WO2001021203A9 - Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale - Google Patents

Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale

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    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates to the use of an enterobacterium membrane protein OmpA, in particular the protein P40 of Klebsiella pneumoniae, associated with an immunogenic peptide derived from respiratory syncytial virus (RSV) for the preparation of a pharmaceutical composition which can be administered by the nasal spray intended to induce a protective immune response of the upper respiratory tract and the lower respiratory tract (lungs) of a subject against infection by RSV.
  • OmpA enterobacterium membrane protein
  • RSV respiratory syncytial virus
  • the invention includes the use of these compounds for the preparation of a vaccine for the prevention and treatment of RSV infection.
  • RSV is the most common cause of hospitalization of infants under one year of age for acute respiratory infections. Children with laryngotracheobronchitis, bronchiolitis and pneumonia require hospital care and in infants with congenital heart disease, the death rate is over 37%. Other disorders such as bronchopulmonary dysplasia, kidney disease and immunodeficiency are all factors responsible for high mortality. RSV infections can also be a cause of death in the elderly.
  • RSV epidemic occurs during the winter period from November to April and the greatest incidence of serious illness occurs in infants 2 to 6 months of age.
  • RSV-A and RSV-B by the antigenic variation of the glycoprotein G of RSV: subgroup A and subgroup B, which circulate concurrently.
  • subgroup A and subgroup B which circulate concurrently.
  • a recent study in France from 1982 to 1990 showed an alternation from one subgroup to another over a period of 5 years.
  • Strain A is often the cause of more serious infections than strain B.
  • Human RSV belongs to the genus pneumovirus, a member of the family of
  • the virus genome consists of a strand of RNA with negative polarity, not segmented, coding for 10 distinct proteins: NS1, NS2, N; P, M, SH (or IA), G, F, M2 (or 22K) and L (Murphy et al., Virus Res. 32: 13-36, 1994).
  • the fusion glycoprotein F synthesized as a precursor FO is split into two subunits F1 (48 kDa) and F2 (20 kDa) linked by disulfide bridges. Protein F is conserved between VRS-A and VRS-B (91% homology). Conversely, the attachment glycoprotein G is very variable from one subgroup to another. Only one region of 13 amino acids (aa164-aa176) is highly conserved and in particular the position of four cysteine residues (173, 176, 182 and 186) is kept constant in all human and bovine RSVs. It has been shown in animal models that the two glycoproteins F and G play a major role in protection against RSV.
  • the monoclonal antibodies directed against G and F are capable of neutralizing the virus in vitro and passively administered, they protect the cotton rat against infection by RSV.
  • conventional vaccines that is, formalin-inactivated RSV, analogous to measles and measles vaccines, failed. Instead of providing protection in vaccinated children, this type of vaccine has the effect of potentiating natural viral disease.
  • Current treatments for worsening RSV disease in infants are airway congestion relief by aspiration of phlegm and respiratory assistance by ventilation.
  • An antiviral, Ribavirin seems to be effective in severely affected cases. However, its use in pediatric therapy is still poorly defined.
  • Passive immunization with anti-RSV immunoglobulins is an alternative route in the treatment of serious RSV infections: no undesirable side effects have been observed. However, this type of treatment is very expensive and difficult to extrapolate on a large scale.
  • the present invention relates to the use of an enterobacterium protein OmpA, or one of its fragments, associated with an immunogenic peptide derived from the respiratory syncytial virus (RSV) for the preparation of an administrable pharmaceutical composition.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • said induced immune response protects both the upper respiratory tract and the lower respiratory tract (lungs) of a subject against infection by RSV.
  • protein will also be understood to denote the peptides or polypeptides and the term “OmpA” (for “Outer Membrane Protein”), the proteins of the outer membrane of type A.
  • fragment of an OmpA protein is intended to denote in particular any fragment of the amino acid sequence included in the amino acid sequence of the OmpA protein which, when associated with an RSV immunogenic peptide, optionally in the presence an immunity adjuvant, is capable of generating or increasing an antibody-type immune response directed against said immunogenic peptide, said fragment of the OmpA protein comprising at least 10 consecutive amino acids, preferably at least 15 consecutive amino acids or more preferably at least 20 consecutive amino acids of the amino acid sequence of said OmpA protein.
  • immunogenic peptide derived from the respiratory syncytial virus is intended to denote in particular any peptide whose amino acid sequence comprises at least 5 consecutive amino acids, preferably at least 10 or 15 consecutive amino acids of the sequence of a protein. expressed by the VRS, said peptide comprising in its sequence an antigenic determinant or epitope capable of inducing an antibody-type immune response (dependent B lymphocytes) exerted against said “B” epitope, in particular in the presence of said OmpA protein or one of its fragments, in an organism previously immunized with said immunogenic peptide
  • the invention comprises the use according to the invention, characterized in that said enterobacterium is Klebsiella pneumomae.
  • a subject of the invention is also the use according to the invention, characterized in that the amino acid sequence of said OmpA protein, or one of its fragments, comprises a) the amino acid sequence of sequence SEQ ID No. 2, b) the amino acid sequence of a sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, 95% or 97%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID N ° 2, or c) the amino acid sequence of a fragment of at least 10 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No. 2.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the regions. local sequence magnetization.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences by "comparison window" in which the region of the sequence of nucleic acid or amino acids to be compared can include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • the invention comprises the use of an enterobacterium OmpA protein or of a fragment thereof according to the invention, characterized in that said enterobacterium OmpA protein, or one of its fragments, is obtained by an extraction process from a culture of said enterobacterium.
  • the invention also comprises the use of an enterobacterium OmpA protein or of a fragment thereof according to the invention, characterized in that said enterobacterium OmpA protein, or the one of its fragments, or said immunogenic peptide is obtained recombinantly.
  • the invention relates to the use according to the invention, characterized in that said immunogenic peptide is chosen from peptides derived from protein G, F, M2 or N of RSV, preferably protein G.
  • said immunogenic peptide is a fragment of protein G comprising a type B epitope.
  • type B epitope included in a fragment of the G protein of RSV is intended to denote in particular an amino acid sequence of at least 5, 10 or 15 consecutive amino acids of a fragment of the G protein capable to induce an antibody-type immune response (dependent B lymphocytes) directed against said amino acid sequence, in particular in the presence of the OmpA P40 protein of sequence SEQ ID No. 1.
  • said immunogenic peptide is chosen from the peptides of sequence SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 9 or SEQ ID No 11, or of amino acid sequence having an identity percentage of at least 80%, preferably 90%, 95% or 97%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID N ° 5, SEQ ID N ° 6 , SEQ ID N ° 7, SEQ ID N ° 9 or SEQ ID N ° 11.
  • the present invention also relates to the use according to the invention, characterized in that said immunogenic peptide is coupled or mixed with said enterobacterium protein OmpA, or one of its fragments.
  • the invention relates to the use according to the invention, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a nucleic construct coding for said enterobacterium protein OmpA, or one of its fragments, and / or a nucleic construct coding for said immunogenic peptide, said nucleic construct being contained in an expression vector or in a transformed host cell capable of expressing said enterobacterium OmpA protein, or one of its fragments, and / or said peptide immunogenic.
  • the invention also includes the use according to the invention, characterized in that said immunogenic peptide is coupled by covalent bond, in particular by chemical coupling, with said OmpA protein or one of its fragments, to form a hybrid protein.
  • the use according to the invention is characterized in that one or more binding elements are introduced into said OmpA protein, or one of its fragments, and / or into said immunogenic peptide for facilitate chemical coupling, preferably, said connecting element introduced is an amino acid.
  • the invention it is possible to introduce one or more binding elements, in particular amino acids to facilitate the coupling reactions between the OmpA protein, or one of its fragments, and said immunogenic peptide.
  • the covalent coupling between the OmpA protein, or one of its fragments, and said immunogenic peptide according to the invention can be carried out at the N- or C-terminal end of the OmpA protein, or one of its fragments.
  • the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined as a function of the end of the OmpA protein, or one of its fragments, chosen to effect the coupling and of the nature of said immunogenic peptide to be coupled.
  • the use according to the invention is characterized in that the hybrid protein formed by covalent coupling between said immunogenic peptide and said OmpA protein, or one of its fragments, is an expressed fusion protein by a cell transformed with a nucleic construct coding for said hybrid protein.
  • the hybrid proteins resulting from covalent coupling between said immunogenic peptide and said OmpA protein, or one of its fragments can be prepared by genetic recombination.
  • the hybrid or chimeric protein can be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for said OmpA protein, or one of its fragments, of a sequence coding for said immunogenic peptide.
  • the methods for synthesizing hybrid molecules include the methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the desired polypeptide sequences.
  • the invention is characterized in that said enterobacterium protein OmpA, or one of its fragments, and said immunogenic peptide derived from the respiratory syncytial virus used for the preparation of a pharmaceutical composition administered by nasal route according to the invention. are in the form of a hybrid protein obtained by covalent coupling, by chemical synthesis or by genetic fusion, between the p40 protein of Klebsiella pneumoniae of sequence SEQ ID No.
  • amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, 95% or 97% after optimal alignment with the sequence SEQ ID No 2, and the immunogenic peptide derived from the RSV of sequence SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 9, SEQ ID No 11, or sequence amino acids with an identity percentage of at least 80%, preferably 90%, 95% or 97%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID N ° 5, SEQ ID N ° 6, SEQ ID N ° 7, SEQ ID N ° 9 ⁇ or SEQ ID N ° 11.
  • the invention also relates to the use according to the invention, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a nucleic construct coding for said hybrid protein, in particular contained in an expression vector, or in a host cell transform containing said nucleic construct capable of expressing said hybrid protein.
  • OmpA in particular P40 from K. pneumoniae, associated in particular by covalent bond to an immunogenic peptide derived from RSV, has the surprising property of potentiating the immune response for some of these immunogenic peptides without it being necessary to resort to the addition of an adjuvant.
  • said pharmaceutical composition will optionally comprise an immunity adjuvant.
  • the invention also includes the use according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity, in particular encapsulated in a liposome.
  • the invention comprises the use according to the invention, characterized in that said vehicle is a viral vector containing a nucleic construct coding for said protein OmpA, or one of its fragments, for said immunogenic peptide, or for said hybrid protein, or a transformed host cell containing said nucleic construct capable of expressing said OmpA protein, or one of its fragments, said immunogenic peptide, or said hybrid protein.
  • said vehicle is a viral vector containing a nucleic construct coding for said protein OmpA, or one of its fragments, for said immunogenic peptide, or for said hybrid protein, or a transformed host cell containing said nucleic construct capable of expressing said OmpA protein, or one of its fragments, said immunogenic peptide, or said hybrid protein.
  • said transformed host cell is a bacterium which is not pathogenic for mammals and said nucleic construct which it contains further comprises the elements necessary for the secretion or the expression on the surface of the membrane of said bacteria of said protein. OmpA, or a fragment thereof, of said immunogenic peptide, or of said hybrid protein.
  • the present invention relates to the use according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition, in particular a vaccine composition, intended for preventing or treating infections with RSV.
  • a pharmaceutical composition in particular a vaccine composition, intended for preventing or treating infections with RSV.
  • the examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope.
  • Figure 1 SDS PAGE 12% gel under denaturing conditions of the recombinant P40 protein (rP40) of sequence SEQ ID No. 2 (37 Kda), molecular size markers (M) in decreasing order (200, 116, 97.4, 66, 45, 31, 21.5 Kda), and of the protein P40G2Na of sequence SEQ ID No. 4 (49 Kda).
  • rP40 recombinant P40 protein
  • M molecular size markers
  • Figures 2A to 2C Evaluation of the systemic IgG response (Figure 2A) and isotyping of serum IgG in naive mice ( Figure 2B) or presensitized with Klebsiella pneumoniae (Figure 2C), having received 3 administrations intra-nasally (in) 40 ⁇ g of G2Na protein of sequence SEQ ID No. 9 fused to rP40.
  • Figures 3A and 3B Immunogenicity of the P40-G5 conjugates, administered i.n. to BABL / c mice. 10 ⁇ g of G5 equivalents coupled to rP40 are administered 3 times, 10 days apart, to naive (FIG. 3A) or presensitized (FIG.
  • FIG. 3B mice by Klebsiella pneumoniae. 10 days after the last immunization, the animals are punctured and the serum IgG directed against G5 assayed by ELISA.
  • Figures 4A and 4B Study of the protection of the upper ( Figure 4A) and lower ( Figure 4B) pathways after immunization of BALB / c mice with the fusion protein P40G2Na.
  • FIGS. 5A and 5B Study of the protection of the lower (FIG. 5A) and upper (FIG. 5B) pathways after immunization of BABL / c mice with the P40-G5 conjugate.
  • the DNA encoding the P40 protein was obtained by PCR amplification from the genomic DNA of Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et al., Gene 210: 93-101, 1998).
  • the gene fragment coding for P40 is inserted into various expression vectors, in particular a vector under the control of the promoter of the Trp operon: pvaLP40 (5.7 Kpb).
  • the nucleotide sequence and the peptide sequence of the P40 protein are represented respectively by the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
  • a producing strain £. coli K12 was transformed with an expression vector pvaLP40 (5.7 Kbp).
  • the rP40 protein is produced under form of inclusion body with a high yield (> 10%, g of protein / g of dry biomass). This example is only an illustration of the expression of the rP40 protein, but it can be extended to other bacterial strains as well as other expression vectors.
  • EXAMPLE 2 Cloning of the DNA Coding for the P40G2Na Protein
  • the DNA coding for the G2Na fragment of sequence SEQ ID No. 9 of the protein G of VRS-A was obtained by assembling synthetic oligonucleotides on solid supports (Dynal magnetic beads, Oslo) as described by Nguyen et al. (M. Uhlen, E. Homes, and O. OIsvik (eds.), Advances in biomagnetic separation. Eaton Publishing Co., Natick, p. 73-78, 1994), the oligonucleotides were designed and optimized with the usual codon from Escherichia coli.
  • the G2Na DNA was cloned into the vector pvaLP40 described in Example 1, the resulting expression vector is named pvaLP40G2Na (6 Kpb).
  • the nucleotide sequence and the peptide sequence of P40G2Na are represented respectively by the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4.
  • the description of the following fermentation process is applicable to the expression of the rP40 protein and that of the P40G2Na protein.
  • the culture conditions are given by way of example and can be optimized to obtain a better yield of expressed proteins.
  • the inoculation is carried out with the recombinant E. coli strain described above in an Erlenmeyer flask containing 250 ml of TSB medium (Tryptic Soy Broth, Difco) containing Ampicillin (100 ⁇ g / ml, Sigma) and Tetracyciine ( 8 ⁇ g / ml, Sigma), which is incubated overnight at 37 ° C. Then 2 liters of culture medium in a fermenter (Biolafitte, France) are seeded using 200 ml of the culture previously obtained.
  • TSB medium Troptic Soy Broth, Difco
  • Ampicillin 100 ⁇ g / ml, Sigma
  • Tetracyciine 8 ⁇ g / ml, Sigma
  • the culture medium can be composed of chemical agents, supplemented with vitamins, yeast extracts, known to have a high density growth of bacterial cells, as described by Nguyen et al. (Gene 210: 93-101, 1998).
  • the parameters controlled during fermentation are: pH, agitation, temperature, oxygenation rate, feeding of combined sources (Glycerol or Glucose).
  • the pH is regulated at 7.0, the temperature is fixed at 37 ° C.
  • Growth is controlled by supplying glycerol (87%) at a constant flow rate (12 ml / h) to maintain the voltage signal for dissolved oxygen at 30%.
  • the cells After centrifuging the culture broth (4000 rpm, 10 min, 4 ° C), the cells are resuspended in a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5.
  • the insolubles or inclusion bodies are obtained after treatment with lysozyme (0.5 g / liter, 1 hour at room temperature / gentle stirring).
  • the inclusion body pellet obtained by centrifugation (15 min at 10,000 g at 4 ° C) is taken up in 25 mM Tris-HCl buffer at pH 8.5 and 5 mM MgCl 2 , then centrifuged (15 min at 10 000 g).
  • the inclusion bodies at 37 ° C. are dissolved for 2 hours in a buffer
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong anion exchanger type (Biorad Macro Prep High Q gel) balanced in the buffer described above at a linear flow rate of 15 cm / h. Proteins are detected at 280 nm.
  • the protein rP40 is eluted, with a linear flow rate of 60 cm / h, for a concentration of 0.2 M in NaCl in the 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 at 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the fractions containing the rP40 protein are mixed and concentrated by ultrafiltration using an Amicon shaking cell system used with a Diaflo membrane type YM10 (cutoff threshold 10 kDa) for volumes of the order of 100 ml, or using a Minitan Millipore tangential flow filtration system used with membrane plates having a cutoff threshold of 10 kDa for higher volumes.
  • the fraction thus concentrated is dialyzed overnight at 4 ° C. against a 20 mM citrate buffer pH 3.0 containing 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong cation exchanger type (Biorad Macro Prep High S gel) balanced in the 20 mM citrate buffer pH 3.0 containing 0.1% of Zwittergent 3-14.
  • the rP40 protein is eluted (speed 61 cm / h) for a 0J M NaCl concentration.
  • the bacteria cells After centrifuging the culture broth (4000 rpm, 10 min, 4 ° C), the bacteria cells are resuspended in a 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing 1 mM EDTA, 0.2 M NaCl and 0 , 05% Tween 20.
  • the insolubles or inclusion bodies are obtained after treatment with lysozyme (0.5 g / liter, 1 hour at room temperature / gentle stirring).
  • the inclusion body pellet obtained by centrifugation (15 min at 10,000 g at 4 ° C) is taken up in a 25 mM Tris-HCl buffer at pH 8.5 containing 5 mM MgCl2, then centrifuged (15 min at 10,000 g).
  • the inclusion bodies are dissolved at 37 ° C for 2 hours in a buffer
  • the supernatant is then resuspended in 13 volumes of 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing NaCl (8.76 g / 1) and Zwittergent 3-14 (0.1%, w / v). The solution is left overnight at room temperature with gentle stirring in contact with air.
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of strong anion exchanger type (Amersham Pharmacia Biotech Source Q gel) equilibrated in the buffer described above, and the P40G2Na protein is eluted using a NaCl gradient. in the same buffer. Proteins are detected at 280 nm.
  • the fractions containing the P40G2Na protein are mixed and concentrated by ultrafiltration using an Amicon shaking cell system used with a Diaflo membrane of the YM10 type (cutoff threshold 10 kDa) for volumes of the order of 100 ml. , or using a Minitan Millipore tangential flow filtration system used with membrane plates having a cutoff threshold of 10 kDa for higher volumes.
  • the fraction thus concentrated is dialyzed overnight at 4 ° C. against a 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0% Zwittergent 3-14.
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong cation exchanger type (Amersham Pharmacia Biotech Source S gel) equilibrated in the preceding buffer, and the P40G2Na protein is eluted using an NaCl gradient in the same buffer. .
  • the fractions of interest are mixed before being concentrated by ultrafiltration using one of the systems described above.
  • Example 6 Chemical coupling to obtain P40-G5 A) Synthesis and characterization of the P40-G5Cvsa conjugate - Synthesis of the peptides G ⁇ aCys and CysG ⁇ a
  • the peptide G5a represented by the sequence SEQ ID No. 5, is a peptide of 16 amino acids which corresponds to the aa144-aa159 fragment of protein G of VRS-A. It is obtained by chemical synthesis on solid phase starting from the C side terminai towards the N-terminal side.
  • the peptides CysG ⁇ a and G5aCys represented respectively by the sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7, correspond respectively to this peptide with an additional Cysteine on the N- or C-terminal side which allows unequivocal coupling on a carrier protein.
  • the peptides were synthesized using an automatic solid phase peptide synthesizer from the C side to the N-terminal side (FMOC chemistry on the scale of 0.1; 0.25 or 1.0 mmol).
  • the synthesis of the CysG ⁇ a peptide is carried out from a Proline preloaded on a resin of HMP type, which allows after cleavage to obtain a free acid function on the C-terminal side or a resin of type Rink amide MHBA, which allows after cleavage to obtain an amide function on the C-terminal side. That of the G ⁇ aCys peptide begins with a Cysteine preloaded on one or the other of the resins.
  • a coupling cycle takes place as follows: deprotection of the N-terminal amino function of the first amino acid using piperidine, activation of the acid function of the second amino acid to be coupled using HBTU / HMP and coupling.
  • the peptide is cleaved from the resin and the side chains are deprotected by reaction with a water / TFA mixture.
  • the peptide is precipitated with ether cooled beforehand to -40 ° C and the mixture is centrifuged. The pellet is washed three times with ether and then dried with nitrogen. The pellet is taken up with water containing 0.1% TFA. The suspension is again centrifuged and the supernatant which contains the peptide is separated from the pellet, which contains the resin.
  • the crude peptide is purified by semi-preparative reverse phase HPLC. The homogeneity of the purified peptide is verified by reverse phase HPLC and by capillary electrophoresis (FZCE). The theoretical structure is confirmed by comparison of the compatibility of the mass measured by ES-MS type mass spectrometry, with the mass calculated from the theoretical amino acid sequence.
  • Mass of purified peptide after lyophilization 50 mg (7 ⁇ % net amount of peptide or 68% yield).
  • AA or aa amino acid
  • Boc Tert Butoxycarbonyl
  • BHA Bromo hydrosuccimidyl acid
  • CE Capillary Electrophoresis
  • ES-MS Electrospray - Mass Spectrometry
  • FMOC Fluorenylmethoxycarbonyl
  • FZCE Free Zone Capillary Electrophoresis
  • HBTU 2- (1 H-Benzotriazole-1-yl) -1J, 3,3-tretramethyluroniumhexafluorophosphate
  • HMP p-hydroxymethylphenoxymethyl polystyrene
  • MBHA methylbenzhydrylamine
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • Pmc 2,2,5J, 8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
  • RP-HPLC Reverse Phase - High Performance Liquid Chromatography
  • tBOC t-butyloxycarbonyl
  • tBu
  • the method used for coupling has been described by Haeuw et al. (Eur. J. Biochem. 256: 446-464, 1998).
  • the heterobifunctional reagent, N-hydroxysuccinimide bromoacetate or HBA, used allows activation of the Lysine residues of the protein by bromoacetylation, then coupling of the peptide via the thiol group carried by the Cysteine residue introduced in the C-terminal position of the peptide.
  • the P40 protein is dialyzed against a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 containing 0.1% Zwittergent 3-14 overnight at 4 ° C.
  • the dialysis protein is then activated using the HBA reagent. This is added at a rate of 1.2 mg (in 10 ⁇ l of dimethylformamide) per mg of P40, then the whole is placed under stirring for 1 hour at room temperature and in the dark.
  • the activated P40 is desalted by molecular sieving chromatography on Pharmacia Sephadex G25 support. Elution of the protein is carried out using a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 containing 0.1% Zwittergent 3-14. The fractions containing the activated P40 are combined.
  • the number of coupled peptides is determined by HPLC assay of the amino acids after acid hydrolysis and derivatization using PITC (PicoTag Waters method).
  • PITC PieroTag Waters method
  • the quantification of the carboxymethylcysteine residue released according to the method described by Kolodny & Robey makes it possible to precisely determine the number of moles of G ⁇ Cysa peptide fixed per mole of P40 protein. This value is generally between ⁇ and 10 G ⁇ Cysa / P40.
  • FIG. 2A shows an elevated serum IgG titer against G2Na following administration of the fusion protein by the in route.
  • This titer is significantly higher in animals presensitized by Klebsiella pneumoniae and the addition of CTB ( cholera toxin subunit B) to the fusion protein also improves the intensity of the response and its homogeneity.
  • Isotyping of the serum IgG response (FIGS. 2B and 2C) highlights a majority IgG1 response in the absence of CTB with an increase in the IgG1 and IgG2a titers in mice sensitized with K. pneumoniae (FIG. 2C). The effect of presensitization on isotyping is no longer perceptible when CTB is added to the fusion protein.
  • BALB / c mice are immunized with the P40G2Na hybrid protein and then infected i.n. with the RSV-A.
  • FIG. 4A shows that the administration of the carrier protein rP40 alone, administered i.n. with or without CTB has no consequence on the infection of mice with RSV-A.
  • administration of the fusion protein P40G2Na to mice not sensitized by Klebsiella pneumoniae leads to a reduction of the viral titer by 2 log 10 for ⁇ of the 6 mice.
  • sensitizing mice with Klebsiella pneumoniae significantly improves the protection of the pulmonary tract.
  • FIG. MontreA shows that the administration of the peptide G ⁇ coupled to rP40 by the nasal route causes a significant reduction in viremia (p ⁇ 0.0 ⁇ ) in the lungs of the mice against infection with RSV-A.
  • FIG. MontreA shows that the administration of the peptide G ⁇ coupled to rP40 by the nasal route causes a significant reduction in viremia (p ⁇ 0.0 ⁇ ) in the lungs of the mice against infection with RSV-A.
  • FIG. MontreA shows that the administration of the peptide G ⁇ coupled to rP40 by the nasal route causes a significant reduction in viremia (p ⁇ 0.0 ⁇ ) in the lungs of the mice against infection with RSV-A.
  • FIG. MontreA shows that the administration of the peptide G ⁇ coupled to rP40 by the nasal route causes a significant reduction in viremia (p ⁇ 0.0 ⁇ ) in the lungs of the mice against infection with RSV-A.
  • FIG. MontreA shows that the administration of the peptide G ⁇ coupled to

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae, associée à un peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale destinée à induire une réponse immunitaire protectrice de la voie respiratoire supérieure et de la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS. L'invention comprend l'utilisation de ces composés pour la préparation de vaccin destiné à la prévention et le traitement d'infection par le VRS.

Description

UTILISATION D'UNE PROTEINE DE MEMBRANE OMPA D'ENTEROBACTERIE ASSOCIEE A UN PEPTIDE IMMUNOGENE DU VRS POUR LA PREPARATION DE VACCINS ADMINISTRABLES PAR VOIE NASALE.
L'invention concerne l'utilisation d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae, associée à un peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale destinée à induire une réponse immunitaire protectrice de la voie respiratoire supérieure et de la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS. L'invention comprend l'utilisation de ces composés pour la préparation de vaccin destiné à la prévention et le traitement d'infection par le VRS.
Le VRS est la cause la plus fréquente d'hospitalisation des nourrissons de moins d'un an pour les infections respiratoires aiguës. Les enfants atteints de laryngo- trachéo-bronchites, bronchiolites et pneumonies nécessitent des soins hospitaliers et chez les nourrissons présentant des maladies cardiaques congénitales, le taux de mortalité est supérieur à 37 %. D'autres troubles comme les dysplasies bronchopulmonaires, les maladies rénales et l'immunodéficience sont autant de facteurs responsables de mortalités élevées. Les infections au VRS peuvent également être une cause de mortalité chez les personnes âgées.
Dans les pays tempérés, l'épidémie du VRS se manifeste pendant la période hivernale de novembre à avril et la plus grande incidence de sérieuses maladies survient chez les nourrissons de 2 à 6 mois. On distingue deux types de VRS : VRS-A et VRS-B par la variation antigénique de la glycoprotéine G du VRS : sous-groupe A et sous-groupe B, qui circulent concurremment. Une étude récente en France de 1982 à 1990 a montré une alternance d'un sous-groupe à l'autre sur une période de 5 ans. La souche A est souvent la cause des atteintes d'infections plus graves que la souche B.
Le VRS humain appartient au genre pneumovirus, membre de la famille des
Paramyxoviridae. Le génome du virus est constitué d'un brin d'ARN à polarité négative, non segmenté, codant pour 10 protéines distinctes : NS1 , NS2, N ; P, M, SH (ou IA), G, F, M2 (ou 22K) et L (Murphy et al., Virus Res. 32:13-36, 1994).
De nombreuses expériences publiées ont démontré que les protéines majeures impliquées dans la protection sont : F, G, et N. La glycoprotéine de fusion F synthétisée comme précurseur FO est scindée en deux sous-unités F1 (48 kDa) et F2 (20 kDa) reliées par des ponts disulfures. La protéine F est conservée entre le VRS-A et le VRS-B (91 % homologie). A l'inverse, la glycoprotéine d'attachement G est très variable d'un sous-groupe à l'autre. Seulement une région de 13 acides aminés (aa164-aa176) est hautement conservée et en particulier la position de quatre résidus cystéines (173, 176, 182 et 186) est maintenue constante chez tous les VRS humains et bovins. Il a été démontré sur les modèles animaux que les deux glycoprotéines F et G jouent un rôle majeur dans la protection contre le VRS. Les anticorps monoclonaux dirigés contre G et F sont capables de neutraliser le virus in vitro et passivement administrés, ils protègent le rat des cotonniers contre l'infection par le VRS. Dans les années 60, la tentative de mise au point de vaccins classiques, c'est-à-dire le VRS inactivé par le formol, analogue à des vaccins antirougeole et antirougeoleux, a échoué. Au lieu de conférer une protection chez l'enfant vacciné, ce type de vaccin a eu pour effet de potentialiser la maladie virale naturelle. Les traitements actuels contre l'aggravation de la maladie due au VRS chez le nourrisson sont les dégagements de l'encombrement des voies respiratoires par aspiration de mucosités et l'assistance respiratoire par ventilation. Un antiviral, la Ribavirine semble être efficace dans les cas gravement atteints. Cependant, son utilisation dans la thérapie pédiatrique est encore mal définie. L'immunisation passive avec des immunoglobulines anti-VRS est une voie alternative dans les traitements des infections graves au VRS : aucun effet secondaire indésirable n'a été observé. Néanmoins, ce type de traitement est très coûteux et difficilement extrapolable à grande échelle.
Les différentes approches de vaccination contre le VRS humain ont été entreprises : soit le vaccin protège contre l'infection du VRS chez l'animal (rongeurs, primates) mais induit une pathologie pulmonaire, soit le vaccin n'est pas assez immunogénique et ne protège pas (Connors et al., Vaccine 10:475-484, 1992). A l'état actuel, les vaccins sous-unitaires administrés par voie injectable ne peuvent conférer une protection efficace que dans les poumons et non pour la sphère ORL On peut citer notamment la demande internationale PCT de brevet publiée sous le numéro WO 96/14415 qui décrit un vaccin anti-VRS administrable par voie sous-cutanée comprenant un fragment de la protéine G du VRS couplée à la protéine P40 de la membrane externe de Klebsiella pneυmoniae ainsi que la demande internationale PCT de brevet publiée sous le numéro WO 96/14416 qui décrit un vaccin anti-VRS administrable par voie intrapéritonéale comprenant un fragment de la protéine G du VRS couplée à la protéine BB de la protéine G de Stœptococcus.
Seuls les vaccins vivants à VRS atténués administrés par la voie nasale peuvent conférer la protection de la sphère ORL. Cependant, cette approche est hasardeuse due à un éventuel risque de révertance de la souche atténuée.
Ainsi, il reste aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un vaccin administrable par voie nasale permettant d'induire une réponse protectrice contre le VRS humain dans les poumons et dans la sphère ORL.
Ceci est justement l'objet de la présente invention. Ainsi, la présente invention est relative à l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, associée à un peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale destinée à induire une réponse immunitaire protectrice de la voie respiratoire supérieure et/ou de la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS.
De préférence, ladite réponse immunitaire induite selon l'invention protège à la fois la voie respiratoire supérieure et la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « protéine » également les peptides ou les polypeptides et par le terme « OmpA » (pour « Outer Membrane Protein »), les protéines de la membrane externe de type A.
Par fragment d'une protéine OmpA, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine OmpA qui, lorsqu'il est associé à un peptide immunogène du VRS, en présence éventuellement d'un adjuvant de l'immunité, est capable de générer ou accroître une réponse immune de type anticorps dirigée contre ledit peptide immunogène, ledit fragment de la protéine OmpA comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 15 acides aminés consécutifs ou de manière plus préférée au moins 20 acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA.
Par « peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial », on entend désigner en particulier tout peptide dont la séquence d'acides aminés comprend au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 10 ou 15 acides aminés consécutifs de la séquence d'une protéine exprimée par le VRS, ledit peptide comportant dans sa séquence un déterminant antigénique ou épitope capable d'induire une réponse immune de type anticorps (lymphocytes B dépendant) dmgée contre ledit épitope « B », notamment en présence de ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, dans un organisme préalablement immunisé avec ledit peptide immunogène De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite entérobacténe est Klebsiella pneumomae.
L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 , b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 2 , ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID N° 2.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similanté de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algoπthme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algonthme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J Mol. Biol 48-443], au moyen de la méthode de recherche de similanté de Pearson et ϋpman (1988) [Proc Natl. Acad S . USA 85.2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces aigonthmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr , Madison, Wl)
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par « fenêtre de comparaison » dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
Les procédés d'extraction de protéines de membranes bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.H. ét al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).
Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, ou ledit peptide immunogène est obtenue par voie recombinante.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., 1993, Récent advances in heterologous gène expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520- 525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gène Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C.P. et Aruffo A., 1993, Cunrent applications of COS cell based transient expression Systems. Curr. Op. Biotechnology 4:558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus Systems for the expression of human gène products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572). En particulier, l'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est choisi parmi les peptides dérivés de la protéine G, F, M2 ou N du VRS, de préférence la protéine G.
Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit peptide immunogène est un fragment de la protéine G comprenant un épitope de type B.
Par « épitope de type B » compris dans un fragment de la protéine G du VRS, on entend désigner en particulier une séquence d'acides aminés d'au moins 5, 10 ou 15 acides aminés consécutifs d'un fragment de la protéine G capable d'induire une réponse immune de type anticorps (lymphocytes B dépendant) dirigée contre ladite séquence d'acides aminés, notamment en présence de la protéine OmpA P40 de séquence SEQ ID N° 1.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de la présente invention, ledit peptide immunogène est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 11, ou de séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 11.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments.
Sous un autre aspect, l'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, et/ou une construction nucléique codant pour ledit peptide immunogène, ladite construction nucléique étant contenue dans un vecteur d'expression ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, et/ou ledit peptide immunogène.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, pour former une protéine hybride.
Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit peptide immunogène pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide immunogène. Le couplage covalent entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide immunogène selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N- ou C- terminale de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit peptide immunogène à coupler.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine hybride formée par couplage covalent entre ledit peptide immunogène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est une protéine de fusion exprimée par une cellule transformée avec une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride.
Les protéines hybrides issues de couplage covalent entre ledit peptide immunogène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, peuvent être préparées par recombinaison génétique. La protéine hybride ou chimérique peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, d'une séquence codant pour ledit peptide immunogène.
Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.V. Goeddel (Gène expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990).
De préférence, l'invention est caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale selon l'invention, sont sous la forme d'une protéine hybride obtenue par couplage covalent, par synthèse chimique ou par fusion génétique, entre la protéine p40 de Klebsiella pneumoniae de séquence SEQ ID N° 2, ou de séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 2, et le peptide immunogène dérivé du VRS de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, ou de séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9 θu SEQ ID N° 11.
Sous un autre aspect, l'invention concerne en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, notamment contenue dans un vecteur d'expression, ou dans une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine hybride.
Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence qu'une telle protéine
OmpA, notamment la P40 de K. pneumoniae, associée en particulier par liaison covalente à un peptide immunogène dérivé du VRS, a la propriété surprenante de potentialiser la réponse immunitaire pour certains de ces peptides immunogènes sans qu'il soit nécessaire de recourir à l'addition d'un adjuvant.
Ainsi, selon la présente invention, ladite composition pharmaceutique comprendra le cas échéant un adjuvant de l'immunité.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité, notamment encapsulée dans un liposome.
De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit véhicule est un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, pour ledit peptide immunogène, ou pour ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit peptide immunogène, ou ladite protéine hybride.
De manière plus préférée, ladite cellule hôte transformée est une bactérie non pathogène pour les mammifères et ladite construction nucléique qu'elle contient comprend en outre les éléments nécessaires à la sécrétion ou à l'expression à la surface de la membrane desdites bactéries de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, dudit peptide immunogène, ou de ladite protéine hybride.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique notamment vaccinale, destinée à prévenir ou à traiter les infections au VRS. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Dans ces exemples, on se référera aux figures dont les légendes sont ci-après.
Légendes des figures :
Figure 1 : Gel SDS PAGE 12 % dans des conditions dénaturantes de la protéine P40 recombinante (rP40) de séquence SEQ ID N° 2 (37 Kda), des marqueurs de tailles moléculaires (M) dans l'ordre décroissant (200, 116, 97.4, 66, 45, 31 , 21.5 Kda), et de la protéine P40G2Na de séquence SEQ ID N° 4 (49 Kda). Figures 2A à 2C : Evaluation de la réponse IgG systémique (figure 2A) et isotypage des IgG sériques chez des souris naïves (figure 2B) ou présensibiiisées avec Klebsiella pneumoniae (figure 2C), ayant reçu 3 administrations par voie intra-nasale (i.n.) de 40 μg de protéine G2Na de séquence SEQ ID N° 9 fusionné à rP40. Figures 3A et 3B : Immunogénicité des conjugués P40-G5, administrés par voie i.n. à des souris BABL/c. 10 μg d'équivalents G5 couplés à rP40 sont administrés 3 fois, à 10 jours d'intervalle, à des souris naïves (figure 3A) ou présensibiiisées (figure 3B) par Klebsiella pneumoniae. 10 jours après la dernière immunisation les animaux sont ponctionnés et les IgG sériques dirigées contre G5 dosées par ELISA. Figures 4A et 4B : Etude de la protection des voies supérieures (figure 4A) et inférieures (figure 4B) après immunisation de souris BALB/c avec la protéine de fusion P40G2Na.
Figures 5A et 5B : Etude de la protection des voies inférieures (figure 5A) et supérieures (figure 5B) après immunisation de souris BABL/c avec le conjugué P40- G5.
Exemple 1 : Clonage de l'ADN codant pour la protéine OmpA P40 de Klebsiella pneumoniae
L'ADN codant pour la protéine P40 a été obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et al., Gène 210:93-101 , 1998). Le fragment de gène codant pour la P40 est inséré dans divers vecteurs d'expression, en particulier un vecteur sous le contrôle du promoteur de l'opéron Trp : pvaLP40 (5, 7 Kpb). La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de la protéine P40 sont représentées respectivement par les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2. Une souche productrice £. coli K12, a été transformée par un vecteur d'expression pvaLP40 (5, 7 Kpb). La protéine rP40 est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 %, g de protéines/g de biomasse sèche). Cet exemple n'est qu'une illustration de l'expression de la protéine rP40, mais elle peut être étendue à d'autres souches bactériennes ainsi que d'autres vecteurs d'expression. Exemple 2 : Clonage de l'ADN codant pour la protéine P40G2Na
L'ADN codant pour le fragment G2Na de séquence SEQ ID N° 9 de la protéine G du VRS-A (correspondant à la séquence d'acides aminés aa 130 - aa 230 de la séquence de la protéine G du VRS-A), a été obtenu par assemblage d'oligonucléotides de synthèse sur supports solides (Billes magnétiques Dynal, Oslo) comme décrit par Nguyen et al. (M. Uhlen, E. Homes, and O. OIsvik (eds.), Advances in biomagnetic séparation. Eaton Publishing Co., Natick, p. 73-78, 1994), les oligonucléotides ont été conçus et optimisés avec le codon usuel de Escherichia coli. L'ADN G2Na a été clone dans le vecteur pvaLP40 décrit dans l'exemple 1 , le vecteur d'expression résultant est nommé pvaLP40G2Na (6 Kpb). La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de P40G2Na sont représentées respectivement par les séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4. La souche E. coli K12, transformée par ce vecteur, dans des conditions de culture décrites ci-dessus, produit sous forme de corps d'inclusion, la protéine P40G2Na (49 Kda) en quantité abondante (> 5 %, g de protéines/g de biomasse sèche). Le clonage de l'ADN codant pour le fragment G2Nb de séquence SEQ ID N° 11 de la protéine G du VRS-B (correspondant à la séquence d'acides aminés aa 130 - aa 230 de la séquence de la protéine G du VRS-A) ainsi que la protéine de fusion P40G2Nb peuvent être obtenus en utilisant les techniques décrites pour G2Na et P40G2Na. Exemple 3 : Procédé de fermentation de la protéine rP40 et de la protéine de fusion P40G2Na
La description du procédé de fermentation suivant est applicable à l'expression de la protéine rP40 et à celle de la protéine P40G2Na. Les conditions de culture sont données à titre d'exemple et pourront être optimisées pour obtenir un meilleur rendement en protéines exprimées.
L'inoculation est réalisée avec la souche E. coli recombinante décrite ci-dessus dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) renfermant de l'Ampicilline (100 μg/ml, Sigma) et de la Tétracyciine (8 μg/ml, Sigma), qui est incubée pendant une nuit à 37°C. Puis 2 litres de milieu de culture dans un fermenteur (Biolafitte, France) sont ensemencés au moyen de 200 ml de la culture précédemment obtenue. De manière assez classique, le milieu de culture peut être composé d'agents chimiques, supplémentés par les vitamines, des extraits de levure, connus pour avoir une croissance à densité élevée de cellules bactériennes, telle que décrit par Nguyen ét al. (Gène 210:93-101 , 1998). Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (Glycérol ou Glucose). De manière générale, le pH est régulé à 7,0, la température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir ie signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidite de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est déclenchée par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/l. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse humide obtenue est d'environ 200 gr. Exemple 4 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine rP40 A) Extraction de la rP40
Le procédé d'extraction et de purification a été décrit selon Haeuw et al. (Eur. J. Biochem. 255:446-454, 1998).
Après centrifugation du bouillon de culture (4000 tpm, 10 min, 4°C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5. Les insolubles ou corps d'inclusion sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure température ambiante / agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25 mM à pH 8,5 et 5 mM MgCI2, puis centrifugé (15 min à 10 000 g). Les corps d'inclusion à 37°C sont solubilisés pendant 2 heures dans un tampon
Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 7 M urée (agent dénaturant) et 10 mM dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer les particules non solubles.
Le surnageant obtenu est ensuite resuspendu dans 13 volumes de tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant du NaCI (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v). La solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de l'air (afin de favoriser la renaturation de la protéine par dilution et la réoxydation des ponts disulfures). B) Purification de la protéine rP40 - Etape de chromatographie d'échange d'anions Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysee contre un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4CC.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High Q) équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280 nm. La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2 M en NaCI dans le tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 à 0,1 % Zwittergent 3-14. - Etape de chromatographie d'échange de cations Les fractions contenant la protéine rP40 sont mélangées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysee pendant une nuit à 4°C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM pH 3,0 contenant 0,1 % de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0J M en NaCI.
Exemple 5 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine P40G2Na A) Extraction de la protéine de fusion P40G2Na
Après centrifugation du bouillon de culture (4000 tpm, 10 min, 4°C), les cellules de bactéries sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 50 mM pH 8,5 contenant 1 mM EDTA, 0,2 M NaCI et 0,05 % Tween 20. Les insolubles ou corps d'inclusion sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure température ambiante / agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25 mM à pH 8,5 contenant 5 mM MgCI2, puis centrifugé (15 min à 10 000 g). Les corps d'inclusion sont solubilisés à 37°C pendant 2 heures dans un tampon
Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 7 M chlorhydrate de guanidinium (agent dénaturant) et 10 mM dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer les particules non solubies.
Le surnagant est ensuite resuspendu dans 13 volumes de tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant du NaCI (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v). La solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de l'air.
B) Purification de la protéine de fusion P40G2Na
- Etape de chromatographie d'échange d'anions Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysee contre un tampon éthanolamine-HCI 20 mM pH 10,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Amersham Pharmacia Biotech Source Q) équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus, et la protéine P40G2Na est éluée à l'aide d'un gradient de NaCI dans le même tampon. Les protéines sont détectées à 280 nm.
- Etape de chromatographie d'échange de cations
Les fractions contenant la protéine P40G2Na sont mélangées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysee pendant une nuit à 4°C contre un tampon Tris-HCI 20 mM pH 8,0 contenant 0J % Zwittergent 3-14. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Amersham Pharmacia Biotech Source S) équilibrée dans le tampon précédent, et la protéine P40G2Na est éluée à l'aide d'un gradient de NaCI dans le même tampon. Les fractions d'intérêt sont mélangées avant d'être concentrées par ultrafiltration à l'aide de l'un des systèmes décrits précédemment. Exemple 6 : Couplage chimique pour obtenir P40-G5 A) Synthèse et caractérisation du conjugué P40-G5Cvsa - Synthèse des peptides GδaCys et CysGδa
Le peptide G5a, représenté par la séquence SEQ ID N° 5, est un peptide de 16 acides aminés qui correspond au fragment aa144-aa159 de la protéine G du VRS-A. Il est obtenu par synthèse chimique sur phase solide en partant du côté C terminai vers le côté N-terminal. Les peptides CysGδa et G5aCys, représentés respectivement par les séquences SEQ ID N° 6 et SEQ ID N° 7, correspondent respectivement à ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du côté N- ou C-terminal qui permet un couplage univoque sur une protéine porteuse. Les peptides ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur automatique de peptide en phase solide du côté C vers le côté N-terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0,1 ; 0,25 ou 1 ,0 mmole). La synthèse du peptide CysGδa est effectuée à partir d'une Proline préchargée sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du côté C-terminal ou une résine de type Rink amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du côté C-terminal. Celle du peptide GδaCys débute par une Cystéine préchargée sur l'une ou l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaînes latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie FMOC [Cys(Trt) ; Arg(Pmc) ; AsnfTrt) ; Gln(Trt) ; Lys(Boc) ; Ser(tBu) ; Thr(tBu)]. Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante : déprotection de la fonction aminé N-terminale du premier acide aminé à l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à l'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthèse, le peptide est clivé de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par réaction avec un mélange eau / TFA. Le peptide est précipité à l'éther refroidi préalablement à -40°C et le mélange est centrifugé. Le culot est lavé à trois reprises avec de l'éther puis séché à l'azote. Le culot est repris avec de l'eau contenant 0,1 % de TFA. La suspension est à nouveau centrifugée et le surnageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui contient la résine. Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative. L'homogénéité du peptide purifié est vérifiée par HPLC en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés.
• Peptide CysGδaNH2
- Synthèse :
Poids théorique peptide-résine en fin de synthèse : 693 mg
Poids mesuré après séchage à l'azote : 619 mg Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut : 200 mg (1/3 du lot)
Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 84 mg (7δ% de quantité nette de peptide soit 97% de rendement).
Homogénéité du peptide brut : 97 % (RP-HPLC ; UV 210 NM)
97 % (FZCE/Microcoat™). - Purification :
Masse de peptide purifié après lyophilisation : 50 mg (7δ% de quantité nette de peptide soit 68 % de rendement).
- Caractérisation : Homogénéité du peptide purifié : > 99 % (RP-HPLC ; UV 210 NM)
> 99 % (FZCE/Microcoat™ ; UV 200 nm) Spectrométrie de masse (ES-MS)
Masse calculée : 1961.29 Da Masse mesurée : 1960.80 Da ± 0.31
- Abréviations :
AA ou aa : acide aminé ; Boc : Tert Butoxycarbonyl ; BHA : Bromo hydrosuccimidyl acide ; CE : Capillary Electrophoresis ; ES-MS : Electrospray - Mass Spectrometry FMOC : Fluorénylméthoxycarbonyl ; FZCE : Free Zone Capillary Electrophoresis HBTU : 2-(1 H-Benzotriazole-1-yl)-1J,3,3-trétraméthyluroniumhexafluorophosphate HMP : p-hydroxyméthylphénoxyméthyl polystyrène ; MBHA : méthylbenzhydrylamine NMP : N-méthyle-2-pyrrolidone ; Pmc : 2,2,5J,8-Pentaméthylchroman-6-sulfonyle RP-HPLC : Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography ; SPPS Synthèse Peptidique en Phase Solide ; tBOC : t-butyloxycarbonyle ; tBu : tertio Butyl ; TFA : trifluoroacetic acid ; Trt : trityle.
La méthode utilisée pour le couplage a été décrite par Haeuw et al. (Eur. J. Biochem. 256:446-464, 1998). Le réactif hétérobifonctionnel, N-hydroxysuccinimide bromoacétate ou HBA, utilisé permet une activation des résidus Lysine de la protéine par bromoacétylation, puis un couplage du peptide via le groupement thiol porté par le résidu Cystéine introduit en position C-terminale du peptide.
Brièvement, la protéine P40 est dialysee contre un tampon phosphate sodique 0,1 M pH 7,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant une nuit à 4°C. La protéine dialysee est ensuite activée à l'aide du réactif HBA. Celui-ci est ajouté à raison de 1 ,2 mg (dans 10 μl de diméthylformamide) par mg de P40, puis l'ensemble est placé sous agitation pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité. La P40 activée est dessalée par chromatographie de tamisage moléculaire sur support Pharmacia Sephadex G25. L'élution de la protéine est réalisée à l'aide d'un tampon phosphate sodique 0,1 M pH 7,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14. Les fractions contenant la P40 activée sont rassemblées. Pour le couplage, 0,4 mg de peptide (dans le tampon précédent à une concentration de 10 mg/ml) sont ajoutés à 1 mg de P40 (concentration de l'ordre de δ mg/ml). Après saturation de la solution sous courant d'argon, l'ensemble est placé sous agitation pendant 2 heures à température ambiante et à l'obscurité. Le conjugué est ensuite dialyse contre un tampon phosphate sodique 0,1 M pH 7,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à +4°C avant caractérisation par SDS-PAGE et dosages.
Le nombre de peptides couplés est déterminé par dosage par HPLC des acides aminés après hydrolyse acide et dérivatisation à l'aide du PITC (méthode PicoTag Waters). La quantification du résidu carboxyméthylcystéine libéré selon la méthode décrite par Kolodny & Robey (Anal. Biochem. 187:136-140, 1990) permet de déterminer avec précision le nombre de moles de peptide GδCysa fixées par mole de protéine P40. Cette valeur est généralement comprise entre δ et 10 GδCysa / P40. Exemple 7 : Réponse anticorps après immunisation par P40G2Na
P40G2Na, à la dose de 40 μg d'équivalent G2Na (antigène dérivé de la protéine G du VRS aa130-230) a été administré 3 fois, à 10 jours d'intervalle, par voie intranasale (i.n.), chez des souris BALB/c présensibilisées ou non par deux administrations i.n. de Klebsiella pneumoniae. Cette présensibilisation a pour but de mimer naturellement la situation humaine dans la mesure où ce pathogène des voies respiratoires est fréquemment rencontré par l'homme qui possède de ce fait un titre anti-rP40 de base. De manière surprenante, la figure 2A met en évidence un titre sérique IgG élevé contre G2Na consécutif à l'administration de la protéine de fusion par voie i.n. Ce titre est significativement plus élevé chez les animaux présensibilisés par Klebsiella pneumoniae et l'addition de CTB (toxine cholérique sous-unité B) à la protéine de fusion améliore également l'intensité de la réponse et son homogénéité. Un isotypage de la réponse IgG (figures 2B et 2C) sérique met en évidence une réponse lgG1 majoritaire en absence de CTB avec une augmentation des titres lgG1 et lgG2a chez les souris sensibilisées avec K. pneumoniae (figure 2C). L'effet de la présensibilisation sur l'isotypage n'est plus perceptible dès lors que la CTB est additionnée à la protéine de fusion. A noter que le CTB (Sigma, St-Louis, MO, USA) d'origine d'extraction, contient encore des traces de CTA (toxine cholérique sous-unité A) la partie toxique qui est responsable de l'induction de réponses d'anticorps. L'ensemble de ces données met en évidence l'immunogénicité du peptide G2Na lorsqu'il est fusionné à la protéine rP40 et administré par la voie intranasale. Exemple 8 : Réponse anticorps après immunisation par P40-G5
L'évaluation de la réponse anticorps a également été réalisée avec un épitope B pur issu de la protéine G du VRS nommé G5 (Plotnicky-Gilquin et al., JNirol. 73:5637, 1999). Comme attendu, le peptide Gδ n'est pas immunogénique seul ou en présence de CTB. Etonnamment, le peptide Gδ est immunogène lorsqu'il est couplé à la protéine rP40 et administré par voie i.n. (figure 3A). La présensibilisation des souris par Klebsiella pneumoniae (figure 3B) améliore sensiblement la réponse IgG sérique anti- Gδ. Exemple 9 : Protection après immunisation par P40G2Νa et challenge VRS
Afin d'évaluer la qualité de la réponse immunitaire en terme de protection, les souris BALB/c sont immunisées par la protéine hybride P40G2Na puis infectées par voie i.n. avec le RSV-A.
La figure 4A montre que l'administration de la protéine porteuse rP40 seule, administrée par voie i.n. avec ou sans CTB est sans conséquence sur l'infection des souris par le RSV-A. De manière intéressante, l'administration de la protéine de fusion P40G2Na à des souris non sensibilisées par Klebsiella pneumoniae entraîne une réduction du titre viral de 2 log 10 pour δ des 6 souris. De manière surprenante, la sensibilisation des souris par Klebsiella pneumoniae améliore de manière significative la protection des voies pulmonaires.
En ce qui concerne la protection des voies nasales (figure 4B), l'apport de la présensibilisation par Klebsiella pneumoniae est particulièrement net en présence ou en absence de CTB. Cette importance de la présensibilisation par Klebsiella pneumoniae peut s'expliquer par une plus grande homogénéité de la réponse IgG chez les souris présensibilisées mais également par l'augmentation de la réponse locale de type IgA chez ces animaux (données non communiquées).
Ces données expérimentales démontrent pour la première fois que l'administration par voie mucosale d'une protéine recombinante sous-unitaire dérivée de la protéine G du VRS fusionnée à une protéine porteuse P40 protège à la fois la voie pulmonaire et la voie nasale de l'animal.
Exemple 10 : Protection après immunisation par P40-G6 et challenge VRS
De manière intéressante, la figure δA montre que l'administration du peptide Gδ couplé à rP40 par voie nasale entraîne une réduction de virémie significative (p<0,0δ) au niveau des poumons des souris contre une infection avec RSV-A. Concernant la protection des voies supérieures (figure δB), les résultats obtenus montrent que les animaux immunisés par P40-G6 ont une virémie réduite après infection par le RSV-A particulièrement significative (p<0,0δ) lorsque ceux-ci ont été présensibilisés avec Klebsiella pneumoniae.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, associée à un peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale destinée à induire une réponse immunitaire protectrice de la voie respiratoire supérieure et/ou de la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS.
2/ Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.
3/ Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec la séquence
SEQ ID N° 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID N° 2.
4/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. δ/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, ou ledit peptide immunogène est obtenue par voie recombinante. 6/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à δ, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est choisi parmi les peptides dérivés de la protéine G, F, M2 ou N du VRS.
7/ Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est un peptide dérivé de la protéine G. 8/ Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est un fragment de la protéine G comprenant un épitope de type B.
9/ Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID N° δ, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11 ou de séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 11.
10/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, ou ledit peptide immunogène, ladite construction nucléique étant contenue dans un vecteur d'expression ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA d'entérobactérie et/ou ledit peptide immunogène.
11/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est couplé par liaison covalente avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, pour former une protéine hybride.
12/ Utilisation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est un couplage réalisé par synthèse chimique.
13/ Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit peptide immunogène pour faciliter le couplage chimique.
14/ Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
15/ Utilisation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que ladite protéine hybride est une protéine de fusion exprimée par une cellule transformée avec une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride.
16/ Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, notamment contenue dans un vecteur d'expression, ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine hybride.
17/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.
18/ Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit véhicule est un liposome, un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit peptide immunogène, ou ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit peptide immunogène, ou ladite protéine hybride. 19/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 18, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment vaccinale, destinée à prévenir ou à traiter les infections au VRS.
PCT/FR2000/002626 1999-09-23 2000-09-22 Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale WO2001021203A1 (fr)

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