BE1024767B1 - Composition immunogene - Google Patents

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BE1024767B1 BE20175427A BE201705427A BE1024767B1 BE 1024767 B1 BE1024767 B1 BE 1024767B1 BE 20175427 A BE20175427 A BE 20175427A BE 201705427 A BE201705427 A BE 201705427A BE 1024767 B1 BE1024767 B1 BE 1024767B1
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Amirreza Faridmoayer
Sabina Marietta Gerber
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Glaxosmithkline Biologicals Sa
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Abstract

La présente invention divulgue des protéines pneumolysines modifiées de Streptococcus pneumoniae qui contiennent des séquences consensus de sites de glycosylation. L'invention divulgue également un conjugué comprenant une protéine pneumolysine modifiée et un antigène (par exemple, un antigène saccharidique de Streptococcus pneumoniae), dans lequel l'antigène est lié (soit directement soit par l'intermédiaire d'un lieur) à un résidu d'acide aminé de la protéine pneumolysine modifiée.

Description

(73) Titulaire(s) :
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA
1330, RIXENSART
Belgique (72) Inventeur(s) :
FARIDMOAYER Amirreza 8952 SCHLIEREN Suisse
GERBER Sabina Marietta 8952 SCHLIEREN Suisse (54) COMPOSITION IMMUNOGENE (57) La présente invention divulgue des protéines pneumolysines modifiées de Streptococcus pneumoniae qui contiennent des séquences consensus de sites de glycosylation. L'invention divulgue également un conjugué comprenant une protéine pneumolysine modifiée et un antigène (par exemple, un antigène saccharidique de Streptococcus pneumoniae), dans lequel l'antigène est lié (soit directement soit par l'intermédiaire d'un lieur) à un résidu d'acide aminé de la protéine pneumolysine modifiée.
Figure BE1024767B1_D0001
Q
Figure: 1
BREVET D'INVENTION BELGE
SPF Economie, PME, Classes Moyennes & Energie
Numéro de publication : 1024767 Numéro de dépôt : BE2017/5427
Office de la Propriété intellectuelle
Classification Internationale : A61K 39/09 C07K 14/315 C12P 19/00 Date de délivrance : 28/06/2018
Le Ministre de l'Economie,
Vu la Convention de Paris du 20 mars 1883 pour la Protection de la propriété industrielle ;
Vu la loi du 28 mars 1984 sur les brevets d'invention, l'article 22, pour les demandes de brevet introduites avant le 22 septembre 2014 ;
Vu le Titre 1er “Brevets d’invention” du Livre XI du Code de droit économique, l'article XI.24, pour les demandes de brevet introduites à partir du 22 septembre 2014 ;
Vu l'arrêté royal du 2 décembre 1986 relatif à la demande, à la délivrance et au maintien en vigueur des brevets d'invention, l'article 28 ;
Vu la demande de brevet d'invention reçue par l'Office de la Propriété intellectuelle en date du 15/06/2017.
Considérant que pour les demandes de brevet tombant dans le champ d'application du Titre 1er, du Livre XI du Code de Droit économique (ci-après CDE), conformément à l'article XI. 19, §4, alinéa 2, du CDE, si la demande de brevet a fait l'objet d'un rapport de recherche mentionnant un défaut d'unité d'invention au sens du §ler de l'article XI.19 précité et dans le cas où le demandeur n'effectue ni une limitation de sa demande ni un dépôt d'une demande divisionnaire conformément aux résultats du rapport de recherche, le brevet délivré sera limité aux revendications pour lesquelles le rapport de recherche a été établi.
Arrête :
Article premier. - Il est délivré à
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA, Rue de l'Institut 89, 1330 RIXENSART Belgique;
représenté par
PRONOVEM - Office Van Malderen, Avenue Josse Goffin 158, 1082, BRUXELLES;
un brevet d'invention belge d'une durée de 20 ans, sous réserve du paiement des taxes annuelles visées à l’article XI.48, §1 du Code de droit économique, pour : COMPOSITION IMMUNOGENE.
INVENTEUR(S) :
FARIDMOAYER Amirreza, c/o LimmaTech Biologies AG, Grabenstrasse 3, 8952, SCHLIEREN;
GERBER Sabina Marietta, c/o LimmaTech Biologies AG, Grabenstrasse 3, 8952, SCHLIEREN;
PRIORITE(S) :
17/06/2016 GB 1610599.1;
DIVISION :
divisé de la demande de base : date de dépôt de la demande de base :
Article 2. - Ce brevet est délivré sans examen préalable de la brevetabilité de l'invention, sans garantie du mérite de l'invention ou de l'exactitude de la description de celle-ci et aux risques et périls du (des) demandeur(s).
Bruxelles, le 28/06/2018, Par délégation spéciale :
BE2017/5427
COMPOSITION IMMUNOGENE
Domaine technique
La présente invention concerne le domaine des compositions immunogènes et des vaccins, leur fabrication et l'utilisation de telles compositions en médecine. Plus particulièrement, elle concerne une pneumolysine modifiée issue de Streptococcus pneumoniae et son utilisation en tant que protéine de support. La pneumolysine modifiée peut être utilisée en tant que protéine de support pour d'autres antigènes, particulièrement des antigènes saccharidiques ou d'autres antigènes auxquels il manque des épitopes de lymphocytes T, ou en tant qu'antigène à elle seule.
Contexte
Les antigènes T-indépendants, par exemple des saccharides, sont des antigènes qui déclenchent la production d'anticorps par l'intermédiaire des lymphocytes B sans implication des lymphocytes T. La conjugaison des antigènes T-indépendants à des protéines de support a été établie depuis longtemps comme moyen permettant aux lymphocytes T de faire partie de la
BE2017/5427 réponse immunitaire induite par un antigène normalement T-indépendant. De cette façon, une réponse immunitaire peut être amplifiée en permettant le développement d'une mémoire immunitaire et la possibilité de stimuler la réponse. Des vaccins conjugués efficaces développés en conjuguant des saccharides capsulaires bactériens à des protéines de support sont connus dans l'art ; la protéine de support ayant l'effet connu de transformer l'antigène saccharidique T-indépendant en un antigène T-dépendant capable de déclencher une réponse immunitaire mémoire. Plusieurs protéines de support sont connues dans l'art avec l'anatoxine tétanique, l'anatoxine diphtérique, la CRM197 et la protéine D d'Haemophilus influenzae étant utilisées en tant que protéine de support dans des vaccins commercialisés. La CRM197 est actuellement utilisée dans le vaccin à base de conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae PREVENAR™ (Pfizer) et la protéine D, l'anatoxine tétanique et l'anatoxine diphtérique sont actuellement utilisées en tant que supports pour des polysaccharides capsulaires dans le vaccin à base de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae SYNFLORIX™ (GlaxoSmithKline). D'autres protéines de support connues dans l'art comprennent l'EPA (exotoxine A de P. aeruginosa) pour les polysaccharides capsulaires de Staphylococcus aureus des sérotypes 5 et 8 (Wacker et al. J Infect. Dis, 15 mai 2014: 209(10): 1551-1561) et la protéine de la membrane externe (OMP) pour Haemophilus influenzae non typable (NTHi) (Wu et al. Infect. Imun. Oct. 1999 67(1): 5508-5513).
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Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumocoque) est une bactérie Gram positif responsable d'une morbidité et d'une mortalité considérable (particulièrement chez les nourrissons et les personnes âgées), provoquant des maladies invasives telles que la bactériémie et la méningite, la pneumonie et d'autres maladies non invasives, telles que l'otite moyenne aiguë. Environ 800 000 enfants meurent chaque année à cause d'une maladie pneumococcique, spécialement dans les pays émergents (O-Brien et al. 2009 Lancet 374: 893-902). Le nombre croissant des souches résistantes aux antibiotiques (Linares et al. 2010 Cin. Microbiol. Infect. 16: 402-410) et la gravité des maladies pneumococciques rendent la vaccination 1'intervention la plus efficace. Les principaux syndromes cliniques provoqués par S. pneumoniae sont largement reconnus et discutés dans des manuels médicaux classiques (Fedson DS, Muscher DM. Dans : Plotkin SA, Orenstein WA, editors. Vaccines. 4ème édition. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588). Par exemple, la maladie pneumococcique invasive (MPI) est définie comme toute infection dans laquelle S. pneumoniae est isolé du sang ou d'un autre site normalement stérile (Musher DM. Streptococcus pneumoniae. Dans Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious diseases (5ème éd.). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 21282147) .
S. pneumoniae est encapsulé avec un polysaccharide lié de façon covalente qui confère un sérotype spécifique. Il existe plus de 90 sérotypes connus de pneumocoques, et la capsule est le déterminant principal de la
BE2017/5427 virulence pour les pneumocoques, car la capsule non seulement protège la surface interne de la bactérie contre le complément, mais elle est elle-même faiblement immunogène. Certains sérotypes sont plus abondants que d'autres, pour être associés aux infections cliniquement apparentes, pour provoquer des infections invasives sévères et pour acquérir une résistance contre une ou plusieurs classes d'agents antibactériens (Rueda, A. M. M. MSc; Serpa, José A. MD; Matloobi, Mahsa MD; Mushtaq, Mahwish MD; Musher, Daniel M. MD. 2010. The spectrum of invasive pneumococcal disease at an adult tertiary care hospital in the early 21st century. Medicine (Baltimore) 89: 331-336). Selon des analyses antérieures, approximativement 10 ou 11 sérotypes représentent plus de 70 % des infections pédiatriques invasives dans toutes les régions du monde (Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR: Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2000, 30(1): 100121) . La distribution des sérotypes provoquant une maladie varie selon l'âge, le syndrome pathologique, la gravité de la maladie, la région géographique, et dans le temps. Les pneumocoques qui sont résistants à la pénicilline, à l'érythromycine, au cotrimoxazole ou à des médicaments multiples sont courants dans de nombreuses régions (Evolving trends in Streptococcus pneumoniae resistance: implications for therapy of community-acquired bacterial pneumonia. Jones RN, Jacobs
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MR, Sader HS. Int J Antimicrob Agents. Sept. 2010; 36(3) : 197-204) .
Les polysaccharides bactériens peuvent déclencher une réponse immunitaire de longue durée chez les êtres humains s'ils sont couplés à un support protéinique qui contient des épitopes de lymphocytes T. Ce concept a été élaboré il y a presque 100 ans (Avery, O. T. and W. F. Goebel, 1929, J. Exp. Med. 50: 521-533), et prouvé plus tard pour le polysaccharide d'Haemophilus influenza de type B (HIB) couplé à un support protéique, la toxine diphtérique (Anderson, P. 1983, Infect Immun 39: 233-8 ; Schneerson, R. O. Barrera, A. Sutton, and J. B. Robbins. 1980, J Exp Med 152: 361-76) . Ce glycoconjugué a été également le premier vaccin conjugué à être autorisé aux Etats-Unis en 1987 et introduit dans le calendrier d'immunisation des nourrissons américains peu de temps après. En dehors du HIB, des vaccins conjugués ont été développés avec succès contre les agents pathogènes pour l'être humain encapsulés Neisseria meningitidis et S. pneumoniae. Après l'autorisation initiale d'un vaccin conjugué 7-valent contenant les sérotypes 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F (VPC7), deux vaccins pneumococciques conjugués (VPC) conçus pour élargir la couverture ont été autorisés. Le vaccin pneumococcique conjugué à base de la protéine D d'Haemophilus influenzae 10-valent (VPC10) contient les sérotypes 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 et 23F conjugués à la protéine D d'H. influenzae non typable, plus le sérotype 18C conjugué à l'anatoxine tétanique et le sérotype 19F conjugué à l'anatoxine diphtérique. Le vaccin pneumococcique conjugué 13-valent (VPC13) contient les sérotypes du VPC7 (4, 6B, 9V, 14,
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18C, 19F, 23F) plus les sérotypes 1, 3, 5, 6A, 7F et 19A, conjugués au matériau à réactivité croisée, la CRM197.
La pneumolysine (ply) est une cytolysine thiolactivée de 53 kDa trouvée dans toutes les souches de S. pneumoniae, elle est libérée lors de l'autolyse et contribue à la pathogenèse de S. pneumoniae. Elle est hautement conservée avec seulement quelques substitutions d'acides aminés survenant entre les protéines ply de différents sérotypes. La pneumolysine est une toxine multifonctionnelle avec des activités distinctes de cytolyse (hémolyse) et d'activation du complément (Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med, 153: 1339-1346 (1996)). La toxine n'est pas sécrétée par les pneumocoques, mais elle est libérée lors de la lyse des pneumocoques sous l'influence de l'autolysine. Ses effets comprennent, par exemple, la stimulation de la production des cytokines inflammatoires par les monocytes humains, l'inhibition du battement des cils sur l'épithélium respiratoire humain, la diminution de l'activité bactéricide et de la migration des neutrophiles, et dans la lyse des érythrocytes, qui implique la liaison au cholestérol. L'expression et le clonage de la pneumolysine de type sauvage ou native sont décrits dans Walker et al. (Infect Immun, 55: 11841189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Brophys Acta, 1007: 67-72 (1989) et Mitchell et al. (NAR, 18: 4010 (1990)). La structure de la pneumolysine, un complexe formant des pores, est décrite dans van Pee et al. (Elife 21 mars 2017; 6. pii: e23644. doi: 10.7554/eLife.23644), Lawrence et al. (Sei Rep. 25 septembre 2015; 5: 14352. doi: 10.1038/srepl4352.) et Marshall et al. (Sei Rep. 3
BE2017/5427 septembre 2015; 5: 13293. doi: 10.1038/srepl3293) et le mécanisme cytolytique est décrit dans Park et al. (J Struct Biol. février 2016; 193(2): 132-40. doi: 10.1016/j.jsb.2015.12.002 . Epub 10 décembre 2015) et van Pee et al. (Nano Lett. 14 décembre 2016; 16(12): 79157924. Epub 3 novembre 2016).
Les vaccins contre la maladie pneumococcique peuvent être synthétisés in vitro par une technologie de conjugaison chimique bien établie. Les polysaccharides capsulaires antigéniques sont extraits des organismes pathogènes, purifiés, activés chimiquement et conjugués à un support protéinique approprié. Actuellement, il existe différents supports protéiniques utilisés pour produire les glycoconjugués, par exemple, la CRM197 (anatoxine diphtérique), l'anatoxine tétanique, et la protéine D d'Haemophilus influenzae.
Alors que le développement de vaccins contre une telle infection est continuel, il demeure un besoin majeur de vaccins efficaces contre une infection par Streptococcus pneumoniae qui peuvent être produits sans risque en quantités élevées. Il existe également un besoin de produire un vaccin avec une large couverture des sérotypes contre une infection par Streptococcus pneumoniae.
Résumé de 1'invention
La présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée et des conjugués (y compris des bioconjugués) dans lesquels la protéine pneumolysine agit à la fois comme une protéine de support pour un antigène saccharidique (par exemple, oligosaccharidique
BE2017/5427 ou polysaccharidique) et/ou comme un antigène à elle seule.
Par conséquent, il est fourni dans un aspect de la présente invention, une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou une séquence d'acides aminés ayant un pourcentage d'identité d'au moins (ou dite au moins identique) à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1, modifiée en ce que la séquence d'acides aminés comprend une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline. En d'autres termes, la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 est modifiée de telle façon qu'elle comprend une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant un antigène lié de façon covalente à une protéine pneumolysine modifiée de l'invention.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un polynucléotide codant pour une protéine pneumolysine modifiée de l'invention.
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Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour une protéine pneumolysine modifiée de l'invention.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni une cellule hôte comprenant
i) un ou plusieurs acides nucléiques qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases ;
ii) un acide nucléique qui code pour une oligosaccharyltransférase ;
iii) un acide nucléique qui code pour une protéine pneumolysine modifiée de l'invention ; et éventuellement iv) un acide nucléique qui code pour une polymérase (par exemple, wzy) .
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un procédé de production d'un bioconjugué qui comprend (ou est constitué de) une protéine pneumolysine modifiée liée à un saccharide, ledit procédé comprenant : (i) la culture de la cellule hôte de l'invention dans des conditions appropriées pour la production de protéines et (ii) l'isolement du bioconjugué produit par ladite cellule hôte.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un bioconjugué produit par un procédé de l'invention, dans lequel ledit bioconjugué comprend un saccharide lié à une protéine pneumolysine modifiée.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni une composition immunogène comprenant la protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou un conjugué de l'invention, ou un bioconjugué de l'invention et un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
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Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un procédé de fabrication d'une composition immunogène de l'invention comprenant l'étape de mélange de la protéine pneumolysine modifiée ou du conjugué ou du bioconjugué avec un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un procédé pour le traitement ou la prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration au dit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou d'un conjugué de l'invention, ou d'un bioconjugué de l'invention.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un procédé d'immunisation d'un hôte humain contre une infection par Streptococcus pneumoniae comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice d'une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou d'un conjugué de l'invention, ou d'un bioconjugué de 1'invention.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni un procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre Streptococcus pneumoniae chez un sujet, le procédé comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou d'un conjugué de l'invention, ou d'un bioconjugué de 1'invention.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou un conjugué de l'invention, ou un bioconjugué de
BE2017/5427 l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae.
Selon un autre aspect de l'invention, il est fourni une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou un conjugué de l'invention, ou un bioconjugué de l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae.
Description des figures
Figure 1 - Représentation en ruban de la structure de la pneumolysine issue de Streptococcus pneumoniae. Les domaines 1 et 4 sont colorés en gris foncé, le domaine 2 est en noir, et le domaine 3 est en gris clair. La boucle N-terminale et la boucle courte C-terminale sont indiquées. Pour les six positions les plus efficaces pour l'introduction de sites de glycosylation, les acides aminés remplacés par la séquence -KDQNATK(SEQ ID NO : 31) sont représentés sous la forme de sphères et sont marqués.
Figure 2 - Glycosylation in vivo glycomodifiés de la pneumolysine détoxifiée, dPly). Il est représenté des immunoblots détectant la protéine Ply acceptrice marquée par His et modifiée glycosylée avec le polysaccharide capsulaire issu de Streptococcus pneumoniae du sérotype 4 (CP4).
Les acides aminés qui ont été remplacés par le séquon de glycosylation -KDQNATK- (SEQ ID NO : 31) sont indiqués au-dessus de chacune des colonnes. La glycosylation produit un décalage de la mobilité de la forme non des mutants (pneumolysine
BE2017/5427 glycosylée (Plyu ; également appelée « U-dPLY ») à la forme glycosylée de la protéine acceptrice (Plygiyco ; également appelée « CP4dPLY ») . L'échantillon (-) représente la Ply sans aucun site de glycosylation ; l'échantillon (+) représente la protéine EPA glycosylée contenant deux sites de glycosylation.
Figures 3a à d - Alignement de multiples séquences de la pneumolysine issue de 16 sérotypes différents montrant la forte conservation de la séquence. L'alignement a été réalisé en utilisant Clustal Omega (disponible sur www(.)ebi(.)ac(.)uk).
Figure 4 - Western blot avec un anticorps anti-His de l'extrait périplasmique provenant de cultures bactériennes exprimant la pneumolysine détoxifiée marquée par His (dPLYHiS6) .
Figure 5 - Gel de SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie de la pneumolysine détoxifiée (dPLY) modifiée purifiée conjuguée au CP4 (voir l'exemple 6). La production de CP4 conjugué à la dPLY modifiée a été démontrée.
Figures 6A à E - Des études chez des cobayes ont démontré que le CPA-dPLY a déclenché des anticorps fonctionnels contre à la fois la pneumolysine et le CP4 (figures 6D, 6E) . Il n'a été observé aucune différence significative du taux de réponse des IgG et de l'OPA contre le CP4 entre les groupes injectés avec la même dose (basée sur le CP) de CP4-dPLY et de CP4-EPA (figures 6A, 6D) , suggérant que l'EPA et la dPLY sont des supports efficaces de façon égale pour le CP4 chez les cobayes. Deux doses différentes, 0,1 pg et 1 pg, basées sur le glycane ont été injectées chez des cobayes
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Hartley femelles âgés de 5 à 8 semaines (n = 12, le seul groupe Al(OH)3 n = 4). L'administration du vaccin a été intramusculaire aux jours 0, 14 et 28. Il est montré les résultats obtenus avec les sérums produits avant l'immunisation (jO, pré) et après trois immunisations (j 42, post) .
Figure 7 - Gel de SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie (premier panel) et Western blot (anticorps anti-His, deuxième panel ; anticorps anti-CP33F, troisième panel) de la pneumolysine détoxifiée (dPLY) modifiée purifiée conjuguée au CP33F (voir l'exemple 7).
Figure 8 - Western blot de la pneumolysine détoxifiée (dPLY) modifiée purifiée conjuguée au CP12F pour le plasmide p2401 (Ply_mut48, PellB, pEC415, Kan) dans le couloir 2 et le plasmide p2901 (Ply_mut48, TolB, pEC415, Kan) dans le couloir 3 (voir l'exemple 12).
Description détaillée
Terminologie
Protéine de support : une protéine fixée de façon covalente à un antigène (par exemple, un antigène saccharidique) pour créer un conjugué (par exemple, un bioconjugué). Une protéine de support active l'immunité médiée par les lymphocytes T en relation avec l'antigène auquel elle est conjuguée.
Acide aminé quelconque à part la proline (pro, P) : se rapporte à un acide aminé choisi dans le groupe constitué de l'alanine (ala, A), l'arginine (arg, R), l'asparagine (asn, N) , l'acide aspartique (asp, D), la cystéine (cys, C), la glutamine (gin, Q), l'acide glutamique (glu, E) , la glycine (gly, G), l'histidine
BE2017/5427 (his, H), l'isoleucine (ile, I), la leucine (leu, L), la lysine (lys, K) , la méthionine (met, M), la phénylalanine (phe, F), la sérine (ser, S), la thréonine (thr, T), le tryptophane (trp, W) , la tyrosine (tyr, Y) , la valine (val, V).
PLY ou ply : pneumolysine de S. pneumoniae.
CP : polysaccharide capsulaire.
LPS : lipopolysaccharide.
wzy : le gène de la polymérase du polysaccharide codant pour une enzyme qui catalyse la polymérisation des polysaccharides. L'enzyme codée transfère les unités oligosaccharidiques à l'extrémité non réductrice formant une liaison glycosidique.
waaL : le gène de la ligase de l'antigène O codant pour une enzyme liée à la membrane. L'enzyme codée transfère l'antigène O lié au diphosphate d'undécaprényle (UPP) à l'oligosaccharide central du lipide A, formant le lipopolysaccharide.
Und-PP : pyrophosphate d'undécaprényle.
Und-P : phosphate d'undécaprényle.
Extrémité réductrice : l'extrémité réductrice d'un oligosaccharide ou d'un polysaccharide est un monosaccharide avec un carbone anomérique libre qui n'est pas impliqué dans une liaison glycosidique et est ainsi capable d'être converti en forme à chaîne ouverte.
Tel qu'utilisé ici, le terme « bioconjugué » se rapporte à un conjugué entre une protéine (par exemple, une protéine de support) et un antigène (par exemple, un saccharide) préparé dans un contexte de cellule hôte, dans lequel la machinerie de la cellule hôte lie l'antigène à la protéine (par exemple, liaisons en N) .
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Tel qu'utilisé ici, le terme « quantité efficace », dans le contexte de l'administration d'un traitement (par exemple, une composition immunogène ou un vaccin de l'invention) à un sujet se rapporte à la quantité d'un traitement qui a un ou plusieurs effets prophylactiques et/ou thérapeutiques. Dans certains modes de réalisation, une « quantité efficace » se rapporte à la quantité d'un traitement qui est suffisante pour obtenir un, deux, trois, quatre, ou plus des effets suivants : (i) réduire ou améliorer la gravité d'une infection bactérienne ou d'un symptôme qui y est associé ; (ii) réduire la durée d'une infection bactérienne ou d'un symptôme qui y est associé ; (iii) prévenir la progression d'une infection bactérienne ou d'un symptôme qui y est associé ; (iv) provoquer la régression d'une infection bactérienne ou d'un symptôme qui y est associé ; (v) prévenir le développement ou l'installation d'une infection bactérienne, ou d'un symptôme qui y est associé ; (vi) prévenir la récurrence d'une infection bactérienne ou d'un symptôme qui y est associé ; (vii) réduire une insuffisance organique associée à une infection bactérienne ; (viii) réduire l'hospitalisation d'un sujet souffrant d'une infection bactérienne ; (ix) réduire la durée de l'hospitalisation d'un sujet souffrant d'une infection bactérienne ; (x) augmenter la survie d'un sujet souffrant d'une infection bactérienne ;
(xi) éliminer une infection bactérienne chez un sujet ;
(xii) inhiber ou réduire une réplication bactérienne chez un sujet ; et/ou (xiii) amplifier ou améliorer le ou les effets prophylactiques ou thérapeutiques d'un autre traitement.
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Tel qu'utilisé ici, le terme « sujet » se rapporte à un animal, en particulier un mammifère tel qu'un primate (par exemple, un être humain).
Tel qu'utilisé ici, le terme « oligosaccharide ou polysaccharide donneur » se rapporte à un oligosaccharide ou un polysaccharide à partir duquel un oligosaccharide ou un polysaccharide est dérivé. Les oligosaccharides et les polysaccharides donneurs, tels qu'utilisés ici, comprennent un monosaccharide d'hexose (par exemple, de glucose) à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive. L'utilisation du terme oligosaccharide ou polysaccharide donneur n'est pas censée suggérer qu'un oligosaccharide ou un polysaccharide est modifié in situ. Plutôt, l'utilisation du terme oligosaccharide ou polysaccharide donneur est censée se rapporter à un oligosaccharide ou un polysaccharide qui, dans son état de type sauvage, est un substrat faible pour l'activité oligosaccharyltransférase (par exemple, PglB) ou n'est pour l'activité oligosaccharylexemple, PglB). Les exemples ou de polysaccharides donneurs comprennent ceux provenant de bactéries, y compris les CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6(A,B,C,D), CP7(A,B,C), CP8, CP9(A,L,N,V), CP10 (A,B,C,F) , CPI1(A,B,C,D,F),
CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15(A,B,C,F), CP16 (A,F),
CP17(A,F), CPI 8(A,B,C,F), CPI 9(A,B,C,F), CP20, CP21,
CP22(A,F), CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26,
CP27, CP28(A,F), CP29, CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, pas un substrat transférase (par d'oligosaccharides
CP41(A,F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F), et
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CP48 de S. pneumoniae. L'homme du métier pourra facilement déterminer si un oligosaccharide ou un polysaccharide comprend un monosaccharide d'hexose (par exemple, de glucose) à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive, et ainsi si un tel oligosaccharide ou polysaccharide est un oligosaccharide ou un polysaccharide donneur tel qu'englobé ici.
Tel qu'utilisé ici, le terme « dérivé monosaccharidique d'hexose » se rapporte à un dérivé monosaccharidique d'hexose qui peut être un substrat pour l'activité oligosaccharyltransférase. En général, les dérivés monosaccharidiques d'hexose comprennent un monosaccharide comprenant un groupe acétamido en position 2. Les exemples de dérivés monosaccharidiques d'hexose comprennent la GlcNAc, la HexNAc, la désoxyHexNAc, ou le 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose.
Tel qu'utilisé ici, le terme « oligosaccharide ou polysaccharide hybride » se rapporte à un oligosaccharide ou un polysaccharide modifié qui ne comprend pas un hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive, mais à la place comprend un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive.
Tel qu'utilisé ici, le terme « fragment immunogène » est une partie d'un antigène plus petite que l'antigène entier, qui est capable de déclencher une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire chez un animal hôte, par exemple, un être humain, spécifique de ce fragment. Des fragments d'une protéine peuvent être produits en utilisant des techniques connues dans l'art, par exemple, par recombinaison, par digestion
BE2017/5427 protéolytique, ou par synthèse chimique. Les fragments internes ou terminaux d'un polypeptide peuvent être produits par prélèvement d'un ou de plusieurs nucléotides à partir d'une extrémité (pour un fragment terminal) ou des deux extrémités (pour un fragment interne) d'un acide nucléique qui code pour le polypeptide. Généralement, les fragments comprennent au moins 10, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés de la séquence pleine longueur. Les fragments peuvent être facilement modifiés par addition ou élimination de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés à partir de l'une ou l'autre ou des deux extrémités N et C terminales.
Tel qu'utilisé ici, le terme « substitution conservative d'acide aminé » implique la substitution d'un résidu d'acide aminé natif par un résidu non natif de telle façon qu'il y a peu ou pas d'effet sur la taille, l'hydrophobicité, ou aminé à cette diminution de la polarité, la charge,
1'hydrophilicité du résidu d'acide position, et sans entraîner de l'immunogénicité. Par exemple, ce peut être des substitutions au sein des groupes suivants : valine, valine, isoleucine, glycine ; leucine ; asparagine acide glutamique ; thréonine ; lysine, glycine, alanine ; acide aspartique, glutamine ; sérine, arginine ; et phénylalanine, tyrosine. Les modifications conservatives d'acides aminés dans la séquence d'un polypeptide (et les modifications correspondantes des nucléotides correspondants) peuvent produire des polypeptides possédant des caractéristiques
BE2017/5427 fonctionnelles et chimiques similaires à celles d'un polypeptide parent.
Tel qu'utilisé ici, le terme « délétion » est l'élimination d'un ou de plusieurs résidus d'acides amrnes partir de la séquence de la protéine
Généralement, pas plus d'environ 1 à 6 résidus (par exemple, 1 à 4 résidus) sont délétés au niveau d'un site quelconque au sein de la molécule de la protéine.
Tel qu'utilisé ici, le terme « insertion » est l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés non natifs dans la séquence de la protéine. Généralement pas plus d'environ 1 à 10 résidus (par exemple, 1 à 7 résidus, 1 à 6 résidus, ou 1 à 4 résidus) sont insérés au niveau d'un site quelconque au sein de la molécule de la protéine.
Protéines
La pneumolysine (ply ou Ply) est une cytolysine thiol-activée de 53 kDa présente dans toutes les souches de S. pneumoniae, qui est libérée lors de l'autolyse et contribue à la pathogenèse de S. pneumoniae. L'expression et le clonage de la pneumolysine de type sauvage ou native sont décrits dans Walker et al. (Infect Immun, 55: 1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Brophys Acta, 1007: 67-72 (1989) et Mitchell et al. (NAR, 18: 4010 (1990)). Elle est hautement conservée avec seulement quelques substitutions d'acides aminés apparaissant entre les protéines ply de différents sérotypes. Selon Lawrence et al. Sei. Rep. 5, 14352 (2015), ply contient 11 % d'hélice et 32 % de feuillet bêta. Elle est composée de quatre domaines : le domaine 1 (Dl ; résidus 1 à 21, 58 à 147, 198 à 243 et
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319 à 342) est constitué de trois hélices a et un feuillet ß, le domaine 2 (D2 ; résidus 22 à 57 et 343 à 359) contient un feuillet ß, le domaine 3 (D3 ; résidus 148 à 197 et 244 à 318) est composé d'un feuillet ß anti-parallèle de 5 brins qui est entouré des deux faisceaux d'hélices a qui deviennent les épingles à cheveux transmembranaires TMH1 (résidus 160 à 186) et TMH2 (résidus 257 à 280), et le domaine 4 (D4 ; résidus 360 à 470) est replié en un sandwich ß compact. Le domaine 2 est relié au domaine 4 par un lieur d'une seule glycine. La boucle riche en Trp dans le domaine 4 entre les résidus 427 et 437 est conservée parmi les CDC et représente la suite la plus longue de l'identité de séquence (Rossjohn et al. 1998, J. Mol. Biol, 30 284: 1223-1237).
La présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée comprenant (ou constituée de) une
séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou une
séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %,
90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % , 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou
99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, SEQ ID NO : 88) ,
modifiée en ce que la séquence d'acides aminés comprend une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline. Les figures 3A à 3D fournissent les séquences (SEQ ID NO : 71 à 86) de seize protéines pneumolysines de type sauvage provenant de divers sérotypes de S. pneumoniae, et l'une quelconque de ces protéines (en plus de la protéine pneumolysine de type sauvage
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SEQ ID NO : 87) peut être modifiée selon l'invention de façon à ce que la séquence d'acides aminés comprenne une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline. Ces séquences peuvent être modifiées par élimination de la méthionine N-terminale et éventuellement la substitution de la méthionine Nterminale à une sérine N-terminale pour des objectifs de clonage. Les séquences peuvent être en outre modifiées pour contenir des mutations détoxifiantes, telles que l'une quelconque ou la totalité des mutations détoxifiantes décrites ici.
Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être dérivée d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 qui est un fragment immunogène et/ou un variant de SEQ ID NO : 1 (par exemple, SEQ ID NO : 88).
Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être dérivée d'un fragment immunogène de SEQ ID NO : 1 comprenant au moins environ 15, au moins environ 20, au moins environ 40, ou au moins environ 60 résidus d'acides aminés contigus de la séquence totale, et est capable de déclencher une réponse immunitaire spécifique de ladite séquence d'acides aminés. La pneumolysine native est connue pour être constituée de quatre domaines structuraux principaux (Rossjohn et al. Cell. 30 mai 1997; 89(5) : 685-92) . Ces domaines peuvent être modifiés
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SEQ ID NO SEQ ID NO par élimination et/ou modification d'un ou de plusieurs de ces domaines. Dans un mode de réalisation, le fragment de SEQ ID NO : 1 contient exactement ou au moins 1, 2 ou 3 domaines. Dans un autre mode de réalisation, le fragment de SEQ ID NO : 1 contient exactement ou au moins 2 ou 3 domaines. Dans un autre mode de réalisation, le fragment de SEQ ID NO : 1 contient au moins 3 domaines. Dans un mode de réalisation, le fragment de SEQ ID NO : 1 peut comprendre (ou être constitué de) les résidus d'acides aminés de DI (résidus 1 à 21, 58 à 147, 198 à 243 et 319 à 342) de SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, le fragment de SEQ ID NO : 1 peut comprendre (ou être constitué de) les résidus d'acides aminés de D2 (résidus 22 à 57 et 343 à 359) de SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, le fragment de SEQ ID NO : 1 peut comprendre (ou être constitué de) les résidus d'acides aminés de D3 (résidus 148 à 197 et 244 à 318) de
1. Dans un autre aspect, le fragment de peut comprendre (ou être constitué de) les résidus d'acides aminés de D4 (résidus 360 à 470) de SEQ ID NO : 1. Par exemple, le fragment de SEQ ID NO : 1 peut comprendre (ou être constitué de) (i) les résidus d'acides aminés 1 à 342 de SEQ ID NO : 1, (ii) les résidus d'acides aminés 22 à 359 de SEQ ID NO (iii) les résidus d'acides
SEQ ID NO : 1.
: 1, ou 47 0 de aminés 360
Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être dérivée d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 qui est un variant de SEQ ID NO : 1 qui a
BE2017/5427 été modifiée par la délétion et/ou l'addition et/ou la substitution d'un ou de plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 acides aminés). La substitution d'acide aminé peut être conservative ou non conservative. Dans un aspect, la substitution d'acide aminé est conservative. Les substitutions, les délétions, les additions ou l'une quelconque de leurs combinaisons peuvent être combinées dans un seul variant tant que le variant est un polypeptide immunogène. Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de la présente invention peut être dérivée d'un variant dans lequel 1 à 10, 5 à 10, 1 à 5, 1 à 3, 1 à 2 ou 1 acide(s) aminé(s) est/sont substitué ( s), délété(s), ou ajouté (s) dans une combinaison quelconque. Par exemple, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être dérivée d'une séquence d'acides aminés qui est un variant de SEQ ID NO : 1 dans lequel il manque la sérine Nterminale (SEQ ID NO : 88).
Dans un mode de réalisation, la présente invention comprend des fragments et/ou des variants qui comprennent un épitope de lymphocyte B ou de lymphocyte T. De tels épitopes peuvent être prédits en utilisant une combinaison de la prédiction de la structure bidimensionnelle, par exemple, en utilisant le programme PSIPRED (de David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, Royaume-Uni) et de l'indice antigénique calculé sur la base du procédé décrit par
Jameson et Wolf (CABIOS 4: 181-186 [1988]).
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Le terme « protéine pneumolysine modifiée » se rapporte à une séquence d'acides aminés de pneumolysine (par exemple, ayant une séquence d'acides aminés de pneumolysine de SEQ ID NO : 1 ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1), laquelle séquence d'acides aminés de pneumolysine peut être une séquence d'acides aminés de pneumolysine de type sauvage (par exemple, une séquence d'acides aminés de type sauvage choisie parmi SEQ ID NO : 71 à 87, par exemple, SEQ ID NO : 87), qui a été modifiée par l'addition, la substitution ou la délétion d'un ou de plusieurs acides aminés (par exemple, par l'addition d'une ou de plusieurs séquences consensus choisies parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/EX-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ; ou par la substitution d'un ou de plusieurs acides aminés par une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30)) La protéine pneumolysine modifiée peut également comprendre d'autres modifications (additions, substitutions, délétions) ainsi que l'addition ou la substitution d'une ou de plusieurs séquences consensus. Par exemple, la méthionine N-terminale provenant d'une protéine pneumolysine de type sauvage peut être éliminée (ou éventuellement substituée à une sérine N-terminale) . Une séquence signal et/ou un marqueur peptidique peut être ajouté. Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être une protéine pneumolysine n'existant pas à l'état naturel.
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Dans un mode de réalisation de l'invention, un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1 à 7 acides aminés, par exemple, un acide aminé) de la séquence d'acides
aminés de la pneumolysine
séquence d'acides aminés
séquence d'acides aminés
identique à 8 0 %, 85 %, 90
95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou
exemple, SEQ ID NO : 88) o:
séquence consensus de cinq
(par exemple, ayant une
de SEQ ID NO : 1 ou une
de pneumolysine au moins
o O r 91 %, 92 %, 93 %, 94 : %,
99 % à SEQ ID NO : 1, par
it été substitués par une
acides aminés D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou de sept acides aminés K-D/E-X-N-ZS/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31) également appelée « KDQNATK »). Par exemple, un seul acide aminé dans la séquence d'acides aminés de la pneumolysine (par exemple, SEQ ID NO : 1) peut être remplacé par une séquence consensus D/E-X-NZ-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K
(SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K
(SEQ ID NO : 31) ) . En variante, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 acides
aminés dans la séquence d'acides aminés de la
pneumolysine (par exemple, SEQ ID NO : 1 ou une séquence
d'acides aminés de pneumolysine au moins identique à
80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %
à SEQ ID NO : 1) peuvent être remplacés par une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) .
L'introduction d'une ou de plusieurs séquences consensus choisies parmi : une séquence consensus de cinq acides aminés D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et une séquence consensus de sept acides aminés K-D/E-X-N-Z26
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S/T-K (SEQ ID NO : 30) permet à la protéine pneumolysine d'être glycosylée. Ainsi, la présente invention fournit également une protéine pneumolysine modifiée de l'invention dans laquelle la protéine pneumolysine modifiée est glycosylée. Dans des modes de réalisation spécifiques, les séquences consensus sont introduites dans des régions spécifiques de la séquence d'acides aminés de la pneumolysine, par exemple, des structures de surface de la protéine, aux extrémités N ou C de la protéine, et/ou dans des boucles qui sont stabilisées par des ponts disulfure à la base de la protéine. Dans un aspect de l'invention, la position de la ou des séquences consensus fournit une glycosylation améliorée, par exemple, un rendement accru. Dans un mode de réalisation, la ou les séquences consensus choisies parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/TK (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) sont localisées dans la séquence d'acides aminés de pneumolysine modifiée au niveau d'une position au sein de la boucle longue de surface Nterminale (A12 à K34) ou de la boucle courte C-terminale (E427 à V439) en référence à SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation, une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/EX-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-TK (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou
plusieurs résidus d'acides aminés 22 à 57 (par exemple,
à la place d'un ou de plusieurs résidus d'acides
aminés 24 à 2 9, ou à la place des résidus d'acides
aminés 24, 27 ou 29) de SEQ ID NO : 1 ou dans une
position équivalente dans une séquence d'acides aminés
BE2017/5427 au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, dans une position équivalente dans la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 88). Dans un aspect, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou plusieurs résidus d'acides aminés entre les acides aminés 22 et 57 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-NA-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou plusieurs résidus d'acides aminés entre les acides aminés 24 et 29 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-NA-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été substituée à un résidu d'acide aminé 24, 27 ou 29 (par exemple, Q24, S27 ou E29) de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation, une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/EX-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T28
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K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou plusieurs acides aminés au niveau d'une position entre les résidus d'acides aminés 360 et 470 (par exemple, à la place d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés 427 à 437, à la place d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés 431 à 434, ou à la place des résidus d'acides aminés 431 ou 434) de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, dans une position équivalente dans la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 88). Dans un aspect, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou plusieurs résidus d'acides aminés entre les acides aminés 360 et 470 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-NA-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou plusieurs résidus d'acides aminés entre les acides aminés 427 et 437 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-NA-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un
BE2017/5427 ou plusieurs résidus d'acides aminés entre les acides aminés 431 et 434 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, la séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-NA-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été substituée au résidu d'acide aminé 431 ou 434 de SEQ ID NO : 1 (c'est-à-dire,
L431 ou E434) ou dans une position équivalente dans une
séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %,
90 %, 92 % , 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à
SEQ ID NO : 1. Dans un autre aspect, la séquence
consensus K-D/E-X-N-Z-: 3/T-K (SEQ ID NO : 30 ) (par
exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été
substituée au résidu d'acide aminé 434 de SEQ ID NO : 1 (c'est-à-dire, E434) ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation, un peptide comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-QN-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajouté ou substitué à un ou plusieurs acides aminés au niveau d'une position entre les résidus d'acides aminés 24 et 29 ou les résidus d'acides aminés 427 et 437 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, dans une position équivalente dans la séquence d'acides
BE2017/5427 aminés de SEQ ID NO : 88). Par exemple, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un résidu d'acide aminé entre les acides aminés 24 et 29 ou les acides aminés 427 et 437 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Ainsi, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus choisie parmi : D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline, dans laquelle le départ de ladite séquence consensus est localisé entre les acides aminés 24 et 29 ou les acides aminés 427 et 437 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation, un peptide comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-QN-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajouté ou substitué à un ou plusieurs acides aminés au niveau d'une position entre les résidus d'acides aminés 24 et 29 ou les acides aminés 431 et 434 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins
BE2017/5427 identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, dans une position équivalente dans la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 88) . Par exemple, une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un résidu d'acide aminé entre les acides aminés 24 et 29 ou les acides aminés 431 et 434 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Ainsi, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus choisie parmi : D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline, dans laquelle le départ de ladite séquence consensus est localisé entre les acides aminés 24 et 29 ou les acides aminés 431 et 434 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation, un peptide comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-QN-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajouté ou substitué à un ou plusieurs acides aminés au niveau d'une position entre
BE2017/5427 le résidu d'acide aminé 24, 27, 29, 431, ou 434 (par exemple, Q24, S27, E29, L431 ou E434) de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, dans une position équivalente dans la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 88). Dans un mode de réalisation, la séquence consensus K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée au résidu d'acide aminé E434 dans SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Par exemple, une séquence consensus D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un résidu d'acide aminé 24, 27, 29, 431, ou 434 de SEQ ID NO : 1 (c'est-à-dire, Q24, S27, E29, L431 ou E434) ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. Ainsi, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus choisie parmi : D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline, dans laquelle le départ de ladite séquence
BE2017/5427 %, 95 %, 96 %, 97 %,
L'homme du métier « entre les acides consensus est localisé au niveau des acides aminés 24, 27, 29, 431, ou 434 de SEQ ID NO : 1 ou dans une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. comprendra qu'une référence à aminés ... » (par exemple, « entre les acides aminés 427 et 437 ») fait référence au comptage des numéros des acides aminés de façon consécutive à partir de l'extrémité N-terminale de la séquence d'acides aminés, par exemple, « entre les acides aminés 427 et 437 ... de SEQ ID NO : 1 » se rapporte à la position dans la séquence d'acides aminés entre les 427ème et 437ème acides aminés de SEQ ID NO : 1 y compris à la fois les 427ème et 437<=me acides aminés. Ainsi, dans un mode de réalisation où « une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) a été ajoutée ou substituée à un ou plusieurs acides aminés entre les résidus d'acides aminés 427 et 437 », la séquence consensus peut avoir été ajoutée ou substituée à l'un quelconque (ou plusieurs) des numéros d'acides aminés 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436 ou 437 dans SEQ ID NO : 1. L'homme du métier comprendra que lorsque la séquence d'acides aminés de la pneumolysine est un variant et/ou un fragment d'une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, une telle séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à
SEQ ID NO : 1, la référence à « entre les acides aminés ...» se rapporte à la position qui serait
BE2017/5427 équivalente à la position définie, si cette séquence était alignée avec une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 afin de maximiser l'identité de séquence entre les deux séquences (les outils d'alignement de séquences ne sont pas limités à Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac ( .)ac ( . ) uk) MUSCLE (www(.)ebi (.)ac ( . ) uk) , ou T-coffee (www(.)tcoffee(.)org). Dans un aspect, l'outil d'alignement de séquences utilisé est Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk).
L'addition ou la délétion d'acides aminés à partir du variant et/ou du fragment de SEQ ID NO : 1 pourra mener à une différence dans la véritable position d'acide aminé de la séquence consensus dans la séquence mutée, toutefois, en alignant la séquence mutée avec la séquence de référence, l'acide aminé dans une position équivalente à l'acide aminé correspondant dans la séquence de référence peut être identifié et par conséquent la position appropriée pour l'addition ou la substitution de la séquence consensus peut être établie. Par exemple, les figures 3A à 3D montrent un alignement de séquences à partir de séquences de pneumolysines de S. pneumoniae de sérotypes différents :
Sérotype6A_CDC1873-00, Sérotype9_SP195, Sérotype2_R6, Sérotype6B_67 0-6B, Sérotype2 3F_ATCC_7 0 0 669,
Sérotype4_TIGR4, Sérotype5_70585, Sérotypel4_JJA, Sérotypel1A_AP200, Sérotypel9F_G54, Sérotype3_OXC141, Sérotypel2F_CDC0288-04, Sérotypel8C_SP18-BS74,
Sérotypel9A_CDC3059-0 6, Sérotype1_INV10 4,
Sérotype7F_CDC1087-00.
Dans un mode de réalisation, la protéine modifiée de l'invention comprend au moins 1, 2, 3 ou 4 séquences
BE2017/5427 consensus D/E-X-N-X-S/T ou exactement 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 séquences consensus D/E-X-N-X-S/T. Dans un mode de réalisation, la protéine modifiée de l'invention comprend au moins 1, 2, 3 ou 4 séquences consensus D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou exactement 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 séquences consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) . Dans un mode de réalisation, la protéine modifiée de l'invention comprend au moins 1, 2, 3 ou 4 séquences consensus K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou exactement 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 séquences consensus KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) . Dans un mode de réalisation, la protéine modifiée de l'invention comprend une seule séquence consensus choisie parmi D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30). Dans un mode de réalisation, la séquence consensus est D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28), dans laquelle X représente Q (glutamine) et Z représente A (alanine), par exemple, D-Q-N-A-T (SEQ ID NO : 29) également appelée « DQNAT ». Dans un mode de réalisation, la séquence consensus est K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans laquelle X représente Q (glutamine) et Z représente A (alanine), par exemple, KD-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31) également appelée « KDQNATK ».
L'introduction de tels sites de glycosylation peut être accomplie, par exemple, par l'addition de nouveaux acides aminés à la structure primaire de la protéine (c'est-à-dire que les sites de glycosylation sont ajoutés, en totalité ou en partie), ou par la mutation d'acides aminés existant dans la protéine afin de produire les sites de glycosylation (c'est-à-dire que
BE2017/5427 des acides aminés ne sont pas ajoutés à la protéine, mais que des acides aminés choisis de la protéine sont mutés de façon à former ainsi des sites de glycosylation) L'homme du métier comprendra que la séquence d'acides aminés d'une protéine peut être facilement modifiée en utilisant des approches connues dans l'art, par exemple, des approches recombinantes qui comprennent la modification de la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine. Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés comprenant une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline, qui ont été introduites de façon recombinante dans la séquence d'acides aminés de la pneumolysine de SEQ ID NO : 1 ou une séquence d'acides aminés de pneumolysine au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1. La présente invention fournit également un procédé de préparation d'une protéine pneumolysine modifiée dans laquelle une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-ZS/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline, sont introduites de façon recombinante dans la séquence d'acides aminés de la pneumolysine de SEQ ID NO : 1 ou une séquence d'acides aminés de pneumolysine au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (c'est37
BE2017/5427 à-dire, une protéine pneumolysine modifiée recombinante) Dans certains modes de réalisation, la séquence consensus de glycosylation de 5 acides aminés classique (D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28)) peut être étendue par des résidus de lysine pour une glycosylation plus efficace (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30)), et ainsi la séquence consensus insérée peut coder pour 5, 6, ou 7 acides aminés qui devront être insérés ou qui remplaceront des acides aminés de la protéine acceptrice.
Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 2, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30) dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)). Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 2. Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 2 avec une sérine N-terminale (c'est-à-dire qu'un résidu de sérine est ajouté à l'extrémité N-terminale).
Parce que la pneumolysine est une toxine, elle doit être détoxifiée (c'est-à-dire, rendue non toxique pour
BE2017/5427 un mammifère, par exemple, un être humain, lorsqu'elle est fournie à un dosage approprié pour une protection) avant de pouvoir être administrée in vivo. Une protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être détoxifiée génétiquement (c'est-à-dire, par mutation). Les séquences détoxifiées génétiquement peuvent éliminer les activités indésirables telles que la perméation membranaire, la lyse cellulaire, et l'activité cytolytique contre les érythrocytes humains et d'autres cellules, afin de réduire la toxicité, tout en conservant la capacité d'induire des anticorps anti-pneumolysine protecteurs et/ou neutralisants à la suite d'une administration à un être humain. Par exemple, comme il est décrit ici, une protéine pneumolysine modifiée peut être altérée de façon à être biologiquement inactive tout en conservant ses épitopes immunogènes, voir, par exemple, les documents WO 90/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67: 981-985 (1999)) et WO 99/03884.
Les protéines pneumolysines modifiées de l'invention peuvent être détoxifiées génétiquement par une ou plusieurs mutations ponctuelles. Par exemple, un motif conservé contenant de la cystéine trouvé près de l'extrémité C-terminale a été impliqué dans l'activité lytique. Il a été suggéré que des mutations de Ply abaissaient cette toxicité (WO 90/06951, WO 99/03884). D'autres mutations détoxifiantes de Ply sont décrites dans les documents WO 1999/003884, WO 2005/076696, WO 2005/108580. Dans un aspect, les protéines pneumolysines modifiées de l'invention peuvent être détoxifiées par des substitutions d'acides aminés comme il est décrit dans Oloo et al. (2011) (Oloo E.O., et al • r
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J Biol Chem. 8 avril 2011 ; 286(14): 12133), par exemple G293 en C, T 65 en C et/ou C428 en A. Par exemple, les protéines pneumolysines modifiées de l'invention peuvent comprendre (i) au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, Τβ5 en C et C428 en A, (ii) au moins deux substitutions d'acides aminés choisies parmi G293 en C, T65 en C et C428 en A (par exemple, G293 en C et T65 en C), ou (iii) trois substitutions d'acides aminés G293 en C, T65 en C et C428 en A (voir également le document WO 2010/071986) . Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être détoxifiée par l'introduction des substitutions d'acides aminés Τβ5 en C et G293 en C pour former une réticulation disulfure. Dans un autre aspect, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être détoxifiée par des substitutions d'acides aminés telles que décrites dans Taylor et al. PLOS ONE 8(4): e61300 (2013), par exemple, A370 en E, W433 en E et/ou L460 en E. Par exemple, les protéines pneumolysines modifiées de l'invention peuvent comprendre (iv) au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi A370 en E, W433 en E et L460 en E, (v) au moins deux substitutions d'acides aminés choisies parmi A370 en E, W433 en E et L460 en E ou (vi) trois substitutions d'acides aminés A370 en E, W433 en E et L460 en E. La protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être également détoxifiée par une combinaison des substitutions d'acides aminés (i) à (vi) décrites ci-dessus. La protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut comprendre par exemple : (a) au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, Τβ5 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E
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et L460 en E, (b) au moins deux substitutions d’ ' acides
aminés choisies parmi G293 en C, T 65 en C, C428 en A, A370
en E, W433 en E et L460 en E, (c) au moins
trois substitutions d 'acides aminés choisies parmi G293
en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en
E, (d) au moins quatre substitutions d'acides aminés
choisies parmi G293 en C, Τβ5 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E, (e) au moins cinq substitutions d'acides aminés choisies parmi G293 en C, Τβ5 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E, ou (f) six substitutions d'acides aminés G293 en C, Τβ5 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E. Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend cinq substitutions d'acides aminés :
G293 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E. Dans
un mode de réalisation, la protéine pneumolysine
modifiée de 1'invention comprend six substitutions
d ' acides aminés : G293 en c, T65 en C, C428 en A, A370 en E,
W433 en E et L460 en E. Ainsi, dans une protéine
pneumolysine modifiée de 1'invention, la séquence
d'acides aminés peut être en outre modifiée par au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C,
T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L4 6 0 en E, en
référence à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1
(ou une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1).
Les numéros des acides aminés auxquels il est fait référence correspondent aux acides aminés dans SEQ ID NO : 1 et comme il est décrit ci-dessus, l'homme du métier peut déterminer des positions d'acides aminés
BE2017/5427 équivalentes dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 par aliqnement. Par exemple, l'homme du métier comprendra que L460 dans SEQ ID NO : 1 correspond à L465 dans SEQ ID NO : 2 à 7 et la référence à L460 en E comprend L465E dans SEQ ID NO : 8, 10 et 12 et L46sE dans SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 11.
Dans un aspect, la protéine pneumolysine modifiée
de 1'invention comprend (ou est constituée de) une
séquence d'acides aminés qui est au moins identique à
80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 % , 98 %, 99 % ou 100 %
à la séquence de SEQ ID NO : 3 à 10, ladite séquence
d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E. Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3 à 10. Dans un autre mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3 à 8 avec une sérine N-terminale (c'est-à-dire qu'un résidu de sérine est ajouté à l'extrémité N-terminale). Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %,
BE2017/5427 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 3. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 4. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 4. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 5. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 6. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 7. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 8. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au
BE2017/5427 moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 9. Dans un mode de réalisation, la pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 10. Dans un mode de réalisation, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, % ou 100 % à SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) dans laquelle X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-ZS/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L46o en E. Dans un mode de réalisation, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à
SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) dans laquelle X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L46o en E. Dans un mode de réalisation, la présente invention
BE2017/5427 (pneumolysine (pneumolysine fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12.
Dans un mode de réalisation, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à
SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 et comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 23 à 27 dans lesquelles XI, X2 et X3 représentent un acide aminé quelconque, de façon appropriée dans lesquelles XI représente C (cystéine), X2 représente E (acide glutamique) et X3 représente A (alanine).
L'activité de la protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être analysée et caractérisée par des procédés décrits, par exemple, dans Nato, et al. Infect Immun. 59(12): 4641-4646 (1991), Taylor et al. PLOS ONE 8(4): e61300 (2013)). Une analyse de l'hémolyse in vitro peut être utilisée pour mesurer l'activité hémolytique (par exemple, cytolytique) de la protéine pneumolysine modifiée par rapport à la pneumolysine de type sauvage. Une analyse de l'inhibition de l'hémolyse peut être utilisée pour mesurer la capacité d'antisérums produits contre une protéine pneumolysine modifiée de l'invention à inhiber l'hémolyse par la pneumolysine, et (généralement) en comparant des modifiée) à des de type sauvage) .
protéine pneumolysine modifiée appropriée de l'invention peut être l'une qui présente une activité hémolytique inférieure à la pneumolysine de type sauvage (par exemple, antisérums antiantisérums antiPar exemple, une
BE2017/5427 par l'intermédiaire d'une analyse de l'hémolyse in vitro). Par exemple, une protéine pneumolysine modifiée appropriée peut posséder une activité spécifique (déterminée en utilisant l'analyse de l'hémolyse in vitro) d'environ (en se rapportant à chacune des valeurs suivantes indépendamment) 0 %,
0,0005 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 % ou < 10 % de l'activité spécifique de la pneumolysine de type sauvage. Une protéine pneumolysine modifiée appropriée de l'invention peut être également l'une qui, après administration à un hôte, provoque la production par l'hôte d'anticorps qui inhibent l'hémolyse par la pneumolysine de type sauvage (par exemple, par l'intermédiaire d'une analyse de l'inhibition de l'hémolyse), est immunogène (par exemple, induit la production d'anticorps contre wtPLY), et/ou protectrice (par exemple, induit une réponse immunitaire qui protège l'hôte contre une infection ou limite une infection existant déjà). Des analyses peuvent être utilisées comme il est décrit dans les exemples.
Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend en outre un « marqueur peptidique » ou « marqueur », c'est-à-dire, une séquence d'acides aminés qui permet l'isolement et/ou l'identification de la protéine pneumolysine modifiée. Par exemple, l'addition d'un marqueur à une protéine pneumolysine modifiée de l'invention peut être utile dans la purification de cette protéine et, par conséquent, la purification des vaccins conjugués comprenant la protéine pneumolysine modifiée marquée. Des exemples de marqueurs qui peuvent être utilisés
BE2017/5427 comprennent, sans limitation, des marqueurs d'histidine (HIS) (par exemple un marqueur d'hexa-histidine, ou marqueur 6XHis), des marqueurs FLAG-TAG, et HA. Dans un mode de réalisation, le marqueur est un marqueur hexahistidine. Dans certains modes de réalisation, les marqueurs utilisés peuvent être éliminés, par exemple, une élimination par des agents chimiques ou par des moyens enzymatiques, une fois qu'ils ne sont plus nécessaires, par exemple, après que la protéine a été purifiée. Eventuellement, le marqueur peptidique est localisé à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés. Eventuellement, le marqueur peptidique comprend six résidus d'histidine à l'extrémité Cterminale de la séquence d'acides aminés. Dans un aspect, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) dans laquelle X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E et un marqueur peptidique (par exemple, six résidus d'histidine à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés). Eventuellement, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention a une séquence
BE2017/5427 d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12.
Dans un mode de réalisation, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend une séquence signal qui est capable de diriger la protéine pneumolysine vers le périplasme d'une cellule hôte (par exemple, une bactérie) . Dans un mode de réalisation spécifique, la séquence signal provient de la DsbA d'E. coli [MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO : 13)], la porine A de la membrane externe (OmpA) d'E. coli [MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO : 14)], la protéine de (MalE) (SEQ ID NO d'Erwinia liaison du maltose [MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA pectate lyase (PelB) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA l'entérotoxine thermolabile [MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA 1'endoxylanase XynA [MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA flagelline (Flgl) d'E. coli 19) ] , d'E. coli 15)], la carotovorans (SEQ ID NO : 16)], LTIIb d'E. coli (SEQ ID NO : 17)], de Bacillus (SEQ ID NO : 18)], la (SEQ ID NO (SEQ ID NO (SEQ ID NO [MIKFLSALILLLVTTAAQA TolB [MKQALRVAFGFLILWASVLHA
20)] ou SipA [MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS 70)]. Dans un mode de réalisation, la séquence signal a une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 13 à 20 ou 70 (séquence signal) . Dans un aspect, la séquence signal a une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à TolB [MKQALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ ID NO : 20)]. Par exemple, une séquence signal ayant une séquence d'acides aminés
BE2017/5427 au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à TolB [MKQALRVAFGFLILWASVLHA (SEQ ID NO : 20)] peut être utilisée pour les CP12F et CP4. Dans un autre aspect, la séquence signal a une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à (PelB) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO : 16)]. Par exemple, une séquence signal ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à (PelB) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO : 16)] peut être utilisée pour le CP33F. Dans un autre aspect, la séquence signal a une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SipA [MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS (SEQ ID NO : 70)]. Dans un mode de réalisation, une protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend en outre une séquence signal SEQ ID NO : 70 (SipA), SEQ ID NO : 16 (PelB) ou SEQ ID NO : 20 (TolB), de façon appropriée à l'extrémité N-terminale. Dans un mode de réalisation, une protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend en outre une séquence signal SEQ ID NO : 16 (PelB) ou SEQ ID NO : 20 (TolB), de façon appropriée à l'extrémité N-terminale. Dans un mode de réalisation, une protéine pneumolysine modifiée de l'invention a une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 32 ou SEQ ID NO : 51 modifiée en ce que la séquence d'acides aminés comprend une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K49
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D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline.
Dans un mode de réalisation, un résidu d'alanine est ajouté entre la séquence signal et le départ de la séquence de la protéine mature. Un tel résidu d'alanine présente l'avantage de mener à un clivage plus efficace de la séquence de tête.
Dans un aspect, la protéine pneumolysine modifiée de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) dans laquelle X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E (et comprenant éventuellement six résidus d'histidine à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés et une séquence signal) . Dans un mode de réalisation, une protéine pneumolysine modifiée de l'invention a une séquence d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22. Dans un autre aspect, la protéine pneumolysine modifiée
BE2017/5427 de l'invention comprend (ou est constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence choisie parmi SEQ ID NO : 33 à 50 ou 52 à 69, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus a D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) dans laquelle X et Z représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline (par exemple, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) ou K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)) et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E (et comprenant éventuellement six résidus d'histidine à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés et une séquence signal) . Dans un mode de réalisation, une protéine pneumolysine modifiée de l'invention a une séquence d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 33 à 50 ou SEQ ID NO : 52 à 69. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 33 à 50 ou SEQ ID NO : 52 à 69.
Un autre aspect de 1'invention est un polynucléotide codant pour une protéine pneumolysine modifiée de l'invention. Par exemple, un polynucléotide codant pour une protéine pneumolysine modifiée, ayant une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide avec une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à l'une quelconque des SEQ ID NO : 2 à 12, 21 ou 22. Par exemple, un polynucléotide codant pour une protéine pneumolysine
BE2017/5427 modifiée, ayant une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide avec une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à l'une quelconque des SEQ ID NO : 33 à 50 ou 52 à 69. Un vecteur comprenant un tel polynucléotide est un autre aspect de 1'invention.
Conjugués,
La présente invention fournit également un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant (ou constitué de) une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, dans lequel la protéine pneumolysine modifiée est liée à un antigène, par exemple, liée de façon covalente à un antigène.
Dans un mode de réalisation, le conjugué comprend un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant (ou constitué de) une protéine pneumolysine modifiée de l'invention ayant une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 2 à 12 liée de façon covalente à un antigène, dans lequel l'antigène est lié (soit
directement soit par 1 'intermédiaire d'un lieur) à un
résidu d'acide aminé de la protéine pneumolysine
modifiée.
Dans un mode de réalisation, la protéine
pneumolysine modifiée est liée de façon covalente à
l'antigène par l'intermédiaire d'une liaison chimique qui peut être obtenue en utilisant un procédé de conjugaison chimique (c'est-à-dire que le conjugué est produit par conjugaison chimique).
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Dans un mode de réalisation, le procédé de conjugaison chimique est choisi dans le groupe constitué de la chimie des carbodiimides, l'amination réductrice, la chimie de la cyanylation (par exemple, la chimie du CDAP), la chimie des maléimides, la chimie des hydrazides, la chimie des esters, et la chimie des Nhydroxysuccinimides. Les conjugués peuvent être préparés par des procédés directs d'amination réductrice tels que décrits dans les documents US 200710184072 (Hausdorff), US 4365170 (Jennings) et US 4673574 (Anderson). D'autres procédés sont décrits dans les documents EP-0-161-188, EP-208375 et EP-0-477508. En variante, le procédé de conjugaison peut reposer sur l'activation du saccharide avec du tétrafluoroborate de l-cyano-4-diméthylaminopyridinium (CDAP) pour former un ester cyanate. De tels conjugués sont décrits dans la demande publiée PCT WO 93/15760 Uniformed Services University et WO 95/08348 et WO 96/29094. Voir également Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256.
En général, les types suivants de groupes chimiques sur une protéine pneumolysine modifiée peuvent être utilisés pour le couplage/la conjugaison :
A) carboxyle (par exemple, par l'intermédiaire de l'acide aspartique ou de l'acide glutamique). Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié aux groupes amino sur les saccharides directement ou à un groupe amino sur un lieur avec la chimie des carbodiimides, par exemple, avec de l'EDAC.
B) Groupe amino (par exemple, par l'intermédiaire de la lysine) . Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié aux groupes carboxyle sur les saccharides
BE2017/5427 directement ou un groupe carboxyle sur un lieur avec la chimie des carbodiimides, par exemple, avec de l'EDAC. Dans un autre mode de réalisation, ce groupe est lié aux groupes hydroxyle activés par du CDAP ou du CNBr sur les saccharides directement ou de tels groupes sur un lieur ; aux saccharides ou aux lieurs comportant un groupe aldéhyde ; aux saccharides ou aux lieurs comportant un groupe ester de succinimide.
C) Sulfhydryle (par exemple, par l'intermédiaire de la cystéine). Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié à un saccharide ou un lieur bromo- ou chloro-acétylé avec la chimie des maléimides. Dans un mode de réalisation, ce groupe est activé/modifié avec de la bis-diazobenzidine.
D) Groupe hydroxyle (par exemple, par l'intermédiaire de la tyrosine). Dans un mode de réalisation, ce groupe est activé/modifié avec de la bis-diazobenzidine.
E) Groupe imidazolyle (par exemple, par l'intermédiaire de l'histidine) . Dans un mode de réalisation, ce groupe est activé/modifié avec de la bis-diazobenzidine.
F) Groupe guanidyle (par exemple, l'intermédiaire de l'arginine).
G) Groupe indolyle (par exemple, l'intermédiaire du tryptophane).
Sur un saccharide, en général, les groupes suivants peuvent être utilisés pour un couplage : OH, COOH ou NH2. Les groupes aldéhyde peuvent être produits après différents traitements tels que : periodate, hydrolyse acide, peroxyde d'hydrogène, etc.
par par
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Approches de couplage direct :
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP > ester cyanate + NH2-protéine ----> conjugué
Saccharide-aldéhyde + NER-protéine ----> base de
Schiff + NaCNBPb----> conjugué
Saccharide-COOH + NER-protéine + EDAC ----> conjugué
Saccharide-NEh + COOH-protéine + EDAC ----> conjugué
Approches de couplage indirect par 1'intermédiaire d'un espaceur (lieur) :
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ---> ester cyanate +
NH2----NH2----> saccharide----NH2 + COOH-protéine + EDAC
----> conjugué
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ----> ester cyanate +
NH2----SH----> saccharide----SH + SH-protéine (protéine native avec une cystéine exposée ou obtenue après modification des groupes amino de la protéine par du SPDP par exemple) ----> saccharide-S-S-protéine
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ---> ester cyanate +
NH2----SH > saccharide----SH + maléimide-protéine (modification des groupes amino) ----> conjugué
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ---> ester cyanate +
NH2----SH---> saccharide-SH + protéine halogénoacétylée
----> conjugué
Saccharide-COOH + EDAC + NH2----NH2---> saccharide---NH2 + EDAC + COOH-protéine----> conjugué
Saccharide-COOH + EDAC + NH2----SH > saccharide---SH + SH-protéine (protéine native avec une cystéine exposée ou obtenue après modification des groupes amino de la protéine par du SPDP par exemple) > saccharide-SS-protéine
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Saccharide-COOH + EDAC + ΝΕΕ----SH----> saccharide---SH + maléimide-protéine (modification des groupes amino) ----> conjugué
Saccharide-COOH + EDAC + NH2----SH---> saccharideSH + protéine halogénoacétylée ----> conjugué
Saccharide-aldéhyde + NH2----NH2----> saccharide---NH2 + EDAC + COOH-protéine ----> conjugué
Note : à la place de 1'EDAC ci-dessus, tout carbodiimide approprié peut être utilisé.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est lié directement à la protéine pneumolysine modifiée.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est fixé à la protéine pneumolysine modifiée par l'intermédiaire d'un lieur. Eventuellement, le lieur est choisi dans le groupe constitué de lieurs avec 4 à 12 atomes de carbone, de lieurs bifonctionnels, de lieurs contenant 1 ou 2 groupes amino réactifs à l'extrémité, de Bproprionamido, de nitrophényl-éthylamine, d'halogénures d'halogénoacyle, de l'acide 6-aminocaproïque et d'ADH. Le saccharide activé peut être ainsi couplé directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur (lieur) à un groupe amino sur la protéine pneumolysine modifiée. Par exemple, l'espaceur pourra être une cystamine ou une cystéamine pour donner un polysaccharide thiolé qui pourra être couplé à la pneumolysine modifiée par l'intermédiaire d'une liaison thioéther obtenue après réaction avec une protéine pneumolysine modifiée activée par un maléimide (par exemple, en utilisant du GMBS (ester de N-hydroxysuccinimide d'acide 4maléimidobutyrique) ou une protéine pneumolysine modifiée halogénoacétylée (par exemple, en utilisant du
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SIAB (4-iodoacétyl)aminobenzoate de succinimidyle), ou du SIA (iodoacétate de succinimidyle), ou du SBAP (succinimidyl-3-(bromoacétamide)propionate)). Dans un mode de réalisation, l'ester cyanate (éventuellement fabriqué par la chimie du CDAP) est couplé avec de 1'hexane-diamine ou de l'ADH (dihydrazide de l'acide adipique) et le saccharide amino-dérivatisé est conjugué à la protéine pneumolysine modifiée en utilisant la chimie des carbodiimides (par exemple, le l-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDAC ou EDC)) par l'intermédiaire d'un groupe carboxyle sur la protéine pneumolysine modifiée. De tels conjugués sont décrits dans la demande PCT publiée WO 93/15760 Uniformed Services University et WO 95/08348 et WO 96/29094.
Dans un mode de réalisation, le résidu d'acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée auquel l'antigène est lié n'est pas un résidu d'asparagine et dans ce cas, le conjugué est généralement produit par conjugaison chimique. Dans un mode de réalisation, le résidu d'acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée auquel
1'antigène est lié est choisi dans le groupe constitué
de : Ala, Arg, Asp, Cys , Gly, Glu, Gin , His, Ile, Leu,
Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, et Val.
Eventuellement, l'acide aminé est : un acide aminé contenant un groupe amine terminal, une lysine, une arginine, un acide glutamique, un acide aspartique, une cystéine, une tyrosine, une histidine ou un tryptophane. Eventuellement, l'antigène est lié de façon covalente à un acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée choisi parmi : l'acide aspartique, l'acide glutamique,
BE2017/5427 la lysine, la cystéine, la tyrosine, 1'histidine, l'arginine ou le tryptophane.
Dans un mode de réalisation, le résidu d'acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée auquel l'antigène est lié ne fait pas partie des séquences consensus D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30). Dans un mode de réalisation, le résidu d'acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée auquel l'antigène est lié n'est pas le résidu d'asparagine des séquences consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30).
En variante, dans un autre mode de réalisation, l'antigène est lié à un acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée choisi parmi l'asparagine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine, la cystéine, la tyrosine, 1'histidine, l'arginine ou le tryptophane (par exemple, l'asparagine) . Dans un autre mode de réalisation, le résidu d'acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée auquel l'antigène est lié est un résidu d'asparagine. Dans un autre mode de réalisation, le résidu d'acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée auquel l'antigène est lié fait partie de la séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) (par exemple, l'asparagine dans la séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30))
Antigènes
Dans un mode de réalisation, l'antigène dans un conjugué (par exemple, un bioconjugué) de l'invention est un saccharide tel qu'un saccharide capsulaire bactérien, un lipopolysaccharide bactérien ou un
BE2017/5427 saccharide pneumoniae oligosaccharide bactérien. Dans un mode de réalisation, l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien.
Les saccharides peuvent être choisis dans un groupe constitué de : saccharide capsulaire de N. meningitidis du sérogroupe A (MenA), saccharide capsulaire de N. meningitidis du sérogroupe C (MenC), saccharide capsulaire de N. meningitidis du sérogroupe Y (MenY), saccharide capsulaire de N. meningitidis du sérogroupe W (MenW), saccharide capsulaire de H. influenzae de type b (Hib), saccharide capsulaire du groupe I de Streptococcus du groupe B, saccharide capsulaire du groupe II de Streptococcus du groupe B, saccharide capsulaire du groupe III de Streptococcus du groupe B, saccharide capsulaire du groupe IV de Streptococcus du groupe B, saccharide capsulaire du groupe V de Streptococcus du groupe B, saccharide capsulaire de type 5 de Staphylococcus aureus, saccharide capsulaire de type 8 de Staphylococcus aureus, saccharide Vi de Salmonella typhi, LPS de N. meningitidis (tel que L3 et/ou L2), LPS de M. catarrhalis, LPS de H. influenzae, antigènes O de Shigella, antigènes O de P. aeruginosa, antigènes O d'E. coli ou polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien de S. pneumoniae capsulaire bactérien de peut être choisi parmi capsulaire de Streptococcus pneumoniae du sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, 10C, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13,
14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B,
Le
Streptococcus un saccharide
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18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C,
35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48. Par exemple, l'antigène peut être un saccharide capsulaire de S. pneumoniae du sérotype : 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14,
15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F ou 33F. Dans un aspect particulier, l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien de Streptococcus pneumoniae du sérotype 4. Dans un autre aspect particulier, l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien de Streptococcus pneumoniae du sérotype 12F. Dans un autre aspect particulier, l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien de Streptococcus pneumoniae du sérotype 33F.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'antigène est une unité répétitive d'un saccharide capsulaire bactérien de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'antigène comprend une unité répétitive d'un saccharide capsulaire bactérien de S. pneumoniae du sérotype 4. Par exemple, le CP4 a une structure d'unités répétitives contenant une GalNAc à l'extrémité réductrice. La structure complète est : 1,4-(2,3 S pyr)-a-D-Gal-1,3-a-D-ManNAc-l,3-a-L-FucNAc1,3-a-D-GalNAc. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'antigène comprend une unité répétitive d'un saccharide capsulaire bactérien de S. pneumoniae du sérotype 12F. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'antigène comprend une unité répétitive d'un saccharide capsulaire bactérien de S. pneumoniae du sérotype 33F.
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Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'antigène est un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride ayant une structure :
(B)n-A->
dans laquelle A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides, avec un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice (indiquée par la flèche) ;
dans laquelle B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides ;
dans laquelle A et B représentent des unités répétitives oligosaccharidiques différentes ; et dans laquelle n vaut soit au moins 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 100 soit au moins 200 ; ou dans laquelle n vaut au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 100 ou au moins 200.
Dans un mode de réalisation, A représente un oligosaccharide ne contenant pas plus de 20, 15, 12, 10,
9, ou 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, B représente un oligosaccharide ne contenant pas plus de 20, 15, 12, 10, 9, ou 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A et B représentent des oligosaccharides ne contenant pas plus de 20, 15, 12, 10, 9, ou monosaccharides. Dans un mode de réalisation, n ne
BE2017/5427 vaut pas plus de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70,
60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 5.
Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 3 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 3 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 3 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 3 monosaccharides et n vaut au moins 5. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 3 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins monosaccharides et n vaut au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 4 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 4 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 4 monosaccharides et n vaut au moins 5. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 4 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins monosaccharides et n vaut au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins monosaccharides et B représente une unité répétitive
BE2017/5427 oligosaccharidique contenant au moins 5 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 5 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 5 monosaccharides et n vaut au moins 5. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 5 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins monosaccharides et n vaut au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 6 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 6 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 6 monosaccharides et n vaut au moins 5. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 6 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 6 monosaccharides et n vaut au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 8 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 8 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 8 monosaccharides et n vaut au moins 5 et
BE2017/5427 pas plus de 500. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 8 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 8 monosaccharides et n vaut au moins 20 et pas plus de 100 .
Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 10 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 10 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 10 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 10 monosaccharides et n vaut au moins 5 et pas plus de 500. Dans un mode de réalisation, A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 10 monosaccharides et B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant 2 à 10 monosaccharides et n vaut au moins 20 et pas plus de 100.
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, la répétition de l'oligosaccharide B contient un monosaccharide d'hexose à l'extrémité réductrice de la répétition. Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le monosaccharide d'hexose à l'extrémité réductrice de la répétition est choisi dans le groupe constitué de glucose, galactose, rhamnose, arabinotol, fucose et mannose ; de façon appropriée le groupe est constitué de glucose et galactose.
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Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, l'unité répétitive oligosaccharidique de A et l'unité répétitive oligosaccharidique de B diffèrent uniquement par la présence d'un monosaccharide différent à l'extrémité réductrice de la répétition.
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, l'unité répétitive oligosaccharidique de A est l'unité répétitive du saccharide capsulaire d'un saccharide capsulaire bactérien de S. pneumoniae tel que décrit ci-dessus ; par exemple, l'unité répétitive du saccharide capsulaire d'un Streptococcus pneumoniae du sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, 10C, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48 ; de façon appropriée du sérotype 33F. Un exemple est le CP33F, pour lequel l'unité répétitive est composée de ß-D-Galf-1, 3-ß-D-Gal-l, 3-a-D-Gal(al,2-DGal)-1,3-ß-D-Galf-l, 3-D-Glc-.
Un aspect de l'invention est un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant une protéine pneumolysine modifiée liée en N à un antigène, par exemple, un saccharide. Dans un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant une protéine pneumolysine modifiée contenant une séquence consensus Asn-X-Ser/Thr (par exemple, au sein de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28)
BE2017/5427 ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30)), le résidu d'asparagine peut être lié à l'antigène, par exemple, un saccharide. Un autre aspect de l'invention est un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant une protéine pneumolysine modifiée liée en N à un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, dans lequel ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à un oligosaccharide ou un polysaccharide donneur, à l'exception du fait que l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride comprend un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive en plus de comprendre la totalité des monosaccharides de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur. En d'autres termes, un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant une protéine pneumolysine modifiée contenant une séquence consensus Asn-X-Ser/Thr (par exemple, au sein de D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30)), dont le résidu d'asparagine est lié à un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, dans lequel ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride contient au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou 50 unités répétitives saccharidiques d'un oligosaccharide ou d'un polysaccharide donneur et une autre unité répétitive liée en N à la protéine pneumolysine modifiée dans lequel un dérivé monosaccharidique d'hexose est à l'extrémité réductrice de ladite autre unité répétitive.
Dans un mode de réalisation, le dérivé monosaccharidique d'hexose est tout monosaccharide dans lequel la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido. Dans un aspect, le monosaccharide d'hexose
BE2017/5427 est choisi dans le groupe constitué de glucose, galactose, rhamnose, arabinotol, fucose et mannose (par exemple, le galactose). Les dérivés monosaccharidiques d'hexose appropriés comprennent la N-acétyl-glucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactosamine (GalNAc), la HexNAc, la désoxyHexNAc, le 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxy-hexose (DATDH), la N-acétylfucosamine (FucNAc), ou la Nacétylquinovosamine (QuiNAc). Un dérivé monosaccharidique d'hexose approprié est la N-acétylglucosamine (GlcNAc).
Dans un mode de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride est identique à un saccharide capsulaire de bactérie Gram positif, à l'exception du fait que l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride comprend un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive à la place du monosaccharide d'hexose normalement présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive du saccharide capsulaire de la bactérie Gram positif.
Cellule hôte
La présente invention fournit également une cellule hôte comprenant :
i) un ou plusieurs acides nucléiques qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases ;
ii) un acide nucléique qui code pour une oligosaccharyltransférase ;
iii) un acide nucléique qui code pour une protéine pneumolysine modifiée de l'invention ; et éventuellement iv) un acide nucléique qui code pour une polymérase (par exemple, wzy) .
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Les cellules hôtes qui peuvent être utilisées pour produire les bioconjugués de l'invention, comprennent des archées, des cellules hôtes procaryotes, et des cellules hôtes eucaryotes. Les exemples de cellules hôtes procaryotes pour une utilisation dans la production des bioconjugués de l'invention comprennent, sans limitation, l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, et l'espèce Clostridium. Dans un mode de réalisation spécifique, la cellule hôte est E. coli.
Dans un mode de réalisation, les cellules hôtes utilisées pour produire les bioconjugués de l'invention sont modifiées pour comprendre des acides nucléiques hétérologues, par exemple, des acides nucléiques hétérologues qui codent pour une ou plusieurs protéines de support et/ou des acides nucléiques hétérologues qui codent pour une ou plusieurs protéines, par exemple, des gènes codant pour une ou plusieurs protéines. Dans un mode de réalisation spécifique, les acides nucléiques hétérologues qui codent pour des protéines impliquées dans les voies de glycosylation (par exemple, les voies de glycosylation procaryotes et/ou eucaryotes) peuvent être introduits dans les cellules hôtes de l'invention.
De tels acides nucléiques peuvent coder pour protéines, y compris, sans oligosaccharyltransférases, des des des des limitation, épimérases, flippases, des polymérases, et/ou des glycosyl68
BE2017/5427 transiérases. Les acides nucléiques hétérologues (par exemple, des acides nucléiques qui codent pour des protéines de support et/ou des acides nucléiques qui codent pour d'autres protéines, par exemple, des protéines impliquées dans la glycosylation) peuvent être introduits dans les cellules hôtes de l'invention en utilisant des procédés tels que 1 ' électroporation, la transformation chimique par choc thermique, la transformation naturelle, la transduction par des phages, et la conjugaison. Dans des modes de réalisation spécifiques, les acides nucléiques hétérologues sont introduits dans les cellules hôtes de l'invention en
utilisant un plasmide, par exemple, les acides
nucléiques hétérologues sont exprimés dans les cellules
hôtes par un plasmide (par exemple, un vecteur
d'expression). Dans un autre mode de réalisation
spécifique, les acides nucléiques hétérologues sont introduits dans les cellules hôtes de l'invention en utilisant le procédé d'insertion décrit dans la demande international No. PCT/EP2013/068737 (publiée sous WO 14/037585).
Ainsi, la présente invention fournit également une cellule hôte comprenant :
i) un ou plusieurs acides nucléiques qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases ;
ii) un acide nucléique qui code pour une oligosaccharyltransférase ;
iii) un acide nucléique qui code pour une protéine pneumolysine modifiée de l'invention ;
iv) un acide nucléique qui code pour une polymérase (par exemple, wzy) ; et
BE2017/5427 vi) un acide nucléique qui code pour une flippase (par exemple, wxy) .
Dans un mode de réalisation, des modifications supplémentaires peuvent être introduites (par exemple, en utilisant des techniques recombinantes) dans les cellules hôtes de l'invention. Par exemple, les acides nucléiques des cellules hôtes (par exemple, des gènes) qui codent pour des protéines qui forment une partie d'une voie de glycosylation éventuellement en compétition ou en interférence (par exemple, qui sont en compétition ou interfèrent avec un ou plusieurs gènes hétérologues impliqués dans la glycosylation qui sont introduits de façon recombinante dans la cellule hôte) peuvent être délétés ou modifiés dans le contexte de la cellule hôte (génome) d'une façon qui les rend inactifs/dysfonctionnels (c'est-à-dire que les acides nucléiques de la cellule hôte qui sont délétés/modifiés ne codent pas pour une protéine fonctionnelle ou ne codent pour aucune protéine) . Dans un mode de réalisation, lorsque des acides nucléiques sont délétés du génome des cellules hôtes de l'invention, ils sont remplacés par une séquence souhaitable, par exemple, une séquence qui est utile pour la production de glycoprotéines.
Les exemples de gènes qui peuvent être délétés dans les cellules hôtes (et, dans certains cas, remplacés par d'autres séquences d'acide nucléique souhaitées) comprennent des gènes des cellules hôtes impliqués dans la biosynthèse des glycolipides, tels que waaL (voir, par exemple, Feldman et al. 2005, PNAS USA 102: 30163021), le groupe de la biosynthèse du cœur du lipide A (raa), le groupe du galactose (gai), le groupe de
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1'arabinose (ara), le groupe de l'acide colanique (me), le groupe des polysaccharides capsulaires, les gènes de la biosynthèse du pyrophosphate d'undécaprénol (par exemple, uppS (pyrophosphate d'undécaprényle synthase), uppP (undécaprényl-diphosphatase)), les gènes de recyclage de l'Und-P, les enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse des sucres activée par des nucléotides, le groupe des antigènes communs des entérobactéries, et les groupes des modifications des antigènes O de prophage comme le groupe gtrABS.
Une telle cellule hôte procaryote modifiée comprend des acides nucléiques codant pour des enzymes capables de produire un bioconjugué comprenant un antigène, par exemple, un antigène saccharidique fixé à une protéine pneumolysine modifiée de l'invention. De telles cellules hôtes peuvent exprimer naturellement des acides nucléiques spécifiques pour la production d'un antigène saccharidique, ou les cellules hôtes peuvent être fabriquées pour exprimer de tels acides nucléiques, c'est-à-dire, dans certains modes de réalisation, lesdits acides nucléiques sont hétérologues aux cellules hôtes. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs desdits acides nucléiques spécifiques pour la production d'un antigène saccharidique sont hétérologues à la cellule hôte et intégrés dans le génome de la cellule hôte. Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes de l'invention comprennent des acides nucléiques codant pour des enzymes supplémentaires actives dans la N-glycosylation des protéines, par exemple, les cellules hôtes de l'invention comprennent en outre un acide nucléique codant pour une
BE2017/5427 oligosaccharyltransférase et/ou un ou plusieurs acides nucléiques codant pour d'autres glycosyltransférases.
Les séquences d'acide nucléique comprenant des groupes de gènes des polysaccharides capsulaires peuvent être insérées dans les cellules hôtes de l'invention. Dans un mode de réalisation spécifique, le groupe de gènes des polysaccharides capsulaires inséré dans une cellule hôte de l'invention est un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires provenant d'une souche d'E. coli, une souche de Streptococcus (par exemple, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalactiae), une souche de Staphylococcus (par exemple, S. aureus), ou une souche de Burkholderia (par exemple, B. mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis). Des divulgations de procédés de fabrication de telles cellules hôtes qui sont capables de produire des bioconjugués se trouvent dans les documents WO 06/119987, WO 09/104074, WO 11/62615, WO 11/138361, WO 14/57109, WO 14/72405 et WO 16/20499.
Dans un mode de réalisation, la cellule hôte comprend un acide nucléique qui code pour une protéine pneumolysine modifiée dans un plasmide dans la cellule hôte.
Machinerie de la glycosylation
Les cellules hôtes de l'invention comprennent, et/ou peuvent être modifiées pour comprendre, des acides nucléiques qui codent pour la machinerie génétique (par exemple, des glycosyltransférases, des flippases, des polymérases, et/ou des oligosaccharyl-transférases) capable de produire des oligosaccharides et/ou des polysaccharides hybrides, ainsi que pour la machinerie
BE2017/5427 génétique capable de lier des antigènes à la protéine pneumolysine modifiée de l'invention.
Glycosyltransférases
Les cellules hôtes de l'invention comprennent des acides nucléiques qui codent pour des glycosyltransférases qui produisent une unité répétitive d'oligosaccharide ou de polysaccharide. Dans un mode de réalisation, ladite unité répétitive ne comprend pas un hexose à l'extrémité réductrice, et ladite unité répétitive d'oligosaccharide ou de polysaccharide est dérivée d'une unité répétitive d'oligosaccharide ou de polysaccharide donneur qui comprend un hexose à l'extrémité réductrice.
Dans un mode de réalisation, les cellules hôtes de 1'invention peuvent comprendre un acide nucléique qui code pour une glycosyltransférase qui assemble un dérivé sur le
Dans un assemble pyrophosphate aspect, la un dérivé monosaccharidique d'hexose d'undécaprényle (Und-PP). glycosyltransférase qui monosaccharidique d'hexose sur 1'Und-PP est hétérologue à la cellule hôte et/ou hétérologues à un ou plusieurs des gènes qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases. Ladite glycosyltransférase peut être dérivée, par exemple, de l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Enterococcus, l'espèce
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Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, la glycosyltransférase qui assemble un dérivé monosaccharidique d'hexose sur 1'Und-PP est wecA, éventuellement d'Eb coli (wecA peut assembler la GlcNAc sur l'UndP de 1'UDP-GlcNAc). Dans un mode de réalisation, le monosaccharide d'hexose est choisi dans le groupe constitué de glucose, galactose, rhamnose, arabinotol, fucose et mannose (par exemple, le galactose).
Dans un mode de réalisation, les cellules hôtes de 1'invention peuvent comprendre des acides nucléiques qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose assemblé sur 1'Und-PP (par exemple, dans la synthèse du CP33F) . Dans un mode de réalisation spécifique, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose consistent en la galactosyltransférase (wfeD) de Shigella boydii. Dans un autre mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose consistent en la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028. Dans un mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose comprennent la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028 ayant une séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 90 (GenBank : DQ462205.1) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %,
BE2017/5427 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 90, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Dans un autre mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose consistent en la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167. Dans un mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose comprennent la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167 ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 89 (GenBank : EU296408.1) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 89, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Des Galftransférases, telles que wfdK et wbeY, peuvent transférer le Galf (galactofuranose) de l'UDP-Galf au GlcNAc-P-P-Undécaprényle. Dans un autre mode de lesdites une ou plusieurs capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose sont la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028 et la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167.
Dans un mode de réalisation, les cellules hôtes de 1'invention comprennent des acides nucléiques qui codent pour des glycosyltransférases qui assemblent l'unité répétitive d'oligosaccharide ou de polysaccharide donneur sur le dérivé monosaccharidique d'hexose.
réalisation spécifique, glycosyltransférases
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Dans un mode de réalisation, les glycosyltransférases qui assemblent l'unité répétitive d'oligosaccharide ou de polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide d'hexose comprennent une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé monosaccharidique d'hexose. Les exemples de glycosyltransférases comprennent les galactosyl-transférases (wclP) , par exemple, wclP d'E. coli 021. Dans un mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases qui assemblent l'unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé monosaccharidique d'hexose comprennent la galactosyltransférase (wclP) d'E. coli 021 ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 115 (GenBank : EU694098.1) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 115, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur.
Dans un mode de réalisation, les glycosyltransférases qui assemblent l'unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé monosaccharidique glycosyltransférase qui monosaccharide qui est d'hexose comprennent une est capable d'ajouter le adjacent au monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité
BE2017/5427 répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur. Les exemples de glycosyltransférases comprennent la glucosyltransférase (wclQ), par exemple, wclQ d'E. coli 021. Dans un mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases qui assemblent l'unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé monosaccharidique d'hexose comprennent la glycosyltransférase (wclQ) d'E. coli 0167 ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 116 (GenBank: EU694098.1) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 116, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur.
Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend des glycosyltransférases pour la synthèse des unités répétitives d'un oligosaccharide ou d'un polysaccharide choisies parmi les groupes de gènes des polysaccharides capsulaires suivants : CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6(A,B,C,D), CP7(A,B,C), CP8, CP9(A,L,N,V),
CP10 (A,B,C,F) , CPU (A,B,C,D,F) , CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A,B,C,F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CPI 8 (A, B, C, F) ,
CP19 (A,B,C,F) , CP20, CP21, CP22(A,F), CP23(A,B,F),
CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26, CP27, CP28(A,F), CP29,
CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43,
CP44, CP45, CP46, CP47(A,F), ou CP48 de S. pneumoniae.
Les gènes de la biosynthèse capsulaire de S. pneumoniae sont décrits dans Bentley et al. (PLoS Genet. Mars 2006 ; 2(3): e31) et les séquences sont fournies à la GenBank. Dans un mode de réalisation spécifique, les
BE2017/5427 glycosyltransférases pour la synthèse des unités répétitives d'un oligosaccharide ou d'un polysaccharide sont choisies parmi les groupes de gènes des polysaccharides capsulaires suivants : CP4, CP8, CP12F, CP15A, CP16F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38. Dans un mode de réalisation spécifique, les glycosyltransférases pour la synthèse des unités répétitives d'un oligosaccharide ou d'un polysaccharide sont choisies parmi les groupes de gènes des polysaccharides capsulaires suivants : CP4, CP12F ou CP33F.
Le groupe de gènes des polysaccharides capsulaires est localisé entre dexB et aliA dans le chromosome pneumococcique (Llull et al., 1999, J. Exp. Med. 190, 241-251). Il y a généralement quatre gènes relativement conservés : (wzg), (wzh) , (wzd) , (wze) à l'extrémité 5’ du groupe de gènes des polysaccharides capsulaires (Jiang et al., 2001, Infect. Immun. 69, 1244-1255). Sont également compris dans le groupe de gènes des polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae, wzx (gène de la flippase de polysaccharide) et wzy (gène de la polymérase de polysaccharide). Les groupes de gènes des CP des 90 sérotypes de S. pneumoniae ont été séquencés par Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/Projects/ S_pneumoniae/CPS/) , et wzx et wzy de 89 sérotypes ont été annotés et analysés (Kong et al., 2005, J. Med. Microbiol. 54, 351-356). Les gènes de la biosynthèse capsulaire de S. pneumoniae sont en outre décrits dans Bentley et al. (PLoS Genet. Mars 2006 ; 2(3): e31) et les séquences sont fournies à la GenBank.
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Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP4 comprenant wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP4 de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP4 comprennent wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP4 de S. pneumoniae ayant les séquences d'acides aminés de
SEQ ID NO : 91, 92, 93 et 94 respectivement (GenBank :
CR931635.1) ou des séquences d'acides aminés au moins
identiques à 8 0 o θ r 85 %, 90 % , 92 %, 95 %, 96 %, 97 %,
% ou 99 % à SEQ ID NO : 91, 92, 93 et 94, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Eventuellement, la cellule hôte de l'invention comprend également weil, wciJ, wciK, wciL, wzy, wciM, wzx, mnaA, fnlA, fnlB et fnlC du CP4 de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, la cellule hôte de l'invention comprend une séquence d'acide nucléique codant pour weil, wciJ, wciK, wciL, wzy, wciM, wzx, mnaA, fnlA (également appelé « fnll ») , fnlB (également appelé « fn!2 ») et fnlC (également appelé « fn!3 ») du CP4 de S. pneumoniae ayant les séquences d'acides aminés de SEQ ID NO : 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 et 105 respectivement (GenBank : CR931635.1) ou des séquences d'acides aminés au moins identiques à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 et 105, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Weil est une glycosyl79
BE2017/5427 phosphate transférase prédite et ainsi responsable de la synthèse de 1'Und-PP-D-GalNAc, wciJ, wciK, et wciL sont des D-ManNAc, L-FucNAc, et D-Gal transférases, et wciM est un homologue des pyruvate transférases (Jiang SM, Wang L, Reeves PR: Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4, 6B, 8, and 18C capsular polysaccharide gene clusters. Infect Immun 2001, 69(3): 1244-1255). D'autres détails sur la synthèse du CP4 peuvent se trouver dans le document WO 2014/072405A1.
Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP12F comprenant wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP12F de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP12F comprennent wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP12F de S. pneumoniae ayant les séquences d'acides aminés de SEQ ID NO : 106, 107, 108 et 109 respectivement (GenBank : CR931660.1) ou des séquences d'acides aminés au moins identiques à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 106, 108 et 109, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur.
Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprenant wciC, wciD, wciE, et/ou wciF du CP33F de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, lesdites une
BE2017/5427 ou plusieurs glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP12F comprennent wciC, wciD, wciE, et/ou wciF du CP33F de S. pneumoniae ayant les séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 110, 111, 112 et 113 respectivement (GenBank : CR931702.1) ou des séquences d'acides aminés au moins identiques à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 110, 111, 112 et 113, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Eventuellement, une cellule hôte de l'invention comprend également wchA (une Glc-1-P transférase) et/ou wciB (une Galt transférase) du CP33F de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend une ou plusieurs séquences d'acide nucléique codant pour wchA (une Glc-1-P transférase) et/ou wciB (une Galt transférase) du CP33F de S. pneumoniae ayant les séquences d'acides aminés respectives de SEQ ID NO : 114 et 115 (GenBank : CR931702.1) ou des séquences d'acides aminés au moins identiques à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 114 et 115, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. De façon appropriée, ladite cellule hôte est capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, dans laquelle ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique au CP33F de S. pneumoniae, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive à la place du
BE2017/5427 monosaccharide d'hexose normalement présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive du CP33F de S. pneumoniae.
Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend des glycosyltransférases gui assemblent l'unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé monosaccharidigue d'hexose, lesguelles comprennent une glycosyltransférase gui est capable d'ajouter le monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé monosaccharidigue d'hexose.
La cellule hôte peut comprendre en outre des gènes supplémentaires pour la synthèse des saccharides. Par exemple, la cellule hôte peut comprendre le groupe codant pour le CP de type 4 de S. pneumoniae gui comprend les gènes wzg à fnlC (c'est-à-dire, un ou plusieurs ou la totalité des gènes wzg, wzh, wzd, wze, weil, wciJ, wciK, wciL, wzy, wciM, wzx, mnaA, fnlA, fnlB, fnlC). l'UDP-DFucNAc et 1'UDP-D-ManNAc sont fabriguées par les protéines mnaA, fnlA, fnlB, et fnlC. Comme il a été décrit ci-dessus, Weil est une glycosyl-phosphate transférase prédite et ainsi responsable de la synthèse de 1 ' Und-PP-D-GalNAc, wciJ, wciK, et wciL sont des DManNAc, L-FucNAc, et D-Gal transiérases, et wciM est un homologue des pyruvates tränstérases. Ces gènes peuvent être en outre des composants de la cellule hôte.
Par exemple, pour synthétiser une sous-unité glycomodifiée du CP33F (une unité répétitive comprenant un dérivé monosaccharidigue d'hexose à l'extrémité réductrice) , deux galactofuranosyltransf érases, Pi/beL
BE2017/5427 d'E. coll 028 et WfdK d'E. coli 0167 peuvent être utilisées. La GlcNAc peut être assemblée sur l'UndP à partir de l'UDP-GlcNAc par WecA (qui existe dans toutes les bactéries Gram négatif qui synthétisent 1'ECA et les bactéries Gram positif qui fabriquent de l'acide téichoïque) (Annu Rev Microbiol. 2013 ; 67: 313-36 ; Glycobiology. Février 2011 ; 21(2): 138-51) pour fabriquer une liaison ß (1,3). Ensuite, en utilisant les glycosyltransférases WciC, WciD, WclE et WclF du groupe de gènes du CP33F de S. pneumoniae, la sous-unité générée du CP33F (ß-D-Galf-1,3-ß-D-Gal-l,3-a-D-Gal(al,2-D-Gal)1,3-ß-D-Galf-(2Ac)-1,3-D-GlcNAc-PP-Undd) est synthétisée. Ainsi, ces gènes peuvent être en outre des composants de la cellule hôte. Dans un mode de réalisation, un plasmide peut être utilisé pour produire la sous-unité générée du CP33F dans le cytoplasme, à partir duquel elle peut être soumise à une translocation dans le périplasme par la flippase du CP33F ou le polysaccharide de type sauvage peut être assemblé dessus par l'action de la polymérase du CP33F (wzy) . Le plasmide peut également contenir la polymérase du CP33F (wzy) et galE et glf d'E. coli 016 pour amplifier la productivité de la polymérase de type sauvage. D'autres détails sur la synthèse du CP33F peuvent se trouver dans le document WO 2016/020499A2.
Oligosaccharyltransférases
La glycosylation des protéines liées en N, l'addition de molécules de glucides à un résidu d'asparagine dans la chaîne polypeptidique de la protéine cible, est le type le plus courant de modification posttraductionnelle se déroulant dans le
BE2017/5427 réticulum endoplasmique des organismes eucaryotes. Le processus s'accomplit par le complexe enzymatique des oligosaccharyltransférases (OST) responsable du transfert d'un oligosaccharide préassemblé depuis un support lipidique (phosphate de dolichol) vers un résidu d'asparagine d'une protéine naissante au sein de la séquence conservée Asn-X-Ser/Thr (où X représente un acide aminé quelconque à l'exception de la proline) dans le réticulum endoplasmique.
Il a été montré qu'une bactérie, le pathogène véhiculé par les aliments Campylobacter jejuni, peut également N-glycosyler ses protéines (Wacker et al. Science. 2002 ; 298(5599): 1790-3) en raison du fait qu'il possède sa propre machinerie de glycosylation. La machinerie responsable de cette réaction est codée par un groupe appelé « pgl » (pour glycosylation des protéines).
La machinerie de glycosylation de C. jejuni peut être transférée à E. coli pour permettre la glycosylation des protéines recombinantes exprimées par les cellules d'E. coli. Des études antérieures ont démontré comment produire des souches d'E. coli qui peuvent effectuer la N-glycosylation (voir, par exemple, Wacker et al. Science. 2002 ; 298 (5599) : 1790-3 ; NitaLazar et al. Glycobiology. 2005 ; 15(4): 361-7 ; Feldman et al. Proc Natl Acad Sei USA. 2005 ; 102(8): 3016-21 ; Kowarik et al. EMBO J. 2006 ; 25(9): 1957-66 ; Wacker et al. Proc Natl Acad Sei USA. 2006 ; 103(18) : 7088-93 ; publications de demandes internationales No. WO 2003/074687, WO 2006/119987, WO 2009/104074, et
WO 2011/06261, et WO 2011/138361).
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Les oligosaccharyltransférases transfèrent les oligosaccharides liés à des lipides aux résidus d'asparagine des chaînes polypeptidiques naissantes qui comprennent un motif consensus de N-glycosylation, par exemple, Asn-X-Ser(Thr), dans lequel X peut représenter un acide aminé quelconque à l'exception de Pro ; ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), dans lequel X et Z sont choisis indépendamment parmi des acides aminés naturels quelconques à l'exception de Pro (voir le document WO 2006/119987). Voir, par exemple, les documents WO 2003/074687 et WO 2006/119987, dont les divulgations sont incorporées en référence dans leur intégralité.
Dans un mode de réalisation, les cellules hôtes de 1'invention comprennent un acide nucléique qui code pour une oligosaccharyltransférase. L'acide nucléique qui code pour une oligosaccharyltransférase peut être natif à la cellule hôte, ou peut être introduit dans la cellule hôte en utilisant des approches génétiques, telles que décrites ci-dessus. Dans un mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyltransférase est une oligosaccharyltransférase de Campylobacter. Dans un autre mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyltransférase est une oligosaccharyltransférase de Campylobacter jejuni (c'est-à-dire, pglB ; voir, par exemple, Wacker et al. 2002, Science 298: 1790-1793 ; voir également, par exemple, ID Gene : 3231775 du NCBI, No d'accession d'UniProt 086154). Dans un autre mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyl-transférase est une oligosaccharyl-transférase de Campylobacter lari (voir, par exemple, ID Gene : 7410986 du NCBI).
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Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes de l'invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase, dans lesquelles ladite séquence d'acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase (par exemple, pglB de Campylobacter jejuni) est intégrée dans le génome de la cellule hôte. Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 120 (GenBank : AF108897.1) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 120, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, il est fourni une cellule hôte procaryote modifiée comprenant (i) une glycosyltransférase dérivée d'un groupe de polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae, telle que ladite glycosyltransférase est intégrée dans le génome de ladite cellule hôte ; (ii) un acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase (par exemple, pglB de Campylobacter jejuni), tel que ledit acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase est intégré dans le génome de la cellule hôte ; et (iii) une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, telle que ladite protéine pneumolysine modifiée est soit portée par un plasmide soit intégrée dans le génome de la cellule hôte. Il est également fourni un procédé de fabrication d'une cellule
BE2017/5427 hôte procaryote modifiée comprenant (i) l'intégration d'une glycosyltransférase dérivée d'un groupe de polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae dans le génome de ladite cellule hôte ; (ii) l'intégration d'un acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase (par exemple, pglB de Campylobacter jejuni) dans le génome de la cellule hôte ; et (iii) l'intégration dans une cellule hôte d'une protéine pneumolysine modifiée de l'invention soit portée par un plasmide soit intégrée dans le génome de la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation spécifique, la cellule hôte de l'invention est telle qu'elle contient au moins un gène inactivé fonctionnellement ou délété, éventuellement le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par un acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase, éventuellement le gène waaL a été remplacé par pglB de C. jejuni.
Polymérases
Dans un mode de réalisation, une polymérase (par exemple, wzy) est introduite dans une cellule hôte de l'invention (c'est-à-dire que la polymérase est hétérologue à la cellule hôte). Dans un mode de réalisation, la polymérase est une polymérase bactérienne. Dans un mode de réalisation, la polymérase est une polymérase de polysaccharide capsulaire (par exemple, wzy) ou une polymérase d'antigène O (par exemple, wzy) . Dans un mode de réalisation, la polymérase est une polymérase de polysaccharide capsulaire (par exemple, wzy).
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Dans un mode de réalisation, une polymérase d'une voie de biosynthèse des polysaccharides capsulaires est introduite dans une cellule hôte de l'invention.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, une polymérase d'une voie de biosynthèse des polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae est introduite dans une cellule hôte de l'invention.
Dans un mode de réalisation, la polymérase introduite dans les cellules hôtes de l'invention est le gène wzy d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CPI, CP2, CP4, CP5, CP6(A,B,C,D), CP7 (A,B,C), CP8, CP9(A,L,N,V), CPI 0(A,B,C,F),
CP11(A,B,C,D,F), CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CP18 (A, B, C, F) , CPI 9 (A, B, C, F) , CP20, CP21, CP22(A,F), CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F),
CP26, CP27, CP28(A,F), CP29, CP31, CP32 (A, F) ,
CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F) ou CP48 de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifique, la polymérase introduite dans les cellules hôtes de l'invention est le gène wzy d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CP4, CP8, CP12F, CP15A, CP16F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38. Dans un mode de réalisation spécifique, la polymérase introduite dans les cellules hôtes de l'invention est le gène wzy d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CP4, CP12F ou CP33F. Par exemple, une cellule hôte de l'invention peut comprendre une séquence d'acide nucléique codant pour une polymérase wzy d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CP4, CP12F ou CP33F ayant une séquence d'acides aminés telle que
BE2017/5427 fournie par GenBank : CR931635.1, GenBank : CR931660.1 et GenBank : CR931702.1 ou une séquence d'acides aminés qui y est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur.
D'autres polymérases qui peuvent être introduites dans les cellules hôtes de l'invention proviennent de S. pneumoniae décrites dans Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al. : Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3): e31).
Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite polymérase wzy est incorporée (par exemple, insérée dans le génome ou exprimée par un plasmide) dans ladite cellule hôte comme faisant partie d'un groupe de polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae, dans lequel ledit groupe de polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae a été modifié pour comprendre la polymérase wzy.
Dans un mode de réalisation spécifique, une séquence d'acide nucléique codant pour la polymérase wzy de S. pneumoniae est insérée dans ou exprimée par les cellules hôtes de l'invention. Ainsi, une cellule hôte de 1'invention peut comprendre en outre une polymérase wzy de S. pneumoniae.
Flippases
Dans un mode de réalisation, une flippase (wzx) est introduite dans une cellule hôte de l'invention (c'està-dire que la flippase est hétérologue à la cellule hôte)
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Ainsi, une cellule hôte de l'invention peut comprendre en outre une flippase. Dans un mode de réalisation, la flippase est une flippase bactérienne. Les flippases effectuent une translocation des unités répétitives de type sauvage et/ou de leurs unités répétitives modifiées (hybrides) correspondantes du cytoplasme dans le périplasme des cellules hôtes (par exemple, E. coli) . Ainsi, une cellule hôte de l'invention peut comprendre un acide nucléique qui code pour une flippase (wzx).
Dans un mode de réalisation spécifique, une flippase d'une voie de biosynthèse des polysaccharides capsulaires est introduite dans une cellule hôte de 1'invention.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, une flippase d'une voie de biosynthèse des polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae est introduite dans une cellule hôte de l'invention. Dans certains modes de réalisation, la flippase introduite dans les cellules hôtes de l'invention est le gène wzx d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CPI, CP2, CP4, CP5, CP6 (A,B,C,D) , CP7(A,B,C), CP8, CP9 (A, L, N, V) ,
CP10 (A,B,C,F) , CPI1(A,B,C,D,F), CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CPI 8 (A, B, C, F) ,
CPI 9 (A, B, C, F) , CP20, CP21, CP22(A,F), CP23(A,B,F),
CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26, CP27, CP28(A,F), CP29,
CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44,
CP45, CP46, CP47(A,F), ou CP48 de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifique, la flippase introduite dans les cellules hôtes de l'invention est le gène wzx d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CP4,
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CP8, CP12F, CP15A, CP16F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38. Par exemple, une cellule hôte de l'invention peut comprendre une séquence d'acide nucléique codant pour une flippase wzx d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CP4, CP12F ou CP33F ayant une séquence d'acides aminés telle que fournie par GenBank : CR931635.1, GenBank : CR931660.1 et GenBank : CR931702.1 ou une séquence d'acides aminés qui y est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur.
Dans un mode de réalisation spécifique, la flippase introduite dans les cellules hôtes de l'invention est le gène wzx d'un groupe de gènes des polysaccharides capsulaires CP4, CP12F ou CP33F.
D'autres flippases qui peuvent être introduites dans les cellules hôtes de l'invention proviennent de S. pneumoniae décrites dans Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al. Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes PLoS genetics 2006, 2(3): e31).
D'autres flippases qui peuvent être introduites dans les cellules hôtes de l'invention proviennent, par exemple, de Campylobacter jejuni (par exemple, pglK).
Enzymes qui modifient les monosaccharides
Enzymes accessoires
Dans un mode de réalisation, des acides nucléiques codant pour une ou plusieurs enzymes accessoires sont introduits dans les cellules hôtes de l'invention. Ainsi,
BE2017/5427 l'invention. Les comprennent, sans d'enzymes accessoires des épimérases, des une cellule hôte de l'invention peut comprendre en outre une ou plusieurs de ces enzymes accessoires. De tels acides nucléiques codant pour une ou plusieurs enzymes accessoires peuvent être soit portés par des plasmides soit intégrés dans le génome des cellules hôtes de exemples limitation, enzymes de ramification, de modification (par exemple, pour ajouter des cholines, des phosphates de glycérol, des pyruvates), d'amidation, de régulation de la longueur de la chaîne, d'acétylation, de formylation, de polymérisation.
Dans certains modes de réalisation, des enzymes qui sont capables de modifier des monosaccharides sont introduites dans une cellule hôte de l'invention (c'està-dire que les enzymes sont capables de modifier des monosaccharides qui sont hétérologues à la cellule hôte) De telles enzymes comprennent, par exemple, des épimérases et des racémases. Ainsi, une cellule hôte de l'invention peut comprendre en outre une épimérase et/ou une racémase.
Dans un mode de réalisation, les épimérases et les racémases proviennent de bactéries. Dans certains modes de réalisation, les épimérases et/ou les racémases introduites dans les cellules hôtes de l'invention proviennent de l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce
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Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campy1obacter.
Dans certains modes de réalisation, l'épimérase insérée dans une cellule hôte de l'invention est une épimérase décrite dans la publication de la demande internationale No. WO 2011/062615, dont la divulgation est incorporée en référence dans son intégralité. Dans un mode de réalisation, l'épimérase est l'épimérase codée par le gène Z3206 de la souche d'E. coli 0157. L'épimérase Z3206 convertit la GlcNAc-UndPP (produit de wecA d'E. coli) en GalNAc-UndPP (Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ. J Biol Chem. 15 janvier 2010 ; 285(3) : 1671-80) . Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend une épimérase ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 118 ([souche d'Escherichia coli 0157:H7 EDL933] GenBank : AAG57102.1) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 118, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Voir, par exemple, le document WO 2011/062615 et Rush et al. 2009, The Journal of Biological Chemistry 285: 1671-1680, qui est incorporé en référence dans son intégralité. Dans un autre mode de réalisation, l'épimérase est galE (UPDGalactose épimérase). Z3206 et galE convertissent la GlcNAc-P-P-undécaprényle en GalNAc-P-P-undécaprényle. Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de 1'invention comprend une épimérase ayant une séquence
BE2017/5427 d'acides aminés de SEQ ID NO : 119 (UniProtKB - P09147) ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 119, par exemple, comprenant au moins 100, 150 ou 200 acides aminés contigus de la séquence pleine longueur. Dans un autre mode de réalisation, l'épimérase est 1'UDP-GlcNAc/Glc 4-épimérase (gne) de Campylobacter jejuni. Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes de l'invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant pour une épimérase, dans lesquelles ladite séquence d'acide nucléique codant pour une épimérase est intégrée dans le génome de la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de l'invention comprend en outre une mutase, par exemple, glf (UDP-galatopyranose mutase).
Dans un mode de réalisation, une cellule hôte de 1'invention comprend en outre RcsA (un activateur de la synthèse des CP) . RcsA est un régulateur positif instable requis pour la synthèse du polysaccharide capsulaire, l'acide colanique, dans Escherichia coli.
Contexte génétique
Les exemples de cellules hôtes qui peuvent être utilisées pour produire les cellules hôtes de l'invention comprennent, sans limitation, l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium,
Streptomyces, l'espèce Streptococcus, Staphylococcus, l'espèce Bacillus, et
1'espèce
1'espèce
1'espèce
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Clostridium. Dans un mode de réalisation spécifique, la cellule hôte utilisée est E. coli.
Dans un mode de réalisation, le contexte génétique de la cellule hôte est modifié, par exemple, par délétion d'un ou de plusieurs gènes. Les exemples de gènes qui peuvent être délétés dans des cellules hôtes (et, dans certains cas, remplacés par d'autres séquences d'acide nucléique souhaitées) comprennent des gènes des cellules hôtes impliqués dans la biosynthèse des glycolipides, tels que waaL (voir, par exemple, Feldman et al. 2005, PNAS USA 102: 3016-3021), le groupe de l'antigène O (rfb ou wb), le groupe des antigènes communs des entérobactéries (mec), le groupe de la biosynthèse du cœur du lipide A (waa), et les groupes de modifications des antigènes O de prophages comme le groupe gtrABS. Dans un mode de réalisation spécifique, un ou plusieurs du gène waaL, du gène gtrA, du gène gtrB, du gène gtrS, ou un ou plusieurs gènes du groupe wec ou un ou plusieurs gènes du groupe de gènes rfb sont délétés ou inactivés fonctionnellement à partir du génome d'une cellule hôte procaryote de l'invention. Dans un mode de réalisation, une cellule hôte utilisée est E. coli, dans laquelle le gène waaL, le gène gtrA, le gène gtrB, le gène gtrS sont délétés ou inactivés fonctionnellement à partir du génome de la cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation, une cellule hôte utilisée est E. coli, dans laquelle le gène waaL et le gène gtrS sont délétés ou inactivés fonctionnellement à partir du génome de la cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation, une cellule hôte utilisée est E. coli, dans laquelle le ou
BE2017/5427 les gènes waaL du groupe wec sont délétés ou inactivés fonctionnellement à partir du génome de la cellule hôte.
Avantages
Les cellules hôtes de l'invention sont d'une importance et d'une pertinence commerciale particulière, car elles permettent une fermentation à grande échelle de bioconjugués comprenant un saccharide, par exemple, des antigènes de Streptococcus qui peuvent être utilisés en tant qu'agents thérapeutiques (par exemple, dans des compositions immunogènes, des vaccins), avec un risque inférieur dû à la stabilité accrue de l'ADN inséré dans le chromosome et ainsi l'expression de l'ADN d'intérêt durant la fermentation. Les cellules hôtes de l'invention sont avantageuses par rapport à des cellules hôtes qui reposent sur une expression portée par le plasmide d'acides nucléiques requis pour la production des bioconjugués de l'invention parce que, entre autres, la sélection par des antibiotiques durant la fermentation n'est pas requise une fois que l'ADN hétérologue est inséré dans le génome de la cellule hôte. C'est-à-dire que, lorsque 1'insert d'ADN est inséré dans le chromosome, il n'a pas besoin d'être sélectionné, parce qu'il est propagé avec la réplication du génome de l'hôte. En outre, un désavantage des systèmes portés par des plasmides est qu'avec chaque génération (c'est-àdire, le cycle de réplication de la cellule hôte), le risque de perdre le plasmide augmente. Cette perte de plasmide est due à la distribution parfois inappropriée des plasmides aux cellules filles au stade de la séparation cellulaire durant la division cellulaire. A grande échelle, les cultures de cellules bactériennes se
BE2017/5427 dupliquent plus souvent qu'à des échelles plus petites de fermentation pour atteindre des densités cellulaires élevées. Ainsi, la stabilité cellulaire supérieure et l'expression de 1'insert d'ADN mènent à des rendements supérieurs des produits, fournissant un avantage distinct. La stabilité cellulaire est en outre un critère d'acceptation de procédés pour une approbation par les autorités réglementaires, alors que la sélection par des antibiotiques n'est généralement pas souhaitée durant la fermentation pour diverses raisons, par exemple, les antibiotiques se présentent comme des impuretés dans les produits médicaux finals et portent le risque de provoquer des réactions allergiques, et les antibiotiques peuvent favoriser la résistance aux antibiotiques (par exemple, par transfert de gènes ou sélection de pathogènes résistants).
La présente demande fournit des cellules hôtes pour une utilisation dans la fabrication de bioconjugués comprenant des antigènes saccharidiques qui peuvent être utilisés en tant qu'agents thérapeutiques (par exemple, dans des compositions immunogènes, des vaccins), dans lesquelles certains éléments génétiques requis pour diriger la production de bioconjugués sont intégrés de façon stable dans le génome des cellules hôtes. Par conséquent, la cellule hôte peut contenir un nombre réduit de plasmides, juste un seul plasmide ou aucun plasmide du tout. Dans certains modes de réalisation, la présence d'un seul plasmide peut entraîner une plus grande flexibilité de la souche de production et la capacité de changer la nature de la conjugaison (en termes de sa teneur en saccharide ou protéine de support)
BE2017/5427 menant facilement à une plus grande flexibilité de la souche de production.
En général, une réduction de l'utilisation de plasmides mène à une souche de production qui est plus adaptée pour une utilisation dans la production de produits médicinaux. Un désavantage de la présence de matériau génétique essentiel sur des plasmides est la nécessité d'une pression de sélection pour maintenir les éléments épisomiques dans la cellule hôte. La pression de sélection nécessite l'utilisation d'antibiotiques, ce qui est indésirable pour la production de produits médicinaux à cause, par exemple, du danger de réactions allergiques contre les antibiotiques et des coûts supplémentaires de fabrication. En outre, la pression de sélection est fréquemment incomplète, produisant des cultures bactériennes qui ne sont pas homogènes dans lesquelles certains clones ont perdu le plasmide et ainsi ne produisent pas le bioconjugué. Par conséquent, les cellules hôtes de l'invention sont capables de produire un produit plus sécuritaire qui peut être obtenu dans des rendements élevés.
Bioconj ugués
Les cellules hôtes de l'invention peuvent être utilisées pour produire des bioconjugués comprenant un antigène saccharidique, par exemple, un antigène de Streptococcus pneumoniae lié à une protéine pneumolysine modifiée de l'invention. Des procédés de production de bioconjugués en utilisant des cellules hôtes sont décrits, par exemple, dans les documents WO 2003/074687 et WO 2006/119987. Les bioconjugués, tels que décrits, possèdent des propriétés avantageuses par rapport à des
BE2017/5427 conjugués chimigues d'antigène-protéine de support, en ce gu'ils nécessitent moins d'agents chimigues dans la fabrication et sont plus homogènes en termes du produit final généré.
Dans un mode de réalisation, il est fourni un bioconjugué comprenant une protéine pneumolysine modifiée liée à un antigène de Streptococcus pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifigue, ledit antigène de Streptococcus pneumoniae est un saccharide capsulaire (par exemple, un polysaccharide capsulaire) . Dans un mode de réalisation spécifigue, il est fourni un bioconjugué comprenant une protéine pneumolysine modifiée de l'invention et un antigène choisi parmi un saccharide capsulaire (par exemple, un polysaccharide capsulaire) de Streptococcus pneumoniae du sérotype CPI,
CP2, CP3, CP4, CP5, CP6(A,B,C,D), CP7(A,B,C), CP8,
CP9(A,L,N,V), CP10 (A,B,C,F) , CPI1(A,B,C,D,F),
CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F) , CP16(A,F),
CP17(A,F), CP18 (A,B,C,F) , CPI 9 (A, B, C, F) , CP20, CP21,
CP22(A,F), CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26,
CP27, CP28(A,F), CP29, CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40,
CP41(A,F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F), ou
CP48. Dans un mode de réalisation spécifigue, il est fourni un bioconjugué pneumolysine modifiée de choisi parmi un saccharide polysaccharide capsulaire) du sérotype CP4, CP8, CP12F, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, réalisation spécifigue, il comprenant une protéine 1'invention et un antigène capsulaire (par exemple, un de Streptococcus pneumoniae
CP15A, CP16F, CP22F, CP23A, ou CP38. Dans un mode de est fourni un bioconjugué
BE2017/5427 comprenant une protéine pneumolysine modifiée de l'invention et un antigène choisi parmi un saccharide capsulaire (par exemple, un polysaccharide capsulaire) de Streptococcus pneumoniae du sérotype 4, 12F ou 33F.
Les bioconjugués de l'invention peuvent être purifiés, par exemple, par chromatographie (par exemple, chromatographie sur colonne d'échange d'ions, d'échange anionique, d'affinité, et d'exclusion), centrifugation, solubilité différentielle, ou par toute autre technique classique pour la purification de protéines. Voir, par exemple, Saraswat et al. 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18) ; voir également les procédés décrits dans le document WO 2009/104074. En outre, les bioconjugués peuvent être fusionnés à des séquences polypeptidiques hétérologues décrites ou sinon connues dans l'art pour faciliter la purification. Les conditions véritables utilisées pour purifier un bioconjugué particulier dépendront, en partie, de la stratégie de synthèse et de facteurs tels que la charge nette, l'hydrophobicité, et/ou 1'hydrophilicité du bioconjugué, et seront évidentes pour l'homme du métier.
Un autre aspect de l'invention est un procédé de production d'un bioconjugué qui comprend (ou est constitué de) une protéine pneumolysine modifiée liée à un saccharide, ledit procédé comprenant (i) la culture de la cellule hôte de l'invention dans des conditions appropriées pour la production de protéines (et éventuellement dans des conditions appropriées pour la production de saccharides) et (ii) l'isolement du bioconjugué produit par ladite cellule hôte.
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Un autre aspect de l'invention est un bioconjugué produit par le procédé de l'invention, dans lequel ledit bioconjugué comprend un saccharide lié à une protéine pneumolysine modifiée.
Méthodes analytiques
Divers méthodes peuvent être utilisées pour analyser les compositions structurales et les longueurs des chaînes des sucres des bioconjugués de l'invention.
Dans un mode de réalisation, 1'hydrazinolyse peut être utilisée pour analyser les glycanes. En premier, les polysaccharides sont libérés de leurs supports protéiniques par incubation avec de 1'hydrazine selon les instructions du fabricant (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, RoyaumeUni) . L'hydrazine nucléophile attaque la liaison glycosidique entre le polysaccharide et la protéine de support et permet la libération des glycanes fixés. Les groupes N-acétyle sont perdus durant ce traitement et doivent être reconstitués par re-N-acétylation. Les glycanes libres sont purifiés sur des colonnes de charbon et subséquemment marqués à l'extrémité réductrice par le fluorophore 2-amido-benzamide. Voir Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB: Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995, 230(2): 229-238. Les polysaccharides marqués sont séparés sur une colonne GlycoSep-N (GL Sciences) selon le protocole de CLHP de Royle et al. (Voir Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM: An analytical and structural database provides a strategy for sequencing
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O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem 2002, 304(1) : 70-90) . Le chromatogramme de fluorescence résultant indique la longueur du polysaccharide et le nombre d'unités répétitives. Les informations structurales peuvent être rassemblées en recueillant les pics individuels et en effectuant subséquemment une analyse MS/MS. De cette façon, la composition en monosaccharide et la séquence de l'unité répétitive pourront être confirmées et en outre l'homogénéité de la composition polysaccharidique pourra être identifiée.
Dans un autre mode de réalisation, une SDS-PAGE ou une électrophorèse sur gel peut être utilisée pour estimer les glycanes et les bioconjugués. La longueur du polymère pour les glycanes antigènes O est définie par le nombre d'unités répétitives qui sont assemblées de façon linéaire. Ceci signifie que le schéma de type échelle typique est une conséquence des nombres différents d'unités répétitives qui composent le glycane Ainsi, deux bandes proches l'une de l'autre dans la SDSPAGE ou d'autres techniques qui séparent par la taille diffèrent seulement d'une seule unité répétitive. Ces différences discrètes sont exploitées lors de l'analyse des glycoprotéines pour la taille des glycanes : la protéine de support non glycosylée et le bioconjugué avec des longueurs de chaîne polymère différentes se séparent selon leurs mobilités électrophorétiques. Le nombre des premières unités répétitives détectables (ni) et le nombre moyen d'unités répétitives (naverage) présentes sur un bioconjugué sont mesurés. Ces paramètres peuvent être utilisés pour démontrer
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BE2017/5427 l'homogénéité d'un lot à l'autre ou la stabilité des polysaccharides.
Dans un autre mode de réalisation, une chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) d'exclusion couplée à une spectrométrie de masse pourront être appliquées pour mesurer la taille des bioconjugués complets.
Dans un autre mode de réalisation, le dosage à base d'anthrone-acide sulfurique peut être utilisé pour mesurer les rendements en polysaccharides. Voir Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals : journal of the International Association of Biological Standardization 2008, 36(2): 134-141. Dans un autre mode de réalisation, un dosage à base de méthyl-pentose peut être utilisé pour mesurer les rendements en polysaccharides. Voir, par exemple, Dische et al. J Biol Chem. Septembre 1948 ; 175(2) : 595603.
Variation de l'usage des sites de glycosylation
Pour montrer que l'usage des sites dans une protéine spécifique varie dans un système de plasmides multiples par opposition à un système inséré, l'usage des sites de glycosylation doit être quantifié. Des procédés pour effectuer ceci sont énumérés ci-dessous.
LC-MS/MS des glycopeptides : les bioconjugués sont digérés avec une ou plusieurs protéases, et les peptides sont séparés par un procédé chromatographique approprié (08, CLHP avec interactions hydrophiles HILIC, colonnes
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GlycoSepN, CLHP d'exclusion, CLHP avec échange d'anions), et les différents peptides sont identifiés en utilisant la MS/MS. Ce procédé peut être utilisé avec ou sans raccourcissement préalable de la chaîne de sucre par des procédés chimiques (dégradation de Smith) ou enzymatiques. La quantification des pics des glycopeptides en utilisant la détection UV à 215 à 280 nm permet une détermination relative de l'usage des sites de glycosylation.
CLHP d'exclusion : l'usage supérieur de sites de glycosylation est reflété par un temps d'élution plus précoce à partir d'une colonne de CLHP d'exclusion.
Homogénéité
L'homogénéité des bioconjugués (c'est-à-dire l'homogénéité des résidus de sucre fixés) peut être estimée en utilisant des procédés qui mesurent la longueur des glycanes et le rayon hydrodynamique.
Méthodes analytiques d'évaluation du bénéfice
Rendement. Le rendement est mesuré en quantité de glucides dérivée d'un litre de culture de production bactérienne développée dans un bioréacteur dans des conditions contrôlées et optimisées. Après la purification du bioconjugué, les rendements en glucides peuvent être mesurés directement par soit le dosage à base d'anthrone soit la technique ELISA en utilisant des antisérums spécifiques des glucides. Des mesures indirectes sont possibles en utilisant la quantité de protéine (mesurée par les tests BCA, de Lowry ou de Bradford) et la longueur et la structure des glycanes pour calculer une quantité théorique de glucides par gramme de protéine. En outre, le rendement peut être
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BE2017/5427 également mesuré en séchant la préparation de la glycoprotéine à partir d'un tampon volatile et en utilisant une balance pour mesurer le poids.
Homogénéité. L'homogénéité signifie la variabilité de la longueur des glycanes et éventuellement du nombre de sites de glycosylation. Les procédés énumérés cidessus peuvent être utilisés pour cet objectif. La CLHP d'exclusion permet la mesure du rayon hydrodynamique. Des nombres supérieurs de sites de glycosylation dans le support mènent à une variation supérieure du rayon hydrodynamique comparativement à un support avec moins de sites de glycosylation. Toutefois, lorsque des chaînes de glycanes simples sont analysées, elles peuvent être plus homogènes grâce à la longueur plus contrôlée. La longueur des glycanes est mesurée par hydrazinolyse, SDS-PAGE, et CGE. En outre, l'homogénéité peut également signifier que certains profils d'usage des sites de glycosylation varient dans une plage plus large/plus étroite. Ces facteurs peuvent être mesurés par la LC-MS/MS des glycopeptides.
Stabilité et reproductibilité de la souche. La stabilité de la souche durant la fermentation bactérienne en l'absence de pression de sélection est mesurée par des procédés directs et indirects qui confirment la présence ou l'absence de l'ADN recombinant dans les cellules de la culture de production. L'influence du volume de la culture peut être simulée par des temps de culture allongés signifiant des temps de production accrus. Plus il y a de générations en fermentation, plus il est vraisemblable qu'un élément recombinant soit perdu. La perte d'un élément
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BE2017/5427 recombinant est considérée comme une instabilité. Les procédés indirects reposent sur l'association de cassettes de sélection avec de l'ADN recombinant, par exemple, les cassettes de résistance aux antibiotiques dans un plasmide. Les cellules de culture de production sont plaquées sur des milieux sélectifs, par exemple, des plaques LB complémentées avec des antibiotiques ou d'autres agents chimiques associés à un système de sélection, et les colonies résistantes sont considérées comme positives pour l'ADN recombinant associé à l'agent chimique de sélection respectif. Dans le cas d'un système à plasmides multiples, les colonies résistantes à des antibiotiques multiples sont dénombrées et la proportion de cellules contenant les trois résistances est considérée comme la population stable. En variante, une PCR quantitative peut être utilisée pour mesurer la quantité d'ADN recombinant des trois éléments recombinants en présence, en l'absence de sélection, et à différents points de temps de la fermentation. Ainsi, la quantité relative et absolue de l'ADN recombinant est mesurée et comparée. La reproductibilité du procédé de production est mesurée par l'analyse complète de lots de qualification par les procédés indiqués dans cette demande.
Compositions immunogènes
Les protéines pneumolysines modifiées et les conjugués (par exemple, les bioconjugués), de l'invention sont particulièrement adaptés pour une incorporation dans des compositions immunogènes et des vaccins. La présente invention fournit une composition immunogène comprenant la protéine pneumolysine modifiée
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BE2017/5427 de l'invention, ou le conjugué de l'invention, ou le bioconjugué de l'invention.
Il est également fourni un procédé de fabrication de la composition immunogène de l'invention comprenant l'étape de mélange de la protéine pneumolysine modifiée ou du conjugué (par exemple, du bioconjugué) de 1'invention avec un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable. Les compositions immunogènes comprennent une quantité immunologiquement efficace de la protéine pneumolysine modifiée ou du conjugué (par exemple, du bioconjugué) de l'invention ainsi que de tout autre composant. Par « quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, soit sous la forme d'une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon l'état de santé et la condition physique de l'individu à traiter, l'âge, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée par des essais de routine.
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent également contenir des diluants tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou d'émulsification, des substances tampons du pH, des polyols et analogues peuvent être présentes.
Les compositions immunogènes comprenant la protéine pneumolysine modifiée de l'invention ou des conjugués (ou des bioconjugués) peuvent comprendre tout composant
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BE2017/5427 supplémentaire approprié pour une utilisation dans une administration pharmaceutique. Dans des modes de réalisation spécifiques, les compositions immunogènes de l'invention sont des formulations monovalentes. Dans d'autres modes de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention sont des formulations multivalentes, par exemple, des formulations bivalentes, trivalentes, et tétravalentes. Par exemple, une formulation multivalente comprend plus d'un antigène, par exemple, plus d'un conjugué.
La composition immunogène de l'invention comprend éventuellement en outre des antigènes supplémentaires. Les exemples de tels antigènes supplémentaires sont des antigènes de S. pneumoniae choisis parmi les catégories suivantes, comme des protéines comportant un motif de séquence signal de type II de LXXC (où X représente un acide aminé quelconque, par exemple, la famille de la triade polyhistidine (PhtX)), des protéines de liaison de la choline (par exemple, CbpX (famille des protéines de liaison de la choline), PcpA (protéine A pneumococcique de liaison de la choline)), des protéines comportant un motif de séquence signal de type I (par exemple, SplOl), et des protéines comportant un motif LPXTG (où X représente un acide aminé quelconque, par exemple, Spl28, Spl30). Ainsi, la composition immunogène de l'invention peut comprendre une ou plusieurs protéines de S. pneumoniae choisies parmi la famille de la triade polyhistidine (PhtX), la famille des protéines de liaison de la choline (CbpX), les formes tronquées de CbpX, la famille des autolysines pneumococciques (LytX) (par exemple, LytA (N-acétylmuramoyl-l-alanine amidase),
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LytB, LytC), les formes tronquées de LytX, les protéines chimériques forme tronquée de CbpX-forme tronquée de LytX, PspA (protéine A de la surface pneumococcique), PsaA (protéine A d'adhérence à la surface pneumococcique), Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 et Spl33. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de 1 'invention comprend 2 protéines ou plus choisies dans le groupe constitué de la famille de la triade polyhistidine (PhtX), la famille des protéines de liaison de la choline (CbpX), les formes tronquées de CbpX, la famille des LytX, les formes tronquées de LytX, les protéines chimériques forme tronquée de CbpX-forme tronquée de LytX (ou fusions) , PspA (protéine A de la surface pneumococcique), PsaA (protéine A d'adhérence à la surface pneumococcique), et Spl28. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend 2 protéines ou plus choisies dans le groupe constitué de la famille de la triade (PhtX) par exemple, PhtD, la famille des protéines de liaison de la choline (CbpX), les formes tronquées de CbpX, la famille des LytX, les formes tronquées de LytX, les protéines chimériques forme tronquée de CbpX-forme tronquée de LytX (ou fusions), et Spl28.
Dans un mode de réalisation, l'antigène de
S. pneumoniae choisi parmi un ou plusieurs membres de la famille de la triade polyhistidine est la PhtD. Le terme « PhtD » tel qu'utilisé ici comprend la protéine totale avec la séquence signal fixée ou la protéine mature totale sans le peptide signal (par exemple, 20 acides aminés à l'extrémité N-terminale), et ses fragments immunogènes, variants et/ou protéines de fusion, par
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BE2017/5427 exemple, SEQ ID NO : 4 du document WO 00/37105. Dans un aspect, la PhtD est la protéine totale avec la séquence signal fixée, par exemple, la SEQ ID NO : 4 du document WO 00/37105. Dans un autre aspect, la PhtD est une séquence comprenant la protéine totale sans le peptide signal (par exemple, 20 acides aminés à l'extrémité Nterminale) , par exemple, les acides aminés 21 à 838 de SEQ ID NO : 4 du document WO 00/37105. De façon appropriée, la séquence de la PhtD comprend une méthionine N-terminale. La présente invention comprend également des polypeptides PhtD qui sont des fragments immunogènes de la PhtD, des variants de la PhtD et/ou des protéines de fusion de la PhtD. Par exemple, comme il est décrit dans les documents WO 00/37105, WO 00/39299, US 6699703 et WO 09/12588.
Vaccins
La présente invention fournit également un vaccin comprenant une composition immunogène de l'invention et un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients et les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent être choisis par l'homme du métier. Par exemple, l'excipient ou le support pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un tampon, tel que Tris (triméthamine), phosphate (par exemple, phosphate de sodium), acétate, borate (par exemple, borate de sodium), citrate, glycine, histidine et succinate (par exemple, succinate de sodium), de façon appropriée le chlorure de sodium, 1'histidine, le phosphate de sodium ou le succinate de sodium. L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un sel, par exemple, le chlorure de sodium,
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BE2017/5427 le chlorure de potassium ou le chlorure de magnésium. Eventuellement, l'excipient pharmaceutiquement acceptable contient au moins un composant qui stabilise la solubilité et/ou la stabilité. Les exemples d'agents solubilisants/ stabilisants comprennent des détergents, par exemple, la laurel-sarcosine et/ou le polysorbate (par exemple, TWEEN™ 80) . Les exemples d'agents stabilisants comprennent également les poloxamer (par exemple, poloxamer 124, poloxamer 188, poloxamer 237, poloxamer 338 et poloxamer 407). L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un tensioactif non ionique, par exemple, des esters d'acides gras polyoxyéthylène sorbitane, Polysorbate-80 (TWEEN™ 80), Polysorbate-60 (TWEEN™ 60), Polysorbate-40 (TWEEN™ 40) et Polysorbate-20 (TWEEN™ 20), ou des éthers alkyliques polyoxyéthylénés (de façon appropriée, le polysorbate-80). D'autres agents solubilisants/stabilisants comprennent l'arginine, et des polyols formant du verre (tels que le saccharose, le tréhalose et analogues). L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut être un conservateur, par exemple, le phénol, le 2-phénoxy-éthanol, ou le thiomersal. D'autres excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent des sucres (par exemple, le lactose, le saccharose), et des protéines (par exemple, la gélatine et l'albumine) . Les supports pharmaceutiquement acceptables comprennent l'eau, des solutions salines, des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol. De nombreux excipients et supports pharmaceutiquement acceptables sont décrits, par exemple, dans Remington's Pharmaceutical Sciences,
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BE2017/5427 par E. W. Martin, Mack Publishing Co. Easton, PA, 5ème Edition (975).
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin de 1'invention comprend en outre un ou plusieurs tampons, par exemple, le tampon phosphate et/ou le tampon phosphate et glutamate de saccharose. Dans d'autres modes de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin de 1'invention ne comprend pas de tampon.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin de 1'invention comprend en outre un ou plusieurs sels, par exemple, le chlorure de sodium, le chlorure de calcium, le phosphate de sodium, le glutamate monosodique, et des sels d'aluminium (par exemple, 1'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, l'alun (sulfate de potassium et d'aluminium), ou un mélange de ces sels d'aluminium) . Dans d'autres modes de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin de 1'invention ne comprend pas de sel.
La composition immunogène ou le vaccin de l'invention peut comprendre en outre un conservateur, par exemple, un dérivé du mercure, le thimérosal. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention comprend 0,001 % à 0,01 % de thimérosal. Dans d'autres modes de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention ne comprend pas de conservateur.
Le vaccin ou la composition immunogène de l'invention peut également comprendre un antimicrobien, généralement lors d'un conditionnement sous format de
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BE2017/5427 doses multiples. Par exemple, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention peut comprendre du 2phénoxyéthanol.
Le vaccin ou la composition immunogène de l'invention peut également comprendre un détergent, par exemple, un polysorbate, tel que TWEEN™ 80. Les détergents sont généralement présents à des taux bas, par exemple, < 0,01 %, mais des taux supérieurs ont été suggérés pour la stabilisation des formulations d'antigènes, par exemple, jusqu'à 10 %.
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent être incluses dans un récipient, un conditionnement, ou un distributeur conjointement avec des instructions pour 1'administration.
Les compositions immunogènes ou les vaccins de l'invention peuvent être stockés avant utilisation, par exemple, les compositions peuvent être stockées congelées (par exemple, à environ -20 °C ou à environ -70 °C) ; stockées dans des conditions réfrigérées (par exemple, à environ 4 °C) ; ou stockées à température ambiante.
Les compositions immunogènes ou les vaccins de 1'invention peuvent être stockés en solution ou lyophilisés. Dans un mode de réalisation, la solution est lyophilisée en présence d'un sucre tel que le saccharose, le tréhalose ou le lactose. Dans un autre mode de réalisation, les vaccins de l'invention sont lyophilisés et reconstitués extemporanément avant utilisation.
La préparation des vaccins est décrite de façon générale dans Vaccine Design (The subunit and adjuvant
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BE2017/5427 approach (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum
Press New York) . L'encapsulation au sein de liposomes est décrite par Fullerton, brevet US 4 235 877.
Adj uvants
Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes ou les vaccins de l'invention comprennent, ou sont administrés en combinaison avec, un adjuvant. L'adjuvant pour une administration en combinaison avec une composition immunogène ou un vaccin de l'invention peut être administré avant, simultanément à, ou après l'administration de ladite composition immunogène ou dudit vaccin. Dans certains modes de réalisation, le terme « adjuvant » se rapporte à un composé qui, lorsqu'il est administré conjointement ou comme faisant partie d'une composition immunogène ou d'un vaccin de l'invention, augmente, amplifie et/ou stimule la réponse immunitaire contre un bioconjugué, mais lorsque le composé est administré seul, il ne produit pas de réponse immunitaire contre la protéine pneumolysine modifiée/le conjugué/le bioconjugué. Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant produit une réponse immunitaire contre la protéine pneumolysine modifiée, le conjugué ou le bioconjugué et ne produit pas d'allergie ou une autre réaction indésirable.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention est adjuvé. Les adjuvants peuvent amplifier une réponse immunitaire par plusieurs mécanismes y compris, par exemple, recrutement des lymphocytes, la stimulation lymphocytes B et/ou T, et la stimulation des macrophages. Les exemples spécifiques d'adjuvants comprennent, mais le des
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BE2017/5427 (voir le brevet du Royaume-Uni MF59 (Novartis), l'AS03 (GlaxoSmithKline), le n'y sont pas limités, les sels d'aluminium (alun) (tels que 1'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, et le sulfate d'aluminium, le monophosphoryl-lipide A (MPL) 3-dés-O-acylé
GB 2220211), le (GlaxoSmithKline), l'AS04 polysorbate 80 (TWEEN™ 80 ; ICL Americas, Inc.), les composés d'imidazopyridine (voir la demande internationale No. PCT/US2007/064857, publiée sous la publication internationale No. WO 2007/109812), les composés d'imidazoquinoxaline (voir la demande internationale No. PCT/US2007/064858, publiée sous la publication internationale No. WO 2007/109813) et les saponines, telles que le QS21 (voir Kensil et al. dans Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995) ; brevet US
No. 5 057 540) . Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant est l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet). D'autres adjuvants sont des émulsions huile dans l'eau (telles que le squalène ou l'huile d'arachide), éventuellement en combinaison avec des immunostimulants, tels que le monophosphoryl-lipide A (voir Stoute et al. N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Un autre adjuvant est le CpG (Bioworld Today, 15 novembre 1998).
Dans un aspect de l'invention, l'adjuvant est un sel d'aluminium tel que le gel d'hydroxyde d'aluminium (alun) ou le phosphate d'aluminium.
Dans un autre aspect de l'invention, l'adjuvant est choisi pour être un inducteur préférentiel d'un type de réponse TH1 ou TH2. Des taux élevés de cytokines de type Thl tendent à favoriser l'induction des réponses
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BE2017/5427 immunitaires à médiation cellulaire contre un antigène donné, alors que des taux élevés de cytokines de type Th2 tendent à favoriser l'induction des réponses immunitaires humorales contre l'antigène. Il est important de se souvenir que la distinction de la réponse immunitaire de type Thl et Th2 n'est pas absolue. En réalité, un individu supportera une réponse immunitaire qui est décrite comme étant de façon prédominante Thl ou de façon prédominante Th2. Toutefois, il est souvent pratique de considérer les familles de cytokine en termes de celles décrites dans les clones de lymphocytes T CD4+ murins par Mosmann et Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman,
R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145-173). Traditionnellement, les réponses de type Thl sont associées à la production des cytokines INF-γ et IL-2 par les lymphocytes T. D'autres cytokines souvent associées directement à l'induction des réponses immunitaires de type Thl ne sont pas produites par les lymphocytes T, comme l'IL-12. Par opposition, les réponses de type Th2 sont associées à la sécrétion d'IL4, d'IL-5, d'IL-6, d'IL-10. Les systèmes d'adjuvants appropriés qui favorisent une réponse Thl de façon prédominante comprennent : le monophosphoryl-lipide A ou l'un de ses dérivés, particulièrement le monophosphoryllipide A 3-dés-O-acylé (3D-MPL) (pour sa préparation voir le document GB 2220211 A) ; et une combinaison de monophosphoryl-lipide A, par exemple, de monophosphoryllipide A 3-dés-O-acylé, conjointement avec soit un sel d'aluminium (par exemple, le phosphate d'aluminium ou
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BE2017/5427 l’hydroxyde d'aluminium) soit une émulsion huile dans l'eau. Dans de telles combinaisons, l'antigène et le 3DMPL sont contenus dans les mêmes structures particulaires, permettant une administration plus efficace des signaux antigéniques et immunostimulants. Des études ont montré que le 3D-MPL est capable d'amplifier encore l'immunogénicité de l'antigène adsorbé sur de l'alun [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14 ; EP 689454-B1]. Les oligonucléotides contenant des CpG non méthylés (WO 96/02555) sont également des inducteurs préférentiels d'une réponse TH1 et sont appropriés pour une utilisation dans la présente invention.
Le vaccin ou la composition immunogène de l'invention peut contenir une émulsion huile dans l'eau, car de telles émulsions ont été suggérées comme étant utiles en tant que compositions adjuvantes (EP 399843 ; WO 95/17210). Des émulsions huile dans l'eau telles que celles décrites dans le document WO 95/17210 (qui divulgue des émulsions huile dans l'eau comprenant de 2 à 10 % de squalène, de 2 à 10 % d'alpha-tocophérol et de 0,3 à 3 % de Tween 80 et leur utilisation seules ou en combinaison avec du QS21 et/ou du 3D-MPL), le document WO 99/12565 (qui divulgue des compositions d'émulsions huile dans l'eau comprenant une huile métabolisable, une saponine et un stérol et du MPL) ou le document WO 99/11241 peuvent être utilisées. D'autres émulsions huile dans l'eau telles que celles divulguées dans les documents WO 09/127676 et WO 09/127677 sont également appropriées. Une formulation adjuvante particulièrement puissante impliquant du QS21, du 3D-MPL et du tocophérol
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BE2017/5427 dans une émulsion huile dans l'eau est décrite dans le document WO 95/17210. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition immunogène ou le vaccin comprend en outre une saponine, par exemple, le QS21. La composition immunogène ou le vaccin peut également comprendre une émulsion huile dans l'eau et du tocophérol (WO 95/17210).
Procédé d'administration
Les compositions immunogènes ou les vaccins de l'invention peuvent être utilisés pour protéger ou traiter un mammifère sensible à une infection, au moyen de l'administration de ladite composition immunogène ou dudit vaccin par l'intermédiaire d'une voie systémique ou mucosale. Ces administrations peuvent comprendre une injection par les voies intramusculaire (IM), intrapéritonéale, intradermique (ID) ou sous-cutanée, ou par une administration mucosale aux systèmes oroalimentaire, respiratoire, génito-urinaire. Par exemple, une administration intranasale (IN) peut être utilisée pour le traitement de la pneumonie ou de l'otite moyenne (car le portage nasopharyngé des pneumocoques peut être traité plus efficacement, atténuant ainsi l'infection à son stade le plus précoce) . Bien que la composition immunogène ou le vaccin de l'invention puisse être administré sous la forme d'une dose unique, ses composants peuvent être également coadministrés ensemble en même temps ou à des temps différents (par exemple, les polysaccharides pneumococciques pourront être administrés séparément, en même temps, ou 1 à 2 semaines après l'administration de tout composant de protéine bactérienne du vaccin pour une coordination optimale des
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BE2017/5427 réponses immunitaires les unes par rapport aux autres). Pour une coadministration, l'adjuvant Thl facultatif peut être présent dans l'une quelconque ou la totalité des différentes administrations, toutefois, dans un aspect particulier de l'invention, il est présent en combinaison avec le composant de protéine pneumolysine modifiée de la composition immunogène ou du vaccin. En plus d'une seule voie d'administration, 2 voies d'administration différentes peuvent être utilisées. Par exemple, les polysaccharides peuvent être administrés par IM (ou ID) et les protéines bactériennes peuvent être administrées par IN (ou ID). En outre, les vaccins de l'invention peuvent être administrés par IM pour les doses de sensibilisation et par IN pour les doses de rappel.
Dans un aspect, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention est administré par la voie d'administration intramusculaire. L'administration intramusculaire peut être réalisée dans la cuisse ou le haut du bras. L'injection est généralement réalisée à l'aide d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut est utilisée en variante. Une dose intramusculaire type est de 0,5 ml.
Dans un autre aspect, la composition immunogène ou le vaccin de 1'invention est administré par l'administration intradermique. La peau humaine comprend une cuticule « cornée » externe, appelée la couche cornée, qui recouvre l'épiderme. Sous cet épiderme, il y a une couche appelée le derme, qui à son tour recouvre le tissu sous-cutané. La technique traditionnelle de
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BE2017/5427 l'injection intradermique, la « procédure de Mantoux », comprend les étapes de nettoyage de la peau, et ensuite d'étirement avec une main, et avec le biseau d'une aiguille de gauge étroite (gauge 26 à 31) faisant face vers le haut, l'aiguille est insérée selon un angle situé entre 10 et 15°. Une fois que le biseau de l'aiguille est inséré, le canon de l'aiguille est abaissé et en outre poussé vers l'avant tout en exerçant une légère pression pour l'élever au-dessus de la peau. Le liquide est ensuite injecté très lentement, formant de cette façon une petite vésicule ou bosse sur la surface de la peau, ceci suivi d'un retrait lent de l'aiguille.
Plus récemment, des dispositifs qui sont spécifiquement conçus pour administrer des agents liquides dans ou à travers la peau ont été décrits, par exemple, les dispositifs décrits dans les documents WO 99/34850 et EP 1092444, également des dispositifs d'injection à jet décrits, par exemple, dans les
documents WO 01/13977 ; US 5 480 381, US 5 599 302,
US 5 334 144, US 5 993 412, US 5 649 912, US 5 569 189,
US 5 704 911, US 5 383 851, US 5 893 397, US 5 466 220,
US 5 339 163, US 5 312 335, US 5 503 627, US 5 064 413,
US 5 520 639, US 4 596 556, US 4 790 824, US 4 941 880,
US 4 940 460, WO 97/37705 et WO 97/13537. D'autres : modes
d'administration intradermique des préparations vaccinales peuvent comprendre des seringues et des aiguilles traditionnelles, ou des dispositifs conçus pour l'administration balistique de vaccins solides (WO 99/27961), ou des patches transdermiques (WO 97/48440 ; WO 98/28037) ; ou sont appliquées sur la
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BE2017/5427 surface de la peau (administration transdermique ou transcutanée, WO 98/20734 ; WO 98/28037).
Dans un autre aspect, la composition immunogène ou le vaccin de 1'invention est administré par l'administration intranasale. Généralement, la composition immunogène ou le vaccin est administré localement à la zone nasopharyngée, par exemple, sans être inhalé dans les poumons. Il est souhaitable d'utiliser un dispositif d'administration intranasale qui administre la composition immunogène ou la formulation vaccinale à la zone nasopharyngée, sans ou sensiblement sans pénétrer dans les poumons. Des dispositifs appropriés pour l'administration intranasale des vaccins selon l'invention sont des dispositifs de pulvérisation. Les dispositifs de pulvérisation nasale disponibles dans le commerce comprennent ACCUSPRAY™ (Becton Dickinson).
Dans un mode de réalisation, les dispositifs de pulvérisation pour une utilisation intranasale sont des dispositifs pour lesquels les performances du dispositif ne dépendent pas de la pression appliquée par l'utilisateur. Ces dispositifs sont connus comme des dispositifs à seuil de pression. Ces dispositifs rendent plus facile d'obtenir une pulvérisation avec une taille de gouttelette régulière. Les dispositifs à seuil de pression appropriés pour une utilisation avec la présente invention sont connus dans l'art et sont décrits, par exemple, dans les documents WO 91/13281 et EP 311863 et EP 516636, incorporés ici en référence. De tels dispositifs sont disponibles dans le commerce auprès de
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Pfeiffer GmbH et ils sont également décrits dans Bommer,
R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999.
Dans un autre mode de réalisation, les dispositifs intranasals produisent des gouttelettes (mesurées en utilisant l'eau comme liquide) dans la plage de 1 à 200 pm, par exemple, 10 à 120 pm. Au-dessous de 10 pm, il y a un risque d'inhalation, par conséquent, il est souhaitable de ne pas avoir plus de 5 % des gouttelettes au-dessous de 10 pm. Les gouttelettes supérieures à 120 pm ne se propagent pas aussi bien que des gouttelettes plus petites, si bien qu'il est souhaitable de ne pas avoir plus d'environ 5 % de gouttelettes dépassant 120 pm.
A la suite d'une vaccination initiale, les sujets peuvent recevoir une ou plusieurs immunisations de rappel espacées de façon adéquate.
La composition immunogène ou le vaccin de la présente invention peut être utilisé pour protéger ou traiter un mammifère, par exemple, un être humain, sensible à une infection, au moyen de l'administration de ladite composition immunogène ou dudit vaccin par l'intermédiaire d'une voie systémique ou mucosale. Ces administrations peuvent comprendre une injection par les voies intramusculaire (IM), intrapéritonéale (IP), intradermique (ID) ou sous-cutanée (SC) ; ou par une administration mucosale aux systèmes oro-alimentaire, respiratoire, génito-urinaire. Bien que le vaccin de l'invention puisse être administré sous la forme d'une dose unique, ses composants peuvent être également coadministrés ensemble en même temps ou à des temps différents (par exemple, les conjugués de saccharides
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pneumococciques pourront être administrés séparément, en même temps ou 1 à 2 semaines après l'administration de la protéine pneumolysine modifiée, du conjugué ou du bioconjugué quelconque de l'invention pour une coordination optimale des réponses immunitaires les unes par rapport aux autres). Pour une coadministration, l'adjuvant facultatif peut être présent dans l'une la totalité des différentes
En plus d'une voie unique d'administration, 2 voies d'administration différentes peuvent être utilisées. Par exemple, les conjugués polysaccharidiques peuvent être administrés par IM (ou ID) et la protéine pneumolysine modifiée, le conjugué ou le bioconjugué de l'invention peut être administré par IN (ou ID) . En outre, les compositions immunogènes ou les vaccins de l'invention peuvent être administrés par IM pour les doses de sensibilisation et par IN pour les doses de rappel.
Dosage
La quantité d'antigène conjugué dans chaque dose de composition immunogène ou de vaccin est choisie comme une quantité qui induit une réponse immunoprotectrice sans effets secondaires indésirables significatifs dans des vaccins types. Une telle quantité variera selon l'immunogène employé et comment il est présenté. La teneur en protéine pneumolysine modifiée se situera généralement dans la plage de 1 à 100 pg, de façon appropriée 5 à 50 pg. La teneur en saccharide se situera généralement dans la plage de 0,1 à 10 pg, de façon appropriée 1 à 5 pg.
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Une dose qui est dans un volume approprié pour un usage humain est généralement entre 0,25 et 1,5 ml, bien que, pour une administration dans la peau, un volume inférieur entre 0,05 ml et 0,2 ml puisse être utilisé. Dans un mode de réalisation, une dose humaine est de 0,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, une dose humaine est supérieure à 0,5 ml, par exemple, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Dans un autre mode de réalisation, une dose humaine se situe entre 1 ml et 1,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, en particulier lorsque la composition immunogène est destinée à la population pédiatrique, une dose humaine peut être inférieure à 0,5 ml comme entre 0,25 et 0,5 ml.
Utilisations prophylactiques et thérapeutiques
La présente invention fournit également des procédés de traitement et/ou de prévention d'infections bactériennes d'un sujet comprenant l'administration au sujet d'une protéine pneumolysine modifiée, d'un conjugué ou d'un bioconjugué de l'invention. La protéine pneumolysine modifiée, le conjugué ou le bioconjugué peut être sous la forme d'une composition immunogène ou d'un vaccin. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention est utilisé dans la prévention d'une infection d'un sujet (par exemple, des sujets humains) par une bactérie. Les infections par des bactéries qui peuvent être traitées et/ou prévenues en utilisant la protéine pneumolysine modifiée, le conjugué ou le bioconjugué de l'invention comprennent celles provoquées par l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia,
124
BE2017/5427 l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition immunogène ou le vaccin de l'invention est utilisé pour traiter ou prévenir une infection par l'espèce Streptococcus (par exemple, Streptococcus pneumoniae).
Il est également fourni des procédés d'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet contre une bactérie, comprenant l'administration au sujet d'une protéine pneumolysine modifiée, ou d'un conjugué ou bioconjugué de l'invention (ou d'une composition immunogène ou d'un vaccin). Dans un mode de réalisation, ledit sujet souffre d'une infection bactérienne au moment de l'administration. Dans un autre mode de réalisation, ledit sujet ne souffre pas d'une infection bactérienne au moment de l'administration. La protéine pneumolysine modifiée, le conjugué ou le bioconjugué de l'invention peut être utilisé pour induire une réponse immunitaire contre l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce
Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce
Lactobacillus,
Corynebacterium,
Streptococcus,
1'espèce 1'espèce
1'espèce
Pseudomonas, Streptomyces, Enterococcus,
1'espèce 1'espèce 1'espèce
125
BE2017/5427
Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine pneumolysine modifiée, ou le conjugué ou bioconjugué de l'invention est utilisé pour induire une réponse immunitaire contre l'espèce Streptococcus (par exemple, Streptococcus pneumoniae).
Il est fourni ici des procédés d'induction de la production d'anticorps opsonophagocytaires chez un sujet contre une bactérie, comprenant l'administration au sujet d'une protéine pneumolysine modifiée, ou d'un conjugué ou bioconjugué de l'invention (ou d'une composition immunogène ou d'un vaccin). Dans un mode de réalisation, ledit sujet souffre d'une infection bactérienne au moment de l'administration. Dans un autre mode de réalisation, ledit sujet ne souffre pas d'une infection bactérienne au moment de l'administration. La protéine pneumolysine modifiée, ou le conjugué ou bioconjugué de l'invention (ou la composition immunogène ou le vaccin) fourni ici peut être utilisé pour induire la production d'anticorps opsonophagocytaires contre l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia,
1'espèce
Pseudomonas, Streptomyces, l'espèce Aeromonas,
Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptococcus,
Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce ' espèce 1 ' espèce
Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique,
126
BE2017/5427 une protéine pneumolysine modifiée, ou un conjugué ou bioconjugué de l'invention (ou une composition immunogène ou un vaccin) est utilisé pour induire la production d'anticorps opsonophagocytaires contre l'espèce Streptococcus (par exemple, Streptococcus pneumoniae).
Dans un mode de réalisation, la présente invention est un procédé amélioré pour déclencher une réponse immunitaire chez des nourrissons (définis comme âgés de 0 à 2 ans dans le contexte de la présente invention) par l'administration d'une guantité thérapeutiguement efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin de l'invention (un vaccin pédiatrigue) . Dans un mode de réalisation, le vaccin est un vaccin pédiatrigue.
Dans un mode de réalisation, la présente invention est un procédé amélioré pour déclencher une réponse immunitaire dans la population des personnes âgées (dans le contexte de la présente invention, un patient est considéré comme âgé s'il est âgé de 50 ans ou plus, généralement de plus de 55 ans et plus généralement de plus de 60 ans) par l'administration d'une guantité thérapeutiguement efficace de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention. Dans un mode de réalisation, le vaccin est un vaccin pour les personnes âgées.
La présente invention fournit un procédé pour le traitement ou la prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration au dit sujet d'une guantité thérapeutiguement efficace de la protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou du conjugué de l'invention,
127
BE2017/5427 ou du bioconjugué de l'invention, ou de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention.
La présente invention fournit un procédé d'immunisation d'un hôte humain contre une infection par Streptococcus pneumoniae comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou du conjugué de l'invention, ou du bioconjugué de l'invention, ou de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention.
La présente invention fournit un procédé d'induction d'une réponse rmmunrtarre contre
Streptococcus pneumoniae chez un sujet, le procédé comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace de la protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou du conjugué de l'invention, ou du bioconjugué de l'invention, ou de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention.
La présente invention fournit une protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou le conjugué de l'invention, ou le bioconjugué de l'invention, ou la composition immunogène ou le vaccin de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae.
La présente invention fournit l'utilisation de la protéine pneumolysine modifiée de l'invention, ou du conjugué de l'invention, ou du bioconjugué de l'invention dans la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae.
128
BE2017/5427
La maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae peut être choisie parmi la pneumonie, la maladie pneumococcique invasive (MPI), les exacerbations de la bronchopneumopathie chronique obstructive (eBPCO), l'otite moyenne, la méningite, la bactériémie, la pneumonie et/ou la conjonctivite. Lorsque l'hôte humain est un nourrisson (défini comme âgé de 0 à 2 ans dans le contexte de la présente invention), la maladie peut être choisie parmi l'otite moyenne, la méningite, la bactériémie, la pneumonie et/ou la conjonctivite. Dans un aspect, lorsque l'hôte humain est un nourrisson (défini comme âgé de 0 à 2 ans dans le contexte de la présente invention), la maladie est choisie parmi l'otite moyenne et/ou la pneumonie. Lorsque l'hôte humain est une personne âgée (c'est-àdire âgé de 50 ans ou plus, généralement de plus de 55 ans et plus généralement de plus de 60 ans) , la maladie peut être choisie parmi la pneumonie, la maladie pneumococcique invasive (MPI), et/ou les exacerbations de la bronchopneumopathie chronique obstructive (eBPCO). Dans un aspect, lorsque l'hôte humain est une personne âgée, la maladie est la maladie pneumococcique invasive (MPI) . Dans un autre aspect, lorsque l'hôte humain est une personne âgée, la maladie consiste en des exacerbations de la bronchopneumopathie chronique obstructive (eBPCO).
Toutes les références ou demandes de brevet citées dans cette demande de brevet sont incorporées ici en référence.
Pour que cette invention soit mieux comprise, les exemples suivants sont présentés. Ces exemples sont
129
BE2017/5427 destinés à des objectifs d'illustration uniquement, et ne doivent pas être interprétés comme limitant l'étendue de l'invention d'une façon quelconque.
Les aspects de l'invention sont résumés dans les paragraphes numérotés subséquents :
1. Une protéine pneumolysine modifiée ayant une
séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou une
séquence d'acides aminés au moins identique à 80 o O r 85 %,
90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à
SEQ ID NO : 1 (par exemple, SEQ ID NO : 88), modifiée en ce que la séquence d'acides aminés comprend une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-NZ-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Y représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline.
2. La protéine pneumolysine modifiée du paragraphe 1, dans laquelle un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1 à 7 acides aminés, par exemple, un acide aminé) de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple, SEQ ID NO : 88) ont été substitués par une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30) .
3. La protéine pneumolysine modifiée du paragraphe 1 ou du paragraphe 2, dans laquelle une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) est localisée au niveau d'une position au sein de la
130
BE2017/5427 sequence (SEQ ID NO boucle longue N-terminale de surface ou de la boucle courte C-terminale de SEQ ID NO : 1 ou d'une position équivalente au sein d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 (par exemple,
SEQ ID NO : 88).
4. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 3, dans laquelle une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) a été ajoutée à, ou substituée à, un ou plusieurs acides aminés, entre les résidus d'acides aminés 22 et 57 (par exemple, entre les résidus d'acides aminés 24 et 29, ou les résidus d'acides aminés 24, 27 ou 29) de SEQ ID NO : 1 ou au niveau d'une position équivalente au lentiqi à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 à SEQ ID NO : 1 (par exemple, SEQ ID NO :
5. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 3, dans laquelle une consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) a été ajoutée à, ou substituée à, un ou plusieurs acides aminés, entre les résidus d'acides aminés 360 et 470 (par exemple, entre les résidus d'acides aminés 427 et 437, entre les acides aminés 431 et 434, ou les résidus d'acides aminés 431 ou 434) de SEQ ID NO : 1 ou au niveau d'une position équivalente au sein d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1
aminés au moins
, 96 %, 97 %, 98
SEQ ID NO : 88)
(par exemple, SEQ ID NO
131
BE2017/5427 équivalente SEQ ID NO :
8. La
6. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 5, comprenant une seule séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30).
7. La protéine pneumolysine modifiée du paragraphe 6, dans laquelle la séquence consensus K-D/EX-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) a été substituée au résidu d'acide aminé 434 dans SEQ ID NO : 1, ou substituée dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 au niveau d'une position d'acide aminé au résidu d'acide aminé 434 dans 1 (par exemple, SEQ ID NO : 88) . protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 7, dans laquelle X représente Q (glutamine) et Z représente A (alanine) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)).
9. Une protéine pneumolysine modifiée comprenant (ou constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 2, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Y représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline.
10. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 9, dans laquelle la séquence d'acides aminés est en outre modifiée par au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L46o en E
132
BE2017/5427 en référence à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 (ou une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identiques à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1, par exemple, SEQ ID NO : 88).
11. Une protéine pneumolysine modifiée comprenant (ou constituée de) une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, %, 99 % SEQ ID NO : comprenant (SEQ ID NO ou 100 % à une séquence choisie parmi les à 10, ladite séquence d'acides aminés une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) dans lesquelles X et Y représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, TUs en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E.
12. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 11, dans laquelle la séquence d'acides aminés comprend en outre un marqueur peptidique qui est utile pour la purification de la protéine pneumolysine, éventuellement ledit marqueur peptidique comprenant six résidus d'histidine et éventuellement ledit marqueur peptidique localisé à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés, éventuellement ladite protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 11 ou
SEQ ID NO : 12.
13. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 12, dans laquelle la séquence d'acides aminés comprend en outre une séquence
133
BE2017/5427 signal qui est capable de diriger la protéine pneumolysine vers le périplasme d'une cellule hôte (par exemple, une bactérie), éventuellement ladite séquence signal étant choisie parmi SEQ ID NO : 13 à 20, éventuellement ladite protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22.
14. La protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 13, dans laquelle la protéine pneumolysine modifiée est glycosylée.
15. Un conjugué (par exemple, un bioconjugué) comprenant une protéine pneumolysine modifiée des paragraphes 1 à 12 et 14, dans lequel la protéine pneumolysine modifiée est liée à un antigène.
16. Le conjugué selon le paragraphe 15, dans lequel la protéine pneumolysine modifiée liée de façon covalente à un antigène par l'intermédiaire d'une liaison chimique qui peut être obtenue en utilisant un procédé de conjugaison chimique, éventuellement choisi dans le groupe constitué de la chimie des carbodiimides, l'amination réductrice, la chimie de la cyanylation (par exemple, la chimie du CDAP), la chimie des maléimides, la chimie des hydrazides, la chimie des esters, et la chimie du N-hydroxysuccinimide soit directement soit par l'intermédiaire d'un lieur.
17. Le conjugué (par exemple, le bioconjugué) du paragraphe 15 ou du paragraphe 16, dans lequel l'antigène est lié à un acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée choisi parmi l'asparagine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine, la cystéine,
134
BE2017/5427 à 17, dans lequel éventuellement un (par exemple, de la tyrosine, l'histidine, l'arginine ou le tryptophane (par exemple, l'asparagine).
18. Le conjugué (par exemple, le bioconjugué) de l'un quelconque des paragraphes 15 l'antigène est un saccharide, saccharide capsulaire bactérien
Streptococcus pneumoniae) éventuellement choisi parmi un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae du sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L,
9N, 9V, 10A, 10B, 10C, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48.
19. Le conjugué (par exemple, le bioconjugué) du paragraphe 18, dans lequel l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien de Streptococcus pneumoniae choisi parmi un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae du sérotype 4, ou de Streptococcus pneumoniae du sérotype 33F.
20. Le conjugué (par exemple, le bioconjugué) du paragraphe 18, dans lequel l'antigène est un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride ayant une structure (B)n-Adans laquelle oligosaccharidique
A représente une contenant au moins unité répétitive 2, 3, 4, 5, 6, 7
135
BE2017/5427 ou 8 monosaccharides, avec un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice (indiquée par une flèche) ;
dans laquelle B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides ;
dans laquelle A et B représentent des unités répétitives oligosaccharidiques différentes ; et dans laquelle n vaut au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou au moins 20, éventuellement dans lequel le monosaccharide d'hexose à l'extrémité réductrice de la répétition est choisi dans le groupe constitué de glucose, galactose, rhamnose, arabinotol, fucose et mannose.
21. Un polynucléotide codant pour la protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14.
22. Un vecteur comprenant le polynucléotide du paragraphe 21.
23. Une cellule hôte comprenant :
i) un ou plusieurs acides nucléiques qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases ;
ii ) un acide nucléique qui code pour une
oligosaccharyltransférase ;
iii) un acide nucléique qui code pour une protéine
pneumolysine modifiée selon l'un quelconque des
paragraphes 1 à 14 ; et éventuellement iv) un acide nucléique qui code pour une polymérase (par exemple, wzy).
24. La cellule hôte du paragraphe 23, dans laquelle ladite cellule hôte comprend (a) une ou plusieurs
136
BE2017/5427 glycosyltransférases qui assemblent monosaccharidique d'hexose sur le d ' undécaprényle (Und-PP) et (b) une un dérivé pyrophosphate ou plusieurs d'aj outer un glycosyltransférases capables monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose assemblé sur 1'Und-PP.
25. La cellule hôte du paragraphe 24, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé monosaccharidique d'hexose sur 1'Und-PP est hétérologue à la cellule hôte et/ou hétérologue à un ou plusieurs des gènes qui codent pour une glycosyltransférases, éventuellement ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé monosaccharidique d'hexose sur 1'Und-PP est de l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, ou dans plusieurs laquelle
Yersinia, ' espèce Lactococcus, Pseudomonas, Streptomyces,
Helicobacter, ' espèce 1 ' espèce 1'espèce l'espèce Proteus, l'espèce
Lactobacillus, l'espèce
Corynebacterium, l'espèce
Streptococcus, l'espèce
Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce
Campylobacter, éventuellement mecA (par exemple, mecA d'E. coli).
26. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 24 à 25, dans laquelle ledit dérivé monosaccharidique d'hexose est un monosaccharide quelconque dans lequel la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido tel que la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactosamine (GalNAc), le 2,4137
BE2017/5427 diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la Nacétylfucosamine (FucNAc), ou la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
27. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 24 à 26, dans laquelle lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose assemblé sur l'Und-PP est la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028 ou la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167 ou sont la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028 et la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167.
28. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 27 dans laquelle la cellule hôte comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du CP4 comprenant wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP4 de S. pneumoniae et éventuellement weil, wciJ, wciK, wciL, wzy wciM, wzx, mnaA, fnlA, fnlB et fnlC du CP4 de S. pneumoniae.
29. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 27 dans laquelle la cellule hôte comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du CP12F comprenant wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP12F de S. pneumoniae.
30. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 27, dans laquelle la cellule hôte comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP33F comprenant wciC, wciD, wciE, et/ou wciF du CP33F de
S. pneumoniae et éventuellement wchA et/ou weiß du CP33F de S. pneumoniae.
138
BE2017/5427
31. La cellule hôte du paragraphe 30, dans laguelle ladite cellule hôte est capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, dans laguelle ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identigue au CP33F de S. pneumoniae, à l'exception du fait gue ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé monosaccharidigue d'hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive à la place d'un monosaccharide d'hexose normalement présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive du CP33F de S. pneumoniae.
32. La cellule hôte de l'un guelcongue des paragraphes 24 à 31, dans laguelle les glycosyltransférases comprennent une glycosyltransférase gui est capable d'ajouter le monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé monosaccharidigue d'hexose, éventuellement dans laguelle lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidigue d'hexose comprennent la galactosyltransférase (wclP), éventuellement d'E. coli 021, et éventuellement comprenant une glycosyltransférase gui est capable d'ajouter le monosaccharide gui est adjacent au monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide
139
BE2017/5427 donneur, éventuellement la glucosyltransférase (wclQ) , éventuellement d'E. coli 021.
33. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 32 dans laquelle 1'oligosaccharyltransférase est dérivée de Campylobacter jejuni, éventuellement dans laquelle ladite oligosaccharyltransférase est pglB de C. jejuni, éventuellement dans laquelle le gène pglB de C. jejuni est intégré dans le génome de la cellule hôte et éventuellement dans laquelle au moins un gène de la cellule hôte a été inactivé fonctionnellement ou délété, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été inactivé fonctionnellement ou délété, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par un acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par pglB de C. jejuni.
34. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 33, dans laquelle ladite cellule hôte comprend un acide nucléique qui code pour une polymérase de polysaccharide capsulaire (par exemple, wzy) ou une polymérase d'antigène O (par exemple, wzy), polymérase de polysaccharide Streptococcus pneumoniae, éventuellement du CPI, CP2, CP4, CP5, CP6 (A,B,C,D), CP7 (A,B,C), CP8, CP9(A,L,N,V), CPI 0(A,B,C,F),
CPI1(A,B,C,D,F), CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CP18 (A, B, C, F) , CPI 9 (A, B, C, F) , CP20, CP21, CP22(A,F), CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F),
CP26, CP27, CP28(A,F), CP29, CP31, CP32 (A, F) , éventuellement ladite capsulaire est de
140
BE2017/5427
CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44, CP46, CP47(A,F), ou
CP48 de S. pneumoniae.
35. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 34, dans laquelle ladite cellule hôte comprend un acide nucléique qui code pour une flippase (wzx), éventuellement dans laquelle ladite flippase est de Streptococcus pneumoniae, éventuellement du CPI, CP2, CP4, CP5, CP6 (A,B,C,D) , CP7(A,B,C), CP8, CP9 (A, L, N, V) ,
CP10 (A,B,C,F) , CPU (A,B,C,D,F) , CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A,B,C,F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CPI 8 (A, B, C, F) ,
CPI 9 (A, B, C, F) , CP20, CP21, CP22(A,F), CP23(A,B,F),
CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26, CP27, CP28(A,F), CP29,
CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44,
CP45, CP46, CP47(A,F), ou CP48 de S. pneumoniae.
36. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 35, dans laquelle ladite cellule hôte comprend en outre une enzyme capable de modifier un monosaccharide, éventuellement une épimérase, éventuellement dans laquelle ladite épimérase est de l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce l'espèce Corynebacterium,
Pseudomonas, Streptomyces,
1'espèce 1'espèce l'espèce Streptococcus,
Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce
Campylobacter, éventuellement dans laquelle ladite
141
BE2017/5427 épimérase est d'E. coli, éventuellement Z3206 d'O157 d'E. coli ou galE.
37. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 36, dans laquelle l'acide nucléique qui code pour la protéine pneumolysine modifiée est dans un plasmide dans la cellule hôte.
38. La cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 37, dans laquelle la cellule hôte est E. coli.
39. Un procédé de production d'un bioconjugué qui comprend une protéine pneumolysine modifiée liée à un saccharide, ledit procédé comprenant (i) la culture de la cellule hôte de l'un quelconque des paragraphes 23 à 38 dans des conditions appropriées pour la production de protéines et (ii) l'isolement du bioconjugué.
40. Un bioconjugué produit par le procédé du paragraphe 39, dans lequel ledit bioconjugué comprend un saccharide lié à une protéine pneumolysine modifiée.
41. Une composition immunogène comprenant la protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14, ou le conjugué de l'un quelconque des paragraphes 15 à 22, ou le bioconjugué du paragraphe 4 0.
42. Un procédé de fabrication de la composition immunogène du paragraphe 41 comprenant l'étape de mélange de la protéine pneumolysine modifiée ou du conjugué ou du bioconjugué avec un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
43. Un vaccin comprenant la composition immunogène du paragraphe 41 et un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
142
BE2017/5427 contre une comprenant
44. Un procédé de traitement ou de prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration au dit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace de la protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14, ou du conjugué de l'un quelconque des paragraphes 15 à 22, ou du bioconjugué du paragraphe 4 0.
45. Un procédé d'immunisation d'un hôte humain infection par Streptococcus pneumoniae l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14, ou du conjugué de l'un quelconque des paragraphes 15 à 22, ou du bioconjugué du paragraphe 40.
46. Un procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre Streptococcus pneumoniae chez un sujet, le procédé comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace de la protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14, ou du conjugué de l'un quelconque des paragraphes 15 à 22, ou du bioconjugué du paragraphe 40.
47. Une protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14, ou le conjugué de l'un quelconque des paragraphes 15 à 22, ou le bioconjugué du paragraphe 40 pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae.
48. Utilisation de la protéine pneumolysine modifiée de l'un quelconque des paragraphes 1 à 14, ou
143
BE2017/5427 du conjugué de l'un quelconque des paragraphes 15 à 22, ou du bioconjugué du paragraphe 40 dans la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae.
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Séquences des protéines et des acides nucléiques
SEQ ID NO : 1 - séquence de pneumolysine (avéc une sérine N-'terminale)
SAmwm wîiôRKKxi- wssesxskr fxkssh^po eftoew® srs-russcrs VTATK&3RLY PGÄLLVVDET £Ε£θη?ΡΰΕΕΑ VORAPKTÏST DSRGCÄSSUS SOGVSORSnS SVROAVUULL AKWKOPY SQV KKVMRMQYE: KÎIAKSMEOA KVKEUSnFEK 'TUÙSLDÎEFiÎ SVHSGSKûIû IVWKOXÏYT V3VDA VKNRS nVFQßTVSVE bLRÛRSÎSAE RPLVSISSVä YGRQVYLKLE ïîXKSDEVEA AESAEtRGVE VRPOT SiiEpT LDNTSVKÄVX I.ÖGOPSSGÄR VVTOKV&MVE IfLI<2E<3SRFT AUHSOtEU.3Y Y~SFSEDÎÏW ATS OU3TUSV EÏÎWAïPÎÎO DLLLDRgGA? VAUTYXTWNE L£YDÎ;ÇSESV ΕΐΕΕΑηϋΕΕΟ SCXÆAHFSSS ïPXKGMVRKL ij .SVKtRECÏSL AW E ïï WRTVYSKTEE REYRKRTXSI ΗΟΙΟΕΪΡύΡΈ DKVEKD
SEQ ID NO : 2 - pneumolysine modifiée avec giycosite
AHKAVHDFXL AMF t DRKKLL THQGESIERR FXKSOQLPD BFWXERKKR SLSTNT3DIS VTAWÜSRÎ.Y RGALLWDSl LL.gWFTLL-A VDRAFMTYSï DLPÙLASSP3 FÏ-QVEPP3K.S SVRGAVNX’LL AKWQBÎ GQV HHVPARMyYE KXTAKSMEÇL F.VEFGSJ>FEK. TGRSLMFFW 5 GVHEGEKQÏÿ XVMFKQjrXT VSVRA VKNPG DVFQOTVTVB GLKQRGI3AE RFLVYISSVA YGR$VYLKI>£ TTSKSBEVEÄ AGEAEÏRG7K VAPQT EWKQX WNTEVKAVX lÆGM'SSGAR WTGK7PM7E SLIQSGSRFT ADBPSI>FX&Y TTS.FERDNW ATF QKSÎDYV ETKVTAÏRNG ÙLLLDH^GÂY VA^YYÎ.TWHE LSYOHQGXEV LTFRAWDRKG ÇDLÏAHFTTS IFLRGKVRNL SVKÏRECÏGL AW KD^NÄTR ïï WVYBKTDL FLVRKRTISI ÏÏGTTLÏPQVE REVEND
SEQ ID NO : 3 - pneumolysine modifiée avec giycosite et uns autre modification
AHKAVHDFIL AMiYtKKKLL· THQGESXBWR FXKEGW^LFD EFWÏSRÉr'R SLSTNïéWS VÏÂCKDSRLÏ PGALLWBET GGBHHPTLLA VDRAFMTYSI DLPGÉASSD.S Fl.QVEDPSMS SVRGAYMOLÂ ÂXïïHÇW GQV NWRARMQYB KITAESHEQL KVKFSSDFBK ÏGWSLDICO SVHSôSKQLQ IWFKQIYï'T VSyi»A VRRPG D7£qDT7TVË DLXQRGXSAE RFLVYISSVA YGRQVYLKLE TTSKSDEVEA AFEMXKGVK VAPQT EÏÏEQI LÜKTEVR&VX LGGRFSSGAR WTGKYBMVE DXIQEGSRFT ADHPSLPÏSY TT3FLRDNW ÄTF QNSTDYŸ ETRVTÄYRRG GIXWBSO&Ï VAÇîïYXïWE LSYßHQGKEV LTPKAKDRNS ÇSLTAHFTTS XPLKGWRNL· svkïrêctgi, aw sfcgaaass w wrtvyektdx rlurkrtisi hgtteypqve dkvwd
SEQ ID NO : 4 - pneumolysine modifiée avec giycosite et une autre modification
5
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ÄNKAVNSFXL AMNYFKKKLL THÇGBSIENR FIKSGNQLPO ËFWIEBARR SLSTNTSbXS VÎATODSRLY FGALLWL'BT LLEWPTLtA VDRAPMTYST GEPGIA3SD3 FXQVEDPSRS 37RGAWDLL AKWHQDY GQV OTVRARMQYE KITAKSNSQt KVKFGSDFBK TGLJSADIDJ'N Λ lç 17VF-.?îuT VUVE& tV' LZrt„TYTÆ F/ ' ?P < ΆΕ Rth/xi-> ZA
YGRQVYLKLE TTSSSDEVSA AFEALIKGVK VAPQT EWKQI LDNTEVF&VX LCGDPSSGAR WIGXVûMVE DLIyEGSRFT AFHFGLFI3Y TTSFLRFNW ATF QNSWYV ETKVIAYPNG ULLLFKSGAY VAQYYITWNE LSYBHQGKEV LTPKAWDRNG ßDLTAHFTTS XPLKGNVRNL SW.ÏRECTGL A» KDßHATK W WTVYEETDL PLVRKRTXSI WGTTLYPQVE DEVENU
SEQ ID NO : 5 -- pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification θ AMAWDFIL AWXOKKKLL THQGE3ÎENR FIKEGSQtPG EFWIERKKR 3L.STNTSDÏS WAWDSRLY RGÂLLWDEï LLENNPTLLÄ VDRAPMTY3I X&PGLÄSSrxS FlgVECFSNS SVRGAWDEL A.WHQDY GQV NNVPARMQYE KITÂBSWgi, RVSFSSDFËK TGNSLSXDFN SVRSGBKQJ.Q ÏVNFKQIYYÎ VSVDÄ VKNRG FVFQFTVTVE DûKQRGÏSAE RPLVYXS3VA YGRQVYLKtE TT3KS-DBVEÄ AFBALIKGVK 7APÇ>T BM£ï WHTEVXAVï LGGDPSSGAR WTGKVDMVE DLÎ2BG.SRFT ÄDHPGLF'X'SY TTSFLRENW AT F QNSTBYV ETKVTÂYRN6 Wi.LPHSGBY VAQYYITWKS LSYBHQGKEV LTPKÄWDRNG. QSLTÄHF'TYS TPLKGNVRNX, .SVKTRECTGL AW KOgïï&TK S WRTVYEKTDL PLVP.KRTÏSI WGÏT&YPQVE ÖKVE-RD
SEQ ID NO : 6 - pneumolysine modifiée avec glycosite et un e aut. r e mod i f i c a t i o n
ANKAVNOFIL AMNYDKRKL.t THQGESIENR FÏKEGRQLPF EFWIERKKR StSTNTSDIS VTATNDSRLY PGALtWDEf LLENNFTLLA VDRAPMTY3Î PLPGLAS3DS FtQVEDPSHS SVRGAWELA AKWHQDY GÇV liNVPAfîXQYE XITÄKSKBQE KVKFGSDFEK TGNSWIDFN SVKSGÉKQIQ IVNFXQXYYT V3VDA VKNPG DVFQDTVTVE SLKQRGXSÄB RPLVYXSSVÄ YGRQVYAEAE TTSXSBEVEft AFSAAIKGVE VAFQÎ EWKQI LSNTEVRAVX LGGDPSSGAR WTGKVONVE DLTQEGSRFT ÄDHPGLPI3Y ÎÏSFLRDNW ATF QNSTUYV ETKVÏAÏPGÎG TILLDH'·’ Ai VAQ-'TT'JNF LSYTziQtKEV LlPeO'/PPtu QDLTAhFTT-' 't (ΚΛΨΙΛ SVEÏREATGX, AW ROQW&TK W WVYBKTDL PLVPERTISI WGTTLYPQVE SEVEN0 seq id NO : ? - pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification
ANEÄVNDFXL AMNYBKKKLL THQGESIENR FIKEGN^LPS EFWIERXXR SLSTNTSDIS VTATNDSREY PGALLWDBT LLBNNPTLLA VORÄFMTYSX FLPGLASSüS FtQVEOFSNS SVRGAVNSLL ÄKSHQDY GÇJV RWPARNQYE KITÂKSMEÇL EVKFGSBFBK TGNSLDIDFN SVKOGEKpIf XVNFKQXYYT V3VDA VXMPG DVFQDTVTVE SLEQRGTSAE P.PLVYX3SVÄ
3Q YGRQVYLKLE TTSKSDEVBA. AFSALÎXGVE VAPQÏ EWKQX LGNTEVKAVI LGGSPSSGAR WTGKVDXVB SLXQEGSRFT ASHPGLPISY TTSFLPSNW ATF ÇNSTDYV ETKVTAYRNG DLLLORSGAY VÂQYYITSÎNB L3YDHQGKEV LTPRAWPNG QÜLTA3FTTS IPLKGNVRNL SVKXRBCTGIj AB RDQUÄTR W WRTVYEKTSL PLVRKRTXSI WGTTX.YPQVE SEVENS
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SEQ ID NO : 8 -· pneumolysine modifiée avec glycosite et. une autre modification
ANKÄVNDFTL AMNYDKKXLL THQGESIENR FIKEGSQLPG EFWIERKRR SL3TNTSDTS VTATNDSRLY PGALLVVDET LLBXNPTLXA VDRAPNTYST DLPGLASSDS FLQVBDPSNS SVRGAVNDLL· &XWHQDY GQV NN7PA.RMQYE XXTAßSMSQT KWFG3DFEK ÏGRSLDIDFN SVHSGSKQÏQ JWFXQIYYT VSVDA VKNPG DVFQDTVTVE DIKQRÖISAE RPLVYISSVA YGP.ÇSVYLXLE TTSKSDEVEA AFEALIXGVK VAFQT BWKQI LDNTEVKAVÏ LSGDPSSGAR WTGKVmVE DLIQEGSRFT AD9PGLFISY TTSFLRDNW ATF QNSTDYV ETKVTAYRNG DLLLDH3GAY VAQYYTTWXE LSYDKQGKEV LTPKAWDRNG QDLTAHFTTS IPLKGNVRXL SVKISSCTGL AW KOQNATK X XRTVYBKTSL PLVPXKTÎSÏ WGTTSYDQVE DXVSSJD
SEQ ID NO : 9 - pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification (avec une sérine. N-terminale)
SANRAVNDFIL AMNYDKKKLL THQGE3ÏENR FIXEGNQLFE» EFWIERKKR SLSTNÎSDÏS VTACND3RLY PGA.LLWDET LLENNPTLLÄ VDRAPMÏYSÎ DLPGLASSDS FLQVEDPSNS SVRGAVNDLL AT.WHQDY GQV WVPAP&QYE KITA.HSMEQL KVKFSSDFEK TGNSLDIDFN SVHSGEXQIQ IWFEQXYYT VSVDA VKNPG DVFÇDT7TVE DLKQRGISAB RPLVYX33VA V.VOLP Τ-χνΝΓΠ/ΕΑ 7>FSÎLÎ>-U£r G'O M/gf _nhTF,V\AVT ÎCSt F '««> wtgkvdmve dliqegsrft adhpglfisy ttsflpdnw atf qxstdyv etkvtayrsg DLLLDHSGSY VAQYYITWNE LSYDHQGKBV LTPKAKDRNG ÇDLTAHFTTS IPLKGNVRHL SVKIRE&ÏGL AE KDQSÄTR N NRTVYBXTDL PLVPKRTÎSI XGTTBYPQVE DKVBND
SEQ ID NO : 10 - pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification (sans sérine N-terminale)
ÄNKAVMÜFIL ÄMRYDKKKLL THÇGES1ENR FIKEGNQLFD EFWIERKKR SLSTNTSDIS VTACNDSRLY PGAÏ.I.WDËT LLEWPTLLA VDRA-PMTYGI &LPGLASSDS FLÇVEDPSNS SVRGAWDÜL ÂKWQDY GQV NRVPÂRMÇYE KXTAHSKEQL -KVKFGSDFEK TGKSLDIDFN SVHSGEKQIQ IVNFXQIïYT VSVDA VXXPG DVFQDTVÏVE DLKQRGISAE RPLVYISSVA YGRQVYLKLB TTSKSDSVEA AFEALIXGVK VA.PQT E'w'XQÏ LDNTSVKÄVI LCGDPSSGAR WTGKVDMVE DL1QBGSRFT ADHFGLPISY TTSFLRDNVV ATF QNSTDÏV ETEVTÄYRWG DLLTDKSGEY VAQYYITWNE LSYDHQGKEV LTPXAXDRXG· QDLTAHFTTS IPI-KGWRNL SVKIRE&TGL AS KDQW&TK W KRTVYEKTDL PLVRRRIÏSI WGTTEYPQVS DKVEND
SEQ ID NO : 11 - pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification et un marqueur Mis (avec une “θ sérine N-terminale)
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SAMKAVNDFXL AMNYDRRKLL THQGESIBtïR FIKEGNQLPD EFWXERKKR 3LSTMTSDIS VTACNOSRtY »GALLWGST LLBWPTLLA VDRAÏ'MTYBÎ DLRGLASSDS FLQVEDPSKS SVRGAVNDLX. AKWHQDY GQV WVPÄRMQYE KXTAHSMEgL KVKFGSDFEK TGNSLDIDFN SVRSGEKÇI2 IVNFKÇ>ÎYYT VSVDÄ VKNPG DVFQOTVTVE DLKQRGISAE RPDVYXSSVA YGRQVYLKLE TTSKSDEVEÄ AFEALTKGVK VÄFQT BKKQI LDNTEVKAVX LCGDR33GAP. WTGKVDXVE DLÎÇjSGSRFT ÄDHPC-LPISY TTSFLRDNW RTF VN3TDYV BTKVTAYR3ÏG
DLLLDHSGSY VAÇYYXTWNE L3YDHQGKEV ETPKAWORKG QDLTAHFTTS XRDKGNVRNL SVKXKEÄTGX. AE SCQN&TR W WRTVYEKTDÎ. PX.VP.KRTÎ3I WGTTEYPQVE DKVERD
SEQ' ID NO : 12 - pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification et un marqueur His (sans sérine
N-terminale)
ÄNKAVNDFXL AMSYDKKKDD THQGBSXBNF. FIKEGîîQLPD EFWXERKKR SLSTNTSDIS VTÄCNDSRLY PGADLWDET LDEWFTLLA VDRAPMTYSÎ DLPSDASSDS FLQVEDFSNS SVRGAVNDLL ARWHQDY G$V WVPÄRXQYE XIÏAHSUEQL KVKFGSDFEK TGSSLDÎDFK SVKSGBtyig IVRFK2IiYT V3VDA VKNPê DVFÿDTVTVE DLKpRGÎSAE RFLVYISSVA YGRÇVYLKtE TTSK3DE7EA AFEALXKGVK VAPQT EWKQX LDNTEVKAVÏ LCGDFSSGAR
WTGKVUWE DLIQSGSRFT ADHPGLPX3Y TTSFLRDKW ATF ÇjRSTDYV ETKVTAYRNG 15
DLLL&KSSJBY VA2YYXTWE DBYDHÇGKEV tïPRAKDRNO QDDTAHFTT3 XPlKGNVRNt 3VKIREÄTGL rj> KDgNÂTK W WRTVYEKÏPL RLVRKRTÎSI WGÏTEYFÇVE DKVESD HHKHHH
SEQ ID NO : 13 - séquence signal de DsbA 2 0 MKKXWl&IAGLVLAFSASA
SEQ ID NO : Γ4 ~ séquence signal de ORipA
MEKTOAXAVäLäGFMVAQA.
SËQ ID NO : 15 - séquence signal de MalE mkxktg&rihälsälttmmfsäsälä
SEQ ID NO : 16 - séquence signal de PeiB
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
SËQ ID NO ; 1.7 - séquence signal de LTIIb
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MSFKKI ÏKAS'VIMAALVS VQAHÂ
SEQ ÏD NO : 18 - séquence signal de XynA
MFKFKKKFLVGLTAÄFMSISMFSATASÄ
SEQ ID NO : 19 - séquence signal de Flgl
MIKFFSALILLLVTTAÄQÄ
SEQ ID NO : 20 - séquence signal de Tq.lB
MKQALRVAFGFLILaASVLHA
SEQ ID NO : 21 ~ pneumolysine modifiée avec glycosite et une autre modification et un marqueur His et la séquence signal de PôIB
MKYLrP TÄAÄG.!> L LIAÄQ PANA
OKAVN&FXL AMNYGKKKLL THESES IBNR FIKEGRQLPD EFWXERKKR SLSTRTSÖIS VTACNDSRÛY PGÄLLWDET LLBWFTLX.^ VDRA&MTYSÎ ULPOÎASSUS FLQVBDRSÎÎS SVRGAWÖLL ÄRWHQDY GQV NNVRAPNQYE KIT&K8NSQL KVKFGSBFBK TGJâSWÎDFN SVHSGEEgig. IVNFXQIYYT VSVDA VSNRG DVFgOTVTVE DÎXQRSÎSÂS fÉLVYÏSSVA YGRgVYfKLE TÏSXSDEVEA AFEAtlKGVK VARQT EWKQÏ LDNTEVKAVX LCGOT33GAR WTGKVDNVS DirgEGSRFT ADHRGtRiSY TTSFLRDNW ATF QNSTDYV BTKVY&YßNG VAQYYTTWE liSï'&HgGKEV LTFK&WRNG ÇSStTÂHFTTS IPtKGNVPNL ÄS KOQNÄTK W WETVYEKTEït PLVRï'RTISI SGTT&YPQVS DETEND : 22 - pneumolysine -modifiée avec glycosite et .modification et un marqueur His et la séquence TolB
DLL DDR;'· se Y SVKIREÄTGL ERHEBE
SEQ ID. NO une autre signal de
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MKQALRVAFGFLILWASVLHA
SANKAVNLFIL AMNYEKRKLL THQGBSIEHR FIKSGFQLPO EFVVTERKKR SLSTHTSFIS VTACFD3RLY FGALLWŒT LLBNNFTLLA VDRAFMTYSÎ GLFGLÄSSES FLqVERFSMS SVRGAWDLL AF^HQRY GQV NÎÏVPAfôiQYE KITAHSMEQL R7EFGSDFLL TGMSLEIEFiï SVHSGEKQIQ IVX.~EQT.YYT VSVDA VKNFG DVFQDTVTVB tÆEQRSIS&E RFLVYÏSSVA YGRQVYLKLE T'TFKSDBVSA. AFEALIEGVK VAPQT EWKQT LDNTSVEÀVï LCGDPSSGAR
WTGR7DM7E DLIQEOSPFT ADHFGLPISY TTSFLRÜMW ATF QNSTÜYV ETKVTAYRFG B.L.L.LDHSGXY VAQYYITWNE LSYDHQGKEV LTPKASDRNG QGiTÄHFTiS LF'LEGWRNA SVEXRE&TGL AS ΧΟβΐϊΑΤΚ W WRîVYËKTDL PldRERTISI WGTTKY.FgVS DKVEXB HKHKBB
SEQ ID NO :: 23 ~ fragment de séquence de pneumolysine 10 modifiée [X3JTÖL A(X2] KDQNÄTK •SEQ' ID NQ : 24 - fragment de séquence de pneumolysine modifiée
ÎXariGL A|X23 KÖQNATK W WRTVYEKTDL PLVEKETISI WTTfX2|
SEQ ID NO :. 25 - fragment de séquence de pneumolysine modifiée
ΪΧ2ΪΥ VAQYZiTWB LSYDSQGRSV LTFEAWnpxe QDLTÄEFTYS IPLKGR7RML SVK.ÎRE£X3JTGL A[X2t) M5QNATK VF WRTVYEKTDL PLVRKRTISI WGTT[X21
SEQ ID NO : 26 - fragment de séquence de pneumolysine modifiée (XI] SORSSGAR 7VTGK7DN7B LLXQEGSRFL ÄDHFGLRISY TTSFLRENW ATT yhiSTDYV ETKVTAYRRG GLLLOHSG(X23Y 'VQ'-'YLTWE LSYRRQGKB7 LT5KAW3RNS QRLTAriFTTS IPSKSWI 3VKIRB [X3JTGL A.(X2J KßQNATK W WRTVYEKÏDÎ. FÏÛÎP.KETI3 Σ «GTT [X2 J
SEQ ID NO : 27 - fragment de séquence de pneumolysine modifiée
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ÎXl]NDSRî..ï FGÄLLVVÖET LLSWETLLÂ VDSfûMTYSÏ DLPGLÄSSDS FLQVEDPSNS SVP.GÄVMOLL ÀKÎiHy.DY GÇV NWEARMQYE KITAHSMEßt KVEFGSüFEK TGNSLMôEX SVRSGSRQÏQ IWFKQIYYÎ VSVDA W3 DVFQDTVTVE DLKßRGtSAE RPLVY1GSVA YSRQVY.EKLE TTSKSDSVSÄ AFE&EIKGVK VAPQT E&7EQÎ LDNTEVRAVI L [XI ] GEGSGGAR WIGRVDKVE: DLIQEGSPFï ADHPGLFISY TTSFLRSNVV ATF ÇNSÏDYV ETKVTAYEQSG DLLLDESG EX2 ] Y VAQYYTTWE LSYDHQGPÊV LTpKAWDW QDLTAHFTTS ÏPLKGïiVRSL SVRYREÎX3]TCE Α[3ί2] KDQNATK W KRTVYERTDL PLWKRTISI WGTT£X21
SEQ ID NO : 28 - séquence consensus D/E~X~N~3~S/T
SEQ ID NO : 29 - séquence, consensus
D-Q-N-A-T
SEQ ID NO : 30 - séquence consensus ' /
K-D/S-X-N~S~S7 T-K
s.
GG i:U i$i :cn. 3 en îëi •n. i 4SI
SEQ ID NQ : 31 - séquence consensus.
K-D-Q-N-A-T-K
SEQ ID NO : 32 - #^s~SÂdPLY&ss£ comme dans pGVXN197,9 (498 aa, abritant 5 mutations dëtoxifiânte.s G293V, A37ÖE C42ÖÄ, W433E, et L460E) :
PùnSVVYERK s ir-i.-PGï>&ss SLRYKFGSBF s^eskgrsïs ÇiïYSM'ï’SVFC.
KGSniÆ&KFT'
SYS'Q'/SDEVS
Si&iYÄÄSK4 KSSÎiSTKTCD XSSEIiOVSBPS SRTÖSSSDIR ÂEaPïjV'ils,« SXSVSSPSSG ÏVSSKVÏÂYR Tfj ïslrsevs KPaSâGîîîAî/ iiAiÆFnYSDE CSC·· îïÆHRSK KSSVBGAWfc FHSYÏiSSERQ v-G'iSRQ'Sïsa SPÀCU’GRYm-i a * emos s *·..NrsVKTREAT
UÄWDKKK
LYP5ALLWÖ ï,îîAKWODYG'
XQXWSKQ'XX
X,StïSRSDEV
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A206KDQNÄTK) :
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K271KDQNATK) :
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K279KDQNATK) :
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P296KDQNATK) :
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B E2017/5427
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481 S1?5-2TT£2?O VEDKVEÎJPæi %%
SEQ ID NO : 50 - pe.is-ssdPLYjmi48Hls6 comme dans pGVXN2240 (504 aa, G293V, A370E, C428&, W433E, L460E,
E434KDQNÄTK) :
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121 SIP1FÖLÄ33 DSB'LQVSOPS .NSSVRGÄVW XiXAKSSKOS.Y© OWNYP&WÖ YSKIxEESME 181 S&KVKFGSBF EKTGMSWXD FHSVESSESQ ISÏVKEKQ.XŸ YTVSVDÂVEB PGEVSQPTVT 241 'ygöX,E.OS«I'S ÄSSPTVYXSS VÄYääROVYLE LSTTSKSDEV SääSEäLIKG YXVÂPQXîSSïS. 381 «SIIiSWEVO. VXRVGDPSSG isPWTGKVßiä VE-DLXCiSSSïi FT&DHPSEPX »YÏÏ.S'FLRPN 261 WATFQSSTE» TVEVKVTÄYP Sl-ÜlXiI,r.>Hi8ö EYVAQ'iïITï-i NÇlSYDfi-OSK SVSEPRAKCR 421 HûQPLT&HFT TS XS-TKSMVt NL'SWKXRE&T S.LASEDßN&T KWBpVYKKE DlPlVRARTÏ •181 SXWôTîSÏP'Q VEDKVE8£i,W KSîSï
SEQ ID NO : 51. ~ peis-ssdPLYEise cöwe dans pGVXN2369 (4 98 aa, abritant 6 imitations détoxiftarîtes ?65C, G293C,
A370E, C428A, W433E, et L460E) :
i xti'muriAÂ s&üâasfa iîsân-k&vhse ΐϊ,Αύηγβκκκ mRonaSiE bsExeègkqx. 61 -PDBFTVXERK 'XPSiSTNTSß· ISVTÄCRTCX rTPSAirWE STELSt-IEPTI.· LÄVEPAPSTY ?0 121 SIDLP3LÄ3Ö DSS'LOVStS'S USSVRGAWD imSSKônïô OWtFTPARMO ΧΕΚ.ΧΧΆ83.Με Z 181 DîiSVKFSÉBE SKTSNSmc FMSYKSGEKO XOXV&FK&XY YTVSYßXVPN PSEVSOBTVX
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SEQ ID NO : 52 ~ i-anr,s:;dPLYwfc4aiss comme dans pGVXN2400 (504 aa,. T65C, G293C, A370E, C428Ä, W433E, L46OE,
Q24KDQNÄTK) :
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482 3IWGT7SYP0 VECKVENDHIY zfzîXK
357
BE2017/5427
SEQ ID NO : 53 ~ peip-«,<?dPLY®nt48Kis6 come dans pGVXN2401 (:504 aa, T65C, G293C, A370E, C428Â, W433E/: L460E,
E434KDQNATK) :
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481 SXWTXEYPQ VSDKYKWÄff isS'Äii
SEQ ID NO : 54 - ojs&a-sed'PLY^^isE come dans p6VXN2887 (502 aa, TSSC, G293C, A370E, C428A, W433E, L46ÖE,
Q24KDQNATK) :
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SEQ ID NO : 55 - psba-ssdPLYniut-48?ns6 corne dans pGVXN28 35 (502 aa, T65C, G293C, A37ÖE, C428A, W433E, L46OÈ,
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SEQ id NO : 56 - Ziffi^-sdPLY^4.ffii5$ comme dans pGVXN2888 30 (502 aa, T65C, G293C, A570E» G428A, W433E, LOGE,
Q24KDQNÄTK) :
158
B E2017/5427 niÂïÔÔÂIII iSVTTÂÂ-SSS &NXAVNWID AäÄtiKRKX.*. TKKDpSATE.G ESIENRFXRB SI SNOLADSEW XSRKKRè&Sï NT-SDISVTA.C NSSA1ÏPGAA XYVBËYL1EÜ ΝΡΤίΐ,ΑΥΒΑΑ 121 WT'iSîtæF© .DASBÜSFXGV ESPSNS'SVRG ÄWDÄLAR5ZH asæsQWè akkgyerïta 131 HSNS3ARVEE 33ΪΪΤΕΚΤ!Α1 iOXD.ElîSYHS: GEK5ÎQÏWF AQIYÏTYSYD AVKNÉGBYFG 241 AWTVSDÄKG 'ÂSXS&ERPXy YiHSYÄYGRT VY1-F.LETT3X SCEVEARFSR DX&GVKYRFQ 3'ÔÎ ÎEBK8Î1W 8YK&VILCGE PSSSAP.YYTS KYDWEBXlû EGSRETACKl GXÎ-XSX-TMF 361 XRDÎÎW&ŒFO K'STÙWE'ÏXV ΥΑΙΥΝΙΟΧΑΧ DHSOEYVAOY ï'ITWSX.S'ZD iïQGEEYlTAR 421 AWDKiJGO&XT AHETYSIAAR GNV.RNX3YKX REATSX&EES TOTWSRTDt PAYARRTÏ01
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SEQ ID NO : 57 - mQ.n^dPLY^'-4SHiSe comme dans pGVXN28.96 (502 aa, T65C, G293C, A370E, C428A, W433E, L460E,
E434KDQNATK) ;
i /JîiSWSrS AXVïY’msÇAC ÄHSAWDFXE. ΑΐΙΗΥΟΕΚΚΧΑ TKCYS3ISHß FXKSGWSPC fcl SSVVSSREKK SXJ5TWSDX«..· VT&CNDSRli &SÀLXÎWÔE2 XXBt«JPXXXR YBRAÏMTYSI 111 DLPGXR3SDS F&GVBDPSN.».· SYAGAYMDLL AÏOmiDYGTY KWPAWÖXE EXTABSMSQX X3X R8KFG.8DFEK TSÎïSL&ÎDO SW3SEE.GIG IVHEKCÎYYT YSVmumSYG DVFQDTYTvS 241 £>MGRS$ÎSA£ SPIVYISSVÄ YàAÛYïAKIS WPKSDEVEA RFSÄ1ÏKGVR YÄSGTEKRll 351 IDNTEVEAVI XCGEPSSSÄR WTSKVÖäSVS KX23SGSRFT APßPSXRISS SSSFXRDNW 361 ATFQNSTDYV ETKVTAXRfiG DliSLCKSGEY VÄQYYITRKS XSÿDHQsSREV AIREäNCRNG 421 3DLÏ&HFTT3 XpXRGMVSNl SVEXRSRTSX ÄSRiiöSt&TKN WRTVSSXTDX. REYRXRX-XSX
4SI WTTSÏPTVE DYYXNDÄA'.YZi* HÄ
SEQ ID No: : 58 - irxxh.--ssdPLYraufc4HisS comme dans pGVXN2889 (506 aa, T65C, G2Ô3C, A370E, C428A, W433E, L460É,
Q24KDQNATK) :
i Äma?m'.r.rAvs ains^iwi'i·· asafahkavr cfxxäiäjxdf. kkixthwxpj âtk-s£3ïeîîr
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SI WSFXRDNW ATFONSTOXV EYKYTAYRRG BllADKSOEi VÂGXŸXW&S CSŸDHüGKSV
Sil ITPKKWSRSJG ODXTAKETTS XPXKÖM’RHÜ SV&XRSRSGI AEEWWB35VÏE F3PDXFXVRRR
31 TlSINGTTEi' PQVKDKVSKD «aaSHA
SEQ ID NQ : 59 - r,TZ7h-a.$dPLYWJt48/;isF comme dans pGVXN2897 (506 aa, T65C, G293C, Ä37ÖE, C423A, W433E, I.46ÖE,
E434KDQNÄTK)
159
B E2017/5427 /fGFKKXXKAF WAWrVa'vY' AHÄS&SKAVK CfiiUjSÏSZ XKILTHÖGES XER’RFXSSGK
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31 DÏWSQDIÆ&H EYTSÏPLRSS VRNLSVKIRS AXGBAßF.DQK AïKKWPÆVYE Ε.ΤΡΟΡΧνΡ.ΓΛ
4P 3 XÎ3IWGTTEY POVEDKYSNL YmKYä'H
SEQ ID NO : 60 - «axs-ssdPLY^iriser comme dans pGVXN2890 (509 aa, T65C, G293C, A37ÛE, C428A, W433E, L460E,
Q24KDQNATK) :
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4$i RKRS5X8XWX >XSYRQVSSKV ENDftWftaYi
SEQ I'D NO Î 61 - waXÄ-ssdPLY“«*48»^· comme dans pGVXN2898 (509 aa, T65C, G293C, A370E, G428A, W433Ë, L460E,
Ê4-34 KDQNATK) :
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SEQ ID NO : 62 - Mpa-ssd-PLY^Wi?'. comme dans pGVXN2S91 (508 .aa, T65C, G293C, A370.E, C428A, W433E, L460E,
Q24KDQNATK) :
160
B E2017/5427 .5 fSÎWÎKÇI.iT S3Y3ÀÀ6L1.ÇC ΑΐΪ'δΑΟΑΪ'ΪΐΆ YFDFILAMNY 'ΒΚΚΚΤΧ,ΪΜΡ SR&'TKGSSIE 62 îfEFIKEGXôr, ÏWFWXSRR ERSDSTNISS ÏSSVÏÂÔÎÎ2SS ïamïÀLlWO ΕΤΧ&ΕΚΚΕΤΧ ill ßRVCRAPMTX SXßXi'FÄt&S'S fUEÙQYEÇE'S MS3YROÄVND LLÄKSSGCYG QVnFVRßSKQ
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3-01 VKVARQTSÎÎK .ÖiWHTEVKR YlLCGDPSSS ARyVT<3KV&J4 YEDAIQEGSR FT&CBBSXEX
241 SYG~SFi,RBm WAFFCN3T2 YVETKWÄYR H«0X.ßXDÖ8S SYV&OYYXTW JSEXSYDHGSX 621 EVXXFK&ÎÏDR KSGDIÆAAFm TSlPLKSiJVR Î413YXÎREAY SI.ÄEEWWP.3?V YSaiDL&LVE
4SI RRTISXWÖTT SYSCVESKVS SWSaSS
SEQ ID NO : 63 - jxpi <,±JrLxmuW5cn, comme duns pGV> N. 809 (508 aa, T65C, G29.3C, .Ά370Ε, C428A, W433E, L46ÖE,
B434RDQNÄTK) :
i u?.'.\7c\-rxrr ctygaacxxyy AcrrAowjEA '’RaFiXAnni ι·εκκι.ι<ικοο spisiipuns 61 SUOLPRSEVV ÎERRRRiSimX .NTSDXSYXÀC SDSRLYPOAD XYVDETXAEN NPTLLAVDKA 121 PÎ6TYSXSLPG LASSGSFDQV EPRSääSSVRS fiVYDLlÄKKH QDYCaVNNVP fePMQYEEXTA 131 nfiMEQSRYW' iSSßEERT'GSS Xs&XOWSVfJS SEKQXQXWE' KÖIYYW3VD AVKSFGßVFQ 241 ÖTVIYE&IKO PSISAÉSPLV YlSSyAYGRQ VÏAKX.ETCSK SDEVEAÄFEÄ ßlESVEVAEQ 3Ö1 'TEWKQXLim 'EVKÄVXX.CSD. ESSSÄRWTS KV'SMWEOXXG SGSRETA&R? 3XFXSYXYSF
361 XiRDMWÄTEG NSXDYVE.XKV TAYRR<3.pi>X.X OESGSYVAOY YXTTO3EX.ŸYÜ HQGKEVXTPX
4.21 AWRMOGPIY AHFTCSiFXiK GSVSRXSVKX ΕΕΑΤΟΪΛΕΚΒ QKA5'KWRTV YSETDXPLVR
481 KRTXSXWTT 2YF0VEDKVE NOSWiHm
SEQ I.D NO : 64 - jy«Ä-S3dPLYmüt<iffja6 comme dans pGVXN2392 (511 aâ, T65C, G293C, A370E, C428A, W433E, L460E,
Q24KDQNÄTK) :
i ærm®'7 ö.n?Asms'im «fsaxag^Pä 62 gXEHREXKES NQL&DEFVVI EPKXESLSTti 12 2 c'YLLAVDR«.? WYSXDDPöL äSSD.-SFLGYS 131 SKGYSKXTAfi Si-SSGIilGlFSU SOFEKYGHSL .241 VK&RGBVSW TVTVESSiKGR GXSASRPLVY
3Ö1 LKSYKYAPGT SKKGXLSKTS L’KAVXfCÖPP 361 LPISllTSSL· Π&ΐίΥΥΑ'ΓΕΟυ STDYYETKVt 42'i QGKEVDTPKä WDEMGOßtTA HSl’XgXPlSS 421 xyRKRTISXSS GTTEYFGVBÇ ΚΥΧΥ&ΗΚΗΗΚ
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SEQ ID NO : 65 - ^A-s«dPX,Y«afc4{!fii3ô comme dans pGVXN2900 (511 aa, T65C, G293C, A370E, C428A, W433E, L460E,
E434KDQNATK) :
161
B E2017/5427 i ramm-’/ ai-m-Amisrs z-rnsAonsASA kkawbfxx-à mFïsPPkiî.î: bqöesxekrf
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121 BSAPÏÎTÏélS LPÖ1AS3O3F XßVEFFSWSS VRG.AVSDÎÆÂ üHO-OOl-VS KVSARRpYSR
131 XTÄRSMSGXFx VRP^SBFBFÆ StfölOIDlW VHSSSKOIGï VîmiiqïYYTV SVDAVRNPSD
2.41 WGS'r-VïVEP BEÔRÔïSAER tmVïïSSVAÏ GRÇWXEXBT TSESBSVBâA FS&LXKGVKV
331 &RQCËKAQ1L &K-TEWAVXL CGDFgSSÀPV V?<fl»?8ß XÎOEGSRFÏR BHS'iSt.PÏSY'T
221 TRFIïRBjRW ÏFCMSSCYVE IKVTAxSNim 2Li£‘H3SE2v ÄGXVXWBBX SYDHOSRgVL «2L WR&SWR&SQ DÎ-Æ'ARESTSr PLKGRVRMLS VEIKSATGLA EKBfcBÄTRW RWYE 1121:1,2
4SI imRPRlïSî?? GTSEl'FOVBß KPSil&H.WKS »
SEQ ID NO : 66 - roifl.-ssdPLY'^Äisi? comme dans pGVXN2893 (504 aa, T65C, G293C, Α37ΌΕ, C428A, W433E, L460E,
Q24KDQNATK) :
J^Q 1 XÎKpÂXSWVîS FiimîiSCVAii AS&NKAW&F IX&Wï'DKRE BXTHABÖKAS KSSSIERRFî
Si nsGwapßSE TOERmsi s-xvTS.Djs'.m acmdsklsfö ju,mtæ«ï, mmmci&AVD·
121 WmSIIfc 22LA3SÖ3FL QVÉDFSHSSV RiSÄWDXXÄR WKßöFSQWH WŒKÎ ICI ÎÂKSÎ-'EÛLK.V WSS'GSS&TG N:522Î.BFKSV HSGSËCIÇÎV KF&QXXETVS VBAVEJIWBV 2 41 ESBTWVBDÎ.· RORÖ2EAERS IVYISSVAYS KQVÎCRSETt SPSDEVâAAF SALIKÖVRVA 331 EpTËÀmQïia NIEVEAVILC CSP33SÄKVV TGKVBMVESZ. XGäSSSRFTAÖ KiOSS'ISfiFT 3Ç1 SFXR&KWÄT FÛN3W2VE3? BVBAYRRGBX XXDH8ÖBFVA Q1’YÏFWBXS: 2CKCSR2V1T 421 FK&WDRRGQD BTARÎ’TTSλ XmSîxVRtmSV EXRSATGX&S. EJBteÂÎ lO&LVRSSËÎ 4 21 $ï?!S22EYEe VEDKVEKBXX' BBSS
SEQ ID NO : 67 - ^••ssdPLY8“’«8^«, comme dans pGVXN2901 (504 aa,·· T65C, G293C, A370E, C428Ä, W433E, L46QE,
E434KDQNATK) :
l z-a'mmssimaa miimvASVlX -äGauxavhbe ixä«wek&· sethqsssxé rrfxkeskqi ¢1 FDBFWÏF.RK RRSBSTBTSB î S VTAC ÎÎPSR XXPG&BïiWEi BTÎLÉWFFL· CAVCRARtîTY
9Q 121. 3Ï&LSU2ASS DSFÎiOWS'BS KS2VRSAWÎ5 12ÀOKCCÇS OWm/RARilS YSKXT&äSME 1ST. QXRVKFGSCF BKïôîfSXDIB S’HSVËSGËmS lOÎVKSKpïY YXVSVDAVKH BSDVFGOÏW .241 'VBCiKQRSIS ÀSRFtWXS'S VAYCSCVYCK XES.SSEBDEY SAAFEÄXXR«: VSVASOISVK 321 G-ïîiONTSVKA VILCSCPSCG J&WTSESW VEBBWSGBR PTACHPGLRÎ 3 ï TT $ FÎ&CB 3êl WAT'FQBSTO 2VECKVTE2R HS.bL&WHSG ΒίΎ'ΑΏΏ'ΐΟΡί KBXSVBRGGF. SYLTFK&TOR 42.1 .kgqbltaeff niisimme/R nlsvkï'Bëat öl-aescoh&t kweiyyskt drrlvrksti 4SI SIWGFTBXRQ VSBEVEKBRH KSf.W 25
SEQ ID NO : 68 - cw>A-SsdP£**ut4BXs<? comme dans pGVXN2894 (504 aa,. T65.C, 6293.C, A370E, C428A, W4..33E, L460E,
Q24XDQNÄTK) ;
ΙΐΚΚΤΑ.ΓΑΙΑΟ A2ÄGf»TX»ß AGABKAYM'CF 'IX&MKXÇKKFt CilSilDONAÇ -XSBSÏËiS&FÎ £t KESBÖSBDEF WIEPBRRSX gTWTSDXSVï ÄGRßSRBFFS AimmBSTLl ESSFTBXÄVTi
121 PARSSCSÏîm BOXASSBSF£ QVSBgSHS-SV RGÄVKBXX&K WOSYSQVMÏÎ WAMQïEKI 131 TÄBSKEOBXV aPOS.BFSy,®« aSlßlCPHSV «.SGBRQ-rûXV b’FKOJiïœVS VB&VKMRSD'V
9η 24 t FOBFVWBßX K^RGtSÄSRB EVIIÖSVAYS ROVYIKLSYT SKSßFYSSAF -S&XÏiRSVKVÄ J: 2öl FOÏE5ÎKOXXB K2EVK&VIIO C&RSSÖARW TSKVßKVBßß XCESSRFX&Bl HBCXSXSYST
34t griilfflSm? FÔï?STDFVE3;' k^S&SRWßB iXÖERSESVA Qxx'XOiNEXS YßKGSRSVXT 421 BKÎOÎDRimOB Îl'aHË'TTSIS XEGiSVRHBSV KXRSRF.SX&S SWWVYBFÄ ßßBXVRERTX
ί. 62
B E2017/5427
452 'giwG'fïsvp; Miasma»
SEQ ID NO : 69 - etepA-s«dPLY^t48WjS6 comme dans pGVXN2902 (504 aa, T65C, G293Ç, Ά370Ε, C428Ä, W433E, I.460E,
E434KDQNATK) :
i
Æ1
12i
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24k
U.U
341
42i
451 ’•;w?A.rÄ.i.äk PEEFWXSSK aw&FSL&ss vtK\XFC-?CF ye nr ra® ax s OXX&aXSY’FA VYS'Xi'OKsau.' NQGöia.FHFT siwaxxsipa
KREIRTHTSD
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ÄERRLVYX'SS· 'v'XieC-öP.33G .czetkyt&xf •S.rkLFOKYF
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HLSVy.kRELT
7::7:7:
XLAMRxt-RKS. LYPSALim’D XMXSWiODYS ÎGXWFFC-XX LETTSK3DEV VEDLLSSCSP. STVÄDYYkT?? <k!:As:<r?cFAT llthpsssxe
STLLSFFTTL owrvr&rjäo msmw
EA&FEÄX:TFT
ÉTADTÏPài-PÏ
KFLSYDHG3F
KWRTVYEK«
KRS'XEFTNPL
LLYDEAR-Î-Tï
YSFIXAFSSE
PSDv'FönrvT
YÉVARÔtSWK
SWTSFLRDn
EVLTEKASDP, .ELPiVRKSTI
SEQ ID NO : 70 - séquence signal de SipA 1 MmwuT stmäästlsv ssvo&s
SEQ ID NO : 71 ~ pneumolysine, Sérotype 7.F _CDC1087-0O
1 MLNKAVHDFX XAUNYD-kF:'.! 1THQSSSXEH SFXKÊLKQLP KSFkOUËRF.F. RSLSXX'ÎFSDX
«2 .SYTATNISRL ÏDGALLYYDS TkLEKLUYLL ÄVBSAFUXYS XENRÔLAS3D SFWVSDRSt?
12 k SSVRÖÄVI4SR L&KKKODïT-a ΥΝΝΥΡΑΕΜφΤ SKI WAESKEG. anvKFasrFE ιηοιοχτητ-
15 · KSVKST-EF.pl OXVIÎFRSÎYY wsvbävxw S.DVFGD’LVTV SDLKQÏ5SXSA epplttxssv
241 a 2axuvi lfl EFTSKSDEVS AAFSSLIF.GV ÂFQTEWF.OÏX.·- ΚΚΪέύΕΑΥΧΧ· T?ïTf£'3SGASY
ϊ·η VTSFYi'XVSD L-XOEGSRETA DHFSUFXSX'T .TSERRBKWA TFpaSXDïVE W/TAYRMGC
34k FLLDiiSGATY AOYXXTWSî. SYDKOSEEYF TFkASîDRnSO DLXAKFTTSX FxKôxnwrs
421 VT.IKE ‘.'XT-LL WEWRTVXSF TDIkFLYRKRT XSIWXTLÏF QVSL-KVEKD
SEQ ID NO : 72 ~ pneumolysine , Sérotype9 SP195
1 nnmn IARSBÏ DKKKX, LXLOTESIgN éETEET-îiprp DSFWXERKK RSLSTNT3Dî
«2: svTÄ^wnsss YRSARXYVrtE axfflæaiEî, avrsarmt’/s Triï,Â-aiassD .SFLOVSDPSN
TTi 3SYP.CAYKDL LÄOKöaYiso WSTÎM^Ï. •2KITAKSMSQ. lk.vkfssdfs KTSRSX.DÏD-F
ran FSVHS'ÏEFCI ΟΤΥΚΕΚΡΧϊΤ TYSYnnanis· srvnioxvxv EDIiKQRÔISÂ ERPàVXXSSy
242 SYSinVYLXL ETTSKSDEYS AAFS&LMFCV kvàRqtswko ILDKTEVKAV XLCÔ'DFSSCir
<3 £> X: SWTC-KVOMV Em ·Χ·Ε· 5· 3 5 F TADRSOLFLS tttsflpdw VATFQXJSXDï YETKVTAFRR
252. SDLLLDKSTS, ÏVÎïQYY 2TKD SI..3YDHQTKE VX,ïRKA»DR& GQDLTAHFTT SÎPL&3NYRK
421 SSVRIRECTS X.-AKEWWRTV1 EKTDLPL'/F.E RTISXWSTXli xPpVSDFVEXï r
SEQ ID NO
3 -- pneumolysine, SérotypeôA CDC1873~00
163
B E2017/5427
i mEâwsn 2«SUYï;KKK. LPHOSESXSN RFÏÎYSSK022 befWxesrf. RS22YSTS2U
t L SYÏATîiGSFÙ YFUmiGWDE TXÆSWSPim AyriR&FMTYS x sχοη.Ά.on? SFXWEGFSN
12i SSYKUAYUGL S&EKS0SY3G WffVRARMQY SE.ÎTAHSMEO UEVKFOSXÙ'E KT SiSGLOIDF
i?l N.ÎYK5GEEQ ï QXWEKO2YY ÎW?6S.W gcaupbtvtv SDZKOKSISA ERPLV-vIASV
24 1 a-; j. 7Ό Y Y: 7../.7.. EPÏSKS3EVE AAs'EAIURUY EV&P0TSÎ4K0 XLUmiSYKAV TLSSBSSSGÂ
<- Rvv'TsîmOuy EOIU QEGSSE TAUHEGLE23 yttsegrcw VA~EONSTDï VEtfcVÏRYRK
sëi SDLXLDH-3ÔA xvaoyyxyw BUSYDiiGGnE ViTPRAWBRN SCGLTAHFTT SIE-EKSiP'KN
42ί 2SYKÎKE2YS lÂïîSWïR-rVÏ EETGGFSVRK RYXSXKSTÏX- YE-QVEXKV£\' '>
SÊQ ID NO :· 74 - pneumolysine, Sérotype2_R6
1 HÄNKAVNGFI LÂKRY&KKXL LTHO3E32EU P.FIEESSQLE· DEFWIKRKK RS&SWTSBÎ
ΙΟ: 41 5VTATNB3RX X 2 ,AlL7r s- TLLEKR ? TLL- ÄVBPÄPMTYS XIÄSOL2SSD SFÎpYEô&SK
122 S.5VKÖAVUEE· XÄKKHQGTGQ 2!SSYE.2?nCY SKXXRH314BO lîty'rfss urs RTGWSSDIBF
131 KSVKS-SES.O1 QXVNFXCIYY TV3VBAVKNR GDVcOPrYTY SDLKÛF.GX8A SRRBVYXSSV
;4i AYIRQVZLEi ETYSKSTEVS AABEALIRGV EV&POÏSWRQ· XX.BÏJTE7KAV ILGGOFSSUA
3 31 F.VV’XSKV&MV EDLI2EU3RF TîUJHj?2222S YïTsrssDuv VAïFOKSXDY YETKYT2ÜRK
202 SB&iLBHSGA '< V Z-2 ï 777 7 ?7F‘ ELSYDîïÇSSŒ V&ÏHU2RORÎJ GUSîÆAHFTT SXPBKURVRK
3 21 Î.-SYKÎ RECTG LAÏÎSWRÏYÏ EKIEÎSSYRK RTXSXWÏTX YPÖVEOKVEN δ
15 SEQ ID NO : 75 ~ pneumolysine , S é r O t ÿp e 6 B 67 Ö- 6B
2 MANR&WBFX SA51KYDKKKL XTHQGESIEH PEXKESÏÏÜIP DEEVVIESEK R3B3TRTSBX
4'1 SVTAiPmSRL ys-SAiivvxe Ttp&NKFTTL A'.’CÏUï PKTY S XimP&LÄSSr :?.?7;.·2ΥΥΓ..'?·.?η
12 2 S3W7ÎÂVKD.Û XAKïïKÔGïGO VRRVFRRKOY FFTTAH31ÎBC XîF.VT^SBFS RTGHSSBXBF
1:551 .USVHSÔEKÔÎ ClYFrKUXYY TYSVnÂVEHP iroïCGivx’1' SBBKÛR&XSX ERPBVYXSS'V
20 24:2 AÿGRGVY&sa. FTTSKS8EVB iuTSEALXKG*'? Ky&FOÏEWXQ. XBiSiTEVRRV JBGGDRS8UR
332 avvnsKv&nK' 'BBS2WS3RF TAGilEÙSÏUSâ YÏTSPSKDUY vsxewTGï ΥΕΤΚΥΤ.&ΧΟ
20 2 SDiiLLDfiSGR YY&Qiwr??© ESSYSHOGRE YLTTKKÏÎGRH GQBSTASFTT siplrghykk
4:2 D BSYKIRECTG iAÎiEWRTVï gmWïÆSYRK s.TrsxnsTTL YFOVEGRYSK 8
SEQ ID NO : 76 - pneumolysine , Sé r o type 2 3 E ATCC__7 0 0 6 6 9
25 1 Î4ÂKKÂVNPFI IjiWlDKKS-S 2 7KG 'JESUS;·! RFIKEWOXR DSFYVTERRK. F.SX.SXU’X'SDT
42 SVEÄ.TSOSSX· YFU&LSVVDS TLLEKKVTLL &YG.RAPMTÏS xcofusassd SFSQVEBP8R·
122 gsyRöKvtmt LAKRKÖ2YU0 VNUVRASKOY SKXIAHSMEO LKYKFGSFFE K2UNSLD2 BF
23 2 K3VHS2EE0I ÖXYKFKQXYY ÏVSYiîAVKi-il SDYîODT'XTV EDLRiQRiSIiS'Ä SREP.YYXSSY
.24 2 ÄYÖKtYYSKG EPTSKSSEVE AAEEsninév IVAi-OXS.WKO XLDïïTEVFAV XS*3UBRS3G<A
3Ö1 S.VYTGKYDÙV ESiïÔSSSRE TASKFisms iTTSFXRÜKY Y.ÀÏFQMSY&Y VETRWAYRR
142 SDSLSDBSGA 2YATYY2TÏÏD SLSÎÔSUGEE YLTKK&WGRî-ï ÖQDiTÄHEÄ’i 3 X EU.KG.HYm·;
30 422: 2SVKTRECTG LAïïSWESin' Αί'ηΖΑΐΖνΡΑ nprsnssiPTL iS-OVSGEYæîi o
164
IS.
B E2017/5427
ID NO : 77 - pneumolysine, Sérotype4 T1GR4
i. MAKKÄWDFX LÂlOJïOEiUU. me ;uo? P.PÏEEGROAR liSFYYXEÎÙlt ΡΑΐΧ3ΥΚΧ3Γΰ
1.1 3VTATHDSSL SESA21.<W&E TLLEKKFTLX.· AVDR&RKTÏ8 .XDiiEGE-ASS.fc SmOVEDRSK
ßi SSVSS&W&X. Ϊ.ΑΑΚΑΟυΥΟΙ insWê'ÂEneo SEIEAHgllEU AE.YO'SSOFÉ ko anse î>x of
141 NSVKSGERQI Ç2VKFKÔÎ Y Y TVSVBAVKNF SXVFSIYXVTV EDARSRS.T3A ΕΡ.Ρ2.ΎΥ 23 ;SY
241 AS SAG <722.!, EYÏ8RSOEVE Ai. FS Al· X FSV KVAPSTSWKO xaoktevfay IFSSFSSSSA
311 RWTGRVDKV E.5tXQfi<38SF YACKPSL SU S YTYSFARDKY YATFQNSTD2 VETK.VTAYRK
3 ê 2 ssi.t,i.2>hssä yVAOYYETW EAStOStSES VLTFKAÎÎDKH SSFITAHF'TY 32PAESHVKK
42 1 .LSYEIRSOYS LAKSWRTVÏ f,efx<ei.vrk P.TXS2?5ST’1'L YE'ÛVSDKVSÎÏ S
SEQ ID NO : 78 ~ pneumolysine , SerotypeS 70585
l nRRRAVKRFx LAi-SEïDEESÎ.· LOK0SE3IÊN RFIEFSKOLF EsSFWXSSEK RSLSXYJ'X'SIÜ
't· X 3YTATNDSR.1: Y S 2 ALL ΥΥ1Έ TAOERK-wnn AVDPAPKTYS 10tS‘i3L.A33F SEraVEOPAÏs
121 S3YÀSAVK&X. LÄMKKCD'Y Sl YNKTRAWOX' .SKITAHS.KEÛ. XiSVKFGSßFB RTSK3X.FX DE
181 K3VHSSERQI ΐσνκΕκςΐΥϊ TVSVSAVRNE ORVFQETYYY EOARORGISA EPP.FVYXFFV
?4 : AY2-R2’’20r.L ET Ti. EFFETS. AAFgATIKSY rvAPGiewro IL.DÎ4ÉEVKAY ÏLGSDPSSSA
: ; pnn’TGRV&MV EPAX2ES3AF FAFKFSFO13 YTYSEl-FCKY VAX FSPSTRY VE? KYïAX'pjS
2 Ά l-DAIACHi-SÄ TTASTYFTKK BASXOHÖSKE VLTPISAWRÎÏ OaCLtAHETT 32PAÎ12RYRR
e:,. ASYKIRE 7T2! IMrWPin EKFFAFtVRK it x a peur t r YS.iYSFFVSY S:
SEQ ID NO : 79 - pneumolysine , Sérotypel4_JJÂ
1 UAKKAYNDFl LAMK-WKKEä. AOKQSSSIEN RFXRËSKQAP OF.FVVXEAKK P,.3ASTiîT3En
ei SVFÄFKFGRX,- 2'PGALXYVPE ÏLLEKKST.ÎYA IvpRAEM-'Yi! 12OSGFÄ33D· SFASVEFF3K
121 SSVPSAYKCr LARKKOOTsa vwiparaioY FKX'tABSiæO LKYRFOgôFE KTSKSiDlOF
1S1 KSWSGEROI ΟΙΥΚΕΚΟΧΥ'Χ' tvsydavwp SEVFOFFVTV SOLKORSIRA ERFAVÏXSSV
241 A.YSROYyARF E1TSK?DEVE AAFEALIKSY KVÄPO-TEWÖ .iaskéevsav xr semas sa
202 AYYTSFY·« k Finies spy YAOHPSFFIS yffsfarow YAFFONSTOY VETiYYTAi'ER
3S1 SDALL-ÖKSGÄ ï'YAOYl 2TSK ELSYr-fHQöKE YLTEEAyimn SODATAHFOT S 2 PïiRSîi YAK
422 asykirecys SA5425ÏWRT7Ï gKFSARAVRR RTÎ3XKSTTL VPQVEDKVSN R
SEQ TD NO : SO - pneumolysine , sérotypel 1NV1Ö4
1 κακκαλοιογχ χαμνυ&κκκα ATKlpESlSN 'RFIKBSXOLP E;SFYY1ESF.E RsiiSTMTori
Sl SYTAYNSSRi YlOlllYVPF TrAERKSTAL· AYORARMTYS ΧΕΑΡ«ΑΑ3Υ£? SEAQVSÔPSN
121 SSVRSAVÎÏDL i mmm sa Wp ARMOY SRXTABSKSO LRYRFGSSEE EYSKSLFXDE
141 KSYKFSERl’I QrWFÉCIYY TV'3VDAVE4<e «BVFOFTVTV SEAA0RS13.A S P. PAY Y ISF T
241 AYGRQWAFA FFFSRilOBVS AAFFAtiROV AYÄRQTEWKO· IFPKT.SYX'AY ÏLSSFPSSSA
301 RWTöKYSiiV EéLIOEUSAF ÏMBPSIPIS YTTSEAK&W VAYFQKgFOï VSTEA'TAX'AK
341 SFALAOÖSSA ΥΤΑΙΥΥΧΥΚΚ EASYO8QSKE ylt&e&îîcrn SOtXtAHFTY F IF..RS BV PR
421 ASYRIRECFS 1„YSGÎO: EKESARAYRR STISXKSETF YPöVSFKVSK m
165
B E2017/5427
SEQ ID NO : 81 - pneumo lysine, sérofcypel'lA AP200
1 24ANEAVB&F2 XAJäKYBKKKB Ï..TH11SSIEÏJ SFIKEGN«IiP DSEYVXERRK RSASWtS.DX
6 2. SWAWDSEX YPGABLWBS mENSlTLX- AYGRAS-iiTYO 1BXPÖBAS8B- sYi-ovios-it?
221 SSVRSAVSiÄ, kA&KKSBY'SQ 'VWVPARMQY SKXTAHSMEO BKVKFSSBEE RïStîSXBXBF
IS 2 KSVHSSE&QX 12 01721.0-2 Ï Y tvsvdavekp SBVFQ EiTVTY SSERCRGXSA ERPBVYXS'SV
211 AYGRO’V'i'LAX ElllïOOOËUE AÄFEAL2RGV KYiPöeswKö 1XBSTEVEAV 2XGGBPS8GA
Sil gVyTGRVDMY Siu, 1001332' TADHPGXPÎ3 ÏÏUrUÏSV 131203 Oil· Y VETKVTÄYSN
361 YU. LOfiS 03 yvaoyy iim: EhSYDHOGRE VljiPRAKßRN SÇÜX'PAHFTT SIPXRGRVRK
42 2 BSVKXRESTS U8SWVÏ ERT BXFXVRK RT18XWGTÏ-B ye1vo;»o.y:y D
SEQ ID NO : 82 -- pneumolysine, sérotypel9F G54
MÄKSAV5WFI .LÄMKXE-KOX XTESGSSIES RFIKESNöl.F DSFYVXERKX' RSDSTMTSCX
Si 3YYAYÄ0.SRL YFÔAIÆVYBE- ΤΙΧΕΝίΤΡΥΧΧ AVDRÄP14TY8 IBLSGXÄSSÜSFLOVEßEäjS 121 SEYRGSYSrai! XARWKiXYGQ VHNVEARUQX EEIXAHSUEQ- XEVEFGSD.FBRTGÎÎ8XBX0F
181 WVKSGE&ÇX CXWFKÖXYY -TVSVÇÂVKMP GDVFQDWTV SDLXGRSXSAERFLYYXSSV 242 ÄYGRCVY2RX ETTSESBEVE -AAFEADXKöV KVAPQTSWKQ. XXBNTEVEAVIXGiSBP^SGA 301 RTOOTW E.BDXGBS3RF TÄBaPGXPXS 'YTT8FBRBHV VATFûMSXBtVETRVTAYRtî 361 ÖBX»XI>ÜHS8A YVÄBXXXSRN SL3YDHQGKE V2,TFEAWBRK •GqBXTARÏ'î’ÏSXPDRSSîVRK
4.22 X3VKIRE0Y3 IÄWSW8BTO EKTSIFLVRK RÏXS'XWm, YPBVEBRYEÎJB
SEQ ID NO : 83 ~ pneumolysine, Sérotype3 OXC141 ieSSAWOFI liU-iR'YDKKRi, MHwGEEIEN RFXKEGKQXP BEFYVXERO, RSBSWTäDl 62 -SVTÄTSBSRI, YFSAhXyVB® YLLEKKSTll AVBRÄPMTYS XDXRGXÄSSPSmjVEBPStt
2 SSVRGÄVKBX 1ÄRWHQBYGÖ WWPÄRMQY EEITÄHSKEQ 2ÄVKFGSBFSRTGMS2<B£BE 2.0 10 2 NIVSXSSERGI. QXVBFK.QÏŸY TVSVDAVKNE· GDVFQBTVTV SDXE0RGX3AER&XVYÏ33V .242 AYGRSVYIYX ÈTTEEEBÊVS AAFEAÏ.IEGV EVAPOXEWKO XLBUTEVEAY'XAGGBPSSGA 301 RVYTGKVßMV EßhlCEGSSF FABKPSIFXS 2TÏ8FLF.PÏ3V VA$FQSSTß?XVETKVT&l'RK 361 SDXUXDHSGA YVAGYIITW ELSYDHGGKE VLÏE'KliîDPïï G0r>LYAHFTX31FiKSNVRK 42 2 SSVEÎRECXG KAKESWRYYY 'BKWXPXYEK RXXÎ150GTYL YRQVEDKVSKÜ
SEQ ID NO : 84 - pneumolysine, sérotypel2F CDC0288-04
Î4ANKAVKBEX WWÏUKKKÎ. ÎÆKÇGSSIEN RFIKSGEOXP DEFWXERKK RSASTSTS Dï ' 61 SVT.ÂTfR?SRî< Y'EGAiiWÔS ÿttBM» ÂVBRAP14FYS XBXPGBASSB Sï'W»ES£‘3®i
22 SSVRSAWBS XAE^KCBYGU VNfJVp&RKQx' EKITASSMEC· BKYRFGSBFE EESNSIsDXBF· 1S1 NSVKSGEfOQX OXWFEQXYY WSYBAVRKP SDYFQßTVTV EB2.KQRGX3A ËRRXVYÎÔÔV 24.2 AïGRÜVïlRX El'l'gKlÖEVS ääSEäIIKOV KVAPC-TSWKû XISÎÏÏEVRAV XBGGBPSSSA» 301 RWTGK.VD1ÎY EUXÏQEGSSF IABHPGSPXS YWéF£>RDÜV VATECNSYDY VETRVTAYSjR in υ 362. ermiADFiSiÄ YVAQYYITKR ELSYEHGGKE YXTPK&WßR» QQBBXAMF'XX M.PBKGWVSi« 42.1 GSVEIREOYG r-AmWRTYF· 2KT0XPX.VRR OXSXRGTTB YPOVEBEVEB B
166
B E2017/5427
SEQ ID NO
- pneumolysine, SérotypelSA CDC3059-06
I ÎI&KKAWDFï 'liÂKKXCKRRL ï,?HO!3£.SrSN RFÎilElWl-l KmiEPM’. RSI.3EÏT3DX
62 yrsäxxwfs YriEwsei'L avgraputys IPPPULXCeR srievEreeu
121 SSVRSrVtXDX L-RKKROPYGO VSNVFRRMGY SniTAHSMSO 1F.VF.F3SPFE ÎViUnSXDICF
2 6 i K3VK8GEKQÏ Q1VKFEQ ΪΠ ÏVSVSÂVRIIF ervFOinne’v EDLKORGÄSl. ERPLVYÎ33V
241 ÂYSRQVim ÊllSKSOEVS AâFEAIîïKîSV nvAPQiswKo llDSTEVillV 2L RXieSSSÄ
361 wssw ExmxçEessF YR&WGXF1S YïŸsriiRCEV vayforsiby vefevy&yrjs
261 eriaiôKsc.-. YVR0YYÏ1W iaeexsQGOE VtîMâSM ÖGPX’I’ÄHFFI aieim.sKVRN
421 lÔÇÏEWRVVY 1F22L11VRK RYÏSÎSÎSICL YF6V2FKVSS 0
SEQ ID NO : 86 -· pneumolysine, SerotypelSC SP18-BS74
1 M&KK&VWDFX LänKYDKKRi, LlHOSSSIEli RS'lRSSKOlP DE ERRR Rsrsmisni
61 $VTM?M>3SU> YP6AXXV7FE ÏLÎâEtæpTLÏ, ÂvnR&PMîrYi! xfxpgxassf SFiQvsnesr-?
131 SSVKSAVisli LRKWKQùxSO VNWPÎiRUOY EKITÄHSMEO Î.SVKFGSDFS néGKsm&F
131 KSVHSBSEKOI exvKFf.oiyy Yvsv&avnsp srvnir'Tviv ssrncneisA FRFFVYISSV
241 ÄYöFÖVYIillX ElF.îKSREVE AÂFE&XUÏ6SV avn-QT£w.e ximi'YEVRÄV 226262663=,
Sil- RWFöKVDW Eix.u'cresRF WHMcflS yeiem’iswv vatfcixfffy VSYKVTÄxSJi
le _ emLiössei YVA1YY12' WK EXSYBHCSKS Vl.T6KÄif7£?RR GO&X!&8 Elfi SlPXieSHVRN
421 XSVElREClö 1 ΛΪ. WRTVY sReeasevEii RIXSIKGYYI. YPÖVEOEVSe 0
SEQ ID NO : 87 - séquence de protéine pneumolysine de type sauvage (avec une méthionine N-terminale) :2Q
MAHKRVKRFXL ÀMSYôFFKll FKÖSESYSKR ΐ’ΪΕ£·3Ν01.Ρ1> EF7VÎSRKKR 62SFÎÎT6 ms
VTÄTKIiSRXY îcalxvvrst XXENKRTLIA YBEÄlliTYSI 2Ί· Ρ 2ΧΛ.? 326 FLl^FllSnS
SVRGÄVKßlil» IX'ÄHQBY FOV WZR&RMÖYS R2XÂHSSF2L· •K.VKFS3E»FEK 6X4 ΎΓΊ- FK
SVHSSGSFQIQ IVRFRQSYYY VSVC& VKNSG DVPG&ÏVÏVE BXKQRiSISAE Ri lYU'XSail
YÖRGVxXKFE TY3K5OEVER afeaxikgvf ’COPY EWKQl X. tOTEWU YG 3YX 3,.
•WTSKVCWE, S&IQE‘SSRS”T ä&HRSXFyS'x YÜ-S'F-ÛSESÎW AYF 33S-ri/V YUXRÎ5 3
jDXIXÔtt.?«ÀÏ VÄQYxXXWB XSVpHÖSKEF IÆ&KÂWBFW pßJjTÄHFx'SS la νΚτΚ'-ΠΧ
SVi\IRFCTC=L· ÄW E Sï VÎRYVsEKï'ÉÎ, PXVRRRYΣSî SÎGTYXY i?CVS BKVEND
SEQ ID NQ : 88 - séquence de pneumolysine (sans méth ί ο n in e N-1 e rmi naIe)
167
B E2017/5427 äSksvndfi e VTATKBSÎitï SÿftGAWt'ÎÆ SVHSGESQXQ YößaVYLi'lLE WT ÇKV'DKV E CLLiEiiSGAY
SSTURSCTÖt
ÄtmVX'KEr.LL «raVôBSIEÜÏR FXKS «'5G1-Ï& 2£WÏ£RKER· SASESYSCiS.
PGALLVYSET LLENrtF’rX.LA Vr.RAPl-ίΤΥ 3 X
AKÎÎKÇX-Ï GQV NMVFARKvYE RXTAK3MF.-iI<
XVK'FKÛXïï'T
STi’KSDfiVEA
SLIUEGEAFT
VAGYYXWKE
Vv’VX'A VKM£ G DVFOOTVTVE ÄFEALIKG-VF. VARQT EKKQX AX>HFG.LS-ISY TV? PLSDÎXW
DLÎ-GLAS/ÏD»
KVSFGSX>FSK DAKQAGÏ SAE LCiiTEVKAYI .-•.t? OBSTEYY
X.SÏI-HQGKBV Χ>ΥΪ>Κ&ΐϊΣ5δΜ·3 GEATMETES
AW fi 1 TÏA 'T’FI £L ΕχΑ X ., ib^î.E- rrFtsD
FLC'VSDFSnS
TGM3LX-TD?K
RFLVTT33VÄ
X.GGDÏ-S5GAR
B’XEYÏAÏRÎJG
XFLKGKVRNI·
SEQ ID NO : 89 - wfdK d’0167 d’Ë, coli
KTVXAIVS'TFNRCALLKKVLKSLLSOS ΙΑΙΝΕΙ T. î ï DKCSNÖIT
ÂKWHÜFSEVODIFYYYKTGDMIGGÂGGFYOGFKXAEGLÏYûYIWX.î-iDDDIIPEPÜCL ΕΕΙΙΙΧΊκ Y ^X'Oi VF Y X “ X W AFIS?'SYNLHY-r HHETWYKEVIbr X-i'kO RErniÄGVTFESPLISKSWNKVGYPMP&FFIFNbDIDYSLRTRSKGFSIFdlvpARÄ TRId.:KKKût<NdLKSWKGYFi.4LPNHYYTLRNÏ!SENELYKΫ'<.VïLIMFïYFÛKSŸFSFÔY KE&KWÎFSFKDS FSLKtîSKRFRP 15 SEQ ID NQ : 90 - wbeY d’0.2.8 d’E. coli
Mb X «ï I AIV I VI YMRCNELMEMIb S ÎEMMS VERS X Y Y VIWN S b W Yb SW TE CD S ROI KX KYHNYGYNAGGÄGGYÄ X b S OA YS «m X WIADDS X V IDEE blSNAMEYDEGRY I IQRMRYKMDG3CÄE X S AI Qï c<îl SNPFYIiRPKÂEf VON î O KNlISYDIOG X PFEGRI .IPRE^/FNVIGEPDERFFI.FNßßID.FÄIRÄQR&GFS IKC ISM ÀKlVRRIPWQgVALKTWÎG.Y.F^B^NYFRVOKVYSISP^XVLRXLIVFdl.ÀIGKSiVR
MEINS iSXiICGAERDGÇbOKFFdiTSOER
SEQ ID NO : 91 - wzg dü CP4 de S. pneumoniae
Μ3ΑΡ.Υϊ·.Κ3Ε3οΥ,νθ3νΜΐνχ.Ε·τΐ'?ΙΙΐνΐ·ΕΙΙΕΙΙΕΚΥΝΧΙΑΡ
RYLNDWI AEVLIVAAVGI II IX W&BOT X FI LVPS HVb SVS I FA YQD FTOIWR ,5 OÂYSÎsYSSV3ISVAeiA.DbEIEMV'rGIYSVI»TG'ÂNNENIbKIIAGIKS3QNYWT
WQS SS Y I AA YPb I1 AGE I RAI VOS V YEN I I ES E Y P D Y A SKI KEI YiKG Y TKKVSA P 'KT b K3 OS ΕΝ X Y VS GΊ DT YG RI-S SVS RS ÖVNI ÎMIVNRI TKE.I II.'T T IRR IA YV P X Aü G GMDGXnSXiTK&GIYGVOSSXHILSKIYiGX^ilNYYVRLNPTSYEKIXniLGGIEVYNEQ EFTÄHSIS3EY’Y'FAöEVKL.RSSCALGYVRBRYSLÄrGIRDRGRHQGKVIYAlLQKIiTST YAXIVATYSTIXirSIObSAGTMMRISIMIMiVKAQLE3GGEY'KVN3CIiIKGl!bRI-i.DIP3Y
0 AMRRSNL YVMEI SYS 81AWKAAIO:PVMEGR
SEQ ID NO wzh du CP4 de pneumoniae
168
B E2017/5427
MIDIH 3 HTVFÔVDDG FR.SRÊBSKÄDDREb Y ROG VRY1Y STSHRF,
EGMEETRES Kl ÀBNFDQ VS.E T ARSVÄS DRV IR Y © & E X Y Y Y RDVRLKLE RRR X PTLND 3 RYRLISFSWY F YRDI HS RESKI RMI® II PVIRK I.E SYDÄEE NREKRWSL X DM©C Y Y QVNSSHVRRFBRFGERYRFÄKFÄCSYFREODRWVT&S'ÜMKNRDGRFFHFIRBXYDLVF î<n r:r\PF' rno^Li
SEQ ID NO : 93 - wzd du CP4 de S. pneumoniae MMES OKI x E l D VFQ R VR 3 WKRKRMX X X V& R V I G RG&FRY ©I El
WIPE YT 3 T TR X Y WSRK 00 DKFGR TNGDROR ST Y LVRD Y RE 11 Yb 0 D VR ES V VS D ERE
DLTF.^LRMKTRVTVFVDTRIXE?TSVNSRVFS'B&SRXäNBTRB\7x^äGKTXSITRVSDV
Y Y RE BÄRFÄ X s RS S F NIKSNIRL GF LRRV X ©IbVIVRH X, E EL DIKYKRÉ £ DIS NT LOM
TLRGVVFNLGKEK
SEQ ID NO : 94 ·- wzé du CP4 de S. pneumoniae
MF I LS I AO KRL-S FIKERB E Y Y NA ECINIQE 3 © DKLKY X. S VIS W ή fc DGEÛSITISINIRKbSRKASYKILEIDdÜIKNbVJIRGVEKSRSKIIGLVSEESSIADE .3 K ©LC D TN I EN R F WO3 G S VS FN PT AL L© S RK FN DM IS TERRYFRY X T X. DT FF IG XVI DARXITOKeDRSIEYYAI©EANiYRDTORAKOOLKOE©î<LEL©WENKLDÏSVNRYGVY
SEQ, ID NO : 95 - weil du GP4 de S. pneumoniae
AÎKNGNR I y s WRR FM Y GX X RRLG D X R LSL IG X11R C F VEUXI RI R.
IELDDE©W XFXOKRFGXHSEYS YI LEFRSMKXDRFRKVAÉRNRYKEEOKITKV3&FL RET S L DSL F OR EK î E WNMS î VO ERRA© ï NES DE R A SKDK YSRKDI L F ©LT ÖWRO TNG RDYLSY^NKYERDSYin/KHRbRYYiDXROIVKTIFYVRKRKSIVSÖSÖKRES
SEQ ID NO 96 - weij du CP4 de S. pneumoniae
169
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KKXLFVGOKYEgEgERLSDIGEDLVVKSHEVS'VLAGXENYFEGK rYLoY'VEyTKKB.nELIESYmVY'nSYGIEREK.:SWFRLLNY'FS2’A2ESILiWLL«RYEGK
D<3âNFCCVFV5îQLSFWî4ÂWÂÔÎ4ÂYXJÇXYK^FÎÎFI.'YCMPVWFDSLTVGGVXQ'DSÎ,ISK
7.?rY~^;T^F>*r7JSÏF'^fcl!XcEvKIT7l.11- AFXLFLSESGiVKF ^VÛIi^FÀGNI'SKÂÔNX.-ETIiKÂXS'L.XEOÎTKI.PKKraFKF/S'DâTKLLSMKÂL&HSi
ELEÎLTSFYSSRgLESRgEFYKKSEAxMLVSiLïGDGÎVSVTIEC^i-QEYGiÂAGEgJXSÂl
Ε&ΕΑΕΐΐνΕΕΑΚΟβΥν3ΕΕνηνκρΕΑΚΝΐηΚΕΕΚΕ31ΪΟΚ0ΕΕΕΡΚΕ&νονΥΕΝΉΕδϊ8Ε
GPRLELETCLERESRKE
SEQ ID NO : 9-7 - wciK du CP4 de S. pneumoniae θ MRVL FI LE DNI V LT F YFNFYRELLEKE SI S YEVI YNLKNI EE 11
I ESNY YR2 E FS GK.GKLS XI LSYVKFREE 2RERLRENL Y DH2L ELKS 2 VS FI L VGELEE SFKNRYiyEIFiLYSYEKELvYRLyGKQLVRNFLWXVSSEGYKFELERSSYFITHNEg NMIELÔVKÛIiRKNS'lFPIQX.SYIGLIRFÔSÔNKXIIDFrXNDSXFQÏiKriGOÂSSL REFCQEXNÏSNVN £VDTF0&X0I'M®-FYX^^.DAVLKLYS5?KTFLEDYALSKXl.YFJtAEX. YRFIXVCEßlYMSXVSIXKÖFGWL^WDE-SSKtCXÄIYTQNX.BRRQi.ISNCWrMDR 15 IGLEXGKTE2ELEKR2LSLDKENL
SEQ ID NO : 98 - WoiE du CP4 de S. pneumoniae MIK’ZSÉEFTILDSGGGESE.LENYYSKIGRKRIQEEELVgGESSG
FLEERÎi'îFEiGlÎRVÏKVPLLRRE.PÎjHOFLELÂÂIIIXRSDYÎHVHOKîilESÂÏG.LiLSKI
0 I iSCSI VI ï H S EMA YVGEN3 FQRYLEKLVI2 EVE! EÄTOTEAC SE DSAEïïL YSSKâ VSD
GKLE 2 2 FNÄ iöLKKYprüd EVPEKGREELGVS NKFVL GN IÄRLE DQKiiQS YL FNVLKE LILI ÉgEVILLLVGNGE DE CXLKpXELELNLS gYVLFLGRRT D 2 g DLL SiGSEVELSE S SY EGEEVSLYEAÛAS GLEL L G S DI VIQ E VD VTKN 2 S XL F INES S VL ER SDKVL 3 L T 3 Ë E CNR FE XNN S RIE G L Y' D ï GY CAS KL LW.Y QENGV2 KE I
G) £SEQ ID NO : 99 -- wzy du CP4 de S. pneumoniae
170
B E2017/5427 mTKX'ICRVTLVÏLSÈXFA.FCYLFKTLÔimNKSFLISKYVRSIF
T WVS FL ΣIFQ X Wîï LQKV 3 X Y Ώ S3 XGÎXL Σ Û3 Y BW FS L ï .FNBŸMSFCTT L LW 3 F g 'K F
XKNSELFK8YXFTIWILFC'YSYfSXLFFXSpSKVKi'8S.SV0HYSSS&SKILY'NASRIt»T
SV'SFlSKVIT&SKTVLAVRAANSXSAYSEAASS'GTinLLSVLMLPSX'FSLFySÖKLS-S.
VI KR ï IF dVALFY LÏLÎ Mï LT 03 SRI Q VFS XLALVLVY TQ 3 LS X TF S KK&VLVFL ï VT 5
VFLLNVLWX RSSRFDLKTISï YLSDSFS -SLDFVRNJ L'SEVFSS SÔLT3LTVASAVT V VP 3 3 X P XS XGMX FLRT XL S X SP X SÏ?LVSSFFDKA 3 LT WINRFL SL F VSB S SVEELSt? USGY X SS VFïi’S FVL S X S3SÎ?RLN FRÄFGT SKI 3KV X X S3 VX S Q L LLLVP.3S 3 î D VXM F XNYSLINXSXSPLLKK
SEQ ID NO : 100 - wciM du CP4 de S. pneumoniae MVKR X1XX KGATLY GS B N Y S D XL X SS I V PPL LSS KGX S VS FY N P S OFFOM XX KKYRQKQS FXKKQÂ DA X L Y X PGGYFGF SHÄRFR W LIQ F&RFL P L SX WÄ G YFKKPXGVLSXSLGÏ-NUPSLMHXSXKPXX.NHAdFXSXG>DPE3SDSFFL:LSFSLPXra£T FDL X X S S RL LS SETS GL CG LKREÄRDFS. X X L V K YKK S RKÄLEKFÄF 'S X S LELSNN PN Y
Y WV TS X S X L p XSDAX X Q S FRKL VPTH SC SG FKXH3 PÄSMXS X LKMVXî V VLT C KL H V S
WATCFNESVIÄXACHPSKTÄRX YS&X GFLGSÙS.3LSF33W3 XVFKLSTSKXKPX XX P S FLVLRÄR S 3 LLXL SLFLEGLVSS 3
SEQ ID NO :: 101 ~ wcx du CE4 de S. pneumoniae
MF. VÜRXS F X KNT3 S L Y X LE X V RLX F RLLTL P XLTRVLS LFAY SM
0
VIYVKAL I&YVOLVILFSFWE SäTKNIVMäCTTPSKXGRIVGSTLVEKXELS X X3 ÎLX XT X LMÎ'ÎQ IFXMFSN X LF 3 VSY LL AT VT N X Fl F DSLSRG X EKMHAVÄ X p X ï X SFX X X T X LTFTVVKGS3SXLWXPXLEGX«NLVÄ&VV3YRSLHYXSXKLSFSXLSWVSFLKE38X YFX3NFATTXFGVSTTVXSGP’YLG3GËXAF?fSX.ASÛLL.SÂAtX3X..YnPXLÎÎSLXPHPiXR TKD'WVK3.XNRXMFI'ÎT ISGVLIVLESSNGÏ LSI IGSBKYTV8AÜFLKY'L.LFAFY&8
FY 3X< IY GW P VL S AIPRVRE TT W T X LA SX VST LSLS X SX LS OMFS L VS LA X C S 3 M'S SV
VLVÎX 3RYLIYFKRRSLFVR3K
SEQ: ID NO : 102 - mnaA du CP4 de S.
pneurnonaae
171
B E2017/5427
MKKVVWPGTR EEA X-F. MO £ LVKS .LR T R KNXE X LV GVXG GSRQXÎL
POVXi DTFGIX R D:F DX. S XMRDRÔX LPDVëX G X L E GREAILE S E RE CL VLVHG D'E S X RFA
SSLXuiRYLC^EnGHVEXàGLRTXDXÏSEÎï'iESB’NRÇÂYGVLAG:YSFXEXûLSRDNLLRE
GKiXEESï?Y.irSt-M,ArDALÔT3’XOEDYTHEELEWXÔS3E,FXXiX^KKRE-NLi>£'EMMHKF
RA 2RRX X ES ï S D YM S ï E X.HMN E RVRO î AB SSL SGORR X ER X £ ELS VL CFSN FLS RS Y 5 LIL’DDS GGXQEMES LGREVLVRRDXîERESG XEAGXLRLY®ADERE îVRSFEE LLSR
D SYS Q ARS QÄ SR P YG SGXÂÇMX ADELE SE Y
SEQ ID NO : 103 - fnlA du. CP4 de S, pneumoniae
MSQP XGRTLL X X SGXG3 FGNAVL RR FL EL DVSEIRX PS EDE KEp
WRRRSrQVEVESVAGEIRFYLGDVRDDASXY/RARKGVDYVFHAAALEGYESCERFEV BÄYKTNXX.ÖXENYX»-TMX:EÄGYKOl7IdX,-S'?D?sÄAYPWÄMd^SW^^X&YAK.SRXY' NEEHXRIGV'XRi'GWLôSRGSVY’ELNXFdÏROGRALTXLSESRXRF'mîXLSEÂYCL’XL FAFEFGRSGDXLYQE.AEACXXE'ZLAKAVSEXFASRQDXRILGXRHGSRRXSGLLXRSS CÄNÄXDLGLEXRVRSLRE.KLNX'LRï EÏ2DGSXKRRLLXSFNSRRXDLEiLYEOinKRRLLE LEE X QTAX RDMYADFER
SEQ ID NO : 104 ~ fnlB du CP 4 de S. pneumoniae MI RE X L X TGAEGFVGKN L X CI LE ALKDGR SRI RENLS X GE X Fû Y DR DX D EX LL DE Y C RKAD FVFKLAGVRRDGR PDSPREGKYGFS SRL.L E XLSRXEEXCE V LL3S3XdÂSLEGRE'Sïi3X'XG0SRLXiGSEL£’EEXGRÉ.XG&?VLVYRFEMLïGmcREKY ? θ RSAYAX FCYNL AH CL EX QYSÏD ES YS DELL Y X D D L XQECLX AL £ GKE HRCKL DGLG X L F
SESGRYCYVEX'IHEAILGEIVSLLETEKEÔEDSLVKESIRCé'SRîUXKLY'SÏYLSYLEV DKFKF ELERRL DSRG S FIS ALEX SK X GQP S W X S KEG X XEGQHKRK S KWS F RK WS G R ΑΧ, X OSRR X GL DSRGQE Y £ X LR FE VSSCKX Έ AI SRI EG SAHN I IRL S CT SKL X T 7KKAM S S FCDEHECT F FE QYE K 25 SEQ ID NO ; 105 - fnlC du CP4 de S. pneumoniae
17:2B E2017/5427
K LEGE Y § pX K FRENGRLFL X, IX VG IR SE X: IRLS SV Il KG RE YE J>V>XXiÄH2?SÖNrE>XNLNGXrF0WS«I.ß'P^0VXMrfÄVÖJ>DLGA:TVsS^IXNTSyKiW'SlK.
P CALL X L SPINS G L S&I AAERL HI RIEHMEAGERCEES CL PEE INRRIVPVIS LVNLÄ Y GEH&REYL HE C SL RESRIY VTÖ S PRAEVL HER L SA IS SS PX HS REGLEES S YILLS A H.ESERXDTPEHFLYH.'ETAXRPIAS-EYRMPIX>YSCHPRSEKRX..Q:ESGFELEEP.VXPHEP
L
L G FK PIS CL PNR APV WS PSG TL PS S3 SSE T S p GY p E P AVCI RTp1ER p£ s L DE AG FI LAS ILSE 8 LLGAVETAVSLAP PE PESL EVE D Y VE BR V8IRVVEI IPS Y IGIVRE ï WE
FïS
SEQ ID NO : 106 ~ wzg du CP12F de S. pneumoniae
1Φ HL IMSRRESK3 RS PE VERS VN X VAL TÜLL LYCELL FL X FRY EI
LAERYLRLWIALVLLVALVGLLLIIYKKAEEFIXELLVESXLVSSVSLFAVOGSVGL IRR.LNAISHYSEY’SISVAVLAPSDIENTIIQLISVIAFICTONSNXQELLÎiPIESSP>NI DL IVPPS S S YLAAYE GLIAGEIRAIVLNSVESÉIXESS ESPYAS ElEEIYIEGFIERV SÂPKiSESQSEKIYVSGXLiYGSGSSŸSRSPWÏPRTVERPiERILLLITPRDAYVPi
ADGGNRpEEELIHÄGXYGVPSSIHILEHLYGVDINYYVRLNSISFLEHIPLLGGVDVH
ΝΕΡΕΡ®ΑΙΗΙΚΕΗΕΡνθΝνΗΙΡ3ΕΡΑΙΟΕνΕΕΚΥ3ΕΑΡΟΡΕ0ΗΑΡ.ΝΰΡΕνΧνΑΙΡΡΕΑ I GTE ALENï Si11ES LOSSIGINMPLEΙΜΣHLVMAQLSS GGN YEVR S PELEGTGRIDL P SYAMS P ®RLYVLE X PIS S L AVVEÄA XQ PVMSG R
SEQ ID NO : 107 - w.zh du CP12F de S, pneumoniae
0 ΜΙ PI HSH I VERVE PSEE.S REE 3EALLAES YRpGVRX I VS I3 HRR
ESRlSiETS'E.SELAERSLGVREIAEEVASEGVIIAYGAEXYYTFPl’LDKLEX/SRrEILRPS RYALISFSMHiPGÄIDiHSALSErLMLGIiEVIAElERYDSLER'RSEr/VPELlPRGGYT OVRSSHVLESELEGERYEEMï/ERAQYELEPDLVHVIASEMHNLPGREPMMASâYPLVI OKYGEAEAPSLEX DMPREI VMLpLI
S
SEQ ID NO : 108 - wzd du CP12F de S. pneumoniae PmEpRilEXPVFPLFEiLWEPGILMrLLVÄLVIGAGAFAYSÄFI
VECSE YïSÏTRI YVPERPQGDESGLiNPPLpAGiSYLVEPYREX .XLSPN’/XjEEVATRLEL nXSAEILAREVpVIVSVDlRIVSLSVEPKPSEEASRXANSLREYAAEF.XXAVIRVSDV
IILEEARPAIISSSRNVGHNSLEGEFGGAXV'IVÎAVLLXELFPIRVERPEXVEPVLPX
0 PLLGWP DL PKME
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SËQ ID NO : '1-09 ~ wze du CPI2F de S:. pneumoniae
KR X X, S L S GAEL,· D BVREASBRY NALGTS LQL G S'Es DLR V F G X I S VK
QδΕδRSLISTSIARAEÄRAGY RILB XBGB X ES EVMLGVFRARDRL TGLTBELS G7TB L
BOGLCDTNLESREVXGASSVSEMBTÂLLQSXBÎE.GTMLETLREGYBDYBXVDTARVGVVI
DAAXXTGRGDASLLVTRAGELRRRBIGRAX<BGBEi7TG:RREXGWLSE.EBTSVBRYGSY
GRYGRK
SEQ I'D NO : 110 - wciC du OP3:3F de S, pneumoniae
ΜΕνΧΧΙΰΟΧΚ54ΚΒ.Τ(3.ΒδΒΑΧΝΒΕΕθΥ4:·δ15ΕΑΤΕΥ!'ΐΒΧηΐΤΝί5Ε1ΐ
EL s ? L Fû X L X S DTGVYYET RAG S VAIS X RB G L EL ERMX :MKPJŒ.X VTRE HN SAEGNVME 1 θ CHS X LMX XRRXLYGRRDBX rLLGSR^RX.MFqQ.X.RXXcEsSF.FRL XERGVB3YLEIBKNSL
NRRM G DL R X lî X L R FS NM X ES KG YR X LL EVARKKVGDEBY H E Y F S GREGBNN LRT RF L R E X YSMNNVT YLBGVYGS BRKRLLGEMK YB'YLES YYKDSTL FI GMLEAMANGL Y X X VS D VÖVV3EVIRRBTÄSL XEMXMEETADSI XEXXSGIGSRBNELBFNVGKYRGBLLNERX Q
4*4x5 X. i AJxSIr
SEQ ID NO : 111 -· wciD du CP33F de S. pneumoniae
KIRBTIiTGRXLIVX’VESYliAEliYLGRTMELXBSAKNXSR’XELLX VS DG STB RT EE L ARD EBBE YS δ XVRVX S KE NG SB S G &VN&G I RMAVGN Y EK WDADB M VSTN RLS BL I VEL SB VBVBGVL S PL OF. X EVNYRGD X SRSEECNERS GVRNEVI Y 3 ABF F Y GR X KG I VSMH S ITVRVGLB QFKN X R LS E KMFY VERS Y X VYKL R YVKKVVL· ELK SX Y
RYRLGIETOSISMäSYXKNBBMHKGVIYRLVBFYNGMEGSäVLRBITMBLILNLIKBQ RII YFliLSKi:£;XRNSEGEBFBÎ'rRLXKE(GPXKRIRLYEEXGAVKYXRERVExYEX,GIRR
SEQ ID NO : 112 - wc±E du CP33F de S, pneumoniae
MARX GRVXNEY WLKRS ET RA L ARSKl EE RER GR X GNYKX ENNX
ASNRYGYRHETXXSFBERBESQRLRSYNEREVGHKRXEBRKXEGMKIGGYBSÂFRBVG RT X B3 GRR.Y AE RY G Y REVELLERS X RE Y VI LP SÊ XVSEYE SG T X DEL R Y S D WRGTL L SKYGGIBXLDSTTYVBGSRRLRYLERBFYXXRAKTHERVPRYXANG^SAFGLSÔERGN XVEBELBKEHVAYEKRY BX VLBYEL L BY X X EL GY RTSDL XRN YI DRVEBSNGELEFL A BREF N G Y BERERAGVLS T TAL ERG S YRdE X NEATGTY FDRLMKSEL
SEQ ID N0 : 113 *-· weil du CP33F de S. pneumoniae
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MI SV X VF V Y MVA L Y LRFALLS LL S 0*1 Y' KD FSVIL VN L 3 S T DN S G EI CDE ï GFL YRNI EVFBRFN 3GL S FARN FGLERS RGE FIT FL L 2 DLYFS R YAL ELLIT ï$K&YDV0XVSTKGi3lT¥SKüliSKKLMAE£>yx».TVKÎLTMK£FLAAVŸŸNDEMS?VS&'?? GKLY RRDLFRT X F FKGRIYEÖLY WAEFLLK X KT VA KT DL R X LH YY ÔRQGSI VMS T F S ßRQL OFF DAXOHNEA I LESEYCGLRELLA ALKAKRVI 3SFTLS NSA FY NSANDTTKII
RTXEFLYWËVTRtÆKRXT'MKRRVQG7“L.FL.LSFKYYYRIÎ<r;EMLdRG.R.I
SEQ ID NO : 114 - wchA du CP33F de S. pneumoniae
MNGRXVRPSLAXXOEFLVXLLTYLLSAVREAEXVST'IATALYIL H Y FFFY X S VLGCL FFRRGVL I.BXVQ TL Ο X L FEAL A X S ï S NFFLE ORF ST S RRGMIY F
1.0 LTLHâLLVYVLNLFÏR?îYAKRTYPHFKGSKR1LLLTATFRVERVLORLISSNEVVGSL VAVS VL DKR D F QH LO LKWAE GË ï VNFATBFVVDËV FI MX. FS EF YM I3 B L VS Q FE TMG LLVTWLNAFLRSLÂRÎXR3LRELLAGLNYVfTFSTTFïRTSKVIAFRII0IM3ALV3LXL Ç GLV S I VL y FL I RKOGG SA X FAQ TFT GKMGRQ FT FYRFRS MO VD AË ARFKËLME ÇNTM GG GMFRVOD OFF I TRI GRF IRRT SL DEL FO FT NVLRGLMS LV 3TRF FT VOSY E HT T FE GRRRL S FKFG V TGLWGVS SRS ET KM F.DE WRLLVÄ Y X L ONT I MC IE X LOFT VKWL M
EDGAR
SEQ ID NO : 115 ~ weiß du CP33F de S. pneumoniae MERSRLIOVRTiVATHKEVKMRQONSLYLRïSVGRESRSPïGFT ê4OMTG0MÎS3LNFYYCELTGLYNA®FôîLLYHYLGLVHYRRYFTHES0GïTÎSÎL.’LFÎOX.'L
ILSRANVEÏLLSFSOXXVRRKRRYYXETLYSHYAKTLNGEHLDLARRXIEGNSSEYLS SFDKWRGRSGYMFNMFXMKîXELLODYLFNLFSILXsTMYEGMDLTDYTLFSSRLFGRV •S S L L FF VNLCGFGIT FREV F FM YMS RVEL FS EGR S FLMARFFG FJ\Y GG S F
SEQ ID NO : 116 ~ wclP d’O21 d’E. c.oli.
MRRK.LVOFC XIS L POEMERROKLRNEMÄKY OIECRVS KAX OGRE •Ii LAERYFS Xi FRISS S RMFGRG FL L F SE LGC FL S H REAL TE FL AS GRRML WLÉ DO V L R RENVRYLFEMXNSFCSS3VYIL 3O0DGLF2FSRVXM3PKSXC F .VVfVLLSTKRVLYRT OCYCVDXRGAERTLRLMSFMSFFCDDNGYXVRMARLDNVFYGGYFSEFVNLNSSSTEA
ERLFXAEF
SEQ ID NO : 117 - wcIQ d ' O? 1 d’E. coli
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KMÖL PMGMETVS11MGAWÂE E T IK BSILgîLRQ TTED EKLYIT
NDNS 3 B 3 TE H L TES IX X’ER IV XL W RN GRG VS SÄEN VG IAÄCNG KX X. M LOB SD D VWE B TRLËEGXiEILSÂGNyKVVCÉNXEVFXADVÉViKERRrRSVxTYNNMLQSEaiGNLTGI YBSTQXGKVXQQEIGKEBXLMgLTIVRRAKLVXCXQKMLÂRXXXHNIGTSSNRrTAAM SRW X TRRVLS F B L ERST, VL FEXV SVLA LAVAL
SEQ ID NO : 118 - 23206 d’0.157 d'E. coli
MMDNVLLÏGA. SGFVGIFLLB VRIÄDcVxRR LDFOOSEEXP EXCQÏOBVRB QOÄLSO&L&Ö VBiWLLÂAE HF.BBVSÏVSL Fi’CWVOGTR NVLMUBKMS TRRXIFTSSV AVYSLÎÎïViMP DBMHPHDPFN HYÖKSKWRE· EYLREWYNKA BTER3LVIIR STVXFÖS.RNR SNVWLLKBI ACSR2MMVGÄ SINYKSMAXV GK'ÎVBFTKYK LES'ZâAGYEV YNXVBKPCîLD WSIVAEVEQ SLSKKXBSfiß LEVBLiSMLSâ ÏOFDÎL3RXX Î3KKX&.VS4YR VREFC&XTOF BATRVKSVGE VÄBXTLSQGL DR1TQXEFVK ÄLMDDXIFVS S
SEQ ID NO : 119 ~ galE d’0157 d’E. coli
MRVLVVGGSG TTGSRTCVQL LQNGHTVIIL DNLŒSRR3V LFVXERLGGE.
HETEVSSDXR NTALMTSILE DH&IDTVIHF AGLRAVGESV GERLSYXDMN
VNGTLSLI3A RRAÄNVXKFI ES.SSAIWGB: QBRIFÏVESF »TGTFQSSYG
K3ELMVSQIL TDLQEAOBDW SIÄLLRYFNR VGAHRSGbMG EFRQGIPMNL
NPYIAQVAVG P.RDSLAIFGN OYRTEGGTGV RGïXHVMDLÂ DÔHWAMÊKL
ANKPGVHIYM LGAGVGNSVL DWMÄFSKÄC GK.BVNYHFAB RREGÜLBAYÎÎ
ÂÜASRADRE'B NRKVTRTLBE RAQDTWBWOB RHFQGYFD
SEQ xD NO : 120 - pglB de Campylobacter jejuni
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3D
1F9 N b GYRFAEGAG.bK F RG FSG RRbE 3 Y YG S 9 b 9 FL F Y5f b YKI F
RFSFESXIbYYgFFbSSEVVIRIXEbRREYRRREXiGFVRRbERSlANSYYRRFMGGYY CW^X.Xnxa.P^FXLFPMVRMXXKKE'FFSXXÂLPLFXGÎYÎS^ïYPESÎfTLKVÂXXOLFL IY F LF FHRRERIF Y1AV F L Y S XF XS b F RW FYGY F X F V F L FAX FALL GKRXF FV F X GI b RSVF EIF b F b3 GG Vb RIEY QbRFYIRRSDE SARLFQGFMY FRWGFIQSVENVSX9 SF RRRlSGSEIVFEFEbFGFvYibXRRRREMXREAERFXVbGFb-RXRSGXRFYIYGVRXYFAb !SFGFXbYEFKFi.FbX’K.KYYGXFYRVGIVFAFXbTbARVFIKXYRYERRYVFYGbERgXb
Si2XEÙXRRRSbYÎ~?F?ÎEXYGYRVRYYSXVRFXVDGGgRHEGRb<RFFFSFXbYR.ÜËQRRÎi EF;&RLS’zEYFE.RSFYARO‘RLILRFDTbGA.Ey>iRRYKGSN’XDXFbR.S:LSR.RbFEFbFPRF RbXYbYRRARMEbXFSFX’RSFSFXREbFGVEbKFFFFSTÂYFEbVRRGEFYbSNGWb Y EbFRS FRIGbR WEVEFIVEXE3IRG GEYRIF F X bXEAG FY F FYbRb YRX FYÄQFX b RGEFRFRSÄYVGMFFXÖFYXEHLFEXVIE3RDAK.VFRLR1
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Exemples Exemple 1
Pour étudier l'insertion de sêquons de glycosylation dans la protéine pneumolysine (PLY) de
S. pneuraoniae, nous nous sommes orientés vers une approche guidée par la structure. Nous avons identifié 52 positions cibles dans la protéine PLY, et nous avons ensuite remplacé les résidus correspondants par le séquon de glycosylation KDQNATK (SEQ ID NO : 31) par synthèse génétique. Parmi ceux-ci, 34 mutants n'ont affiché aucune expression dans E. coli {données non présentées) . Les 18' mutants de PLY restants (mutants 1,. 4, 5, 6, 10, 15, 16, 1.9, 20., 25, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 47, et 48 (tableau 1)) ont affiché une expression dans
E, coli (données non présentées), et ont été soumis à un criblage de glycosylation in vivo pour voir si ces mutants peuvent être conjugués avec le polysaccharide capsulaire 4 (CP4) de S, pneumoniae dans E. coli (voir ci-dessous).
En plus de la glycomodif ieation, nous avons détoxifié notre protéine de support PLY: pour éliminer l'activité lytique due aux propriétés de formation de pores dépendantes du cholestérol des oligomères de PLY (Tilley S.J., et ai., Cell, 22 avril 2005. ; 121(2): 2 4725 56). Plusieurs stratégies pour la détoxification de PLY ont été décrites dans la littérature, et nous avons introduit une série de mutations ponctuelles par synthèse génétique basée sur une étude rapportée par Oloo et ses collègues (Qloo E.Ö., et ai., J Biol Chem.
8 avril 2011 ; 286(14): 12133)♦ Notre version finale détoxifiée de PLY (dPLY) contenait les mutations formant
8 des ponts disulfure T65C et G293C combinées aux mutations Ä370E, W433E, 042871, et L460E.
Pour reconstituer la voie de biosynthèse du CP4 de
S. pneumoniae dans ë. cold, nous avons utilisé le
S plasmide p803 (également appelé pG'VXN6O3j contenant les gènes du CP4 entre aliA et dexB. Comme hôte d’expression·, nous avons utilisé la souche d'É,. coli stSOll, où le gène waaL est remplacé par une version optimisée pour les .codons, inductible par IPTG de la pglB de
Campylobacter jejuni (W3110 waaL : : pgiBcU0).. Nous avons transformé st8011 avec le plasmide p803, et avec le plasmide p207 (également appelé pGVXN207) exprimant 1’epimerase GalE. Pour analyser 1’occupation par la glycosylation de nos 18 routants modifiés de dPLY, nous avons en outre transformé des plasmides pEÇ415 pour coder pour ces mutants de dPLY. Les cellules transformées ont été inoculées dans une préculture TB de 5 roi compléroentée avec 10 mM de MgCla, 50 pg/ml de kanamycine, 100 pg/ml de trimëthopriroe, et 20 pg/ml de tétracycline, et les cultures ont été agitées pendant une nuit à 37 °C, Les cultures principales ont été inoculées jusqu’à une DOgoo de 0,1, développées à 37 '°C jusqu’à une DOsoô de 0,8 à 0,95, avant que les cultures soient induites avec 0,1 % d’arabinose (p/v) et 1 mM d’IPTG. 15 h après i’induction,
150 DOsoo cie chaque culture ont été récoltées et lavées avec 5 roi de NaCi à 0,9 %. Des extraits périplasmiques ont été préparés par incubation des cellules remises en suspension dans du tampon de lyse (30 mM de Irisc-HÇl, pH 8,5 ; 2 50 mM de NaCi ; 1 mM d'EDTA ; 20 mg/ml de .30 lysozyme) pendant 30 min a 4 ÖC, La glycosylation des routants de dPLY dans les extraits préparés a été analysée
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B E2017/5427 par: SOS-PAGE et analyse inununoblot en utilisant un anticorps primaire an'ti-His et un anticorps secondaire conjugué à de la HRP.
La figure 2 montre 1‘expression et l’efficacité de 5 la glycosylation des mutants- de dPLY par la PglB avecl’oligosaccharide C-P4 - Les mutants testés ici codent pour les mutants de dPLY 1, 4, 3, 6,z lû, 15, 16, 19, 20, 25, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 47, et 48. L'acide aminé de PLY qui a été remplacé par ie séquon de glycosylation -RDQNATE- (SEQ LD NÖ : 31) est indiqué audessus de chaque colonne. La glycosylation entraîne un décalage de la mobilité par rapport au poids moléculaire supérieur et peut être observée sous la forme d’un profil de type échelle. D’après la figure .2, il est. évident que les mutants de dPLY 4 (remplacement de Q24) , 5 (remplacement de S27), 6 (remplacement de E29), 47 (remplacement de 1.431), et. 48 (remplacement de E434) sont les substrats les plus efficaces pour la glycosylation avec le CP4... Les mutations 4, 5:, et 6 sont localisées dans la boucle N-terminaie (A12 à K34} , tandis que les mutations 47 et 48 sont localisées dans la boucle courte C-terminale {E427 à V439). La position exacte de ces mutations au sein de la structure de PLY est. indiquée dans le tableau .1 ci-dessous en référence aux positions des acides aminés, de SEQ ID NO : 1,
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Tableau 1
Sites de glycosylation introduits dans la dPLY (pGVXN19'7 9) par inutagenèse dirigée
1D du plasmide 1D de la mutation Echange d’aa au sein de dPLY
pGVXN 1979 -
pGVXN 2193 mut 1 K4 {-»KDQNÄTK}
pGVXN 2196 mu t 4 Q24 (-->KDQNATK)
pGVXN 2197 mut 5 S27 ftKDQNATK)
pGVXN 2198 mut 6 E29 hdWQNATE;
pGVXN 2202 Jinuir 10 i S 68 (-jKDQNâTK)
pGVXN 2207 mut 15 3109 (-vKDQNATK)
pGVXN 2208 mut 16 LU. 3 ftKDQNATK)
pGVXN 2211 mut 19 Q140 ftKDQWATK)
pGVXN 2212 mut 2 0 PI 4 5 (->KDQNATK)
pGVXN 2217 mut 2 5 A20 6 L.,kDQN7\TK]
pGVXN 2223 mut 31 K271 {-XOQNATK)
pGVXN 2224 mut 32 K279 ftKDQNATK)
pGVXN 2225 mut 33 P2.96 (--sKDQNÂTK)
pGVXN 2226 mut 34 R3Ö1 (VKDQNATK)
pGVXN 2227 mut 35 G305 ftKDQNATR)
pGVXN 2229 mut 37 P325 (->KDQNATK)
pGVXN 223.9 mut 4 7 L431 (~>KDQNATK)
pGVXN 2240 mut 4 8 E434 (-4KDQNÄTK)
Exemple 2 - Clonage moléculaireet synthèse de plasmides d'expression codant pour un ORF pourune pneumolysine détox ί fiée (dPLY) avec un marqueur hexa-histidine (Hiss) et une séquence signa1 (Pe2 B-ss) pour une translocateon péri, pi a smi g ue
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Pour fournir dans des cellules d'E. coli, une protéine de support qui abrite un signal de translocation pour une expression périplasmique, un cadre de lecture ouvert (ORF) optimisé pour l'usage des codons (pour une expression dans E. coli) codant pour la pneumolysine détoxifiée (dPLY) de S. pneumoniae abritant 5 mutations détoxifiantes (G293V, A370E, C428A, W433E, et L460E) et contenant un marqueur hexa-histidine (His6) a été synthétisé et cloné dans le cadre avec 1 ' ORF de la séquence signal issu du précurseur de la pectase lyase 2 de P. carotovorum (PelB-ss) . L ' ORF synthétisé (peiBssdPLYftise) (SEQ ID NO : 32) flanqué de sites de restriction uniques pour Ndel et Xmal a été cloné dans les sites de restriction Ndel and Xmal de pGVXN1184 (pEC415-Kan) produisant le plasmide pGVXN1979. Pour estimer la sécrétion périplasmique, E. coli StGVXN4274 (W3110 AaraBAD) a été transformé avec pGVXN1979 et les transformants ont été sélectionnés sur des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine [50 qg/ml] pour une croissance pendant une nuit à 37 °C et utilisés pour inoculer une préculture liquide en milieu LB contenant de la kanamycine [50 qg/ml]. La préculture a été utilisée pour inoculer une culture principale en milieu TBdev de 100 ml complémentée avec du MgCl2 [10 mM] et de la kanamycine [50 qg/ml] pour atteindre une DCGoonm de 0,1. L'expression de peie-ssdPLYhîs6 a été induite à DCGoonm 0,68 avec 0,1 % d'arabinose. Après une expression pendant une nuit, les équivalents de DCGoonm ont été récoltés et soumis à un enrichissement de l'extrait périplasmique. 2 équivalents de DCGoonm de l'extrait périplasmique (EPP) ont été chargés sur une SDS-PAGE (NuPAGE à 4 à 12 %) et
182
BE2017/5427 analysés par Western blot (voir la figure 4) en utilisant un anticorps anti-His (Penta-His Antibody, Quiagen) .
Exemple 3 - Synthèses de plasmides d'expression codant pour un ORF pour une pneumolysine détoxifiée (dPLY) avec cinq mutations détoxifiantes, un site de glycosylation, un marqueur hexa-histidine (Hiss) et une séquence signal (PelBss) pour une translocation périplasmique
Pour fournir dans des cellules d'E. coli, une protéine de support qui abrite en tant qu'accepteur un site de glycosylation approprié pour une glycosylation de protéine dépendante de la PglB périplasmique, des cadres de lecture ouverts (ORF) optimisés pour l'usage des codons (pour une expression dans E. coli) de la pneumolysine détoxifiée (dPLY) de S. pneumoniae ont été modifiés par mutagenèse pour contenir un site de glycosylation (remplacement d'un acide aminé par le séquon consensus de TV-glycosylation bactérien KDQNATK (SEQ ID NO : 31), tel qu'énoncé dans le tableau 1 ; SEQ ID NO : 33 à 50) . Le plasmide pGVXN1979 (P FeiB-ssdPL Yhîs 6 ) abritant 5 mutations detoxif iantes (G293V, A370E, C428A, W433E, et L460) a été utilisé.
Les 18 plasmides d'expression peiB-ssdPLY^jiisë résultants ont été analysés pour l'expression périplasmique et l'efficacité de la glycosylation des mutants de dPLY par la PglB avec le CP4 comme il est décrit ci-dessous (voir la figure 2) . Les résultats indiquent que les régions couvrant la boucle N-terminale et C-terminale (figure 1) y compris les résidus Q24, S27, E29, L431 et E434 représentent des sites préférés pour la glycosylation de la dPLY par la PglB.
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Exemple 4 - Clonage moléculaire et synthèse de plasmides
d'expression codant pour un ORF pour une pneumolysine
détoxifiée (dPLY) avec six mutations détoxifiantes, un
site de glycosylation, un marqueur hexa-histidine (Hiss)
et une séquence signal (PelB-ss) pour une translocation
périplasmique
Le plasmide pEC415-plasmide pGVXN1979 abrite une cassette d'expression inductible par l'arabinose pour 1'ORF de la pneumolysine contenant 5 mutations détoxifiantes (G293V, A370E, C428A, W433E, et L460E) fusionné à l'extrémité NER-terminale à une séquence signal de PelB et à l'extrémité COOH-terminale à un marqueur hexa-histidine (voir SEQ ID NO : 32, telle que fournie par Gene Synthesis (servant à la synthèse chimique de novo d'une séquence d'ADN d'intérêt), voir ci-dessus)). Pour fournir d'autres mutations détoxifiantes, une réticulation disulfure a été introduite par mutagenèse dans 1'ORF de la pneumolysine, menant à 6 mutations détoxifiantes, à savoir T65C, V293C, A370E, C428A, W433E, et L460E. L'ORF de la pneumolysine contenant ces six mutations a été fusionné à l'extrémité NH2-terminale à une séquence signal de PelB et à l'extrémité COOH-terminale à un marqueur hexa-histidine. Le plasmide résultant a été nommé pGVXN2369.
Dans 1'ORF de la pneumolysine de pGVXN2369, un séquon consensus de Ν-glycosylation bactérien (KDQNATK, SEQ ID NO : 31) a été introduit en remplaçant soit Q24 (Q24KDQNATK, dPLYmut4) soit E434 (E434KDQNATK, dPLYmut48) . Les ORF de pneumolysine résultants contenaient 6 mutations détoxifiantes et un site de glycosylation et
184
BE2017/5427 étaient fusionnés à l'extrémité NER-terminale à une séquence signal de PelB et à l'extrémité COOH-terminale à un marqueur hexa-histidine. Les plasmides résultants ont été nommés pGVXN2400 (p PelB-ssdRL Yrnut4His6 ) et pGVXN2401 (P FeiB-ssdPLy5nut4g) f respectivement.
Exemple 5 - Clonage_moléculaire_de_plasmides
d'expression codant pour un ORF pour une pneumolysine
détoxifiée (dPLY) avec un site de glycosylation, un
marqueur hexa-histidine (Hiss) et diverses séquences
signal pour une translocation périplasmique
Pour fournir dans des cellules d'E. coli, une
protéine de support qui abrite en tant qu'accepteur un site de glycosylation approprié pour une glycosylation de protéine dépendante de la pglB périplasmique, deux variants d'un cadre de lecture ouvert (ORF) optimisé pour les codons (pour une expression dans E. coli) de la pneumolysine de S. pneumoniae contenant six mutations détoxifiantes (dPLYT6sc, G293c, a37oe, c428a, w433e, l46oe) et contenant un site de glycosylation (et un marqueur hexa-histidine (His6)) ont été clonés dans le cadre avec 1'ORF de l'une de huit séquences signal (ss).
Afin d'échanger le gène de la bêta-lactamase (bla) sur pEC415 (pGVXN315) contre un gène d'aminoglycosides' -o-phosphotransférase, le procédé décrit par Datsenko & Wanner (Datsenke KA & Wanner BL, Proc Natl Acad Sei U S A. 2000 Jun 6 ; 97(12): 66405) a été employé.
Plus en détail :
La souche d'E. coli DH5a contenant le plasmide pGVXN315 (pEC415-Amp) a été transformée avec pGVXN837 (modifié (contient une aminoglycoside acétyltransférase
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BE2017/5427 [100 gg/ml], de la [v/v] d'arabinose a été au lieu d'un gène de bêta-lactamase) pKD46, contenant des recombinases lambda-Red sous le promoteur araB (pour pKD46 comparer Datsenke KA & Wanner BL, 2000) et les doubles transformants ont été sélectionnés sur des plaques de gélose LB contenant de l'ampicilline [100 gg/ml] et de la gentamycine [15 gg/ml] pour une croissance pendant une nuit à 30 °C. Du milieu LB liquide contenant de l'ampicilline gentamycine [15 gg/ml] et 0,2 ί inoculé avec une seule colonie de DH5a [pGVXN315, pGVXN837] et la culture a été développée à 30 °C jusqu'à une OD6oonm de 0,6 afin de préparer un E. coli électrocompétent. Les cellules ont été transformées par électroporation avec 100 ng de produit purifié par PCR (englobant les régions homologues nécessaires à la recombinaison et un gène d'aminoglycoside-3'-ophosphotransférase obtenu par PCR en utilisant les oligonucléotides OGVXN2276 et OGVXN2277 et pGVXN73 (pEXT22, voir Dykxhoorn DM et al., Gene 177(1996) 133
136) comme matrice. Les cellules transformées d'E. coli ont été laissées récupérer dans du SOC liquide à 37 °C pendant 4 h et ont été étalées sur des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine [50 gg/ml]. Les cellules d'E. coli dans lesquelles les gènes bla sur le plasmide à base de pEC415 (pGVXN315) ont été échangés contre les gènes aminoglycoside-3'-o-phosphotransférase ont été sélectionnées pour une croissance à 37 °C sur de la kanamycine et en l'absence du plasmide auxiliaire pGVXN837 et les gènes bla ont été confirmés par sensibilité aux antibiotiques gentamycine et ampicilline après étalement des réplicats. En outre, l'échange des
186
BE2017/5427 gènes bla avec les gènes aminoglycoside-3'-ophosphotransférase sur le plasmide pEC415 a été confirmé par PCR sur colonie en utilisant la paire d'oligonucléotides oGVXNl672/oGVXNl178. Les plasmides résultants pEC415-KanR ont été nommés pGVXN1184.
En employant la mutagenèse dirigée, un site Nhel a été introduit dans le site de clonage multiple (SCM) de pGVXN1184 produisant pGVXN2555. pGVXN2555 affiche au sein de son SCM (parmi d'autres sites de restriction) un site de restriction Ndel et Nhel qui peut être utilisé pour le clonage directionnel des cadres de lecture ouverts en utilisant 1'« atg » au sein du site Ndel en tant que codon de départ putatif pour la traduction.
Finalement, les ORF pour les séquences signal suivantes (ss) ont été clonés dans les sites de restriction Ndel et Nhel de pGVXN2555 en utilisant des techniques de clonage moléculaire classiques :
i. DsbA-ss (disulfure oxydoréductase d'E. coli,
SEQ ID NO : 13), menant à pGVXN2556 ;
ii. Flgl-ss /protéine de biosynthèse de l'anneau P du corps basal flagellaire de S. flexneri, SEQ ID NO : 19), menant à pGVXN2557 ;
iii. LTIIb-ss, (entérotoxine thermolabile IIB d'E. coli, chaîne B, SEQ ID NO : 17), menant à pGVXN2558 ;
iv. MalE-ss (protéine de liaison du maltose d'E. coli, SEQ ID NO : 15), menant à pGVXN2559 ;
v. SipA-ss (S. agalactiae, protéine immunogène de surface, SEQ ID NO : 70), menant à pGVXN2561 ;
vi. XynA-ss (B. amyloliquefaciens, xylanase,
SEQ ID NO : 18), menant à pGVXN2562 ;
187
BE2017/5427 vii. TolB-ss (protéine de translocation d'E. coli,
SEQ ID NO : 20), menant à pGVXN2563 ;
viii. OmpA-ss (protéine de la membrane externe d'E. coli, SEQ ID NO.14), menant à pGVXN2564.
En utilisant la PCR avec pGVXN2400 ou pGVXN2401 en tant que matrice, les gènes dPPYrnut4HiS6 et dPPYrnut48HiS6 de S. pneumoniae, respectivement, ont été amplifiés par PCR et clonés dans les sites Nhel et Xhol de :
i. pGVXN2556 dans le cadre avec 1 ' ORF de la DsbA-
SS produisant pGVXN2887 (pDsbA-ssdPL Yrnut4His6 ;
SEQ ID NO : 54) et pGVXN2895 (pDsM-ssdPPYmut48His6 ;
SEQ ID NO : 55) ;
ii . pGVXN2557 dans le cadre avec 1'ORF de la Flgl-
SS produisant pGVXN2888 (pFlgl-ssdPLY^^Hisë ;
SEQ ID NO : 56) et pGVXN2896 (p Flgl-ssdPLY^trp.^ .
SEQ ID NO : 57) ;
iii . pGVXN2558 dans le cadre avec 1'ORF de la LTIIb-
SS produisant pGVXN2 8 8 9 (pLTIIb-ssdPL Ymut4His6 ;
SEQ ID NO : 58) et pGVXN2897 (pLTiib-ssdPLYmut48niSe ;
SEQ ID NO : 59) ;
iv. pGVXN2559 dans le cadre avec 1'ORF de la MalE-
SS produisant pGVXN2890 (pMaIE-ssdPPYmut4His6 ;
SEQ ID NO : 60) et pGVXN2898 (pMalE-ssdPL Ymut48His6 /
SEQ ID NO : 61) ;
v. pGVXN2561 dans le cadre avec 1 ' ORF de la SipA-
SS produisant pGVXN2891 (psiPA-ssdPPYrnut4His6 ;
SEQ ID NO : 62) et pGVXN2899 (psyA-ssdPLY^8pis6 ;
SEQ ID NO : 63) ;
vi . pGVXN2562 dans le cadre avec 1'ORF de la XynA-
SS produisant pGVXN2892 (pXynA-ssdPLY^^Fisi, /
BE2017/5427
SEQ SEQ ID NO : 64) ID NO : 65) et r pGVXN2900 (pXynA-ssdPLYIaut/i8nis6 ,-
vii . pGVXN2563 dans le cadre avec 1'ORF de la TolB-
SS produisant pGVXN2893 (proiB-ssdRLYrnut4His6 ;
SEQ ID NO : 66) et pGVXN2901 (proIB-ssdPLYrnut48His6 ;
SEQ ID NO : 67) r
viii . pGVXN2564 dans le cadre < avec 1'ORF de 1'OmpA-
SS produisant pGVXN2894 (pOmpA-ssdPLYrnut4His6 ,-
SEQ ID NO : 68) et pGVXN2902 (pOmpA-ssdPLYrnut48His6 ,-
SEQ ID NO : 69).
Ces plasmides peuvent être utilisés pour exprimer
soit dPLYmut4His6 soit dPLYmut48His6 dans le périplasme d'E. coli.
Clonage moléculaire de pGVXN803 :
En utilisant l'ADN génomique isolé d'une souche de type sauvage de Streptococcus pneumoniae de type 4, le groupe de gènes entiers codant pour les gènes nécessaires à la synthèse du polysaccharide capsulaire issu du sérotype 4 (CP4) a été amplifié par PCR et ligaturé dans les sites Xhol et Ascl de pGVXN725 dérivé de pLAFR (pLAFR_J23103-RBS-MCS-term_J23103-RBS-MCS-term). Le plasmide résultant a été nommé pGVXN803.
Exemple 6 - Production et purification du bioconjugué dPLY-CP4
E. coli StGVXN1128 (W3110 AwaaL) a été cotransformé avec les plasmides codant pour (a) le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de type 4 (CP4) pGVXN803, (b) la protéine de support de S. pneumoniae dPLY (pneumolysine détoxifiée, portant les mutations détoxifiantes : T65C, G293C, A370E, C428A, W433E, L460E),
189
BE2017/5427 portant un site de glycosylation au niveau de la position 434 (mut48) et un marqueur d'affinité C-terminal hexappeiB-ssdPLYmut48His6) ,
PglBcuo de [20 pg/ml], [100 pg/ml] et histidine (His6) (pGVXN2401, (c) 1'oligosaccharyltransférase Campylobacter jejuni (pGVXN970) et (d) 1'UDP-GlcNAc/Glc 4-épimérase (gne) de Campylobacter jejuni (pGVXN207). Les cellules ont été cotransformées par électroporation et cultivées pendant une nuit sur des plaques de gélose sélective complémentées avec les quatre antibiotiques tétracycline [20 pg/ml], kanamycine [50 pg/ml], triméthoprime [100 pg/ml] et spectinomycine [80 pg/ml].
Les cellules ont été récupérées à partir des plaques de gélose et inoculées dans une préculture TBdev de 1000 ml complémentée avec du MgCl2 [10 mM] et les quatre antibiotiques tétracycline kanamycine [50 pg/ml], triméthoprime spectinomycine [80 pg/ml] et incubées pendant une nuit à 37 °C. La préculture a été utilisée pour inoculer un bioréacteur de 20 1 contenant 7 1 de milieu TBdev complémenté avec du MgCl2 [10 mM] pour atteindre une DCPoonm de 0,25. Le polysaccharide recombinant a été exprimé de façon constitutive, alors que la PglB a été induite avec 1 mM d'isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG), et les dPLY et Gne ont été induites avec 0,4 % d'arabinose, à une densité optique DCdoonm de 30, et le récipient a été alimenté avec 3,5 1 de milieu TB (186 ml/h) pendant une nuit.
Après l'induction pendant une nuit, au total, 945 000 DO ont été récoltées à partir du récipient par centrifugation et les culots cellulaires ont été stockés à -80 °C. A partir d'un total de 400 000 DO
190
BE2017/5427 (2 x 200 000 DO) , le bioconjugué a été extrait par un traitement de choc osmotique. Un équivalent cellulaire de 200 000 DO a été lavé avec du NaCl à 0,9 % et recueilli par centrifugation. Le culot a été remis en suspension dans 666 ml de TBS 1/3X et à l'échantillon, 333 ml de tampon de remise en suspension (600 mM de Tris, 30 mM d'EDTA, 75 % de saccharose, pH 8,5) ont été ajoutés et la suspension a été incubée par agitation dans la chambre froide pendant 30 min. La suspension a été centrifugée pendant 30 min à 4 °C et 10 000 tr/min, le surnageant a été stocké à 4 °C et le culot a été remis en suspension dans le même volume (1000 ml) avec du tampon de choc osmotique (10 mM de Tris, pH 8) . La suspension a été incubée par agitation dans la chambre froide pendant 30 min et clarifiée par centrifugation pendant 30 min à 4 °C et 9000 tr/min. Au surnageant (960 ml), du MgCl2 IM a été ajouté pour produire une concentration finale de 50 mM de MgCl2 et il a été dilué avec 240 ml de tampon de liaison 5X (150 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 M de NaCl, 50 mM d'imidazole) . Cet EPP (1250 ml) a été filtré (0,22 pm) avant le chargement d'une colonne IMAC (chromatographie d'affinité sur métal immobilisé) (GE Healthcare XK 26/70 avec 100 ml de résine IMAC immobilisée (tampon de liaison IX, 30 mM de TrisHCl, pH 8, 0, 500 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole) (Tosoh Toyopearl)). L'échantillon a été chargé sur la colonne IMAC avec une pompe péristaltique à TA (température ambiante) (débit de 5 ml/min) et la colonne a été lavée avec 4 VC (volume de colonne) de tampon de liaison IX. La protéine liée a été éluée en fractions de 14 ml en utilisant un gradient linéaire (1 à 50 % de tampon B)
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BE2017/5427 avec une longueur de 15 VC (tampon A : 30 mM de TrisHC1, pH 8,0, 50 mM de NaCl, tampon B : 30 mM de TrisHC1, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 1 M d'imidazole) . Les fractions éluées ont été analysées par SDS-PAGE (NuPAGE à 4 à 12 %) et Western blot en utilisant un anticorps anti-His (Penta-His Antibody, Quiagen) et les fractions contenant le bioconjugué marqué par His ont été groupées et diluées avec du tampon A (30 mM de Tris-HCl, pH 7,5) pour produire une conductivité de 8,82 mS/cm (mS correspond à milli-Siemens).
L'échantillon groupé (600 ml) a été chargé sur une colonne PallQ de 50 ml équilibrée (Ceramic HyperD F) et la colonne a été lavée avec 5 VC de tampon A (30 mM de Tris-HCl, pH 7,5) . Le bioconjugué lié a été élué en fractions de 10 ml en utilisant un gradient linéaire (0 à 50 % de tampon B) avec une longueur de 20 VC (tampon A : 30 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM de NaCl, tampon B :
mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1000 mM de NaCl). Les fractions éluées ont été analysées par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et Western blot en utilisant un anticorps anti-CP4 (antisérums pneumococciques de type 4 (lapin), Serum Statens Institute) et les fractions contenant le bioconjugué PLY-CP4 ont été groupées et diluées avec du tampon A (30 mM de Tris-HCl, pH 7,5) pour produire une conductivité de 8,69 mS/cm.
L'échantillon groupé (480 ml) a été chargé sur une colonne SourceQ de 20 ml équilibrée et la colonne a été lavée avec 5 VC de tampon A (30 mM de Tris-HCl, pH 7,5). Le bioconjugué lié a été élué en fractions de 5 ml en utilisant un premier gradient linéaire (0 à 15,5 % de
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BE2017/5427 tampon B) avec une longueur de 10 VC suivi d'un deuxième gradient linéaire (15,5 à 18 % de tampon B) avec une longueur de 2 VC et d'un troisième gradient linéaire (18 à 50 % de tampon B) avec une longueur de 8 VC (tampon A : 30 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM de NaCl, tampon B : 30 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1000 mM de NaCl). Les fractions éluées ont été analysées par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et Western blot en utilisant un anticorps anti-CP4 (antisérums pneumococciques de type 4 (lapin), Serum Statens Institute) et les fractions contenant le bioconjugué PLY-CP4 ont été groupées (pour produire 50 ml) et ajustées à des conditions de chargement de chromatographie avec interactions hydrophobes (HIC) (HIC PPG-600M) par addition goutte à goutte de sulfate d'ammonium pour atteindre une concentration finale de
M de sulfate d'ammonium dans l'échantillon chargé.
ml de résine PPG-600M ont été équilibrés avec 10 VC de tampon A (1,0 M de sulfate d'ammonium dans 5 mM de NaPhosphate pH 7,2) et mélangés avec l'échantillon chargé et incubés pendant 10 min à TA sur une roue en rotation. La suspension a été versée dans un dispositif de colonne et la fraction non retenue a été recueillie. La colonne a été lavée 4 fois avec 5 VC de tampon A (1,0 M de sulfate d'ammonium dans 5 mM de Na-Phosphate pH 7,2) . Chaque liquide de lavage a été recueilli en fractions de 10 ml. La protéine liée a été éluée avec 5 VC de ddH2O. La fraction non retenue, les fractions des liquides de lavage et l'éluat ont été analysés par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et Western blot en utilisant un anticorps anti-His
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BE2017/5427 (Penta-His Antibody, Quiagen) et les fractions (c'està-dire, la fraction non retenue et les fractions des liquides de lavage 1 et 2) contenant le bioconjugué marqué par His ont été groupées et concentré en utilisant un dispositif centrifuge Amicon (10k MWCO) jusqu'à un volume de 0,5 ml. L'échantillon groupé a été chargé sur une colonne Superdex 200 (10/300, volume = 24 ml) et des fractions de 0,5 ml ont été recueillies en utilisant du TBS IX (sérum physiologique tamponné par du Tris). Les fractions recueillies ont été analysées par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et les fractions de SEC contenant le bioconjugué CP4-dPLY ont été groupées, stérilisées par filtration (Costar Centrifuge Tube, filtre de 0,22 pm) et la concentration de la protéine a été déterminée comme étant de 0,404 mg/ml.
Au sein de cet échantillon groupé, le taux d'endotoxine a été analysé et déterminé comme étant de
24,2 UE/ml.
2,5 pg de l'échantillon final purifié de CP4-dPLY
a été analysé côte à côte avec 1 pg de dPLY non
glycosylée (uPLY) par SDS-PAGE colorée au Coomassie
(Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) , figure 5.
Le résultat indique que le CP4-dPLY a pu être purifié
jusqu'à une homogénéité élevée et a été bien séparé de la dPLY non glycosylée et des impuretés durant la procédure de purification décrite.
Exemple 7 - Production et purification du bioconjugué dPLY-CP33F
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E. coli StGVXN9329 (W3110 mca ::33Fwt ; waaL: :pglBcu0 ; ECA::33Feng ; rfb::cat) a été cotransformé avec (a) un plasmide codant pour la protéine de support de S. pneumoniae dPLY (pneumolysine détoxifiée, portant les mutations détoxifiantes : T65C, G293C, A370E, C428A, W433E, L460E), portant un site de glycosylation au niveau de la position 434 (mut48) et un marqueur d'affinité Cterminal hexa-histidine (His6) (pGVXN2901, ρτοίβssdPLYrnut48His6) , et (b) un plasmide (pGVXN1883) portant le gène pour un activateur positif du locus de l'acide colanique (rcsA). Les cellules ont été cotransformées par électroporation et cultivées pendant une nuit sur des plaques de gélose sélective complémentées avec de la kanamycine [50 pg/ml], et de la spectinomycine [8 0 pg/ml] .
Des cellules récupérées des plaques de gélose ont été inoculées dans une préculture TBdev de 50 ml complémentée avec du MgCl2 [10 mM] et les deux antibiotiques kanamycine [50 pg/ml] et spectinomycine [80 pg/ml] et incubées pendant une nuit à 30 °C. La préculture a été utilisée pour inoculer un flacon d'agitation contenant 21 de milieu TBdev complémenté avec du MgCl2 [10 mM] , de la kanamycine [50 pg/ml], de la spectinomycine [80 pg/ml], et 0,1 mM d'isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) pour atteindre une DCdoonm de 0,25. Le polysaccharide recombinant et la PglB ont été exprimés après addition d'IPTG, alors que la dPLY a été induite avec de 1'arabinose à 0,5 % après 8 h. En même temps, 0,9 mM d'IPTG a été ajouté pour une seconde fois et la culture a été passée à 37 °C pour une induction pendant une nuit.
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Après l'induction pendant une nuit, au total, 15 400 DO ont été récoltées par centrifugation et lavées avec du NaCi à 0,9 %. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans 52 ml de TBS et à l'échantillon, 26 ml de tampon de remise en suspension (600 mM de Tris, 30 mM d'EDTA, 75 % de saccharose, pH 8) ont été ajoutés et la suspension a été incubée par agitation dans la chambre froide pendant 30 min. La suspension a été centrifugée pendant 30 min à 4°C et 8000 tr/min, le surnageant a été stocké à 4 °C et le culot a été remis en suspension dans le même volume (78 ml) avec du tampon de choc osmotique (10 mM de Tris, pH 8). La suspension a été incubée par agitation dans la chambre froide pendant 30 min et clarifiée par centrifugation pendant 30 min à 4 °C et 8000 tr/min. Le surnageant a été filtré (0,45 pm) et du MgCl2 1 M a été ajouté pour produire une concentration finale de 50 mM de MgCl2 et il a été dilué avec du tampon de liaison 5X (150 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 M de NaCi, 50 mM d'imidazole) pour produire une concentration finale de tampon de liaison IX au sein de l'échantillon. Cet EPP (80 ml) a été filtré (0,22 pm) avant le chargement sur la colonne IMAC (chromatographie d'affinité sur métal immobilisé) (Millipore VL 11 x 250 avec 20 ml de résine IMAC équilibrée (tampon de liaison IX, 30 mM de Tris-HCl, pH 8, 0, 500 mM de NaCi, 10 mM d'imidazole) (Tosoh Toyopearl). L'échantillon a été chargé sur la colonne IMAC avec une pompe péristaltique à TA (débit de 5 ml/min) et la colonne a été lavée avec 5 VC de tampon de liaison IX. La protéine liée a été éluée en fractions de 5 ml en utilisant un gradient linéaire (1 à 50 % de tampon B) avec une longueur de
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7,5 VC (tampon A : 30 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de
NaCl, tampon B : 30 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de
NaCl, 1 M d'imidazole) . Les fractions éluées ont été analysées par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et Western blot en utilisant un anticorps anti-His (Penta-His Antibody, Quiagen) et les fractions contenant le bioconjugué marqué par His ont été groupées (45 ml) et diluées avec 105 ml de tampon A (30 mM de Bis-Tris, pH 6,0) . L'échantillon groupé (150 ml) a été chargé sur une colonne SourceQ de 20 ml équilibrée et la colonne a été lavée avec 3 VC de tampon A (30 mM de Bis-Tris, pH 6,0) . Le bioconjugué lié a été élué en fractions de 5 ml en utilisant un gradient linéaire (0-50 % tampon B) avec une longueur de 30 VC (tampon A : 30 mM de Tris-Bis, pH 6,0, tampon B : 30 mM de Bis-Tris, pH 6,0, 1000 mM de NaCl). Les fractions éluées ont été analysées par SDSPAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et Western blot en utilisant un anticorps anti-CP33F (sérum Pneumo Factor 33b (lapin), Serum Statens Institute) et un anticorps anti-His (Penta-His Antibody, Quiagen), respectivement. Les fractions contenant le bioconjugué CP33F-dPLY ont été groupées (pour produire 10 ml) et concentrées en utilisant un dispositif centrifuge Amicon (10k MWCO) jusqu'à un volume de 0,5 ml. L'échantillon groupé a été chargé sur une colonne Superdex 200 (10/300, volume = ml) et des fractions de 0,5 ml ont été recueillies en utilisant du TBS IX, pH 7,4. Les fractions recueillies ont été analysées par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et les
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BE2017/5427 fractions de SEC contenant le bioconjugué CP33F-dPLY ont été groupées et la concentration de la protéine a été déterminée comme étant de 0,158 mg/ml.
2,5 pg de l'échantillon final purifié de CP33F-dPLY a été analysé côte à côte avec 1,5 pg de dPLY non glycosylée (uPLY) par SDS-PAGE colorée au Coomassie (Simply Blue Coomassie) (NuPAGE à 4 à 12 %) et 1 pg de l'échantillon final purifié de CP33F-dPLY a été analysé côte à côte avec 0,45 pg de dPLY non glycosylée (uPLY) par Western blot en utilisant un anticorps anti-CP33F (sérum Pneumo Factor 33b (lapin), Serum Statens Institute) et un anticorps anti-His (Penta-His Antibody, Quiagen), respectivement, voir la figure 7. Ces résultats indiquent que la dPLY est efficacement glycosylée avec le CP33F et a pu être purifiée jusqu'à une homogénéité élevée par la procédure décrite cidessus. La dPLY non glycosylée n'a pu être détectée ni par coloration au Coomassie de la SDS-PAGE ni par Western blot avec un anticorps anti-His.
Exemple 8 - Procédures ELISA pour mesurer la réponse en IgG contre le CP4, l'EPA et la Ply chez des cobayes
CP4
Dans des plaques de microtitrage de 96 puits (MAXISORP™, Nunc, Thermo Scientific), la rangée A a été sensibilisée avec 100 μΐ par puits d'anticorps monoclonaux de chèvre anti-IgG de cobaye (Jackson 106005-003 à 2,4 mg/ml) à 2 pg/ml dans du tampon PBS. Les rangées B à H ont été sensibilisées avec 100 μΐ par puits de CP4 (PS04P130 à 2 mg/ml) à 5 pg/ml dans du tampon PBS. Après incubation pendant 2 heures à 37 °C, les plaques
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BE2017/5427 ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %TWEEN™ 20 à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi (dans du PBS-TWEEN™ 20 à 0,05 %) d'IgG de cobaye purifiées (Jackson 006000-003 à 0,25 pg/ml) utilisées comme étalon de référence pour doser les IgG correspondantes dans les sérums ont été ajoutées dans la rangée A. Ensuite, des dilutions en série au demi des sérums à tester ont été ajoutées dans les rangées B à H dans du PBS-TWEEN™ 20 à 0,05 %. Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Après lavage, des anticorps de chèvre antiIgG de cobaye conjugués à de la peroxydase (Jackson 106035-003) ont été ajoutés à une dilution finale au 1/2000 (100 μΐ par puits) pendant 30 min à température ambiante sous agitation. Les plaques ont été lavées comme cidessus et la solution de révélation [4 mg de dichlorhydrate d'O-phénylènediamine (OPDA) et 5 μΐ de H2O2 dans 10 ml de tampon citrate 0,1 M pH 4,5] a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl 1 N et la densité optique (DO) a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence). Les concentrations individuelles des IgG (exprimées en pg/ml) ont été calculées par le procédé à 4 paramètres en utilisant le logiciel Soft Max Pro.
EPA
Dans des plaques de microtitrage de 96 puits (MAXISORP™, Nunc, Thermo Scientific), la rangée A a été sensibilisée avec 100 μΐ par puits d'anticorps monoclonaux de chèvre anti-IgG de cobaye (Jackson 106005-003 à 2,4 mg/ml) à 2 pg/ml dans du tampon PBS. Les
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BE2017/5427 rangées B à H ont été sensibilisées avec 100 μΐ par puits d'EPA (EPA E-5_6 à 1, 996 mg/ml) à 2 gg/ml dans du tampon PBS. Après incubation pendant une nuit à 4 °C, les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %TWEEN™ 20 à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi (dans du PBS-TWEEN™ 20 à 0,05 %) d'IgG de cobaye purifiées (Jackson 006000-003 à 0,25 gg/ml) utilisées comme étalon de référence pour doser les IgG correspondantes dans les sérums ont été ajoutées dans la rangée A. Ensuite, des dilutions en série au demi des sérums à tester ont été ajoutées dans les rangées B à H dans du PBS-TWEEN™ 20 à 0,05 %. Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Après lavage, des anticorps de chèvre antiIgG de cobaye conjugués à de la peroxydase (Jackson 106035-003) ont été ajoutés à une dilution finale au 1/2000 (100 μΐ par puits) pendant 30 min à température ambiante sous agitation. Les plaques ont été lavées comme cidessus et la solution de révélation [4 mg de dichlorhydrate d'O-phénylènediamine (OPDA) et 5 μΐ de H2O2 dans 10 ml de tampon citrate 0,1 M pH 4,5] a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl 1 N et la densité optique (DO) a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence). Les concentrations individuelles des IgG (exprimées en gg/ml) ont été calculées par le procédé à 4 paramètres en utilisant le logiciel Soft Max Pro.
Ply
Dans des plaques de microtitrage de 96 puits (MAXISORP™, Nunc, Thermo Scientific), la rangée A a été
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BE2017/5427 sensibilisée avec 100 μΐ par puits d'anticorps monoclonaux de chèvre anti-IgG de cobaye (Jackson 106005-003 à 2,4 mg/ml) à 2 pg/ml dans du tampon PBS. Les rangées B à H ont été sensibilisées avec 100 μΐ par puits de Ply (EPly 07A à 5,98 mg/ml) à 8 pg/ml dans du tampon PBS. Après incubation pendant 2 heures à 37 °C, les plaques ont été lavées trois fois avec du NaCl à 0,09 %TWEEN™ 20 à 0,05 %. Après lavage, des dilutions en série au demi (dans du PBS-TWEEN™ 20 à 0,05 %) d'IgG de cobaye purifiées (Jackson 006000-003 à 0,25 pg/ml) utilisées comme étalon de référence pour doser les IgG correspondantes dans les sérums ont été ajoutées dans la rangée A. Ensuite, des dilutions en série au demi des sérums à tester ont été ajoutées dans les rangées B à H dans du PBS-TWEEN™ 20 à 0,05 %. Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Après lavage, des anticorps de chèvre antiIgG de cobaye conjugués à de la peroxydase (Jackson 106035-003) ont été ajoutés à une dilution finale au 1/2000 (100 μΐ par puits) pendant 30 min à température ambiante sous agitation. Les plaques ont été lavées comme cidessus et la solution de révélation [4 mg de dichlorhydrate d'O-phénylènediamine (OPDA) et 5 μΐ de H2O2 dans 10 ml de tampon citrate 0,1 M pH 4,5] a été ajoutée dans chaque puits (100 μΐ/puits) pendant 15 min dans l'obscurité. La réaction a été stoppée par l'addition de 50 μΐ de HCl 1 N et la densité optique (DO) a été lue à 490 nm (620 nm pour le filtre de référence). Les concentrations individuelles des IgG (exprimées en pg/ml) ont été calculées par le procédé à 4 paramètres en utilisant le logiciel Soft Max Pro.
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Exemple 9 - Procédure du test d1opsonophagocytose
La fonctionnalité des anticorps anti-polysaccharide pneumococcique 4 a été évaluée en utilisant un test d'opsonophagocytose spécifique du sérotype. Les échantillons de sérum ont été chauffés à 56 °C (pour inactiver leur contenu en complément) et ensuite dilués en série au demi dans 25 μΐ de HBSS-BSA (solution saline équilibrée de Hank-sérumalbumine bovine) à 3 % dans une plaque à fond plat de 96 puits. Vingt-cinq μΐ d'un mélange de cellules HL60 activées (des cellules promyélocytaires humaines HL-60 ont été différenciées en neutrophiles en utilisant du N, N-diméthylformamide), des pneumocoques et du complément de lapin bébé ont été ajoutés dans un rapport de 4/2/1. Les plaques ont été incubées pendant 2 heures à 37 °C (sous agitation pour favoriser le processus de phagocytose). Une aliquote de 20 μΐ de chaque puits a été ensuite transférée dans le puits correspondant d'une microplaque à fond plat de 96 puits. Cinquante μΐ de bouillon de Todd-Hewitt-0,9 % de gélose ont été ajoutés deux fois dans chaque puits. Après incubation pendant une nuit à 37 °C, les colonies pneumococciques ont été dénombrées en utilisant un système d'analyse d'images automatisé (Axiovision). Le nombre moyen d'unités formant une colonie de huit puits contenant des bactéries sans aucun sérum a été déterminé et utilisé pour le calcul de l'activité de destruction de chaque échantillon de sérum. Les titres bactéricides ont été exprimés par l'inverse de la dilution de sérum induisant 50 % de destruction.
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Exemple 10 - Test d'inhibition de l'hémolyse
Cent (100) μΐ de sérums traités au chloroforme (pour éliminer le cholestérol sérique) ont été ajoutés à une plaque à fond en U de 96 puits et dilués en série (dilutions au demi) dans le tampon du test (PBS contenant 0,155 % de dithiothréitol et 1 % de BSA, dilué au 1/10 dans du Tris 15 mM, NaCi 150 mM pH 7,5) . A cinquante (50) μΐ, il a été ajouté cinquante (50) μΐ de Ply native à 4 UH (unités hémolytiques) (déterminées auparavant dans le test hémolytique) et incubés pendant 15 min à 37 °C. Une suspension d'érythrocytes de mouton (100 μΐ) a été ajoutée à la concentration de 1 % dans chaque puits. Les plaques ont été incubées pendant 30 min à 37 °C et ensuite centrifugées à 900 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C. 150 μΐ du surnageant ont été transférés dans les puits de la microplaque et la DO a été lue à 405 nm en utilisant un spectrophotomètre. L'activité hémolytique a été calculée comme la dilution de chaque échantillon entraînant 50 % d'inhibition de l'hémolyse.
Exemple 11 - Evaluation préclinique du bioconjugué CP4dPLY
Afin d'évaluer la dPLY en tant que protéine de support pour les bioconjugués de S. pneumoniae, le CP4dPLY a été utilisé pour immuniser des cobayes et comparé à une protéine de support établie, à savoir l'EPA (exotoxine A de P. aeruginosa) conjuguée au polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae de type 4 (CP4-EPA).
Plus en détail, des cobayes Dunklin-Hartley femelles âgés de 5 à 8 semaines (n = 12/groupe) ont été
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BE2017/5427 immunisés aux jours 0, 14 et 28 par voie intramusculaire avec soit 0,1 pg de CP4-EPA (groupe 1, CP4-EPA, n = 12) soit 1 pg de CP4-EPA (groupe 2, n = 12) soit 0,1 pg de CP4-dPLY (groupe 3, n = 12) soit 1 pg de CP4-dPLY (groupe 4, n = 12), respectivement. Les vaccins à base de bioconjugués ont été adjuvés avec Alhydrogel pour produire une concentration finale de 0,06 % de Al3+. Comme témoin, 4 animaux ont reçu seulement du TBS plus 0,06 % de Al3+ (groupe 5, n = 4) . Les animaux ont été saignés sur la veine tarsale latérale aux jours 0 (pré), et 42 (post).
Des tests sérologiques ont été appliqués pour suivre l'immunogénicité et la fonctionnalité des anticorps dans les sérums induits au cours de l'étude d'immunisation.
Les taux d'anti-IgG dans les sérums contre le CP4 (figure 6A) , la dPLY (figure 6B) , et l'EPA (figure 6C) ont été testés dans un test ELISA (en utilisant les procédés décrits ci-dessus) dans les pré- et post-sérums de tous les groupes. Les deux bioconjugués, CP4-EPA et CP4-dPLY, ont été immunogènes et ont induit après trois injections un taux similaire de réponses en IgG contre le CP4 sans différence significative. En outre, les sérums post-immunisation des groupes 1, 2, 3, et 4 ont été efficaces de façon égale dans la médiation de la destruction opsonophagocytaire des pneumocoques du sérotype 4 par les cellules promyélocytaires activées HL-60 (en utilisant le procédé décrit ci-dessus) (figure 6D) indiquant que la dPLY et l'EPA sont des supports efficaces de façon égale pour le CP4 chez les cobayes.
204
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Les réponses en IgG anti-dPLY ont été détectées dans les post-sérums provenant des animaux qui ont reçu le CP4-dPLY (figure 6B) . Le taux d'IgG anti-dPLY a été supérieur dans le groupe qui a reçu plus de bioconjugué et par conséquent plus de protéine de support (comparer les post-sérums du groupe 3 (0,1 pg de CP4-dPLY) et du groupe 4 (1 pg de CP4-dPLY) sur la figure 6B) . Par conséquent, des taux élevés d'IgG anti-EPA ont été détectés dans les post-sérums provenant des animaux qui ont reçu le CP4-EPA (figure 6C).
La fonctionnalité des IgG anti-dPLY induites par le bioconjugué a été évaluée dans un test d'inhibition de l'hémolyse (en utilisant le procédé décrit ci-dessus). Les sérums provenant d'animaux immunisés avec le CP4dPLY ont inhibé efficacement l'hémolyse des érythrocytes par la pneumolysine native (figure 6E) montrant que des IgG anti-dPLY fonctionnelles ont été induites.
En conclusion, le CP4 conjugué à la dPLY a induit des réponses d'OPA spécifiques du CP4 comparables à celles d'anticorps neutralisants induits par le CP4-EPA spécifiques de la pneumolysine. Ceci permet la conception de nouveaux vaccins à base de conjugués avec une couverture potentiellement plus large en incluant divers antigènes protéiniques issus de S. pneumoniae conjugués à différents CP.
Exemple 12 - Production et purification du bioconjugué dPLY-CP12F
E. coli StGVXN9876 (W3110 waaL : :pgIBN3iiv-K482R-D483HA6 6 9v , ECA. . gn e , r fb. . ( tvz g f n 1C) s . pneumoniael2F 9- ete cotransformé avec les plasmides codant pour la protéine
205
BE2017/5427 de support de S. pneumoniae dPLY (pneumolysine détoxifiée, portant les mutations détoxifiantes : T65C, V293C, A370E, C428A, W433E, L460E), portant un site de glycosylation au niveau de la position 434 (mut48) et un marqueur d'affinité C-terminal hexa-histidine (His6) (pGVXN2401, pPeis-ssdPL^t^Hiss) , et un plasmide pLAFR (pGVXN3177) portant les gènes de S. pneumoniae 12F wciJwcxB-wzy-wcxD-wcxE-wzxF par électroporation et cultivé pendant une nuit sur des plaques de gélose sélective complémentées avec de la kanamycine [50 pg/ml], et de la tétracycline [20 pg/ml].
Les cellules ont été inoculées dans une préculture TBdev de 5 ml complémentée avec du MgCl2 [10 mM] et les deux antibiotiques kanamycine [50 μ/ml], et tétracycline [20 pg/ml] et incubées pendant une nuit à 30 °C. La préculture a été utilisée pour inoculer un flacon d'agitation contenant 50 ml de milieu TBdev complémenté avec du MgCl2 [10 mM] , de la kanamycine [50 pg/ml], et de la tétracycline [20 pg/ml], pour atteindre une DCPoonm de 0,1 et incubée à 30 °C. La dPLY recombinante a été induite avec de 1 ' arabinose à 0,4 % à une DCPoonm de 0,63 et à une DCPoonm de 1,87 la PglB a été exprimée lors de l'addition de 1 mM d'IPTG, et la culture été passée à 37 °C pour une incubation pendant une nuit.
Après incubation pendant une nuit, au total, 100 DO ont été récoltées par centrifugation et lavées avec du NaCl à 0.9 % et le contenu périplasmique des cellules a été extrait en tant qu'extrait périplasmique (EPP).
La protéine et le bioconjugué marqués par His ont été enrichis à partir de l'EPP par IMAC (chromatographie d'affinité sur métal immobilisé) et 1 équivalent de DO
206
BE2017/5427 de la fraction éluée a été analysé par Western blot en utilisant un anticorps anti-His (Penta-His Antibody, Quiagen), respectivement, voir la figure 8.
La présente divulgation ne doit pas être limitée dans son étendue par les modes de réalisation spécifiques décrits ici. En effet, diverses modifications de la matière sujette fournie ici, en plus de celles décrites, deviendront évidentes pour l'homme du métier d'après la description précédente et les figures qui l'accompagnent De telles modifications sont prévues se situer au sein de l'étendue des revendications annexées.
Diverses publications, divers brevets et diverses demandes de brevet sont cités ici, dont les divulgations sont incorporées en référence dans leur intégralité.
207
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Claims (20)

REVENDICATIONS
1'espèce 1'espèce l'espèce Aeromonas,
Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptococcus,
Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter, éventuellement dans laquelle ladite épimérase est d'E. coli, éventuellement Z3206 d'O157 d'E. coli ou galE.
37. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 36, dans laquelle l'acide nucléique qui code pour la protéine pneumolysine modifiée est dans un plasmide dans la cellule hôte.
38. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 37, dans laquelle la cellule hôte est E. coli.
39. Procédé de production d'un bioconjugué qui comprend une protéine pneumolysine modifiée liée à un saccharide, ledit procédé comprenant (i) la culture de la cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 38 dans des conditions appropriées pour la production de protéines et (ii) l'isolement du bioconj ugué.
219
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40. Bioconjugué produit par le procédé selon la revendication 39, dans lequel ledit bioconjugué comprend un saccharide lié à une protéine pneumolysine modifiée.
41. Composition immunogène comprenant la protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou le conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou le bioconjugué selon la revendication 40.
42. Procédé de fabrication de la composition immunogène selon la revendication 41 comprenant l'étape de mélange de la protéine pneumolysine modifiée ou du conjugué ou du bioconjugué avec un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
43. Vaccin comprenant la composition immunogène selon la revendication 41 et un excipient ou un support pharmaceutiquement acceptable.
44. Procédé de traitement ou de prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae chez un sujet en ayant besoin comprenant l'administration au dit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace de la protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou du conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou du bioconjugué selon la revendication 40.
45. Procédé d'immunisation d'un hôte humain contre une infection par Streptococcus pneumoniae comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou du conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou du bioconjugué selon la revendication 40.
220
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46. Procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre Streptococcus pneumoniae chez un sujet, le procédé comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace de la
1'espèce
Pseudomonas, Streptomyces,
1. Protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1, modifiée en ce que la séquence d'acides aminés comprend une ou plusieurs séquences consensus choisies parmi : D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Y représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline.
2. Protéine pneumolysine modifiée selon la revendication 1, dans laquelle un ou plusieurs acides aminés de la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 ou d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 ont été substitués par une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-NZ-S/T-K (SEQ ID NO : 30) .
3. Protéine pneumolysine modifiée selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) est localisée au niveau d'une position au sein de la boucle longue N-terminale de surface ou de la boucle courte C-terminale de SEQ ID NO : 1 ou d'une position équivalente au sein d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %,
97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
92 %, 95 %, 96 %,
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4. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) a été ajoutée à, ou substituée à, un ou plusieurs acides aminés, entre les résidus d'acides aminés 22 et 57 de SEQ ID NO : 1 ou au niveau d'une position équivalente au sein d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
5 protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou du conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou du bioconjugué selon la revendication 40.
47. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une 10 quelconque des revendications 1 à 14, ou le conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou le bioconjugué selon la revendication 40 pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae.
5. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle une séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) a été ajoutée à, ou substituée à, un ou plusieurs acides aminés, entre les résidus d'acides aminés 360 et 470 de SEQ ID NO : 1 ou au niveau d'une position équivalente au sein d'une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1.
6. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant une seule séquence consensus choisie parmi D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) et K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30).
7. Protéine pneumolysine modifiée selon la revendication 6, dans laquelle la séquence consensus KD/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) a été substituée au résidu d'acide aminé 434 dans SEQ ID NO : 1, ou substituée dans une séquence d'acides aminés au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à SEQ ID NO : 1 au niveau d'une position
209
BE2017/5427 d'acide aminé équivalente au résidu d'acide aminé 434 dans SEQ ID NO : 1.
8. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle X représente Q (glutamine) et Z représente A (alanine) (par exemple, K-D-Q-N-A-T-K (SEQ ID NO : 31)).
9. Protéine pneumolysine modifiée comprenant une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à la séquence de SEQ ID NO : 2, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/EX-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N-Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30), dans lesquelles X et Y représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline.
10. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle la séquence d'acides aminés est en outre modifiée par au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L46o en E en référence à la séquence d'acides aminés de
SEQ ID NO : 1 ou une position équivalente dans une séquence d'acides aminés au moins identiques à 80 %,
85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à
SEQ ID NO : 1.
11. Protéine pneumolysine modifiée comprenant une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à une séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 3 à 10, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO : 28) ou K-D/E-X-N210
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Z-S/T-K (SEQ ID NO : 30) dans lesquelles X et Y représentent indépendamment un acide aminé quelconque à part la proline et au moins une substitution d'acide aminé choisie parmi G293 en C, T65 en C, C428 en A, A370 en E, W433 en E et L460 en E.
12. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle la séquence d'acides aminés comprend en outre un marqueur peptidique qui est utile pour la purification de la protéine pneumolysine, éventuellement ledit marqueur peptidique comprenant six résidus d'histidine et éventuellement ledit marqueur peptidique localisé à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés, éventuellement ladite protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12.
13. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle la séquence d'acides aminés comprend en outre une séquence signal qui est capable de diriger la protéine pneumolysine vers le périplasme d'une cellule hôte, éventuellement ladite séquence signal étant choisie parmi SEQ ID NO : 13 à 20, éventuellement ladite protéine pneumolysine modifiée ayant une séquence d'acides aminés au moins identique à 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % à SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22.
14. Protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle la protéine pneumolysine modifiée est glycosylée.
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15 48. Utilisation de la protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou du conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou du bioconjugué selon la revendication 40 dans la fabrication d'un médicament
15. Conjugué comprenant une protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et 14, dans lequel la protéine pneumolysine modifiée est liée à un antigène.
16. Conjugué selon la revendication 15, dans lequel la protéine pneumolysine modifiée liée de façon covalente à un antigène par l'intermédiaire d'une liaison chimique qui peut être obtenue en utilisant un procédé de conjugaison chimique, éventuellement choisi dans le groupe constitué de la chimie des carbodiimides, l'amination réductrice, la chimie de la cyanylation, la chimie des maléimides, la chimie des hydrazides, la chimie des esters, et la chimie du N-hydroxysuccinimide soit directement soit par l'intermédiaire d'un lieur.
17. Conjugué selon la revendication 15 ou la revendication 16, dans lequel l'antigène est lié à un acide aminé sur la protéine pneumolysine modifiée choisi parmi l'asparagine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la lysine, la cystéine, la tyrosine, l'histidine, l'arginine ou le tryptophane.
18. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, dans lequel l'antigène est un saccharide, éventuellement un saccharide capsulaire bactérien éventuellement choisi parmi un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae du sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B,
10C, 10F, 11A, 11B, 11C , 11D, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 2 5A, 25F, 26, 27 , 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C , 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C,
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35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48.
19. Conjugué selon la revendication 18, dans lequel l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien de Streptococcus pneumoniae choisi parmi un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae du sérotype 4, ou de Streptococcus pneumoniae du sérotype 33F.
20. Conjugué (selon la revendication 18, dans lequel l'antigène est un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride ayant une structure :
(B)n-Adans laquelle A représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides, avec un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice (indiquée par une flèche) ;
dans laquelle B représente une unité répétitive oligosaccharidique contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides ;
dans laquelle A et B représentent des unités répétitives oligosaccharidiques différentes ; et dans laquelle n vaut au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou au moins 20, éventuellement dans lequel le monosaccharide d'hexose à l'extrémité réductrice de la répétition est choisi dans le groupe constitué de glucose, galactose, rhamnose, arabinotol, fucose et mannose.
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21. Polynucléotide codant pour la protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
22. Vecteur comprenant le polynucléotide selon la revendication 21.
23. Cellule hôte comprenant :
i) un ou plusieurs acides nucléiques qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases ;
ii) un acide nucléique qui code pour une oligosaccharyltransférase ;
iii) un acide nucléique qui code pour une protéine pneumolysine modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ; et éventuellement iv) un acide nucléique qui code pour une polymérase.
24. Cellule hôte selon la revendication 23, dans laquelle ladite cellule hôte comprend (a) une ou plusieurs glycosyltransférases qui assemblent un dérivé monosaccharidique d'hexose sur le pyrophosphate d'undécaprényle (Und-PP) et (b) une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose assemblé sur l'Und-PP.
25. Cellule hôte selon la revendication 24, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé monosaccharidique d'hexose sur l'Und-PP est hétérologue à la cellule hôte et/ou hétérologue à un ou plusieurs des gènes qui codent pour une ou plusieurs glycosyltransférases, éventuellement dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé monosaccharidique d'hexose sur l'Und-PP est de l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella,
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BE2017/5427 l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella,
l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, 1 ' espèce Lactococcus, 1 ' espèce Lactobacillus, 1 ' espèce Pseudomonas, 1 ' espèce Corynebacterium, 1 ' espèce Streptomyces, 1'espèce Streptococcus, 1 ' espèce Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, 1' espèce Listeria, ou 1'espèce
Campylobacter, éventuellement wecA.
26. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 24 à 25, dans laquelle ledit dérivé monosaccharidique d'hexose est un monosaccharide quelconque dans lequel la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido tel que la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactosamine (GalNAc), le 2,4diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la Nacétylfucosamine (FucNAc), ou la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
27. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, dans laquelle lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose assemblé sur l'Und-PP est la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028 ou la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167 ou sont la galactofuranosyltransférase (wbeY) d'E. coli 028 et la galactofuranosyltransférase (wfdK) d'E. coli 0167.
28. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 27 dans laquelle la cellule hôte comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du CP4 comprenant wzg,
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BE2017/5427 wzh, wzd et/ou wze du CP4 de S. pneumoniae et éventuellement weil, wciJ, wciK, wciL, wzy wciM, wzx, mnaA, fnlA, fnlB et fnlC du CP4 de S. pneumoniae.
29. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 27 dans laquelle la cellule hôte comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du CP12F comprenant wzg, wzh, wzd et/ou wze du CP12F de S. pneumoniae.
30. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 27, dans laquelle la cellule hôte comprend des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des unités répétitives du saccharide CP33F comprenant wciC, wciD, wciE, et/ou wciF du CP33F de S. pneumoniae et éventuellement wchA et/ou weiß du CP33F de S. pneumoniae.
31. Cellule hôte selon la revendication 30, dans laquelle ladite cellule hôte est capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, dans laquelle ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique au CP33F de S. pneumoniae, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé monosaccharidique d'hexose à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive à la place d'un monosaccharide d'hexose normalement présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive du CP33F de S. pneumoniae.
32. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 24 à 31, dans laquelle les glycosyltransférases comprennent une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive
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BE2017/5427 de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé monosaccharidique d'hexose, éventuellement dans laquelle lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé monosaccharidique d'hexose comprennent la galactosyltransférase (wclP) , éventuellement d'E. coli 021, et éventuellement comprenant une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide qui est adjacent au monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide d'hexose présent à l'extrémité réductrice de la première unité répétitive de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur, éventuellement la glucosyltransférase (wclQ) , éventuellement d'E. coli 021.
33. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 32 dans laquelle 1'oligosaccharyltransférase est dérivée de Campylobacter jejuni, éventuellement dans laquelle ladite oligosaccharyltransférase est pglB de C. jejuni, éventuellement dans laquelle le gène pglB de C. jejuni est intégré dans le génome de la cellule hôte et éventuellement dans laquelle au moins un gène de la cellule hôte a été inactivé fonctionnellement ou délété, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été inactivé fonctionnellement ou délété, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par un acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase, éventuellement dans laquelle
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par pglB ique des ; cellule pour une ou une ladite est de
34. Cellule revendications 23 polymérase polymérase le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par pglB de C. jejuni.
hôte selon l'une quel« à 33, dans laquelle lad: hôte comprend un acide nucléique qui code pour une polymérase de polysaccharide capsulaire d'antigène O, éventuellement de polysaccharide capsulaire
Streptococcus pneumoniae, éventuellement du CPI, CP2, CP4, CP5, CP6 (A,B,C,D), CP7 (A,B,C), CP8, CP9(A,L,N,V), CP10 (A,B,C,F) , CPU (A,B,C,D,F) , CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A,B,C,F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CPI 8 (A, B, C, F) ,
CP19 (A,B,C,F) , CP20, CP21, CP22(A,F), CP23(A,B,F),
CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26, CP27, CP28(A,F), CP29,
CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44,
CP46, CP47(A,F), ou CP48 de S. pneumoniae.
35. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 34, dans laquelle ladite cellule hôte comprend un acide nucléique qui code pour une flippase (wzx), éventuellement dans laquelle ladite flippase est de Streptococcus pneumoniae, éventuellement du CPI, CP2, CP4, CP5, CP6 (A, B, C, D) , CP7(A,B,C), CP8,
CP9 (A, L,N, V) , CP10 (A,B,C,F) , CPI 1 (A, B, C, D, F) ,
CP12(A,B,F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F) , CP16(A,F),
CP17(A,F), CP18 (A,B,C,F) , CPI 9 (A, B, C, F) , CP20, CP21,
CP22(A,F), CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F), CP26,
CP27, CP28(A,F), CP29, CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35 (A,B,C,D,F) , CP36, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F), ou CP48 de S.
pneumoniae.
218
BE2017/5427
36. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 23 à 35, dans laquelle ladite cellule hôte comprend en outre une enzyme capable de modifier un monosaccharide, éventuellement une épimérase, éventuellement dans laquelle ladite épimérase est de l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xanthomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia,
20 pour le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae
221
B E2017/5427
Domaine 1
o CO c _0J E o u. 3 O O -w CÛ Z
'co
E o
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
MA47223A (fr) 2016-12-30 2019-11-06 Sutrovax Inc Conjugués polypeptide-antigène avec des acides aminés non naturels
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
CN111065388A (zh) * 2017-09-07 2020-04-24 默沙东公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
GB201807303D0 (en) * 2018-05-03 2018-06-20 London School Of Hygeine & Tropical Medicine Glyconjugate vaccines
CN108774628B (zh) * 2018-07-02 2022-03-25 南开大学 合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途
WO2020191082A1 (fr) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugués d'antigènes polysaccharidiques o d'e. coli, procédés de production de ces derniers, et méthodes d'utilisation de ces derniers
AR118389A1 (es) 2019-03-18 2021-09-29 Janssen Pharmaceuticals Inc Métodos de producción de bioconjugados de polisacáridos de e. coli o-antígeno, sus composiciones y métodos de utilización
KR102099342B1 (ko) * 2019-09-03 2020-04-10 주식회사 제노포커스 Crm197 단백질 발현 방법
EP4213870A1 (fr) 2020-09-17 2023-07-26 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions de vaccin multivalentes et leurs utilisations
KR20220142219A (ko) * 2021-04-14 2022-10-21 한국생명공학연구원 장내 미생물에서 단백질 분비를 유도하는 신호서열

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004043376A2 (fr) * 2002-11-07 2004-05-27 Synergy America, Inc. Compositions et methodes de traitement ou de prevention d'une infection a pneumocoques
WO2010071986A1 (fr) * 2008-12-24 2010-07-01 Sanofi Pasteur Limited Polypeptides de pneumolysine de streptococcus pneumoniae modifiés
WO2011138361A1 (fr) * 2010-05-06 2011-11-10 Glycovaxyn Vaccins de bioconjugué de bactéries gram positif capsulaire
WO2016020499A2 (fr) * 2014-08-08 2016-02-11 Glycovaxyn Ag Cellules hôtes modifiées utilisables dans la production de bioconjugués

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
EP0027888B1 (fr) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Interrupteur à semiconducteur
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
DE3734306A1 (de) 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
ES2160570T3 (es) 1988-12-16 2001-11-16 Nederlanden Staat Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
NZ249704A (en) 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
ATE157882T1 (de) 1993-03-23 1997-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
KR100376361B1 (ko) 1993-09-22 2003-07-18 헨리 엠. 잭슨 파운데이션 포 더 어드벤스먼트 오브 밀리터리 메디신 면역원성구조체의제조를위하여신규한시아닐레이팅시약을사용하여용해성탄수화물을활성화하는방법
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (fr) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Dispositif de remplissage d'ampoule
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1996002555A1 (fr) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Oligonucleotides immunomodulateurs
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
ATE241384T1 (de) 1995-03-22 2003-06-15 Jackson H M Found Military Med Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
DK0914178T3 (da) 1996-06-18 2003-04-22 Alza Corp Anordning til forøgelse af transdermal afgivelse eller prøveudtagning af et middel
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
ES2195190T3 (es) 1996-12-20 2003-12-01 Alza Corp Dispositivo y metodo para mejorar el flujo de agente transdermico.
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
US6800744B1 (en) 1997-07-02 2004-10-05 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
HUP0002475A3 (en) 1997-07-21 2002-01-28 Baxter Healthcare S A Wallisel Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1279401B1 (fr) 1997-09-05 2008-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Emulsions du type huile-dans-l'eau contenant des saponines
CA2312900A1 (fr) 1997-12-02 1999-06-10 Powderject Vaccines, Inc. Administration transdermique de compositions particulaires de vaccins
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
PT1140157E (pt) 1998-12-21 2009-05-06 Medimmune Inc Proteínas de streptococcus pneumoniae e fragmentos imunogénicos para vacinas
NZ512574A (en) 1998-12-23 2004-03-26 Iaf Biochem Int Novel streptococcus antigens useful as vaccines
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
KR20090110951A (ko) 2002-03-07 2009-10-23 아이드게노쉬쉐 테흐니쉐 호흐슐레 쥬리히 원핵 숙주에서의 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법 및 생산계
CA2555803A1 (fr) 2004-02-13 2005-08-27 Sanofi Pasteur Limited Derives de pneumolysine
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP2853600B1 (fr) 2005-05-11 2018-09-19 ETH Zürich Proteines N-glycosylées de recombinaison produites a partir de cellules procaryotes
ATE539079T1 (de) 2006-03-23 2012-01-15 Novartis Ag Imidazochinoxalinverbindungen als immunmodulatoren
CA2646891A1 (fr) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Composes de potentialisation immunitaire
ES2397488T3 (es) 2007-07-23 2013-03-07 Sanofi Pasteur Limited Polipéptidos inmunógenos y anticuerpos monoclonales
WO2009104074A2 (fr) 2008-02-20 2009-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugués faits à partir de protéines n-glycosylées recombinées issues de cellules procaryotes
EP2612680B1 (fr) 2008-04-16 2018-05-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Vaccin
EP2268307A1 (fr) 2008-04-16 2011-01-05 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccin
JP2012533285A (ja) 2009-07-17 2012-12-27 オーシャン ハーベスト テクノロジー （カナダ） インコーポレイテッド 魚用飼料中の合成添加物を置換する、天然かつ持続可能な海藻配合物
HUE038456T2 (hu) 2009-11-19 2018-10-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bioszintetikus rendszer, amely immunogén poliszaccharidokat termel prokarióta sejtekben
JP2015529214A (ja) 2012-09-10 2015-10-05 グリコヴァキシン アーゲー 修飾された抗原を含むバイオコンジュゲート及びその使用
EA201590488A1 (ru) 2012-10-12 2015-09-30 Гликоваксин Аг Способы модификации клеток-хозяев
ES2713166T3 (es) 2012-11-07 2019-05-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Producción de vacuna recombinante en E. coli mediante conjugación enzimática

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004043376A2 (fr) * 2002-11-07 2004-05-27 Synergy America, Inc. Compositions et methodes de traitement ou de prevention d'une infection a pneumocoques
WO2010071986A1 (fr) * 2008-12-24 2010-07-01 Sanofi Pasteur Limited Polypeptides de pneumolysine de streptococcus pneumoniae modifiés
WO2011138361A1 (fr) * 2010-05-06 2011-11-10 Glycovaxyn Vaccins de bioconjugué de bactéries gram positif capsulaire
WO2016020499A2 (fr) * 2014-08-08 2016-02-11 Glycovaxyn Ag Cellules hôtes modifiées utilisables dans la production de bioconjugués

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELIUD O. OLOO ET AL: "Structure-guided Antigen Engineering Yields Pneumolysin Mutants Suitable for Vaccination against Pneumococcal Disease", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 286, no. 14, 4 February 2011 (2011-02-04), US, pages 12133 - 12140, XP055396198, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M110.191148 *
MICHON F ET AL: "Multivalent pneumococcal capsular polysaccharide conjugate vaccines employing genetically detoxified pneumolysin as a carrier protein", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 16, no. 18, 1 November 1998 (1998-11-01), pages 1732 - 1741, XP004138424, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/S0264-410X(98)00225-4 *
SARA L. LAWRENCE ET AL: "Crystal structure of Streptococcus pneumoniae pneumolysin provides key insights into early steps of pore formation", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 5, no. 1, 25 September 2015 (2015-09-25), XP055396196, DOI: 10.1038/srep14352 *
SIDNEY D. TAYLOR ET AL: "The Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin from Streptococcus pneumoniae Binds to Lipid Raft Microdomains in Human Corneal Epithelial Cells", PLOS ONE, vol. 8, no. 4, 5 April 2013 (2013-04-05), pages e61300, XP055396199, DOI: 10.1371/journal.pone.0061300 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190248841A1 (en) 2019-08-15
BE1024767A1 (fr) 2018-06-21
WO2017216286A1 (fr) 2017-12-21
EP3471764A1 (fr) 2019-04-24
GB201610599D0 (en) 2016-08-03

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