FR2828106A1 - Utilisation d'une omp d'enterobacterie de faible masse moleculaire comme porteur et/ou adjuvant - Google Patents
Utilisation d'une omp d'enterobacterie de faible masse moleculaire comme porteur et/ou adjuvant Download PDFInfo
- Publication number
- FR2828106A1 FR2828106A1 FR0110381A FR0110381A FR2828106A1 FR 2828106 A1 FR2828106 A1 FR 2828106A1 FR 0110381 A FR0110381 A FR 0110381A FR 0110381 A FR0110381 A FR 0110381A FR 2828106 A1 FR2828106 A1 FR 2828106A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- low molecular
- omp
- molecular weight
- peptide
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 55
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 title abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 35
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 25
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-N Zwittergent 3-14 Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 6
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N (3s)-3-amino-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-carboxyethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-ox Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N 0.000 description 5
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 5
- 101710147950 P18 protein Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000606685 Bartonella bacilliformis Species 0.000 description 3
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229940092528 bartonella bacilliformis Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- PTMFUWGXPRYYMC-UHFFFAOYSA-N triethylazanium;formate Chemical compound OC=O.CCN(CC)CC PTMFUWGXPRYYMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- RUPBZQFQVRMKDG-UHFFFAOYSA-M Didecyldimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC RUPBZQFQVRMKDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 101000597577 Gluconacetobacter diazotrophicus (strain ATCC 49037 / DSM 5601 / CCUG 37298 / CIP 103539 / LMG 7603 / PAl5) Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- -1 ISCOM Chemical compound 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000282374 Puma concolor Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960002798 cetrimide Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000007386 hepatic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008180 pharmaceutical surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55544—Bacterial toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou d'une construction nucléique codant pour ledit peptide; tout comme l'utilisation d'un tel peptide ou d'une telle construction pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.
Description
flore intestinale ou encore pour traiter l'encéphalopathie hépatique.
UTILISATION D'UNE OMP D'ENTEROBACTERIE DE FAIBLE MASSE
MOLECULAIRE COMME PORTEUR ET/OU ADJUVANT
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou une construction nucléique codant pour ledit peptide, tout comme l'utilisation d'un tel peptide ou d'une telle construction nucléique pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. La vaccination est un moyen effficace de prévenir ou de réduire les infections viral es ou b act ériennes. Le succès des campagnes de vaccinati on dans c es d om aines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. La mise au point de vaccins parfaitement définis et dépourvus d'effets secondaires marqués, nécessite l'emploi d'antigènes vaccinants de faible masse moléculaire, tels que des peptides ou des oligosaccharides. Ces antigènes de faible mas se, mai s aus si certains antigènes de mass e molécul aire sup éri eure tel. s que l es polysaccharides de la paroi bactérienne, ne peuvent induire seuls une réponse immunitaire durable et intense. Il est indispensable de lier ces antigènes, par voie
chimique ou par génie génétique, à des protéines porteuses.
Les protéines porteuses, actuellement utilisées, sont de deux types: - les anatoxines tétanique et diphtérique: l'emploi trop fréquent de ces protéines s porteuses risque d'aller à l'encontre d'une réponse intense contre l'haptène et risque de po ser des probl èm es d' immunotoxi co lo gie, - les extraits de protéines membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun., 60, 49774983, 1992), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol., 146, 793798, 1991) ou PorB de Neisseria
meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis., 175, 364-372, 1997).
L'OmpA de KleLsiella pnenmoniae, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présente une activité de protéine porteuse, par voie systémique, pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (brevets WO 95/27787 et WO 96/14415; Haeuw et al., Eur. J. Biochem., 255, 446-454, 1998; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol., 73, 5637 s 5645, 1999) et polysaccharidiques (brevet WO 97/41888; Rauly et al., Infect. Immun.,
67, 5547-5551, 1999).
De plus, les antigènes possèdent généralement une faible immunogénicité et il est néces s aire de l es mél anger à des adj uvants. On recherche donc constamment de
nouveaux adjuvants.
Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire dirigée contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire antivirale, antibactérienne, antifongique ou antiparasitaire,
ou antitumorale.
Il existe donc aujourd'hui un besoin de disposer de protéine porteuse et/ou
adjuvante capable de générer une réponse immunitaire.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'un peptide provenant d'une
Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, répond à ces besoins.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérob actéri e de faib l e mas se mol écul aire en tant que protéine porteu se et/ou adjuvante pour augmenter l'immunogénicité d'un antigène associé de manière
covalente, soit conjugué de manière chimique soit fusionné.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme "peptide" également les polypeptides et par le terme " Omp " (pour " Outer Membrane Protein "),
les protéines de la membrane externe.
Par peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, on entend désigner en particulier tout peptide de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés d'une protéine Omp d'entérobactérie qui, lorsqu'il est associé à un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale, est capable de générer ou accro^tre une réponse immunitaire dirigée contre
ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale.
L'invention a pour objet une composition pharrnaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide s provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou une construction
nucléique codant pour ledit peptide.
Dans la présente invention, une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est définie comme une Omp présentant une masse moléculaire comprise enke 15 et 25 kDa. Ces Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire sont
0 notamment celles dénommées OMPs pour "small outer-membrane proteins".
C es Omp d' entérob actéri es d e faib le m as s e mol écul aire, qu ' ell es soi ent constitutives de ladite entérobactérie ou exprimées par un bactériophage qui lui est associé, constituent une famille de protéines de membrane externe de bactérie gram négative et sont généralement impliquées dans l'adhésion desdites entérobactéries aux cellules de l'hôte qu'elles infectent, notamment dans l'adhésion aux cellules épithéliales de mammifères, dans la résistance au sérum etlou dans la virulence de l'entérobactérie (Mescsas et al., J. of Bact., 177(3), 799- 804, 1995; Heffernan et al., J. of Bact., 174 (1),
84-91, 1992).
De manière également préférée, lesdites Omp d'entérobactéries de faible masse moléculaire sont des protéines dont la séquence comprend un nombre de résidus
d'acides aminés compris entre 165 et 210 (séquence signal comprise).
De manière également préférée, lesdites Omp d'entérobactéries de faible masse moléculaire comprennent un fragment consensus de séquence G[X]N[X] KYRYE (SEQ ID N 5) dont le premier résidu d'acide aminé "G" est situé à une position comprise 2s entre les positions 40 à 60 de la séquence de 1'Omp de faible poids moléculaire, et/ou un fragment consensus de séquence YAQ (de préférence GYAQK (SEQ ID N 21) ou YAQS (SEQ ID N 22)) dont le résidu d'acide aminé "Y" est situé à une position comprise entre les positions 30 à 38 de la séquence de l'Omp de faible poids moléculaire. Par peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, on entend notamment un peptide choisi parmi: - une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci avant; un peptide présentant après alignement optimal au moins 80 %, de préférence %, 90 %, 95 % et 99 % d'homologie avec une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-avant; - un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-avant et présentant une activité immunogénique; et - un épitope T helper d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire
0 telle que définie ci-avant.
Dans un mode de réalisation préPéré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi l'OmpK17 de Klebsiella pneumoniae, l'OmpX de Escherichia coli, l'OmpX de Enterobacter clocue, Rck et PagC de Salmonella typhimurium et Rck de Salmonella enteritidis, Ail de Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, Omp4 de Serratia marcescens, IalB de Bartonella bacilliformis et
Lom du bactériophage lambda.
Dans un mode de réalisation particulièrement prétéré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi l'OmpK17 de Klebsiella pneumonine décrite par Climent et al. (Res. Microbiol. 148, 133-143, 1997) et clonée à partir de la souche KleLsiella pneumoniae 52145 (O1:K2). Le précurseur de l'OmpK17 possède 170 acides aminés (SEQ ID N 2). Ce dernier contient une séquence signal N-terminale de 24 résidus, et la protéine mature possède donc 146 acides aminés. L'OmpK17 de Klabsiella
pneumoniae est également dénommée dans la présente invention "P18".
Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi l'OmpX de Escherichia
coli. L'OmpX possède 171 acides aminés (SEQ ID N 4).
Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisie parmi le groupe suivant: - l'OmpX de Enterobacter clocoe de séquence SEQ ID N 6 (Stoorvogel et al., J. of Bact., 173 (1), 156-160, 1991; GenBank sous le numéro d'accession A39189); s - Rck de Salmo 'ella enteriditis de séquence SEQ ID N 7 (Aneda et al., Infect Immun 2001, 69 (4), 2612-20, 2001; GenBank sous le numéro d'accessionBAB20575);
- Rck de Salmonella typhimurium de séquence SEQ ID N 8 (Cirillo et al., Infect.
Immun., 64 (6), 2019-23, 1996; Heffernan et al., J. of Bact., 174 (1), 8491, 1992; GenBank sous le numéro d'accession A43309); - PagC de Salmonella phimurlum de séquence SEQ ID N 9 (Pukkinen et al., J. of Bact. , 173 (1), 86-93, 1991; GenBank sous le numéro d'accession A39185); - Ail de Yersinia enterocolitica de séquence SEQ ID N 10 (Miller et al., J. of Bact., 172 (2), 1062-1069, 1990; GenBank sous le numéro d'accession A35123);
0 - Ail de Yersinia pseuJotuberculosis de séquence SEQ ID N 11 (Yang et al., Infec.
Immun., 64 (7), 2483-2489, 1996; GenBank sous le numéro d'accession AAB36601); - Omp4 de Serratia marcescens de séquence SEQ ID N 12 (Guasch et al., Microbiol., 141 (Pt 10), 2535-2542, 1995; GenBank sous le numéro d'accession CAA85513);
- IalB de Bartonella bacilliformis de séquence SEQ ID N 13 (Mitchell et al., Infec.
Immun., 63 (4), 1552-1562, 1995; GenBank sous le numéro d'accession AAA87327); et - Lom du bactériophage lambda de séquence SEQ ID N 14 (Pacheco et al., FEMS Microbiol. Letter, 156 (1), 129-132, 1997; Sanger et al., J. Mol. Biol., 25,162 (4), 729
73, 1982; GenBank sous le numéro d'accession P03701).
L'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire peut 8tre obtenue par un
procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
Les procédés d'exkaction de protéines de membrane bactériennes sont connus de
l 'homme de l' art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer
par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.F. et al.
(Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).
L' Omp d'entérobactérie de faible masse mol éculaire peut également eke obtenue
par voie recombinante.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien
connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description,
on pourra néanmoins se rétérer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., Recent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525, 1993), mais également les cellules de levure (Buclolz R.G., Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542, 1993), de même que l es cellul es animal es, en parti culi er les cultures d e cellul es de mammi fère (Edward s
C.P. et Aruffo A., Current applications of COS cell based transient expression systems.
Curr. Op. Biotechnology 4:558-563, 1993) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus
0 (Luckow V.A., Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr.
Op. Biotechnology 4:564-572, 1993).
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire comprend: a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N
6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID
N 12, SEQ ID N 13 ou SEQ ID N 14, de préférence la séquence SEQ ID N 2 ou
SEQ ID N 4;
b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant après alignement optimal une homologie d'au moins 80 %, de prétérence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec une des séquences telle que définie en a); ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragrnent d'au moins 5 acides aminés d'une
séquence telle que définie en a).
Par séquence d'acide nocléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au
moins 80 % avec ladite séquence déterminée.
Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement stati stique et l es di fférences entre l es deux séquences étant rép arti es au has ard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifer et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de
l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol.
0 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Soltware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI,
ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenétre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de rétérence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenétre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100
pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, "BLAST 2 sequences", disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par déLaut (en particulier pour les paramètres "open gap penaltie>>: 5, et "extension gap penaltie": 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice "BLOSUM 62" proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux
séquences à comparer étant calculé directement par le programme.
Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence Omp de référence, on préfère les séquences de, ou codant pour des, peptides capables d'induire une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre l'antigène ou haptène qui lui est associée, telle que l'induction d'une réponse immunitaire mesurée au
s moyen des techniques standards décrites dans les exemples ci-après.
La présente invention concerne aussi une composition selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ledit peptide provenant d'une Omp dentérobactérie de faible masse moléculaire ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ledit peptide
provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire.
L' invention a également pour objet la composition selon l 'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, un antigène,
immunogène ou haptène.
Par " immunogène, antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale ", on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire
spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.
On entend également désigner par "immunogène, antigène ou haptène" dans la
présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène
ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène
ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue.
Ledit antigène ou haptène peut notamment étre choisi parmi les protéines, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides
nucléiques et les lipides.
Dans une forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou
haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influeuza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus
influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus
s respiratoire syncytial.
L'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant étre prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut 0 citer en particulier, mais sans s'y limiter: le cancer du sein, du poumon, du côlon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., Cancer Res. 59:431 -5, 1999);
le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., J. Natl. Cancer.
Inst. 91:169-75, 1999); 5. le mélanome (Zheuten et al., Bratilsl. Lek. Listy 99:426-34, 1998);
l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., Eur. J. gastroenterol. Hepatol.
:345-8, 1998);
le cancer colorectal (Ogura et al., Anticancer Res. 18:3669-75, 1998); le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., Cancer Res. 58:3078-86, 1998); et
À le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., Cancer. 77:1501-9, 1996).
La présente invention a aussi pour objet une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est couplé ou mélangé au
peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en 2s ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible
masse moléculaire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique, de prétérence, ledit élément de liaison introduit est
un acide aminé.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre ledit peptide s provenant d'une Omp d' entérobactéri e de faib le mass e mol éculaire, et l ed it immunogène, antigène ou haptène. Le couplage covalent entre le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire et ledit immunogène, antigène ou haptène selon l'invention peuvent être réalisés à l'extrémité N- ou C- terminale dudit poptide. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en 0 fonction de l'extrémité dudit peptide choisie pour effectuer le couplage et de la nature
dudit immunogène, antigène ou haptène à coupler.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le couplage entre ledit immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit immunogène, antigène ou haptène est de nature peptidique. Les conjugués issus d'un couplage entre l'immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire, peuvent êhe préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (le conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide provenant d'une Omp d' entérob actéri e de faibl e mas se molécul aire, d'une séquence cod ant p our l ed it
immunogène, antigène ou haptène de nature protéique.
Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisces en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se rétérer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.V. Gooddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology,
vol. 185, 3-187, 1990).
Ainsi, la présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique qui comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, ou qui comprend un vecteur contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable
d'exprimer ladite protéine hybride.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A (" MonoPhosphoryl Lipid A "), le Quil-A (adjuvant dérivé de saponine), 1'ISCOM (" ImmunoStimulating COMplex "), le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG (oligodésoxynucléotides contenant un motif spécifique centré sur un dinucléotide CpG), la Leif (antigène protélque dérivé de Leishmania capable de stimuler les cellules PBMC et présentatrices d'antigène, et de produire une réaction cytokine de type Th-l), la CT (Toxine Cholérique), la LT ("heat Labil Toxin") et les versions
détoxifiées de la CT ou la LT.
Dans un mode de réalisation prétéré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que le poptide
provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient
en outre un détergent.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un détergent, et notamment tout type de tensioactif pharmaceutiquement acceptable, permettant notamrnent, le cas échéant, de solubiliser l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire. On pourra plus particulièrement utiliser des tensioactifs anioniques,
cationiques, non-ioniques ou amphotères, préférentiellement acceptables chez l'hornme.
On utilise préférentiellement les détergents Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside
et encore plus prétérentiellement le Zwittergent 3-14.
2s Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon
l'invention ne contient pas de détergent.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, prétérentiellement un milieu injectable chez l'homme. I1 peut étre constitué d'eau, d'une solution aqueuse
saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
L'invention comprend égalernent une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme perrnettant diaméliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité; ainsi, elle peut étre véhiculée sous
forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules.
L'utilisation d'un poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-dessus comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin
constitue un autre objet de l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci- dessus pour la 0 préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un
vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire telle que définie ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroitre une
réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer
l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Légendes des figures: Figure 1: Analyse de la P18 recombinante produite dans BL-21 DE3 par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie ou Western blot à l'aide d'un anticorps anti-6
histidines couplé à la peroxydase.
Lignes 1 et 5: corps d'inclusion des bactéries transformées avec pET 24d 2s OmpK17.
Lignes 3 et 7: corps d'inclusion des bactéries transformoes avec pET 24d.
Lignes 2 et 6: fraction soluble des bactéries transformées avec pET 24d
OmpK1 7.
Lignes 4 et 8: fraction soluble des bactéries transformées avec pET 24d.
Fiure 2: Immunogénicité du conjugué Pl8-AII (Angiotensine II) administré par voie
sous-cutanée en absence d'adjuvant.
Les résultats sont exprimés en log0 du titre, le titre étant déterminé comme
l'inverse de la dernière dilution donnant une DO > 0,2 (DO pour DensitéOptique).
Fieure 3: Analyse de la OmpX recombinante produite dans BL-21 DE3 par gel SDS
PAGE et coloration au bleu de Coomassie.
s Ligne 1: solution initiale.
Ligne 2: solution initiale filtrée.
Ligne 3: fraction non retenue.
Ligne 4: pool OmpX purifiée.
Exemple 1: Extracffon et purifcation d'une Omp d'entérobacterie de faible masse moléculare L'Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire est purifiée à partir d'un
extrait membranaire de Klabsiella p 'eumoniae.
1. Préparation de fractions membranaires de Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumonine, souche I-145, est cultivoe sur milieu chimiquement défini. Après centrifugation et lavage, la biomasse est resuspendue dans un tampon Tris HC1 10 mM pH 7 contenant 150 mM NaCl et 10 mM MgCl2, à raison de 5 g de cellules sèches pour 100 ml de tampon, et l'ensemble est homogénéisé (homogénéisateur à palettes IKA RW 10R, 1 h 30 à température ambiante) avant addition de DNAse (5 g/ml). Après une nouvelle homogénéisation (30 min à température ambiante), les bactéries sont broyées par sonication dans la glace (sonicateur Vibra Cell, 3 x 10 min. puissance 8, 50 % de cycle actif), puis traitées au lysozyme (0,5 mg/ml) pendant 1 h à température ambiante sous agitation (homogéncisateur à palettes IKA RW 10R). Le surnageant issu d'une première centrifugation (10 000 g, 10 min. + 4 C) est centrifugé de nouveau à plus haute vitesse: 30 000 g, 45 min. + 4 C. Les culots sont resuspendus dans une solution de NaCl à 0,9 %, et la solution est placée sous agitation (agitateur magnétique) pendant une nuit à + 4 C. Après deux nouvelles centrifugations réalisées dans les conditions précédemment décrites (10 000 g puis 30 000 g), le culot est repris dans l'eau. Après un nouveau cycle d'agitation-centrifugation, le culot est resuspendu
dans l'eau, et la suspension obtenue est congelée puis lyophilisée.
2. Purification de l'Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire L'Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire, ci-après dénornmée P 18 est extraite des fractions membranaires par traitement à l'aide d'une solution contenant un détergent. Le Iyophilisat est solubilisé dans une solution d'acétate de sodium 0,2 M pH 2,5 contenant 0,2 M CaCI2, 20 % (v/v) éthanol et 2 % (p/v) cétrimide à raison de 100 ml s de solution / g de Iyophilisat. Le mélange est placé sous agitation (agitateur magnétique) pendant une nuit à température ambiante. Après centrifugation à 15 000 g pendant 20 min à + 4 C, les protéines du surnageant sont précipitées à l'éthanol: deux précipitations successives avec centrifugation intermédiaire (10 000 g, 10min, + 4 C) sont réalisées, 20 à 50 % puis 50 à 80 %. Les culots 80 % sont remis en suspension dans 0 1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Après agitation (agitateur magnétique) pendant 3 heures à température ambiante, le pH est ajusté à 6,5 à 1'aide de NaOH 1N. Une centrifugation du mélange (10 000 g, 10 min. + 4 C) permet d'obtenir une fraction enrichie en
protéines de la membrane externe.
La protéine P18 est ensuite purifiée à 1'aide de deux étapes chromatographiques successives. La solution est dans un premier temps dialysée contre un tampon triéthylammonium formate 40 mM pH 3,1 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14 (TEAF/Zw). La première étape de purification est une chromatographie d'échange de cations: celle-ci est réalisée sur support Mono-S ou Source S (Amersham Pharmacia Biotech). L'élution des protéines est réalisce à l'aide d'un gradient linéaire de NaCI dans le tampon TEAF/Zw. Après analyse des fractions par él ectrophorès e, l es fractions contenant la P18 sont rassemblées, puis le mélange est dialysé contre un tampon Tris HC120 mM pH 8 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 314 (Tris/Zw). La seconde étape de purification est une chromatographie d ' échange d' anions réalisée sur support Mono Q ou Source Q (Amersham Pharmacia Biotech). L'élution des protéines est réalisée à 2s 1'aide d'un gradient linéaire de NaCI dans le tampon Tris/Zw. Après analyse des fractions par électrophorèse, les fractions contenant la P18 sont rassemblées puis
concentrées par ultrafiltration (seuil de coupure 10 kda).
Cette purification par chromatographie peut être réalisée avec succès directement
à partir des fractions membranaires totales.
Exemple 2: Caractérisation de la P18 1. Cartocraphie peptidique et séquençage de peptides issus de la P 18 La protéipe P18 est hydrolysée à 1'aide de l'endoprotéinase Lys-C: 100 1lg de protéine sont hydrolysés dans un tarnpon Tris-HCl 25 mM pH 8 contenant 1 mM EDTA pendant une nuit à 37 C (rapport Endo Lys-C/Pl8 = 1/50). Les peptides libérés sont purifiés par HPLC phase reverse sur colonne Vydac C18 (250 x 4,6 rnm). L'élution des s peptides est réalisce à l'aide d'un gradient linéaire d'acétonitrile. Deux pics majeurs sont isolés, puis lyophilisés avant d'être analysés par spectrométrie de masse et séquençage N-terminal. Les masses moléculaires et séquences N-terminales déterminées sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous: Tableau 1: Masse moléculaire et séquences N- terminales de la protéine P18 0 hydrolysée Pic A Pic B Masse molèculaire 10598,36 Da 5515,1 Da Séquence N- terminale ATSTVTGXYAa WDMSDYGFSY (10 acides aminés) SEQ ID N 15 SEQ ID N 16 a X: résidu non déterminé b: ES-MS pour " ElectroSpray-Mass Spectrometry 2. Clonage et séquençage du gène exprimant la protéine P18 Les séquences déterminces étant identiques à deux segments de la séquence de l'OmpK17 (Climent et al., Res. Microbiol. 148, 133-143, 1997), les oligonucléotides 'ggctagcaataaaattgcacgtctttcag 3' (SEQ ID N 17) et 5' cctcgaggaagcggtaacccacgccagc 3'(SEQ ID N 18) ont été utilisés pour amplifier le gène codant pour cette OMP: du DNA génomique à été isolé de la souche I-145 de KleLsiella pnemonine, cultivée comme décrit sous " exemple 1 " à l'aide d'un kit " Quiagen genomic tip system " (Qui agen, Courtaboeuf, France). Une réaction de polymérase en chaîne (P CR) a été effectuée à l'aide d'un kit " Expand high fidelity PCR system " selon les instructions du fournisseur (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) . Le produit de PCR a été cloné dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega, Charbonnières, France) et séquencé à 2s l'aide d'oligonucléotides appropriés. L'insert a été isolé par digestion avec les enzymes de restriction Nhe I et X7o I et électrophorèse en gel agarose et recloné dans le vecteur d'expression procariotique pET 24d (Novagen, Madison, VVI) . La construction pET 24d OmpK17 ou le vecteur vide pET 24d (contrôle) ont été introduits par transformation dans la souche de E. coli BL-21 DE3 (Novagen). Les bactéries ont été cultivées dans du milieu LB contenant 50 1lg par ml de kanamycine jusqu'à densité optique de 0,6 à 600 nm et l 'expression de la protéine recombinante induite par l j addition d' IPTG (concentration final e 1 mM) pour 4 h. Les b actéri es ont été lys ées par soni cati on d ans du s tampon 25 mM Tris-HC1 pH 7,4, 1,15 mM EDTA contenant 1 mg/ml de lysozyme et les fractions solubles séparées des corps d'inclusion par centrifugation à 10 000 g pour 15 min. Des aliquotes des fractions solubles ou des corps d'inclusions correspondant à 20 111 de cultures ont été repris dans du tampon 0,05 M Tris-HC1 pH 6,8, 0,1 M dithiothreitol, 2 /O SDS, 0,1% bromophénol blue, 20 % glycérol, dénaturés 5 min à
0 95 C et analysés par SDS-PAGE (figure 1).
La protéine OmpK17 est purifiée par chromatographie échangeuse d'ions. Après extraction, OmpK17 est reprise dans un tampon Tris 25 mM, 6 M urée, pH 8,5. La protéine est purifiée sur une colonne QHP sépharose, et est éluce à 110 mM NaCI, pH 8,5. Exemple 3: Couplage du peptide Angiotensine II La protéine P18 est dialysée contre un tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14 pendant une nuit à + 4 C. La concentration en protéine est ensuite ajustée à 2 mg/ml à l'aide d'un tampon carbonate de sodium 0,1 M pH 9 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 314. Le peptide Angiotensine II (AII), en solution à 1 mg/ml en tampon carbonate 0,1 M pH 9 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14, est additionné à la protéine afin d'obtenir un rapport AII/P18 = 1/4. Le couplage débute par l'addition de glutaraldéhyde à la concentration finale de 0,0185 %. Le mélange est placé sous agitation (agitateur basculant) à + 4 C. Une nouvelle addition de glut araldéhyde es t réal i sée après 96 heures. Le coupl age est stopp é, après 2 4 heures 2s d'agitation, par addition de Lysine 1 M: concentration finale = 3 mM. Le conjugué est dialysé contre un tampon PBS pendant une nuit à + 4 C, puis est filtré sur filtre 0,22 1lm
et conservé à- 20 C ou lyophilisé.
Exemple 4: Immunogénicité du coujugué P18-AII Des groupes de 5 souris (OF1) reçoivent par voie sous-cutanée à J0, J7 et J14, 15 g de peptide AII en présence d'adjuvant de Freund, ou 15 g de conjugué P18-AII en absence d'adjuvant. Le sang est prélevé à J21, J28, J35 et J42 et la réponse IgG anti AII est déterminée par ELISA. A cet effet, des microplaques de titration sont sensibilisées avec un conjugué BSA-AII à la concentration de 5 1lg/ml. Après saturation, les sérums de souris sont déposés et dilués: lére dilution testée = 1/lOO6me, puiS dilutions sérielles de raison 2. La réaction antigène/anticorps est mise en évidence à l'aide s d'anticorps secondaires anti-IgG de souris conjugués à une enzyme, puis par ajout du substrat de l'enzyme. Les résultats sont exprimés en logo du titre, le titre étant
déterminé comme l'inverse de la dernière dilution donnant une DO > 0,2.
Les résultats présentés dans la figure 2 montrent que la protéine P 18 est capable d'induire, en absence d'adjuvant, une réponse anticorps contre un peptide qui lui est associé, ce même poptide étant incapable de générer une telle réponse méme lorsqu'il
est injecté en présence d'un adjuvant puissant comme l'adjuvant de Freund.
Ces résultats mettent en évidence les propriétés de porteur et d'adjuvant de la
protéine P18.
Exemple 5: Clonage et séquençage du gène exprimant la protéine PX d'E. Coli De la méme manière que pour l'OmpK17, le clonage et le séquençage ont été réalisés en utilisant le DNA génomique de la souche E. coli XL1 blue (Stratagène). Les oligonucléotides 5' cctcgaggaagcggtaaccaacaccggc 3' (SEQ ID N l9) et 5' gggctagcaataaaaaaatt gcatgtctttc 3' (SEQ ID N 20) ont été utilisés pour amplifier le gène
codant pour cette OmpX.
La protéine OmpX est purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne nickel (IMAC). Après extraction, OmpX est reprise dans un tampon Tris 25 mM, 6 M urée, NaC10,5 M, imidazole 1,25 mM, pH 8,5. Elle est chargée sur la colonne IMAC préalablement équilibrce avec le tampon Tris 25 mM, 6 M urée, NaC1 0,5 M, imidazole 1,25 mM, pH 8,5. Après lavage de la colonne avec ce méme tampon, OmpX est éluée à
2s 500 mM imidazole, pH 8,5.
i Jl
REVE ND I CATI ON S
1/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire ou une construction nucléique codant pour
ledit poptide.
2/ Composition selon la revendication 1, dans laquelle l'Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est caractérisce en ce qu'elle présente une
masse moléculaire comprise entre 15 et 25 kDa.
0 3/ Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisi parmi: - une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire; - un peptide présentant après alignement optimal 80 % d'homologie avec une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire; - un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire et présentant une activité immunogénique; et
- un épitope T helper d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire.
4/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,
caractérisée en ce que le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire est choisi parmi un peptide provenant d'une protéine OmpK17 de Kletsiella pnenmoniae, OmpX de Escherichia coli, OmpX de Enterobacter clocue, Rck et PagC de Salmonella typhimurium et Rck de Salmonella enteritidis, Ail de Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, PagC de Salmonella typhimurium, Omp4 de Serratia marcescens, IalB de Bartonella bacilliformis et Lom du bactériophage lambda.
/ Composition selon l'une quelcorique des revendications 1 à 4,
caractérisce en ce que le peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire comprend: a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2 ou 4; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant après alignement optimal une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N 2 ou 4; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une
séquence telle que définie en a).
6/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,
caractérisée en ce qu'elle contient en outre un antigène, immunogène ou haptène.
s 7/ Composition selon la revendication 6, caractérisce en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides
nucléiques et les lipides.
8/ Composition selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. 9/ Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pnenmocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. / Composition selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du
virus respiratoire syncytial.
111 Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'antigène,
immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale.
121 Composition selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que
ledit antigène, immunogène ou haptène est associé, par mélange ou par couplage, au
2s peptide provenant d'une Omp d'entérobacterie de faible masse moléculaire.
131 Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène, immunogène ou haptène et ledit peptide provenant d'une Omp
d'entérobacterie de faible masse moléculaire est réalisé par recombinaison génétique.
14/ Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que
ladite composition pharmaceutique contient en outre un adjuvant, préférentiellement choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, 1'ISCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure
(DDAC), les CpG, la Leif, la CT, la LT et les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
/ Composition selon l'une des revendications l à 13, caractérisée en ce que
ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que le poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible masse moléculaire.
161 Composition selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que
ladite composition contient en outre un détergent.
17/ Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit détergent est choisi parmi les tensioactifs anioniques, cationiques, nonioniques ou 0 amphotères, et préférentiellement parmi le Zwittergent 3-12, l'octylglucopyrannoside et
le Zwittergent 3-14.
181 Composition selon l'une des revendications l à 15, caractérisce en ce que
ladite composition ne contient pas de détergent.
191 Composition selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que
i5 ledit milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'eau, d'une solution aqueuse
saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose etlou de glycérol.
201 Composition selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que
ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer
sa stabilité etlou son immunogénicité.
211 Utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible
masse moléculaire telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 ou d'une
construction nucléique codant pour ledit poptide comme porteur etlou adjuvant pour la
préparation d'un vaccin.
221 Utilisation d'un poptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible
masse moléculaire telle que définie dans l'une des revendications l à 4 ou d'une
construction nucléique codant pour ledit poptide pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales' bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement
prophylactique ou thérapeutique des cancers.
231 Utilisation d'un peptide provenant d'une Omp d'entérobactérie de faible
masse moléculaire telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 ou d'une
construction nucléique codant pour ledit peptide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer on accrotre une réponse imrounitaire contre un agent
*infectieux ou une cellule tumorale.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0110381A FR2828106A1 (fr) | 2001-08-02 | 2001-08-02 | Utilisation d'une omp d'enterobacterie de faible masse moleculaire comme porteur et/ou adjuvant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0110381A FR2828106A1 (fr) | 2001-08-02 | 2001-08-02 | Utilisation d'une omp d'enterobacterie de faible masse moleculaire comme porteur et/ou adjuvant |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2828106A1 true FR2828106A1 (fr) | 2003-02-07 |
Family
ID=8866229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0110381A Pending FR2828106A1 (fr) | 2001-08-02 | 2001-08-02 | Utilisation d'une omp d'enterobacterie de faible masse moleculaire comme porteur et/ou adjuvant |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2828106A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021120019A1 (fr) * | 2019-12-17 | 2021-06-24 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | Composition d'immunisation et son procédé de préparation |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996014415A1 (fr) * | 1994-11-07 | 1996-05-17 | Pierre Fabre Medicament | Proteine porteuse a effet adjuvant, complexe immunogene la contenant, leur procede de preparation, sequence nucleotidique et vaccin |
| WO1997041888A1 (fr) * | 1996-05-07 | 1997-11-13 | Pierre Fabre Medicament | Complexe immunogene, son utilisation, son procede de preparation et vaccin le contenant |
| WO1999049892A2 (fr) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Pierre Fabre Medicament | Utilisation de conjugues p40 actifs par voie nasale |
| WO2001021203A1 (fr) * | 1999-09-23 | 2001-03-29 | Pierre Fabre Medicament | Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale |
-
2001
- 2001-08-02 FR FR0110381A patent/FR2828106A1/fr active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996014415A1 (fr) * | 1994-11-07 | 1996-05-17 | Pierre Fabre Medicament | Proteine porteuse a effet adjuvant, complexe immunogene la contenant, leur procede de preparation, sequence nucleotidique et vaccin |
| WO1997041888A1 (fr) * | 1996-05-07 | 1997-11-13 | Pierre Fabre Medicament | Complexe immunogene, son utilisation, son procede de preparation et vaccin le contenant |
| WO1999049892A2 (fr) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | Pierre Fabre Medicament | Utilisation de conjugues p40 actifs par voie nasale |
| WO2001021203A1 (fr) * | 1999-09-23 | 2001-03-29 | Pierre Fabre Medicament | Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANDRADE DE C M ET AL: "CHEMICAL AND IMMUNOLOGICAL CHARACTERIZATION OF A LOW MOLECULAR WEIGHT OUTER MEMBRANE PROTEIN OF SALMONELLA TYPHI", MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, TOKYO, JP, vol. 42, no. 8, 1998, pages 521 - 526, XP001008307, ISSN: 0385-5600 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021120019A1 (fr) * | 2019-12-17 | 2021-06-24 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | Composition d'immunisation et son procédé de préparation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BE1024361B1 (fr) | Composition immunogene | |
| BE1024767B1 (fr) | Composition immunogene | |
| FR2827605A1 (fr) | Nouveaux peptides derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin | |
| US11286283B2 (en) | Immunogenic composition | |
| US20210077607A1 (en) | Immunogenic composition | |
| EP1335935A1 (fr) | Domaine periplasmique d'une proteine omp d'enterobacterie et son utilisation comme porteur ou adjuvant | |
| EP1150707B1 (fr) | UTILISATION D'UNE PROTEINE OmpA D'ENTEROBACTERIE ASSOCIEE AU PEPTIDE ELAGIGILTV POUR LE TRAITEMENT DE MELANOMES | |
| BE1022949B1 (fr) | Composition immunogene | |
| EP1124577B1 (fr) | Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie, pour le ciblage specifique vers les cellules presentatrices d'antigenes | |
| FR2828106A1 (fr) | Utilisation d'une omp d'enterobacterie de faible masse moleculaire comme porteur et/ou adjuvant | |
| FR2827606A1 (fr) | Nouveaux derives d'anatoxines diphteriques et leur utilisation comme porteur | |
| WO2002035242A1 (fr) | Procede d'identification de nouvelles molecules se liant au recepteur lox | |
| WO2000050071A1 (fr) | PROTEINE OmpA DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE ASSOCIEE A L'HORMONE HCG OU A UN COMPOSE IMPLIQUE DANS LA PROLIFERATION DE CELLULES TUMORALES OU DANS LA FERTILITE | |
| EP3770269A1 (fr) | Quantification de glycosylation de bioconjugués | |
| FR2805163A1 (fr) | Utilisation d'un detergent de type zwittergent pour la preparation d'une composition pharmaceutique destinee a etre administree par voie nasale | |
| WO2001082959A1 (fr) | Proteine omp associee a un lysat de cellules tumorales autologues et/ou heterologues | |
| FR2806913A1 (fr) | Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale |