JP2003528812A - Ｒｓｖの免疫原性ペプチドと組み合わせた腸内細菌ｏｍｐａ膜タンパク質の経鼻投与可能なワクチンの製造のための使用 - Google Patents

Ｒｓｖの免疫原性ペプチドと組み合わせた腸内細菌ｏｍｐａ膜タンパク質の経鼻投与可能なワクチンの製造のための使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、RSウイルス (respiratory syncytial virus, RSV) 由来の免疫原性ペプチドと組み合わせた腸内細菌外膜タンパク質Ａ（OmpA) 、特にクレブシエラ・ニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae) P40タンパク質を、RSV 感染に対して上気道および下気道 (肺) を防御する免疫応答を引き起こすように設計された、鼻腔内投与のための薬剤組成物の製造に使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、RSウイルス (respiratory syncytial virus, RSV) 由来の免疫原性
ペプチドと組み合わせた腸内細菌 (enterobacterium) OmpA 膜タンパク質、特に
クレブシエラ・ニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae) P40タンパク質を、経
鼻的に投与することができ、 RSV感染に対して個体の上気道および下気道 (肺)
を防御する免疫応答を引き起こすための薬剤組成物を製造するのに使用すること
に関する。
【０００２】 RSVは急性呼吸器感染症による１歳未満乳児の入院の最も大きい原因である。
喉頭気管支炎、細気管支炎、肺炎に罹患した小児は入院治療を必要とし、先天性
心疾患を持つ乳児においては死亡率は37％以上である。気管支肺の異形成症、腎
疾患および免疫不全症などのその他の疾患も、同じく高い死亡率の原因となる因
子である。また、RSV 感染は高齢者における死亡の原因となるかもしれない。
【０００３】 温帯の国々では、11月から４月の冬の間に RSVの流行が現れ、２〜６カ月の乳
児において重篤な病状が最も高率に発生する。RSV Ｇ糖タンパク質の抗原の変化
により２種類の RSV、すなわちRSV-A およびRSV-B が区別され、亜群 (subgroup
) Ａおよび亜群Ｂは共に循環している。フランスにおける1982年から1990年の最
近の研究により、５年の期間にわたる１つの亜群から他の亜群への変化が示され
た。Ａ株はＢ株よりもより罹患して重篤な感染症を引き起こすことが多い。
【０００４】 ヒト RSVは、パラミクソウイルス科 (Paramyxoviridae)の中の１つであるニュ
ーモウイルス属 (pneumovirus 、肺炎ウイルス属) に属する。このウイルスのゲ
ノムは、負の極性を有する非分節型 RNA鎖からなり、異なる10のタンパク質：NS
1, NS2, N, P, M, SH ( またはIA),Ｇ, Ｆ, M2 (または22K)およびＬをコードす
る (Murphy et al., Virus Res. 32:13-36, 1994) 。
【０００５】 多数の既報の実験により、防御に関わる主なタンパク質はＦ、ＧおよびＮであ
ることが実証された。Ｆ融合糖タンパク質は、前駆体FOとして合成され、２つの
サブユニットF1 (48kDa)およびF2 (20kDa)に分かれ、これらはジスルフィド架橋
により連結される。Ｆタンパク質はRSV-A およびRSV-B の間で保存されている (
91％相同性) 。逆に、接着 (attachment) 糖タンパク質Ｇは１つの亜群と他方の
間で非常に変化する。13アミノ酸の領域 (aa164-aa176)のみが高度に保存され、
特に４つのシステイン残基の位置 (173 、176 、182 および186)はすべてのヒト
およびウシ RSVにおいて一定に保たれている。動物モデルにおいて、２つの糖タ
ンパク質ＦおよびＧが RSVに対する防御において主要な役割を果たしていること
が実証されている。ＧおよびＦに対するモノクローナル抗体はin vitroでウイル
スを中和することができ、受動的に投与された場合、コトンラットを RSV感染か
ら防御する。1960年代において、麻疹ワクチンに類似した通常ワクチン、すなわ
ちホルモール不活化 RSVを開発する試みは失敗した。ワクチン接種した小児にお
いて防御を与える代わりに、この種のワクチンの作用は自然のウイルス性疾患を
増強することであった。
【０００６】 乳児における RSVによる疾患の悪化に対する現在の治療は、粘液の吸引による
気道のうっ血の除去、および換気による呼吸の補助である。抗ウイルス薬のリバ
ビリン (Ribavirin)は重症の患者において有効であるようである。しかし、小児
科の治療におけるその使用はあまり明確にされていない。抗-RSV免疫グロブリン
による受動免疫は重篤な RSV感染症を治療するための別の方法である：望ましく
ない副作用はこれまでみられない。しかし、この種の治療は非常に費用がかかり
、大規模な治療に応用するのは困難である。
【０００７】 ヒト RSVに対するワクチン接種のための各種方法が採用されてきた：ワクチン
は動物 (ラット、霊長類) において RSV感染に対して防御するが、肺の病的状態
を引き起こすか、あるいはワクチンは十分に免疫原性ではなく防御しないかのい
ずれかである (Connors et al., Vaccine 10:475-484, 1992) 。現状では、注射
により投与されるサブユニットワクチンは肺においてのみ有効な防御を与え、耳
鼻咽喉科 (ORL)領域ではそうでない。特に以下のものが挙げられる。WO 96/1441
5 として公開されたPCT 国際出願は、Klebsiella pneumoniae 外部 (external)
膜タンパク質P40 に結合したRSV Ｇタンパク質の断片からなる、皮下投与されう
る RSVワクチンを記載している。WO 96/14416 として公開されたPCT 国際特許出
願は、ストレプトコッカス (Streptococcus)のＧタンパク質のBBタンパク質に結
合したRSV Ｇタンパク質の断片からなる、腹膜内投与されうる RSVワクチンを記
載している。
【０００８】 経鼻的に投与される、弱毒化 RSVを含む生ワクチンのみがORL 領域の防御を付
与しうる。しかし、この方法は弱毒株の復帰の可能性がありうるため危険である
。
【０００９】 従って、現在、経鼻的に投与することができ、肺およびORL 領域におけるヒト
RSVに対する防御反応を誘導することを可能にするワクチンが大いに必要とされ
ている。
【００１０】 これはまさに本発明の主題である。 従って、本発明は、腸内細菌OmpAタンパク質およびその断片を、RSウイルス (
respiratory syncytial virus,RSV)由来の免疫原性ペプチドと組み合わせて、 R
SV感染に対して個体の上気道及び／又は下気道 (肺) を防御する免疫応答を引き
起こすための、鼻内に投与可能な薬剤組成物の製造に使用することに関する。
【００１１】 好ましくは、本発明により生じる免疫応答は、 RSVの感染に対して個体の上気
道および下気道 (肺) の両方を防御する。 本発明において、「タンパク質」の用語は、ペプチドまたはポリペプチドのい
ずれをも意味し、「OmpA」 (「外膜タンパク質 (Outer Membrane Protein) 」に
関して) の用語は外膜のＡ型タンパク質を意味する。
【００１２】 「OmpAタンパク質の断片」なる表現は、 RSVの免疫原性ペプチドと、場合によ
り免疫アジュバントの存在下で組み合わせた場合に、この免疫原性ペプチドに対
する抗体型の免疫応答を生じさせるか向上させるうるOmpAタンパク質のアミノ酸
配列に含まれる任意断片のアミノ酸配列を特に意味し、OmpAタンパク質のこの断
片は、OmpAタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも10の連続したアミノ酸、好
ましくは少なくとも15の連続したアミノ酸、またはより好ましくは少なくとも20
の連続したアミノ酸を含む。
【００１３】 「RSウイルス (respiratory syncytial virus)由来免疫原性ペプチド」なる表
現は、特に、そのアミノ酸配列が RSVにより発現されるタンパク質の配列の少な
くとも５つの連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも10または15の連続したア
ミノ酸を含む任意のペプチドであり、特にOmpAタンパク質またはその断片の存在
下、この免疫原性ペプチドで予め免疫された生体において、前記「Ｂ」エピトー
プに対する抗体型 (Ｂリンパ球依存性) の免疫反応を生じさせうる抗原決定基す
なわちエピトープをその配列に含むペプチドを意味する。
【００１４】 本発明は好ましくは、前記腸内細菌がクレブシエラ・ニューモニアエ (Klebsi
ella pneumoniae)であることを特徴とする本発明による使用を含む。 本発明の主題はまた、前記OmpAタンパク質またはその断片のアミノ酸配列が以
下を含むことを特徴とする、本発明による使用である： a)配列番号 (SEQ ID No.) ２のアミノ酸配列； b)最適の整列後、配列番号２の配列と少なくとも80％、好ましくは90％、95％も
しくは97％の同一性％を有する配列のアミノ酸配列；または c)配列番号２の配列の少なくとも10の連続したアミノ酸の断片のアミノ酸配列。
【００１５】 本発明の目的にとっては、２つの核酸またはアミノ酸配列の間の「同一性％」
なる用語は、最適の整列後に得られる、比較すべき２つの配列間で同一であるヌ
クレオチドまたはアミノ酸残基の割合 (％) を意味し、この％は純粋に統計的な
ものであり、２つの配列間の違いはその全長にわたりランダムに分布している。
２つの核酸またはアミノ酸配列の間の配列比較は、それらを最適に整列させた後
にこれらの配列を比較することにより通常の方法で行われ、この比較は、配列類
似性をもつ局所的領域を同定し比較するために区分してあるいは「比較ウインド
ウ」により行われる。比較のための配列の最適の整列は、人手による以外に、Sm
ith and Waterman (1981) [Ad.App.Math. 2:482]の局部相同性アルゴリズム、Ne
ddleman and Wunsch (1970) [J.Mol.Biol.48:443] の局部相同性アルゴリズム、
Pearson and Lipman (1988) [Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444] の類似性検索
方法により、これらのアルゴリズムを用いるコンピュータープログラム (Wiscon
sin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison,WIのGAP, BESTFIT, FASTA およびTFASTA) を用いて行うことができる。
【００１６】 ２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性％は、比較すべき核酸またはアミノ
酸配列の領域がこれらの２つの配列間での最適整列を行うための参照配列に比べ
て付加または欠失を含むかもしれない場合、「比較ウインドウ」により最適に整
列させたこれら２つの配列を比較することにより決定される。同一性％は、ヌク
レオチドまたはアミノ酸残基が２つの配列間で同一である同一位置の数を決定し
、この同一位置の数を比較ウインドウにおける全位置数で割り、得られた結果を
100 倍して、これら２つの配列間の同一性％を得ることにより算出される。
【００１７】 ある特定の態様において、本発明は、腸内細菌OmpAタンパク質またはその断片
がこの腸内細菌の細胞から抽出する方法を用いて得られることを特徴とする、本
発明による腸内細菌OmpAタンパク質またはその断片使用の使用からなる。
【００１８】 細菌の膜タンパク質を抽出する方法は当業者に知られており、本明細書におい
て開発されるものではない。例えば、J.H.Haeuw et al.(Eur.J.Biochem. 255,44
6-454, 1998)に記載の抽出方法が挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】 別の好ましくは態様では、本発明は、腸内細菌OmpAタンパク質もしくはその断
片、または免疫原性ペプチドが組換え経路を介して得られることを特徴とする、
本発明による腸内細菌OmpAタンパク質またはその断片の使用も含む。
【００２０】 組換えタンパク質の製造方法は現在当業者には周知であり、本明細書において
開発されるものではないが、実施例に記載の方法が挙げられる。これらの組換え
タンパク質を産生するのに使用しうる細胞には、当然、細菌細胞 (Olins P.O. a
nd Lee S.C., 1993,「E.coliにおける異種遺伝子発現の最近の進展」 Curr.Op B
iotechnology, 4:520-525)、酵母細胞 (Buchholz R.G., 1993,「異種遺伝子産物
の発現のための酵母系」 Curr.Op.Biotechnology, 4:538-542)、および動物細胞
、特に哺乳動物細胞の培養物 (Edwards C.P. and Aruffo A., 1993, 「COS 細胞
系の一過性発現系の最近の応用」 Curr.Op.Biotechnology 4:558-563) 、また例
えばバキュロウイルス (Luckoq V.A., 1993,「ヒト遺伝子産物の発現のためのバ
キュロウイルス系」 Curr.Op.Biotechnology 4:564-572) を用いる方法が使用さ
れる昆虫細胞が挙げられる。
【００２１】 特に、本発明は、前記免疫原性ペプチドが RSVのＧ、Ｆ、M2またはＮタンパク
質、好ましくはＧタンパク質から選択されることを特徴とする、本発明の使用に
関する。
【００２２】 本発明の好ましい態様において、この免疫原性ペプチドは、Ｂ型のエピトープ
を含むＧタンパク質の断片である。 RSV Ｇタンパク質の断片に含まれる「Ｂ型エピトープ」なる用語は、特に、抗
体型 (Ｂリンパ球依存性) の免疫応答を、特に配列番号１の配列を有するP40 Om
pAタンパク質の存在下で誘導しうる、Ｇタンパク質の断片の少なくとも５、10ま
たは15の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を意味する。
【００２３】 本発明の特に好ましい態様において、前記免疫原性ペプチドは、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号11の配列、または配列番
号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９もしくは配列番号11の配列と最適の
整列後に少なくとも80％、好ましくは90％、95％もしくは97％の同一性％を有す
るアミノ酸配列を有するペプチドから選択される。
【００２４】 本発明の主題は、前記免疫原性ペプチドが前記腸内細菌OmpAタンパク質または
その断片に結合されるか、あるいはそれと混合されることを特徴とする、本発明
による使用でもある。
【００２５】 別の面において、本発明は、薬剤組成物が、前記腸内細菌OmpAタンパク質もし
くはその断片をコードする核酸作製物、及び／又は前記免疫原性ペプチドをコー
ドする核酸作製物を含み、この核酸作製物はこの腸内細菌OmpAタンパク質もしく
はその断片、及び／又はこの免疫原性ペプチドを発現しうる発現ベクターまたは
形質転換宿主細胞中に含まれていることを特徴とする、本発明による使用に関す
る。
【００２６】 本発明はまた、前記免疫原性ペプチドが、共有連結、特に化学的結合により、
前記OmpAタンパク質またはその断片に結合され、ハイブリッドタンパク質を形成
していることを特徴とする、本発明による使用も含む。
【００２７】 ある特定の態様において、本発明の使用は、化学的結合を容易にするために１
または２以上の連結要素が前記OmpAタンパク質もしくはその断片中に、及び／又
は前記免疫原性ペプチド中に導入されており、好ましくはこの導入された連結要
素がアミノ酸であることを特徴とする。
【００２８】 本発明によれば、OmpAタンパク質またはその断片と前記免疫原性ペプチドの間
の結合反応を容易にするために、１または２以上の連結要素、特にアミノ酸を導
入することが可能である。本発明によるOmpAタンパク質またはその断片と免疫原
性ペプチドの間の共有結合は、OmpAタンパク質またはその断片のＮまたはＣ末端
において行うことができる。この結合を可能にする二官能性試薬は、結合を行う
ために選択されるOmpAタンパク質またはその断片の末端、および結合させる免疫
原性ペプチドの性質に関連して決定されるであろう。
【００２９】 別の具体的態様において、本発明の使用は、前記免疫原性ペプチドと前記OmpA
タンパク質またはその断片との間の共有結合により形成されるハイブリッドタン
パク質が、このハイブリッドタンパク質をコードする核酸作製物で形質転換され
た細胞により発現される融合タンパク質であることを特徴とする。
【００３０】 前記免疫原性ペプチドおよび前記OmpAタンパク質またはその断片との間の共有
結合から得られるハイブリッドタンパク質は遺伝的組換えにより作製されてもよ
い。このハイブリッドまたはキメラタンパク質は、前記免疫原性ペプチドをコー
ドする配列を、前記OmpAタンパク質またはその断片をコードする DNA配列中に挿
入または付加することにより、組換え DNA技術を用いて産生してもよい。
【００３１】 ハイブリッド分子を合成する方法には、所望のポリペプチド配列をコードする
ハイブリッドポリヌクレオチドを作製するために遺伝子工学で使用される方法を
含む。有利には、例えば、D.V.Goeddel(「遺伝子発現技術」 Methods in Enzymo
logy, vol.185,3-187,1990) により記載された融合タンパク質をコードする遺伝
子を得るための技術が挙げられる。
【００３２】 本発明は好ましくは、本発明により経鼻的に投与することができる薬剤組成物
を調製するのに使用される、前記腸内細菌OmpAタンパク質またはその断片、およ
び前記RSウイルス由来の免疫原性ペプチドが、配列番号２の配列または最適の整
列後、配列番号２の配列と少なくとも80％、好ましくは90％、95％もしくは97％
の同一性％を有するアミノ酸配列のクレブシエラ・ニューモニアエ (Klebsiella
pneumoniae)P40 タンパク質と、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番
号９もしくは配列番号11の配列、または配列番号５、配列番号６、配列番号７、
配列番号９もしくは配列番号11の配列と最適の整列後に少なくとも80％、好まし
くは90％、95％もしくは97％の同一性％を有するアミノ酸配列の RSV由来の免疫
原性ペプチド間の、共有結合、化学的合成または遺伝的融合により得られたハイ
ブリッドタンパク質の形態であることを特徴とする。
【００３３】 別の面において、本発明は、薬剤組成物が、前記ハイブリッドタンパク質をコ
ードする核酸作製物を、特に前記ハイブリッドタンパク質を発現しうる核酸作製
物を含む発現ベクターまたは形質転換宿主細胞として含むことを特徴とする、本
発明の使用にも関する。
【００３４】 本発明者等は、かかるOmpAタンパク質、特にK.neumoniae P40 が RSV由来の免
疫原性ペプチドと特に共有結合で結合されると、アジュバントの添加にたよる必
要なくこれらの免疫原性ペプチドのいくつかに対する免疫応答を増強するという
予想外の能力を有することを実証した。
【００３５】 従って、本発明によれば、この薬剤組成物は場合により免疫アジュバントを含
有するであろう。 本発明はまた、薬剤組成物がその安定性及び／又は免疫原性を改善することを
可能にする形態、特にリポソーム中に内包された形態でビヒクル化 (vehiculate
) されていることを特徴とする本発明の使用にも関する。
【００３６】 本発明は好ましくは、このビヒクルが、前記OmpAタンパク質もしくはその断片
、前記免疫原性ペプチドまたは前記ハイブリッドタンパク質をコードする核酸作
製物を含むウイルスベクター、あるいは前記OmpAタンパク質もしくはその断片、
前記免疫原性ペプチドまたは前記ハイブリッドタンパク質を発現しうる核酸作製
物を含む形質転換宿主細胞であることを特徴とする特徴とする本発明による使用
からなる。
【００３７】 より好ましくは、上記形質転換宿主細胞が、哺乳動物に対して非病原性である
細菌であり、それが含有する上記核酸作製物が、さらに前記OmpAタンパク質もし
くはその断片、前記免疫原性ペプチドまたは前記ハイブリッドタンパク質を、前
記細菌の膜表面において分泌または発現するのに必要な要素も含む。
【００３８】 最後に、本発明は、 RSV感染症を予防または治療するための薬剤組成物、特に
ワクチン組成物を製造するための本発明の使用に関する。 以下の実施例は、本発明の範囲を何ら制限することなく本発明を例示するため
のものである。
【００３９】 これらの実施例では、後で説明される図面が参照されるであろう。
【００４０】
【実施例】
【実施例１】Klebsiella pneumoniae P40 OmpAタンパク質をコードする DNAのク
ローニング P40 タンパク質をコードする DNAを、Klebsiella pneumoniae IP I145 のゲノ
ム DNA (Nguyen et al., Gene 210:93-101, 1998) を用いて PCR増幅によって得
た。P40 をコードする遺伝子断片を各種発現ベクター、特にTrp オペロンプロモ
ーターの制御下のベクター：pvaLP40 (5.7Kbp)に挿入する。P40 タンパク質のヌ
クレオチド配列およびペプチド配列を、それぞれ配列番号１および２に表す。E.
coli K12プロデューサー株をpvaLP40 発現ベクター (5.7Kbp) で形質転換した。
rP40タンパク質がかなりの収率 (＞10％、タンパク質ｇ／乾燥生物量ｇ) で封入
体の形態で産生される。この実施例はrP40タンパク質の発現の例示のみであるが
、他の細菌株および他の発現ベクターにも拡張できる。
【００４１】
【実施例２】 P40G2Naタンパク質をコードする DNAのクローニング RSV-A Ｇタンパク質の配列番号９のG2Na断片 (RSV-A Ｇタンパク質配列のアミ
ノ酸配列aa130-aa230 に相当する) をコードする DNAを、Nguyen et al. (M.Uhl
en,E.Hornes and O.Olsvik編, Advances in biomagnetic separation. Eaton Pu
blishing Co.Natick, p.73-78, 1994)に記載の固体担体 (Dynal 磁気ビーズ、オ
スロ) 上で合成オリゴヌクレオチドを集合させることにより得た；このオリゴヌ
クレオチドは通常の大腸菌 (Esherichia coli)のコドンを用いて設計され最適化
されている。G2Na DNAを実施例１に記載のpvaLP40 ベクター中にクローン化した
；得られた発現ベクターをpvaLP40G2Na (6Kbp)と称する。P40G2Na のヌクレオチ
ド配列およびペプチド配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に示す。上記
の培養条件の下でこのベクターにより形質転換したE.coli K12株は、P40G2Na タ
ンパク質 (49 kDa) を封入体の形態で多量 (＞５％、タンパク質ｇ／乾燥生物量
ｇ) 産生する。
【００４２】 RSV-B Ｇタンパク質の配列番号11のG2Nb断片 (RSV-A Ｇタンパク質配列のアミ
ノ酸配列aa130-aa230 に相当する) をコードする DNAのクローニングおよびP40G
2Nb 融合タンパク質を、G2Naおよび P40G2Naについて記載された技術を用いて得
ることができる。
【００４３】
【実施例３】rP40タンパク質および P40G2Na融合タンパク質の発酵方法 以下の発酵方法の説明はrP40タンパク質の発現および P40G2Naタンパク質の発
現に適用することができる。培養条件は例示として示され、発現タンパク質の収
率をよくするために最適化してもよい。
【００４４】 アンピシリン (100 μｇ/ml 、Sigma)およびテトラサイクリン (８μｇ/ml 、
Sigma)を含有するTBS (Tryptic Soy Broth, Difco)培地 250mlを含むエーレンマ
イヤーフラスコ (三角フラスコ) に、上記組換えE.coliの菌株を接種し、フラス
コを37℃で一晩培養する。次いで、上記で得られた培養液200ml を用いて、発酵
槽 (Biolafitte、フランス) 中の培地２リットルに接種する。通常と全く同じよ
うに、培地は化学的薬剤を含み、ビタミン類及び／又は酵母エキスをを添加して
よく、これはNguyen et al. (Gene 210:93-101, 1998) に記載のように、高密度
な細菌細胞の増殖を促進することが知られている。
【００４５】 発酵の間制御されるパラメーターは、pH、攪拌、温度、酸素添加の程度および
混合栄養源 (グリセロールまたはグルコース) の供給である。一般的に、pHは7.
0 に調整され、温度は37℃に保つ。増殖は、溶解酸素圧シグナルを30％に維持す
るために、グリセロール (87％) を一定の量 (12ml/h) で供給することにより制
御する。培養液の濁度 (580nm で測定) が80の値に達した時 (約24時間の培養後
) 、インドールアクリル酸 (IAA)を最終濃度25mg/lで添加することによりタンパ
ク質の産生を引き起こす。誘導の約４時間後、細胞を遠心分離により回収する。
得られた生体量の湿重量は約 200ｇである。
【００４６】
【実施例４】rP40タンパク質の抽出および精製法 A)rP40の抽出 抽出および精製法はHaeuw et al. (Eur.J.Biochem. 255:446-457,1998)により
記載されている。
【００４７】 培養液の遠心分離 (4000 rpm、10分、４℃) 後、細胞をpH8.5 のトリス-HCl緩
衝液に再懸濁する。不溶性成分、すなわち封入体をリゾチーム処理 (0.5 ｇ／リ
ットル、１時間、室温／穏やかな攪拌) した後に得る。遠心分離 (15分、10,000
ｇ、４℃) により得られた封入体のペレットを、５mM MgCl2を含有するpH8.5 の
25mMトリス-HCl緩衝液中にとり、次いで遠心分離する (15分、10,000ｇ) 。
【００４８】 封入体を、７M 尿素 (変性剤) および10mMジチオスレイトール (ジスルフィド
架橋の還元) を含有するpH8.5 の25mMトリス-HCl緩衝液中に２時間かけて37℃で
可溶化する。遠心分離 (15分、10,000ｇ) により不溶性粒子の除去が可能となる
。
【００４９】 次に、得られた上清をNaCl (8.76ｇ/l) およびZwittergent 3-14 (0.1 ％,w/v
) を含有するpH8.5 の25mMトリス-HClの13体積中に再懸濁する。溶液を空気に接
触させながら穏やかに攪拌して室温に一晩放置する (希釈およびジスクフィド架
橋の再酸化によりタンパク質の再生を促進する) 。 B)rP40タンパク質の精製 −陰イオン交換クロマトグラフィー工程 さらに遠心分離した後、溶液を0.1 ％Zwittergent 3-14を含有するpH8.5 の25
mMトリス-HCl緩衝液で４℃において透析する (緩衝液100 体積) 。
【００５０】 透析物を、上記緩衝液で平衡化した強力な陰イオン交換型 (Biorad Macro Pre
p High Q gel) の支持体を含むカラム上に、線形流量15cm/hで流す。タンパク質
を280nm で検出する。rP40タンパク質を、0.1 ％Zwittergent 3-14を含有するpH
8.5 の25mMトリス-HCl緩衝液中の0.2 M のNaCl濃度に対し、線形流量60cm/hで溶
離する。 −陽イオン交換クロマトグラフィー工程 rP40タンパク質を含む画分を混合し、約100ml の量についてはYM10- 型Diaflo
膜 (10kDa カットオフしきい値) を用いて攪拌しながらAmicon cell systemの補
助により、またはより多量の場合は10kDa カットオフしきい値を有する膜プレー
トを用いてMillipore Minitan 接線流れ濾過 (tangential flow filtration) シ
ステムの補助により、超遠心分離により濃縮する。こうして濃縮した画分を0.1
％Zwittergent 3-14を含有するpH3.0 の20mMクエン酸緩衝液に対し４℃で一晩透
析する。
【００５１】 透析物を、0.1 ％Zwittergent 3-14を含有するpH3.0 の20mMクエン酸緩衝液中
で平衡状態にした強力な陽イオン交換型 (Biorad Macro Prep High S gel) の支
持体を含むカラム上に流す。rP40タンパク質0.7 M のNaCl濃度に対し溶離する (
流量61cm/h) 。
【００５２】
【実施例５】P40G2Na タンパク質の抽出および精製方法 A)P40G2Na 融合タンパク質の抽出 培養液の遠心分離 (4,000 rpm 、10分、４℃) 後、細菌細胞を１mM EDTA 、0.
2M NaCl および0.05％Tween 20を含有するpH8.5 の50mMトリス-HCl緩衝液に再懸
濁する。不溶性成分、すなわち封入体をリゾチーム処理 (0.5 ｇ／リットル、１
時間、室温／穏やかな攪拌) した後に得る。遠心分離 (15分、10,000ｇ、４℃)
により得られた封入体のペレットを、５mM MgCl2を含有するpH8.5 の25mMトリス
-HCl緩衝液中にとり、次いで遠心分離する (15分、10,000ｇ) 。
【００５３】 封入体を、７M グアニジン塩酸塩 (変性剤) および10mMジチオスレイトール (
ジスルフィド架橋の還元) を含有するpH8.5 の25mMトリス-HCl緩衝液中に２時間
かけて37℃で可溶化する。遠心分離 (15分、10,000ｇ) により不溶性粒子の除去
が可能となる。
【００５４】 次に、上清をNaCl (8.76ｇ/l) およびZwittergent 3-14 (0.1 ％,w/v) を含有
するpH8.5 の25mMトリス-HClの13体積中に再懸濁する。溶液を空気に接触させな
がら穏やかに攪拌して室温に一晩放置する。 B)P40G2Na 融合タンパク質の精製 −陰イオン交換クロマトグラフィー工程 さらに遠心分離した後、溶液を0.1 ％Zwittergent 3-14を含有するpH10.5の20
mMエタノールアミン-HCl緩衝液で４℃において一晩透析する (緩衝液100 体積)
。
【００５５】 透析物を、上記緩衝液で平衡状態にした強力な陰イオン交換型 (Amersham Pha
rmacia Biotech Source Q gel)の支持体を含むカラム上に流し、P40G2Na タンパ
ク質を、同じ緩衝液中のNaClの勾配により溶離する。タンパク質を 280nmで検出
する。 −陽イオン交換クロマトグラフィー工程 P40G2Na タンパク質を含む画分を混合し、約100ml の量についてはYM10- 型Di
aflo膜 (10kDa カットオフしきい値) を用いて攪拌しながらAmicon cell system
の補助により、またはより多量の場合は10kDa カットオフしきい値を有する膜プ
レートを用いてMillipore Minitan 接線流れ濾過 (tangential flow filtration
) システムの補助により、超遠心分離により濃縮する。こうして濃縮した画分を
0.1 ％Zwittergent 3-14を含有するpH8.0 の20mMトリス-HCl緩衝液に対し４℃で
一晩透析する。
【００５６】 透析物を、上と同じ緩衝液中で平衡状態にした強力な陽イオン交換型 (Amersh
am Pharmacia Biotech Source S gel)の支持体を含むカラム上に流し、P40G2Na
タンパク質を、同じ緩衝液中のNaClの勾配により溶離する。関心ある画分を混合
し、上記のシステムの１つを用いて超遠心分離する。
【００５７】
【実施例６】P40-G5を得るための化学結合 A)P40-G5Cysa複合体の合成および特性決定 −G5aCysおよびCysG5aペプチドの合成 配列番号５により表されるG5a ペプチドはRSV-A Ｇタンパク質のaa144-aa159
断片に対応する16アミノ酸のペプチドである。これは、Ｃ末端側から開始しＮ末
端側への固相化学合成により得られる。それぞれ配列番号６および配列番号７で
表されるCysG5aおよびG5aCysペプチドは、それぞれＮまたはＣ末端側にシステイ
ンが付加した上記ペプチドに相当し、付加したシステインは担体タンパク質に１
つずつ結合させることを可能にする。
【００５８】 これらのペプチドはＣ末端側からＮ末端側に自動固相ペプチド合成機を用いて
合成された (0.1, 0.25 または1.0mmol 規模のFMOC化学) 。CysG5aペプチドは、
開裂の後Ｃ末端側に遊離酸官能基を得ることを可能にする、HMP 型の樹脂、ある
いは開裂の後Ｃ末端側にアミド官能基を得ることを可能にする、RinkアミドMBHA
型の樹脂上に予め装入したプロリンを用いて合成される。G5aCysペプチドの合成
は樹脂の一方または他方に予め装入たシステインから始まる。使用するアミノ酸
の側鎖の反応性官能基は、FMOC化学に適合する基 [Cys(Trt); Arg(Pmc); Asn(Tr
t); Gln(Trt); Lys(Boc); Ser(tBu); Thr(tBu)] によって保護される。結合サイ
クルは次のように生じる：ピペリジンを用いた第１のアミノ酸のＮ末端アミン官
能基の脱保護、HBTU/HMPを用いた結合すべき第２のアミノ酸の酸官能基の活性化
および結合。合成の最後に、ペプチドを樹脂から切り離し、側鎖を水/TFA混合物
との反応により脱保護する。ペプチドを予め-40 ℃に冷却したエーテルで沈殿さ
せ、混合物を遠心分離する。ペレットをエーテルで３回洗浄し、窒素下で乾燥さ
せる。ペレットを0.1 ％TFA を含む水にとる。懸濁液を再遠心分離し、ペプチド
を含む上清を、樹脂を含むペレットより分離する。粗製ペプチドをセミプレパラ
ティブ逆相HPLCにより精製する。精製したペプチドの均質性は逆相HPLCおよび毛
細管電気泳動 (FZCE) により実証される。理論的構造は、ES-MS 型の質量分析法
により測定された質量と、理論的アミノ酸配列から計算した質量との適合性の比
較により確認される。
【００５９】 ・CysG5aNH2 ペプチド −合成： 合成終了時の理論的ペプチド- 樹脂重量： 593mg 窒素下での乾燥後の測定重量： 619mg ペプチド- 樹脂開裂および粗製ペプチドの分析： 200mg(バッチの1/3) 凍結乾燥後の開裂粗製ペプチドの質量： 84mg (ペプチドの正味量の 75％、すなわち97％収率) 粗製ペプチドの均質性： 97％(RP-HPLC;UV 210 NM) 97％(FZCE/Microcoat TM) 精製： 凍結乾燥後の精製ペプチドの質量： 50mg( ペプチドの正味量の 75％、すなわち収率58％) 特性決定： 精製ペプチドの均質性： ＞99％(RP-HPLC;UV 210 NM) ＞99％(FZCE/Microcoat TM; UV 200nm) 質量分析(ES-MS) 計算質量： 1951.29 Da 測定質量： 1950.80 Da±0.31
【００６０】 −略語： AAまたはaa：アミノ酸； Boc： tert-ブトキシカルボニル； BHA：ブロモヒドロ
キシスクシンイミジルアシッド； CE ：毛細管電気泳動； ES-MS：エレクトロス
プレー (electrospray)-質量分析； FMOC ：フルオレニルメトキシカルボニル (
fluorenylmethoxycarbonyl) ； FZCE ：フリーゾーン毛細管電気泳動 (free zon
e capillary electrophoresis)； HBTU ：2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-
1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート； HMP：p-ヒドロ
キシメチルフェノキシメチルポリスチレン； MBHA ：メチルベンズヒドリルアミ
ン； NMP：N-メチル-2- ピロリドン； Pmc：2,2,5,7,8-ペタメチルクロマン-6-
スルホニル； RP-HPLC：逆相高性能液体クロマトグラフィー； SPPS ：固相ペプ
チド合成； tBOC ：t-ブチルオキシカルボニル； tBu：tert- ブチル； TFA：ト
リフルオロ酢酸； Trt：トリチル。
【００６１】 結合に使用される方法はHaeuw et al. (Eur.J.Biochem. 255:446-454, 1998)
に記載されている。使用されるヘテロ二官能性試薬のN-ヒドロキシスクシンイミ
ド・ブロモ酢酸、すなわちHBA はブロモアセチル化によるタンパク質のリシン残
基の活性化、次いでペプチドのＣ末端位置に導入されたシステイン残基によるチ
オールを介したペプチドの結合を可能にする。
【００６２】 簡単に述べると、P40 タンパク質を0.1 ％Zwittergent 3-14を含有するpH7.0
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で４℃において一晩透析する。透析されたタンパ
ク質を次いで HBA試薬を用いて活性化する。これをP40 １mgに対して1.2mg ( ジ
メチルホルムアミド10μｌ中) 添加し、次いで全混合物を攪拌しながら室温にお
いて１時間暗中に放置する。活性化P40 をファルマシアセファデックスG25 担体
上の分子ふるいクロマトグラフィーにより脱塩処理する。タンパク質を0.1 ％Zw
ittergent 3-14を含有するpH7.0 の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液を用いて溶離す
る。活性化P40 を含む画分をプールする。結合のために、ペプチド (上記緩衝液
に10mg/ml 濃度)0.4mgをP40(約５mg/ml 濃度) １mgに添加する。アルゴン気流下
での溶液の飽和後、全混合物を攪拌しながら室温に暗中に２時間放置する。次い
で、複合体を、SDS-PAGEによる特性決定および分析の前に、0.1 ％Zwittergent
3-14を含有するpH7.0 の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で＋４℃において24時間透
析する。
【００６３】 結合したペプチドの数を、酸加水分解およびPITC (Waters PicoTag法) を用い
る誘導の後、HPLCによりアミノ酸を分析することにより測定する。Kolodny and
Robey (Anal.Biochem. 187:136-140, 1990) に記載の方法による、放出されたカ
ルボキシメチルシステイン残基の定量により、P40 タンパク質１モルにつき結合
しているG5Cysaペプチドのモル数を正確に決定することが可能となる。この値は
通常５〜10 G5Cysa/P40 の間である。
【００６４】
【実施例７】 P40G2Naでの免疫後の抗体応答 P40G2NaをG2Na (RSV Ｇタンパク質aa130-230 由来の抗原) として40μｇの用
量で、Klebsiella pneumoniae の２回の鼻内投与により予め感作されていても感
作されていなくてもよいBALB/cマウスに10日間隔で鼻内 (i.n.) に３回投与した
。この予備感作の目的は、この気道の病原体にヒトがしばしば出会い、その結果
基礎的な抗ｒP40 力価を有する場合、このヒトの状況を自然に模倣することであ
る。
【００６５】 意外にも、図2Aは融合タンパク質のi.n.投与後のG2Naに対する高い血清IgG 力
価を実証している。この力価はKlebsiella pneumoniae で予備感作した動物にお
いて顕著により高く、また、CTB(コレラ毒素サブユニットＢ) を融合タンパク質
に添加すると応答の強さおよびその均質性を改善する。血清IgG 応答のアイソタ
イプの判別 (アイソタイピング,isotyping)(図2Bおよび2C) により、CTB が存在
しない場合主にIgG1応答であり、Klebsiella pneumoniae で感作されたマウスに
おいてはIgG1およびIgG2a 力価が増加することが実証される (図2C) 。予備感作
のアイソタイピングに対する効果は、CTB が融合タンパク質に添加されるともは
や目立たなくなる。抽出源のCTB (Sigma, 米国、ミズーリー州、セントルイス)
は痕跡量のCTA(コレラ毒素サブユニットＡ) も含有しており、これは抗体応答の
誘導を担う毒素成分である。この一組のデータは、rP40タンパク質に融合され鼻
内投与された場合のG2Naペプチドの免疫原性を実証している。
【００６６】
【実施例８】P40-G5で免疫後の抗体応答 抗体応答は、G5と称されるRSV Ｇタンパク質由来の純粋なＢエピトープ (Plot
nicky-Gilquin et al., J.Virol.73-5637, 1999)を用いても評価された。
【００６７】 予想通り、G5ペプチドは単独または CTBの存在下では免疫原性をもたない。意
外にも、G5ペプチドはrP40タンパク質に結合してi.n.投与された場合に免疫原性
である (図3A) 。Klebsiella pneumoniae でのマウスの予備感作 (図3B) は、抗
G5血清IgG 応答を実質的に改善する。
【００６８】
【実施例９】P40G2Na での免疫および RSV攻撃後の防御 免疫応答の防御に関する質を評価するために、BALB/cマウスをP40G2Na ハイブ
リッドタンパク質で免疫し、次いでRSV-Ａをi.n.感染させた。
【００６９】 図4Aは、rP40担体タンパク質単独の投与は、 CTBを添加してまたは添加せずに
i.n.投与しても、マウスのRSV-Ａ感染に何ら効果を及ぼさないことを示している
。有利にも、Klebsiella pneumoniae で感作されていないマウスにP40G2Na 融合
タンパク質を投与すると、マウス６匹中５匹について２log10 のウイルス力価の
減少を生じた。予想外にも、Klebsiella pneumoniae でのマウスの感作は肺領域
の防御を顕著に改善した。
【００７０】 鼻領域の防御に関しては (図4B) 、Klebsiella pneumoniae での予備感作の寄
与は CTBが存在してもしなくても特に明瞭である。このKlebsiella pneumoniae
での予備感作の重要性は、予備感作されたマウスでの IgG応答のより高い均質性
により、またこれらの動物での局所的IgA 型応答における増加 (データ示さず)
により説明されるかもしれない。
【００７１】 これらの実験データは、 P40担体タンパク質に融合されたRSV Ｇタンパク質由
来の組換えサブユニットタンパク質の粘膜投与が動物の肺領域およびおよび鼻領
域の両方を防御することを初めて実証するものである。
【００７２】
【実施例10】P40-G5での免疫および RSV攻撃後の防御 有利にも、図5Aは、rP40に結合したG5ペプチドの経鼻投与がRSV-A 感染に対し
てマウスの肺におけるウイルス血症を顕著に減少 (p ＜0.05) させることを示す
。上気道の防御に関しては (図5B) 得られた結果は、P40-G5で免疫した動物はRS
V-A 感染後のウイルス血症が減少し、これはKlebsiella pneumoniae での予備感
作した場合に特に顕著である (p ＜0.05) ことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 配列番号２の組換えP40 タンパク質 (rP40)(37kDa)、順に減少している分子サ
イズマーカー(M) (200、116 、97.4、66、45、31および21.5kDa)、および配列番
号４の配列のP40G2Na タンパク質 (49kDa)の変性条件下での12％ SDS PAGE ゲル
。
【図２Ａ〜２Ｃ】 rP40に融合した配列番号９の配列のG2Naタンパク質40μｇを３回鼻腔内(i.n.)
投与した、自然のマウスまたはKlebsiella pneumoniae で予備感作したマウスに
おける全身性IgG 応答の評価 (図2A) 、および自然のマウス (図2B) またはKleb
siella pneumoniae で予備感作したマウス (図2C) における血清IgG のアイソタ
イピング。
【図３Ａおよび３Ｂ】 BALB/cマウスにi.n.投与したP40-G5複合体の免疫原性。rP40に結合したG5相当
物10μｇを自然のマウス (図3A) またはKlebsiella pneumoniae で予備感作した
マウス (図3B) に10日間隔で３回投与する。最後の免疫から10日後に動物より血
液を採取し、G5に対する血清IgG の力価をELISA で測定する。
【図４Ａおよび４Ｂ】 P40G2Na 融合タンパク質によるBALB/cマウスの免疫後の上気道 (図4A) および
下気道 (図4B) の防御の検討。
【図５Ａおよび５Ｂ】 P40G5 複合体によるBALB/cマウスの免疫後の上気道 (図5A) および下気道 (図
5B) の防御の検討。
【配列表】

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 RSウイルス (respiratory syncytial virus,RSV)由来の免疫
    原性ペプチドと組み合わせた腸内細菌OmpAタンパク質またはその断片を、経鼻投
    与可能な、 RSV感染に対して個体の上気道及び／又は下気道 (肺) を防御する免
    疫応答を引き起こすための薬剤組成物を製造するのに使用すること。
  2. 【請求項２】 前記腸内細菌がクレブシエラ・ニューモニアエ (Klebsiella
    pneumoniae)であることを特徴とする請求項１記載の使用。
  3. 【請求項３】 前記OmpAタンパク質またはその断片のアミノ酸配列が以下を
    含むことを特徴とする、請求項２記載の使用： a)配列番号２ (SEQ ID No.２) のアミノ酸配列； b)最適の整列後、配列番号２の配列と少なくとも80％の同一性を有する配列のア
    ミノ酸配列；または c)配列番号２の配列の少なくとも10の連続したアミノ酸の断片のアミノ酸配列。
  4. 【請求項４】 前記OmpAタンパク質またはその断片が、前記腸内細菌の細胞
    から抽出する方法を用いて得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか
    の項記載の使用。
  5. 【請求項５】 前記腸内細菌OmpAタンパク質もしくはその断片、または前記
    免疫原性ペプチドが組換え体経路により得られることを特徴とする、請求項１〜
    ３のいずれかの項記載の使用。
  6. 【請求項６】 前記免疫原性ペプチドが RSVのＧ、Ｆ、M2またはＮタンパク
    質由来のペプチドから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの
    項記載の使用。
  7. 【請求項７】 前記免疫原性ペプチドがＧタンパク質由来のペプチドである
    ことを特徴とする、請求項６記載の使用。
  8. 【請求項８】 前記免疫原性ペプチドが、Ｂ型エピトープを含むＧタンパク
    質の断片であることを特徴とする、請求項７記載の使用。
  9. 【請求項９】 前記免疫原性ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番
    号７、配列番号９もしくは配列番号11の配列、または配列番号５、配列番号６、
    配列番号７、配列番号９もしくは配列番号11の配列と最適の整列後に少なくとも
    80％の同一性を有する配列のペプチドから選択されることを特徴とする、請求項
    ７記載の使用。
  10. 【請求項10】 薬剤組成物が、前記腸内細菌OmpAタンパク質もしくはその断
    片または前記免疫原性ペプチドをコードする核酸作製物を含み、該核酸作製物は
    前記腸内細菌OmpAタンパク質及び／又は前記免疫原性ペプチドを発現しうる発現
    ベクターまたは形質転換宿主細胞中に含まれていることを特徴とする、請求項１
    〜９のいずれかの項記載の使用。
  11. 【請求項11】 前記免疫原性ペプチドが、共有連結により、前記OmpAタンパ
    ク質またはその断片に結合され、ハイブリッドタンパク質を形成していることを
    特徴とする、請求項１〜10のいずれかの項記載の使用。
  12. 【請求項12】 共有連結による結合が化学合成により生成した結合であるこ
    とを特徴とする、請求項11記載の使用。
  13. 【請求項13】 化学的結合を容易にするために、１または２以上の連結要素
    が前記OmpAタンパク質もしくはその断片中に、及び／又は前記免疫原性ペプチド
    中に導入されていることを特徴とする、請求項12記載の使用。
  14. 【請求項14】 前記導入された連結要素がアミノ酸であることを特徴とする
    、請求項13記載の使用。
  15. 【請求項15】 前記ハイブリッドタンパク質が、該ハイブリッドタンパク質
    をコードする核酸作製物で形質転換された細胞により発現される融合タンパク質
    であることを特徴とする、請求項11記載の使用。
  16. 【請求項16】 前記薬剤組成物が、前記ハイブリッドタンパク質をコードす
    る核酸作製物、特に該ハイブリッドタンパク質を発現しうる発現ベクター中また
    は形質転換宿主細胞中に含まれる核酸作製物を含有することを特徴とする、請求
    項15記載の使用。
  17. 【請求項17】 前記薬剤組成物が、その安定性及び／又は免疫原性を改善す
    ることを可能にする形態でビヒクル化 (vehiculate) されることを特徴とする、
    請求項１〜16のいずれかの項記載の使用。
  18. 【請求項18】 前記ビヒクルが、リポソーム、前記OmpAタンパク質もしくは
    その断片、前記免疫原性ペプチドまたは前記ハイブリッドタンパク質をコードす
    る核酸作製物を含むウイルスベクター、あるいは前記OmpAタンパク質もしくはそ
    の断片、前記免疫原性ペプチドまたは前記ハイブリッドタンパク質を発現しうる
    形質転換宿主細胞であることを特徴とする特徴とする、請求項17記載の使用。
  19. 【請求項19】 RSV感染症を予防または治療するための薬剤組成物、特にワ
    クチン組成物を製造するための、請求項１〜18のいずれかの項記載の使用。
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