JP2008512986A - 免疫原複合体、その調製方法および薬学組成物における利用 - Google Patents

免疫原複合体、その調製方法および薬学組成物における利用 Download PDF

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Abstract

本発明は、小型の担体ペプチドとのカップリングにより、免疫原、抗原またはハプテンの免疫原性の改善を可能にする方法に関するものである。より特定的には、本発明は、免疫原複合体の調製方法およびかかる方法によって得られる可能性のある複合体、ならびに免疫原の免疫原性を増大させるための薬剤としてのかかる複合体の利用に関するものである。本発明は特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質由来のペプチドとカップリングした担体ペプチド、およびＲＳＶに関連する呼吸器感染症の治療のためのワクチンとしてのその利用を含むものである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING

<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT

<120> IMMUNOGENIC COMPLEXES, PREPARATION METHOD THEREOF AND USE
OF SAME IN PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

<130> D22398

<140> PCT/FR2005/001913
<141> 2005-07-25

<150> FR0408175
<151> 2004-07-23

<160> 4

<170> Patent In version 3.1

<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> Streptococcus

<400> 1

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Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu
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Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala
100 105 110

Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser
115 120 125

Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe
130 135 140

Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu
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Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val
165 170 175

Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly
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<213> Respiratory syncytial virus

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Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro
100

Description

本発明は、小型の担体ペプチドとのカップリングにより、免疫原、抗原またはハプテンの免疫原性の改善を可能にする方法に関するものである。より特定的には、本発明は、免疫原複合体の調製方法、ならびにかかる方法によって得ることができる複合体、および免疫原の免疫原性を増大させるための薬剤としてのかかる複合体の利用に関するものである。本発明は特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質由来のペプチドとカップリングした担体ペプチド、およびＲＳＶに関連する呼吸器感染症の治療のためのワクチンとしてのその利用を含むものである。
免疫系は、宿主が除去を目的として自己と非自己を識別し、そして病原性と判断された作用物質を識別することを可能にするために相互作用する、体液性および細胞性の構成要素のネットワークである。このために、免疫系は、先天性免疫と後天性免疫という、協働して作用する二つの機序を発達させた。
先天性免疫という用語には、攻撃に応えて機能させられるかまたは産生される、物理的障壁（皮膚、粘膜…）、細胞（単球／マクロファージ、多核球、ＮＫ細胞…）および可溶性因子（補体、サイトカイン、急性期タンパク質…）が含まれる。先天性免疫性の応答は迅速であるが、特異的でも記憶されたものでもない。
後天性免疫の細胞メディエーターは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球である。それらの相互作用により、特にＢリンパ球による免疫グロブリンの産生が可能となる。先天性免疫性の応答とは逆に、後天性免疫性の応答は特異的、適応可能、そして記憶可能である。実際、新たな生体内への抗原の侵入により、記憶リンパ球と呼ばれる寿命が長いリンパ球（ＴおよびＢ）が増殖し、その間に一次応答と呼ばれる免疫応答が生じる。これらの細胞により、同じ抗原の二度目の侵入の際の、二次免疫応答と呼ばれる免疫応答は、より急速でより強いものとなる。一次応答を発生させるためには、まず第一に、抗原が、Ｔリンパ球に提示されるよう、抗原提示細胞によって捕捉され処理されることが必要である。
ワクチンは、病原体の侵襲を妨げるかまたは制限することによって宿主を保護することを目的としている。現在のところ、市販されている全てのワクチンは、抗体の産生をひき起こすことでこの役割を全うしている。
ワクチン抗原が免疫応答を生じさせることができない場合または免疫応答が弱過ぎる場合、ワクチン抗原を、Ｔリンパ球と相互作用することが可能なＴ細胞エピトープを有するキャリアタンパク質と呼ばれるタンパク質と物理的に結合させることにより、それが補われる。最も良く知られているワクチンキャリアタンパク質は、ジフテリアおよび破傷風のアナトキシンである。
これらのキャリアタンパク質の中では、アルブミンと結合することが可能な、連鎖球菌のＧタンパク質の断片である「ＢＢ」と呼ばれるタンパク質を挙げることもでき、該断片は、配列番号１の配列の残基２４〜２４２に対応するものである。このタンパク質は、自らに結合したワクチン抗原に対し、より早期でより強い一次抗体応答を生じさせることができる（Ｌｉｂｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， １７（５）： ４０６−４１， １９９９）。これについては、国際公開第９６／１４４１６号で公開された国際特許出願を参照することもできる。
国際公開第９６／１４４１６号パンフレット
本発明は、キャリアタンパク質の代替案を提供することを目的としており、それは、以下の記載で明らかになるように、かかるキャリアタンパク質の利用に関連する全ての欠点を改善することを可能にするものである。より特定的には、本発明は、高い産生量を得つつも、比較的大型のキャリアタンパク質の存在に関わる副次的効果を制限することを可能にするものである。
明確さを期して、本発明の利点は、現行技術のキャリアタンパク質、つまりはＢＢキャリアタンパク質との比較において明らかにされる。
全く予期せぬことに、また、当業者が認めている現在の知識に反して、発明者はキャリアタンパク質の利用に対する代替案を明らかにした。より特定的には、発明者は、非常に小型で、従って非免疫原性である、以下担体ペプチドと呼ばれるペプチドを同定することに基づく、免疫原の免疫原性の改善方法の特徴づけを行い、それらの合成および／または、それらが構成する免疫原−担体ペプチド複合体の合成を容易にした。
このため、本発明は、免疫原、抗原またはハプテンを担体ペプチドに結合させて前記免疫原複合体を形成させる、免疫原複合体の調製方法に関するものであり、該方法は、前記担体ペプチドが、配列番号２の配列の３つのアミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）のペプチド断片を少なくとも含む１０個未満のアミノ酸のペプチドから構成されることを特徴とするものである。
免疫原というのは、免疫応答を引き起こすことが可能な全ての物質を意味する。非制限的な例としては、免疫原は好ましくは、タンパク質、糖タンパク質、リポペプチド、または少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０もしくは５０個のアミノ酸のペプチドをその構造に含むあらゆる免疫原化合物であり、該化合物は、免疫応答を引き起こすことが可能であり、特に、哺乳動物にそれを投与するとそのペプチドに対する特異的抗体の産生を誘発することが可能である。
本明細書では、ポリペプチド、ポリペプチド配列、ペプチドおよびタンパク質という用語は、互換的なものである。
以上に記載したことを鑑みて、担体ペプチドという表現は、キャリアタンパク質という表現と区別するべきものであることを充分理解しなければならない。実際、キャリアタンパク質は大きなサイズ（ＢＢタンパク質については２１８個のアミノ酸）に特徴を有し、そして特に、Ｔリンパ球の表面に存在する抗原に対するＴ細胞受容体に結合することが可能なＴ細胞エピトープの存在に特徴を有する。本発明の目的である担体ペプチドは、その非常に小さいサイズ（アミノ酸１０個未満）と、またそれがＴ細胞エピトープを提示しないという点において、キャリアタンパク質と異なっている。
第一の有利な態様に従うと、本発明の目的である方法は、免疫原の免疫原性の改善を可能にする免疫原複合体を、より容易な産生またはより高い産生量で得ることを可能にする。実際、本発明の目的である担体ペプチドを含む複合体は、先行技術のキャリアタンパク質を含む複合体よりもはるかに小型であることから、ペプチド合成／化学合成または当業者にとって既知の他のあらゆる技術によってより容易に産生することができる。
第二の有利な様相に従うと、本発明の目的である発明に従った免疫原複合体は、キャリアタンパク質自体の性質に関連する望ましくない効果を除去すること、また少なくとも制限することを可能にする。当業者には、ＢＢのような比較的大型のキャリアタンパク質が、望ましくない免疫応答の基となる可能性がきわめて高いことが認められている。例えば、破傷風のアナトキシンについては、このキャリアタンパク質への宿主の事前の感作が、コンジュゲートでのワクチン接種の際に、破傷風のアナトキシンに結合した抗原に対する抗体の応答の発達を妨げ得るということが示された（Ｋａｌｉｙａｐｅｒｕｍａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２５ （１２）： ３３７５−８０， １９９５年）。この現象は、エピトープ抑制という用語で知られている。
従って、本明細書から、本発明がキャリアタンパク質の利用に対する有利な代替案をもたらすということが明らかになる。実際、そのサイズが小さいため、担体ペプチドは、副次的作用または望ましくない効果の原因となる可能性が全くないか、または少なくともきわめて少ない。
本発明の好ましい実施態様に従うと、１０個未満のアミノ酸の担体ペプチドは、配列番号２によってコードされるペプチドを少なくとも含んでおり、多くとも８個、好ましくは多くとも５個、そしてさらに好ましくは４個のアミノ酸で構成されている。
さらにもう一つのより好ましい実施態様に従うと、本発明の目的である１０個未満のアミノ酸の担体ペプチドは、配列番号２の配列のペプチドから構成される。
前記担体ペプチドと免疫原の間の結合は、免疫原の完全性および免疫原性特性を保持することを可能にする、当業者に既知のあらゆるカップリング技術によって実施可能である。より特定的には、本発明の目的である方法は、前記結合が共有結合によるカップリングからなることを特徴としている。共有結合によるカップリングというのは、化学的カップリングか、またさらには、組換えＤＮＡ（融合タンパク質（免疫原複合体）をコードする核酸によって形質転換された宿主細胞（真核細胞または原核細胞）による前記核酸の翻訳により得られる融合タンパク質）と呼ばれる技術によるタンパク質融合であることを理解しなければならない。
前記担体ペプチドは、前記免疫原がペプチドである場合、前記免疫原のＮ末端またはＣ末端にカップリングすることが可能である。好ましくは、前記担体ペプチドは、前記免疫原のＮ末端にカップリングする。
免疫原性を改善したい化合物と担体ペプチドとの間の複合体は、特に担体をコードするＤＮＡ分子に免疫原をコードするＤＮＡを挿入するまたは融合させることによって、組換えＤＮＡ技術で産生することが可能である。
もう一つの実施態様に従うと、担体ペプチドと免疫原との間の共有結合によるカップリングは、当業者に既知の技術に従って化学的な方法によって実施される。
本発明は同様に、免疫原をコードするＤＮＡを、場合によってはプロモーターと共に、担体ペプチドをコードするＤＮＡ分子と融合する（またはその中へ挿入する）結果得られる核酸を用いた遺伝子組換え（組換えタンパク質）により前記免疫原複合体が得られる、本発明に従った方法をも目的としている。
この方法においては、このような融合核酸を含むベクターを使用することも可能であり、前記ベクターは特に、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよび／またはコスミドに由来するＤＮＡベクターに基づくことができ、前記複合体をコードする融合核酸は、そこで発現させるために宿主細胞のゲノムに組込まれる。
かくして、本発明に従った方法は、その実施態様の一つにおいて、宿主細胞内における遺伝子工学により複合体を産生する段階を含む。
宿主細胞は原核細胞型であってよく、特に、大腸菌、桿菌、乳酸菌、ブドウ球菌、および連鎖球菌を含む群から選択することが可能であり、また、これは酵母菌であってもよい。
他の様相に従えば、宿主細胞は、哺乳動物の細胞または昆虫の細胞（Ｓｆ９型）といったような真核細胞である。
免疫原複合体をコードする融合核酸は、特に、ウイルスベクターを介して宿主細胞に導入することが可能である。
利用する免疫原は、好ましくは細菌、寄生虫、ウイルス、または黒色腫に関係する抗原のような腫瘍に関係する抗原、またはベータｈＣＧから誘導された抗原に由来するものである。
本発明に従った方法は、病原体の表面ポリペプチドにとりわけ適している。これが組換えＤＮＡ技術により融合タンパク質の形で発現される場合、融合タンパク質は有利にも宿主細胞膜の表面で発現、アンカリングおよび提示される。宿主細胞において抗原の合成を導くことが可能な核酸分子が利用される。
これらには、当業者によって適合させられる、プロモーター配列、機能的に結合した分泌シグナル、および膜アンカー領域をコードする配列が含まれる。
免疫原は、特に、ＡもしくはＢ型のヒトＲＳＶまたはウシＲＳＶの表面糖タンパク質から誘導され得、特にＦタンパク質およびＧタンパク質から選択される。
とりわけ有利な結果は、サブグループＡもしくはＢのヒトＲＳＶの、またはウシＲＳＶの、Ｇタンパク質断片の場合に得られる。
好ましい方法では、免疫原は、ＲＳＶのＧタンパク質のペプチド配列の残基１３０〜２３０の間の配列によってコードされるポリペプチド、または、前記ペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を示すあらゆる配列によってコードされるポリペプチド、好ましくは前記Ｇタンパク質のペプチド配列の残基１３０〜２３０の間の配列と８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示すあらゆる配列によってコードされるポリペプチド、または、哺乳動物に投与すると自らに対する特異的抗体の産生を誘発することが可能である、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０もしくは５０個のアミノ酸の、前記ポリペプチドの断片の一つから構成されている。
本発明の意味合いにおける二つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の「同一率」または「相同率」（これら二つの表現は本明細書においては区別なく利用される）は、最良のアライメント（最適アライメント）の後で得られた、比較される二つの配列の間で同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを意味するものであり、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、二つの配列の間の差異は、無作為に、そしてそれらの長さの全体に渡って分布している。二つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、最適な形でアラインした後にこれらの配列を比較することにより実施されるものであり、前記比較は、セグメント毎に、または「比較ウインドウ」毎に実施することが可能である。比較のための配列の最適なアライメントは、さらに手動で、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（１９８１年）［Ａｄ． Ａｐｐ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２］を用いて、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの局所的相同性アルゴリズム（１９７０年）［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３］を用いて、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（１９８８年）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４］を用いて、これらのアルゴリズムを用いる情報処理ソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、あるいはさらに比較用ソフトウェアＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐによって、実施することができる。
核酸またはアミノ酸の二つの配列の間の同一率は、最適な形でアラインしたこれら二つの配列を比較することによって決定されるものであり、ここで、比較される核酸配列またはアミノ酸配列は、これらの二つの配列の間の最適なアラインメントのための参照配列と比較して、付加または欠失を含むことが可能である。同一率は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基がこれら二つの配列の間で同一である同一位置の数を求め、この同一位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で除し、その結果に１００を乗じて、これら二つの配列の間の同一率を得ることによって計算される。
例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ というサイト上で入手できるＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」（Ｔａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．， “Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １７４： ２４７−２５０）を利用することができ、使用されるパラメータは、デフォルトで与えられるパラメータ（とりわけパラメータ「ギャップ開始ペナルティ」については５、そして「ギャップ伸長ペナルティ」については２、選択されるマトリクスは、例えばプログラムによって提案されるマトリクス「ＢＬＯＳＵＭ６２」である）であり、比較される二つの配列間の同一率は、プログラムによって直接計算される。
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列は、参照配列と比較してある種の改変、とりわけ少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加または置換、トランケーションまたは伸長を示すものが好ましい。連続するまたは連続しない一つまたは複数のアミノ酸の置換の場合には、置換されるアミノ酸が「等価の」アミノ酸によって置き換えられる置換が好ましい。「等価のアミノ酸」という表現はここでは、対応する抗体の生物学的活性を基本的に変化させることなく、基本構造のアミノ酸の一つに置換される可能性のある、あらゆるアミノ酸を示すものである。これらの等価のアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造上の類似性、または実施可能な異なる抗体間での生物学的活性の比較試験の結果に応じて決定することができる。
さらに他の好ましい実施態様に従えば、本発明に従った方法は、免疫原が、配列番号３の配列のポリペプチド、または配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列のポリペプチド、好ましくは前記Ｇタンパク質のペプチド配列の残基１３０〜２３０の間の配列と８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のポリペプチド、または、哺乳動物に投与すると自らに対する特異的抗体の産生を誘発することが可能である、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０もしくは５０個のアミノ酸の、配列番号３の配列の断片の一つであることを特徴とする。
本発明に従った方法の実施に適合したその他の免疫原は、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルスの表面タンパク質の誘導体、麻疹ウイルスの表面タンパク質、パラインフルエンザ３型ウイルスの表面タンパク質、とりわけヘマグルチニンノイラミニダーゼＨＮおよび融合タンパク質Ｆといった表面糖タンパク質を含んでいる。
他の実施態様に従うと、本発明は本発明の方法の実施によって得られる免疫原複合体に関するものである。
より特定的には、本発明は同様に、免疫原、抗原またはハプテンを含む免疫原複合体をも目的としており、前記免疫原が、配列番号２の配列の３つのアミノ酸残基のペプチド断片を少なくとも含んでいる１０個未満のアミノ酸の担体ペプチドに結合していることを特徴とするものである。
好ましくは、本発明に従った前記免疫原複合体においては、配列番号２によってコードされるペプチドを少なくとも含む前記担体ペプチドは、多くとも８個のアミノ酸、好ましくは多くとも５個のアミノ酸、さらに好ましくは４個のアミノ酸で構成されている。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った免疫原複合体の前記担体ペプチドは、配列番号２によってコードされるペプチドで構成される。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った免疫原複合体の前記担体ペプチドは、前記結合が前記担体ペプチドと前記免疫原の間の共有結合によるカップリングからなることを特徴とするものである。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った前記免疫原複合体は、前記免疫原がペプチドである場合、前記担体ペプチドが前記免疫原のＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端にカップリングしていることを特徴とするものである。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った前記免疫原複合体は、該免疫原が細菌、寄生虫および／またはウイルスに由来する抗原であることを特徴とするものである。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った前記免疫原複合体は、免疫原が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の表面タンパク質もしくは表面糖タンパク質、特にＦタンパク質もしくはＧタンパク質、または、前記Ｆタンパク質もしくはＧタンパク質の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列の表面タンパク質もしくは表面糖タンパク質、好ましくは前記Ｆタンパク質もしくはＧタンパク質と８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列の表面タンパク質または表面糖タンパク質、または、哺乳動物に投与すると自らに対する特異的抗体の産生を誘発することが可能である、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０または５０個のアミノ酸の、前記タンパク質の断片の一つであることを特徴とするものである。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った前記免疫原複合体は、免疫原が、Ａ型もしくはＢ型のヒトＲＳＶのＧタンパク質、またはウシＲＳＶのＧタンパク質であることを特徴とするものである。
好ましい実施態様に従えば、本発明に従った前記免疫原複合体は、免疫原が、ＲＳＶのＧタンパク質の残基１３０〜２３０を全て含む配列のポリペプチド、または前記配列１３０〜２３０と少なくとも８０％の同一性を示す配列のポリペプチド、またはＲＳＶのＧタンパク質の前記配列１３０〜２３０の少なくとも１０個のアミノ酸の断片の一つであることを特徴とするものである。
本発明に従った前記免疫原複合体の免疫原は、配列番号３の配列のポリペプチドである。
さらに他の好ましい実施態様に従えば、本発明に従った複合体は、配列番号４の配列の複合体ＭＥＦＧ２Ｎａであるか、または、１〜３位において配列番号２の配列のＭＥＦ配列を有し、それに続いて
− 配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは配列番号３の配列と８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列、または
− 哺乳動物に投与すると自らに対する特異的抗体の産生を誘発することが可能である、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０または５０個のアミノ酸の、配列番号３の配列の断片の一つの配列、
を有する配列である、類似の免疫原複合体である。
もう一つの様相に従えば、本発明は、本発明に従った免疫原複合体、特に配列番号４の配列の免疫原複合体ＭＥＦＧ２Ｎをコードする、好ましくは単離および／または精製された核酸を目的とするものである。
本明細書中で区別無く利用されている用語である核酸、核配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列とは、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの正確な連鎖を指し、核酸の断片または領域を画定することを可能にし、非天然ヌクレオチドを有するかまたは有しておらず、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡにも、また当該ＤＮＡの転写産物にも対応することが可能である。
さらに他の様相においては、本発明は、薬剤としての、本発明に従った免疫原複合体または本発明に従った免疫原複合体をコードする核酸、特に配列番号４の配列の免疫原複合体ＭＥＦＧ２Ｎａまたはこの複合体ＭＥＦＧ２ＮａをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を目的とするものである。
本発明に従ったもしくは上述で定義した免疫原複合体またはかかる免疫原複合体をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの核酸を、生理学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含む薬学組成物も、同様に本発明の一部を成すものである。これらはワクチンの調製にとりわけ適合している。
免疫化は、上述で定義されたような免疫原複合体をコードする前記ポリヌクレオチドを、単独で、またはかかるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを介して投与することによって得ることが可能である。同様に、本発明に従ったこのようなポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、特に不活化細菌を使用することが可能である。
本発明は同様に、本発明に従った免疫原複合体の使用を目的とするものであり、これにおいて、前記免疫原複合体は、ＲＳＶに関連する呼吸器感染症の予防または治療用の薬学組成物の調製を目的とする、上述で定義したようなＲＳＶのＧタンパク質もしくはＦタンパク質から誘導されたタンパク質もしくはペプチド、特に複合体ＭＥＦＧ２Ｎａ、または本発明に従ったそれらの類似体の一つ、または前記免疫原複合体をコードする本発明に従った核酸である。
本発明の利点は、実施例および以下の図面に照らして明らかにされる。
‐図１は、ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける抗−ＲＳＶ−ＡＩｇＧレベルを示している。
‐図２は同様に、他の提示方法に従い、ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける、二度の免疫化の後の抗−ＲＳＶ−ＡＩｇＧレベルを示している。
‐図３は、ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける抗Ｇ２ＮａＩｇＧレベルを示している。
‐図４は同様に、他の提示方法に従い、ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける抗Ｇ２ＮａＩｇＧレベルを示している。
実施例１：キャリアタンパク質ＢＢまたは担体ペプチドＭＥＦを使用することにより誘発されるインビボ活性の比較
８週齢の雌のＳＰＦのＢＡＬＢ／ｃマウスを、２０日目に、ＲＳＶ−ＡのＬｏｎｇ株（１０5ｐｆｕ）に経鼻感染させる。０日目に、ＲＳＶ−Ａのセロコンバーションの確認後、マウスに、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓに吸着させた２０μｇのＢＢＧ２Ｎａ（６μｇがＧ２Ｎａに相当）、またはＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓに吸着させた６μｇのＭＥＦＧ２Ｎａを一度筋内注射する。抗−ＲＳＶ−ＡＩｇＧ（精製したウイルス抗原）および抗ＭＥＦＧ２ＮａＩｇＧのレベルを、ＥＬＩＳＡによって調べる。
図１および２は、反応のどの点においても、６μｇのＭＥＦＧ２Ｎａまたは２０μｇのＢＢＧ２Ｎａによって誘発された抗−ＲＳＶ−ＡＩｇＧのレベル間に有意な差異が見られないことを示している。抗−Ｇ２ＮａＩｇＧのレベルについても同様のことが言える（図３および４）。
実施例２：複合体ＢＢＧ２ＮａとＭＥＦＧ２Ｎａの調製
ＢＢＧ２Ｎａの調製：
宿主細胞である大腸菌ＲＶ３０８と、対象の遺伝子の転写がトリプトファンプロモーターの制御下にあるプラスミドを用いて、タンパク質ＢＢＧ２Ｎａを産生させる。発酵段階は、半合成培地と、炭素源およびエネルギー源としてグリセロールを用いた、回分培養タイプの方法である。生産用発酵装置に播種するために利用する接種材料を調製するには、二つの培養段階が必要である。この発酵装置においては、微生物を、６２０ｎｍでの光学密度が５０になるまで培養し、次にトリプトファンの類似体（ＩＡＡ）を添加することによって発現を誘発する。培養は、発酵装置におけるＯ2分圧が急激に再上昇するまで続行されるが、これは炭素源の枯渇を知らせるものである。この段階で、平均細胞密度は、９．５％の発現率で４０ｇ乾燥細胞／リットル、つまり培養物１リットル当たりのＢＢＧ２Ｎａの産生量が３．８ｇである。培養物を＋４℃まで冷却し、微生物を遠心分離により回収し、−１５／−２５℃で凍結する。
ＢＢＧ２Ｎａの抽出には、ジスルフィド架橋を減少させるため、グアニジン、ＨＣｌおよび１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液に、解凍した微生物の沈渣を溶解させることが必要である。タンパク質の再生およびジスルフィド架橋の酸化は、変性した懸濁液を希釈し、開放反応装置で一晩室温で攪拌することによって得られる。再生したタンパク質を含有する懸濁液は、遠心分離により清澄化し、その後ろ過する。続いて、ＰＥＧ６０００をろ液に加え、その結果得られる沈殿物を遠心分離により回収する。ＢＢＧ２Ｎａを含有する沈殿物を新たに、尿素を含有する緩衝液に溶解させる。得られた抽出物を０．２２μｍの担体でろ過し、−１５／−２５℃で保存する。
解凍した抽出物からのＢＢＧ２Ｎａの精製には、次の五つ段階が含まれる。（１）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラムにおける陽イオン交換クロマトグラフィー、（２）Ｍａｃｒｏｐｒｅｐメチルカラムにおける疎水性相互反応クロマトグラフィー、（３）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００カラムにおけるゲルろ過、（４）ＤＥＡＥ−セファロースカラムにおける陰イオン交換クロマトグラフィー、そして最後に（５）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムにおける脱塩段階。精製タンパク質の溶液は無菌下でろ過し、無菌かつ非発熱性の袋に分配する。
ＭＥＦＧ２Ｎａの調製：
宿主細胞である大腸菌ＩＣＯＮＥ２００と、対象の遺伝子の転写がトリプトファンプロモーターの制御下にあるプラスミドを用いて、タンパク質ＭＥＦＧ２Ｎａを産生させる。大腸菌ＩＣＯＮＥ２００は、増殖期の間の発現の制御を改善するために開発された、大腸菌ＲＶ３０８の突然変異体である。発酵段階は、化学合成培地と炭素源およびエネルギー源としてグリセロールを用いた半回分培養タイプの方法である。生産用発酵装置に播種するために利用する接種材料を調製するには、二つの培養段階が必要である。この発酵装置においては、微生物を、６２０ｎｍでの光学密度が１１０になるまで培養し、次にトリプトファンの類似体（ＩＡＡ）を添加することによって発現を誘発する。培養は、発酵装置におけるＯ2分圧が急激に再上昇するまで続行されるが、これは炭素源の枯渇を知らせるものである。この段階で、平均細胞密度は、５．４％の発現率で５６ｇ乾燥細胞／リットル、つまり培養物１リットル当たりのＭＥＦＧ２Ｎａの産生量が３ｇである。培養物を＋４℃まで冷却し、微生物を遠心分離により回収し、−１５／−２５℃で凍結する。
ＭＥＦＧ２Ｎａの抽出には、グアニジン、ＨＣｌを含む緩衝液に、解凍した微生物沈渣を溶解させることが必要である。変性したタンパク質を含有する懸濁液を、遠心分離により清澄化し、その後ろ過する。グアニジンはその後の精製段階に相容性がないことから、１０ｋＤａの分離境界を有するポリエーテルスルホン製の限外ろ過担体での透析濃縮段階が、緩衝液の交換を行うために設けられる。得られた抽出物は、０．２２μｍの担体でろ過し、引き続き精製される。
ＭＥＦＧ２Ｎａの精製には以下のような３段階が含まれている。（１）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐカラムにおける陽イオン交換クロマトグラフィー、（２）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラムにおけるゲルろ過、（３）ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにおける陰イオン交換クロマトグラフィー。精製されたバルクタンパク質は、無菌状態でろ過し、無菌で非発熱性の袋に分配する。
発現量：
ＭＥＦＧ２ＮａとＢＢＧ２Ｎａの発現のデータを、以下の表１にまとめる。
Figure 2008512986
複合体ＭＥＦＧ２Ｎａの発現レベルは、複合体ＢＢＧ２Ｎａの発現レベルよりも約２倍大きいことがわかる。
本明細書ならびに実施例は抗原Ｇ２Ｎａにのみ基づいているものの、全ての免疫原が同様に本発明の対象である担体ペプチドにカップリングしうるということを理解すべきである。
ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける抗−ＲＳＶ−ＡＩｇＧレベルを示したグラフ。 同様に、他の提示方法に従い、ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける、二度の免疫化の後の抗−ＲＳＶ−ＡＩｇＧレベルを示したグラフ。 ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける抗Ｇ２ＮａＩｇＧレベルを示したグラフ。 同様に、他の提示方法に従い、ＢＢＧ２ＮａまたはＭＥＦＧ２Ｎａで免疫化したマウスにおける抗Ｇ２ＮａＩｇＧレベルを示したグラフ。

Claims (19)

  1. 担体ペプチドと免疫原とをカップリングして免疫原複合体を形成させることによって、免疫原、抗原またはハプテンの免疫原性を改善する方法であり、前記担体ペプチドが、少なくとも配列番号２の配列のペプチドを含む１０個未満のアミノ酸のペプチドから構成されることを特徴とする方法。
  2. １０個未満のアミノ酸の前記担体ペプチドが、配列番号２にコードされるペプチドから構成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記カップリングが、前記担体ペプチドと前記免疫原との間の共有結合によるカップリングからなることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記免疫原がペプチドである場合に、前記担体ペプチドが前記免疫原のＮ末端にカップリングすることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記共有結合によるカップリングが組換えＤＮＡ技術によって実施されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記共有結合によるカップリングが化学的に実施されることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
  7. 免疫原が、細菌、寄生虫および／またはウイルスに由来する抗原であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
  8. 免疫原が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の表面タンパク質または表面糖タンパク質、当該ＲＳＶの表面タンパク質の配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列のタンパク質、または当該ＲＳＶの表面タンパク質の連続する少なくとも１０個のアミノ酸の断片の一つであり、前記少なくとも８０％の同一性を示す配列のタンパク質または前記断片が、哺乳動物に投与されると、このタンパク質または前記断片に対する特異的抗体の産生を誘発することが可能であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 免疫原が、Ａ型もしくはＢ型のヒトＲＳＶのＧタンパク質、ウシＲＳＶのＧタンパク質、前記Ｇタンパク質の配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列のタンパク質、または少なくとも１０個のアミノ酸の前記Ｇタンパク質の断片の一つであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 免疫原が、ＲＳＶのＧタンパク質の残基１３０〜２３０を全て含む配列のポリペプチド、または前記配列１３０〜２３０と少なくとも８０％の同一性を示す配列のポリペプチド、または前記Ｇタンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸の断片の一つであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 免疫原が配列番号３の配列のポリペプチドであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 担体ペプチドと結合した免疫原、抗原またはハプテンを含む免疫原複合体であり、
    ‐前記免疫原が、少なくとも配列番号２の配列のペプチドを含む１０個未満のアミノ酸の担体ペプチドに、共有結合によりカップリングしており、そして、
    ‐免疫原が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の表面タンパク質もしくは表面糖タンパク質であるＦタンパク質もしくはＧタンパク質、または哺乳動物に投与すると自らに対する特異的抗体の産生を誘発することが可能である、ＲＳＶの前記表面タンパク質の配列と少なくとも８０％の同一性を示す配列のタンパク質または糖タンパク質であることを特徴とする、免疫原複合体。
  13. 前記担体ペプチドが配列番号２の配列のペプチドであることを特徴とする、請求項１２に記載の複合体。
  14. 配列番号４の配列の複合体ＭＥＦＧ２Ｎａ、または、１位〜３位において配列番号２の配列を有しそれに続いて配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは配列番号３と８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する免疫原複合体であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の複合体。
  15. 配列番号４の配列の、請求項１４に記載の複合体。
  16. 請求項１２〜１５のいずれか一つに記載の免疫原複合体をコードする核酸。
  17. 配列番号４の配列を有する免疫原複合体をコードする請求項１６に記載の核酸。
  18. 薬剤としての、請求項１２〜１５のいずれか一つに記載の複合体または請求項１６または１７に記載の核酸。
  19. ＲＳＶに関連する呼吸器感染症の治療または予防用の薬学組成物の調製のための、請求項１２〜１５のいずれか１つに記載の免疫原複合体、または請求項１６または１７に記載の核酸の利用方法。
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