WO1997041888A1 - Complexe immunogene, son utilisation, son procede de preparation et vaccin le contenant - Google Patents

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Hans Binz
Jean-François HAEUW
Stefan Svenson
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Pierre Fabre Medicament
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to new immunogenic complexes comprising a saccharide derivative, useful in particular as medicaments and in particular as vaccines.
  • Proteins and polysaccharides are the two main types of surface antigens found in bacteria and fungi and are, by their antigenic nature, excellent tools that can be used in the design of vaccines.
  • the development of defined vaccines devoid of side effects requires the use of low molecular weight vaccinating antigens, mainly peptides or oligosaccharides.
  • antigens but also others of higher molecular mass such as polysaccharides, cannot alone induce an immune response which is intense and lasting.
  • bacterial po saccharides in the preparation of vaccines appeared at the start of the 20th century. These compounds play an important role in the structure and pathogenicity of certain Gram positive and negative bacteria.
  • Two types of poh bacterial saccharides are excellent candidates as a vaccine agent. These are polysaccharides from the bacterial capsule and polysaccharides from lipopoh saccharides (LPS) from the outer membrane of Gram negative bacteria.
  • polymers essentially composed of a carbohydrate part, and part of the molecule of which is exposed on the surface of the bacteria. They consist of a linear sequence of repeating units, characteristic of a given bacterial species, the number of which can vary from one to several hundred, thus explaining their molecular weight which is sometimes very high.
  • Each repeating unit itself consists of several monosaccharides linked together by glycosidic bonds, generally from 1 to 7 monosaccharide residues. The latter can be more or less substituted by mineral groups such as phosphates or by organic groups, such as acids, amino, alcohols, fatty acids or amino acids.
  • Vaccines comprising a polysaccharide extract have been shown to be relatively effective in adults at low doses, 25 to 50 ⁇ g.
  • vaccines based on bacterial polysaccharides, there are to date vaccines against infections
  • Neisseria meningitidis tetravalent vaccine against strains of groups A, C, YV135 and Y
  • Streptococcus pneumoniae multivalent pneumococcal vaccine combining 23 serotypes of capsular polysaccharides
  • Salmonella typhi vaccine composed of the capsular polysaccharide of S. typhi.
  • Salmonella typhi vaccine composed of the capsular polysaccharide of S. typhi.
  • these vaccines are particularly ineffective in young children.
  • Other approaches have been tested in the vaccine strategy against Salmonella infections. Indeed, bacteria of the genus Salmonella are virulent enterobacteria with digestive tropism, pathogenic for humans and for many vertebrate animals. The genus Salmonella is conventionally made up of more than 2000 different serotypes. The main pathologies induced by these bacteria are (for general reviews see: Le Minor, L, 1987, Salmonella in Medical Bacteriology, L Le Minor and M. Véron Eds., Médecine-Sciences Flammarion Paris, p. 41 1- 427, Pegues, DA and Miller, SI, 1994, Salmonellosis including typhoid fever, Curr. Opin. Infect Dis. 7, 616-623): - in animals, toxi
  • Salmonella abortus-ovis in sheep Salmonella galinarum in poultry
  • typhoid fevers (Salmonella typhi) and paratyphoid fevers (Salmonella paratyphi A, B and D),
  • the "inactivated bacterial vaccine” type injectable forms are the oldest vaccine forms. These are vaccines that can contain 500 to 1000 million bacteria per dose, in liquid form. The bacteria are inactivated by heat treatments and / or by chemical compounds such as acetone, formalin or phenol. Depending on the bacterial serotypes they contain, there are
  • this second class includes "Vac TAB” vaccines from PASTEUR in France or "Typhidrall” from BIOCINE SCLAVO in Italy.
  • the TAB (PASTEUR) vaccine is a complete inactivated trivalent liquid bacterial vaccine, combining Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A and B. Its relative efficacy is in fact limited to the valence T. This vaccine is reactogenic: it causes in a third cases of early local and general reactions. 11 is injected subcutaneously, 2 to 3 injections, 2 to 4 weeks apart, followed by a booster. In France the current regulations which still impose it on certain professional categories, including the military and health professions, are in fact no longer justified. In the military, we now use a monovalent T vaccine, not marketed.
  • Ty21a oral typhoid vaccine (“Vivotif", BERNA) contains a living defective strain of Salmonella typhi, devoid of galactose-4-epimerase. Its administration is oral, in the form of gastroresistant capsules containing 1 to 8.10 9 live bacteria in lyophilized form.
  • the vaccination schedule includes 3 successive doses on days 1, 3 and 5, with simultaneous intake of baking soda to neutralize stomach acid. Evaluated in endemic areas in Egypt and Chile, the protective value would be between 60 and 90%. There would be no side effects. Vaccine protection becomes effective approximately 10 days after the last dose. The protection is valid for a period ranging from 1 to 7 years, and it is therefore recommended that travelers to endemic regions repeat the vaccination annually. Older oral forms are still available. These are inactivated vaccines, the efficacy of which, however, has not been clearly established (“Taboral" from the company BERNA, "Enterovaccino” in Italy).
  • the MERIEUX Institute's "Typhim Vi” vaccine is prepared from purified Vi capsular polysaccharide of Salmonella typhi. It is a solution for injection containing 25 ⁇ g of polysaccharide.
  • a single injection, subcutaneous or intramuscular, provides protection only against the infectious risk associated with Salmonella typhi in adults and children over 5 years of age.
  • This vaccine does not provide protection against Salmonella paratyphi A and B, these serotypes not being encapsulated. Immunity appears approximately 15 days to 3 weeks after the injection. The term of protection is at least 3 years. In high endemic areas, the protection rate observed is around 60%.
  • immunogenic complexes characterized in that they consist of at least one oligo- or polysaccharide epitope naturally present in pathogens such as bacteria, coupled to a carrier protein chosen from the binding protein to human serum albumin from Streptococcus, the outer membrane proteins of gram negative bacteria, or their fragments. Indeed, the coupling by a covalent bond of the oligosaccharide or of the polysaccharide transforms the latter into T-dependent immunogen.
  • the oligo- or polysaccharide epitope is capable of being obtained from bacteria, gram negative or gram positive, and in particular from membrane lipopolysaccharides or capsule oligosaccharides, bacteria of the genus Salmonella, Escherich ia, Neisseri a, Shigel la, I laemophilus or Klebsiella.
  • the pathogenic agent can be Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Neisseria miningitidis or Streptococcus pneumoniae.
  • the oligo- or polysaccharide epitope can also be obtained from a fungus, in particular belonging to one of the genera Candida, Cryptococcus or Lipomyces.
  • the polysaccharides derived from lipopolysaccharides are prepared by extracting the LPS from the membrane and then removing lipid A by gentle hydrolysis.
  • the capsular polysaccharides are more easily isolated from the bacterial suspension: heating at 100 ° C. for ten minutes (solubilization) followed by centrifugation makes it possible to isolate the capsular polysaccharide Vi from Salmonella typhi.
  • the two types of polysaccharides can then be purified by chromatography and / or by membrane filtration.
  • the use of "whole" polysaccharides in a coupling process can see certain technical problems appear, mainly due to the too large size of these compounds: gel formation, precipitation.
  • cleavage methods of the polysaccharide can be used: ultrasonic fragmentation, depolymerization by oxidation-reduction, hydrolysis carried out in acidic or basic medium, enzymatic hydrolysis.
  • An oligossacharide is a compound, which can be derived from a polysaccharide, and which, compared to the starting polysaccharide, has a reduced number of repeat units.
  • conjugate vaccine on the market is a vaccine to prevent invasive Haemophilus influenzae type b infections (meningitis) in humans.
  • conjugate vaccinating antigen is an oligosaccharide or a polysaccharide isolated from the capsule: PRP, polyribosyl ribitol phosphate.
  • the carrier proteins used in the design of this conjugate vaccine are of two types:
  • TT Tetanus
  • DT diphtheria
  • Tetanus and diphtheria toxoids are currently the best characterized carrier proteins, both from a structural and biological point of view (vaccine properties, properties of carrier proteins), and are therefore considered to be the reference carrier proteins.
  • TT toxin is a 150kDa protein.
  • the DT toxin has a lower molecular weight and is secreted as a single polypeptide chain of 535 amino acids. After purification, these proteins are inactivated by heat and formalin. They can be combined with each other (DT vaccine), and with many other vaccines (whooping cough, poliomyelitis ). Heat resistant, they keep at + 4 ° C for a few years, but should not be frozen.
  • the second type of carrier used in this same vaccine is in fact an extract of membrane proteins: OMPC, "Outer membrane protein complex", isolated from Neisseria meningitidis. This vesicular complex actually contains several proteins associated with lipids and lipopolysaccharides.
  • the carrier protein comprises at least part of an OmpA type protein of gram negative bacteria, in particular of an outer membrane protein of Klebsiella pneumoniae.
  • Proteins particularly suitable for carrying out the present invention are proteins derived from the major membrane protein of Klebsiella pneumoniae 1- 145, hereinafter designated p40; they present in particular one of the sequences ID No. 2, ID No. 4 or ID No. 6.
  • Other proteins of interest derived from the outer membrane protein of K. Pneumoniae include fragments
  • Invariable extramembrane loops are defined as homologous P40 sequences with the loop sequences conserved between different species of enterobacteria.
  • the sequences of extramembrane loops not conserved during evolution are called variable loops.
  • the localization of the extramembrane loops is carried out according to the model of VOGEL and JAHNIG (1986, J. Mol. Biol., 190: 191-199) concerning the OmpA of E. coli.
  • the fragments between amino acids 127 to 179 of sequence ID No. 1 will be used.
  • Suitable sequences are respectively the sequences between amino acids 108 to 179 of sequence ID no . 1, amino acids 1 to 179 of sequence ID no. 1, as well as sequences having at least 90% of homology with the preceding sequences.
  • the carrier protein comprises all or part of the human serum albumin binding domain of the streptococcus protein G (hereinafter called BB).
  • BB streptococcus protein G
  • This protein has a molecular mass of 29 kDa and can be expressed and produced in Escherichia coli in the form of inclusion bodies.
  • the carrier protein may in particular have the sequence ID no. 8, or a sequence having at least 80%, and preferably at least 90% of similarity with said sequence ID no. 8.
  • All of these carrier proteins can be extracted from the original bacteria or else obtained by the recombinant DNA pathway.
  • Immunogenic complexes may in particular consist of a conjugate between a carrier protein as defined above and at least one substantially purified oligosaccharide, capable of being obtained from membrane lipopolysaccharides of bacteria of the genus Salmonella; in particular the bacteria of the genus Salmonella will belong to a serogroup carrying an antigenic specificity chosen from the following group: 0: 1, 0: 2, 0: 4, 0: 6, 7, 8, 0: 3 and 0: 9 .
  • the immunogenic complex contains an oligosaccharide capable of being obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella enteritidis with antigen specificity 0: 9.
  • Salmonella serotypes are identified by their antigenic formula; they are classified into different groups, according to their antigenic specificity O.
  • Salmonella typhi belongs to group D, with specificity 0: 9, as well as S. enteritidis, S. panama, and S. dublin.
  • - serogroup B of specificity 0: 4, having as representative t S. paratyphi B and S. typhimurium
  • - serogroup C of specificity 0: 6, 7, 8, having as representative S. infantis and S. bovis morficans ,
  • oligosaccharides belonging to the major antigenic specificities listed above will be particularly suitable for the implementation of the invention.
  • a vaccine prepared from oligosaccharide isolated from S. enteritidis lipopolysaccharide, carrying the antigen specificity 0: 9, will protect against septicemia with Salmonella typhi and against typhoid fever, but it can also be used in prevention in humans and animals of toxi- infections and zoonoses due to Salmonella from the same serogroup.
  • Oligosaccharides according to one of the preferred aspects of the invention have at least one unit: ⁇ D galactose p (l-2) - ⁇ D mannose p (l-4) - ⁇ L Rhamnose p (l-3)
  • the subject of the invention is an immunogenic complex comprising at least one oligosaccharide of formula
  • Man represents mannose Rha represents rhamnose Tyv represents tyvélose and n can vary between 1 and 24.
  • n can vary between 1 and 5, and the oligosaccharide is coupled with a protein having one of the sequences ID n "2, ID n" 4, ID n "6, or ID n ° 8, or having at least at least 80% similarity with one of the sequences ID No. 2, ID No. 4 or ID No. 6 or ID No. 8.
  • the invention also relates to the use of immunogenic complexes as defined above, for the preparation of a vaccine; according to a particularly advantageous aspect, the complexes are useful for the preparation of a vaccine intended to protect an animal against infections caused by the Salmonella bacteria belonging to the 0: 9 antigenic serogroup.
  • n will have different values.
  • Immunogenic complexes according to the invention are also those comprising a capsular Salmonella antigen.
  • the latter can be coupled alone to a carrier protein as defined above, or else associated with a complex comprising another oligo- or polysaccharide epitope.
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions containing at least one oligosaccharide and / or antigenic complex as defined above. They may also contain other adjuvants of imm unity, and pharmaceutically acceptable excipiens ts necessary for their formulation such as diluent, stabilizer, preservatives, etc., known to those skilled in the art.
  • the invention relates to a vaccine containing a membrane oligosaccharide coupled to a carrier protein, and further comprising another antigenic determinant.
  • the vaccine comprises a capsular antigen of Salmonella, such as the capsular antigen Vi (homopolymer of partially acetylgalacturonic acid N); this increases the effectiveness of the vaccine against the encapsulated bacteria.
  • the process for the preparation of the unogenic immunogenic complex can comprise the following stages: a) oligosaccharides from Salmonell are isolated from membrane lipopolysaccharides, b) optionally, the oligosaccharides are purified so as to preserve oligosaccharides of the same molecular weight , c) the oligosaccharides are chemically activated, d) the activated oligosaccharides are coupled to a carrier protein to form the immunogenic complex.
  • the carrier protein is activated before step d) by a chemical method to facilitate coupling.
  • oligosaccharides of different sizes can be envisaged. These oligosaccharides being released by enzymatic cleavage (endorhamnosidasic activity of a phagc), it will preferably be multiples of 4: tetrasaccharides, octasaccharides, dodecasaccharides, hexadecasaccharides, icosasaccharides ... Similarly the coupling of a mixture of these oligosaccharides (without prior purification) is included in the invention.
  • step d) it is then possible to carry out an additional step consisting in coupling the complex obtained at the end of step d) with another antigenic determinant of Salmonella.
  • the invention also relates to the use of a protein comprising one of the sequences ID No. 2, 4, 6 or 8 to improve the immunogenicity of an oligosaccharide.
  • analogous proteins in which at least one amino acid has been replaced by a homologous amino acid in sequences ID No. 2, 4, 6 or 8.
  • the proteins will in particular be encoded by DNA sequences having one of the sequences ID No. 1, 3, 5 or 7 or equivalent sequences, taking into account the degeneracy of the genetic code.
  • the sequence ID No. 2 represents the complete sequence of the protein
  • sequences ID No. 5 and 6 correspond to the entire transmembrane part, ( ⁇ P40F8), and are devoid of the very immunogenic periplasmic part (Puohiniemi, R., Karvonen, M., Vuopio-Varkila, J., Muotiala, A., Helander, IM and Sarvas, M., 1990, Infect. Immun. M, 1691-1696)
  • sequence ID No. 8 corresponds to the human serum albumin binding domain of the Streptococcus protein G.
  • Figure 1 Demonstration of the immunogenic power of the P40-icosasaccharide conjugate in mice.
  • Figure 2 Demonstration of the immunogenic power of the P40-icosasaccharide conjugate in rabbits.
  • EXAMPLE 1 Isolation and purification of the natural P40 protein.
  • the P40 protein a major protein of the outer membrane of Klebsiella pneumoniae is isolated by extraction in the presence of a detergent from the biomass Klebsiella pneumoniae, then purified from the extract thus obtained by anion exchange chromatography then cations.
  • the pH of the Klebsiella pneumoniae biomass (strain 1 145, 40 to 340 g of dry cells, 7 to 10% of dry cells) is adjusted to pH 2.5 with pure acetic acid. After adding 0.5 volume of a solution containing
  • the supernatant is an extract of membrane proteins from Klebsiella pneumoniae.
  • the supernatant proteins are precipitated by adding 3 volumes of 95 ° ethanol at -20 ° C (final ethanol concentration ⁇ 80%). After rapid stirring, the whole is left to stand for 1 hour at 4 ° C minimum. The precipitated proteins are collected by centrifugation for 10 min at 10000 g at 4 ° C.
  • the pellets are resuspended in a 1% solution of Zwittergent 3- 14 at a rate of 5 ml / g of wet pellet. After stirring for 1 hour (propeller stirrer) and grinding using an ultra-turrax (13500 rpm, 30 sec), the pH is adjusted to 6.5 using I N sodium hydroxide. Centrifugation of the mixture makes it possible to obtain the fraction MP (elimination of the insoluble matter).
  • the proteins of the MP are dialyzed overnight at 4 ° C. against a Tris / HCl buffer 20 mM pH 8.0, 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong anion exchanger type (Biorad Macro Prep High Q gel) balanced in the buffer described above at a linear flow rate of 15 cm / h. Proteins are detected at 280nm.
  • the P40 protein is eluted, with a linear flow rate of 60 cm / h, for a concentration of 0.2M NaCl in the Tris / HCl buffer 20mM pH 8.0; 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the fractions containing the P40 protein are combined and concentrated by ultrafiltration using an Amicon shaking cell system used with a Diaflo membrane of the YM 10 type (cutoff threshold 10kDa) for volumes of the order of 100 ml, or using a Minitan Millipore tangential flow filtration system used with membrane plates with a cut-off threshold of OkDa for higher volumes.
  • the fraction thus concentrated is dialyzed overnight at 4 ° C against a 20mM citrate buffer pH 3.0, 0.1% Zwittergent 3- 14.
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of strong cation exchanger type (Biorad Macro Prep High S gel) balanced in the citrate buffer 20mM pH3.0, 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the P40 protein is eluted (speed 61 cm / h) for a 0.7M NaCl concentration.
  • the fractions containing P40 are combined and concentrated as described above.
  • the fractions obtained after each chromatographic step are analyzed by SDS PAGE in order to gather those containing the P40 protein.
  • the amounts of protein are determined by assay according to the Lowry method.
  • the purity and homogeneity of the P40 protein are estimated by SDS PAGE with revelations in coomassie blue and silver nitrate.
  • the P40 is concentrated in order to reach a protein concentration of the order of 5 to 10 mg / ml.
  • the electrophoretic profiles reveal a degree of purity greater than 90%.
  • the protein is specifically recognized by an anti-P40 monoclonal antibody obtained in mice.
  • the nucleotide primers were determined from the part of the published sequence of the OmpA of Klebsiella pneumoniae LD 199 (Lawrence JG et al., 1991, J. Gen. Microbiol. 131, 191 1-1921), of the sequence conscience based on the alignment of the OmpA sequences of different enterobacteria (Escberichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dyscnteriae, Enterobactcr aeroginosae) as well as sequences of peptides obtained by sequencing according to the Edman method of the natural protein isolated from Klebsiella pneumoniae 1- 145 and peptides isolated after digestion with cyanogen bromide.
  • the oligonucleotides were synthesized by the chemical method of phosphoramidites using the Pharmacia Gene Assembler Plus device.
  • a colony of Klebsiella pneumoniae 1- 145 is lysed in 10 ⁇ l of lysis buffer (25mM Taps pH 9.3, 2mM MgC12). 1 ⁇ l of this solution is then used as a DNA source for the PCR amplification reactions. These are carried out in 100 ⁇ l of amplification buffer with 5 pmol of each primer and an enzymatic unit of Taq polymerase (Perlcin Elmer Cetus). Each cycle includes a 30 second denaturation step at 95 ° C followed by hybridization of the primer with DNA and an extension of one minute at 72 ° C.
  • the fragment thus cloned is sequenced using an Applied Biosystem 373 DNA Sequencer automatic sequencer.
  • the sequencing reactions are carried out using the dye terminator kit according to the supplier's recommendations.
  • the entire gene for the P40 protein is then cloned into the expression vector pTrp inducible by the presence of the gene for the operon tryptophan, carrying the gene for resistance to kanamycin and having two restriction sites Bsml and Sali.
  • a Bsml restriction site is introduced by PCR upstream of the P40 gene, which already has a SalI site downstream, in the vector pRIT28P40.
  • the P40 gene having Bsml / SalI sites is thus cloned into the vector pTrp to constitute the plasmid pTrpLP40.
  • the fusion protein LP40 is expressed and produced in
  • Escherichia coli as an inclusion body. This will include the complete sequence of Klebsiella pneumoniae OmpA to which must be added at the N-terminal end an 8 amino acid peptide (L peptide) comprising part of the leader sequence of the tryptophan operon necessary for the expression of the protein in Escherichia coli.
  • L peptide 8 amino acid peptide
  • the expression of the protein LP40 is carried out in Escherichia coli
  • RRI ⁇ M15 (R ⁇ ther, U., 1982, Nucl. Acid Res. Ifl 5765-5772).
  • a preculture is carried out with stirring at 37 ° C. overnight in a medium based on soy tryptic broth (TSB medium) supplemented with yeast extract and in the presence of kanamycin 30 ⁇ g / ml.
  • TLB medium soy tryptic broth
  • the vector operating region is blocked in the presence of an excess of tryptophan (100 ⁇ g / ml).
  • the culture After reading the optical density at 580nm, the culture is diluted in order to obtain an optical density of 1 in the preceding medium (TSB medium with yeast extract and kanamycin).
  • TLB medium with yeast extract and kanamycin.
  • the synthesis of the protein LP40 is induced by the addition of indolacrylic acid (analog of tryptophan) at the final concentration of 25 ⁇ g / ml.
  • the culture is maintained at 37 ° C. with stirring for 5 hours. 2.1.4. Renaturation and purification of the LP40 protein.
  • the cells After centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C), the cells are resuspended in a 25 mM Tris MCI buffer pH 8.5. Sonication allows the release of inclusion bodies.
  • the inclusion body pellet obtained by centrifugation (25 min at 10000 g at 4 ° C) is taken up in a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing 5 mM MgCl 2 , then centrifuged (15 min at 10000 g). Denaturation of the protein is obtained by incubation of the inclusion bodies at 37 ° C. for 2 hours in a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing 7M guanidinium hydrochloride or urea (denaturing agent) and OmM dithiothreitol (reduction of disulfide bridges). Centrifugation (1 5 min at 10000 g) eliminates the insoluble part of the inclusion bodies.
  • the sample is dialyzed against a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing 0.1% Zwittergent 3-14 (100 volumes of buffer) overnight at 4 ° C.
  • the anion exchange chromatography step is carried out on the Biorad Macro Prep High Q support as described above (Example 1).
  • the fractions containing the LP40 protein are combined and then concentrated by ultrafiltration before a new dialysis against a 20mM citrate buffer pH 3 containing 0.1% Zwittergent 3-14 (100 volumes of buffer) overnight at 4 ° C.
  • the cation exchange chromatography step is carried out on the Biorad Macro Prep High S support as described in Example 1.
  • the fractions containing the LP40 are combined and then concentrated by ultrafiltration.
  • the Klebsiella pneumoniae (P40) OmpA gene contains 1008 base pairs (Sequence ID No "1) and codes for a protein of 335 amino acids (Sequence ID No 2).
  • the LP40 gene has 1035 base pairs (Sequence ID No.3) and codes for a protein of 344 amino acids (Sequence ID No.4).
  • As regards the part of the OmpA gene there are some differences at the end coding for the two amino acids in the C-terminal position. These differences in fact concern only three nucleotides.
  • a denaturation-renaturation cycle makes it possible to obtain 300 mg of protein (estimation by assay according to the Lowry method). 75 mg of LP40 are purified after the two chromatographic steps.
  • the LP40 protein is concentrated after purification in order to reach a final concentration of between 5 and l Omg / ml.
  • the electrophoretic profiles show a degree of purity of the order of 95%.
  • the protein is specifically recognized by a natural anti-P40 monoclonal antibody obtained in mice.
  • the state of the protein is followed by SDS-PAGE.
  • the P40 protein extracted from the membrane of Klebsiella pneumoniae has a characteristic electrophoretic (migration) behavior.
  • the native form indeed has a lower molecular weight than the denatured form ( ⁇ -helix structure) under the action of a denaturing agent, such as urea or guanidinium hydrochloride, or by heating to 100 ° C in the presence of SDS.
  • the protein LP40 is not correctly renatured at the end of renaturation, whether this is carried out in the absence or in the presence of 0.1% (w / v) Zwittergent 3- 14.
  • EXAMPLE 3 Cloning, expression and purification of the transmembrane part of the P40 protein.
  • the gene sequence corresponding to the fragment sought was amplified by PCR from the DNA of a miniprep of the vector pRIT28P40, then purified and cloned in the same vector. A sequencing is carried out in order to verify that no mutation has occurred during the amplification.
  • This gene is then cloned as described above (Example 2) into the vector pTrp to constitute the plasmid pTrpL ⁇ P40F8.
  • the fusion protein L ⁇ P40F8 is expressed in Escherichia coli
  • the gene for the protein L ⁇ P40F8 comprises 567 base pairs (sequence ID no. 5) and codes for a protein of 11-18 amino acids (sequence ID no. 6).
  • EXAMPLE 4 Expression and purification of the BB protein
  • the BB protein gene is cloned into the pva expression vector inducible by the presence of the tryptophan operon gene, carrying genes for resistance to ampicillin and tetracycline and having an origin of replication in Escherichia coli.
  • the BB protein is expressed and produced in Escherichia coli RV 308 (strain ATCC 31608) in the form of inclusion bodies.
  • the competent Escherichia coli RV 308 strains are transformed by the vector pvaBB.
  • a preculture is carried out with stirring at 37 ° C. overnight in a medium based on soy tryptic broth (TSB medium) supplemented with yeast extract and in the presence of tetracycline (8 ⁇ g / ml) and ampicillin (200 ⁇ g / ml).
  • TLB medium soy tryptic broth
  • tetracycline 8 ⁇ g / ml
  • ampicillin 200 ⁇ g / ml
  • the vector operating region is blocked in the presence of an excess of tryptophan (100 ⁇ g / ml).
  • the culture After reading the optical density at 580nm, the culture is diluted in order to obtain an optical density of 1 in the preceding medium (TSB medium with yeast extract and tetracycline / ampicillin).
  • TLB medium with yeast extract and tetracycline / ampicillin.
  • the synthesis of the BB protein is induced by the addition of indolacrylic acid (analog of tryptophan) at the final concentration of 25 ⁇ g / ml.
  • the culture is maintained at 37 ° C. with stirring for 5 hours.
  • the cells After centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C), the cells are resuspended in 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5. Sonication allows the release of inclusion bodies.
  • the inclusion body pellet obtained by centrifugation (25 min at 10000 g at 4 ° C) is taken up in a 25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 containing 5 mM MgCl 2 , then centrifuged (15 min at 10000 g). Denaturation of the protein is obtained by incubation of the inclusion bodies at 37 ° C.
  • the BB protein is purified by affinity chromatography on an HSA-Sepharose support (support prepared by coupling of human serum albumin on a Pharmacia gel "CNBr- activated Sepharose 4B").
  • HSA-Sepharose support support prepared by coupling of human serum albumin on a Pharmacia gel "CNBr- activated Sepharose 4B"
  • the unbound proteins are eluted with a 25 mM Tris / HCl buffer pH 8.5, 0.2 M NaCl, 0.05% Tween 20 and EDTA ImM.
  • the BB protein retained on the support is eluted with a 0.5 M acetic acid solution, pH 2.7.
  • the fractions containing the protein of interest are pooled and then concentrated by ultrafiltration.
  • the BB protein gene has 774 base pairs (Sequence ID
  • the protein expressed comprises from the N-terminal end (see Sequence ID No. 7):
  • the protein produced has a molecular mass of approximately 29kDa (analysis by SDS-PAGE).
  • EXAMPLE 5 Isolation and purification of the oligosaccharides of Salmonella enteritidis from lipopolysaccharides.
  • the bacteria Salmonella enteritidis SH 1 262 are cultivated in a 10 liter fermenter at 37 ° C., at pH 7.0, with vigorous stirring, in a Ty medium.
  • the cells are killed by the addition of 1% formaldehyde and are collected by centrifugation at 4000 g for 20 min at 4 ° C. After washing in PBS and a new centrifugation, carried out as above, the pellet is resuspended at a concentration of the order of 20 mg (dry weight) / ml.
  • the LPS are extracted by the phenol method (Westphal 0., L ⁇ deritz O. and Bister F., 1952, Z. Naturforsch. 7, 148-155) and the aqueous phase is collected and lyophilized.
  • Partially defatted LPS are prepared by hydrolysis of the phosphate and ester bonds at the lipid part (lipid A) by a treatment carried out in the presence of 0.15M sodium hydroxide at 100 ° C. for 2 hours. After centrifugation, the pH is adjusted to 3.5 and the free fatty acids are eliminated by successive extractions with chloroform. The pH is then adjusted to 7.0 before the LPS thus delipidated are dialyzed against water and finally lyophilized.
  • the oligosaccharides are prepared from partially delipidated LPS using the endorhamnosidase activity associated with bacteriophage P36.
  • a dialysis rod containing phage P36 dialysis beforehand against a 5mM ammonium carbonate buffer pH 7, 1, are added the LPS obtained previously in a ratio lg of LPS / 10 14 pfu of phage. Dialysis is carried out at 37 ° C against 600 to 800 ml of the preceding buffer. After 50 hours the dialysis bath is changed and the dialysis is renewed for an additional period of approximately 40 hours. The two counter-dialysis solutions are then mixed and then concentrated using a rotary evaporator. The oligosaccharides are fractionated by molecular sieving chromatography.
  • the concentrated oligosaccharides are deposited on a column (2.5 x 170 cm) of Biogel P2 or P4 (Biorad, 200-400 mesh) eluted with water (flow rate 8.5 ml / h).
  • the fractions containing the oligosaccharides are detected by the phenol method (+ sulfuric acid). After analysis of the fractions by thin layer chromatography, the fractions containing the various isomers are combined and then lyophilized.
  • the purity of the oligosaccharides obtained is determined by nuclear magnetic resonance and mass spectrometry.
  • EXAMPLE PLE 6 Coupling of ol igosaccha wrinkles isolated from lipopolysaccharides of Salmonella enteritidis to the protein P40.
  • the oligosaccharides (10 to 40 mg) are dissolved in 0.5 ml of water. This oligosaccharide solution is added dropwise with stirring to 1 ml of a para-aminophenylethylamine solution diluted in water (v / v) containing 20 mg of sodium cyanoborohydride. After adjusting the pH to 8.0 using NaOH I N, the reaction mixture is left at room temperature for 24 hours. Excess reagents are removed by gelfiltration on a column of Biogel P2. The fractions containing the derived oligosaccharides are collected, concentrated to dryness using a rotary evaporator then the oligosaccharides are taken up in 3 ml of 80% ethanol.
  • the aqueous phase is concentrated to dryness and the oligosaccharides are taken up in 0.5 ml of 0.1 M bicarbonate buffer pH 8.2 containing 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the P40 protein (LP40 or ⁇ P40F8) in solution in a 0.1 M bicarbonate buffer pH 8.2 containing 0.1% Zwittergent 3-14 (2.3 ml, concentration of the order of 5 mg / ml) is added drop by drop with constant stirring with oligosaccharides.
  • the pH is adjusted to 8.7 using IM soda and the reaction mixture is kept at room temperature for 48 hours.
  • Uncoupled oligosaccharides are eliminated by a series of several dilutions and concentrations using an Amicon shaking cell equipped with a Diaflo membrane having a cutoff threshold of 30kDa.
  • the conjugates obtained are dialyzed several times against 1 liter of PBS buffer containing 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the substitution rate is determined after estimation of the quantities of oligosaccharides by the assay method using phenol (+ sulfuric acid), and of protein by the Lowry method.
  • the conjugates are stored at -20 ° C.
  • the degree of substitution estimated by assaying the proteins and oligosaccharides is 5.3 moles of icosasaccharides / mole of P40. This value is in agreement with that established after SDS PAGE of the conjugate.
  • mice females NMRI, lS20g, 6 / lot are immunized daily
  • Each mouse receives a dose of 0.5 ml of the conjugate prepared in Example 3.
  • the conjugates (10 ⁇ g) are injected in the presence or in the absence of complete Freud's adjuvant and the injections are carried out intraperitoneally.
  • the blood samples are taken by puncture on days 0 and 35.
  • the antibody responses are evaluated on the individual sera collected by the EL1SA method.
  • the anti-icosasaccharide IgGs of the sera are isolated on the BSA-hexadecasaccharide support and are revealed using an anti-mouse IgG antiserum labeled with alkaline phosphatase.
  • the optical density is determined at 405nm. 6.2. Results.
  • the P40 / icosasaccharide conjugate When injected in the presence of complete Freud's adjuvant, the P40 / icosasaccharide conjugate allows the induction of a response directed against the significant oligosaccharide from day 35 (3 immunizations): the antibody titer is close to 1 / 1.10 5 .
  • this titer is maintained when the immunizations are carried out in the absence of adjuvant.
  • the anti-oligosaccharide antibody titers are in fact between 1 / 1.10 4 and 1 / 1.10 5 .
  • EXAMPLE 8 Demonstration of the immunogenic power of the P40 / icosasaccharide conjugates in rabbits.
  • Rabbits (New Zealand white rabbits, 2-3 kg) are immunized on days 0.14 and 28.
  • the P40 / oligossacharid conjugates (10 ⁇ g) are injected into the popliteal lymph nodes in the presence (v / v) or absence of Freud's complete adjuvant.
  • On days 0, 14, 28 and 56 blood samples are taken and the antibody responses are evaluated on the individual sera by the ELISA method.
  • the titration plates are covered by 2 different antigens: the P40 protein and the LPS from which the oligosaccharides coupled to P40 are derived.
  • Antibodies are revealed using an anti-rabbit IgG conjugate labeled with alkaline phosphatase. The optical density is determined at 405nm.
  • the icosasaccharide when presented by the protein P40, induces in the presence of adjuvant of Freud an important response against the lipopolysaccharide from which it is derived: titer greater than 1 / 1.10 6 .
  • the response directed against the icosasaccharide when presented by P40 is weaker than that obtained in the presence of adjuvant, but significantly greater than that induced after injection of the conjugate BSA-octasaccharide.
  • FIG. 2 presents the results of the ELISA assay carried out against the LPS from which the icosasaccharide coupled to the protein P40 is derived. After 56 days the antibody titer is greater than 1/10000.
  • EXAMPLE 9 Challenge experiment in mice after passive transfer.
  • mice receive an intravenous injection of 0.2 ml of a hyperimmune serum obtained in rabbits after an immunization cycle carried out under the conditions previously described in Example 5 (injections in the absence of adjuvant, collection of the serum on D56).
  • Salmonella enteritidis SH 2204 is carried out 2 to 3 hours after injection of the hyperimmune serum.
  • the bacteria are injected into the animal intraperitoneally.
  • the mice are observed up to 60 days after the injection.
  • mice 60 days after challenges made by injecting doses of 1.3 and 13 times the LD50, all the mice are alive (Table 1), the dose 52 x LD50 being excessive (death of animals).
  • Table 1 Challenge experiments in mice after passive transfer of a hyperimmune rabbit serum or after immunization with the P40-icosasaccharide conjugate. Determination of the percentage of live animals 60 days after intraperitoneal injection of a dose of Salmonella enteritidis bacteria.
  • EXAMPLE 10 Challenge experiment in mice after immunization with the P40 / icosasaccharidc conjugate.
  • mice (NMRI females, 20 g, 6 / lot) are immunized with the P40 / icosasaccharide conjugate in the absence of adjuvant as described in Example 4.
  • Vaccination with the P40-icosasaccharide conjugate makes it possible to directly protect the mice against a challenge by Salmonella enteritidis. Immunizations with this conjugate indeed make it possible to increase the LD50 by a factor of at least 10 (Table 1), the LD50 can then be greater than 3.4 ⁇ 10 6 / ml.
  • GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC 48 Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser 1 5 10 15 CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC 96
  • GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC 816
  • GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205
  • GAC ACT TAC AAA ⁇ A ATC CTT AAT GGT AAA ACA ⁇ G AAA GGC GAA ACA 672 Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 210 215 220 ACT ACT GAA GCT G ⁇ GAT GCT GCT ACT GCA AGA TCT ⁇ C AAT ⁇ C CCT 720 Thr Thr Glu Al ⁇ Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro 225 230 235 240

Abstract

La présente invention concerne un complexe immunogène, caractérisé en ce qu'il consiste en au moins un épitope oligo- ou polysaccharidique naturellement présent dans des bactéries, couplé à une protéine porteuse choisie parmi la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque, les protéines de membrane externe de bactérie gram negatif, ou leurs fragments. L'invention concerne également des vaccins comprenant un tel complexe immunogène, et procédé de préparation de ce complexe.

Description

COMPLEXE IMMUNOGENE, SON UTILISATION, SON PROCEDE DE PREPARATION ET VACCIN LE CONTENANT
La présente invention concerne de nouveaux complexes immunogènes comprenant un dérivé saccharidique, utiles notamment comme médicaments et en particulier comme vaccins.
Protéines et polysaccharides sont les deux principaux types d'antigènes de surface rencontrés chez les bactéries et les champignons et sont par leur caractère antigénique d'excellents outils pouvant entrer dans la conception de vaccins. Toutefois la mise au point de vaccins définis dépourvus d'effets secondaires nécessite l'emploi d'antigènes vaccinants de faible masse moléculaire, principalement des peptides ou des oligosaccharides. Ces antigènes, mais aussi d'autres de masse moléculaire supérieure tels que les polysaccharides, ne peuvent induire seuls une réponse immunitaire qui soit intense et durable.
Le potentiel des poh saccharides bactériens dans la préparation de vaccins est apparu dès le début du XXème siècle. Ces composés jouent en effet un rôle important dans la structure et le pouvoir pathogène de certaines bactéries Gram positives et négatives. Deux types de poh saccharides bactériens sont d'excellents candidats à titre d'agent vaccinal. 11 s'agit des polysaccharides issus de la capsule bactérienne et des polysaccharides issus des lipopoh saccharides (LPS) de la membrane externe des bactéries Gram négatives.
Ce sont des polymères composés essentiellement d'une partie glucidique, et dont une partie de la molécule est exposée à la surface de la bactérie. Ils sont constitués d'un enchaînement linéaire d'unités répétitives, caractéristiques d'une espèce bactérienne donnée, dont le nombre peut varier de une à plusieurs centaines, expliquant ainsi leur poids moléculaire parfois très élevé. Chaque unité répétitive est constituée elle-même de plusieurs monosaccharidcs reliés entre eux par des liaisons glycosidiques, généralement de 1 à 7 résidus monosaccharidiques. Ces derniers peuvent se voir plus ou moins substitués par des groupements minéraux tels que des phosphates ou par des groupes organiques, tels que des acides, des aminés, des alcools, des acides gras ou des acides aminés. Le caractère répétitif des épitopes des polysaccharides bactériens (petit nombre d 'épitopes différents), qu'il s'agisse de polysaccharides isolés de la capsule bactérienne ou de lipopolysaccharides de la membrane externe des bactéries Gram négatives, en fait en effet des immunogènes T- indépendants. Cela se traduit par l'absence de réponse immunitaire à ces antigènes chez le jeune enfant et par l'absence de mémoire immunitaire chez l'adulte (pas de réponse immunitaire de type cellulaire, peu ou pas d'effet de rappel, réponse anticorps restreinte à la classe des IgM).
Des vaccins comprenant un extrait polysaccharidique se sont révélés relativement efficaces chez l'adulte à faible dose, 25 à 50 μg. Parmi les vaccins à base de polysaccharides bactériens, on compte à ce jour des vaccins contre les infections
- à Neisseria meningitidis : vaccin tétravalent contre les souches des groupes A, C, YV135 et Y, - à Streptococcus pneumoniae : vaccin pneumococcique multivalent associant 23 sérotypes de polysaccharides capsulaires,
- à Salmonella typhi : vaccin composé du polysaccharide capsulaire de S. typhi. Toutefois ces vaccins sont particulièrement inefficaces chez les jeunes enfants. D'autres approches ont été testées dans la stratégie vaccinale contre les infections à Salmonella. En effet, les bactéries du genre Salmonella sont des entérobactéries virulentes à tropisme digestif, pathogènes pour l'homme et pour de nombreux animaux vertébrés. Le genre Salmonella est classiquement constitué de plus de 2000 sérotypes différents. Les principales pathologies induites par ces bactéries sont (pour des revues générales voir: Le Minor, L, 1987, Salmonella dans Bactériologie Médicale, L Le Minor et M. Véron Eds., Médecine-Sciences Flammarion Paris, p. 41 1- 427, Pegues, D.A. and Miller, S.I., 1994, Salmonellosis including typhoïd fever, Curr. Opin. Infect Dis. 7, 616-623): - chez l'animal, des toxi-infections:
. spécifiques de certaines espèces, Salmonella abortus-ovis chez les ovins, Salmonella galinarum chez les volailles,
. non spécifiques provoquées par les sérotypes dits "ubiquitaircs" (Salmonella Typhimurium, enteritidis,...), - chez l'homme:
. les fièvres typhoïdes (Salmonella typhi ) et les fièvres paratyphoïdes (Salmonella paratyphi A, B et D),
. les toxi-infections alimentaires, pour lesquelles les sérotypes les plus fréquemment incriminés sont Salmonella typhimurium, enteritidis et panama.
Actuellement trois types de vaccins anti-typhoïdiques sont disponibles sur le marché (pour des revues générales voir : Levine, M. M., Hone, D.M., Stocker, B.A.D. et Cadoz, M., 1990, New and improved vaccines against typhoïd fever dans New Génération Vaccines, G.C. Woodrow and M.M. Levine Eds, Marcel Dekker Inc. New York and Basel, p. 269-287, Jalla, A. G. S., Sazawal, S. et Bhan, M.K., 1994, Advances in vaccines for typhoïd fever, Indian J. Pediatr. £1 321-329):
- Les vaccins inactivés
Les formes injectables de type "vaccin bactérien inactivé" sont les formes vaccinales les plus anciennes. Il s'agit de vaccins pouvant contenir 500 à 1000 millions de bactéries par dose, sous forme liquide. Les bactéries sont inactivées par des traitements par la chaleur et/ou par des composés chimiques tels que l'acétone, le formol ou le phénol. Selon les sérotypes bactériens qu'ils contiennent, on distingue
- les vaccins anti-typhoïdiques: on trouve dans cette classe les spécialités "Typhoïd vaccine" de la Société WYETH-AYERST aux Etats-Unis, ou "Typhoïd monovalent" de la Société WELLCOME au Royaume Uni,
- les vaccins anti-typho/paratyphoïdiques: on recense dans cette seconde classe les vaccins "Vac TAB" de PASTEUR en France ou "Typhidrall" de BIOCINE SCLAVO en Italie.
En France, le vaccin TAB (PASTEUR) est un vaccin bactérien inactivé complet liquide trivalent, associant Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A et B. Son efficacité relative est en fait limitée à la valence T. Ce vaccin est réactogène: il provoque dans un tiers des cas des réactions locales et générales précoces. 11 est injecté par voie sous-cutanée, à raison de 2 à 3 injections, à 2 à 4 semaines d'intervalle, suivies d'un rappel. En France la réglementation actuelle qui l'impose encore à certaines catégories professionnelles, dont les professions militaires et de santé, n'est en fait plus justifiée. En milieu militaire, on utilise maintenant un vaccin monovalent T, non commercialisé.
L'immunisation des enfants de moins de un an n'est en général pas recommandée à cause des effets indésirables pouvant survenir après l'injection ( fortes douleurs et fièvre importante).
- Un vaccin vivant atténué.
Le vaccin typhoïdique oral Ty21 a ("Vivotif", BERNA) contient une souche vivante défective de Salmonella typhi, dépourvue de galactose-4- épimérase. Son administration est orale, sous la forme de capsules gastrorésistantes contenant 1 à 8.109 bactéries vivantes sous forme lyophilisée. Le schéma vaccinal comporte 3 doses successives aux jours 1 , 3 et 5, avec prises simultanées de bicarbonate de soude pour neutraliser l'acidité gastrique. Evaluée dans des zones d'endémie en Egypte et au Chili, la valeur protectrice serait comprise entre 60 et 90%. Il n'y aurait pas d'effets indésirables. La protection vaccinale devient effective environ 10 jours après la dernière dose. La protection est valable pour une période pouvant aller de 1 à 7 ans, et il est ainsi recommandé aux voyageurs à destination de régions endémiques de répéter la vaccination annuellement. Des formes orales plus anciennes sont encore disponibles. U s'agit de vaccins inactivés dont l'efficacité n'a toutefois pas été clairement établie ("Taboral" de la Société BERNA, "Enterovaccino" en Italie).
Un vaccin de type sous-unitaire. Le vaccin "Typhim Vi" de l'Institut MERIEUX est préparé à partir de polyoside capsulaire Vi purifié de Salmonella typhi. Il s'agit d'une solution injectable contenant 25 μg de polysaccharide. Une seule injection, sous-cutanée ou intramusculaire, assure une protection uniq uement contre le risque infectieux lié à Salmonella typhi chez les adultes et les enfants de plus de 5 ans. Ce vaccin ne confère pas de protection vis-à-vis des Salmonella paratyphi A et B, ces sérotypes n'étant pas encapsulés. L'immunité apparaît environ 15 jours à 3 semaines après l'injection. La durée de la protection est au moins égale à 3 ans. Dans les territoires à forte endémie, le taux de protection observé est aux alentours de 60% .
Aucune de ces spécialités n'est suffisamment efficace dans le traitement et la prévention de la fièvre typhoïde. La durée de la protection est souvent limitée. La vaccination des enfants est difficile et celle des nourrissons impossible. Les vaccins inactivés ne peuvent en aucun cas être prescrits chez l'enfant et le nourrisson et les deux dernières formes vaccinales ne peuvent quant à elles être utilisées chez le nourrisson et l'enfant en bas âge. Le vaccin oral Ty21a n'est en effet pas recommandé chez l'enfant de moins de 6 ans et le vaccin polysaccharidique "Typhim Vi" ne peut être injecté chez l'enfant de moins de 18 mois. Afin d'éviter ces inconvénients, il serait souhaitable de pouvoir disposer de complexes immunogènes capables de conférer une bonne immunité contre les souches pathogènes, en entraînant une réponse immunitaire à la fois de type humoral et cellulaire, chez l'enfant et le nourrisson, l'induction d'un effet mémoire, et provoquant peu d'effets secondaires.
Ces buts, et d'autres qui apparaîtront par la suite, peuvent être atteints grâce à des complexes immunogènes, caractérisés en ce qu'ils consistent en au moins un épitope oligo- ou polysaccharidique naturellement présent dans des agents pathogènes tels que les bactéries, couplé à une protéine porteuse choisie parmi la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque, les protéines de membrane externe de bactérie gram négatif, ou leurs fragments. En effet le couplage par une liaison covalente de l'oligosaccharide ou du polysaccharide transforme ces derniers en immunogène T dépendants. L'épitope oligo- ou polysaccharidique est susceptible d'être obtenu à partir de bactéries, gram négatif ou gram positif, et en particulier à partir de lipopolysaccharides de membrane ou des oligosaccharides de capsule, de bactéries du gen re Salmonella, Escherich ia, Neisseri a , Shigel la, I laemophilus ou Klebsiella.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'agent pathogène peut être Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Neisseria miningitidis ou Streptococcus pneumoniae.
L'épitope oligo- ou polysaccharidique peut également être obtenu à partir d'un champignon, en particulier appartenant à l'un des genres Candida, Cryptococcus ou Lipomyces.
Les polysaccharides issus de lipopolysaccharides sont préparés par extraction des LPS de la membrane puis élimination du lipide A par hydrolyse ménagée. Les polysaccharides capsulaires sont quant à eux plus facilement isolés de la suspension bactérienne : un chauffage à 100° C pendant une dizaine de minutes (solubilisation) suivi d'une centrifugation permet d'isoler le polysaccharide capsulaire Vi de Salmonella typhi. Les deux types de polysaccharides peuvent ensuite être purifiés par chromatographie et/ou par filtration sur membrane. L'utilisation de polysaccharides "entiers" dans un procédé de couplage peut voir apparaître certains problèmes techniques dûs principalement à la taille trop importante de ces composés : formation d'un gel, précipitation.
Afin de surmonter ce problème différentes méthodes de clivage du polysaccharide peuvent être utilisées : fragmentation aux ultra-sons, dépolymérisation par oxydo-réduction, hydrolyses ménagées en milieu acide ou basique, hydrolyse enzymatique.
La méthode de fragmentation permettant l a libération d'oligosaccharides doit être adaptée au polysaccharide étudié. Un oligossacharide est un composé, pouvant dériver d'un polysaccharide, et qui présente par rapport au polysaccharide de départ un nombre réduit d'unités de répétition osidiques. La Demanderesse a maintenant mis en évidence que le couplage par liaison covalente de l'oligosaccharide ou du polysaccharide avec une protéine porteuse telle que définie précédemment permettait de résoudre les problèmes posés par l'utilisation de dérivés polysaccharidiques seuls, ou couplés à d'autres porteurs.
Par exemple, le seul vaccin conjugué sur le marché est un vaccin destiné à prévenir chez l'homme les infections invasives à Haemophilus influenzae de type b (méningites). Pour les q uatre spécialités commercialisées, l'antigène vaccinant conjugué est un oligosaccharide ou un polysaccharide isolé de la capsule : le PRP, polyribosyl ribitol phosphate.
Les protéines porteuses utilisées dans la conception de ce vaccin conjugué sont de deux types :
- Les anatoxines tétanique (TT) et diphtérique (DT), - un extrait de protéines membranaires de Neisseria meningitidis, l'OMPC.
Les anatoxines tétanique et diphtérique sont actuellement les protéines porteuses les mieux caractérisées, tant d'un point de vue structural que biologique (propriétés vaccinales, propriétés de protéines porteuses), et sont pour ces raisons considérées comme les protéines porteuses de référence.
Ces protéines sont utilisées dans le cadre des vaccinations antitétanique et antidiphtérique. Les vaccins correspondants sont très efficaces (protection proche de 100% dans les deux cas) et bien tolérés.
Ce sont des exotoxines bactériennes qui peuvent être extraites et purifiées d'un filtrat de culture : Clostridium tetani pour TT et Corynebacterium diphteria pour DT. La toxine TT est une protéine de 150kDa. La toxine DT possède une masse moléculaire inférieure et est sécrétée sous forme d'une simple chaine polypeptidique de 535 acides aminés. Après purification, ces protéines sont inactivées par la chaleur et le formol. Elles peuvent être combinées entre elles (vaccin DT), et avec de nombreux autres vaccins (coqueluche, poliomyélite...). Thermorésistantes, elles se conservent à +4°C pendant quelques années, mais ne doivent pas être congelées. L'emploi trop fréquent de ces protéines (vaccination antiténique et antidiphtérique, vaccins conjugués) peut toutefois aller à l'encontre d 'une réponse intense contre l'haptène. Le risque de leur utilisation trop fréquente est en effet de voi r la réponse immunitai re porter majoritairement contre ces protéines, si les sujets immunisés présentent déjà des taux d'anticorps élevés contre celles-ci.
Le second type de porteur utilisé dans ce même vaccin est en fait un extrait de protéines membranaires : l'OMPC, "Outer membrane protein complex", isolé de Neisseria meningitidis. Ce complexe vésiculaire contient en fait plusieurs protéines associées à des lipides et des lipopolysaccharides.
Selon un aspect préféré de l'invention, la protéine porteuse comporte au moins une partie d'une protéine de type OmpA de bactéries gram négatif, en particulier d'une protéine de membrane externe de Klebsiella pneumoniae.
Des protéines convenant particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention sont des protéines dérivées de la protéine de membrane majeure de Klebsiella pneumoniae 1- 145, désignée ci-après p40; elles présentent notamment l'une des séquences ID n° 2, ID n" 4 ou ID n° 6. D'autres protéines porteuses d 'intérêt dérivées de la protéine de membrane externe de K. Pneumoniae comprennent des fragments
- contenant la troisième et la quatrième boucle extramembranaire flanquant une séquence intramembranaire,
- contenant une boucle extramembranaire invariable et la séquence intramembranaire adjacente.
On définit comme boucles extramembranaires invariables les séquences de P40 homologues avec les séquences des boucles conservées entre différentes espèces d'entérobactéries. Les séquences des boucles extramembranaires non conservées au cours de l 'évolution sont dénommées boucles variables . La localisation des boucles extramembranaires est réalisée d'après le modèle de VOGEL et JAHNIG ( 1986, J. Mol. Biol., 190 : 191- 199) concernant l'OmpA d'E. coli. En particulier, on utilisera les fragments compris entre les acides aminés 127 à 179 de la séquence ID n° 1.
D'autres séquences appropriées sont respectivement les séquences comprises entre les amino-acides 108 à 179 de la séquence ID n* 1 , les amino-acides 1 à 179 de la séquence ID n° 1 , ainsi que des séquences présentant au moins 90% d'homologie avec les séquences précédentes.
Selon un autre aspect avantageux de l'invention, la protéine porteuse comporte tout ou partie du domaine de liaison à la sérumalbumine humaine de la protéine G du streptocoque (ci-après appelée BB). Cette protéine présente une masse moléculaire de 29 kDa et peut être exprimée et produite chez Escherichia coli sous forme de corps d'inclusion.
La protéine porteuse peut notamment présenter la séquence ID n° 8, ou une séquence présentant au moins 80%, et de préférence au moins 90% de similarité avec ladite séquence ID n° 8.
Toutes ces protéines porteuses peuvent être extraites à partir des bactéries d'origine ou bien être obtenues par la voie de l'ADN recombinant.
Des complexes immunogènes selon l'invention pourront notamment consister en un conjugué entre une protéine porteuse telle que définie précédemment et au moins un oligosaccharide substantiellement purifié, susceptible d'être obtenu à partir de lipopolysaccharides de membrane de bactéries du genre Salmonella ; en particulier la bactérie du genre Salmonella appartiendra à un sérogroupe porteur d'une spécificité antigénique choisie dans le groupe suivant : 0:1 , 0:2, 0:4, 0:6, 7, 8, 0:3 et 0:9. Dans un mode de réalisation préféré, le complexe immunogène contient un oligosaccharide susceptible d'être obtenu à partir du lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis de spécificité antigénique 0:9.
En effet, les différents sérotypes de Salmonella sont identifiés par leur formule antigénique ; il sont classés en différents groupes, en fonction de leur spécificité antigénique O.
Par exemple, Salmonella typhi appartient au groupe D, de spécificité 0:9, de même que S. enteritidis, S. panama, et S. dublin.
Parmi les autres spécificités polysaccharidiques majeures on peut citer : - le sérogroupe A, de spécificité 0: 2, ayant comme représentant S. paratyphi A,
- le sérogroupe B, de spécificité 0:4, ayant comme représentan t S. paratyphi B et S. typhimurium, - le sérogroupe C, de spécificité 0:6, 7, 8, ayant comme représentant S. infantis et S. bovis morficans,
- le sérogroupe E, de spécificité 0:3, avec S. meleagridis
Les oligosaccharides appartenant aux spécificités antigéniques majeures énumérées ci-dessus seront particulièrement adaptés à la mise en oeuvre de l'invention. Par exemple, un vaccin préparé à partir d'oligosaccharide isolé de lipopolysaccharide de S. enteritidis, porteur de la spécificité antigénique 0:9, permettra de protéger contre les septicémies à Salmonella typhi et contre la fièvre typhoïde, mais il pourra également être utilisé dans la prévention chez l'homme et l'animal des toxi- infections et zoonose dues aux Salmonelles du même sérogroupe.
Des oligosaccharides selon l'un des aspects préférés de l'invention présentent au moins une unité : αD galactose p( l-2)-αD mannose p( l-4)-αL Rhamnose p( l-3)
αtyvelose p( l-3)
Plus particulièrement, l'invention a pour objet un complexe immunogène comprenant au moins un oligosaccharide de formule
αD-Galp( l-2)
Figure imgf000012_0001
dans laquelle Gai représente le galactose
Man représente le mannose Rha représente le rhamnose Tyv représente le tyvélose et n peut varier entre 1 et 24. De préférence, n peut varier entre 1 et 5, et l'oligosaccharide est couplé avec une protéine présentant l'une des séquences ID n" 2, ID n" 4, ID n" 6, ou ID n° 8, ou possédant au moins 80% de similarité avec l'une des séquences ID n° 2, ID n" 4 ou ID n° 6 ou ID n" 8. L'invention a également pour objet l'utilisation de complexes immunogènes tels que définis précédemment, pour la préparation d'un vaccin ; selon un aspect particulièrement avantageux, les complexes sont utiles pour la préparation d'un vaccin destiné à protéger un animal contre les infections provoquées par les bactéries Salmonella appartenant au sérogroupe antigénique 0:9.
On pourra utiliser un mélange d'oligosaccharides pour lesquels, dans la formule ci-dessus, n aura différentes valeurs.
Des complexes immunogènes selon l'invention sont également ceux comprenant un antigène capsulaire de Salmonella. Celui-ci peut être couplé seul à une protéine porteuse telle que définie précédemment, ou bien associé à un complexe comprenant un autre épitope oligo- ou polysaccharidique.
L'invention a également pour objet des composi tions pharmaceutiques contenant au moins un oligosaccharide et/ou complexe antigénique tels que définis précédemment. Elles peuvent également conten ir d 'au tres adjuvants d 'imm unité, et des excipien ts pharmaceutiquement acceptables nécessaires à leur formulation tels que diluant, stabilisant, conservateurs, ete, connus de l'homme du métier.
Selon un aspect avantageux l'invention concerne un vaccin contenant un oligosaccharide de membrane couplé à une protéine porteuse, et comprenant en outre un autre déterminant antigénique. En particulier le vaccin comprend un antigène capsulaire de Salmonella, tel l'antigène capsulaire Vi (homopolymère d'acide N acétylgalacturonique partiellement acétylé) ; ceci permet d'accroître l'efficacité du vaccin contre les bactéries capsulées. Le procédé de préparation du complexe imm unogène peut comprendre les étapes suivantes : a) on isole des oligosaccharides de Salmonell a à partir des lipopolysaccharides de membrane, b) de manière facultative, on purifie les oligosaccharides de manière à conserver des oligosaccharides de même poids moléculaire, c ) les oligosaccharides sont activés chimiquement, d) les oligosaccharides activés sont couplés à une protéine porteuse pour former le complexe immunogène. Selon un aspect préféré, la protéine porteuse est activée avant l'étape d) par une méthode chimique pour faciliter le couplage.
Les méthodes d'activation des oligosaccharides avec formation d'un dérivé isothiocyanatophénylaminé et de couplage de ce dérivé sur une protéine pourront être effectuées comme décrit par: - Me Broom C.R., et al ( 1972, in: Methods in Enzymology, vol. 28B, éd. V. Ginsburg (Académie Press, New York), p. 212-219), ou - Svenson S.B. and Lindberg A.A. ( 1979, J. Immunol. Methods Z5_, 323-335).
D'autres méthodes peuvent être utilisées dans le but d'activer les oligosaccharides puis de coupler les dérivés obtenus sur une protéine : méthodes faisant appel aux borohydrure et cyanoborohydrure de sodium, à l'acide adipique dihydrazide...
Ce couplage pourra notamment suivre le schéma suivant :
Oligosaccharide j-OH HzN-{CH2)2- // W •NH.
NaCNBH: Amiπation réductive
Figure imgf000015_0001
CsCL- Formation d'un isothiocyanate
OligosacchaTïdë~1-HN-(CH2)2-<^\N=C=S
Couplage
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0003
Le couplage d'oligosaccharides de différentes tailles peut être envisagé. Ces oligosaccharides étant libérés par coupure enzymatique (activité endorhamnosidasique d'un phagc), il s'agira de préférence de multiples de 4: tétrasaccharides, octasaccharides, dodécasaccharides, hexadecasaccharides, icosasaccharides... De même le couplage d 'un mélange de ces oligosaccharides (sans purification préalable) est compris dans l'invention.
On peut ensuite effectuer une étape supplémentaire consistant à coupler le complexe obtenu à l'issue de l 'étape d) avec un autre déterminant antigénique de Salmonella.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine comportant l'une des séquences ID n° 2, 4, 6 ou 8 pour améliorer l'immunogénicité d'un oligosaccharide.
Elle comprend également l'utilisation de protéines analogues, dans lesquelles au moins un acide aminé a été remplacé par un acide aminé homologue dans les séquences ID n° 2, 4, 6 ou 8.
Les protéines seront notamment codées par des séquences d'ADN présentant l'une des séquences ID n° 1 , 3, 5 ou 7 ou des séquences équivalentes, compte tenu de la dégénérescence du code génétique. La séquence ID n° 2 représente la séquence complète de la protéine
P40.
On peut également utiliser une protéine recombinante désignée par LP40 (seq ID n° 4), qui comporte en outre un peptide de 9 acides aminés comportant une partie de la séquence leader de l'opéron tryptophane. Enfin les séquences ID n" 5 et 6 correspondent à la totalité de la partie transmembranaire, (Δ P40F8), et sont dépourvues de la partie périplasmique très immunogénique (Puohiniemi, R., Karvonen, M., Vuopio-Varkila, J., Muotiala, A., Helander, I.M. and Sarvas, M., 1990, Infect. Immun. M, 1691-1696). La séquence ID n" 8 correspond au domaine de liaison à la sérumalbumine humaine de la protéine G du Streptocoque.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : Mise en évidence du pouvoir immunogène du conjugué P40- icosasaccharide chez la souris.
Figure 2 : Mise en évidence du pouvoir immunogène du conjugué P40- icosasaccharide chez le lapin.
EXEMPLE 1 : Isolement et purification de la protéine P40 nature lle.
La protéine P40, protéine majeure de la membrane externe de Klebsiella pneumoniae est isolée par extraction en présence d'un détergent à partir de la biomasse Klebsiella pneumoniae, puis purifiée à partir de l'extrait ainsi obtenu par chromatographie d'échange d'anions puis de cations.
1.1. Matériel et méthodes.
1.1.1. Extraction des protéines membranaires.
Le pH de la biomasse Klebsiella pneumoniae (souche 1- 145, 40 à 340g de cellules sèches, 7 à 10 % de cellules sèches) est ajustée à pH 2,5 avec de l'acide acétique pur. Après addition de 0,5 volume d'une solution contenant
6% cétrimide (détergent), 60% éthanol, CaCl 2 1 ,5M (concentrations finales
2% cétrimide, 20% éthanol, CaCl 2 0,5 M ), le pH est ajusté à 2,5 et le mélange est placé sous agitation pendant 16 heures à température ambiante.
1.1.2. Etape de clarification.
Après centrifugation 20 min à 15000g à 4°C, le culot est éliminé. Le surnageant est un extrait de protéines membranaires de Klebsiella pneumoniae.
1.1.3. Précipitation des protéines membranaires.
Les protéines du surnageant sont précipitées par addition de 3 volumes d'éthanol 95 ° à -20°C (concentration finale en éthanol ≈ 80%). Après une agitation rapide, l'ensemble est laissé au repos pendant 1 heure à 4°C minimum . Les protéines précipitées sont recueil l ies par centrifugation 10 min à 10000g à 4°C.
1.1.4. Préparation d'une fraction enrichie en protéines membranaires ( fraction MP) .
Les culots sont remis en suspension dans une solution 1 % de Zwittergent 3- 14 à raison de 5ml/g de culot humide. Après agitation pendant 1 heure (agitateur à hélice) et broyage à l'aide d'un ultra-turrax ( 13500trs/min, 30 sec), le pH est ajusté à 6,5 à l'aide de soude I N. Une centrifugation du mélange permet d'obtenir la fraction MP (élimination de l'insoluble).
1.1.5. Etape de chromatographie d'échange d'anions.
Les protéines du MP sont dialysées pendant une nuit à 4°C contre un tampon Tris/HCl 20mM pH 8,0, 0,1% Zwittergent 3-14. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High Q) équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280nm. La protéine P40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2M en NaCI dans le tampon Tris/HCl 20mM pH 8,0; 0, 1% Zwittergent 3-14.
1.1.6. Etape de chromatographie d'échange de cations.
Les fractions contenant la protéine P40 sont rassemblées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM 10 (seuil de coupure lOkDa) pour des volumes de l'ordre de 100ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure l OkDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4°C contre un tampon citrate 20mM pH3,0, 0, 1 % Zwittergent 3- 14. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20mM pH3,0, 0, 1 % Zwittergent 3- 14. La protéine P40 est éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,7M en NaCl. Les fractions contenant la P40 sont rassemblées et concentrées comme décrit précédemment.
1. 2. Résultats.
Les fractions obtenues après chaque étape chromatographique sont analysées par SDS PAGE afin de rassembler celles contenant la protéine P40.
Après chaque étape, les quantités de protéine_ sont déterminées par dosage selon la méthode de Lowry. La pureté et l'homogénéité de la protéine P40 sont estimées par SDS PAGE avec révélations au bleu de coomassie et au nitrate d'argent.
En fin de procédé de purification, la P40 est concentrée dans le but d'atteindre une concentration en protéine de l'ordre de 5 à 10 mg/mL Les profils électrophorétiques révèlent un degré de pureté supérieur à 90%.
Après immunoblot, la protéine est reconnue spécifiquement par un anticorps monoclonal anti-P40 obtenu chez la souris.
La présence de lipopolysaccharides (endotoxines) contaminants est estimée par la méthode de gélification en tubes ou essai LAL (Lysat d'Amébocytes de Limule). Cet essai réalisé sur la solution finale révèle un taux d'endotoxines inférieur à 160 UE/ml et montre donc que celle-ci satisfait aux normes de la réglementation européenne.
EXEMPLE 2: Clonage, expression et purification de la protéine P40 recombinante.
2.1. Matériel et méthodes. 2.1.1 . Clonage du gène de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Les amorces nucléotidiques ont été déterminées à partir de la partie de la séquence publiée de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae LD 199 (Lawrence J. G. et al., 1991 , J. Gen. Microbiol. 131, 191 1-1921 ), de la séquence conscensus issue de l'alignement des séquences de l'OmpA de différentes entérobactéries ( Escberichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dyscnteriae, Enterobactcr aeroginosae) ainsi que des séquences de peptides obtenues par séquenςage selon la méthode d'Edman de la protéine naturelle isolée de Klebsiella pneumoniae 1- 145 et de peptides isolés après digestion au bromure de cyanogène.
Les oligonucléotides ont été synthétisés selon la méthode chimique des phosphoramidites à l'aide de l'appareil Pharmacia Gène Assembler Plus. Une colonie de Klebsiella pneumoniae 1- 145 est lysée dans 10 μl de tampon de lyse (25mM Taps pH 9,3, 2mM MgC12). 1 μl de cette solution est ensuite utilisé comme source d'ADN pour les réactions d'amplification par PCR. Celles-ci sont réalisées dans 100,ul de tampon d'amplification avec 5pmoles de chaque amorce et une unité enzymatique de Taq polymérase (Perlcin Elmer Cetus). Chaque cycle comprend une étape de dénaturation de 30 secondes à 95°C suivie d'une hybridation de l'amorce avec l'ADN et d'une extension d'une minute à 72°C. 30 cycles sont ainsi réalisés à l'aide d'un thermocycleur Perkin Elmer Cetus Gen Amp PCR 9000. Le gène de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae est clone dans le vecteur pRIT28 (Hultman T. et al., 1988, Nucleosides Nucléotides Z, 629-638), vecteur possédant le gène de résistance à l'ampicilline, les origines de réplication de Escheήchia coli et du phage FI ainsi qu'une portion du gène Lac-Z de Escberichia coli (Is-galactosidase).
Le fragment ainsi clone est séquence à l'aide d'un séquenceur automatique Applied Biosystem 373 DNA Séquenceur. Les réactions de séquenςage sont réalisées à l'aide du kit dye terminator selon les recommandations du fournisseur. 2.1.2. Construction du vecteur d'expression contenant le gène de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Le gène entier de la protéine P40 est ensuite clone dans le vecteur d'expression pTrp inductible par la présence du gène de l 'opéron tryptophane, porteur du gène de résistance à la kanamycine et présentant deux sites de restriction Bsml et Sali.
Pour le clonage un site de restriction Bsml est introduit par PCR en amont du gène de la P40, présentant déjà un site Sali en aval, dans le vecteur pRIT28P40. Le gène de la P40 possédant des sites Bsml/Sall est ainsi clone dans le vecteur pTrp pour constituer le plasmide pTrpLP40.
2.1.3. Expression de la protéine LP40.
La protéine de fusion LP40 est exprimée et produite chez
Escherichia coli sous forme de corps d'inclusion. Celle-ci comportera la séquence complète de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae à laquelle il faut ajouter au niveau de l'extrémité N-terminale un peptide de 8 acides aminés (peptide L) comportant une partie de la séquence leader de l'opéron tryptophane nécessaire à l'expression de la protéine chez Escherichia coli.
L'expression de la protéine LP40 est réalisée chez Escherichia coli
RRIΔM15 (Rϋther, U., 1982, Nucl. Acid Res. Ifl 5765-5772). Une préculture est réalisée sous agitation à 37°C pendant une nuit dans un milieu à base de bouillon tryptique de soja (milieu TSB) complémenté en extrait de levure et en présence de kanamycine 30 μg/ml. La région opératrice du vecteur est bloquée en présence d'un excès de tryptophane (100 μg/ml).
Après lecture de la densité optique à 580nm, la culture est diluée afin d'obtenir une densité optique de 1 dans le milieu précédent (milieu TSB avec extrait de levure et kanamycine). La synthèse de la protéine LP40 est induite par addition d'acide indolacrylique (analogue du tryptophane) à la concentration finale de 25 μg/ml. La culture est maintenue à 37°C sous agitation pendant 5 heures. 2.1.4. Renaturation et purification de la protéine LP40.
Après centrifugation (4000rpm, 10 min, 4°C) , les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris MCI 25mM pH 8,5. Une sonication permet la libération des corps d'inclusion.
Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (25 min à 10000g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5 contenant 5mM MgCl2 , puis centrifugé ( 15 min à 10000g). La dénaturation de la protéine est obtenue par incubation des corps d'inclusion à 37°C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5 contenant 7M chlorhydrate de guanidinium ou urée (agent dénaturant) et l OmM dithiothréitol (réduction des ponts disulfure). Une centrifugation ( 1 5 min à 10000g) permet d'éliminer la partie insoluble des corps d'inclusion.
Après dilution par 13 volumes d'un tampon Tris HCI 25mM pH 8,5 contenant du NaCl (8,76g/l et du Zwittergent 3-14 (0, 1%, p/v), le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante sous agitation au contact de l'air (renaturation par dilution et réoxydation des ponts disulfure).
Après une nouvelle centrifugation, l'échantillon est dialyse contre un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5 contenant 0, 1 % Zwittergent 3- 14 ( 100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C. L'étape de chromatographie d'échange d'anions est réalisée sur le support Biorad Macro Prep High Q. comme décrit précédemment (Exemple 1 ). Les fractions contenant la protéine LP40 sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration avant une nouvelle dialyse contre un tampon citrate 20mM pH 3 contenant 0, 1% Zwittergent 3-14 ( 100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C. L'étape de chromatographie d'échange de cations est réalisée sur le support Biorad Macro Prep High S comme décrit à l'exemple 1. Les fractions contenant la LP40 sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration.
2. 2. Résultats.
Le gène de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae (P40) comporte 1008 paires de bases (Séquence ID N" 1 ) et code pour une protéine de 335 acides aminés (Séquence ID N° 2). Le gène de la LP40 comporte quant à lui 1035 paires de bases (Séquence ID N° 3) et code pour une protéine de 344 acides aminés (Séquence ID N° 4). En ce qui concerne la partie du gène de l'OmpA, on constate quelques différences au niveau de l'extrémité codant pour les deux acides aminés en position C-terminale. Ces différences concernent en fait uniquement trois nucléotides. I l s'agit des nucléotides en position 1027 (C pour G en position 1000 dans la séquence de la P40), 1028 (A pour C en position 1001 dans la séquence de la P40), 1032 (C pour T en position 1005 dans la séquence de la P40). Ces modifications sont dues à l'utilisation lors du clonage du gène de l'OmpA dans le vecteur pRIT28 d'une amorce oligonucléotidiq ue partiellement dégénérée ( séquence Kpnl4) : 5'ATAGTCGACAACTTA A(G)G(C)CCTGCGGCTGAG3'. Ces modifications de la séquence du gène provoquent une unique différence entre les séquences peptidiques de la P40 et de la LP40 exprimée et produite chez Escherichia coli. U s'agit de l'acide aminé en position 343 de la séquence de la LP40, qui est un résidu glutamine (Gin) alors qu'un résidu alanine (Ala) est trouvé dans la séquence de la LP40 (position 334).
A parti r d' une culture d e 1 lit re, un cycle de dénaturation-renaturation permet d'obtenir 300mg de protéine (estimation par dosage selon la méthode de Lowry). 75mg de LP40 sont purifiés après les deux étapes chromatographiques.
Comme précédemment la protéine LP40 est concentrée après purification afin d'atteindre une concentration finale comprise entre 5 et l Omg/ml. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de l'ordre de 95%. Après immunoblot la protéine est spécifiquement reconnue par un anticorps monoclonal anti-P40 naturelle obtenu chez la souris.
L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme, dénaturée ou native, la protéine P40 extraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets β) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices α) sous l'action d'un agent dénaturant, tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidinium, ou par chauffage à 100°C en présence de SDS. La protéine LP40 n'est pas correctemen t renaturée en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0, 1% ( p/v) Zwittergent 3- 14. Par contre une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCl 25mM pH 8,5 contenant 0, 1 % (p/v) Zwittergent 3- 14. Toutefois il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante sont réalisés eux-mêmes en présence de Zwittergent 3- 1 4 (résultats négatifs en absence de détergent).
EXEMPLE 3 : Clonage, expression et purification de la partie transmembranaire de la protéine P40.
Afin de cloner la partie du gène correspondant à la totalité de la partie transmembranaire dépourvue de la partie périplasmique de la protéine P40 un oligonucléotide complémentaire de l'extrémité codant pour la partie C-terminale de cette région du gène, séquence comprise entre les acides aminés 1 à 179 de la protéine P40 et baptisée fragment F8, a été synthétisé.
La séquence du gène correspondant au fragment recherché a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN d'une miniprep du vecteur pRIT28P40, puis purifiée et clonée dans le même vecteur. Un séquenςage est réalisé afin de vérifier qu'aucune mutation n'est survenue au cours de l'amplification.
Ce gène est ensuite clone comme décrit précédemment (Exemple 2 ) dans le vecteur pTrp pour constituer le plasmide pTrpLΔP40F8.
La protéine de fusion LΔP40F8 est exprimée chez Escherichia coli
RRI après transfection par le vecteur pTrpLΔP40F8. Après un cycle de dénaturation/renaturation, celle-ci est purifiée par chromatographie d'échange d'anions puis de cations comme décrit précédemment (Exemple 1 ).
Le gène de la protéine LΔP40F8 comporte 567 paires de bases (séquence ID n" 5 ) et code une protéine de 1 1 8 acides aminés (séquence ID n° 6). EXEMPLE 4 : Expression et purification de la protéine BB
4.1. Matériel et méthodes 4.1.1. Expression de la protéine BB
Le gène de la protéine BB est clone dans le vecteur d'expression pva inductible par la présence du gène de l'opéron tryptophane, porteur des gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline et possédant une origine de réplication chez Escherichia coli. La protéine BB est exprimée et produite chez Escherichia coli RV 308 (souche ATCC 31608) sous forme de corps d'inclusion.
Les souches de Escherichia coli RV 308 compétentes sont transformées par le vecteur pvaBB. Une préculture est réalisée sous agitation à 37°C pendant une nuit dans un milieu à base de bouillon tryptique de soja (milieu TSB) complémenté en extrait de levure et en présence de tétracycline (8μg/ml) et ampicilline (200μg/ml). La région opératrice du vecteur est bloquée en présence d'un excès de tryptophane (lOOμg/ml).
Après lecture de la densité optique à 580nm, la culture est diluée afin d'obtenir une densité optique de 1 dans le milieu précédent ( milieu TSB avec extrait de levure et tétracycline/ampicilline). La synthèse de la protéine BB est induite par addition d'acide indolacrylique (analogue du tryptophane) à la concentration finale de 25μg/ml. La culture est maintenue à 37°C sous agitation pendant 5 heures.
4.1.2. Renaturation et purification de la protéine BB
Après centrifugation (4000rpm, 10 min, 4°C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5. Une sonication permet la libération des corps d'inclusion. Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (25 min à 10000g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5 contenant 5mM MgCl2 , puis centrifugé ( 15 min à 10000g). La dénaturation de la protéine est obtenue par incubation des corps d'inclusion à 37°C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5 contenant 7M chlorhydrate de guanidinium (agent dénaturant) et lOmM dithiothréitol (réduction des ponts disulfure). Une centrifugation ( 15 min à 10000g) permet d'éliminer la partie insoluble des corps d'inclusion.
Après dilution par 13 volumes d'un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,5 contenant du NaCl (8,76g/l et du Zwittergent 3- 14 (0, 1%, p/v), le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante sous agitation au contact de l'air ( renaturation par dilution et réoxydation des ponts disulfure) .
Après une nouvelle centrifugation, la protéine BB est purifiée par chromatographie d'affinité sur support HSA-Sépharose (support préparé par couplage d'albumine sérique humaine sur un gel Pharmacia "CNBr- activated Sepharose 4B"). Après injection (débit faible), les protéines non fixées sont éluées par un tampon Tris/HCl 25mM pH 8,5, NaCl 0.2M, 0,05% Tween 20 et EDTA ImM. La protéine BB retenue sur le support est éluée par une solution d'acide acétique 0,5 M pH 2,7. Les fractions contenant la protéine d'intérêt sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration.
4.2. Résultats
Le gène de la protéine BB comporte 774 paires de bases (Séquence ID
N° 7) et code pour une protéine de 257 acides aminés (Séquence ID N" 8).
La protéine exprimée comporte à partir de l'extrémité N-terminale (voir Séquence ID N° 7) :
- le peptide L, acides aminés 1 à 8, - le peptide E', acides aminés 9 à 14,
- un peptide linker, acides aminés 15 à 23,
- la protéine BB, acides aminés 24 à 257.
La protéine produite présente une masse moléculaire de 29kDa environ (analyse par SDS-PAGE). EXEMPLE 5 : Isolement et purification des oligosaccharides de Salmonella enteritidis à partir de lipopolysaccharides.
4.1. Préparation des lipopolysaccharides (EPS).
Les bactéries Salmonella enteritidis SH 1 262 sont cultivées dans un fermenteur de 10 litres à 37°C, à pH 7,0, sous agitation forte, dans un milieu Ty. Les cellules sont tuées par addition de formaldhéhyde 1% et sont recueillies par centrifugation à 4000g pendant 20 min à 4°C. Après un lavage dans du PBS et une nouvelle centrifugation, réalisée comme précédemment, le culot est remis en suspension à une concentration de l'ordre de 20mg (poids sec)/ml. Les LPS sont extraits par la méthode au phénol (Westphal 0., Lϋderitz O. and Bister F., 1952, Z. Naturforsch. 7, 148- 155) et la phase aqueuse est recueillie et lyophilisée. Des LPS partiellement délipidés sont préparés par hydrolyse des liaisons phosphate et ester au niveau de la partie lipidique (lipide A) par un traitement réalisé en présence de soude 0, 15M à 100°C pendant 2 heures. Après centrifugation, le pH est ajusté à 3,5 et les acides gras libres sont éliminés par extractions successives au chloroforme. Le pH est ensuite ajusté à 7,0 avant que les LPS ainsi délipidés ne soient dialyses contre de l'eau et finalement lyophilisés.
4.2. Préparation des oligosaccharides.
Les oligosaccharides sont préparés à partir des LPS partiellement délipidés en utilisant l'activité endorhamnosidase associée au bactériophage P36.
Dans un boudin de dialyse contenant le phage P36, dialyse au préalable contre un tampon carbonate d'ammonium 5mM pH 7, 1 , sont ajoutés les LPS obtenus précédemment dans un rapport lg de LPS/1014 p.f.u. de phage. La dialyse est réalisée à 37°C contre 600 à 800 ml du tampon précédent. Après 50 heures le bain de dialyse est changé et la dialyse est renouvelée pour une durée additionnelle de 40 heures environ. Les deux- solutions de contre dialyse sont ensuite mélangées puis concentrées à l'aide d'un évaporateur rotatif. Les oligosaccharides sont fractionnés par chromatographie de tamisage moléculaire. Les oligosaccharides concentrés sont déposés sur une colonne (2,5 x 170 cm) de Biogel P2 ou P4 (Biorad, 200-400 mesh) éluée par de l'eau (débit 8,5 ml/h). Les fractions contenant les oligosaccharides sont détectées par la méthode au phénol (+ acide sulfuriquc) . Après analyse des fractions par chromatographie sur couche mince, les fractions contenant les différents isomères sont rassemblées puis lyophilisées. La pureté des oligosaccharides obtenus est déterminée par résonance magnétique nucléaire et spectrométrie de masse.
EXEM PLE 6 : Couplage des ol igosaccha rides isolés de lipopolysaccharides de Salmonella enteritidis à la protéine P40.
Les oligosaccharides ( 10 à 40mg) sont dissouts dans 0,5ml d'eau. Cette solution d'oligosaccharides est ajoutée goutte à goutte sous agitation à 1 ml d'une solution de para-aminophényléthylamine diluée dans l'eau (v/v) contenant 20 mg de cyanoborohydrure de sodium. Après ajustement du pH à 8,0 à l'aide de NaOH I N, le mélange réactionnel est laissé à température ambiante pendant 24 heures. L'excès de réactifs est éliminé par gelfiltration sur une colonne de Biogel P2. Les fractions contenant les oligosaccharides dérivés sont recueillies, concentrées à sec à l'aide d'un évaporateur rotatif puis les oligosaccharides sont repris par 3ml d'éthanol 80%.
L'addition de 200 μl d'une solution de thiophosgène dilué dans de l 'éthano l 80% ( l v/3 v ) perme t l 'ob te n t ion d e d é rivés isothiocyanato-p-aminophényléthylamino-oligosaccharides. Le pH est maintenu à l'aide d'une solution de soude 1 M dans l'éthanol 80%. Après 2 heures à température ambiante la réaction est complète, et les oligosaccharides dérivés sont séparés de l'excès de réactifs par extraction chloroformique (élimination du thiophosgène). La phase aqueuse est concentrée à sec et les oligosaccharides sont repris par 0,5ml de tampon bicarbonate 0, 1 M pH 8,2 contenant 0, 1% Zwittergent 3-14. La protéine P40 (LP40 ou ΔP40F8) en solution dans un tampon bicarbonate 0, 1 M pH 8,2 contenant 0, 1 % Zwittergent 3- 14 ( 2,3 ml, concentration de l'ordre de 5 mg/ml) est ajoutée goutte à goutte sous agitation constante aux oligosaccharides. Le pH est ajusté à 8,7 à l'aide de soude I M et le mélange réactionnel est maintenu à température ambiante pendant 48 heures. Les oligosaccharides non couplés sont éliminés par une série de plusieurs dilutions et concentrations à l'aide d'une cellule à agitation Amicon équipée d'une membrane Diaflo possédant un seuil de coupure de 30kDa. Les conjugués obtenus sont dialyses plusieurs fois contre 1 litre de tampon PBS contenant 0, 1% Zwittergent 3-14. Le taux de substitu tion est déterminé après estimation des q uanti tés d'oligosaccharides par la méthode de dosage faisant appel au phénol ( + acide sulfurique), et de protéine par la méthode de Lowry. Les conjugués sont conservés à -20°C. Dans le cas du conjugué P40-icosasaccharide le degré de substitution estimé par dosage des protéines et des oligosaccharides est de 5,3 moles d'icosasaccharides/mole de P40. Cette valeur est en accord avec celle établie après SDS PAGE du conjugué.
EXEMPLE 7: Mise en évidence du pouvoir immunogène des conjugués P40/icosasaccharide chez la souris.
6.1. Matériel et méthodes.
Les souris (femelles NMRI, lS20g, 6/lot) sont immunisées aux jours
0, 14 et 21. Chaque souris reçoit une dose de 0,5ml du conjugué préparé à l'exemple 3. Les conjugués ( 10 μg) sont injectés en présence ou en l'absence d'adjuvant complet de Freud et les injections sont effectuées par voie intrapéritonéale. Les prélèvements sanguins sont réalisés par ponction aux jours 0 et 35. Les réponses anticorps sont évaluées sur les sérums individuels prélevés par la méthode EL1SA. Les IgG anti-icosasaccharide des sérums sont isolées su r support BSA-hexadécasaccharide et sont révélées à l'aide d'un antisérum anti-IgG de souris marqué à la phosphatase alcaline. La densité optique est déterminée à 405nm. 6.2. Résultats.
Lorsqu'il est injecté en présence d'adjuvant complet de Freud, le conjugué P40/icosasaccharide permet l'induction d'une réponse dirigée contre l'oligosaccharide importante dès le jour 35 ( 3 immunisations): le titre anticorps est proche de 1/1.105.
Comme le montre la figure 1 ce titre se maintient lorsque les immunisations sont réalisées en l'absence d'adjuvant. Les titres anticorps anti-oligosaccharide sont en effet compris entre 1 / 1.104 et 1/1.105.
EXEMPLE 8: Mise en évidence du pouvoir immunogène des conjugués P40/icosasaccharide chez le lapin.
7.1. Matériel et méthodes.
Les lapins (lapins blancs de Nouvelle Zélande, 2-3 kg) sont immunisés aux jours 0,14 et 28. Les conjugués P40/oligossacharides ( 10 μg ) sont injectés aux animaux dans les ganglions lymphatiques poplitéaux en présence (v/v) ou absence d'adjuvant complet de Freud. Aux jours 0, 14, 28 et 56, des prélèvements sanguins sont effectués et les réponses anticorps sont évaluées sur les sérums individuels par la méthode ELISA. Les plaques de titrage sont couvertes par 2 antigènes différents: la protéine P40 et le LPS dont sont issus les oligosaccharides couplés à la P40. Les anticorps sont révélés à l'aide d'un conjugué anti-IgG de lapin marqué à la phosphatase alcaline. La densité optique est déterminée à 405nm.
7.2. Résultats.
L'icosasaccharide, lorsqu'il est présenté par la protéine P40, induit en présence d'adj uvant de Freud une réponse importante contre le lipopolysaccharide dont il est issu: titre supérieur à 1/1.106 . En absence d'adjuvant la réponse dirigée contre l'icosasaccharide lorsqu'il est présenté par la P40 est plus faible que celle obtenue en présence d'adjuvant, mais significativement plus importante que celle induite après injection du conj ugué BSA-octasaccharide. La figure 2 présente les résultats du dosage ELISA réalisé contre le LPS dont est issu l'icosasaccharide couplé à la protéine P40. Après 56 jours le titre anticorps est supérieur à 1/10000.
EXEMPLE 9: Expérience de challenge chez la souris après transfert passif.
8.1. Matériel et méthodes.
Les souris (femelles NMRI, 20g, 6/lot) reçoivent une injection par voie intraveineuse de 0,2ml d'un sérum hyperimmun obtenu chez le lapin après un cycle d'immunisations réalisé dans les conditions précédemment décrites à l'exemple 5 (injections en absence d'adjuvant, prélèvement du sérum à J56).
Le challenge par des bactéries Salmonella enteritidis SH 2204 est réalisé 2 à 3 heures après injection du sérum hyperimmun. Les bactéries sont injectées à l'animal par voie intrapéritonéale. Trois doses différentes sont utilisées: 1 ,3 - 13 et 52 fois la DL50 (DL50 = 2,6.105 cellules/ml) . Les souris sont observées jusqu'à 60 jours après l'injection.
8.2. Résultats.
Les anticorps obtenus chez le lapin après immunisation par le conjugué P40-icosasaccharide permettent, après injection par voie intraveineuse, de protéger des souris contre une infection par Salmonella enteritidis. 60 jours après des challenges réalisés par injection de doses de l'ordre de 1,3 et 13 fois la DL50 toutes les souris sont vivantes (Tableau 1 ), la dose 52 x DL50 étant quant à elle excessive (mort des animaux). Tableau 1: Expériences de challenge chez la souris après transfert passif d'un sérum hyperimmun de Lapin ou après immunisation par le conjugue P40-icosasaccharide. Détermination du pourcentage d'animaux vivants 60 jours après injection par voie intrapéritonéale d'une dose de bactéries Salmonella enteritidis.
Dose de Salmonella Challenge après Challenge après enteritidis transfert passif immunisation
l,3xDL50 100% 100%
13xDL50 100% 100%
52xDL50 O 0
EXEMPLE 10: Expérience de challenge chez la souris après immunisation par le conjugué P40/icosasaccharidc.
9.1. Matériel et méthodes.
Les souris (femelles NMRI, 20g, 6/lot) sont immunisées par le conjugué P40/icosasaccharide en absence d'adjuvant comme décrit dans l'exemple 4.
Au jour 42 le challenge par les bactéries Salmonella enteritidis SH 2204 est réalisé comme décrit précédemment dans l'exemple 6.
9.2. Résultats.
La vaccination par le conjugué P40-icosasaccharide permet de protéger directement les souris contre un challenge par Salmonella enteritidis. Les immunisations par ce conjugué permettent en effet d'augmenter la DL50 par un facteur 10 au minimum (Tableau 1), la DL50 pouvant alors être supérieure à 3,4.106/ml. LEGENDES DES FIGURES
Figure 1
Figure imgf000033_0001
Figure 2 :
Figure imgf000033_0002
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT
(A) NOM PIERRE FABRE MEDICAMENT
(B) RUE 45 PLACE ABEL GANCE
(C) VILLE: BOULOGNE
CE) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92100
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: Apple Macintosh
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: MAC OS Système 7
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 1008 paires de bases
(B) Type : acide nucléique
(C) Nombre de brins : simple
(D) Configuration : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1008
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC 48 Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser 1 5 10 15 CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC 96
Gin Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gin Asn Asn Asn
20 25 30
GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC 144
Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gin Leu Gly Alα Gly Alα Phe Gly Gly Tyr
35 40 45
CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC 192
Gin Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly
50 55 60
CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG 240
Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gin 65 70 75 80
GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG 288
Gly Val Gin Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu
85 90 95
GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA 336
Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys
100 105 110
GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC 384
Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly
115 120 125
GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC 432
Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp
130 135 140
ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG 480
Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gin Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala 145 150 155 160
GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT 528
Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val
165 170 175
TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT 576
Ser Tyr Arg Phe Gly Gin Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala
180 185 190
CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT 624 Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser 195 200 205 GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG 672
Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gin 210 215 220
CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA 720
Gin Ala Leu Asp Gin Leu Tyr Thr Gin Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys
225 230 235 240
GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA 768
Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu 245 250 255
GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC 816
Alα Tyr Asn Gin Gin Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gin Ser Val Val Asp 260 265 270
TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC 864 Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly 275 280 285
ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA 912 Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys 290 295 300
GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG 960 Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu 305 310 315 320
ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA GAA GTT GTA ACT CAG CCG GCG GGT TAA 1008 Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gin Pro Ala Gly 325 330 335
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 335 acides aminés
(B) Type : acide aminé
(C) Nombre de brins : simple
(D) Configuration : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Alα Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Alα Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gin Tyr 1 5 10 15
His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gin Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg 20 25 30 35
Asn Asp Gin Leu Gly Alα Gly Alα Phe Gly Gly Tyr Gin Val Asn Pro Tyr Leu 40 45 50
Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val 55 60 65 70
Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gin Gly Val Gin Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr 75 80 85 90
Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg 95 100 105
Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp 110 115 120 125
Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp 130 135 140
Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gin Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr 145 150 155 160
Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe 165 170 175 180
Gly Gin Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu 185 190 195
Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys 200 205 210 215
Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gin Gin Ala Leu Asp Gin Leu Tyr Thr Gin Leu 220 225 230
Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg 235 240 245 250
Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gin Gin Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gin Ser Val 255 260 265 270
Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly 275 280 285 Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg 290 295 300 305
Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys 310 315 320
Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gin Pro Ala Gly 325 330 335
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 1035 paires de bases
(B) Type : acide nucléique
(C) Nombre de brins : simple
(D) Configuration : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1035
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15
TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gin Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30
TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gin Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gin 35 40 45
CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC CAG Gπ AAC CCG TAC CTC GGT 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gin Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60
TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288
Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gin Gly Val Gin Leu Thr Ala Lys 85 90 95
CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336
Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
100 105 110
GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384
Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125
GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432
Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140
GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480
Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160
CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528 Gin Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175
GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA 576 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gin Glu 180 185 190
GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205
GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220
AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gin Gin Ala Leu Asp Gin Leu Tyr 225 230 235 240
ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG 768
Thr Gin Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255
GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT 816
Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gin Gin Leu Ser
260 265 270 GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC 864 Glu Lys Arg Alα Gin Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile 275 280 285
CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT 912 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300
ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320
TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335
GAA GTT GTA ACT CAG CCG CAG GGC TAA 1035 Glu Val Val Thr Gin Pro Gin Gly 340
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 344 acides aminés
(B) Type : acide aminé
(C) Nombre de brins : simple
(D) Configuration : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala
1 5 10 15
Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gin Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly 20 25 30 35
Phe Gin Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gin Leu Gly Ala Gly Ala Phe 40 45 50
Gly Gly Tyr Gin Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu 55 60 65 70 Gly Arg Met Alα Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gin Gly 75 80 85 90
Val Gin Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr 95 100 105
Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser 110 115 120 125
Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140
Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gin Trp 145 150 155 160
Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met 165 170 175 180
Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gin Glu Asp Ala Ala Pro Val Val 185 190 195
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys 200 205 210 215
Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gin Gin 220 225 230
Ala Leu Asp Gin Leu Tyr Thr Gin Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser 235 240 245 250
Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gin Gin 255 260 265 270
Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gin Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile 275 280 285
Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly 290 295 300 305
Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro 310 315 320
Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gin Pro 325 330 335 340
Gin Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 567 paires de bases
(B) Type : acide nucléique
(C) Nombre de brins : simple
(D) Configuration : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..567
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15
TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gin Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30
TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gin Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gin 35 40 45
CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gin Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60
TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80
GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gin Gly Val Gin Leu Thr Ala Lys 85 90 95
CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125
GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140
GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160
CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528 Gin Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175
GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TAA 567 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg 180 185
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 188 acides aminés
(B) Type : acide aminé
(C) Nombre de brins : simple
(D) Configuration : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala 1 5 10 15
Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gin Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly 20 25 30 35
Phe Gin Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gin Leu Gly Ala Gly Ala Phe 40 45 50
Gly Gly Tyr Gin Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu 55 60 65 70 Gly Arg Met Alα Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gin Gly 75 80 85 90
Val Gin Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr 95 100 105
Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser 110 115 120 125
Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140
Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gin Trp 145 150 155 160
Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met 165 170 175 180
Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg 185
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 774 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..774
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTA GAC 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gin His Asp Glu Ala Val Asp 1 5 10 15
GCG AAT TTC GAC CAA TTC AAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG 96 Ala Asn Phe Asp Gin Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys 20 25 30 AAT CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGC GTA AAA GAC CTT CAA 144 Asn Leu Ile Asn Asn Alα Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin 35 40 45
GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA 192 Ala Gin Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr 50 55 * 60
GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT 240 Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr 65 70 75 80
GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA 288 Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu 85 90 95
CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT CAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT 336 Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn
100 105 110
GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA Gπ Gπ GAA 384 Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin Ala Gin Val Val Glu 115 120 125
TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC πA TCT GAT 432 Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp 130 135 140
TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT Gπ AAA TCA Aπ GAA 480 Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu 145 150 155 160
TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA cπ GAC AAA TAT GGA 528 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 165 170 175
GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT Gπ GAA 576 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 180 185 190
GGT GTA AAA GCA CTG ATA GAT GAA Aπ πA GCT GCA πA CCT AAG ACT 624 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr 195 200 205
GAC ACT TAC AAA πA ATC CTT AAT GGT AAA ACA πG AAA GGC GAA ACA 672 Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 210 215 220 ACT ACT GAA GCT Gπ GAT GCT GCT ACT GCA AGA TCT πC AAT πC CCT 720 Thr Thr Glu Alα Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro 225 230 235 240
ATC CTC GAG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC CTG CAG CCA AGC πA AGT 768 Ile Leu Glu Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu Gin Pro Ser Leu Ser
245 250 255
AAG TAA Lys
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 257 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gin His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn 1 5 10 15
Phe Asp Gin Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn 20 25 30 35
Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin Ala Gin Val Val Glu Ser 40 45 50
Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys 55 60 65 70
Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys 75 80 85 90
Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn 95 100 105
Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin Ala Gin Val 110 115 120 125 Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp
130 135 140
Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala 145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr 165 170 175 180
Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile 185 190 195
Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn 200 205 210 215
Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala 220 225 230
Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu Gin 235 240 245 250
Pro Ser Leu Ser Lys 255

Claims

REVENDICATIONS
1. Complexe immunogène, caractérisé en ce qu'il consiste en au moins un épitope oligo- ou polysaccharidique naturellement présent dans des bactéries, couplé à une protéine porteuse choisie parmi la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque, les protéines de membrane externe de bactérie gram négatif, ou leurs fragments.
2. Complexe immunogène selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'épitope oligo- ou polysaccharidique est susceptible d'être obtenu à partir de bactéries, gram négatif ou gram positif.
3. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'épitope oligo- ou polysaccharidique est choisi parmi les oligosaccharides susceptibles d'être obtenus à partir de lipopolysaccharides de membrane et les oligosaccharides de capsule, de bactéries du genre Salmonella, Escherichia, Neisseria, Shigella, Haemophilus ou Klebsiella.
4. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un oligosaccharide substantiellement purifié, susceptible d'être obtenu à partir de lipopolysaccharides de membrane de bactéries du genre Salmonella.
5. Complexe immunogène selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'oligosaccharide peut être obtenu à partir d'une bactérie du genre Salmonella appartenant à un sérogroupe porteur d'une spécificité antigénique choisie dans le groupe suivant : 0: 1 , 0:2, 0:4, 0:6, 7, 8, 0:3 et 0:9.
6. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient un oligosaccharide susceptible d'être obtenu à partir du lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis de spécificité antigénique 0:9.
7. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une unité :
αD galactose p( l-2)-αD mannose p( l-4)-αL Rhamnose p( 1 -3)
αtyvclose p( l-3)
8. Complexe immunogène selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un oligosaccharide de formule
oD-Galp( l-2)
Figure imgf000049_0001
dans laquelle Gai représente le galactose
Man représente le mannose
Rha représente le rhamnose
Tyv représente le tyvélose et n peut varier entre 1 et 24.
9. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la protéine porteuse comporte au moins une partie d'une protéine de type OmpA de bactéries gram négatif.
10. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la protéine porteuse comporte au moins une partie d'une protéine de membrane externe de Klebsiella pneumoniae.
1 1. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la protéine porteuse présente a) la seq ID n° 2, ID n° 4 ou ID n" 6, ou b ) une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences mentionnées en a).
12. Complexe immunogène, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins un oligosaccharide de formule
p( l-4) --> αL-Rha p( l-3) -->
Figure imgf000049_0002
— ' n dans laquelle Gai représente le galactose
Man représente le mannose
Rha représente le rhamnose
Tyv représente le tyvélose et n peut varier entre 1 et 5, couplé avec une protéine présentant l'une des séquences ID n° 2, ID n° 4, ID n" 6, ou ID n° 8, ou possédant au moins 80% de similarité avec l'une des séquences ID n" 2, ID n° 4 ou ID n' 6 ou ID n° 8.
13. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un antigène capsulaire de
Salmonella.
14. Utilisation d'un complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 13, pour la préparation d'un vaccin.
15. Utilisation d'un complexe selon la revendication 12, pour la préparation d'un vaccin destiné à protéger un animal contre les infections provoquées par les bactéries Salmonella appartenant au sérogroupe antigénique 0:9.
16. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend un complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 12 et en ce qu'il comprend en outre un antigène capsulaire de Salmonella.
17. Procédé de préparation d'un complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que : a) on isole des oligosaccharides de Salmonella à partir des lipopolysaccharides de membrane, b) de manière facultative, on purifie les oligosaccharides de manière à conserver des oligosaccharides de même poids moléculaire, c ) les oligosaccharides sont activés chimiquement, d) les oligosaccharides activés sont couplés à une protéine porteuse pour former le complexe immunogène.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la protéine porteuse est activée avant l'étape d) par une méthode chimique pour faciliter le couplage.
19. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 1 8, caractérisé en ce qu'on effectue ensuite une étape supplémentaire consistant à coupler le complexe obtenu à l'issue de l'étape d) avec un autre déterminant antigénique de Salmonella.
20. Utilisation d'une protéine présentant l'une des séquences ID n°
2, 4 , 6 ou 8 pour améliorer l'immunogénicité d'un oligosaccharide.
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