CA2254084A1 - Complexe immunogene, son utilisation, son procede de preparation et vaccin le contenant - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un complexe immunogène, caractérisé en ce qu'il consiste en au moins un épitope oligo- ou polysaccharidique naturellement présent dans des bactéries, couplé à une protéine porteuse choisie parmi la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque, les protéines de membrane externe de bactérie gram negatif, ou leurs fragments. L'invention concerne également des vaccins comprenant un tel complexe immunogène, et procédé de préparation de ce complexe.

Description

WO 97/41888 PCT/IH'R97/00800 -COI'~tI'Lla); 11'~1l'9UNOGENE, SON 1J'I'ILISATION, SON PROCEDE DE
l'REPAF:ATION
Er VACCIN I_E CONTENANT
La présente invention concerne de nouveaux romplexes immunogènes comprenant un dérivé saccharidiquc, utiles notamment comme médicaments ct en particulier comme vaccins.
Protéines et polysaccharides sont les deux principaux types d'antïgènes de surface rencontrés chez les bactéries et les champignons et sont par leur caractère ancigénique d'excellents outils pow°ant entrer dans la conception de vaccins. Toutefois la mise au point de vaccins définis dépourvus d'effets secondaires nécessite l'emploi d'antigènes vaccinants de faible masse moléculaire) principalement des peptides ou des oligosaccharides. Ces antigènes, mais aussi d'autres de masse moléculaire supérieure tels que les polysaccharides, ne peuvent induire seuls une réponse immunitaire qui soit intense et durable.
Le potentiel des polysaccharides bactériens dans la préparation de vaccins est apparu dès le début du XXème siècle. Ces composés jouent en effet un rôle important dans la structure et le pouvoir pathogène de certaines bactéries Gram positives et négatives. Deux types de polysaccharides bactériens sont d'excellents candidats à titre d'agent vaccinal. lI s'agit des polysaccharides issus de la capsule bactérienne et des polysaccharidcs issus des lipopolysaccharides (LPS) de la membrane externe des bactéries Gram négatives.
Ce sont des polymères composés essentiellement d'une partie

2~ glucidique, et dont une partie de la molécule est exposée à la surface de ia bactérie. Ils sont constitués d'un enchainement linéaire d'unités répétitives, caractéristiques d'une espèce bactérienne donnée, dont le nombre peut varier de une à plusieurs centaines, expliquant ainsi leur poids moléculaire parfois très élevé. Chaque unité répétitive est constituée elle-mëme de plusieurs monosaccharides reliés entre eux par des liaisons glycosidiques, généralement de 1 à 7 résidus monosaccharidiques. Ces derniers peuvent se voir plus ou moins substitués par des groupements minéraux tels que des phosphates ou par des groupes organiques, tels que des acides, des amines, des alcools, des acides gras ou des acides aminés.

Le caractère répétitif des épitopes des pol~~saccharides bactériens (petit nombre d'épitopes différents), qu'il s'agisse de polysaccharides isolés de la capsule bactérienne ou de lipopolysaccharides de la membrane externe des bactéries Gram négatives, en fait en effet des immunogènes T-indépendants. Cela se traduit par l'absence de réponse immunitaire à ces antigènes chez le jeune enfant et par l'absence de mémoire immunitaire chez l'adulte (pas de réponse immunitaire de type cellulaire, peu ou pas d'effet de rappel, réponse anticorps restreinte à la classe des IgM).
Des vaccins comprenant un extrait polysaccharidique se sont révélés relativement efficaces chez l'adulte à faible dose, 25 à SO ~g. Parmi les vaccins à base de polysaccharides bactériens, on compte à ce jour des vaccins contre les infections - à Neisseria meningitidis : vaccin tétravalent contre les souches des groupes A, C, W13~ et Y, - à Streptococcus pneumoniae : vaccin pneumococcique multivalent associant 23 sérotypes de polysaccharides capsulaires, - à Salmonelle typhi : vaccin composé du polysaccharide capsulaire de S.
typhi. Toutefois ces vaccins sont particulièrement inefficaces chez les jeunes enfants.
D'autres approches ont été testées dans la stratégie vaccinale contre les infections à Salmonelle. En effet, les bactéries du genre Salmonelle sont des entérobactéries virulentes à tropisme digestif, pathogènes pour l'homme et pour de nombreux animaux vertébrés. Le genre Salmonelle est classiquement constitué de plus de 2000 sérotypes différents. Les 2â principales pathologies induites par ces bactéries sont (pour des revues générales voir: Le Minor) L, 1987, Salmonelle dans Bactériologie Médicale, L Le Minor et M. Véron Eds., Médecine-Sciences Flammarion Paris, p. 411-427, Pegues, D.A. and Miller) S.L, 1994, Salmonellosis including typhoïd fever, Curr. Opin. Infect Dis. 7, 616-623):
- chez l'animal, des toxi-infections:
. spécifiques de certaines espèces, Salmonelle abortus-ovin chez les ovins, Salmonelle galinarum chez les volailles, . non spécifiques provoquées par les sérotypes dits "ubiquitaires"
(Salmonelle Typhimurium, enteritidis,...),

3~

- chez l'homme:
les fièvres t~~phoïdes (Salmonelle ryphi) et les fièvres paratyphoïdes (Salmonelle paratyphi A, B et D), . les toxi-infections alimentaires) pour lesquelles les sérotypes les plus fréquemment incriminés sont Salmonelle typhimurium, enteritidis et panama.
Actuellement trois types de vaccins anti-typhoïdiques sont disponibles sur le marché (pour des revues générales voir : Levine, Ivf.Mf., Hone, D.M., Stocker, B.A.D. et Cadoz, t'~.) 1990, New and improved vaccines against typhoïd fever dans New Generation Vaccines) G.C. Woodrow and M.M. Levine Eds, Marcel Dekker Inc. New York and Basel, p. 2G9-287, Jalla, A.G.S.) Sazawal, S. et Bhan) M.K., 1994, Advances in vaccines for typhoïd fever, Indien J. Pediatr. pl 321-329):
- Les vaccins inactivés Les formes injectables de type "vaccin bactérien inactivé" sont les formes vaccinales les plus anciennes. Il s'agit de vaccins pouvant contenir 500 à 1000 millions de bactéries par dose, sous forme liquide. Les bactéries sont inactivées par des traitements par la chaleur et/ou par des composés chimiques tels que l'acétone, le formol ou le phénol. Selon les sérotypes bactériens qu'ils contiennent, on distingue - les vaccins anti-typhoïdiques: on trouve dans cette classe les spécialités "Typhoïd vaccine" de la Société WY>rTI-I-AYERST aux Etats-Unis, 2~ ou "Typhoïd monovalent" de la Société WELLC01'fE au Royaume Uni, - les vaccins anti-typho/paratyphoïdiques: on recense dans cette seconde classe les vaccins "Vac TAB" de PASTEUR en France ou "Typhidrall" de BIOCINE SCLAVO en Italie.
En France) le vaccin TAB (PASTEUR) est un vaccin bactérien inactivé complet liquide trivalent, associant Salmonelle typhi, Salmonelle paratyphi A et B. Son efficacité relative est en fait limitée à la valence T.
Ce vaccin est réactogène: il provoque dans un tiers des cas des réactions locales et générales précoces. I1 est injecté par voie sous-cutanée, à raison

4 de 2 à 3 injections, à 2 à 4 semaines d'intervalle, suivies d'un rappel. En France la réglementation actuelle qui l'impose encore à certaines catégories professionnelles, dont les professions militaires et de santé, n'est en fait plus justifiée. En milieu militaire, on utilise maintenant un vaccin monovalent T, non commercialisé.
L'immunisation des enfants de moins de un an n'est en général pas recommandée à cause des effets indésirables pouvant survenir après l'injection (fortes douleurs et fièvre importante).
- Un vaccin vivant atténué.
Le vaccin typhoïdique oral Ty2la ("Vivotif") BERNA) contient une souche vivante défective de Salmonella typhi, dépourvue de galactose-~-épimérase. Son administration est orale, sous la forme de capsules gastrorésistantes contenant 1 à 8.10 bactéries vivantes sous forme lyophilisée. Le schéma vaccinal comporte 3 doses successives aux jours 1, 3 et S) avec prises simultanées de bicarbonate de soude pour neutraliser l'acidité gastrique. Évaluée dans des zones d'endémie en Égypte et au Chili, la valeur protectrice serait comprise entre GO et 909'0. I1 n'y aurait pas d'effets indésirables. La protection vaccinale devient effective environ 10 jours après la dernière dose. La protection est valable pour une période pouvant aller de 1 à 7 ans, et il est ainsi recommandé aux voyageurs à
destination de régions endémiques de répéter la vaccination annuellement.
Z5 Des formes orales plus anciennes sont encore disponibles. I i s'agit de vaccins inactivés dont l'efficacité n'a toutefois pas été clairement établie ("Taboral" de la Société BERNA, "Enterovaccino" en Italie).
- Un vaccin de t~~pe sous-unitaire.

S
Le vaccin "Typhim Vi" de l'Institut I'-IER1EUX est préparé à partir de polyoside capsulaire Vi purifié de Salmonelle typhi. Il s'agit d'une solution injectable contenant 25 ~g de polysaccharide. Une seule injection, sous-cutanée ou intramusculaire, assure une protection uniquement contre le risque infectieux lié à Salmonelle typhi chez les adultes et les enfants de plus de S ans. Ce vaccin ne confère pas de protection vis-à-vis des Salmonelle paratyphi A et B, ces sérotypes n'étant pas encapsulés.
L'immunité apparait environ 15 jours à 3 semaines après l'injection. La durée de la protection est au moins égale à 3 ans. Dans les territoires à
forte endémie, le taux de protection observé est aux alentours de 60'0 .
Aucune de ces spécialités n'est suffisamment efficace dans le traitement et la prévention de la fièvre typhoîde. La durée de la protection est souvent limitée. La vaccination des enfants est difficile et celle des nourrissons impossible. Les vaccins inactivés ne peuvent en aucun cas étre prescrits chez l'enfant et le nourrisson et les deux dernières formes vaccinales ne peuvent quant à elles ètre utilisées chez le nourrisson et l'enfant en bas àge. Le vaccin oral TyZla n'est en effet pas recommandé
chez l'enfant de moins de 6 ans et le vaccin polysaccharidique "Typhim Vi"
ne peut ètre injecté chez l'enfant de moins de 18 mois.
Afin d'éviter ces inconvénients, il serait souhaitable de pouvoir disposer de complexes immunogènes capables de conférer une bonne immunité contre les souches pathogènes) en entrainant une réponse immunitaire à la fois de type humoral et cellulaire) chez l'enfant et le nourrisson, l'induction d'un effet mémoire, et provoquant peu d'effets 2~ secondaires.
Ces buts, et d'autres qui apparaitront par la suite) peuvent étre atteints grâce à des complexes immunogènes, caractérisés en ce qu'ils consistent en au moins un épitope oligo- ou polysaccharidique naturellement présent dans des agents pathogènes tels que ies bactéries, couplé à une protéine porteuse choisie parmi la protéine de liaison à la sét~umalbumine humaine du Streptocoque, les protéines de membrane externe de bactérie gram négatif, ou leurs fragments. En effet le couplage par une liaison covalente de l'oligosaccharide ou du polysaccharide transforme ces derniers en immunogène T dépendants.
3~

WO 97/41888 PCT/FR97/008Mi -L'épitope oligo- ou polysaccharidique est susceptible d'étre obtenu à
partir de bactéries, gram négatif ou gram positif, et en particulier à partir de lipopolysaccharides de membrane ou des oligosaccharides de capsule, de bactéries du genre Salmonella, Escherichia, Neisseria, ShigeIla) I-Iaemophilus ou Klebsiella.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'agent pathogène peut étre Salmonella typhi, i-Iaemophilus influenzae) Neisseria miningicidis ou Streptococcus pneumoniae.
L'épitope oligo- ou polysaccharidique peut également étre obtenu à
partir d'un champignon, en particulier appartenant à l'un des genres Candida, Cryptococcus ou Lipomyces.
Les polysaccharides issus de lipopolysaccharides sont préparés par extraction des LPS de la membrane puis élimination du lipide A par hydrolyse ménagée. Les polysaccharides capsulaires sont quant à eux plus facilement isolés de la suspension bactérienne : un chauffage à 100° C
pendant une dizaine de minutes (solubilisation) suivi d'une centrifugation permet d'isoler le polysaccharide capsulaire Vi de Salmonella typhi. Les deux types de polysaccharides peuvent ensuite étre purifiés par chromatographie et/ou par filtration sur membrane.
L'utilisation de polysaccharides "entiers" dans un procédé de couplage peut voir apparaitre certains problèmes techniques dùs principalement à la taille trop importante de ces composés : formation d'un gel, précipitation.
Afin de surmonter ce problème différentes méthodes de clivage du polysaccharide peuvent étre utilisées : fragmentation aux ultra-sons, dépolymérisation par oxydo-réduction, hydrolyses ménagées en milieu acide ou basique, hydrolyse enzymatique.
La méthode de fragmentation permettant la libération d'oligosaccharides doit ctre adaptée au polysaccharide étudié. Un oligossacharide est un composé, pouvant dériver d'un polysaccharide, et qui présente par rapport au polysaccharide de départ un nombre réduit d'unités de répétition osidiques.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence que le couplage par liaison covalente de l'oligosaccharide ou du polysaccharide avec um protéine porteuse telle que définie précédemment permettait de résoudre les problèmes posés par !'utilisation de dérivés polysaccharidiques seuls, ou couplés à d'autres porteurs.
I'ar exemple, le seul vaccin conjugué sur le marché est un vaccin destiné à prévenir chez l'homme les infections invasives à I-laemophilus influenzas de type b (méningites). Pour les quatre spécialités commercialisées, l'antigène vaccinant conjugué est un oligosaccharide ou un polysaccharide isolé de la capsule : le PRP, polyribosyl ribitol phosphate.
Les protéines porteuses utilisées dans la conception de ce vaccin conjugué sont de deux types - Les anatoxines tétanique (TT) et diphtérique (DT), - un extrait de protéines membranaires de Neisseria meningitidis, l'OI'~iPC.
Les anatoxines tétanique et diphtérique sont actuellement les protéines porteuses les mieux caractérisées, tant d'un point de vue structural que biologique (propriétés vaccinales, propriétés de protéines porteuses), et sont pour ces raisons considérées comme les protéines porteuses de référence.
Ces protéines sont utilisées dans le cadre des vaccinations antitétanique et antidiphtérique. Les vaccins correspondants sont très efficaces (protection proche de 100~'o dans les deux cas) et bien tolérés.
Ce sont des exotoxines bactériennes qui peuvent étre extraites et purifiées d'un filtrat de culture . Clostridium tetani pour TT et Corynebacterium diphteria pour DT. La toxine TT est une protéine de 150kDa. La toxine DT possède une masse moléculaire inférieure et est sécrétée sous forme d'une simple chaine polypeptidique de 535 acides aminés. Après purification, ces protéines sont inactivées par la chaleur et le formol. Elles peuvent étre combinées entre elles (vaccin DT)) et avec de nombreux autres vaccins (coqueluche, poliomyélite...). Thermorésistantes, elles se conservent à +~l°C pendant quelques années, mais ne doivent pas étre congelées.

L'emploi trop fréquent de ces protéines (vaccination antiténique et antidiphtérique, vaccins conjugués) peut toutefois aller à l'encontre d'une réponse intense contre l'haptène. Le risque de leur utilisation trop fréquente est en effet de voir la réponse immunitaire porter majoritairement contre ces protéines, si les sujets immunisés présentent déjà des taux d'anticorps élevés contre celles-ci.
Le second type de porteur utilisé dans ce même vaccin est en Cait un extrait de protéines membranaires : l'OMPC, "Outer membrane protein complex", isolé de Neisseria meningitidis. Ce complexe vésiculaire contient en fait plusieurs protéines associées à des lipides et des lipopolysaccharides.
Selon un aspect préféré de l'invention, la protéine porteuse comporte au moins une partie d'une protéine de type OmpA de bactéries gram négatif, en particulier d'une protéine de membrane externe de Klebsiella pneumoniae.
Des protéines convenant particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention sont des protéines dérivées de la protéine de membrane majeure de Klebsiella pneumoniae I-1~5, désignée ci-après p40; elles présentent notamment l'une des séquences ID n° 2, ID
n° 4 ou ID
n° 6. D'autres protéines porteuses d'intérét dérivées de la protéine de membrane externe de K. Pneumoniae comprennent des fragments - contenant la troisième et la quatrième boucle extramembranaire flanquant une séquence intramembranaire, - contenant une boucle extramembranaire invariable et la séquence intramembranaire adjacente.
On définit comme boucles extramembranaires invariables les séquences de P40 homologues avec les séquences des boucles conservées entre différentes espèces d'entérobactéries. Les séquences des boucles extramembranaires non conservées au cours de l'évolution sont dénommées boucles variables. La localisation des boucles extramembranaires est réalisée d'après le modèle de VOGEL et JAI-INIG
( 1986, j. 1'fol. l3iol., 190 : 191-199) concernant l'OmpA d'E. coli.

En particulier, on utilisera les fragments compris entre les acides aminés 127 à 179 de la séquence ID n° 1.
D'autres séquences appropriées sont respectivement les séquences comprises entre les amino-acides 108 à 179 de la séquence ID n° 1, les amino-acides 1 à 179 de la séquence 1D n° l, ainsi que des séquences présentant au moins 909'o d'homologie avec les séquences précédentes.
Selon un autre aspect avantageux de l'invention) la protéine porteuse comporte tout ou partie du domaine de liaison à la sérumalbumine humaine de la protéine G du streptocoque (ci-après appelée BB).
Cette protéine présente une masse moléculaire de 29 kDa et peut étre exprimée et produite chez Escherichia coli sous forme de corps d'inclusion.
La protéine porteuse peut notamment présenter la séquence ID n° 8, ou une séquence présentant au moins 809'0, et de préférence au moins 909'0 de similarité avec ladite séquence ID n° 8.
Toutes ces protéines porteuses peuvent étre extraites à partir des bactéries d'origine ou bien étre obtenues par la voie de l'ADN
recombinant.
Des complexes immunogènes selon l'invention pourront notamment consister en un conjugué entre une protéine porteuse telle que définie précédemment et au moins un oligosaccharide substantiellement purifié, susceptible d'étre obtenu à partir de lipopolysaccharides de membrane de bactéries du genre Salmonella ; en particulier la bactérie du genre Salmoneila appartiendra à un sérogroupe porteur d'une spécificité
2~ antigénique choisie dans le groupe suivant : 0:1, 0:2, 0:4, 0:6, 7) 8, 0:3 et 0:9.
Dans un mode de réalisation préféré, le complexe immunogène contient un oligosaccharide susceptible d'étre obtenu à partir du lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis de spécificité antigénique 0:9.
En effet, les différents sérotypes de Salmonella sont identifiés par leur formule antigénique ; il sont classés en différents groupes, en fonction de leur spécificité antigénique O.
Par exemple, Salmonella typhi appartient au groupe D, de spécificité
0:9, de mémo que S. enteritidis, S. panama, et S. dubiin.
Parmi les autres spécificités polysaccharidiques majeures on peut 3~ citer - le sérogroupe A, de spécificité 0:2, ayant comme représentant S.
paratyphi A, - le sérogroupe B, de spécificité 0:4, ayant comme représentant S.
paratyphi L3 et S. typhimurium, - le sérogroupe C, de spécificité O:G, 7, 8, ayant comme représentant S.
infantis et S. bovis morficans, - le sérogroupe E, de spécificité 0:3, avec S. meleagridis Les oligosaccharides appartenant aux spécificités antigéniques majeures énumérées ci-dessus seront particulièrement adaptés à la mise 10 en oeuvre de l'invention. Par exemple) un vaccin préparé à partir d'oligosaccharide isolé de lipopolysaccharide de S. enteritidis, porteur de la spécificité antigénique 0:9) permettra de protéger contre les septicémies à
Salmonella typhi et contre la fièvre typhoîde, mais il pourra également ètre utilisé dans la prévention chez l'homme et l'animal des toxi-1~ infections et zoonose dues aux Salmonelles du méme sérogroupe.
Des oligosaccharides selon l'un des aspects préférés de l'invention présentent au moins une unité
aD galactose p( 1-2)-aD mannose p( 1-4)-aL Rhamnose p( 1-3 ) atyvelose p(1-3) Plus particulièrement) l'invention a pour objet un complexe immunogène comprenant au moins un oligosaccharide de formule a-Tyvp( 1-3) aD-Galp( 1-2) --> aD-Manp( 1-4) --> aL Rhap( 1-3) -->
n dans laquelle Gal représente le galactose 1'tan représente le mannose Rha représente le rhamnose Tyv représente le tyvélose et n peut varier entre 1 et Zq.
3~

De préférence, Il peut varier entre 1 et 5, et l'oligosaccharide est couplé avec une protéine présentant l'une des séquences 1D n° 2, ID
n° 4, ID n° 6, ou ID n° 8, ou possédant au moins 80g'o de similarité
avec l'une des séquences ID n° 2, ID n° 4 ou ID n° 6 ou ID n° 8.
S L'invention a également pour objet l'utilisation de complexes immunogènes tels que définis précédemment) pour la préparation d'un vaccin ; selon un aspect particulièrement avantageux, les complexes sont utiles pour Ia préparation d'un vaccin destiné .à protéger un animal contre les infections provoquées par les bactéries Salmonella appartenant au sérogroupe antigénique 0:9.
On pourra utiliser un mélange d'oligosaccharides pour lesquels) dans la formule ci-dessus, n aura différentes valeurs.
Des complexes immunogènes selon l'invention sont également ceux comprenant un antigène capsulaire de Salmonella. Celui-ci peut étre couplé seul à une protéine porteuse telle que définie précédemment, ou bien associé à un complexe comprenant un autre épitope oligo- ou polysaccharidique.
L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant au moins un oligosaccharide et/ou complexe antigénique tels que définis précédemment. Elles peuvent également contenir d'autres adjuvants d'immunité) et des excipients pharmaceutiquement acceptables nécessaires à leur formulation tels Que diluant, stabilisant, conservateurs, etc, connus de l'homme du métier.
Selon un aspect avantageux l'invention concerne un vaccin ZS contenant un oligosaccharide de membrane couplé à une protéine porteuse) et comprenant en outre un autre déterminant antigénique. En particulier le vaccin comprend un antigène capsulaire de Salmonella, tel l'antigène capsulaire Vi (homopolymère d'acide N acétylgalacturonique partiellement acétylé) ; ceci permet d'accroitre l'efficacité du vaccin contre les bactéries capsulées.

wo 9vaisss pcT~~ioosoo Le procédé de préparation du complexe immunogène peut comprendre les étapes suivantes a) on isole des oligosaccharides de Salmonelle à partir des lipopolysaccharides de membrane, b) de manière facultative, on purifie les oligosaccharides de manière à
conserver des oligosaccharides de mémo poids moléculaire) c ) les oligosaccharides sont activés chimiquement, d) les oligosaccharides activés sont couplés à une protéine porteuse pour former le complexe immunogène.
Selon un aspect préféré) la protéine porteuse est activée avant l'étape d) par une méthode chimique pour faciliter le couplage.
Les méthodes d'activation des oligosaccharides avec formation d'un dérivé isothiocyanatophénylaminé et de couplage de ce dérivé sur une protéine pourront étre effectuées comme décrit par:
- Mc Broom C.R.) et al ( 1972, in: Methods in Enzymology) vol. 2 ô B, ed. ~.
Ginsburg (Academic Press, New York)) p. 212-219), ou - Svenson S.B. and Lindberg A.A. (1979, J. Immunol. Methods 2~, 323-335).
D'autres méthodes peuvent ètre utilisées dans le but d'activer les oligosaccharides puis de coupler les dérivés obtenus sur une protéine méthodes faisant appel aux borohydrure et cyanoborohydrure de sodium, à
l'acide adipique dihydrazide...
Ce couplage pourra notamment suivre le schéma suivant S
Oligosaccharide OH + HzN-(CH2)z ~ ~ NHz NaCNBHz Amination réductive Qligosaccharide HN-(CHz)z- ~ ~ NHz CSCIz Formation d'un isothiocyanate Oligosaccharide -HN-(CHz)z ~ ~ N=C=S
zHN Protéine Couplage Oligosaccharidel-HN-(CHz)z ~ ~ NH-CS-NH Protéine WO 97/41888 PCT/FR97/00800 , Le couplage d'oligosaccharides de différentes tailles peut étre envisagé. Ces oligosaccharides étant libérés par coupure enzymatique (activité endorhamnosidasique d'un phage), il s'agira de préférence de multiples de 4: tétrasaccharides, octasaccharides) dodécasaccharides, S hexadécasaccharides, icosasaccharides... De méme le couplage d'un mélange de ces oligosaccharides (sans purification préalable) est compris dans l'invention.
On peut ensuite effectuer une étape supplémentaire consistant à
coupler le complexe obtenu à l'issue de l'étape d) avec un autre déterminant antigénique de Salmonella.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine comportant l'une des séquences ID n° 2, 4, 6 ou 8 pour améliorer l'immunogénicité d'un oligosaccharide.
Elle comprend également l'utilisation de protéines analogues, dans lesquelles au moins un acide aminé a été remplacé par un acide aminé
homologue dans les séquences ID n° 2, 4, 6 ou 8.
Les protéines seront notamment codées par des séquences d'ADN
présentant l'une des séquences ID n° 1, 3) S ou 7 ou des séquences équivalentes) compte tenu de la dégénérescence du code génétique.
La séquence ID n° 2 représente la séquence complète de la protéine P40.
On peut également utiliser une protéine recombinante désignée par LP40 (seq ID n° 4), qui comporte en outre un peptide de 9 acides aminés comportant une partie de la séquence leader de l'opéron tryptophane.
2~ Enfin les séquences ID n° 5 et 6 correspondent à la totalité de la partie transmembranaire, (eP40F8), et sont dépourvues de la partie périplasmique très immunogénique (Puohiniemi, R., Karvonen, M., Vuopio-Varkila) j.) Muotiala, A., Helander, LM. and Sarvas) IVf., 1990, Infect.
Immun. 58, 1691-169G).
La séquence ID n° 8 correspond au domaine de liaison à la sérumalbumine humaine de la protéine G du Streptocoque.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes Figure 1 : Mise en évidence du pouvoir immunogène du conjugué P40-icosasaccharide chez la souris.
Figure 2 : Mise en évidence du pouvoir immunogène du conjugué F'-10-icosasaccharide chez le lapin.

5 EXEMPLE 1: Isolement et purification de la protéine P40 naturelle.
La protéine P40, protéine majeure de la membrane externe de 10 Klebsiella pneumoniae est isolée par extraction en présence d'un détergent à partir de la biomasse Klebsiella pneumoniae, puis purifiée à
partir de l'extrait ainsi obtenu par chromatographie d'échange d'anions puis de cations.
15 1.1. Matériel et méthodes.
1.1.1. Extraction des vrotéines membranaires.
Le pH de la biomasse Klebsiella pneumoniae (souche I-145, 40 à 3408 de cellules sèches, 7 à 10 9'o de cellules sèches) est ajustée à pH 2,5 avec de l'acide acétique pur. Après addition de 0,5 volume d'une solution contenant 69'o cétrimide (détergent), 609'o éthanol, CaCl Z 1,5M (concentrations finales 29'o cétrimide, 209'o éthanol) CaCl z 0,5 M ), le pH est ajusté à 2,5 et le mélange est placé sous agitation pendant 16 heures à température ambiante.
1.1.2. Etane de clarification.
Après centrifugation 20 min à 150008 à 4°C, le culot est éliminé.
Le surnageant est un entrait de protéines membranaires de l\'lebsiella pneumoniae.
1.1.3. Précipitation des protéines membranaires.
Les protéines du surnageant sont précipitées par addition de 3 volumes d'éthanol 95 ° à -20°C (concentration finale en éthanol = 809'0).

Après une agitation rapide, l'ensemble est laissé au repos pendant 1 heure à 4°C minimum. Les protéines précipitées sont recueillies par centrifugation 10 min à 10000g à 4°C.
S 1.1.4. Préparation d'une fraction enrichie en protéines membranaires_ (fraction MP).
Les culots sont remis en suspension dans une solution 1 g'o de Zwittergent 3-14 à raison de 5ml/g de culot humide. Après agitation pendant 1 heure (agitateur à hélice) et broyage à l'aide d'un ultra-currax ( 13500trs/min) 30 sec), le pl-I est ajusté à 6,~ à l'aide de soude 1 N. Une centrifugation du mélange permet d'obtenir la fraction MP (élimination de l'insoluble).
1.1.5. Etane de chromatographie d'échange d'anions.
Les protéines du MP sont dialysées pendant une nuit à 4°C contre un tampon Tris/HCI 20m1'~f pH 8,0, 0,1~'o Zwittergent 3-14. Le dialysat est déposé
sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High ~ équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus à un débit linéaire de 15 crn/h. Les protéines sont détectées à 280nm. La protéine P40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2M en NaCI dans Ie tampon Tris/HCI 20mM pH 8,0; 0, lg'o Zwittergent 3-14.
1.1.6. Etane de chromatographie d'échange de cations.
Les fractions contenant la protéine P40 sont rassemblées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM 10 (seuil de coupure lOkDa) pour des volumes de l'ordre de 100m1, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel 1'linitan 1'tillipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure lOl;Da pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à

4°C contre un tampon citrate ZOmM pH3,0, 0,1 9'o Zwittergent 3-l~. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep I-iigh S) équilibrée dans le tampon citrate 20mM pH3,0, 0,1 9'o Zwittergent 3-14. La protéine P40 est S éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,71'~t en NaCI. Les fractions contenant la P40 sont rassemblées et concentrées comme décrit précédemment.
1. 2. IZésulrats.
Les fractions obtenues après chaque étape chromatographique sont analysées par SDS PAGE afin de rassembler celles contenant la protéine P40.
Après chaque étape) les quantités de protéine sont déterminées par dosage selon la méthode de Lowry. La pureté et l'homogénéité de la protéine P40 sont estimées par SDS PAGE avec révélations au bleu de coomassie et au nitrate d'argent.
En fin de procédé de purification) la P40 est concentrée dans le but d'atteindre une concentration en protéine de l'ordre de 5 à 10 mg/mL Les profils électrophorétiques révèlent un degré de pureté supérieur à 909'0.
Après immunoblot, la protéine est reconnue spécifiquement par un anticorps monoclonal anti-P40 obtenu chez la souris.
La présence de lipopolysaccharides (endotoxines) contaminants est estimée par la méthode de gélification en tubes ou essai LAL (Lysat 2~ d'Amébocytes de Limule). Cet essai réalisé sur la solution finale révèle un taux d'endotoxines inférieur à 160 UE/ml et montre donc que celle-ci satisfait aux normes de la réglementation européenne.
EXEMPLE 2: Clonage, expression et purification de la protéine P40 recombinantc.
2.1. i'-fatériel et méthodes.

2.1.1.. Clonage du gène de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Les amorces nucléotidiques ont été déterminées à partir de la partie de la séquence publiée de l'OmpA de Klebsiella pneumonize LD 199 S (Lawrence J.G. et al., 1991, j. Gen. Ivficrobiol. 137) 1911-1921 ), de la séquence conscensus issue de l'alignement des séquences de l'OmpA de différentes entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serraria marcescens, Shigella dysenteriae, Enterobacter aeroginosae) ainsi que des séquences de peptides obtenues par séquen~age selon la méthode d'Edman de la protéine naturelle isolée de Klebsiella pneumoniae I-145 et de peptides isolés après digestion au bromure de cyanogène.
Les oligonucléotides ont été synthétisés selon la méthode chimique des phosphoramidites à l'aide de l'appareil Pharmacia Gene Assembler Plus.
Une colonie de f.'lebsiella pneumoniae I-145 est lysée dans 10 NI de tampon de lyse (25mM Taps pH 9,3, 2mM MgCl2). 1 N1 de cette solution est ensuite utilisé comme source d'ADN pour les réactions d'amplification par PCR. Celles-ci sont réalisées dans 100,uf de tampon d'amplification avec Spmoles de chaque amorce et une unité enzymatique de Taq polymérase (Perlcin Elmer Cetus). Chaque cycle comprend une étape de dénaturation de 30 secondes à 95°C suivie d'une hybridation de l'amorce avec l'ADN
et d'une extension d'une minute à 72°C. 30 cycles sont ainsi réalisés à
l'aide d'un thermocycleur Perkin Elmer Cetus Gen Amp PCR 9000. Le gène de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae est cloné dans le vecteur pRIT28 2~ (Hultman T. et al., 1988, Nucleosides Nucleotides 7 629-638), vecteur possédant le gène de résistance à l'ampicilline, les origines de réplication de Escherichia coli et du phage Fl ainsi qu'une portion du gène Lac-Z de Escherichia coli (l~-galactosidase).
Le fragment ainsi cloné est séquencé à l'aide d'un séquenceur automatique Applied Biosystem 373 DNA Séquenceur. Les réactions de séquençage sont réalisées à l'aide du kit dye terminator selon les recommandations du fournisseur.

2.1.2. Construction du vecteur d'ewression contenant le Qéne de l'OmpA de h'lebsiella pneumoniae.
Le gène entier de la protéine P40 est ensuite cloné dans le vecteur S d'expression pTrp inductible oar la nré~en~~ r~tt ~nnn ~~ l'nnnrn"
tryptophane, porteur du gène de résistance à la I;anamycine et présentant deux sites de restriction BsmI et SaII.
Pour le clonage un site de restriction Bsm1 est introduit par PCR en amont du gène de la P40, présentant déjà un site SaII en aval, dans le vecteur pRIT28P40. Le géne de la Pq0 possédant des sites Bsml/SaII est ainsi cloné dans le vecteur pTrp pour constituer le plasmide pTrpLP~IO.
2.1.3. E.~~nression de la protéine LP40.
La protéine de fusion LP40 est exprimée et produite chez Escherichia coli sous forme de corps d'inclusion. Celle-ci comportera la séquence complète de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae à laquelle il faut ajouter au niveau de l'extrémité N-terminale un peptide de 8 acides aminés (peptide L) comportant une partie de la séquence leader de l'opéron tryptophane nécessaire à l'e~~pression de la protéine chez Escherichia coli.
L'expression de la protéine LP40 est réalisée chez Escherichia coli RRIeMlS (Rüther, U.) 1982, Nucl. Acid Res. 10 5765-5772). Une préculture est réalisée sous agitation à 37°C pendant une nuit dans un milieu à
base de bouillon tryptique de soja (milieu TSB) complémenté en extrait de levure et 2S en présence de l:anamycine 30 ~g/ml. La région opératrice du vecteur est bloquée en présence d'un excès de tryptophane (100 ~g/ml).
Après lecture de la densité optique à S 80nm, la culture est diluée afin d'obtenir une densité optique de 1 dans le milieu précédent (milieu TSB avec extrait de levure et kanamycine). La synthèse de la protéine LP40 est induite par addition d'acide indolacrylique (analogue du tryptophane) à la concentration finale de 25 ~g/ml. La culture est maintenue à 37°C
sous agitation pendant 5 heures.

wo 9~iai888 PcT~9~~oogoo -2.1.4. Renaturation et purification de la protéine LP40.
Après centrifugation (4000rpm, 10 min, 4°C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris I-IC1 25mMI pl-1 8,5. Une 5 sonication permet la libération des corps d'inclusion.
Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (25 min à
10000g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25mM pH 8,S contenant 5mM MgCIZ, puis centrifugé (1S min à 10000g). La dénaturation de la protéine est obtenue par incubation des corps d'inclusion à 37°C
pendant 2 10 heures dans un tampon Tris-HC1 25mM pH 8,5 contenant 7M chlorhydrate de guanidinium ou urée (agent dénaturant) et lOml'-I dithiothréitol (réduction des ponts disulfure). Une centrifugation ( 1 S min à 10000g) permet d'éliminer la partie insoluble des corps d'inclusion.
Après dilution par 13 volumes d'un tampon Tris HCl 2Sml'4 pH 8,5 1S contenant du NaCI (8,76g/1 et du Zwittergent 3-14 (0,19'0, p/v), le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante sous agitation au contact de l'air (renaturation par dilution et réoxydation des ponts disulfure).
Après une nouvelle centrifugation, l'échantillon est dialysé contre 20 un tampon Tris-HCl 25mM pH 8,5 contenant 0,1 9'o Zwittergent 3-14 ( 100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C. L'étape de chromatographie d'échange d'anions est réalisée sur le support Biorad Macro Prep High Q
comme décrit précédemment (Exemple 1). Les fractions contenant la protéine LP40 sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration avant 2S une nouvelle dialyse contre un tampon citrate 20mM pt~ 3 contenant 0,19'0 Zwittergent 3-14 { 100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C.
L'étape de chromatographie d'échange de cations est réalisée sur le support Biorad Macro Prep High S comme décrit à l'exemple 1. Les fractions contenant la LP40 sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration.
2. 2. Résultats.
Le gène de l'OmpA de f~lebsiella pneumoniae (P40) comporte 1008 paires de bases (Séquence ID N° 1) et code pour une protéine de 33S
acides aminés (Séquence 1D N° 2).

Le gène de la 1.P40 comporte quant à lui 1035 paires de bases (Séquence ID N° 3) et code pour une protéine de 344 acides aminés (Séquence ID N° 4). En ce qui concerne la partie du géne de l'OmpA) on constate quelques différences au niveau de l'extrémité codant pour les S deux acides aminés en position C-terminale. Ces différences concernent en fait uniquement trois nucléotides. Il s'agit des nucléotides en position 1027 (C pour G en position 1000 dans la séquence de la P40), 1028 (A pour C en position 1001 dans la séquence de la P40), 1032 (C pour T en position 1005 dans la séquence de la P40). Ces modifications sont dùes à l'utilisation lors du clonage du gène de l'OmpA dans le vecteur pRIT28 d'une amorce oligonucléotidique partiellement dégénérée (séquence Kpnl4):
5'ATAGTCGACAACTTA A(G)G(C)CCTGCGGCTGAG3'. Ces modiftcations de la séquence du géne provoquent une unique différence entre les séquences peptidiques de la P40 et de la LP40 exprimée et produite chez Fscherichia 1S coli. Il s'agit de l'acide aminé en position 343 de la séquence de la LP40, qui est un résidu glutamine (Gln) alors qu'un résidu alanine (Ala) est trouvé
dans la séquence de la LP40 (position 334).
A partir d'une culture de 1 litre, un cycle de dénaturation-renaturation permet d'obtenir 300mg de protéine {estimation par dosage selon la méthode de Lowry). 75mg de LP40 sont purifiés après les deux étapes chromatographiques.
Comme précédemment la protéine LP40 est concentrée après purification afin d'atteindre une concentration finale comprise entre S et lOmg/ml. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de 2S l'ordre de 9S9'o. Après immunoblot la protéine est spécifiquement reconnue par un anticorps monoclonal anti-P40 naturelle obtenu chez la souris.
L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme, dénaturée ou native) la protéine P40 e~.rtraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets ~) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices a) sous l'action d'un agent dénaturant) tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidinium) ou par chauffage à 100°C en présence de Z
SDS. La protéine LP40 n'est pas correctement renaturée en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0,19'0 (p/v) Zwittcrgent 3-14. Par contre une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCI 25m1'~1 pH 8,5 contenant 0,1 9'0 S {p/v) Zwittergent 3-14. Toutefois il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante sont réalisés eux-mémos en présence de Zwittergent 3-l~i (résultats négatifs en absence de détergent).
EX)rMl'LE 3: Clonage, expression et purification de la partie transmembranairc de la protéine P40.
Afin de cloner la partie du gène correspondant à la totalité de la partie transmembranaire dépourvue de la partie péri plasmique de la protéine P40 un oligonucléotide complémentaire de l'extrémité codant pour la partie C-terminale de cette région du gène,séquence comprise entre les acides aminés 1 à 179 de la protéine P40 et baptisée fragment F8, a été synthétisé.
La séquence du gène correspondant au fragment recherché a été
amplifiée par PCR à partir de l'ADN d'une miniprep du vecteur pRIT28P~10, puis purifiée et clonée dans le mémo vecteur. Un séquençage est réalisé
afin de vérifier qu'aucune mutation n'est survenue au cours de l'amplification.
Ce gène est ensuite cloné comme décrit précédemment (Exemple 2) dans le vecteur pTrp pour constituer le plasmide pTrpLoP40F8.
La protéine de fusion LOP40F8 est exprimée chez Escherichia coli RRI après transfection par le vecteur pTrpLeP40F8. Après un cycle de dénaturation/renaturation, celle-ci est purifiée par chromatographie d'échange d'anions puis de cations comme décrit précédemment (Exemple I ).
Le gène dc la protéine LeP40F8 comporte 567 paires de bases (séquence ID n° 5) et code une protéine de 118 acides aminés (séquence ID
n° 6).

I:XEMI'LC 4 : Expression et purification de la protéine BB
4.1. Matériel et méthodes 4.1.1. Expression de la protéine BB
S
Le gène de la protéine BB est cloné dans le vecteur d'expression pva inductible par la présence du gène de l'opéron tryptophane, porteur des gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline et possédant une origine de réplication chez Escherichia coli. La protéine BB est exprimée et produite chez Escherichia coli RV 308 (souche ATCC 31608) sous forme de corps d'inclusion.
Les souches de Escherichia coli RV 308 compétentes sont transformées par le vecteur pvaBB. Une préculture est réalise sous agitation à 37°C pendant une nuit dans un milieu à base de bouillon tryptique de soja (milieu TSB) complémenté en entrait de levure et en présence de tétracycline (8~g/ml) et ampicilline (200~g/ml). La région opératrice du vecteur est bloquée en présence d'un excès de tryptophane ( 100~.g/ml).
Après lecture de la densité optique à 580nm, la culture est diluée afin d'obtenir une densité optique de 1 dans le milieu précédent ( milieu TSB avec extrait de levure et tétracycline/ampicilline). La synthèse de Ia protéine BB est induite par addition d'acide indolacrylique (analogue du tryptophane) à la concentration finale de ZS~g/ml. La culture est maintenue à 37°C sous agitation pendant S heures.
4.1.Z. Renaturation et purification de la protéine BB
Après centrifugation (4000rpm, 10 min, 4°C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 ZSmM p1-I 8,5. Une sonication permet la libération des corps d'inclusion.

Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (25 min à
10000g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25mM pI-i 8,5 contenant 5ml'~f MgClz, puis centrifuge (15 min à 10000g). La dénaturation de la protéine est obtenue par incubation des corps d'inclusion à 37°C
pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCI 25mM pl-I 8,5 contenant 7M chlorhydrate de guanidinium (agent dénaturant) et lOml'4 dithiothréitol (réduction des ponts disulfure). Une centrifugation ( 1 S min à 10000g) permet d'éliminer la partie insoluble des corps d'inclusion.
Après dilution par 13 volumes d'un tampon Tris-i-ICI 25m1'~1 pH 8,5 contenant du NaCI (8,76g/I et du Zwittergent 3-14 (0) 19'0, p/v), le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante sous agitation au contact de l'air (renaturation par dilution et réoxydation des ponts disulfure).
Après une nouvelle centrifugation, la protéine BB est purifiée par chromatographie d'affinité sur support HSA-Sépharose (support préparé
par couplage d'albumine sérique humaine sur un gel Pharmacia "CNBr-activated Sepharose 4B"). Après injection (débit faible), les protéines non fixées sont éluées par un tampon Tris/HC1 25mM pH 8,5, NaCI 0,2M) 0,059'0 Tween 20 et EDTA lmM. La protéine BB retenue sur le support est éluée par une solution d'acide acétique 0,51'4 pH 2,7. Les fractions contenant la protéine d'intérét sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration.
4.2. Résultats Le gène de la protéine BB comporte 774 paires de bases (Séquence 1D
N° 7) et code pour une protéine de 257 acides aminés (Séquence ID
N° 8).
La protéine exprimée comporte à partir de l'extrémité N-terminale (voir Séquence ID N° 7) - le peptide L, acides aminés 1 à 8, - le peptide E', acides aminés 9 à 14, - un peptide linher, acides aminés 15 à 23, - la protéine BB, acides aminés 24 à 257.
La protéine produite présente une masse moléculaire de 29kDa environ (analyse par SDS-PAGE).

WO 97!41888 PCT/FR97/00800 EXEMPLE 5: Isolement et purification des oligosaccharides de Salmonella enteritidis à partir de lipopolysaccharides.
4.1. Préparation des linonolvsaccharides (LPS).

Les bactéries SZlmonella enteritidis SH 1262 sont cultivées dans un fermenteur de 10 litres à 37°C, à pH 7,0, sous agitation forte, dans un milieu Ty. Les cellules sont tuées par addition de formaldhéhyde l~'o et sont recueillies par centrifugation à ~OOOg pendant 20 min à 4°C. Après un 10 lavage dans du PBS et une nouvelle centrifugation, réalisée comme précédemment, le culot est remis en suspension à une concentration de l'ordre de 20mg (poids sec)/ml. Les LPS sont extraits par la méthode au phénol (Westphal 0., Lüderitz O. and Bister F., 1952, Z. Naturforsch. 7, 148-155) et la phase aqueuse est recueillie et lyophilisée.
ï5 Des LPS partiellement délipidés sont préparés par hydrolyse des liaisons phosphate et ester au niveau de la partie lipidique {lipide A) par un traitement réalisé en présence de soude 0,15M à 100°C pendant 2 heures. Après centrifugation, le pH est ajusté à 3,5 et les acides gras libres sont éliminés par extractions successives au chloroforme. Le pH est 20 ensuite ajusté à 7,0 avant que les LPS ainsi délipidés ne soient dialysés contre de l'eau et finalement lyophilisés.
4.2. Préparation des oliQOSaccharides.
Les oligosaccharides sont préparés à partir des LPS partiellement délipidés en utilisant l'activité endorhamnosidase associée au bactériophage P36.
Dans un boudin de dialyse contenant le phage P36, dialysé au préalable contre un tampon carbonate d'ammonium 5ml'-I p1-i 7,1, sont ajoutés les LPS obtenus précédemment dans un rapport lg de LPS/101-~
p.f.u. de phage. La dialyse est réalisée à 37°C contre 600 à 800 ml du tampon précédent. Après 50 heures le bain de dialyse est changé et la dialyse est renouvelée pour une durée additionnelle de ~0 heures environ. Les deux solutions de contre dialyse sont ensuite mélangées puis concentrées à
l'aide d'un évaporateur rotatif.

Les oligosaccharides sont fractionnés par chromatographie de tamisage moléculaire. Les oligosaccharidcs concentrés sont déposés sur une colonne (2,5 x 170 cm) de Biogel P2 ou P4 (Biorad, 200-X00 mesh) éiuée par de l'eau (débit 8,5 ml/h). Les fractions contenant les oiigosaccharides sont détectées par la méthode au phénol (+ acide sulfurique). Après analyse des fractions par chromatographie sur couche mince, les fractions contenant les différents isomères sont rassemblées puis lyophilisées. La pureté des oligosaccharides obtenus est déterminée par résonance magnétique nuciéaire et spectrométrie de masse.
LXEMPLE 6: Couplage des oligosaccharides isolés de lipopolysaccharidcs dc Salmonella cntcritidis à la protéine P40.
Les oligosaccharides ( 10 à 40mg) sont dissouts dans 0,5m1 d'eau. Cette solution d'oligosaccharides est ajoutée goutte à goutte sous agitation à 1 ml d'une solution de para-aminophényléthylamine diluée dans l'eau (v/v) contenant 20 mg de cyanoborohydrure de sodium. Après ajustement du pH
à 8,0 à l'aide de NaOH 1 N, le mélange réactionnel est laissé à température ambiante pendant 2~ heures. L'excès de réactifs est éliminé par gelfiltration sur une colonne de Biogel P2. Les fractions contenant les oligosaccharides dérivés sont recueillies, concentrées à sec à l'aide d'un - évaporateur rotatif puis les oligosaccharides sont repris par 3ml d'éthanol 809'0.
L'addition de 200 E~l d'une solution de thiophosgène dilué dans de l'éthanol 809'0 ( 1 v/3v) permet l'obtention de dérivés isothiocyanato-p-aminophényléthylamino-oligosaccharides. Le pl-i est maintenu à l'aide d'une solution de soude ll'1 dans l'éthanol 809'0. Après 2 heures à température ambiante la réaction est complète, et les oligosaccharides dérivés sont séparés de l'excès de réactifs par extraction chloroformique {élimination du thiaphosgène). La phase aqueuse est concentrée à sec et les oligosaccharides sont repris par 0,5m1 de tampon bicarbonate 0,ll~i pl-l 8,2 contenant 0,19'o Zwittergcnt 3-14.

La protéine P40 (LP40 ou OP40F8) en solution dans un tampon bicarbonate 0,11'~f pH 8,2 contenant 0,19'o Zwittergent 3-14 (2,3 ml, concentration de l'ordre de 5 mg/ml) est ajoutée goutte à goutte sous agitation constante aux oligosaccharides. Le pH est ajusté à 8,7 à l'aide de soude 1 ~-1 et le mélange réactionnel est maintenu à température ambiante pendant 48 heures. Les oligosaccharides non couplés sont éliminés par une série de plusieurs dilutions et concentrations à l'aide d'une cellule à
agitation Amicon équipée d'une membrane Diaflo possédant un seuil de coupure de 301;Da. Les conjugués obtenus sont dialysés plusieurs fois contre 1 litre de tampon PBS contenant 0, lg'o Zwittergent 3-14. Le taux de substitution est déterminé après estimation des quantités d'oligosaccharides par la méthode de dosage faisant appel au phénol {+
acide sulfurique)) et de protéine par la méthode de Lowry. Les conjugués sont conservés à -20°C.
Dans le cas du conjugué P40-icosasaccharide le degré de substitution estimé par dosage des protéines et des oligosaccharides est de 5,3 moles d'icosasaccharides/mole de P40. Cette valeur est en accord avec celle établie après SDS PAGE du conjugué.
FJCEMPLE 7: Mise cn évidence du pouvoir immunogène des conjugués P40/icosasaccharide chez la souris.
G.l.Iviatériel et méthodes.
Les souris (femelles NMRI, 1S20g, 6/lot) sont immunisées aux jours 0,14 et 21. Chaque souris redoit une dose de O,SmI du conjugué préparé à
l'exemple 3. Les conjugués ( 10 ~g) sont injectés en présence ou en l'absence d'adjuvant complet de Freud et les injections sont effectuées par voie intrapéritonéale. Les prélèvements sanguins sont réalisés par ponction aux jours 0 et 35. Les réponses anticorps sont évaluées sur les sérums individuels prélevés par la méthode ELISA. Les IgG
anti-icosasaccharide des sérums sont isolées sur support BSA-hexadécasaccharide et sont révélées à l'aide d'un antisérum anti-IgG
de souris marqué à la phosphatase alcaline. La densité optique est déterminée à 405nm.

7g

6.2. Résultats.
Lorsqu'il est injecté en présence d'adjuvant complet de Freud) le conjugué P40/icosasaccharide permet l'induction d'une réponse dirigée contre l'oligosaccharide importante dès le jour 35 (3 immunisations): le titre anticorps est proche de 1/1.105.
Comme le montre la figure 1 ce titre se maintient lorsque les immunisations sont réalisées en l'absence d'adjuvant. Les titres anticorps anti-oligosaccharide sont en effet compris entre 1 / 1.10-1 et 1 / 1.10.
EXEMPLE 8: Mise en évidence du pouvoir immunogène des conjugués P40/icosasaccharide chez Ie lapin.

7.1.1'fatériel et méthodes.
Les lapins {lapins blancs de Nouvelle Zélande, 2-3kg) sont immunisés aux jours 0) 14 et 28. Les conjugués P40/oligossacharides ( 10 ~g ) sont injectés aux animaux dans les ganglions lymphatiques poplitéaux en présence (v/v) ou absence d'adjuvant complet de Freud. Aux jours 0, 14) 28 et 56, des prélèvements sanguins sont effectués et les réponses anticorps sont évaluées sur les sérums individuels par la méthode ELISA. Les plaques de titrage sont couvertes par 2 antigènes différents: la protéine P40 et le LPS dont sont issus les oligosaccharides couplés à la P40. Les anticorps sont révélés à l'aide d'un conjugué anti-1gG de lapin marqué à la phosphatase alcaline. La densité optique est déterminée à 40~nm.
7.2.Résultats.
L'icosasaccharide, lorsqu'il est présenté par la protéine P40, induit en présence d'adjuvant de Freud une réponse importante contre le lipopolysaccharide dont il est issu: titre supérieur à 1/1.10 .

8 PCT/FR97/00800 S
En absence d'adjuvant la réponse dirigée contre l'icosasaccharide lorsqu'il est présenté par la P40 est plus faible que celle obtenue eu présence d'adjuvant, mais significativement plus importante que celle induite après injection du conjugué 13SA-octasaccharide. La figure 2 présente les résultats du dosage ELISA réalisé contre Ie LPS dont est issu l'icosasaccharide couplé à la protéine P~10. Après SG jours le titre anticorps est supérieur à 1/10000.
EXEMPLE 9: Expericnce de challenge cher la souris après transfert passif.
8.1. 1'latériel et méthodes.
Les souris (femelles NI'-1RI, 20g, 6/lot) redoivent une injection par 1~ voie intraveineuse de 0,2m1 d'un sérum hyperimmun obtenu chez le lapin après un cycle d'immunisations réalisé dans les conditions précédemment décrites à l'exemple S (injections en absence d'adjuvant, prélèvement du sérum à J56).
Le challenge par des bactéries Salmonelle enteritidis SH 2204 est réalisé 2 à 3 heures après injection du sérum hyperimmun. Les bactéries sont injectées à l'animal par voie intrapéritonéale. Trois doses différentes sont utilisées: 1,3 - 13 et 52 fois la DLSO (DLSO = 2,6.105 cellules/ml). Les souris sont observées jusqu'à 60 jours après l'injection.
2~ 8.2. Résultats.
Les anticorps obtenus chez le lapin après immunisation par le conjugué P40-icosasaccharide permettent, après injection par voie intraveineuse, de protéger des souris contre une infection par Salmonelle enteritidis. 60 jours après des challenges réalisés par injection de doses de l'ordre de 1,3 et 13 fois la DL50 toutes les souris sont vivantes (Tableau 1 ), la dose 52 x DLSO étant quant à elle excessive (mort des animaux).

Tableau 1: Expériences de challenge chez la souris après transfert passif d'un sérum hyperimmun dc Lapin ou après immunisation par lc conjugué P40-icosasaccharide.
S Détermination du pourcentage d'animaux vivants 60 jours après injection par voie intrapéritonéale d'une dose de bactéries Salmonelle enteritidis.
10 Dose de Salmonelle Challenge après Challenge après enreritidis transfert passif immunisation 1,3 x DL50 100 g'o 100 g'o 1S 13 x DL50 100 9'0 100 95 52 x DISO O O
20 EXEMPLE 10: Expérience de challenge chez la souris après immunisation par le conjugué P40/icosasaccharidc.

9.1. Mlatériel et méthodes.
25 Les souris (femelles NMRI, 20g, 6/lot) sont immunisées par le conjugué P40/icosasaccharide en absence d'adjuvant comme décrit dans l'exemple 4.
Au jour 42 le challenge par les bactéries Salmonelle enteritidis SH
2204 est réalisé comme décrit précédemment dans l'exemple G.
9.2. Résultats.
La vaccination par Ie conjugué P40-icosasaccharide permet de protéger directement les souris contre un challenge par Salmonelle enteritidis. Les immunisations par ce conjugué permettent en effet d'augmenter fa DL50 par un facteur 10 au minimum (Tableau 1 ), la DLSO
pouvant alors ètre supérieure à 3,4.10~/ml.

LÉGENDES DES FIGURFS
Figure 1 ' - J35 lo ~ Jo Figure 2 1~
.------ Jo ~- J14 ~ J2s LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DÉPOSANT:
(A) NOM: PIERRE FABRE MÉDICAMENT
(B) RUE: 45 PLACE ABEL GANCE
(C) VILLE: BOULOGNE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92100 (ii) TITRE DE L' INVENTION: COMPLEXE IMMUNOG~NE, SON UTILISATION, SON
PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET VACCIN LE CONTENANT
(iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 8 (iv) ADRESSE DE LA CORRESPONDANCE:
(A) NOM: Swabey Ogilvy Renault (B) ADRESSE: 1981 McGill College, Suite 1600 (C) VILLE: Montréal (D) ÉTAT: Québec (E) PAYS: Canada (F) CODE POSTAL: H3A 2Y3 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC/DOS-MS-DOS
(D) LOGICIEL: Word for Windows 95 (vi) DONNÉES DE LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: 2,254,084 (B) DATE DE DEPOT: 06-MAI-1997 (vii) DONNÉES DE LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/00800 (B) DATE DE DEPOT: 06-MAI-1997 (vii) DONNÉES DE LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: FR 96/05692 (B) DATE DE DEPOT: 07-MAI-1996 (viii) INFORMATIONS CONCERNANT L'AGENT:
(A) NOM: CÖTÉ, France (B) NUMÉRO D'INSCRIPTION: 4166 (C) NUMÉRO DE RÉFÉRENCE: 7091-336 FC/ntb (ix) INFORMATION DE TÉLÉCOMMUNICATION:
(A) TÉLÉPHONE: (514) 845-7126 (B) TÉLÉCOPIE: (514) 288-8389 (C) TÉLEX:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:

(A) Longueur : 1008 paires de bases (B) Type : acide nucléique (C) Nombre de brins . simple (D) Configuration : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1008 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 1:

Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser AspValLeu PheAsnPhe AsnLysAla ThrLeuLys ProGluGly Gln GlnAlaLeu AspGlnLeu TyrThrGln LeuSerAsn MetAspPro Lys AspGlySer AlaValVal LeuGlyTyr ThrAspArg IleGlySer Glu AlaTyrAsn GlnGlnLeu SerGluLys ArgAlaGln SerValVal Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) Longueur : 335 acides aminés (B) Type : acide aminé
(C) Nombre de brins . simple (D) Configuration : linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser~Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Ser~Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 1035 paires de bases (B) Type : acide nucléique (C) Nombre de brins . simple (D) Configuration : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1035 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly ATG

PheGluMet GlyTyrAsp TrpLeuGly ArgMetAla TyrLysGly Ser ValAspAsn GlyAlaPhe LysAlaGln GlyValGln LeuThrAla Lys LeuGlyTyr ProIleThr AspAspLeu AspIleTyr ThrArgLeu Gly GlyMetVal TrpArgAla AspSerLys GlyAsnTyr AlaSerThr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro Gln Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 344 acides aminés (B) Type : acide aminé

(C) Nombre de brins : simple (D) Configuration : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 4 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro Gln Gly (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) Longueur : 567 paires de bases (B) Type : acide nucléique (C) Nombre de brins : simple (D) Configuration : linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..567 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) Longueur : 188 acides aminés (B) Type : acide aminé
(C) Nombre de brins : simple (D) Configuration : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 774 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..774 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu Gln Pro Ser Leu Ser AAG TAA
Lys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 257 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn 95 ' 100 105 Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu Gln Pro Ser Leu Ser Lys

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Complexe immunogène, caractérisé en ce qu'il consiste en au moins un épitope oligo- ou polysaccharidique naturellement présent dans des bactéries, couplé à une protéine porteuse, ladite protéine porteuse comportant au moins une partie d'une protéine de membrane externe de type OmpA de bactérie gram négatif.

2. Complexe immunogène selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie gram négatif est Klebsiella pneumoniae.

3. Complexe immunogène selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'épitope oligo- ou polysaccharidique est susceptible d'être obtenu à partir de bactéries, gram négatif ou gram positif.

4. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'épitope oligo- ou polysaccharidique est choisi parmi les oligosaccharides susceptibles d'être obtenus à partir de lipopolysaccharides de membrane et les oligosaccharides de capsule, de bactéries du genre Salmonella, Escherichia, Neisseria, Shigella, Haemophilus ou Klebsiella.

5. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un oligosaccharide substantiellement purifié, susceptible d'être obtenu à partir de lipopolysaccharides de membrane de bactéries du genre Salmonella.

6. Complexe immunogène selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'oligosaccharide peut être obtenu à partir d'une bactérie du genre Salmonella appartenant à un sérogroupe porteur d'une spécificité
antigénique choisie dans le groupe suivant: 0:1, 0:2, 0:4, 0:6, 7, 8, 0:3 et 0:9.

7. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il contient un oligosaccharide susceptible d'être obtenu à partir du lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis de spécificité antigénique 0:9.

8. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une unité:

.alpha.D galactose p(1-2)-.alpha.D mannose p(1-4)-.alpha.L Rhamnose p(1-3) .alpha.tyvelose p(1-3)

9. Complexe immunogène selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un oligosaccharide de formule .alpha.-Tyvp(1-3) .alpha.D-Galp(1-2) ~ .alpha.D-Manp(1-4) ~ .alpha.L-Rhap(1-3) ~
n dans laquelle Gal représente le galactose Man représente le mannose Rha représente le rhamnose Tyv représente le tyvélose et n peut varier entre 1 et 24.

10. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la protéine porteuse présente a) la seq ID n° 2, ID n° 4 ou ID n° 6, ou b) une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec l'une des séquences mentionnées en a).

11. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins un oligosaccharide de formule .alpha.-Tyvp(1-3) .alpha.D-Gal p(1-2) ~ .alpha.D-Man p(1-4) ~ .alpha.L-Rha p(1-3) ~
n dans laquelle Gal représente le galactose Man représente le mannose Rha représente le rhamnose Tyv représente le tyvélose et n peut varier entre 1 et 5, couplé avec une protéine présentant l'une des séquences ID n° 2, ID n°
4 ou ID n° 6, ou possédant au moins 80% de similarité avec l'une des séquences ID n° 2, ID n° 4 ou ID n° 6.

12. Complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un antigène capsulaire de Salmonella.

13. Utilisation d'un complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 12, pour la préparation d'un vaccin.

14. Utilisation d'un complexe selon la revendication 11, pour la préparation d'un vaccin destiné à protéger un animal contre les infections provoquées par les bactéries Salmonella appartenant au sérogroupe antigénique 0:9.

15. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend un complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 11 et en ce qu'il comprend en outre un antigène capsulaire de Salmonella.

16. Procédé de préparation d'un complexe immunogène selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que:

a) on isole des oligosaccharides de Salmonella à partir des lipopolysaccharides de membrane, b) de manière facultative, on purifie les oligosaccharides de manière à
conserver des oligosaccharides de même poids moléculaire, c) les oligosaccharides sont activés chimiquement, d) les oligosaccharides activés sont couples à une protéine porteuse pour former le complexe immunogène.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la protéine porteuse est activée avant l'étape d) par une méthode chimique pour faciliter le couplage.

18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérise en ce qu'on effectue ensuite une étape supplémentaire consistant à
coupler le complexe obtenue à l'issue de l'étape d) avec un autre déterminant antigénique de Salmonella.

19. Utilisation d'une protéine présentant l'une des séquences ID
n° 2, 4 ou 6 pour améliorer l'immunogénicité d'un oligosaccharide.