BE1022792B1 - Molecule support - Google Patents

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BE1022792B1 BE2015/5496A BE201505496A BE1022792B1 BE 1022792 B1 BE1022792 B1 BE 1022792B1 BE 2015/5496 A BE2015/5496 A BE 2015/5496A BE 201505496 A BE201505496 A BE 201505496A BE 1022792 B1 BE1022792 B1 BE 1022792B1
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Roberta Cozzi
Guido Grandi
Domenico Maione
Y Ros Immaculada Margarit
Daniela Cira Rinaudo
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Abstract

L'invention concerne un conjugué comprenant un antigène et une molécule support, dans lequel la molécule support comprend un antigène de BP-2a et un antigène de spb1. BP-2a et spb1 sont des antigènes de Streptococcus agalactiae. Le conjugué peut être utilisé dans un procédé permettant de déclencher une réponse immunitaire chez un mammifère, ledit procédé comprenant l'administration du conjugué au mammifère. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques, en particulier des vaccins comprenant ledit conjugué.

Description

MOLECULE SUPPORT
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne des conjugués d'antigènes et de molécules supports, et des vaccins comprenant ces conjugués. Ces antigènes sont typiquement des saccharides.
ARRIERE PLAN L'utilisation de la conjugaison à des protéines supports afin de renforcer l'immunogénicité des antigènes de saccharide est bien connue [par exemple revoir les références 1 à 9 etc.] et en particulier pour les vaccins pédiatriques [10]. Trois protéines supports largement utilisées dans les vaccins actuels sont le toxoïde du tétanos (TT) , le toxoïde de la diphtérie (DT) et le variant du toxoïde de la diphtérie, CRM197. Ces protéines sont utilisées comme supports pour divers saccharides, y compris les saccharides capsulaires streptococciques et méningococciques (voir par exemple l'utilisation du TT comme support pour les saccharides dérivés des sérotypes II et III de Streptococcus agalactiae dans la référence 11 et pour les saccharides dérivés des sérogroupes A, C, W135 et Y de Neisseria meningitidis dans la référence 12 ; et l'utilisation du DT et de CRM197 comme supports pour les mêmes saccharides de N. meningitidis dans les références 13 et 14 et pour les saccharides dérivés des sérotypes la, Ib et III de Streptococcus agalactiae dans la référence 15). Des inquiétudes ont été exprimées concernant l'utilisation excessive de ces protéines supports dans les vaccins [voir par exemple la référence 16] , divers supports alternatifs ayant été alors suggérés (par exemple la protéine D de Haemophilus influenzae dans la référence 17) . Cependant, de nombreuses protéines supports alternatives ne sont pas aussi efficaces que le TT, DT et/ou CRM197. Par conséquent, il est nécessaire de trouver des protéines supports alternatives et/ou meilleures.
Un objet de la présente invention consiste donc à fournir d'autres protéines supports améliorées, en particulier des protéines supports pour les saccharides capsulaires. Les protéines supports peuvent être utilisées dans les conjugués pour induire des réponses immunitaires protectrices et/ou thérapeutiques contre les infections ou les médicaments.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont découvert que des supports comprenant deux polypeptides spécifiques de Streptococcus agalactiae (GBS), un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl, sont particulièrement efficaces. Ces supports sont versatiles et peuvent être conjugués à divers antigènes, en particulier des saccharides provenant par exemple d'organismes pathogènes. Les conjugués résultants peuvent être plus immunogéniques que les conjugués basés sur les protéines supports utilisées actuellement, par exemple CRM197. De plus, ils peuvent apporter des degrés supérieurs d'immunité protectrice contre GBS quand ils sont utilisés comme supports des saccharides GBS.
La présente invention concerne par conséquent un conjugué comprenant un antigène et une molécule support, dans lequel la molécule support comprend un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl. La molécule support comprend typiquement le polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl sous forme de polypeptide monocaténaire (un polypeptide « hybride »). Typiquement, l'antigène est un saccharide. Le saccharide peut être un saccharide quelconque, en particulier un saccharide provenant d'un organisme pathogène. Par exemple, le saccharide peut être un saccharide capsulaire provenant de Streptococcus agalactiae, Neisseria meningitidis, ou Streptococcus pneumoniae, ou un glucane. Quand le saccharide est un saccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae, il provient typiquement de l'un des sérotypes suivants : Ia, Ib, II, III et V, et en particulier des sérotypes II ou V. L'utilisation de supports polypeptidiques de l'invention en tant que supports pour des saccharides provenant de différentes souches de Streptococcus agalactiae peut être avantageuse en fournissant des réponses immunitaires améliorées ou en fournissant une protection contre des souches multiples, ce qui permet d'étendre la couverture vaccinale.
Quand le saccharide est un saccharide capsulaire de N. meningitidis, il provient typiquement d'un des sérogroupes méningococciques suivants : A, C, W135 et Y. Quand le saccharide est un glucane, il est typiquement une laminarine. Quand le saccharide est un saccharide capsulaire de S. pneumoniae, il provient typiquement d'un des sérotypes pneumococciques suivants : 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F. L'utilisation des supports polypeptidiques de l'invention en tant que supports pour des saccharides hétérologues, par exemple pour des saccharides qui n'existent pas naturellement, dans Streptococcus agalactiae, par exemple, peut être avantageuse en fournissant une protection contre deux microorganismes différents ou plus, ce qui permet d'étendre la couverture vaccinale.
La présente invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques comprenant un conjugué de l'invention en combinaison avec un support pharmaceutiquement acceptable. En particulier, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant (i) un conjugué selon l'invention, (ii) des saccharides du sérotype serotype la, Ib et III de Streptococcus agalactiae conjugués avec CRM197 et (iii) un saccharide du sérotype II ou V de Streptococcus agalactiae conjugué avec GBS80. Encore plus particulièrement, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant (i) un saccharide du sérotype V de Streptococcus agalactiae conjugué avec un support GBS59(6XD3)-GBS1523, (ii) des saccharides du sérotype la, Ib et III de Streptococcus agalactiae conjugués avec CRM197 et (iii) un saccharide du sérotype II de Streptococcus agalactiae conjugué avec GBS80. De manière toute particulière, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant (i) un saccharide du sérotype II de Streptococcus agalactiae conjugué avec un support GBS59(6XD3)-GBS1523, (ii) des saccharides du sérotype la, Ib et III de Streptococcus agalactiae conjugué avec CRM197 et (iii) un saccharide du sérotype V de Streptococcus agalactiae conjugué avec GBS80.
La présente invention concerne en outre des procédés pour déclencher une réponse immunitaire chez un mammifère adéquat, comprenant l'administration d'un conjugué ou d'une composition pharmaceutique de l'invention au mammifère.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 compare la protection (ligne plus basse du tableau) et les titres d'anticorps anti-saccharide de sérotype-II (graphique et ligne supérieure du tableau) déclenchés par immunisation avec des conjugués comprenant le saccharide de sérotype-II, les supports CRM197 et BP-2a/spbI, dans deux études. Les compositions ont été administrées en une dose de 1 pg de protéine.
La Figure 2 indique le titre d'anticorps spécifique pour GBS59 et GBS1523 déclenché par les compositions de conjugué GBS59 (6XD3)-GBS1523-II, dans deux études. NB : dans cet exemple, le support BP-2a/spbl est appelé GBS59(6XD3)-GBS1523.
La Figure 3 compare les titres d'anticorps anti-saccharide de sérotype-II déclenchés par immunisation avec des conjugués comprenant le saccharide de sérotype-II et les supports CRM197, GBS80 et BP-2a/spbl.
La Figure 4 compare les titres d'anticorps anti-saccharide de type-V déclenchés par immunisation avec des conjugués comprenant le saccharide de sérotype-V et les supports CRM197, GBS80 et BP-2a/spbl.
La Figure 5 compare la protection (ligne plus basse du tableau) et les titres d'anticorps anti-saccharide de sérotype-V (graphique et ligne supérieure du tableau) déclenchés par immunisation avec des conjugués comprenant le saccharide de sérotype-V et les supports CRM197 et BP-2a/spbl. Les compositions ont été administrées en une dose de 1 pg de protéine.
La Figure 6 illustre le titre d'anticorps spécifiques pour GBS59 et GBS1523 déclenchés par les compositions de conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523-V, dans deux études. NB : dans cet exemple, le support BP-2a/spbl est appelé GBS59(6XD3)-GBS1523.
La Figure 7 montre la réponse IgG générée par différents conjugués de protéine support dans un système de modèle utilisant la laminarine et indique tous les antigènes de protéine ne sont pas appropriés à une utilisation comme supports. (A=CRM197 ; B=GBS01132; C=GBS01157; D=GBS52; E=GBS150; F=SAN1516).
La Figure 8 compare les titres d'anticorps anti-saccharide de type-II déclenchés par immunisation avec divers mélanges de conjugués.
La Figure 9 compare les titres d'anticorps anti-saccharide de type-V déclenchés par immunisation avec divers mélanges de conjugués.
La Figure 10 présente certaines des données de la Figure 8 et indiquent certaines différences statistiquement significatives dans les titres d'anticorps.
La Figure 11 présente certaines des données de la Figure 9 et indiquent certaines différences statistiquement significatives dans les titres d'anticorps.
La Figure 12 fournit la séquence de protéine support GBS59(6XD3)-GBS1523 (SEQ ID N° : 276) et met en exergue ses parties constituantes. Les séquences de liaison sont encadrées alors que les différentes séquences BP-2a et spbl sont marquées par un simple soulignement et un double soulignement.
La Figure 13 indique les motifs répétitifs des saccharides bactériens représentatifs pour une utilisation dans les conjugués de l'invention.
La Figure 14 présente un western blot avec du sérum provenant d'un patient humain, qui reconnaît fortement le spbl de longueur entière (GBS1523) et le spblD2+D3 (GBS1523D2+d3) / mais pas le spblDi (GBS1523Di) .
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention concerne un conjugué comprenant un antigène et une molécule support, dans lequel la molécule support comprend un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl. Les caractéristiques de ce conjugué sont décrites plus en détail ci-dessous.
En ce qui concerne le Streptococcus du groupe B, un vaccin à base uniquement de polysaccharide(s) capsulaire(s) ne sera pas efficace pour déclencher une protection optimale contre une infection GBS non typable, car les isolats de NT produisent de très faibles taux de capsules ou ont des structures capsulaires modifiées qui ne réagissent pas avec l'antisérum obtenu à partir de l'un quelconque des neuf sérotypes connus. L'utilisation des antigènes de protéine GBS, en particulier en tant que supports de polysaccharide, est avantageuse au contraire des supports non-GBS comme CRM197, les antigènes de protéine GBS déclenchent une réponse immunologique protectrice contre GBS. Ainsi, l'utilisation des molécules supports GBS de l'invention en tant que protéines support pour le ou les polysaccharide (s) GBS dans une composition vaccinale augmente la couverture vaccinale. Les sérotypes non prévalents de GBS colonisateurs (par exemple types IV et VII) peuvent émerger dans une population vaccinée par un vaccin multivalent contre les sérotypes colonisateurs prédominants actuellement dans un procédé appelé « substitution du sérotype ». Pour les vaccins GBS, l'utilisation des conjugués de l'invention peut aussi régler certains soucis concernant la substitution du sérotype.
La molécule support
La molécule support comprend un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl. De préférence, la molécule support comprend le polypeptide BP-2a et le polypeptide spbl en tant que polypeptide monocaténaire (un polypeptide « hybride »). BP-2a
Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B, GBS) a trois variants de pilus, chacun codé par un îlot de pathogénicité distinct, PI-1, PI-2a et PI-2b [18,19]. Chaque îlot de pathogénicité se compose de 5 gènes codant pour : la protéine squelette de pilus (BP); 2 protéines auxiliaires (API et AP2) ; et 2 protéines sortases qui sont impliquées dans l'assemblage des pili. Toutes les souches GBS portent au moins un de ces 3 îlots de pathogénicité et les séquences des protéines structurelles du pilus (BP, API et AP2) codées par ces îlots de pathogénicité sont en général bien conservées. Néanmoins, la séquence de la protéine squelette codée par l'îlot de pathogénicité 2a varie entre les souches GBS. La sous-unité de pilus BP-2a possède au moins sept clades et l'identité de séquence entre ces clades est faible avec 48%. Le polypeptide BP-2a peut aussi être désigné GBS59 ou SAL1486.
Les séquences d'acides aminés de référence pour les sept clades de BP-2a sont la SEQ ID N° : 1 (dérivée de la souche 2603 de GBS) , la SEQ ID N° : 2 (dérivée de la souche 515) , la SEQ ID N° : 3 (dérivée de la souche CJBlll de GBS) , la SEQ ID N° : 4 (dérivée de la souche H36B de GBS) , la SEQ ID N° : 5 (dérivée de la souche CJB110 de GBS), la SEQ ID N° : 6 (dérivée de la souche DK21 de GBS) et la SEQ ID N° : 7 (dérivée de la souche NEM316 de GBS) du présent document. Les inventeurs ont découvert que les polypeptides BP-2a sont utiles en tant que molécules supports quand ils sont combinés à un polypeptide spbl.
Les polypeptides BP-2a préférés pour utilisation avec l'invention comprennent : une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ; un fragment d'au moins 20 acides aminés contigus (par exemple au moins 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250) d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ; ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70 % (par exemple d'au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ou ayant ladite identité avec ledit fragment d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ; ou un fragment de 20 à 250 acides aminés contigus, 25 à 250 acides aminés contigus, 30 à 250 acides aminés contigus, 40 à 250 acides aminés contigus, 50 à 170 acides aminés contigus, 50 à 165 acides aminés contigus d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7. Le polypeptide BP-2a de l'invention comprend de préférence au moins un épitope de lymphocyte T CD4+. Les fragments préférés sont dépourvus d'un ou de plusieurs acides aminés (par exemple 1/ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou plus) à partir de la terminaison C et/ou d'un ou plusieurs acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou plus) à partir de la terminaison N d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 tout en conservant au moins un épitope d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7. Les autres fragments sont exempts d'un ou de plusieurs domaines de protéine.
Le polypeptide BP-2a de l'invention comprend au moins un épitope de lymphocyte T CD4+. Les lymphocytes T CD4+ aident les lymphocytes B à produire des anticorps contre les antigènes [20] . Les épitopes de lymphocytes T peuvent être identifiés empiriquement (par exemple en utilisant PEPSCAN [21,22] ou des méthodes similaires), ou ils peuvent être prédits (par exemple en utilisant l'indice antigénique de Jameson-Wolf [23], les approches à base de matrice [24] , TEPITOPE [25], les réseaux neuronaux [26], OptiMer & EpiMer [27,28], ADEPT [29], Tsites [30], 1'hydrophilicité [31], l'indice antigénique [32] ou les méthodes exposées dans la référence 33, etc.).
Les polypeptides BP-2a pour une utilisation avec l'invention comprennent ou se composent de domaines immunogéniques qui peuvent comprendre d'importants épitopes de lymphocytes T CD4+. Des exemples de domaines présents dans les différents clades de BP-2a sont indiqués ci-dessous.
La protéine BP-2a peut être divisée en quatre domaines (DI à D4) entre l'extrémité de son peptide leader et le début de son ancrage LPXTG. Ces quatre domaines sont les suivants dans les SEQ ID N° : 1 à 7, et les positions dans les autres séquences de BP-2a qui correspondent à ces résidus peuvent être facilement identifiées par alignement :
Tableau 1
Les sous-fragments du domaine D3 identifiés ci-dessous (SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48) sont des fragments à surface exposée. Les inventeurs ont identifié que ces sous-fragments de D3 peuvent être des supports particulièrement efficaces quand ils sont combinés aux polypeptides spbl.
Tableau 2
Des épitopes plus petits à l'intérieur de ces fragments exposés en surface peuvent être facilement identifiés par l'homme du métier et utilisés dans les compositions de l'invention. Par exemple, deux anticorps monoclonaux (17C4/A3 et 4H11/B7, SEQ ID N° : 262-269) se sont révélés lier un épitope comprenant les acides aminés 411-436 (SEQ ID N° : 270) à l'intérieur du sous-fragment de D3 provenant du clade 515 (SEQ ID N° : 38, fragment de la SEQ ID N° : 2) . Les sous-fragments du domaine D4 identifiés ci-dessous comprennent les deux hélices (dénommées ici D4H) présentes sur la terminaison N du domaine D4 et non du restant du domaine D4. Ces hélices sont normalement exposées en surface.
Par conséquent, dans certains modes de réalisation, les polypeptides BP-2a pour une utilisation avec l'invention comprennent une séquence d'acides aminés choisie parmi les domaines ci-dessus, un fragment d'au moins 20 acides aminés parmi l'un des domaines ci-dessus, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité de séquence d'au moins 70% avec lesdits domaines ou fragments.
Dans des modes de réalisation préférés, les polypeptides BP-2a pour une utilisation avec l'invention comprennent un fragment de D3, ou un homologue de celui-ci. Les fragments de D3 se sont révélés induire une réponse immunitaire protectrice [34]. En particulier, dans les modes de réalisation préférés, les polypeptides BP-2a pour une utilisation avec l'invention comprennent ou se composent d'un sous-fragment de D3. Ces polypeptides peuvent être des supports particulièrement efficaces quand ils sont combinés au polypeptide spbl. Par conséquent, les polypeptides BP-2a pour une utilisation avec l'invention peuvent se composer de fragments des SEQ ID N° : 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 comprenant ou se composant du domaine D3 ou d'un sous-fragment de D3 tel qu'identifié ci-dessus. Les polypeptides BP-2a particulièrement préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent : une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48 ; un fragment d'au moins 20 acides aminés contigus (par exemple au moins 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250) d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48 ; ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% (par exemple d'au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, .92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48 ou ayant ladite identité avec ledit fragment d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48. D'autres polypeptides BP-2a pour une utilisation avec l'invention comprennent : un fragment comprenant ou se composant de pas plus de 2 0 acides aminés contigus (par exemple pas plus de 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 acides aminés contigus) d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48. Les fragments des sous- fragments de D3 sont possibles, par exemple, les fragments dépourvus d'un ou de plusieurs acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou
plus) à partir de la terminaison C et/ou d'un ou de plusieurs acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou plus) à partir de la terminaison N d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48 tout en conservant au moins un épitope d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48. Dans certains cas, des fragments même plus petits peuvent être utilisés. Par exemple, un polypeptide peut se composer d'un fragment de la SEQ ID N° : 3 comprenant SEQ ID N° : 78 (acides aminés 411 à 436 de la SEQ ID N° : 3).
Bien que les fragments D3 et sous-fragments de D3 soient des polypeptides BP-2a préférés pour une utilisation avec l'invention, les fragments peuvent conserver des domaines D4, D2 et/ou DI en plus des épitopes du domaine D3. Les polypeptides de l'invention peuvent par conséquent se composer des fragments des SEQ ID N° : 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 comprenant ou se composant des i) domaines D2 et D3 ; ii) domaines D3 et D4 ; iii) domaines Dl, D2 et D3 ; ou iv) domaines D2, D3 et D4, tels qu'identifiés ci-dessus. Les exemples de fragments sont indiqués ci-dessous. Ces fragments contiennent des combinaisons des domaines D2, D3, et D4 (ou D4H) telles qu'exposées ci-dessous :
Tableau 3
Les séquences d'acides aminés utilisées avec l'invention, peuvent, par rapport aux SEQ IDN° : 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 ou fragments de celles-ci inclure une ou plusieurs (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) substitutions conservatrices d'acides aminés, c'est-à-dire substitutions d'un acide aminé par un autre qui a une chaîne latérale associée. Les acides aminés codés génétiquement sont généralement divisés en quatre familles : (1) acide, c'est-à-dire aspartate, glutamate ; (2) basique, c'est-à-dire lysine, arginine, histidine ; (3) non polaire, c'est-à-dire alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane ; et (4) polaire non chargé, c'est-à-dire glycine, asparagine, glutamine, cystéine, sérine, thréonine, tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane, et la tyrosine sont parfois classés conjointement comme acides aminés aromatiques. En général, la substitution d'acides aminés uniques à l'intérieur de ces familles n'a pas d'effet majeur sur l'activité biologique. Les polypeptides peuvent comporter une ou plusieurs délétions (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) d'acides aminés individuels par rapport à une séquence de référence. Les polypeptides peuvent donc inclure une ou plusieurs insertions (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) d'acides aminés (par exemple chacun des 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés) par rapport à une séquence de référence.
Dans des modes de réalisation préférés, le support comprend plus d'un polypeptide BP-2a. Les inventeurs ont démontré que les supports comprenant de multiples polypeptides BP-2a peuvent être des supports particulièrement efficaces quand ils sont utilisés en combinaison avec un polypeptide spbl. Par conséquent, dans des modes de réalisation préférés, le support comprend au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6 ou au moins 7 polypeptides BP-2a. Quand plus d'un polypeptide BP-2a est présent, chaque polypeptide BP-2a provient généralement d'une souche différente.
Les conjugués de l'invention peuvent comprendre : au moins deux (par exemple au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6 ou au moins 7) séquences d'acides aminés choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ; au moins deux fragments d'au moins 20 acides aminés contigus (par exemple 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou more) ou pas plus de 20 acides aminés contigus (par exemple 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou moins) de séquences d'acides aminés choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ; ou au moins deux séquences d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% (par exemple au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec les séquences d'acides aminés choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7 ou ayant ladite identité avec lesdits fragments de séquences d'acides aminés choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1-7.
Le support peut comprendre des domaines de BP-2a correspondants provenant de différentes souches. Par exemple, le support peut comprendre des domaines D3 ou des sous-fragments de D3 provenant de 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 différentes souches.
En général, chaque polypeptide BP-2a sera présent dans un polypeptide monocaténaire. Quand de multiples polypeptides BP-2a sont présents dans un polypeptide monocaténaire, ils peuvent être séparés par des lieurs. Les lieurs appropriés comprennent les séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage, les lieurs de poly-glycine (c'est-à-dire comprenant Glyn oùn=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID N° : 295)), et des étiquettes histidine (c'est-à-dire His„ où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID N° : 296)). D'autres séquences d'acides aminés de liaison seront évidentes pour l'homme du métier. A titre d'exemple non limitatif, les lieurs utiles peuvent inclure GSGS (SEQ ID N° : 277), GSGGGG (SEQ ID N° : 272) ou GSGSGGGG (SEQ ID NO: 273) . La chaîne polypeptidique comprenant les polypeptides BP-2a (et éventuellement des lieurs) peut être exprimée sous la forme d'un polypeptide de fusion en utilisant les techniques d'expression recombinantes standards. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « polypeptide monocaténaire » désigne en général une chaîne polypeptidique dans laquelle tous les acides aminés sont liés séquentiellement par des liaisons peptidiques. Un « polypeptide monocaténaire » est usuellement généré par l'expression d'une unique séquence d'ADN. Cependant, en variante ou en plus, deux polypeptides BP-2a ou plus peuvent être liés en utilisant des techniques de conjugaison chimique standard, par exemple en utilisant des lieurs carbonés linéaires ou ramifiés, des lieurs carbonés hétérocycliques, des lieurs hydrate de carbone. Par exemple, un lieur peut être lié par le biais de chaînes latérales lysine ou cystéine. Donc, dans certains modes de réalisation, des techniques recombinantes d'expression de la protéine de fusion et de conjugaison chimique peuvent être utilisées de manière combinée pour produire un polypeptide monocaténaire comprenant de multiples polypeptides BP-2a.
Les différents polypeptides BP-2a peuvent être présents dans n'importe quel ordre dans la chaîne polypeptidique. Des exemples de combinaison sont donnés ci-dessous. Chaque numéro dans le tableau indique la SEQ ID N° pertinente.
Tableau 4
Donc, les exemples d'hybrides de polypeptides BP-2a appropriés à l'utilisation dans l'invention incluent les polypeptides comprenant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID N° : 83 ; SEQ ID N° : 84 ; SEQ ID N° : 85 ; SEQ ID N° : 86 ; ou SEQ ID N° : 87, et des homologues ayant une identité d'au moins 70% avec lesdites séquences (par exemple au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%). D'autres hybrides BP-2a sont exposés dans la publication de la demande de brevet international WO2011/121576. spbl
La séquence originale spbl (SAN1518 ; GBS1523) a été mentionnée dans la référence 35 comme étant une protéine de la famille à ancrage de surface dans la paroi cellulaire (voir GI : 77408651 ou n° d'enregistrement Uniprot Q8E479) . Les termes 'spbl' et 'GBS1523' sont utilisés dans le présent document de manière synonyme. Pour les motifs de référence, la séquence d'acides aminés de longueur entière spbl telle qu'elle se trouve dans la souche COH1 est indiquée sous le nom de SEQ ID N° : 206 dans le présent document. Les polypeptides spbl préférés pour une utilisation avec l'invention comprennent : la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 206 ; un fragment d'au moins 20 acides aminés contigus (par exemple 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) de la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 206 ; un fragment de moins de 400 acides aminés contigus (par exemple 395, 390, 389, 388, 387, 386, 385, 384, 383 ou moins) de la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 206 ; ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% (par exemple au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 20 6 ou ayant ladite identité avec ledit fragment de la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 206. Les fragments particuliers de spbl de l'invention comprennent le fragment spblD2+D3 (dénommé dans les exemples BP-2bD2+D3 ou BP-2bi85-468) r un fragment constitué des acides aminés 185 à 4 68 de spbl de longueur entière, en particulier des acides aminés 185 à 468 de la SEQ ID N° : 206 appelés SEQ ID N° : 285. Les inventeurs ont démontré que les polypeptides spbl peuvent être des supports particulièrement efficaces quand ils sont utilisés en combinaison avec un polypeptide BP-2a. Ces protéines spbl comprennent des variants de la SEQ ID N° : 206. Le polypeptide spbl de l'invention comprend de préférence au moins un épitope de lymphocytes T CD4+. Les fragments préférés sont dépourvus d'un ou de plusieurs acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou plus) à partir de la terminaison C et/ou d'un ou plusieurs acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou plus) à partir de la terminaison N de la SEQ ID N° : 206 tout en conservant au moins un épitope de la SEQ ID N° : 20 6. Les autres fragments sont exempts d'un ou de plusieurs domaines de protéine.
Le spbl de type sauvage contient une séquence leader N-terminale ou une région de la séquence signal au niveau des acides aminés 1 à 30 de la SEQ ID N° : 206 qui peut être retirée en fragments, par exemple SEQ ID N° : 207. En variante ou en plus, les acides aminés 468-502 de la SEQ ID N° : 206 peut être retirée en fragments, par exemple SEQ ID N° : 207. En variante ou en plus, les acides aminés 1-185 de SEQ ID N° : 206 peuvent être découpés en fragments. Par conséquent, dans des modes de réalisation préférés, les polypeptides spbl pour une utilisation dans l'invention comprennent : la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 207 ; un fragment d'au moins 20 acides aminés contigus (par exemple 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) de la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 207 ; un fragment de pas plus de 20 acides aminés contigus (par exemple 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 260, 270, 280, 290 ou moins, par exemple 283 acides aminés contigus) de la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 207 ; ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% (par exemple au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 206 ou ayant ladite identité avec ledit fragment de la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 207. Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide spbl comprend ou se compose de la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 207.
La séquence spbl de type sauvage contient un motif d'acide aminé indicatif d'un ancrage à la paroi cellulaire (LPSTG) au niveau des acides aminés 468-472 de la SEQ ID N° : 206. Dans certains systèmes de cellules hôtes recombinants, il peut être préférable d'éliminer ce motif pour faciliter la sécrétion d'un polypeptide recombinant à partir de la cellule. En variante, il peut être préférable d'utiliser le motif d'ancrage à la paroi cellulaire pour ancrer le polypeptide exprimé de manière recombinante à la paroi cellulaire. Le domaine extracellulaire du polypeptide exprimé peut être clivé au cours de la purification ou le polypeptide recombinant peut rester fixé soit aux cellules hôtes inactivées soit aux membranes cellulaires dans la composition finale. Une boite E contenant un résidu glutamique conservé a aussi été identifiée au niveau des acides aminés 419-429 de SEQ ID N° : 206, avec un résidu d'acide glutamique conservé au niveau du résidu 423. Le motif de la boite E peut être important pour la formation de structures de type pilus oligomérique, et des fragments aussi utiles de spbl peuvent inclure le résidu d'acide glutamique conservé. Un mutant de spbl a été identifié, dans lequel la glutamine (Q) en position 41 de ,1a SEQ ID N° : 206 est substituée par une lysine (K) , résultat d'une mutation d'un codon dans la séquence nucléotidique codante de CAA à AAA. Cette substitution peut être présente dans les séquences de spbl et les fragments de spbl (par exemple SEQ ID N° : 208).
Polypeptides hybrides
Typiquement, le polypeptide spbl et le polypeptide BP-2a ou les polypeptides BP-2a sont' exprimés sous la forme d'un polypeptide monocaténaire (un polypeptide 'hybride'). Les polypeptides hybrides peuvent être représentés par la formule NH2-A-{-X-L-}^-B-COOH, dans laquelle : A est une séquence d'acides aminés N-terminale optionnelle ; B est une séquence d'acides aminés C-terminale optionnelle ; n est un entier de 2 ou plus (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, etc.) ; chaque X est une séquence d'acides aminés d'un polypeptide spbl ou d'un polypeptide BP-2a (tel que décrit ci-dessus), dans laquelle au moins un X est un polypeptide spbl et au moins un X est un polypeptide BP-2a ; et L est une séquence de liaison d'acides aminés optionnelle. Quand n est 2, Xx est usuellement un polypeptide BP-2a et X2 est usuellement un polypeptide spbl. Quand n est supérieur à 2, chaque polypeptide spbl (quand plus d'un est présent) peut être identique ou différent et chaque polypeptide BP-2a (quand plus d'un est présent) peut être identique ou différent.
Le polypeptide spbl ou le polypeptide BP-2a c'est-à-dire la séquence d'acides aminés dont chaque X est tel que défini ci-dessus. Quand ces polypeptides sont définis comme comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins un certain pourcentage d'identité avec un polypeptide ou fragment spbl ou BP-2a donné, le degré d'identité peut être identique pour chaque X.
Pour chaque occurrence de n de {-X-L-}, la séquence d'acides aminés de liaison -L- peut être présente ou absente. Par exemple, quand n=2 l'hybride peut être NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-Xi-X2-COOH, NH2-Xi-Li-X2-COOH, NH2-Xi-X2-L2-COOH, etc. La ou les séquences d'acides aminés de liaison -L- sera ou seront typiquement courte (s) (par exemple de 20 acides aminés ou moins, c'est-à-dire 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Les exemples comprennent de courtes séquences peptidiques qui facilitent le clonage, des lieurs poly-glycine (c'est-à-dire comprenant Glyn où n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID N° : 295)), et des étiquettes histidine (c'est-à-dire Hisfl où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID N° : 296)) . D'autres séquences d'acides aminés de liaison appropriées seront évidentes pour l'homme du métier. Un lieur utile est GSGS (SEQ ID N° : 277), GSGGGG (SEQ ID N° : 272) ou GSGSGGGG (SEQ ID N° : 273), le dipeptide Gly-Ser étant formé à partir d'un site de restriction BamHI, facilitant ainsi le clonage et la manipulation, et le tétrapeptide (Gly)4 (SEQ ID N° : 297) étant un lieur poly-glycine typique. D'autres lieurs appropriés, en particulier pour une utilisation en tant que Ln final, sont un dipeptide Leu-Glu ou de SEQ ID N° : 274. La SEQ ID N° : 277 est préférée pour lier les différents polypeptides BP-2a. La SEQ ID N° : 272 est préférée pour lier les polypeptides BP-2a et polypeptides spbl. -A- est une séquence d'acides aminées N-terminale optionnelle. Celle-ci sera typiquement courte (par exemple de 40 acides aminés ou moins, c'est-à-dire de 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Les exemples comprennent des séquences leader destinées à diriger la circulation de la protéine ou des séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (par exemple étiquettes histidine c'est-à-dire His„ où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID N° : 296)). D'autres séquences d'acides aminées N-terminales appropriées seront évidentes pour l'homme du métier. Si Xi est exempt de sa propre méthionine N-terminale, -A- est de préférence un oligopeptide (par exemple avec 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 acides aminés) qui fournit une méthionine N-terminale par exemple Met-Ala-Ser, ou un unique résidu Met. Un -A-préféré est un unique résidu Met. -B- est une séquence d'acides aminés C-terminale optionnelle. Celle-ci sera typiquement courte (par exemple de 40 acides aminés ou moins, c'est-à-dire de 39, 38, 37, 36, 35, · 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Les exemples comprennent des séquences destinées à diriger la circulation de la protéine, des séquences peptidiques courtes qui facilitent le clonage ou la purification (par exemple comprenant des étiquettes histidine c'est-à-dire His„ où n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus (SEQ ID N° : 296) , comme la SEQ ID N° : 275) , ou des séquences qui accentuent la stabilité de la protéine. D'autres séquences d'acides aminés C-terminales appropriées seront évidentes pour l'homme du métier. De préférence, -B- est absent.
On préfère que les séquences -A-, -B- et -L- ne comprennent pas de séquence qui partage 10 acides aminés contigus ou plus en commun avec une séquence de polypeptide humaine.
Des molécules supports particulières peuvent comprendre une fusion de (i) au moins un sous-fragment de D3 choisi dans le groupe constitué par les souches 515, H36B, CJBlll, 2603, CJB110 et DK21 de GBS et (ii) un polypeptide spbl ou un fragment de celui-ci. Plus particulièrement, les molécules supports peuvent comprendre une fusion de (i) au moins une séquence de sous-fragment de D3 choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 38, SEQ ID N° : 42, SEQ ID N° : 40, SEQ ID N° : 36, SEQ ID N° : 44 et SEQ ID N° : 46 et (ii) un polypeptide spbl de SEQ ID N° : 207. Encore plus particulièrement, les molécules supports peuvent comprendre une fusion de (i) au moins une séquence de sous-fragment de D3 choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 38, SEQ ID N° : 42, SEQ ID N° : 40, SEQ ID N° : 36, SEQ ID N° : 44 et SEQ ID N° : 4 6 et (ii) un fragment D2+D3 du polypeptide spbl, en particulier un fragment comprenant ou se composant des acides aminés 185 à 468 de SEQ ID N° : 206.
Un exemple d'hybride est le support GBS59(6XD3)-GBS1523, présenté dans la SEQ ID N° : 27 6. Dans certains modes de réalisation, la molécule support de l'invention comprend une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% (par exemple d'au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec la SEQ ID N° : 276 (telle que déterminée à travers la longueur de la SEQ ID N° : 276). Dans certains de ces modes de réalisation, la molécule support comprend au moins un épitope de lymphocytes T CD4 + de spbl et au moins un épitope de lymphocytes T CD4+ de BP-2a CD4+ provenant de chacun parmi BP-2a (515), BP-2a (H36B), BP-2a (CJBlll), BP-2a (2603), BP-2a (CJB110) et BP-2a (DK21).
La séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 276 est reproduite sous forme de schéma sur la Figure 12. Cette molécule support particulière se compose des parties suivantes en partant de la terminaison N pour aller jusqu'à la
terminaison C : une méthionine N-terminale ; un sous-fragment de D3 provenant de 515 (SEQ ID N° : 38) ; un lieur GSGS (SEQ
ID N° : 277) ; un sous-fragment de D3 provenant de H36B (SEQ ID N° : 42) ; un lieur GSGS (SEQ ID N° : 277) ; un sous- fragment de D3 provenant de CJBlll (SEQ ID N° : 40) ; un lieur GSGS (SEQ ID N° : 277) ; un sous-fragment de D3 provenant de 2603 (SEQ ID N° : 36) ; un lieur GSGS (SEQ ID N° : 277) ; un sous-fragment de D3 provenant de CJB110 (SEQ ID N° : 44) ; un lieur GSGS (SEQ ID N° : 277) ; un sous-f ragment de D3 provenant de DK21 (SEQ ID N° : 46) ; un lieur GSGGGG (SEQ ID N° : 272) ; spbl avec des délétions N- et C- terminales (SEQ ID N° : 207). L'homme du métier comprendra que des variantes de séquences et des variations dans les dispositions des polypeptides indiqués dans la SEQ ID N° : 27 6 puissent présenter les mêmes caractéristiques de support avantageuses que révélées dans les exemples. Par exemple, la séquence du polypeptide spbl peut être variée, comme expliqué ci-dessus dans la section intitulée « spbl ». De manière similaire, le nombre de polypeptides BP-2a différents peut varier et la séquence de chaque polypeptide BP-2a présent peut varier comme expliqué ci-dessus dans la section intitulée « BP-2a ». Dans certains modes de réalisation, le support comprend au moins 1 (c'est-à-dire 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou plus) polypeptide BP-2a provenant de différentes souches. Dans des modes de réalisation préférés, le support comprend au moins 2 polypeptides BP-2a. Même plus préférentiellement, le support comprend au moins 4, 5, 6 ou 7 polypeptides BP-2a provenant de différentes souches.
Les polypeptides BP-2a et spbl peuvent être présents dans la molécule support dans n'importe quel ordre. Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide spbl est en direction ou est au niveau de la terminaison C (ce qui veut dire que le-X- final est un polypeptide spbl) . Dans des modes de réalisation préférés, la totalité des polypeptides BP-2a présents dans le support sont regroupés et sont tous soit au niveau de la terminaison N soit de la terminaison C du polypeptide spbl. De préférence, le polypeptide hybride peut être représenté par la formule NH2-A- {-XBp-2a~L- }n_XsPbi_L-B-COOH, dans laquelle n est au moins 1, et est de préférence au moins 2, et chaque XBp-2a est dérivé d'une souche différente.
Le support peut comprendre d'autres polypeptides en plus des polypeptides spbl et BP-2a. Par exemple, le support peut comprendre les polypeptides GBS80 et/ou GBS67, ou des homologues ou fragments de ceux-ci. Les séquences d'acides aminés des polypeptides GBS80 et GBS67 sont indiquées dans les SEQ ID N° : 177-205. GBS80 est aussi connu sous le nom de SAG0645 identifié dans Uniprot sous le n° d'enregistrement Q8E0S9 (protéine de la famille à ancrage de surface dans la paroi cellulaire).
Le polypeptide hybride peut être produit en utilisant des procédés d'expression de la protéine de fusion recombinante, des techniques de conjugaison chimique, ou n'importe quelle combinaison, telle que décrite ci-dessus.
Molécules supports modifiées pour incorporer des acides aminés non naturels L'invention concerne également des molécules supports qui ont été modifiées pour incorporer des acides aminés non naturels. Les acides aminés non naturels peuvent être utilisés pour conjuguer la molécule support à une autre molécule.
Dans certaines variantes, la molécule support comprend un ou plusieurs (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) acides aminés non naturels. Les acides aminés non naturels peuvent avoir un groupe fonctionnel avec un profil de réaction qui est différent par rapport aux groupes fonctionnels disponibles pour réagir dans les protéines constituées des acides aminés canoniques (par exemple le groupe aminé de la lysine ou le groupe sulfhydryle de la cystéine). Cela signifie en retour que des réactions chimiosélectives permettent des conjugaisons sélectives de site devant être réalisées au niveau de sites prédéterminés où un acide aminé non naturel a été incorporé dans la protéine.
Par exemple, la molécule support peut comprendre un ou plusieurs résidus de L-homoallylglycine (HAG). Typiquement, les résidus HAG sont substitués à la place des résidus méthionine dans la séquence. HAG, connue chimiquement sous le nom d'acide L-2-amino-5-hexènoique, est un analogue de la méthionine, et contient un site alcène réactif. HAG peut remplacer la méthionine à la fois dans les étapes d'initiation et d'extension de la synthèse des protéines. HAG a une chaîne latérale oléfinique qui possède un profil de réaction différent des groupes fonctionnels qui se trouve dans les acides aminés canoniques, en réagissant par le biais d'un mécanisme thiyl-ène.
Dans d'autres modes de réalisation, la molécule support peut être modifiée pour inclure d'autres acides aminés non naturels qui permettent de réaliser des conjugaisons sélectives de site au niveau de sites prédéterminés. Par exemple, la molécule support peut être modifiée de sorte qu'un ou plusieurs (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, etc.) résidus p-acétylphénylalanine soient inclus dans sa séquence. Cet acide aminé a un groupe fonctionnel kéto, qui n'est pas présent dans l'un quelconque des acides aminés canoniques, et par conséquent, l'acide aminé peut réagir spécifiquement avec les hydrazines, alcoxyamines et semicarbazides dans des conditions aqueuses douces pour produire des liaisons hydrazone, oxime et semicarbazone. D'autres acides aminés ayant des groupes fonctionnels kéto comprennent la m-acétylphénylalanine et la p-benzoylphénylalanine et ces résidus peuvent être utilisés de la même manière.
Dans d'autres modes de réalisation, la molécule support peut être modifiée pour inclure un groupe azide (qui n'est également pas présent dans les acides aminés canoniques), par exemple grâce à l'incorporation d'un ou de plusieurs (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, etc.) résidus p-azidophénylalanine. Le groupe azide peut réagir avec un groupe acétylène sur le partenaire de conjugaison par le biais d'une réaction de cycloaddition [2 + 3] catalysée par le cuivre (I) . Inversement, il est possible de manipuler génétiquement le groupe acétylène non présent à l'état naturel dans la protéine support grâce à l'incorporation d'un ou de plusieurs (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, etc.) résidus p-propargyloxyphénylalanine, que l'on peut faire réagir par le biais du même mécanisme avec un groupe azide sur le partenaire de conjugaison.
Dans d'autres modes de réalisation à présent, la molécule support peut être modifiée pour inclure un ou plusieurs (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, etc.) résidus phénylsélénocystéine. Le traitement de ce résidu avec du peroxyde d'hydrogène permet sa conjugaison avec des groupes thiol. L'antigène L'antigène est typiquement un saccharide. Quand l'antigène est un saccharide, le saccharide peut être tout saccharide, en particulier un saccharide provenant d'un organisme pathogène. Les exemples de saccharides pour une utilisation avec l'invention sont décrits ci-dessous. En particulier, le saccharide peut être un saccharide bactérien, par exemple un saccharide capsulaire bactérien. Des saccharides bactériens représentatifs sont illustrés sur la Figure 13.
Les saccharides peuvent être utilisés sous forme d'oligosaccharides. Ceux-ci sont adéquatement formés par fragmentation de polysaccharide purifié (par exemple par hydrolyse), laquelle sera usuellement suivie d'une purification des fragments de la taille désirée. Les saccharides peuvent être purifiés à partir de sources naturelles. La fragmentation des polysaccharides est typiquement réalisée afin de donner un degré moyen final de polymérisation (DP) dans l'oligosaccharide inférieur à 30 (par exemple entre 10 et 20, autour de 10 (par exemple pour le sérogroupe A) ; entre 15 et 25 (par exemple pour les sérogroupes W135 et Y) , autour de 15-20 ; entre 12 et 22 (par exemple pour le sérogroupe C) ; etc.). Le DP peut être adéquatement mesuré par chromatographie d'échange ionique ou par des essais colorimétriques [36].
Si une hydrolyse est réalisée, l'hydrolysat sera généralement découpé afin d'enlever les oligosaccharides de courte longueur [37]. Ceci peut être fait de différentes manières, comme l'ultrafiltration, suivie par la chromatographie d'échange ionique. Les oligosaccharides ayant un degré de polymérisation inférieur ou égal à environ 6 sont de préférence éliminés (par exemple pour le sérogroupe A), et ceux en ayant un inférieur à environ 4 sont de préférence éliminés (par exemple pour les sérogroupes W135 et Y). L'hydrolyse chimique des saccharides implique généralement le traitement soit avec un acide soit avec une base dans des conditions qui sont la norme dans l'art. Les conditions de la dépolymérisation des saccharides capsulaires en leurs monosaccharides constitutifs sont connues dans l'art. Un procédé de dépolymérisation implique l'utilisation de peroxyde d'hydrogène [38] . Le peroxyde d'hydrogène est ajouté à un saccharide (par exemple pour donner une concentration finale en H2O2 de 1%) , et le mélange est ensuite incubé (par exemple autour de 55°C) jusqu'à obtention d'une réduction de longueur de chaîne désirée. La réduction progressive peut être suivie par l'élimination des échantillons du mélange et puis la mesure de la taille moléculaire (moyenne) du saccharide dans l'échantillon. La dépolymérisation peut ensuite être interrompue par un rapide refroidissement une fois que la longueur de chaîne désirée a été atteinte. A titre d'alternative à la purification, les saccharides peuvent être obtenus par une synthèse partielle ou totale.
Quand l'antigène n'est pas un saccharide, il peut être un autre antigène quelconque, c'est-à-dire un immunogène ou un haptène quelconque. Les conjugués de l'invention peuvent déclencher une réponse immunitaire contre un haptène conjugué à la molécule support. L'haptène peut être par exemple un stupéfiant [39] . Les exemples comprennent, mais sans y être limités, les opiacés, la marijuana, les amphétamines, la cocaïne, les barbituriques, le glutéthimide, le méthyprylon, l'hydrate de chloral, la méthaqualone, les benzodiazépines, le LSD, la nicotine, les médicaments anticholinergiques, les médicaments antipsychotiques, la tryptamine, les autres psychomimétiques, les sédatifs, la phèncyclidine, la psilocybine, le nitrite volatil, et autres drogues induisant une dépendance physique et/ou psychologique.
Saccharides capsulaires de Streptococcus agalactiae
Les exemples préférés de saccharides capsulaires bactériens comprennent ceux provenant de Streptococcus agalactiae. Les exemples montrent que les supports comprenant des polypeptides BP-2a et des polypeptides spbl peuvent être des supports efficaces pour les saccharides GBS. En plus, les supports comprenant des polypeptides BP-2a et des polypeptides spbl peuvent induire des réponses immunitaires spécifiques au support qui fournissent une protection utile.
Le saccharide capsulaire GBS est lié de manière covalente au squelette peptidoglycane du GBS, et est distinct de l'antigène du groupe B, qui est un autre saccharide qui est fixé au squelette peptidoglycane.
Les saccharides capsulaires GBS sont apparentés chimiquement, et tous les saccharides capsulaires GBS partagent le cœur trisaccharide suivant : ß-D-GlcpNAc (1—3) ß-D-Galp(1-4) ß-D-Glcp
Les divers sérotypes de GBS diffèrent du fait que leur cœur est modifié. La différence entre les sérotypes la et III, par exemple, provient de l'utilisation soit de GlcNAc (la) soit de Gal (III) dans ce cœur pour lier les cœurs trisaccharides suivants. Les sérotypes la et Ib ont tous deux un disaccharide [α-D-NeupNAc (2—»3) ß-D-Galp- (1-»] lié à GlcNAc dans le coeur, mais la liaison est soit 1—4 (la) soit 1—3 (Ib) .
La maladie liée à GBS provient initialement des sérotypes la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, et VIII, plus de 85% étant provoquée par les cinq sérotypes: la, Ib, II, III & V. L'invention peut utiliser un saccharide provenant d'un ou de plusieurs de ces huit sérotypes, en particulier d'un ou de plusieurs des sérotypes choisis dans le groupe constitué par la, Ib, II, III, IV et V, encore plus particulièrement d'un ou de plusieurs polysaccharides choisis dans le groupe constitué par les sérotypes la, Ib, II, III et V. Les saccharides capsulaires de chacun de ces sérotypes comprennent : (a) un résidu terminal acide N-acétyl-neuraminique (NeuNAc) (communément appelé l'acide sialique), qui est lié dans tous les cas en 2—3 à un résidu galactose ; et (b) un résidu N-acétyl-glucosamine (GlcNAc) à l'intérieur du cœur trisaccharide.
Les cinq saccharides comprennent tous des résidus galactose à l'intérieur du cœur trisaccharide, mais les sérotypes la, Ib, II & III contiennent aussi des résidus galactose additionnels dans chaque motif répétitif.
De préférence, le conjugué de l'invention comprend un saccharide capsulaire de sérotype II ou de sérotype V. Les exemples montrent que les supports BP-2a/spbl de l'invention peuvent être des supports particulièrement efficaces pour le saccharide capsulaire de sérotype II ou de sérotype V, et plus efficace que CRM. Dans des modes de réalisation particuliers, le conjugué de l'invention comprend un saccharide capsulaire de sérotype II. Les exemples montrent que les supports BP-2a/spbl de l'invention peuvent être des supports particulièrement efficaces pour le saccharide capsulaire de sérotype II.
Les saccharides utilisés selon l'invention peuvent être sous forme native, ou peuvent avoir été modifiés. Par exemple, le saccharide peut être plus court que le saccharide capsulaire natif, ou peut être chimiquement modifié. En particulier, le saccharide capsulaire de sérotype V utilisé dans l'invention peut être modifié comme décrit dans les références 40 et 41. Par exemple, un saccharide capsulaire de sérotype V qui a été sensiblement désialylé. Le saccharide capsulaire de sérotype V de GBS désialylé peut être préparé en traitant le saccharide capsulaire de sérotype V de GBS purifié dans des conditions faiblement acides (par exemple 0,1M d'acide sulfurique à 80°C pendant 60 minutes) ou par traitement avec la neuraminidase, comme décrit dans la référence 40. Ainsi, le saccharide utilisé selon l'invention peut être un polysaccharide capsulaire sensiblement de longueur entière, tel qu'il se trouve à l'état naturel, ou peut être plus court que la longueur naturelle. Les polysaccharides de longueur entière peuvent être dépolymérisés pour donner des fragments plus courts pour une utilisation avec l'invention par exemple par hydrolyse dans l'acide faible, par chauffage, par chromatographie stérique, etc. En particulier, les saccharides capsulaires de sérotype II et/ou III utilisés dans l'invention peuvent être dépolymérisés comme décrit dans les références 42 et 43.
Le saccharide peut être chimiquement modifié par rapport au saccharide capsulaire de l'état naturel. Par exemple, le saccharide peut être dés-O-acétylé (partiellement ou entièrement), dés-N-acétylé (partiellement ou entièrement), N-propionaté (partiellement ou entièrement), etc. La désacétylation peut se produire avant, pendant ou après la conjugaison, mais de préférence avant la conjugaison. En fonction du saccharide particulier, la dés-acétylation peut affecter ou ne pas affecter l'immunogénicité. La pertinence de la O-acétylation sur les saccharides de GBS dans divers sérotypes fait l'objet de la discussion de la référence 44, et dans certains modes de réalisation, la O-acétylation des résidus d'acide sialique en positions 7, 8 et/ou 9 est conservée avant, pendant et après la conjugaison par exemple par protection/dé-protection, par ré-acétylation, etc. Cependant, le saccharide de GBS utilisé typiquement dans la présente invention ne présente sensiblement pas de 0-acétylation des résidus d'acide sialique en positions 7, 8 et/ou 9. En particulier, quand le saccharide de GBS a été purifié par extraction avec une base comme décrit ci-après, alors la O-acétylation est typiquement perdue. L'effet de la dés-acétylation etc. peut être évalué par des essais de routine.
Les saccharides capsulaires peuvent être purifiés par des techniques connues, comme décrit dans la référence 45. Un procédé typique implique l'extraction avec des bases, la centrifugation, la filtration, le traitement à la RNase/DNase, le traitement à la protéase, la concentration, la chromatographie d'exclusion stérique, l'ultrafiltration, la chromatographie échangeuse d'anion, et également l'ultrafiltration. Le traitement des cellules GBS avec l'enzyme mutanolysine qui clive la paroi de la cellule bactérienne pour libérer les composants de la paroi cellulaire est aussi utile. A titre de variante, le procédé de purification décrit dans la référence 4 6 peut être utilisé. Ceci implique l'extraction par des bases, le traitement à 1'éthanol/CaCl2, la précipitation CTAB et la re-solubilisation. Un autre procédé alternatif est décrit dans la référence 47.
Saccharides capsulaires de Neisseria meningitidis
Les exemples de saccharides capsulaires pour une utilisation avec les supports de l'invention comprennent ceux provenant de Neisseria meningitidis. A partir du polysaccharide capsulaire de l'organisme, divers sérogroupes de N. meningitidis ont été identifiés y compris A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y & Z. Le saccharide de l'invention peut provenir de l'un quelconque de ces sérogroupes. Le saccharide provient typiquement d'un des sérogroupes méningococciques suivants : A, C, W135 et Y.
Sérogroupes C, W135 et Y
Les techniques pour préparer des polysaccharides capsulaires à partir des méningococques sont connues depuis plusieurs années et impliquent typiquement un procédé comprenant les étapes de précipitation du polysaccharide (par exemple en utilisant un détergent cationique), de fractionnement à l'éthanol, d'extraction phénolique à froid (pour retirer la protéine) et d'ultracentrifugation (pour retirer les LPS) [par exemple voir la référence 48].
Un procédé mieux préféré [49] implique la précipitation du polysaccharide suivie par la solubilisation du polysaccharide précipité en utilisant un alcool inférieur. La précipitation peut être réalisée en utilisant un détergent cationique comme les sels de tétrabutylammonium et de cétyltriméthylammonium (par exemple les sels de bromure), ou les sels de bromure d'hexadiméthrine et de myristyl-triméthylammonium. Le bromure de cétyltriméthylammonium ('CTAB') est particulièrement préféré [50]. La solubilisation de la matière précipitée peut être réalisée en utilisant un alcool inférieur comme le méthanol, le propan-l-ol, le propan-2-ol, le butan-l-ol, le butan-2-ol, le 2-méthyl-propan-l-ol, le 2-méthyl-propan-2-ol, les diols, etc., mais l'éthanol est particulièrement approprié pour la solubilisation des complexes CTAB-polysaccharide. L'éthanol peut être ajouté au polysaccharide précipité pour donner une concentration finale en éthanol (sur la base de la teneur totale en éthanol et en eau) située entre 50% et 95%.
Après re-solubilisation, le polysaccharide peut être encore traité pour en retirer les contaminants. C'est particulièrement important dans des situations où même une contamination mineure est inacceptable (par exemple pour la production de vaccins humains). Cela impliquera typiquement une ou plusieurs étapes de filtration, on peut utiliser par exemple la filtration en profondeur, la filtration sur charbon actif, la filtration stérique et/ou l'ultrafiltration. Une fois filtré pour retirer les contaminants, le polysaccharide peut être précipité pour un traitement et/ou une transformation ultérieure. On peut y parvenir de manière adéquate par échange de cations (par exemple grâce à l'addition de sels de calcium ou de sodium) . Après purification, les saccharides capsulaires sont conjugués avec les protéines supports, comme décrit ci-après. D'autres procédés et variantes de procédés pour la purification et la conjugaison des saccharides méningococciques sont exposés dans les références 38 & 51. A titre d'alternative à la purification, les saccharides capsulaires de la présente invention peuvent être obtenus par synthèse totale ou partielle, par exemple, la synthèse de Hib est exposée dans la référence 52, et la synthèse de MenA dans la référence 53.
Le saccharide peut être chimiquement modifié par exemple, il peut être O-acétylé ou dés-O-acétylé. L'une de ces dés-O-acétylation ou hyper-acétylation peut se situer en des positions spécifiques dans le saccharide. Par exemple, la plupart des souches du sérogroupe C ont des groupes O-acétyle en position C-7 et/ou C-8 des résidus d'acide sialique, mais environ 15% des isolats cliniques sont dépourvus de ces groupes O-acétyle [54,55]. L'acétylation ne semble pas affecter l'efficacité protectrice (par exemple a contrario du produit Menjugate™, le produit NeisVac-C™ utilise un saccharide dés-O-acétylé, mais les deux vaccins sont efficaces). Le saccharide de sérogroupe W135 est un polymère à motifs disaccharide acide sialique-galactose. Le saccharide du sérogroupe Y est similaire au saccharide du sérogroupe W135, sauf que le motif répétitif disaccharide comprend du glucose à la place du galactose. Comme les saccharides du sérogroupe C, les saccharides MenWl35 et MenY ont une O-acétylation variable, mais en positions 7 et 9 de l'acide sialique [56]. N'importe laquelle de ces modifications chimiques a lieu de préférence avant la conjugaison, mais peut, en variante ou en plus, avoir lieu pendant la conjugaison.
Les saccharides provenant de différents sérogroupes sont de préférence purifiés séparément et peuvent être ensuite combinés, soit avant soit après la conjugaison.
Sérogroupe A
Les conjugués de l'invention peuvent comprendre un antigène de saccharide capsulaire du sérogroupe A. Le saccharide peut être purifié et conjugué de la même manière que pour les sérogroupes C, W135 et Y (voir ci-dessus) , bien qu'ils soient structurellement différents - alors que les capsules des sérogroupes C, W135 et Y sont bâties autour de l'acide sialique (acide N-acétyl-neuraminique, NeuAc), la capsule du sérogroupe A est basée sur la N-acétyl-mannosamine, qui est le précurseur naturel de l'acide sialique. Le saccharide du sérogroupe A est particulièrement sensible à l'hydrolyse, et son instabilité en milieux aqueux signifie que (a) l'immunogénicité des vaccins liquides contre le sérogroupe A diminue dans le temps, et (b) le contrôle qualité est plus difficile à effectuer, à cause de la libération des produits d'hydrolyse du saccharide dans le vaccin.
Le saccharide capsulaire natif MenA est un homopolymère de A7-acétyl-D-mannosamine-l—phosphate lié en (al->6) , avec une O-acétylation partielle en C3 et C4. La liaison glycosidique principale est une liaison 1-6 phosphodiester impliquant le groupe hémi-acétal en Cl et le groupe alcool en C6 de la D-mannosamine. La longueur moyenne de la chaîne est de 93 monomères. Elle a la formule suivante :
On a préparé un antigène de saccharide modifié qui conserve l'activité immunogénique du saccharide natif de sérogroupe A mais qui est bien plus stable dans l'eau. Les groupes hydroxyles liés aux carbones 3 et 4 des motifs monosaccharide sont remplacés par un groupe de blocage [références 57 et 58].
Le nombre de motifs monosaccharide ayant des groupes de blocage à la place des hydroxyles peut varier. Par exemple, la totalité ou presque la totalité des motifs monosaccharide peut avoir des groupes de blocage. En variante, au moins 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% des motifs monosaccharide peuvent avoir des groupes de blocage. Au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 des motifs monosaccharide peuvent avoir des groupes de blocage.
De la même manière, le nombre de groupes de blocage sur un motif monosaccharide peut varier. Par exemple, le nombre de groupes de blocage sur un motif monosaccharide particulier peut être de 1 ou 2.
Le motif monosaccharide terminal peut avoir ou ne pas avoir de groupes de blocage à la place de son groupe hydroxyle natif. On préfère conserver un groupe hydroxyle anomérique libre sur un motif monosaccharide terminal afin de fournir un point d'ancrage pour d'autres réactions (par exemple la conjugaison). Les groupes hydroxyles anomériques peuvent être convertis en groupes amino (-NH2 ou -NH-E, où E est un groupe protecteur azoté) par amination réductrice (en utilisant, par exemple, NaBH3CN/NH4Cl) , et peuvent être ensuite régénérés après que d'autres groupes hydroxyles ont été convertis en groupes de blocage.
Les groupes de blocage destinés à remplacer les groupes hydroxyles peuvent être directement accessibles par le biais d'une réaction de dérivatisation du groupe hydroxyle, c'est-à-dire en remplaçant l'atome d'hydrogène du groupe hydroxyle par un autre groupe. Les dérivés appropriés des groupes hydroxyles qui agissent comme groupes de blocage sont, par exemple, les carbamates, les sulfonates, les carbonates, les esters, les éthers (par exemple les éthers de silyle ou les éthers d'alkyle) et les acétals. Certains exemples spécifiques de ces groupes de blocage sont les groupes allyle, alloc, benzyle, BOM, t-butyle, trityle, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. D'autres groupes de blocage qui ne sont pas directement accessibles et qui remplacent complètement le groupe hydroxyle comprennent les groupes alkyle en C1-12, alkyle en C3-12, aryle en C5-12, aryle en C5_i2-alkyle en C1-6, NR1^ (R1 et R2 sont définis dans le paragraphe suivant), H, F, Cl, Br, CO2H, CO2 (alkyle en Ci_6) , CN, CF3, CCI3, etc.
Les groupes de blocage typiques sont de formule : -0—X—Y ou -OR3 dans lesquelles : X est C (0) , S (0) ou S02 ; Y est un groupe alkyle en C1-12, alcoxy en C1-12, cycloalkyle en C3-12, aryle en C5-12 ou aryle en Cs-i2-alkyle en C1-6, chacun d'entre eux pouvant être éventuellement substitué par 1, 2 ou 3 groupes choisis indépendamment parmi F, Cl, Br, CO2H, CO2 (alkyle en Ci-β) , CN, CF3 ou CC13 ; ou Y est NR1R2 ; R1 et R2 sont choisis indépendamment parmi H, alkyle en Ci_i2, cycloalkyle en C3_i2, aryle en C5-12 ou aryle en C5-i2-alkyle en C1-6 ; ou R1 et R2 peuvent être regroupés pour former un groupe hétérocyclique saturé en C3-12 ; R3 est un groupe alkyle en C1-12 ou cycloalkyle en C3-12, chacun d'entre eux pouvant être éventuellement substitué par 1, 2 ou 3 groupes choisis indépendamment parmi F, Cl, Br, CO2 (alkyle en Ci-ô) , CN, CF3 ou CC13 ; ou R3 est un groupe aryle en C5-12 ou aryle en Cs-i2-alkyle en C1-6, chacun d'entre eux pouvant être éventuellement substitué par 1, 2, 3, 4 ou 5 groupes choisis parmi F, Cl, Br, CO2H, C02 (alkyle en Ci-6) , CN, CF3 ou CC13. Quand R3 est un groupe alkyle en C1-12 ou cycloalkyle en C3-12, il est typiquement substitué par 1, 2 ou 3 groupes tels que définis ci-dessus. Quand R1 et R2 sont regroupés pour former un groupe hétérocyclique saturé en C3-12, cela signifie que R1 et R2 conjointement avec l'atome d'azote forment un groupe hétérocyclique saturé contenant un nombre quelconque d'atomes de carbone entre 3 et 12 (par exemple C3, C4, C5, Ce, C7, Ce,
Cg, Cio, Cu, C12) . Le groupe hétérocyclique peut contenir 1 ou 2 hétéroatomes (comme N, O ou S) autres que l'atome d'azote. Les exemples de groupes hétérocycliques saturés en C3-12 sont pyrrolidinyle, pipéridinyle, morpholinyle, pipérazinyle, imidazolidinyle, azétidinyle et aziridinyle.
Les groupes de blocage -O-X-Y et -OR3 peuvent être préparés à partir de groupes -OH par des procédures de dérivatisation standards, comme la réaction du groupe hydroxyle avec un halogénure d'acyle, halogénure d'alkyle, halogénure de sulfonyle, etc. Par conséquent, l'atome d'oxygène dans -O-X-Y est usuellement l'atome d'oxygène du groupe hydroxyle, alors que le groupe -X-Y dans -O-X-Y remplace usuellement l'atome d'hydrogène du groupe hydroxyle.
En variante, les groupes de blocage peuvent être accessibles via une réaction de substitution comme la substitution de type Mitsonobu. Ces procédés tout comme d'autres procédés de préparation des groupes de blocage à partir des groupes hydroxyles sont bien connus.
Les groupes de blocage spécifiques pour une utilisation dans l'invention sont -0C(0)CF3 [59] et un groupe carbamate OC (0) NR1R2, où R1 et R2 sont choisis indépendamment entre les groupes alkyle en C1-6. Typiquement, R1 et R2 sont tous deux méthyle ce qui veut dire que le groupe de blocage est -0C(0)NMe2. Les groupes de blocage carbamate ont un effet stabilisateur sur la liaison glycosidique et peuvent être préparés dans des conditions douces.
Un groupe de blocage particulièrement préféré est -0C(0)CH3 [58]. La proportion de positions 4- et/ou 3 dans le saccharide modifié de sérogroupe A de N. meningitidis qui possède ce groupe de blocage peut varier. Par exemple, la proportion de positions 4 qui possèdent ces groupes de blocage peut être d'environ 0%, au moins 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou d'environ 100%, une proportion d'au moins 80% et d'environ 100% étant préférée. De manière similaire, la proportion de positions 3 qui possèdent des groupes de blocage peut être d'environ 0%, au moins 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou d'environ 100%, une proportion d'au moins 80% et d'environ 100% étant préférée. Typiquement, la proportion de positions 4 et 3 ayant ces groupes de blocage est environ identique à chaque position. En d'autres termes, le rapport des positions 4 qui possèdent des groupes de blocage sur les positions 3 qui ont des groupes de blocage est d'environ 1:1. Néanmoins, dans certains modes de réalisation, la proportion de positions 4 qui possèdent des groupes de blocage peut varier par rapport à la proportion de positions 3 qui ont des groupes de blocage. Par exemple, le rapport des positions 4 qui possèdent des groupes de blocage sur les positions 3 qui ont des groupes de blocage peut être de 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 ou 1:2. De manière similaire, le rapport des positions 3 qui possèdent des groupes de blocage sur les positions 4 qui ont des groupes de blocage peut être de 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 ou 1:2.
Les saccharides modifiés MenA typiques contiennent n motifs monosaccharide, où au moins h% des motifs monosaccharide n'ont pas de groupes -OH sur les deux positions 3 et 4. La valeur de h est 24 ou plus (par exemple 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ou 100) et est usuellement de 50 ou plus. Les groupes -OH absents sont des groupes de blocage tels que définis ci-dessus.
Les autres saccharides MenA modifiés typiques comprennent des motifs monosaccharide, dans lesquels au moins s des motifs monosaccharide n'ont pas de groupe -OH en position 3 et n'ont pas de groupe -OH en position 4. La valeur de s est d'au moins 1 (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, '9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90) . Les groupes -OH absents sont des groupes de blocage tels que définis ci-dessus.
Les saccharides MenA adéquatement modifiés pour une utilisation avec l'invention ont pour formule :
dans laquelle n est un entier de 1 à 100 (en particulier un entier de 5 à 25, usuellement de 15-25) ; T est de formule (A) ou (B) :
chaque groupe Z est choisi indépendamment parmi OH ou un groupe de blocage tel que défini ci-dessus ; et chaque groupe Q est choisi indépendamment parmi OH ou un groupe de blocage tel que défini ci-dessus ; Y est choisi parmi OH ou un groupe de blocage tel que défini ci-dessus ; E est H ou un groupe protecteur azoté ; et dans laquelle plus d'environ 7% (par exemple 8%, 9%, 10% ou plus) des groupes Q sont des groupes de blocage. Dans certains modes de réalisation, le groupe hydroxyle fixé au carbone 1 dans la formule (A) est remplacé par un groupe de blocage tel que défini ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, E dans la formule (B) est un lieur ou une molécule support de l'invention. Quand E est un lieur, le lieur peut être lié de manière covalente à une molécule support de l'invention.
Chacun des groupes Z n+2 peut être identique ou différent l'un de l'autre. De la même manière, chacun des groupes Q n+2 peut être identique ou différent l'un de l'autre. Tous les groupes Z peuvent être OH. En variante, au moins 10%, 20, 30%, 40%, 50% ou 60% des groupes Z peuvent être OAc. Typiquement, environ 70% des groupes Z sont OAc, le restant des groupes Z étant OH ou des groupes de blocage tels que définis ci-dessus. Au moins environ 7% des groupes Q sont des groupes de blocage. Typiquement, au moins 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou même 100% des groupes Q sont des groupes de blocage.
Glucanes
Le saccharide peut être un glucane. Les glucanes sont des polysaccharides contenant du glucose qui se trouvent entre autres dans les parois cellulaires fongiques. Les a-glucanes comprennent une ou plusieurs liaisons a entre les sous-motifs de glucose, alors que les ß-glucanes comprennent une ou plusieurs liaisons ß entre les sous-motifs de glucose. Le glucane utilisé selon l'invention comprend des liaisons ß, et peut contenir seulement des liaisons ß (c'est-à-dire des liaisons a).
Le glucane peut comprendre une ou plusieurs liaisons ß-1,3 et/ou une ou plusieurs liaisons ß-1,6. Il peut aussi comprendre une ou plusieurs liaisons ß-1,2 et/ou liaisons ß-1,4, mais normalement ses seules liaisons ß seront des liaisons ß-1,3 et/ou des liaisons ß-1,6. Le glucane peut être ramifié ou linéaire.
Les ß-glucanes natifs de longueur entière sont insolubles et ont un poids moléculaire dans la plage du mégadalton. On préfère utiliser des glucanes solubles dans des conjugués de l'invention. La solubilisation peut être réalisée par fragmentation des glucanes longs insolubles. On peut y parvenir par hydrolyse ou, plus adéquatement, par digestion avec une glucanase (par exemple avec une ß-Ι,3-glucanase ou une ß-Ι,6-glucanase). En variante, les glucanes courts peuvent être préparés par la voie de la synthèse par regroupement des blocs constituants monosaccharide.
Les glucanes de faible poids moléculaire sont préférés, en particulier ceux ayant un poids moléculaire inférieur à 100 kDa (par exemple inférieur à 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, ou 15 kDa). Il est aussi possible d'utiliser des oligosaccharides contenant par exemple 60 motifs de glucose monosaccharide ou moins (par exemple 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4) . Dans cette plage, les oligosaccharides ayant entre 10 et 50 ou entre 20 et 40 motifs monosaccharides sont préférés.
Le glucane peut être un glucane fongique. Un 'glucane fongique' sera en général obtenu à partir d'un champignon, mais quand une structure de glucane particulière se trouve à la fois dans les champignons et les non champignons (par exemple dans les bactéries, les plantes inférieures ou les algues) alors l'organisme non fongique peut être utilisé comme source alternative. Ainsi, le glucane peut être dérivé de parois cellulaires d'une Candida, comme C. albicans, ou de Coccidioides immitis, Trichophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis, ou Pythiumn insidiosum.
Il existe diverses sources de ß-glucanes fongiques. Par exemple, les ß-glucanes purs sont vendus dans le commerce, par exemple le pustulane (Calbiochem) est un ß-1,6-glucane purifié à partir de Umbilicaria papullosa. Les ß-glucanes peuvent être purifiés à partir de parois cellulaires fongiques de différentes manières. La référence 60, par exemple, expose une procédure en deux étapes pour la préparation d'un extrait de ß-glucane hydrosoluble provenant de Candida, exempt de mannane de paroi cellulaire, impliquant l'oxydation par NaCIO et l'extraction au DMSO. Le produit résultant ( 'ß-D-glucane soluble de Candida' ou 'CSBG') est principalement constitué d'un ß-1,3-glucane linéaire avec une fraction de ß-1,6-glucane linéaire. De manière similaire, la référence 61 expose la production de GG-zyme à partir de C. albicans. Ces glucanes provenant de C. Albicans comprennent (a) des ß-1,6-glucanes ayant des chaînes latérales de ß-1,3-glucane et un degré moyen de polymérisation d'environ 30, et (b) des ß-1,3-glucanes avec des chaînes latérales de ß-1,6-glucane et un degré moyen de polymérisation d'environ 4.
Dans certains modes de réalisation de l'invention, le glucane est un ß-1,3 glucane avec certaines ramifications ß-1,6, comme on peut le voir par exemple dans les laminarines. Les laminarines se trouvent dans les algues brunes et le varech. Les rapports ß (1-3) :ß(1-6) des laminarines varient entre les différentes sources par exemple, il est à un niveau faible à 3:2 dans la laminarine de Eisenia bicyclis, mais élevé à 7:1 dans la laminarine de Laminaria digititata [62]. Ainsi, le glucane utilisé avec l'invention peut avoir un rapport ß(1-3):ß(1-6) situé entre 1.5:1 et 7.5:1 par exemple environ 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 ou 7:1. Eventuellement, le glucane peut avoir un sous-motif terminal de mannitol, par exemple un résidu de mannitol lié en 1,1-a [63]. Le glucane peut aussi comprendre des sous-motifs de mannose.
Dans d'autres modes de réalisation, le glucage a exclusivement ou principalement des liaisons ß-1,3, comme on le voit dans le curdlane. Ces glucanes peuvent déclencher une meilleure protection que les glucanes comprenant d'autres liaisons, en particulier des glucanes comprenant des liaisons ß-1,3 et une plus grande proportion de liaisons ß-1,6. Ainsi, le glucane peut être constitué uniquement de résidus de glucose liés en ß-1,3 (par exemple des ß-D-glucopyranoses linéaires avec exclusivement des liaisons 1,3). Eventuellement, par conséquent, le glucane peut comprendre des résidus de monosaccharide qui ne sont pas des résidus de glucose liés en ß-1,3, par exemple, il peut inclure des résidus de glucose liés en ß-1,6. Le rapport des résidus de glucose liés en ß-1,3 sur ces autres résidus devrait être d'au moins 8:1 (par exemple >9:1, >10:1, >11:1, >12:1, >13:1, >14:1, >15:1, >16:1, >17:1, >18:1, >19:1, >20:1, >25:1, >30:1, >35:1, >40:1, >45:1, >50:1, >75:1, >100:1, etc.) et/ou il y a une ou plusieurs (par exemple >1, >2, >3, >4, >5, >6, >7, >8, >9, >10, >11, >12, etc.) séquences d'au moins cinq (par exemple >5, >6, >7, >8, >9, >10, >11, >12, >13, >14, >15, >16, >17, >18, >19, >20, >30, >40, >50, >60, etc.) résidus non terminaux adjacents liés aux autres résidus seulement par des liaisons ß-1,3. Par « non terminaux », on veut dire que le résidu n'est pas présent à une extrémité libre du glucane.
Dans certains modes de réalisation, les résidus non terminaux adjacents peuvent ne pas inclure des · résidus quelconques couplés à une molécule support, un lieur ou un autre écarteur, comme décrit ci-dessous. La présence de cinq résidus non terminaux adjacents liés à d'autres résidus seulement par des liaisons ß-1,3 peut fournir une réponse d'anticorps protectrice, par exemple contre C. albicans.
Dans d'autres modes de réalisation, un conjugué peut inclure deux glucanes différents, par exemple un premier glucane ayant un rapport ß(1-3):ß (1-6) situé entre 1,5:1 et 7,5:1, et un second glucane ayant exclusivement ou principalement des liaisons ß-1,3. Par exemple, un conjugué peut comprendre à la fois un glucane de laminarine et un glucane de curdlane.
Quand un ß-glucane comprend à la fois des liaisons ß-1,3 et ß-1,6 en un rapport désiré et/ou sa séquence, alors ce glucane peut se trouver à l'état naturel (par exemple une laminarine), ou il peut être fabriqué artificiellement. Par exemple, il peut être fabriqué par synthèse chimique, en tout ou en partie. Les procédés pour la synthèse chimique des ß-1,3/ß-l,6-glucanes sont connus, par exemple les références 64-74. Le ß-glucane comprenant à la fois les liaisons ß-1,3 et ß-1,6 en un rapport désiré peut être aussi fabriqué en partant d'un glucane disponible et en le traitant avec une ß-1,6-glucanase (connue également sous le nom de glucane endo-l,6-ß-glucosidase, 1, 6-ß-D-glucane glucanohydrolase, etc. ; EC 3.2.1.75) ou une ß-Ι,3-glucanase (comme une exo-1,3-glucanase (EC 3.2.1.58) ou une endo-1,3-glucanase (EC 3.2.1.39) jusqu'à obtention d'un rapport désiré et/ou d'une séquence désirée.
Quand un glucane contenant uniquement un glucose lié en ß-1,3 est souhaité, alors le traitement avec le ß-1,6-glucanase peut être poursuivi jusqu'à son terme, puisque la ß-1,6-glucanase donnera éventuellement du ß-1,3 glucane pur.
Plus adéquatement, cependant, un ß-1,3-glucane pur peut être utilisé. Ceux-ci peuvent être fabriqués par synthèse, par synthèse chimique et/ou enzymatique par exemple en utilisant une (l-*3) -ß-D-glucane synthase, parmi lesquelles plusieurs sont connues grâce à de nombreux organismes (y compris des bactéries, des levures, des plantes et des champignons). Les procédés de synthèse chimique des ß-1,3 glucanes sont connus, par exemple grâce aux références 75-78. Comme alternative utile à la synthèse, une ß-1,3-glucane naturelle peut être utilisée, comme le curdlane (ß-1,3-glucane linéaire provenant d'une Agrobacterium connue auparavant sous le nom de Alcaligenes faecalis var. myxogenes ; vendu dans le commerce par exemple dans le catalogue Sigma-Aldrich sous le n° C7821) ou paramylon (ß-1,3-glucane provenant d' Euglena) . Les organismes produisant des taux élevés de ß-1,3-glucanes sont connus dans l'art, par exemple 1'Agrobacterium des références 79 & 80, ou 1'Euglena gracilis de la référence 81.
La laminarine et le curdlane se trouvent typiquement à l'état naturel en tant que polymères de poids moléculaire élevé, par exemple avec un poids moléculaire d'au moins 100 kDa. Ils sont souvent insolubles en milieux aqueux. Sous leurs formes naturelles, par conséquent, ils ne sont pas bien appropriés à l'immunisation. Ainsi, l'invention peut utiliser un glucane plus court, par exemple contenant 60 motifs de glucose monosaccharide ou moins (par exemple 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4). Un glucane ayant un certain nombre de résidus de glucose dans la plage de 2-60 peut être utilisé, par exemple entre 10-50 ou entre 20-40 motifs de glucose. Un glucane ayant 25-30 résidus de glucose est particulièrement utile. Les glucanes appropriés peuvent être formés par exemple par hydrolyse acide d'un glucane naturel, ou par digestion enzymatique, par exemple avec une glucanase, comme une ß-1,3-glucanase. Un glucane ayant 11-19, par exemple 13-19 et en particulier 15 ou 17, motifs de glucose monosaccharide est aussi utile. En particulier, les glucanes ayant les structures (A) ou (B) suivantes sont spécifiquement envisagés pour une utilisation dans la présente invention : (A)
dans laquelle n+2 est situé dans la plage de 2-60, par exemple entre 10-50 ou entre 2-40. De préférence, n+2 est situé dans la plage de 25-30 ou 11-19, par exemple 13-17. Les inventeurs ont découvert que n+2 = 15 est approprié. (B)
dans laquelle n est situé dans la plage de 0-9, par exemple entre 1-7 ou entre 2-6, de préférence, situé dans la plage de 3-4 ou 1-3. Les inventeurs ont découvert que n = 2 est approprié.
Dans certains modes de réalisation, le glucane est une espèce moléculaire unique. Dans ces modes de réalisation, la totalité des molécules de glucane est identique en termes de séquence. Par conséquent, la totalité des molécules de glucane est identique en termes de propriétés structurelles, y compris poids moléculaire, etc. Typiquement, cette forme de glucane est obtenue par synthèse chimique, par exemple en utilisant les procédés décrits ci-dessus. Par exemple, la référence 7 6 décrit la synthèse d'une unique espèce liée en ß-1,3. En variante, dans d'autres modes de réalisation, le glucane peut être obtenu à' partir d'un glucane naturel, par exemple un glucane de Laminaria digitata, d'Agrobacterium ou d'Euglena comme décrit ci-dessus, le glucane étant purifié jusqu'à ce que l'unique espèce moléculaire requise soit obtenue. Les glucanes qui ont été purifiés de cette manière sont disponibles dans le commerce. Un glucane qui est une unique espèce moléculaire peut être identifiée en mesurant la polydispersité (Mw/Mn) de l'échantillon de glucane. Ce paramètre peut être adéquatement mesuré par SEC-MALLS, par exemple, comme décrit dans la référence 82. Les glucanes appropriés pour une utilisation dans ce mode de réalisation de l'invention ont une polydispersité d'environ 1, par exemple de 1,01 ou moins. La solubilité des glucanes naturels, comme le curdlane, peut être augmentée en introduisant des groupes ioniques (par exemple par sulfatation, en particulier en 0-6 dans le curdlane). Ces modifications peuvent être utilisées dans l'invention, mais sont idéalement évitées car elles peuvent modifier l'antigénicité du glucane. Quand le saccharide est un glucane, c'est typiquement une laminarine.
Saccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae
Comme cela est exposé ci-dessus, le saccharide peut être aussi un saccharide capsulaire bactérien. D'autres exemples de saccharides capsulaires bactériens comprennent ceux provenant de Streptococcus pneumoniae.
Quand le saccharide est un saccharide capsulaire de S. pneumoniae, il provient typiquement d'un des sérotypes pneumococciques suivants : 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F, de préférence de 1, 5, 6B, 14, 19F et 23F. Les polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae comprennent des motifs répétitifs d'oligosaccharide qui peuvent contenir jusqu'à 8 résidus de sucre. Les motifs oligosaccharides pour les sérotypes principaux de S. pneumoniae sont décrits dans les références 83 et 84.
Saccharides capsulaires de Staphylococcus aureus D'autres exemples de saccharides capsulaires bactériens comprennent ceux provenant de Staphylococcus aureus, en particulier les polysaccharides capsulaires de S. aureus de type 5 et de type 8. Les structures des polysaccharides capsulaires de type 5 et de type 8 ont été décrites dans les références 85 et 86 as:
Type 5 : —> 4)-ß-D-ManNAcA(30Ac)-(l —» 4)-a-L-FucNAc(l —> 3)-ß-D-FucNAc-( 1 —» Type 8 : —> 3)-ß-D-ManNAcA(40Ac)-(l —> 3)-a-L-FucNAc(l —> 3)-ß-D-FucNAc-(l —>
Des données récentes de la spectroscopie RMN [87] ont conduit à une révision de ces structures en :
Type 5 : —» 4)-ß-D-ManNAcA-(l —> 4)-a-L-FucNAc(30Ac)-(l —> 3)-ß-D-FucNAc-(l —» Type 8 : -» 3)-ß-D-ManNAcA(40Ac)-(l —► 3)-a-L-FucNAc(l —> 3)-a-D-FucNAc(l —>
Le polysaccharide peut être chimiquement modifié par rapport au polysaccharide capsulaire tel qu'il se trouve à l'état naturel.
Par exemple, le polysaccharide peut être dés-O-acétylé (partiellement ou entièrement), dés-N-acétylé (partiellement ou entièrement), JV-propionaté (partiellement ou entièrement), etc. La dés-acétylation peut se produire avant, pendant ou après la conjugaison, mais typiquement avant la conjugaison. En fonction du polysaccharide particulier, la dés-acétylation peut affecter ou ne pas affecter l'immunogénicité, par exemple le vaccin NeisVac-C™ utilise un polysaccharide dés-O-acétylé alors que Menjugate™ est acétylé, mais les deux vaccins sont efficaces. L'effet de la dés-acétylation etc. peut être apprécié par des essais de routine. Par exemple, la pertinence de la O-acétylation sur les polysaccharides capsulaires de S. aureus type 5 ou type 8 est exposée dans la référence 88. Les polysaccharides natifs sont dits avoir dans le présent document 75% d'O-acétylation. Ces polysaccharides ont induit des anticorps envers à la fois le squelette de polysaccharide et les groupes O-acétyle. Les polysaccharides avec 0% de 0-acétylation ont continué à susciter des anticorps dirigés contre le squelette de polysaccharide. Les deux types d'anticorps ont été opsoniques vis-à-vis des souches de S. aureus dont la teneur en O-acétyle a varié. Par conséquent, les polysaccharides capsulaires de type 5 ou de type 8 utilisés dans la présente invention peuvent avoir entre 0 et 100% de O-acétylation.
Le degré de O-acétylation du polysaccharide peut être déterminé par tout procédé connu dans l'art, par exemple par RMN protonique (par exemple comme décrit dans les références 89, 90, 91 ou 92) . Un autre procédé est décrit dans la référence 93. Des procédés similaires peuvent être utilisés pour déterminer le degré de N-acétylation du polysaccharide. Les groupes O-acétyle peut être éliminés par hydrolyse, par exemple par traitement avec une base comme l'hydrazine anhydre [94] ou NaOH [88]. Des procédés similaires peuvent être utilisés pour enlever les groupes i\7-acétyle. Pour maintenir des degrés élevés de O-acétylation sur les polysaccharides capsulaires de type 5 et/ou 8, les traitements provoquant l'hydrolyse des groupes O-acétyle sont réduits, par exemple les traitements à des pH extrêmes.
Les polysaccharides capsulaires peuvent être purifiés par des techniques connues, comme décrites dans les références du présent document. Un procédé typique implique l'inactivation au phénol-éthanol des cellules de S. aureus, la centrifugation, le traitement à la lysostaphine, le traitement à la RNase/DNase, la centrifugation, la dialyse, le traitement par protéase, la dialyse consécutive, la filtration, la précipitation avec éthanol/CaCl2, la dialyse, la lyophilisation, la chromatographie échangeuse d'anions, la dialyse, la lyophilisation, la chromatographie d'exclusion stérique, la dialyse et la lyophilisation [95]. Un procédé alternatif implique le placement en autoclave des cellules de S. aureus, l'ultrafiltration du surnageant contenant le polysaccharide, la concentration, la lyophilisation, le traitement au métapériodate de sodium pour enlever l'acide téichoïde, l'ultrafiltration consécutive, la diafiltration, la chromatographie liquide d'exclusion stérique haute performance, la dialyse et la lyophilisation [96]. L'invention n'est pas limitée néanmoins aux polysaccharides purifiés à partir de sources naturelles, et les polysaccharides peuvent être obtenus par d'autres procédés, comme la synthèse totale ou partielle.
Autres saccharides capsulaires bactériens D'autres exemples de saccharides capsulaires bactériens comprennent ceux provenant de Haemophilus influenzae de type b, Salmonella enterica Typhi Vi et Clostridium difficile.
Hydrate de carbone de Streptococcus pyogenes L'invention peut aussi utiliser des saccharides bactériens non capsulaires. Un exemple de saccharide bactérien non capsulaire est l'hydrate de carbone de Streptococcus pyogenes GAS (connu également sous le nom de polysaccharide de paroi cellulaire GAS ou GASP). Ce saccharide caractérise une structure ramifiée avec un squelette de L-rhamnopyranose (Rhap) se composant de liaisons alternées alpha- (l-»2) et alpha- ( 1—»3) et les résidus de D-N-acétylglucosamine (GlcpNAc) reliés en bêta-(l->3) à des cycles rhamnose alternés ([97]). L'hydrate de carbone GAS sera en général sous sa forme native, mais il peut avoir été modifié. Par exemple, le saccharide peut être plus court que l'hydrate de carbone GAS natif ou peut être chimiquement modifié.
Par conséquent, le saccharide utilisé selon l'invention peut être un hydrate de carbone GAS sensiblement de longueur entière, tel qu'il se trouve dans la nature, ou il peut être plus court que la longueur naturelle. Les polysaccharides de longueur entière peuvent être dépolymérisés pour donner des fragments plus courts pour une utilisation selon l'invention par exemple par hydrolyse dans de l'acide faible, par chauffage, par chromatographie stérique, etc. Un fragment court que l'on pensait correspondre au motif terminal sur l'hydrate de carbone GAS a été proposé pour une utilisation dans un dans un vaccin [98]. Par conséquent, de courts fragments sont considérés dans la présente invention. Néanmoins, on préfère utiliser des saccharides sensiblement de longueur entière. L'hydrate de carbone GAS a typiquement un poids moléculaire d'environ 10, en particulier d'environ 7,5-8,5 kDa. Les masses moléculaires peuvent être mesurées par HPLC, par exempmle SEC-HPLC en utilisant une colonne de gel TSR Gel G3000SW (Sigma) par rapport à des références pullulane, comme celles disponibles grâce au Polymer Standard Service [99], Le saccharide peut être chimiquement modifié par rapport à l'hydrate de carbone GAS que l'on trouve à l'état naturel. Par exemple, le saccharide peut être dés-iV-acétylé (partiellement ou entièrement), N-propionaté (partiellement ou entièrement), etc. L'effet de la dés-acétylation etc., par exemple sur l'immunogénicité, peut être évalué par des essais de routine.
Production des conjugués de saccharidé de type II et type V
Les saccharides capsulaires peuvent être purifiés par des techniques connues, par exemple comme décrit dans Wessels et al, (J Clin Invest, 1990 86:1428-33) ou Wessels et al. (Infect Immun 1989, 57:1089-94). Un procédé de purification typique implique l'extraction basique, la centrifugation, la filtration, le traitement à la RNase/DNase, le traitement par protéase, la concentration, la chromatographie d'exclusion stérique, l'ultrafiltration, la chromatographie échangeuse d'anions, et l'ultrafiltration consécutive. Le traitement des cellules GBS avec l'enzyme mutanolysine, qui clive la paroi des cellules bactériennes en composants de paroi cellulaire libres, est aussi utile.
En variante, le procédé de purification décrit dans le document W02006/082527 peut être utilisé. Celui-ci implique l'extraction basique, le traitement à 1'éthanol/CaCl2, la précipitation CTAB, et la resolubilisation. D'autres procédés d'extraction et de purification sont connus dans l'art,· comme ceux décrits dans le document WO 2009/081276.
Le conjugué L'invention concerne un conjugué comprenant un antigène et une molécule support, dans lequel la molécule support comprend un polypeptide spbl et au moins un polypeptide BP-2a. En particulier, une molécule support est une protéine de. fusion qui comprend un polypeptide spbl et au moins un polypeptide BP-2a, au moins deux polypeptides BP-2a, en particulier trois, quatre, cinq, six ou sept polypeptides BP-2a ou fragments de ceux-ci.
La molécule support peut être conjuguée de manière covalente à l'antigène directement ou par le biais d'un lieur. Une réaction de conjugaison appropriée peut être utilisée, avec un lieur approprié quelconque si désiré.
La liaison de l'antigène au support se fait de préférence par le biais d'un groupe -NH2, par exemple dans la chaîne latérale d'un résidu de lysine dans une protéine support, ou d'un résidu d'arginine. Quand l'antigène possède un groupe aldéhyde libre, celui-ci peut alors réagir avec une amine dans le support pour former un conjugué par amination réductrice. La fixation peut aussi se faire par le biais d'un groupe -SH par exemple dans la chaîne latérale d'un résidu cystéine. En variante, l'antigène peut être fixé au support par le biais d'une molécule liante. L'antigène sera typiquement activé ou fonctionnalisé avant la conjugaison. L'activation peut impliquer, par exemple des réactifs de cyanylation comme CDAP (par exemple le tétrafluoroborate de l-cyano-4-diméthylaminopyridinium [100, 101, etc.]). D'autres techniques appropriées utilisent les carbodiimides, les hydrazides, les esters actifs, le norborane, l'acide p-nitrobenzorque, le N-hydroxysuccinimide, S-NHS, EDC, TSTU (voir aussi l'introduction de la référence 7) .
Les liaisons directes à la protéine peuvent comprendre l'oxydation de l'antigène, suivie par l'amination réductrice avec la protéine, comme décrit par exemple dans les références 102 et 103.
Les liaisons par le biais d'un groupe lieur peut être effectué en utilisant n'importe quelle procédure connue, par exemple les procédures décrites dans les références 104 et 105. Typiquement, le lieur est fixé par le biais d'un carbone anomérique d'un antigène de saccharide. Un type préféré de liaison est un lieur acide adipique, lequel peut être formé en couplant un groupe -NH2 libre (par exemple introduit dans un saccharide par amination) avec de l'acide adipique (en utilisant par exemple l'activation diimide), et puis en couplant une protéine à l'intermédiaire antigène - acide adipique résultant [5, 106, 107]. Un type similaire préféré de liaison est un lieur acide glutarique, lequel peut être formé en couplant un groupe -NH2 libre avec de l'acide glutarique de la même manière. Les lieurs acide adipique et glutarique peuvent aussi être formés par couplage direct à l'antigène, c'est-à-dire sans introduction préalable d'un groupe libre, par exemple un groupe -NH2 libre, à l'antigène, suivi par le couplage d'une protéine à l'intermédiaire antigène - acide adipique/glutarique. Un autre type préféré de liaison est un lieur carbonyle, lequel peut être formé par réaction d'un groupe hydroxyle libre d'un antigène modifié avec CDI [108, 109] suivie par la réaction avec une protéine pour former une liaison carbamate. D'autres lieurs comprennent des liaisons ß-propionamido [110], nitrophényl-éthylamine [111], halogénures d'halogénoacyle [112], glycosidiques [113], acide 6-aminocaproïque [114], A7-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate (SPDP) [115], dihydrazide d'acide adipique ADH [116], fractions en C4 à Ci2 [117], etc. La condensation carbodiimide peut aussi être utilisée [118].
Un lieur bifunctionnel peut être utilisé pour donner un premier groupe destiné au couplage à un groupe amine dans l'antigène (par exemple introduit dans l'antigène par amination) et un second groupe pour le couplage au support (typiquement destiné au couplage à une amine dans le support). En variante, le premier groupe est capable de couplage direct à l'antigène, c'est-à-dire sans introduction préalable d'un groupe, par exemple d'un groupe amine, dans l'antigène.
Dans certains modes de réalisation, le premier groupe dans le lieur bifonctionnel est ainsi capable de réagir avec un groupe amine (-NH2) sur l'antigène. Cette réaction impliquera typiquement une substitution électrophile de l'hydrogène de l'amine. Dans d'autres modes de réalisation, le premier groupe dans le lieur bifonctionnel est capable de réagir directement avec l'antigène. Dans les deux groupes de modes de réalisation, le second group dans le lieur bifonctionnel est typiquement capable de réagir avec un groupe amine sur le support. Cette réaction impliquera de nouveau typiquement une substitutipn électrophile de l'amine.
Quand les réactions avec à la fois l'antigène et le support impliquent des amines, alors on préfère utiliser un lieur bifonctionnel. Par exemple, on peut utiliser un lieur homobifonctionnel de formule X-L-X dans lequel : les deux groupes X sont identiques entre eux et peuvent réagir avec les amines ; et dans lequel L est une fraction liante dans le lieur. De manière similaire, on peut utiliser un lieur hétérobifonctionnel de formule X-L-X dans lequel : les deux groupes X sont différents et peuvent réagir avec les amines ; et dans lequel L est une fraction liante dans le lieur. Un groupe X préféré est le N- oxysuccinimide. L possède de préférence la formule L'-L2-L', dans laquelle L' est carbonyle. Les groupes L2 préférés sont des alkyles à chaîne linéaire ayant de 1 à 10 atomes de carbone (par exemple Ci, C2, C3, Ct, C5, C6, C7, C8, C9, Cio) par exemple -(CH2)4- ou -(CH2)3-.
De manière similaire quand la réaction avec l'antigène implique le couplage direct et la réaction avec le support implique une amine, alors on préfère utiliser un lieur bifonctionnel. Par exemple, on peut utiliser un lieur homobifonctionnel de formule X-L-X dans lequel : les deux groupes X sont identiques entre eux et peuvent réagir avec 1'antigène/amine ; et dans lequel L est une fraction liante dans le lieur. De manière similaire, on peut utiliser un lieur hétérobifonctionnel de formule X-L-X dans lequel : les deux groupes X sont différents et un peut réagir avec l'antigène alors que l'autre peut réagir avec l'amine ; et dans lequel L est une fraction liante dans le lieur. Un groupe X préféré est le W-oxysuccinimide. L possède de préférence la formule L'-L2- L', dans laquelle L' est carbonyle. Les groupes L2 préférés sont des alkyles à chaîne linéaire ayant de 1 à 10 atomes de carbone (par exemple Ci, C2, C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, Cio) par exemple -(CH2)4- ou -(CH2)3-. D'autres groupes X pour une utilisation dans les lieurs bifonctionnels décrits dans les deux paragraphes précédents sont ceux qui forment des esters quand ils sont combinés à HO-L-OH, comme le norborane, l'acide p-nitrobenzoïque, et le suif o-iV-hydroxysuccinimide. D'autres lieurs bifonctionnels pour une utilisation avec l'invention comprennent les halogénures d'acryloyle (par exemple chlorure) et les halogénures d'halogénoacyle.
Le lieur sera en général ajouté en excédent molaire à l'antigène au cours du couplage à l'antigène.
Quand l'antigène possède un unique groupe qui est lié à la molécule support (éventuellement par le biais d'un lieur), et le lieur possède de multiples groupes qui sont liés à différentes molécules antigène/lieur, le conjugué résultant peut former une structure en « étoile ». Cette structure comprend une molécule support centrale avec de multiples molécules d'antigène irradiant depuis le support (éventuellement par le biais de lieurs). Quand l'antigène possède plus d'un groupe qui est lié à la molécule support (éventuellement par le biais d'un lieur), et le support possède plus d'un groupe qui est lié à différentes molécules antigène/lieur, le conjugué résultant peut former une structure en « filet ». Cette structure comprend un réseau de molécules supports raccordées par des molécules d'antigène (éventuellement par le biais de lieurs).
Les conjugués peuvent avoir un support excédentaire (w/w) ou un antigène excédentaire (w/w) , par exemple dans la plage des rapports de 1:5 à 5:1. Les conjugués ayant une protéine support excédentaire sont typiquement, par exemple, dans la plage de 0,2:1 à 0,9:1, ou des poids équivalents. Le conjugué peut comprendre de petites quantités de support libre (c'est-à-dire non conjugué). Quand une protéine support donnée est présente à la fois sous forme libre et conjuguée dans une composition de l'invention, la forme non conjuguée est présente à un taux qui n'est de préférence pas supérieur à 5% de la quantité totale de protéine support dans la composition totale, et plus préférentiellement présente à moins de 2% (en poids).
Quand le conjugué est compris dans une composition pharmaceutique de l'invention, la composition peut aussi comprendre une protéine support libre comme immunogène [119].
Après conjugaison, les antigènes libres et conjugués peuvent être séparés. Il existe de nombreux procédés appropriés par exemple chromatographie hydrophobe, ultrafiltration tangentielle, diafiltration, etc. [voir aussi les références 120, 121 etc.]. L'ultrafiltration à flux tangentiel est préférée.
Une fraction saccharide dans le conjugué est de préférence un saccharide de faible poids moléculaire ou un oligosaccharide, tel que défini ci-dessus. Les oligosaccharides seront typiquement coupés à la bonne taille avant la conjugaison.
Le conjugué est de préférence soluble dans l'eau et/ou dans un tampon physiologique.
Conjugaison L'invention concerne des conjugués qui sont des saccharides capsulaires provenant de GBS des sérotypes la, Ib, II, III et V, chacun conjugué à une protéine support. En général, la conjugaison covalente de saccharides à des supports améliore l'immunogénicité des saccharides puisqu'elle les convertit d'antigènes T-indépendants à des antigènes T-dépendants, permettant ainsi la primovaccination pour la mémoire immunologique. La conjugaison est particulièrement utile pour les vaccins pédiatriques et est une technique bien connue. La conjugaison des saccharides GBS a été largement rapportée, par exemple voir Paoletti et al. (1990) J Biol Chem 265 : 18278-83. Bien que les polysaccharides soient immunogéniques, la conjugaison des polysaccharides à des protéines supports peut améliorer ou renforcer l'immunogénicité. Par conséquent, tel qu'utilisé ici, le terme « support » désigne une substance immunogénique, qui, une fois conjuguée à un antigène (tel qu'un polysaccharide) et administrée à un animal approprié, induira ou renforcera une réponse immunitaire chez l'animal, en particulier une réponse immunitaire protectrice et déclenchera la production d'anticorps qui se lient spécifiquement à l'antigène, par exemple les polysaccharides décrits ci-dessus. Le procédé typique de l'art antérieur pour la conjugaison du saccharide GBS impliquera typiquement une amination réductrice d'un saccharide à une protéine support telle que le toxoïde du tétanos (TT) ou CRM197 Wessels et al. (1990) J Clin Invest 86:1428-33. L'amination réductrice implique un groupe amine sur la chaîne latérale d'un acide aminé dans le support et un groupe aldéhyde dans le saccharide. Puisque les saccharides capsulaires GBS ne comprennent pas de groupe aldéhyde sous leur forme naturelle, alors celui-ci sera typiquement généré avant la conjugaison par oxydation (par exemple oxydation au périodate) d'une portion (par exemple entre 5 et 40%, en particulier entre 10 et 30%, de préférence environ 20%) des résidus d'acide sialique des saccharides. Les vaccins conjugués préparés de cette manière se sont révélés être sûrs et immunogéniques chez les humains pour chacun des sérotypes de GBS Ia, Ib, II, III, et V, Paoletti & Kasper (2003) Expert Opin Biol Ther 3:975-84. Typiquement, tous les conjugués dans les compositions immunogéniques de la présente invention peuvent être préparés de cette manière. Cependant, quand l'invention utilise un saccharide capsulaire de sérotype V qui est désialylé, alors un groupe aldéhyde peut être généré dans ce saccharide avant la conjugaison par oxydation (par exemple oxydation au périodate) d'une portion ((par exemple entre 5 et 40%, en particulier entre 10 et 30%, de préférence environ 20%) des résidus de galactose des saccharides. Une variante de procédé de conjugaison concerne l'utilisation des groupes -NH2 dans le saccharide (soit provenant de la dés-N-acétylation, soit après introduction des amines) en conjugaison avec des lieurs bifonctionnels. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs des conjugués dans les compositions immunogéniques de la présente invention peut être préparé de cette manière. Dans une autre variante de procédé, on utilise des groupes aldéhyde libres de résidus terminaux 2,5-anhydro-D-mannose provenant de la dépolymérisation des saccharides capsulaires de type II ou type III par clivage désaminatif doux pour la conjugaison de l'amination réductrice. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs conjugués dans les compositions immunogéniques de la présente invention peuvent être préparés de cette manière. Dans certains modes de réalisation, le support et l'antigène peuvent être conjugués par ligation sortase-induite, comme décrit par exemple dans les documents W013065009 ou WO13003555.
Conjugaison protéine-protéine
Les conjugués de l'invention peuvent comprendre l'utilisation de la conjugaison protéine-protéine et peuvent comprendre des protéines conjuguées à des protéines. En particulier, le polypeptide BP-2a peut être conjugué au polypeptide spbl. En variante ou en plus, la molécule de protéine support de l'invention peut être conjuguée à un antigène de protéine. Un procédé approprié quelconque peut être utilisé pour générer un conjugué de l'invention. Par exemple, des procédés appropriés sont décrits en détails ci-après .
Les liaisons protéine-protéine dans les conjugués de l'invention peuvent être générées en utilisant toute technique appropriée et l'homme du métier connaîtra de telles techniques appropriées. Les exemples d'agents réticulants appropriés comprennent la protéine A, le carbodiimide, le thioacétate de 2\7-succinimidyl-S-acétyle (SATA) , l'acide 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoïque) (DTNB), le o-phénylènedimaléimide (oPDM), le N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), et le 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-l-carboxylate de suifosuccinimidyle (sulfo-SMCC) (voir par exemple [122,123]). D'autres procédés comprennent ceux décrits dans les références 124, 125 et 126. Les agents de conjugaison préférés sont SATA et sulfo-SMCC, tous deux disponibles chez Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .
Les conjugués supports peptide-protéine peuvent aussi être formés en utilisant des agents réticulants usuels comme les carbodimides. Les exemples de carbodimides sont le 1 -cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-éthyl) carbodiimide (CMC), le 1 -éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et le 1 -éthyl-3-(4-azonia-44-diméthylpentyl) carbodiimide. Les exemples d'autres agents réticulants appropriés sont le bromure de cyanogène, le glutaraldéhyde et l'anhydride succinique. En général, n'importe quel nombre d'agents homo-bifonctionnels y compris un aldéhyde homo-bifonctionnel, un époxyde homo-bifonctionnel, un imido-ester homo-bifonctionnel, un ester de i\7-hydroxysuccinimide homo-bifonctionnel, un maléimide homo-bifonctionnel, un halogénure d'alkyle homo-bifonctionnel, un disulfure de pyridyle homo-bifonctionnel, un halogénure d'aryle homo-bifonctionnel, un hydrazide homo-bifonctionnel, un dérivé de diazonium homo-bifonctionnel et un composé photoréactif homo-bifonctionnel peuvent être utilisés. Ceci inclut également des composés hétéro-bifonctionnels par exemple des composés ayant un groupe amine-réactif et un groupe sulfhydryle-réactif, des composés ayant un groupe amine-réactive et un groupe photoréactif et des composés ayant un groupe carbonyle-réactif et un groupe sulfhydryle-réactif.
Les exemples spécifiques de ces agents réticulants homo-bifonctionnels comprennent les esters bifonctionnels de N-hydroxysuccinimide dithiobis(succinimidylpropionate) , subérate de disuccinimidyle, et tartrate disuccinimidyle ; les imido-esters bifonctionnels diméthyladipimidate, diméthyl-pimélimidate, et diméthylsubérimidate ; les réticulants sulfhydryle-réactifs 1,4-di-[3'-(2'-pyridyldithio)propion-amido]butane, bismaléimidohexane, et bis-N-maléimido-1,8-octane ; les halogénures d'aryle bifonctionnels 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène et 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrophényl-sulfone ; les agents photoréactifs bifonctionnels comme le bis-[ß-(4-azidosalicylamido)éthyl]-disulfure ; les aldéhydes bifonctionnels formaldéhyde, malonedialdéhyde, succinaldéhyde, glutaraldéhyde, ,et adipaldéhyde ; un époxyde bifonctionnel comme le 1,4-butanéodiol diglycidyl éther ; les hydrazides bifonctionnels dihydrazide d'acide adipique, carbohydrazide, et dihydrazide d'acide succinique ; les diazoniums bifonctionnels o-tolidine, benzidine diazotée et bis-diazotée ; les halogénures d'alkyle bifonctionnels Νχ,Ν'-éthylène-bis(iodoacétamide), NirN’-hexaméthylène-bis(iodo-acétamide) , Ni, N' -undécaméthylène-jbis (iodoacétamide) , ainsi que les halogénures de benzyle et les halogénomoutardes, comme l'acide al,a'-diiodo-p-xylène sulfonique et la tri (2-chloroéthyl)amine, respectivement.
Les exemples d'agents réticulants hétéro-bifonctionnels communs pouvant être utilisés pour effectuer la conjugaison
des protéines aux peptides comprennent, mais sans y être limités, SMCC (succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1 -carboxylate), MBS (m-maléimidobenzoyl-W-hydroxysuccinimide ester), SIAB (JV-succinimidyl (4-iodoacétyl) aminobenzoate) , SMPB (succinimidyl-4-(p-maléimidophényl)butyrate), GMBS (ester de N-(γ-maléimidobutyryloxy)succinimide), MPBH (hydrazide d'acide 4-(4-Ji-maléimidopohényl)butyrique) , M2C2H (hydrazide de 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-l-carboxyle), SMPT (succinimidyloxycarbonyl-Qi-méthyl-cx-(2-pyridyldithio)toluène), •et SPDP (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate). La réticulation peut être effectuée en couplant un groupe carbonyle à un groupe amine ou à un groupe hydrazide par amination réductrice.
Production et conjugaison de molécules supports modifiées pour incorporer des acides aminés non naturels.
Quand un ou plusieurs résidus d'acide aminé non naturels doivent être incorporés dans la molécule support, alors ceci peut être fait en utilisant des procédures standards. Un tel procédé comprend l'utilisation de cellules hôtes modifiées dans lesquelles l'aminoacyle ARNt synthétase pour un codon spécifique a été manipulée pour conjuguer l'ARNt à un acide aminé non naturel, qui est ensuite incorporé dans le support au cours de la traduction [voir la référence 127 pour une étude de ces techniques]. En variante, certaines procédures exploitent le fait que certains acides aminés non naturels soient incorporés dans les protéines par un mécanisme cellulaire natif quand l'acide aminé naturel cognate n'est pas présent. Un exemple de ce second type de procédure est observé dans l'incorporation de HAG. Quand l'acide aminé non naturel est HAG, alors la conjugaison thiyl-ène est utilisée [voir par exemple la référence 128]. Mélanges comprenant les conjugués
Les conjugués de l'invention peuvent être mélangés avec d'autres antigènes. Ces autres antigènes peuvent être d'autres conjugués de l'invention ou d'autres antigènes.
Par exemple, des mélanges de conjugués sont considérés. Usuellement, les mélanges de conjugués seront fournis sous forme de compositions pharmaceutiques. Au moins un des conjugués dans ces mélanges est un conjugué de l'invention, ce qui veut dire que la molécule support comprend un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl. Le ou les autres conjugués dans ces mélanges peuvent être aussi des conjugués de l'invention. Cependant quand le ou les autres conjugués ne sont pas des conjugués de l'invention, la molécule support peut être toute protéine support appropriée (comme décrit ci-dessous).
Dans des modes de réalisation préférés, les conjugués de l'invention sont mélangés avec des conjugués comprenant des molécules supports qui ne comprennent pas de polypeptides BP-2a et de polypeptides spbl. Par exemple, dans des modes de réalisation particuliers, les conjugués de l'invention sont mélangés avec des conjugués comprenant CRM197 comme molécule support. Les exemples montrent que les molécules supports comprenant un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl peuvent être particulièrement efficaces quand elles sont combinées à d'autres conjugués comprenant CRM197. De manière similaire, dans des modes de réalisation particuliers, les conjugués de l'invention peuvent être mélangés avec des conjugués comprenant GBS80 comme molécule support. Les exemples montrent que les molécules supports comprenant un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl peuvent être particulièrement efficaces quand elles sont combinées à d'autres conjugués comprenant GBS80. Dans des modes de réalisation particulièrement préférés, les conjugués de l'invention sont mélangés avec des conjugués comprenant GBS80 et des conjugués comprenant CRM197.
Quand les conjugués de l'invention sont mélangés avec d'autres conjugués, les autres conjugués comprennent de préférence des antigènes provenant du même pathogène que l'antigène dans le conjugué de l'invention. Par exemple, on considère des mélanges comprenant un premier antigène, comme un antigène de saccharide, provenant d'un pathogène conjugué à un support comprenant un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl, et un second antigène provenant du même pathogène conjugué à une autre molécule support (et éventuellement un troisième antigène provenant du même pathogène, et un quatrième, etc.). Le second antigène peut être dérivé d'un sérotype différent. De cette manière, il peut être possible d'induire une réponse immunitaire large spécifique pour de nombreux antigènes différents, en faisant usage des propriétés avantageuses de la molécule support de l'invention.
Par exemple, dans des modes de réalisation préférés, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un mélange de conjugués, dans lequel au moins un conjugué comprend un support contenant un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl, ledit mélange comprenant plus d'un saccharide capsulaire dérivé des sérogroupes Ia, Ib, II, III, V de Streptococcus agalactiae. Dans des modes de réalisation préférés, le mélange comprend 4, ou tous ces 5 saccharides. Dans des modes de réalisation particuliers, c'est le saccharide de sérotype-V voire même plus particulièrement, le saccharide de sérotype II qui est conjugué au support BP-2a et spbl de l'invention.
Dans d'autres modes de réalisation, l'invention concerne une composition immunogénique comprenant : (a) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype la de GBS conjugué à une première protéine support ; (b) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype Ib de GBS conjugué à une deuxième protéine support (c) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype III de GBS conjugué à une troisième protéine support ; (d) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype II de GBS conjugué à une quatrième protéine support ; et (e) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype V de GBS conjugué à une cinquième protéine support, dans laquelle au moins une des première, deuxième, troisième, quatrième ou cinquième protéines est un support BP-2a et spbl de l'invention.
Dans certains modes de réalisation, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant des saccharides la, Ib et III de S. agalactiae conjugués à CRM197, un saccharide du sérotype V de S. agalactiae conjugué à GBS80, et un saccharide du sérotype II de S. agalactiae conjugué au support BP-2a et spbl de l'invention. En variante, le saccharide de sérotype II peut être conjugué à GBS80, et le saccharide de sérotype V peut être conjugué au support BP-2a et spbl de 1'invention.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant : (a) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype la de GBS conjugué à une première protéine support ; (b) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype Ib de GBS conjugué à une deuxième protéine support (c) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype III de GBS conjugué à une troisième protéine support, dans laquelle les première, deuxième et troisième protéines sont choisies dans le groupe constitué par le toxoi’de du tétanos (TT) , le toxoïde de la diphtérie (DT) , GBS80, GBS67 et CRM197 ; et, (d) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype II de GBS conjugué à une quatrième protéine support, et (e) un conjugué qui est un saccharide capsulaire provenant du sérotype V de GBS conjugué à une cinquième protéine support, dans laquelle au moins une des quatrième ou cinquième protéines supports est choisie dans le groupe constitué par le toxoide du tétanos (TT), le toxoïde de la diphtérie (DT) , GBS67, CRM197 et GBS80, et l'autre des quatrième ou cinquième protéines supports comprend une fusion de (i) au moins une séquence du sous-fragment de D3 choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 38, SEQ ID N° : 42, SEQ ID N° : 40, SEQ ID N° : 36, SEQ ID N° : 44 et SEQ ID N° : 46 et (ii) un fragment de D2+D3 du polypeptide spbl comprenant ou se composant des acides aminés 185 à 468 de la SEQ ID N° : 206.
Dans des variantes de modes de réalisation, des mélanges de conjugués provenant de plus d'un sérogroupe de Neisseria meningitidis sont considérés, par exemple des compositions comprenant des saccharides provenant des sérogroupes A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y, etc. Typiquement, le mélange est un mélange de conjugués comprenant des saccharides provenant des sérogroupes A, C, W135 et Y. Au moins un des conjugués dans ces mélanges est un conjugué de l'invention, ce qui veut dire que la molécule support comprend un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl. Typiquement, le ou les autres conjugués dans ces mélanges seront aussi des conjugués de l'invention. Cependant, quand l'autre ou les autres conjugués ne sont pas des conjugués de l'invention, la molécule support peut être toute protéine support appropriée (comme décrit ci-dessous), typiquement la même protéine support dans chaque conjugué.
Les protéines supports appropriées sont des toxines bactériennes, comme les toxines de la diphtérie ou du tétanos, ou des toxoides ou des mutants de ceux-ci. Le mutant de la toxine de la diphtérie CRM197 [129] peut être approprié. Les autres protéines supports appropriées comprennent le complexe de protéine membranaire externe de N. meningitidis [130], les peptides synthétiques [131,132], les protéines de choc thermique [133,134], les protéines de pertussis [135,136], les cytokines [137], les lymphokines [137], les hormones [137], les facteurs de croissance [137], l'albumine sérique humaine (typiquement recombinante), les protéines artificielles comprenant de multiples épitopes de lymphotyctes T CD4+ humains provenant d'antigènes dérivés de divers pathogènes [20] comme N19 [138], la protéine D de Haemophilus influenzae [139-141], la protéine de surface pneumococcique PspA [142], la pneumolysine [143] ou ses dérivés non toxiques [144], les protéines d'absorption du fer [145], la toxine A ou B de Clostridium difficile [146], une protéine de GBS [147], une protéine GAS [148] etc.
Une unique protéine support pourrait porter plus d'un antigène de polysaccharide [149,150]. Pour y parvenir, différents saccharides peuvent être mélangés avant le procédé de conjugaison. Typiquement, cependant, il existe des conjugués séparés pour chaque saccharide, les différents saccharides étant mélangés après conjugaison. Les conjugués séparés peuvent être basés sur le même support, en particulier le même support comprenant un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl.
Les mélanges peuvent aussi comprendre des protéines. Par exemple, les mélanges peuvent comprendre S. agalactiae ou ses protéines [par exemple 147, 151-153]
Le ou les autres antigènes peuvent comprendre des antigènes provenant de pathogènes non S. agalactiae. Ainsi, les compositions de l'invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs antigènes non S. agalactiae, y compris des antigènes bactériens, viraux ou parasitaires additionnels. Ceux-ci peuvent être choisis parmi les suivants : - un antigène de saccharide provenant de Streptococcus pneumoniae [par exemple références 154-156; chapitres 22 & 23 de la réf. 163]. - un antigène provenant du virus de l'hépatite A, comme un virus inactivé [par exemple 157, 158 ; chapitre 15 de la réf. 163]. - un antigène provenant du virus de l'hépatite B, comme les antigènes de surface et/ou de noyau [par exemple 158, 159 ; chapitre 16 de la réf. 163]. - un antigène provenant du virus de l'hépatite C [par exemple 160] . - un antigène provenant de Bordetella pertussis, comme l'holotoxine de pertussis (PT) et 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA) de B. pertussis, éventuellement aussi en combinaison avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3 [par exemple références 161 & 162; chapitre 21 de la réf. 163] . - un antigène de la diphtérie, comme un toxoïde de la diphtérie [par exemple chapitre 13 de la réf. 163]. - un antigène du tétanos, comme un toxoïde du tétanos [par exemple chapitre 27 de la réf. 163] . - un antigène de saccharide provenant de H. influenzae B [par exemple chapitre 14 de la réf. 163] . - un antigène de protéine provenant du sérogroupe B de N. meningitidis [par exemple références 164 à 169]. - un antigène de Neisseria gonorrhoeae [par exemple 164-167]. - un antigène de Chlamydia pneumoniae [par exemple 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176]. - un antigène de Chlamydia trachomatis [par exemple 177]. - un antigène de Porphyromonas gingivalis [par exemple 178]. - un ou les antigènes de la polio [par exemple 179, 180 ; chapitre 24 de la réf. 163] comme l'IPV. - un ou les antigènes de lapin [par exemple 181] comme le virus inactivé lyophilisé [par exemple 182, RabAvert™]. - les antigènes des oreillons, de la rougeole et/ou de la rubéole [par exemple chapitres 19, 20 et 26 de la réf. 163]. - un ou les antigènes de la grippe [par exemple chapitres 17 & 18 de la réf. 163], comme 1'hémagglutinine et/ou les protéines de surface neuraminidase. - un antigène de Moraxella catarrhalis [par exemple 183]. - un antigène de Streptococcus pyogenes (streptoccocque du groupe A) [par exemple 184, 185, 186] . - un antigène de Staphylococcus epidermidis [par exemple polysaccharide caspulaire de type I, II et/ou III pouvant être obtenu à partir des souches ATCC-31432, SE-360 et SE-10 comme décrit dans les réf. 187, 188 et 189].
Quand un antigène de saccharide ou d'hydrate de carbone est utilisé, il est typiquement conjugué à un support afin de renforcer l'immunogénicité. La molécule support peut être un support de l'invention, c'est-à-dire un support qui comprend un polypeptide BP-2a et un polypeptide spbl. En variante, la molécule support peut être toute protéine support appropriée, par exemple comme décrit ci-dessus. La conjugaison d'antigènes de saccharide de Haemophilus influenzae B, de méningocoque et de pneumocoque est bien connue.
Les antigènes de protéines toxiques peuvent être détoxifiés si nécessaire (par exemple détoxification de la toxine de pertussis par des moyens chimiques et/ou génétiques [162] ) .
Quand un antigène de la diphtérie est inclus dans la composition, il est typique d'inclure également l'antigène du tétanos et des antigènes de pertussis. De manière similaire, quand un antigène du tétanos est inclus, il est typique d'inclure également des antigènes de la diphtérie et de pertussis. De manière similaire, quand un antigène de pertussis est inclus, il est typique d'inclure également des antigènes de la diphtérie et du tétanos.
Les antigènes peuvent être adsorbés sur un sel d'aluminium. Les antigènes dans la composition seront typiquement présents en une concentration d'au moins 1 pg/ml chacun. En général, la concentration de n'importe quel antigène donné sera suffisante pour déclencher une réponse immunitaire contre cet antigène.
Comme variante à l'utilisation des antigènes de protéines dans la composition de l'invention, un acide nucléique codant l'antigène peut être utilisé [par exemple réfs. 190 à 191 198]. Les composants protéinés des compositions de l'invention peuvent donc être remplacés par l'acide nucléique (usuellement de l'ADN par exemple, prenant la forme d'un plasmide) qui code la protéine.
En pratique, il peut y avoir une limite supérieure au nombre d'antigènes inclus dans les compositions de l'invention. Le nombre d'antigènes (y compris les conjugués de l'invention) dans une composition de l'invention peut être inférieur à 20, inférieur à 19, inférieur à 18, inférieur à 17, inférieur à 16, inférieur à 15, inférieur à 14, inférieur à 13, inférieur à 12, inférieur à 11, inférieur à 10, inférieur à 9, inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, inférieur à 4, ou inférieur à 3. Le nombre de conjugués de l'invention dans une composition peut être inférieur à 6, inférieur à 5, ou inférieur à 4.
Compositions pharmaceutiques comprenant les conjugués L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant (a) un conjugué de l'invention, et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. Une discussion approfondie de ces supports est disponible dans la référence 199.
Les infections microbiennes affectent diverses zones du corps et donc, les compositions de l'invention peuvent être préparées sous diverses formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous formes injectables, soit en tant que solutions liquides soit suspensions. Les formes solides appropriées pour la solution dans ou la suspension dans des véhicules liquides avant l'injection peuvent aussi être préparées. La composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple sous forme de pommade, de crème ou de poudre. La composition peut être préparée pour une administration orale par exemple sous forme de comprimé ou de gélule, ou de sirop (éventuellement aromatisé). La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire par exemple sous forme d'inhalateur en utilisant une fine poudre ou un spray. La composition peut être préparée sous forme de suppositoire ou d'ovule. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire par exemple sous forme de gouttes, de spray, ou de poudre [par exemple 200]. La composition peut être incluse dans un bain de bouche. La composition peut être lyophilisée.
La composition pharmaceutique est de préférence stérile. Elle est de préférence exempte de pyrogène. Elle est de préférence tamponnée par exemple à un pH situé entre 6 et 8, en général autour de pH 7. L'invention concerne aussi un dispositif de distribution contenant une composition pharmaceutique de l'invention. Le dispositif peut être par exemple une seringue ou un inhalateur.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont de préférence des compositions immunogéniques du fait qu'elles comprennent une quantité immunologiquement efficace d'un antigène. Par 'quantité immunologiquement efficace', on entend que l'administration de cette quantité à un individu, soit sous forme de dose unique soit de partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie en fonction de l'état de santé et de la condition physique de l'individu à traiter, de l'âge, du groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection désiré, la formulation du vaccin, l'appréciation du médecin traitant de la situation médicale, et autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité tombe dans une plage relativement large, qui peut être déterminée par des essais de routine. Le traitement de dosage peut être une posologie à dose unique ou à dose multiple (par exemple y compris des doses de rappel). La composition peut être administrée en conjonction avec d'autres agents immunorégulateurs.
Une fois formulées, les compositions de l'invention peuvent être administrées directement au sujet. Les sujets à traiter peuvent être des animaux ; en particulier des sujets humains peuvent être traités.
Les compositions immunogéniques de l'invention peuvent être utilisées thérapeutiquement (c'est-à-dire pour traiter une infection existante) ou prophylactiquement (c'est-à-dire pour éviter une future infection).
Une composition immunogénique peut comprendre un autre adjuvant, qui peut agir pour renforcer les réponses immunitaires (humorales et/ou cellulaires) déclenchées chez un patient qui reçoit la composition. Les adjuvants qui peuvent être utilisés avec l'invention comprennent, mais sans y être limités : • une composition contenant un minéral, y compris des sels de calcium et des sels d'aluminium (ou des mélanges de ceux-ci). Les sels de calcium comprennent le phosphate de calcium (par exemple les particules « CAP » exposées dans la référence 201). Les sels d'aluminium comprennent les hydroxydes, les phosphates, les sulfates, etc., les sels prenant une forme appropriée quelconque (par exemple gel, crystalline, amorphe, etc.). L'adsorption sur ces sels est préférée. Les compositions contenant un minéral peuvent aussi être formulées sous forme de particules d'un sel métallique [202]. Les adjuvants connus comme 1'hydroxyde d'aluminium et le phosphate d'aluminium phosphate peuvent être utilisés. Ces noms sont usuels mais sont utilisés pour des raisons pratiques seulement, puisque aucun d'entre eux n'est une description précise du composé chimique réel qui est présent (par exemple voir chapitre 9 de la référence 285). L'invention peut utiliser l'un quelconque des adjuvants « hydroxyde » ou « phosphate » qui sont utilisés en général comme adjuvants. Les adjuvants connus en tant que « hydroxyde d'aluminium » sont typiquement des sels d'oxyhydroxyde d'aluminium qui sont usuellement au moins partiellement cristallins. Les adjuvants connus sous le nom de « phosphate d'aluminium » sont typiquement des hydroxyphosphates d'aluminium, contenant fréquemment également une petite quantité de sulfate (c'est-à-dire du sulfate d'hydroxyphosphate d'aluminium). Ils peuvent être obtenus par précipitation, et les conditions de réaction et les concentrations au cours de la précipitation influencent le degré de substitution du phosphate pour l'hydroxyle dans le sel. L'invention peut utiliser un mélange à la fois d'un hydroxyde d'aluminium et d'un phosphate d'aluminium. Dans ce cas, il peut y avoir plus de phosphate que d'hydroxyde d'aluminium par exemple en un rapport en poids d'au moins 2:1, par exemple ^5:1, >6:1, ^7:1, ^8:1, ^9:1, etc. La concentration en Al+++ dans une composition pour une administration à un patient est de préférence inférieure à 10 mg/ml par exemple <5 mg/ml, ^4 mg/ml, <3 mg/ml, ^2 mg/ml, ^1 mg/ml, etc. Une plage préférée est située entre 0,3 .et 1 mg/ml. Un maximum de 0,85 mg/dose est préféré. • les saponines [chapitre 22 de la réf. 285], qui sont un groupe hétérologue de glycosides de stérols et de glycosides de triterpènoïdes qui se trouvent dans l'écorce, les feuilles, les tiges, les racines et même les fleurs d'une large gamme d'espèces végétales. La saponine provenant de l'écorce de l'arbre à savon Quillaia saponaria Molina a été largement étudiée comme adjuvants. La saponine peut aussi être obtenue dans le commerce à partir de Smilax ornata (salsepareille), Gypsophilla paniculata (souffle de bébé), et de Saponaria officianalis (herbe à savon). Les formulations avec l'adjuvant saponine comprennent les formulations purifiées, comme QS21, ainsi que les formulations lipidiques, comme les ISCOMs. QS21 est commercialisé sous le nom de Stimulon™. Les compositions a la saponine ont été purifiées en utilisant la HPLC et la RP-HPLC. Des fractions spécifiques purifiées en utilisant ces techniques ont été identifiées, y compris QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B et QH-C. De préférence, la saponine est QS21. Un procédé de production de QS21 est exposé dans la réf. 203. Les formulations à la saponine peuvent comprendre un stérol, comme le cholestérol [204]. Des combinaisons de saponines et de cholestérols peuvent être utilisées pour former des particules uniques appelées complexes immunostimulants (ISCOMs) [chapitre 23 de la réf. 285]. Les ISCOMs comprennent également typiquement un phospholipide tel que la phosphatidyléthanolamine ou la phosphatidyl-choline. Toute saponine connue peut être utilisée dans les ISCOMs. De préférence, l'ISCOM comprend un ou plusieurs éléments parmi QuilA, QHA &amp; QHC. Les ISCOMs sont décrits plus en· détails dans les réf. 204-206. Eventuellement, les ISCOMS peuvent être dépourvus des détergents traditionnels [207]. Une étude concernant le développement des adjuvants à base de saponine peut se trouver dans les réfs. 208 &amp; 209. • Les toxines bactériennes d'ADP-ribosylation (par exemple l'entérotoxine thermolabile de Escherichia coli « LT », la toxine du choléra « CT », ou la toxine de pertussis « PT ») et les dérivés détoxifiés de celles-ci, comme les toxines mutantes connues sous le nom de LT-K63 et LT-R72 [210]. L'utilisation des toxines détoxifiées d'ADP-ribosylation en tant qu'adjuvants mucosiques est décrite dans la réf. 211 et en tant qu'adjuvants parentéraux dans la réf. 212. • les bioadhésifs et mucoadhésifs, comme les microsphères d'acide hyaluronique estérifié [213] ou le chitosane et ses dérivés [214]. • les microparticules (c'est-à-dire une particule de ~100 nm à ~150 pm de diamètre, plus préférentiellement ~200 nm à ~30 pm de diamètre, ou ~500 nm à ~10 pm de diamètre) formées à partir de matières qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple un poly(a-hydroxyacide), un acide polyhydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), le poly(lactide-co-glycolide) étant préféré, éventuellement traitées pour avoir une surface chargée négativement (par exemple par SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple avec un détergent cationigue, comme CTAB). • les liposomes (chapitres 13 &amp; 14 de la réf. 285) . Les exemples de formulations de liposome appropriées pour une utilisation comme adjuvants sont décrits dans les réf. 215-217. • les peptides de muramyle, comme la Ji-acétylmuramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine (« thr-MDP »), la N-acétyl- normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (nor-MDP), le N-acétylglucosaminyl-N-acétylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide (« DTP-DPP », ou « Théramide™ »), la W-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1'-2'dipalmitoyl-sn-glycéro-3-hydroxyphosphoryloxy)-éthylamine (« MTP-PE »). • un polymère de polyoxydonium [218,219] ou autre dérivé N-oxydé de polyéthylène-pipérazine. • le méthylinosine 5'-monophosphate (« MIMP ») [220]. • un composé polyhydroxylé de pyrrolizidine [221], comme celui qui a pour formule :
dans laquelle R est choisi dans le groupe comprenant un hydrogène, des groupes acyle, alkyle (par exemple cycloalkyle), alcényle, alcynyle et aryle linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué, saturé ou insaturé, ou un sel pharmaceutiquement acceptable ou un dérivé de celui-ci. Les exemples comprennent, mais sans y être limité : la casuarine, le casuarine-6-a-D-glucopyranose, la 3-épi-casuarine, la 7-épi-casuarine, la 3,7-diépi-casuarine, etc. • un ligand CDld comme un a-glycosylcéramide [222-229] (par exemple a-galactosylcéramide) , les a-glycosylcéramides contenant de la phytosphingosine, OCH, KRN7000 [(2 S,3S,4R)-1-0-(a-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1,3,4-octadécanetriol], CRONY-101, le 3''-O-sulfo-galactosylcéramide, etc. • une gamma-inuline [230] ou ses dérivés, comme 1'algammuline. • une émulsion huile-dans-eau. Plusieurs de ces émulsions sont connues et comprennent typiquement au moins une huile et au moins un tensioactif, la ou les huiles et le ou les tensioactifs étant biodégradables (métabolisables) et biocompatibles. Les gouttelettes d'huile dans l'émulsion sont en général inférieures à 5 pm de diamètre, et peuvent avoir un diamètre de l'ordre du sous-micron, ces petites tailles étant obtenues grâce à un microfluidiseur pour donner des émulsions stables. Les gouttelettes ayant une taille inférieure à 220 nm sont préférées puisqu'elles peuvent être soumises à une stérilisation filtrante. • un oligonucléotide immunostimulant, comme celui contenant un motif CpG (une séquence de dinucléotide contenant un résidu de cytosine non méthylé lié par une liaison phosphate à un résidu de guanosine) , ou un motif Cpl (une séquence de dinucléotide contenant une cytosine liée à une inosine), ou un ARN double brin, ou un oligonucléotide contenant une séquence palindromique, ou un oligonucléotide contenant une séquence poly(dG). Les oligonucléotides immunostimulants peuvent comprendre des modifications/analogues nucléotidiques comme des modifications phosphorothioate et peuvent être double brin ou (sauf pour l'ARN) simple brin. Les références 231, 232 et 233 exposent des substitutions analogues possibles par exemple par remplacement de la guanosine par la 2’-désoxy-7-désazaguanosine. L'effet adjuvant des oligonucléotides CpG est également exposé dans les réf. 234-239. Une séquence CpG peut être dirigée contre TLR9, comme le motif GTCGTT ou TTCGTT [240] . La séquence CpG peut être spécifique pour induire une réponse immunitaire Thl, comme un ODN (oligodésoxynucléotide) CpG-A, ou il peut être plus spécifique pour induire une réponse des lymphocytes B comme un ODN CpG-B. Les ODN CpG-A et CpG-B sont exposés dans les références 241-243. De préférence le CpG est un ODN CpG-A. De préférence, l'oligonucléotide CpG est conçu de sorte que l'extrémité 5' soit accessible pour la reconnaissance du récepteur. Eventuellement, deux séquences d'oligonucléotides CpG peuvent être fixées à leurs extrémités 3' pour former des « immunomères ». Voir par exemple les références 240 &amp; 244-246. Un adjuvant CpG utile est CpG7909, connu également sous le nom de ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Un autre est CpG1826. En variante ou en plus d'utiliser des séquences CpG, on peut utiliser des séquences TpG [247], et ces oligonucléotides peuvent être exempts de motifs CpG non méthylés. L'oligonucléotide immunostimulant peut être riche en pyrimidine. Par exemple, il peut comprendre plus d'un nucléotide thymidine consécutif (par exemple TTTT, tel qu'exposé dans la réf. 247), et/ou il peut avoir une composition nucléotidique avec >25% de thymidine (par exemple >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Par exemple, il peut comprendre plus d'un nucléotide cytosine consécutif (par exemple CCCC, tel qu'exposé dans la réf. 247), et/ou il peut avoir une composition nucléotidique avec >25% de cytosine (par exemple >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Ces oligonucléotides peuvent être exempts de motifs CpG non méthylés. Les oligonucléotides immunostimulants comprendront typiquement au moins 20 nucléotides. Ils peuvent comprendre moins de 100 nucléotides.
Un adjuvant particulièrement utile à base d'oligonucléotides immunostimulants est connu sous le nom de IC31™ [248]. Ainsi, un adjuvant utilisé avec l'invention peut comprendre un mélange de (i) un oligonucléotide (par exemple entre 15-40 nucléotides) y compris au moins un (et de préférence plusieurs) motifs Cpl et (ii) un polymère polycationique comme un
Oligopeptide (par exemple entre 5-20 acides aminés) y compris au moins une (et de préférence plusieurs) séquences tripeptidiques Lys-Arg-Lys. L'oligonucléotide peut être un désoxynucléotide comprenant une séquence 2 6-mère 5 * — (IC) 13—3 * (SEQ ID N° : 98). Le polymère polycationique peut être un peptide comprenant une séquence d'acides aminés 11-mère KLKLLLLLKLK (SEQ ID N° : 99). • le monophosphoryle lipide A 3-O-désacylé ('3dMPL', connu également sous le nom de 'MPL™' ) [249-252] . Dans des conditions aqueuses, 3dMPL peut former des agrégats micellaires ou des particules de différentes tailles, par exemple d'un diamètre <150nm ou >500nm. L'un ou l'autre de ceux-ci peut être utilisé avec l'invention, et les meilleures particules peuvent être choisies grâce à des essais de routine. Des particules plus petites (par exemple suffisamment petites pour donner une suspension aqueuse claire de 3dMPL) sont préférées pour une utilisation selon l'invention à cause de leur activité supérieure [253]. Les particules préférées ont un diamètre moyen inférieur à 220 nm, plus préférentiellement inférieur à 200 nm ou inférieur à 150 · nm ou inférieur à 120 nm, et peuvent même avoir un diamètre moyen inférieur à 100 nm. Dans la plupart des cas, cependant, le diamètre moyen ne sera pas inférieur à 50 nm. • un composé imidazoquinoline tel que Imiquimod (« R-837 ») [254,255], Resiquimod (« R-848 ») [256], et leurs analogues ; et leurs sels (par exemple les sels de chlorhydrate). De plus amples détails concernant les imidazoquinolines immunostimulantes peuvent se trouver dans les références 257 à 261. • un composé thiosemicarbazone tel que ceux exposés dans la référence 262. Des procédés de formulation, de fabrication et de criblage des composés actifs sont aussi décrits dans la référence 262. Les thiosemicarbazones sont particulièrement efficaces dans la stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique humain pour la production de cytokines, comme TNF-a. • un composé tryptanthrine comme ceux exposés dans la référence 263. Des procédés de formulation, de fabrication et de criblage des composés actifs sont aussi décrits dans la référence 263. Les thiosemicarbazones sont particulièrement efficaces dans la stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique humain pour la production de cytokines, comme TNF-a. • un analogue de nucléoside comme : (a) 1'Isatorabine (ANA- 245; 7-thia-8-oxoguanosine):
et ses promédicaments ; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) les composés exposés dans les références 264 à 266 et la Loxoribine (7-allyl-8-oxoguanosine) [267]. • les composés exposés dans la référence 268, y compris : les composés acylpipérazine, les composés indoledione, les composés tétrahydroisoquinoline (THIQ), les composés benzocyclodione, les composés aminoazavinyle, les composés aminobenzimidazole quinolinone (ABIQ) [269,270], les composés hydrapthalamide, les composés benzophénone, les composés isoxazole, les composés stérol, les composés quinazilinone, les composés pyrrole [271], les composés anthraquinone, les composés quinoxaline, les composés triazine, les composés pyrazalopyrimidine, et les composés benzazole [272] . • un dérivé d'aminoalkyle glucosaminide phosphate comme RC-529 [273,274]. • un phosphazène, comme le poly[di(carboxylatophénoxy)-phosphazène] (« PCPP ») comme décrit par exemple dans les références 275 et 276. • une urée substituée ou un composé de formule I, II ou III, ou un sel de celui-ci :
I II III
tel que défini dans la référence 277, comme 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 ou 'ER 804057' par exemple :
ER804057
ER-803022: • les dérivés du lipide A de Escherichia coli comme OM-174 (décrits dans les références 278 &amp; 279). • Les composés contenant des lipides liés à un squelette acyclique contenant du phosphate comme l'antagoniste de TLR4 E5564 [280,281] :
Ces substances et d'autres substances actives en tant qu'adjuvant sont exposées plus en détail dans les références 285 &amp; 286.
Les antigènes et adjuvants dans une composition seront typiquement en mélange.
Les compositions peuvent inclure deux desdits adjuvants ou plus. Par exemple, elles peuvent avantageusement inclure à la fois une émulsion huile-dans-eau et du 3dMPL, etc.
Les adjuvants en émulsion huile-dans-eau spécifiques utiles avec l'invention comprennent, mais sans y être limités : • une émulsion submicronique de squalène, Tween 80, et Span 85. La composition de l'émulsion en volume peut être d'environ 5% de squalène, d'environ 0,5% de polysorbate 80 et d'environ 0,5% de Span 85. En termes de poids, ces rapports passeront à 4,3% de squalène, 0,5% de polysorbate 80 et 0,48% de Span 85. Cet adjuvant est connu sous le nom de 'MF59®' [282-284], comme décrit plus en détail au Chapitre 10 de la réf. 285 et au chapitre 12 de la réf. 286. L'émulsion MF59® comprend avantageusement des ions citrate par exemple lOmM de tampon de citrate de sodium. • une émulsion de squalène, d'un tocophérol, et de Tween 80. L'émulsion peut comprendre un tampon phosphate salin. Elle peut contenir aussi du Span 85 (par exemple à 1%) et/ou de la lécithine. Ces émulsions peuvent avoir de 2 à 10% de squalène, de 2 à 10% de tocophérol et de 0,3 à 3% de Tween 80, et le rapport en poids de squalène:tocophérol est de préférence ^1 puisque cela donne une émulsion plus stable. Le squalène et Tween 80 peuvent être présents en un rapport volumique d'environ 5:2. Une telle émulsion peut être préparée en dissolvant Tween 80 dans du PBS pour donner une solution à 2%, puis en mélangeant 90 ml de cette solution avec un mélange de (5 g de DL-a-tocophérol et 5 ml de squalène) , puis en microfluidisant le mélange. L'émulsion résultante peut avoir des gouttelettes d'huile submicroniques, par exemple d'un diamètre moyen situé entre 100 et 250 nm, de préférence d'environ 180 nm. • une émulsion de squalène, d'un tocophérol, et d'un détergent Triton (par exemple Triton X-100) . L'émulsion peut aussi inclure du 3d-MPL (voir ci-dessous). L'émulsion peut contenir un tampon phosphate. • une émulsion comprenant un polysorbate (par exemple polysorbate 80) , un détergent Triton (par exemple Triton X-100) et un tocophérol (par exemple un succinate d'a-tocophérol). L'émulsion peut inclure ces trois composants en un rapport en poids de 75:11:10 (par exemple 750 pg/ml de polysorbate 80, 110 pg/ml de Triton X-100 et 100 pg/ml de succinate d'a-tocophérol), et ces concentrations devront comprendre toute contribution de ces composants provenant d'antigènes. L'émulsion peut aussi inclure du squalène. L'émulsion peut aussi inclure du 3d-MPL (voir ci-dessous). La phase aqueuse peut contenir un tampon phosphate. • une émulsion de squalane, de polysorbate 80 et de poloxamère 401 (« Pluronic™ L121 »). L'émulsion peut être formulée dans un tampon de phosphate salin, pH 7.4. Cette émulsion est un véhicule de distribution utile pour les dipeptides de muramyle et est utilisée avec le thréonyle-MDP dans l'adjuvant « SAF-1 » [287] (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de squalane, 2,5% de Pluronic L121 et 0,2% de polysorbate 80) . Elle peut aussi être utilisée sans le Thr-MDP, comme dans l'adjuvant « AF » [288] (5% de squalane, 1,25% de Pluronic L121 et 0,2% de polysorbate 80). La microfluidisation est préférée. • une émulsion contenant de 0,5-50% d'une huile, 0,1-10% d'un phospholipide, et 0,05-5% d'un tensioactif non ionique. Comme décrit dans la référence 289, les composants de phospholipide préférés sont la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, le phosphatidylglycérol, l'acide phosphatidique, la sphingomyéline et la cardiolipine. Des tailles de gouttelettes submicroniques sont avantageuses. • une émulsion submicronique huile-dans-eau d'une huile non métabolisable (comme une huile minérale légère) et d'au moins un tensioactif (comme la lécithine, Tween 80 ou Span 80) . Des additifs peuvent être inclus comme la saponine QuilA, le cholestérol, un conjugué saponine-lipophile (comme GPI-0100, décrit dans la référence 290, produit par l'addition d'une amine aliphatique à la désacylsaponine par le biais du groupe carboxyle de l'acide glucuronique) , le bromure de diméthyldioctadécyl-ammonium et/ou la W,W-dioctadécyl-i\7,W-bis (2-hydroxy-éthyl)propanediamine. • une émulsion dans laquelle une saponine (par exemple QuilA ou QS21) et un stérol (par exemple un cholestérol) sont associés sous forme de micelles hélicoïdales [291]. Des adjuvants particuliers pour une utilisation avec les compositions immunogéniques de l'invention comprennent MF59®, l'alun et/ou les agonistes du récepteur de type toll 7 (TLR7), par exemple, comme ceux exposés dans le document EP2459216 incorporé ici par référence.
Traitements médicaux et utilisations L'invention concerne aussi un conjugué de l'invention, pour une utilisation en médecine, par exemple pour une utilisation dans le déclenchement d'une réponse d'anticorps chez un mammifère approprié. L'invention propose également un procédé permettant de déclencher une réponse immunitaire chez un mammifère approprié, comprenant l'administration d'un conjugué ou d'une composition pharmaceutique de l'invention au mammifère. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un conjugué de l'invention dans la fabrication d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une infection microbienne chez un mammifère approprié.
La réponse immunitaire déclenchée par ces procédés et utilisations comprendra en général une réponse d'anticorps, de préférence une réponse d'anticorps protectrice. Les procédés permettant d'évaluer les réponses d'anticorps après une immunisation par un antigène sont bien connues dans l'art. La réponse d'anticorps est de préférence une réponse IgA ou IgG. La réponse immunitaire peut être prophylactique et/ou thérapeutique. Le mammifère est de préférence un être humain, en particulier une femme, plus particulièrement une femme enceinte. L'efficacité d'un traitement thérapeutique peut être testée en surveillant l'infection microbienne après administration de la composition de l'invention. L'efficacité du traitement prophylactique peut être testée en surveillant les réponses immunitaires contre un antigène (par exemple des anticorps anti-antigène) après administration de la composition.
Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. L'administration directe peut se faire par injection parentérale (par exemple en sous-cutané, en intrapéritonéale, en intraveineuse, en intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intradermique, oculaire, nasale, auriculaire, ou pulmonaire. L'injection ou l'administration intranasale est préférée. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosique.
Des vaccins préparés selon l'invention peuvent être utilisés pour traiter à la fois enfants et adultes. Ainsi, un sujet peut avoir moins de 1 an, 1-5 ans, 5-15 ans, 15-55 ans, ou au moins 55 ans. Les sujets particuliers pour la réception des vaccins sont les personnes âgées (par exemple â50 ans, ^55 ans, ^60 ans, et h65 ans) , ou les jeunes enfants (par exemple ^5 ans) . Les vaccins ne sont néanmoins pas adéquats seulement pour ces groupes et peuvent être utilisés en général dans une population.
Le traitement peut être à posologie à dose unique ou à posologie à dose multiple. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un programme d'immunisation primaire et/ou dans un programme d'immunisation de rappel. Dans un programme à doses multiples, les diverses doses peuvent être administrées par des voies identiques ou différentes, par exemple une primo-vaccination parentérale et un rappel mucosique, une primo-vaccination mucosique et un rappel parentéral, etc. L'administration de plus d'une dose (typiquement deux doses) est particulièrement utile chez les patients naïfs immunologiquement. Les doses multiples seront typiquement administrées au moins à 1 semaine (par exemple environ 2 semaines, environ 3 semaines, environ 4 semaines, environ 6 semaines, environ 8 semaines, environ 10 semaines, environ 12 semaines, environ 16 semaines, etc.) d'intervalle.
Les utilisations et les procédés de l'invention sont particulièrement utiles pour le traitement/la protection contre les infections provoquées par l'organisme dont l'antigène est dérivé. Des exemples d'utilisations/de procédés sont exposés ci-dessous.
Saccharides capsulaires de Streptococcus agalactiae
Les utilisations et les procédés sont destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par Streptococcus agalactiae. Les exemples montrent que les molécules supports de l'invention sont particulièrement efficaces pour les saccharides de S. agalactiae. En plus, les polypeptides BP-2a et spbl du support sont susceptibles d'aider l'induction d'une réponse immunitaire protectrice spécifique pour le support. Les compositions immunogéniques comprenant des protéines supports de l'invention peuvent être destinées à une utilisation dans : (i) un procédé pour le traitement ou la prévention d'une maladie infectieuse provoquée par Streptococcus agalactiae ; ou (ii) un procédé pour induire une réponse immunitaire contre Streptococcus agalactiae chez un sujet ; ou (iii) un procédé de vaccination d'un sujet pour le protéger contre une infection par Streptococcus agalactiae ou en réduire les symptômes, ledit procédé consistant à administrer à un sujet qui en a besoin une quantité thérapeutiquement efficace de ladite composition. Dans des modes de réalisation particuliers, les compositions immunogéniques comprenant les protéines supports de l'invention peuvent être utilisées dans un procédé consistant à fournir une immunité protectrice contre Streptococcus agalactiae ou une protection vis-à-vis d'une maladie provoquée par Streptococcus agalactiae chez un enfant, ledit enfant étant né d'une femme chez qui une quantité thérapeutiquement efficace de la composition a été administrée au cours de sa grossesse. La maladie provoquée par Streptococcus agalactiae peut être une maladie à déclenchement précoce (EOD) et/ou maladie à déclenchement tardif (LOD).
Saccharides capsulaires de Neisseria meningitidis
Les utilisations et les procédés peuvent être destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par Neisseria meningitidis, par exemple méningite, septicémie, etc.
Glucanes
Puisque les glucanes (et les ß-glucanes en particulier) sont un constituant essentiel et principal polysaccharide de presque tous les champignons pathogènes, en particulier ceux impliqués dans les infections touchant des sujets immunodéprimés ainsi que dans les pathogènes bactériens et les protozoaires, une immunité anti-glucane peut avoir une efficacité contre une large gamme de pathogènes et de maladies. Par exemple, le sérum anti-glucane suscité après immunisation avec Saccharomyces cerevisiae présente une réactivité croisée avec Candida albicans. Une immunité à large spectre est particulièrement utile car, pour ces agents fongiques infectieux humains, la chimiothérapie est peu abondante, la résistance aux médicaments antifongiques est émergente et il existe un besoin en matière de vaccins thérapeutiques et préventifs qui est de plus en plus reconnu.
Les utilisations et les procédés sont particulièrement utiles pour le traitement/la protection contre les infections suscitées par : l'espèce Candida comme C. albicans ; l'espèce Cryptococcus comme C. neoformans ; l'espèce Enterococcus comme E. faecalis ; l'espèce Streptococcus comme S. pneumoniae, S. mutans, S. agalactiae et S. pyogenes ; l'espèce Leishmania comme L. major ; l'espèce Acanthamoeba comme A. castellani ; l'espèce Aspergillus comme A. fumigatus et A. flavus ; l'espèce Pneumocystis comme P. carinii ; l'espèce Mycobacterium comme M. tuberculosis ; l'espèce Pseudomonas comme P. aeruginosa ; l'espèce Staphylococcus comme S. aureus ; Salmonella comme S. typhimurium ; l'espèce Coccidioides comme C. immitis ; l'espèce Trichophyton comme T. verrucosum ; l'espèce Blastomyces comme B. dermatidis ; l'espèce Histoplasma comme H. capsulatum ; l'espèce Paracoccidioides comme P. brasiliensis ; l'espèce Pythium comme P. insidiosum ; et l'espèce Escherichia comme E. coli.
Les utilisations et les procédés de l'invention sont particulièrement utiles pour la prévention/ le traitement des maladies comprenant, mais sans y être limitées : la candidose (y compris la candidose hépatosplénique, la candidose invasive, la candidose mucocutanée chronique et la candidose disséminée) ; la candidémie ; l'aspergillose, la cryptococcose, les dermatomycoses, la sporothrychose et autres mycoses sous-cutanées, la blastomycose, l'histoplasmose, la coccidiomycose, la paracoccidiomycose, la pneumocystose, le muguet, la tuberculose, la mycobactériose, les infections respiratoires, la scarlatine, la pneumonie, l'impétigo, le rhumatisme articulaire aigu, la sepsis, la septicémie, la leishmaniose cutanée et viscérale, 1'acanthamoébiase cornéenne, la fibrose kystique, la fièvre typhoïde, la gastroentérite et le syndrome hémolytique - urémique. L'activité anti-C. albicans est particulièrement utile dans le traitement des infections chez les patients sidéens.
Les conjugués de l'invention peuvent être combinés à des antigènes non-glucane dans une unique composition pour l'immunisation simultanée contre de multiples pathogènes. Comme variante à la fabrication d'un vaccin combiné, les conjugués peuvent être administrés à des patients sensiblement en même temps que (par exemple au cours de la même consultation ou visite médicale chez un professionnel de santé ou un centre de vaccination) d'autres vaccins. Les antigènes pour une utilisation dans ces vaccins combinés ou pour une administration concomitante comprennent par exemple des immunogènes provenant de Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus et/ou Pseudomonas aeuruginosa, du virus de l'hépatite A, du virus de l'hépatite B, de Neisseria meningitidis (comme les saccharides ou saccharides conjugués, pour les sérogroupes A, C, W135 et/ou Y) , de Streptococcus pneumoniae (comme les saccharides ou saccharides conjugués), etc.
Les conjugués de l'invention peuvent être utilisés conjointement avec des antifongiques, en particulier quand un patient est déjà infecté. L'antifongique apporte un effet thérapeutique immédiat alors que le conjugué apporte un effet longue durée. Les antifongiques appropriés comprennent, mais sans y être limités, les azoles (par exemple fluconazole, itraconazole), les polyènes (par exemple amphotéricine B) , la flucytosine, et les inhibiteurs de squalène époxidase (par exemple terbinafine) [voir aussi la réf.. 292]. L'antifongique et le conjugué peuvent être administrés séparément ou en combinaison. Quand ils sont administrés séparément, ils seront typiquement administrés à 7 jours d'intervalle. Après la première administration d'un conjugué, l'antifongique peut être administré plus d'une fois.
Saccharides capsulaires de Streptococcus pyogenes
Les utilisations et les procédés peuvent être destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par le streptocoque du groupe A.
Saccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae
Les utilisations et les procédés peuvent être destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par un pneumocoque, par exemple méningite, sepsis, pneumonie etc. Définitions
La pratique de la présente invention utilisera, sauf stipulation contraire, les procédés usuels de la chimie, biochimie, biologie moléculaire, immunologie et pharmacologie, dans le domaine de l'art. Ces techniques sont totalement exposées dans la littérature. Voir par exemple les références 199 et 293-299, etc.
La numérotation « GI » est utilisé dans ce qui précède. Un numéro GI ou « Genlnfo Identifier » est une série de chiffres attribués consécutivement à chaque enregistrement de séquences traité par le NCBI quand les séquences sont ajoutées à sa base de données. Le numéro GI n'a aucune ressemblance avec le numéro d'immatriculation de l'enregistrement de la séquence. Quand une séquence est mise à jour (par exemple pour être corrigée ou pour ajouter plus d'annotations ou d'informations) alors elle reçoit un nouveau numéro GI. Donc, la séquence associée à un numéro GI donnée ne change jamais.
Quand un « domaine » d'antigène est omis, cela implique l'omission d'un peptide signal, d'un domaine cytoplasmique, d'un domaine transmembranaire, d'un domaine extracellulaire, etc.
Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « se composant », par exemple une composition « comprenant » X peut se composer exclusivement de X ou peut inclure quelque chose d'autre, par exemple X + Y. Le terme « se composant essentiellement de » signifie que la composition, le procédé ou la structure peuvent inclure des ingrédients, étapes et/ou parties additionnels, mais seulement si les ingrédients, étapes et/ou parties additionnels ne modifient pas concrètement les caractéristiques nouvelles de base de la composition, du procédé ou de la structure revendiqués. Le terme « consistant en » est généralement considéré comme signifiant que l'invention telle qu'elle est revendiquée est limitée aux éléments spécifiquement cités dans la revendication (et peut inclure leurs équivalents, dans la mesure où le principe des équivalents est applicable).
Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x signifie par exemple + deux écart-types de la valeur. Dans certains modes de réalisation, « environ » est compris comme étant une variation acceptable et des tolérances à l'intérieur de l'art en question. Par exemple, quand on désigne une valeur mesurable comme une quantité, une durée temporelle, et similaire, cela peut englober des variations de ±20% ou ±10%, de préférence de ±5%, même plus préférentiellement de ±1%, et toujours plus préférentiellement de ±0,1% par rapport à la valeur spécifiée, puisque ces variations sont appropriées pour la réalisation des procédés exposés.
Le mot « essentiellement » n'exclut pas « complètement », par exemple une composition qui est « essentiellement exempte » de Y peut être complètement exempte de Y. Par exemple « essentiellement exempte » de Y peut être compris comme étant une composition ne contenant pas plus de 5% de Y, pas plus de 4% de Y, pas plus de 3% de Y, pas plus de 2% Y, pas plus de 1% de Y, ou pas plus de 0,1% de Y. Si nécessaire, le mot « essentiellement » peut être omis de la définition de 1'invention.
Le terme « canonique » en relation avec les acides aminés signifie que l'acide aminé est un acide aminé parmi les vingt acides aminés codés par le code génétique universel, c'est-à-dire Alanine, Asparagine, Acide Aspartique, Arginine, Cystéine, Glutamine, Glycine, Acide Glutamique, Histidine, Isoleucine, Lysine, Leucine, Phénylalanine, Méthionine, Sérine, Proline, Tryptophane, Thréonine, Tyrosine et Valine.
Tel qu'utilisé ici, « un » et « le » sont compris comme incluant tous deux le singulier et le pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire.
Tel qu'utilisé ici, le terme « fragment » désigne une séquence qui est un sous-ensemble d'une autre séquence. Quand il est utilisé dans le contexte d'une séquence d'acide nucléique ou d'acide aminé, les termes « fragment » et « sous-séquence » sont utilisés de manière synonyme. Ces termes sont utilisés pour désigner une partie ou une portion d'un polypeptide intact ou complet de type sauvage, mais qui comprennent moins de résidus d'acides aminés qu'un polypeptide intact ou complet de type sauvage. Donc, le terme désigne des séquences d'acides aminés tronquées ou plus courtes, correspondant à une ou plusieurs régions d'un polypeptide de type sauvage ou de référence. Il sera évident pour l'homme du métier que, bien que ces fragments sdient des fragments tronqués ou plus courts d'une séquence de référence, ces fragments peuvent être modifiés pour comprendre des séquences additionnelles qui ne se trouvent pas dans le polypeptide de référence, par exemple pour former des polypeptides de fusion, comprendre des séquences 'étiquettes' comme des étiquettes His ou des étiquettes Glutathione S-transférase (GST), des séquences de liaison et similaire. Par conséquent, dans ces fragments modifiés, le groupe amino de l'acide aminé N-terminal du fragment n'est pas lié par une liaison peptidique au groupe carboxyle d'un acide aminé auquel il est relié dans le polypeptide de référence. Le pourcentage d'identité d'un premier polypeptide et d'un second polypeptide est généralement déterminé par comptage du nombre de positions appariées entre les premier et second polypeptides et en divisant ce nombre par la longueur totale du polypeptide le plus court, puis en multipliant la valeur résultante par 100. Pour les fragments de polypeptides, cette valeur est usuellement déterminée comme étant autour de 100% et a par conséquent peut de signification. Donc, dans le contexte des fragments de la présente invention, le terme « proportion du polypeptide de référence » (exprimé sous forme de pourcentage) peut être utilisé. La proportion du polypeptide de référence est calculée par comptage du nombre de positions appariées entre les premier et second polypeptides et en divisant ce nombre par la longueur totale du polypeptide le plus court, puis en multipliant la valeur résultante par 100. En particulier, les fragments comprendront moins de 90, 80, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25 ou moins de 20% de la séquence du polypeptide de référence.
Sauf stipulation contraire, un procédé comprenant une étape de mélange de deux composants ou plus ne nécessite pas un ordre spécifique de mélange. Donc, les composants peuvent être mélangés dans n'importe quel ordre. Quand il y a trois composants, alors les deux composants peuvent être combinés l'un avec l'autre, et puis la combinaison peut être combinée avec le troisième composant, etc.
Quand des matières animales (et particulièrement bovines) sont utilisées dans la culture des cellules, elles devront être obtenues à partir de sources qui sont dépourvues d'encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), et en particulier dépourvues de l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Globalement, on préfère cultiver les cellules en l'absence totale de matières dérivées d'animaux.
Quand un composé est administré au corps en tant que partie d'une composition alors ce composé peut en variante être remplacé par un promédicament approprié.
Les références à un pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences d'acides aminés signifient que, quand elles sont alignées, le pourcentage d'acides aminés est identique si on compare les deux séquences. En général, le pourcentage d'identité de séquence est calculé en divisant le nombre d'acides aminés identiques par le nombre total d'acides aminés dans la séquence plus longue. Cet alignement et le pourcentage d'homologie ou d'identité de séquence peuvent être déterminés en utilisant des logiciels connus dans l'art, par exemple ceux décrits dans la section 7.7.18 de la réf. 300. Un alignement préféré est déterminé par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman qui utilise une recherche de gap affine avec une pénalité d'ouverture de gap de 12 et une pénalité d'extension de gap de 2, une matrice BLOSUM de 62. L'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman est exposé dans la réf. 301.
Tous les numéros d'enregistrement de la GenBank indiqués ici sont incorporés par référence en leur version disponible à la date de dépôt de la présente demande.
EXEMPLES
Exemple 1 : GBS59 (6XD3)-GBS1523 fusion
Le gène de la protéine de fusion « GBS59 (6XD3)-GSG4-1523 » (SEQ ID N° : 276) a été généré par clonage PIPE en amplifiant le gène de 59(6XD3) (de nouveau à partir d'un gène synthétique acheté chez geneart) en utilisant les amorces 59pipeF (SEQ ID N° : 278), 59GSG41523.R (SEQ ID NO: 281) et, le gène gbsl523 provenant de l'ADN génomique de la souche COHI du GBS en utilisant les amorces 59GSG41523.F (SEQ ID N° : 280) et 1523pipe.R (SEQ ID N° : 279). Les deux I-PCR, contenant une région chevauchante de 18 bp (SEQ ID N° : 282) correspondant au lieur GSG4 (SEQ ID N° : 272), ont été co-utilisées dans une réaction PIPE en utilisant la PCR vecteur pET15 TEV (codant pour l'étiquette N-terminale 6XHIS-TEV (« 6XHIS » exposé en tant que SEQ ID N° : 79 et 275) ) et co-transformées dans la socuhe HK100 de E.coli. La séquence correcte a été vérifiée par séquençage de l'ADN des clones obtenus.
Afin de générer le protéine de fusion sans étiquette 59(6XD3)-GSG4-1523, le gène 59(6XD3)-GSG4-1523 a été encore amplifié à partir du clone pET15-TEV-59(6XD3)-GSG4-1523 (« GSG4 » exposé en tant que SEQ ID N° : 272) en utilisant les amorces 596xD3 Nhel F (SEQ ID N° : 283) et 1523 Xhol Stop R (SEQ ID N° : 284). Le produit PCR a été clivé avec les enzymes de restriction NheI\XhoI et ligaturé dans le vecteur pET24b+ (novagen) digéré au préalable avec les mêmes enzymes de restriction. La réaction de ligature a été transformée dans des cellules de E. coli DH5a E. coli et la séquence correcte des clones a été vérifiée apr séquençage de l'ADN.
Le clone pET24-59(6XD3)-GSG4-1523 (résistance à la kanamycine) a été transformé dans la souche résistance BL21(DE3) tl (NEB). L'expression des protéines a été réalisée en inoculant une unique colonie dans un milieu LB-PTK + kanamycine et en induisant l'expression des protéines par by addition d'IPTG.
Pour l'expression des protéines recombinantes, les cultures ont été maintenues à 25°C pendant 5h après induction avec ImM d'IPTG pour les clones pET. Toutes les protéines recombinantes ont été purifiées par chromatographie d'affinité et filtration sur gel. En bref, les cellules ont été récoltées par centrifugation et lysées dans un « tampon de lyse », contenant lOmM d'imidazole, lmg\ml de lysozyme, 0,5 mg\ml de DNAse et le cocktail d'inhibiteurs COMPLETE (Roche) dans du PBS. Le lysat a été clarifié apr centrifugation et appliqué sur une colonne HP His-Trap (Armesham Biosciences) prééquilibrée dans du PBS contenant lOmM d'imidazole. L'élution des protéines a été réalisée en utilisant le même tampon contenant 250mM d'imidazole, après deux étapes de lavage en utilisant des tampons de 20mM et 50mM d'imidazole. Les protéines éluées ont été alors concentrées et chargées sur une colonne Superdex 75 HiLoad 16/60 (Amersham Biosciences) prééquilibrée dans du PBS.
Exemple 2 : l'immunisation avec GBS59(6XD3)-GBS1523 fournit une protection
La fusion GBS59(6XD3)-GBS1523-HIS a été testée au niveau de sa capacité à fournir une protection vis-à-vis d'une gamme de souches de GBS pour la mise à l'épreuve. Des groupes séparés de souris ont été immunisés avec la fusion GBS59(6XD3)-GBS1523-HIS et ensuite testés avec différentes souches de GBS pour la mise à l'épreuve qui expriment différents allèles GBS59 ou expriment GBS1523. L'immunisation avec le PBS a été utilisée à titre de témoin négatif. Comme le montre le tableau 5, la présence des antigènes de GBS59 et GBS1523 dans la fusion a offert une protection contre les souches exprimant GBS59, et contre les souches exprimant GBS1523.
Tableau 5
Il est important de noter que la fusion comprenant GBS1523 a fourni une protection comparable à celle obtenue avec la fusion GBS59(6XD3) exposée dans le document WO2011/121576 contre les souches exprimant différentes allèles GBS59, montrant que l'addition de GBS1523 n'a pas d'impact négatif sur l'immunogénicité.
Exemple 3 : Conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 à titre de support pour GBS PS-II L'efficacité du conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 en tant que support pour le polysaccharide GBS de type II a été comparée à d'autres protéines supports. Des groupes de souris ont reçu trois doses du conjugué de saccharide pertinent dans de l'alun à une dose de 1 pg de protéine par dose. Comme le montre le tableau 6, le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 est un support particulièrement efficace pour le polysaccharide GBS de type II et 100% des souris immunisées par GBS59(6XD3)-GBS1523-II ont survécu à une mise à l'épreuve avec la souche 5401 de GBS de type II. Il faut noter que la protection fournie par GBS59(6XD3)—GBS1523—II a été supérieure à la protection fournie par CRM-II (85% de survie) et supérieure à la protection fournie par GBS80-II (78% de survie).. En plus, GBS59(6XD3)-GBS1523-II a apporté une bonne protection contre la mise à l'épreuve de la souche COH1 de type III (100% de survie) et la souche 515 de type la (40% de survie).
Tableau 6
Le titre d'anticorps spécifique pour le saccharide de type II déclenché par les compositions est indiqué sur la Figure 1. GBS59(6XD3)-GBS1523-II a déclenché des titres élevés d'anticorps spécifiques et les titres sont comparables ou supérieure aux titres déclenchés par CRM-II. De nouveau, ces données sont significatives car elles indiquent que la protection accrue présentée par GBS59(6XD3)-GBS1523-II par rapport, par exemple, à CRM-II n'est pas simplement le résultat de la présence de protéines supports qui comprennent des antigènes de GBS. En revanche, le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 est efficace comme molécule support et renforce la réponse immunitaire qui est spécifique pour l'antigène de saccharide de type II. Le titre d'anticorps spécifiques pour GBS59 et GBS1523 déclenché par les compositions GBS59(6XD3)-GBS1523-II est indiqué sur la Figure 2.
Exemple 4 : Conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 comme support pour GBS PS-V L'efficacité du conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 en tant que support pour le polysaccharide GBS de type V a été comparée à d'autres protéines supports. Des groupes de souris ont reçu trois doses du conjugué de saccharide pertinent dans de l'alun à une dose de 1 pg de protéine par dose. Comme le montre le tableau 7, le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 est un support particulièrement efficace pour le polysaccharide GBS de type V et 86% des souris immunisées avec GBS59(6XD3)-GBS1523-V ont survécu à la mise à l'épreuve avec la souche CJB111 de GBS de type V. En plus, GBS59(6XD3)-GBS1523-V a apporté une bonne protection vis-à-vis d'une mise à l'épreuve par une souche C0H1 de type III (60% de survie).
Tableau 7
Exemple 5 : Efficacité de GBS59 (6XD3)-GBS1523 vs toxoide du tétanos, CRM197 et GBS80 comme supports L'efficacité du conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 comme support pour les polysaccharides GBS de type II et type V a été aussi comparée à TT, CRM197 et GBS80. Des groupes de 8 souris ont reçu trois doses du conjugué de saccharide pertinent dans de l'alun à une dose de 1 pg de saccharide et 400 pg d'alun par dose. Comme le montre le tableau 8, l'immunisation avec GBS59(6XD3)-GBS1523-II a fourni une protection supérieure vis-à-vis d'.une mise à l'épreuve avec la souche 5401 de type II que CRM-II et GBS80-II, et aussi une protection supérieure à TT-II.
Tableau 8
La Figure 3 indique les moyennes géométriques des titres d'anticorps anti-saccharide II déclenchés par les différents conjugués dans cette étude. Les titres déclenchés par GBS59(6XD3)-GBS1523-II ont été supérieurs à CRM-II et GBS80- II. Ces données sont significatives car elles indiquent que la protection accrue démontrée par GBS59(6XD3)-GBS1523-II par rapport à, par exemple, CRM-II n'est pas simplement le résultat de la présence de protéines supports qui comprennent des antigènes de GBS. Au contraire, le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 est efficace comme molécule support et accentue la réponse immunitaire qui est spécifique pour l'antigène de saccharide de type II.
La Figure 4 indique les moyennes géométriques des titres d'anticorps anti-saccharide V déclenchés par les différents conjugués dans cette étude. Les titres déclenchés par GBS59(6XD3)-GBS1523-V ont été supérieurs à CRM-V et GBS80-V. Ces données sont significatives car elles indiquent que la protection accrue démontrée par GBS59(6XD3)-GBS1523-V par rapport à, par exemple, CRM-V n'est pas simplement le résultat de la présence de protéines supports qui comprennent des antigènes de GBS. Au contraire, le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 est efficace comme molécule support et accentue la réponse immunitaire qui est spécifique pour l'antigène de saccharide de type V.
Le titre d'anticorps spécifiques pour le saccharide de type V déclenché par les compositions testées est indiqué sur la Figure 5. GB.S59 (6XD3)-GBS1523-V a déclenché des titres élevés d'anticorps spécifiques et les titres sont comparables ou supérieurs aux titres déclenchés par CRM-V. De nouveau, ces données sont significatives car elles indiquent que la protection accrue démontrée par GBS59(6XD3)-GBS1523-V par rapport à, par exemple, CRM-V n'est pas simplement le résultat de la présence de protéines supports qui comprennent des antigènes de GBS. Au contraire, le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 est efficace comme molécule support et accentue la réponse immunitaire qui est spécifique pour l'antigène de saccharide de type V.
Le titre d'anticorps spécifiques pour GBS59 et GBS1523 déclenché par les compositions GBS59(6XD3)-GBS1523-V est indiqué sur la Figure 6.
Exemple 6 : toutes les protéines GBS ne sont pas des protéines supports efficaces
La capacité d'autres protéines de GBS à faire office de protéines supports a été testée en utilisant la laminarine comme modèle de polysaccharide capsulaire. Les protéines suivantes, y compris les protéines auxiliaires provenant de l'ilôt du pilus de GBS, ont été conjuguées à la laminarine et utilisées pour immuniser des souris comme décrit précédemment : CRM197, GBS01132, GBS01157, GBS52 (uniprot Q8E0S8), GBS150 et SAN1516. Une seule protéine (GBS52) a été capable de faire office de protéine support en déclenchant des titres d'IgG anti-laminarine comparables à ceux du conjugué laminarine-CRMl97 utilisé comme référence (Figure 7). Donc, la capacité des antigènes de protéine de GBS à faire office de protéines supports à la place de, par exemple, CRM197 est indépendante de leur capacité à induire une réponse immunitaire.
Exemple 7 : Conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 comme support dans des vaccins multivalents - protection
Le conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 a été testé sur le plan de l'efficacité, une fois utilisé en combinaison avec d'autres conjugués support - saccharide. En particulier, les conjugués GBS59(6XD3)-GBS1523-II et GBS59(6XD3)-GBS1523-V ont été combinés avec un vaccin trivalent comprenant les saccharides de GBS la, Ib et III conjugués à CRM, et avec les conjugués GBS80. La protection fournie par ces compositions tétravalentes et pentavalentes a été comparée aux compositions comprenant le vaccin trivalent en combinaison avec les saccharides de sérotype-II et -V conjugués à CRMi97 et GBS80.
Tableau 9 - mise à l'épreuve avec la souche 5401 - type II
Tableau 10 - mise à l'épreuve avec la souche CJB111 - type V
Les tableaux 9 et 10 montrent l'efficacité du conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 comme support pour les deux saccharides de type -II et -V, quand il est administré seul ou en combinaison avec d'autres conjugués de saccharide. GBS59(6XD3)-GBS1523-II fournit une meilleure protection contre la souche 5401 de sérotype-II que CRM-II et GBS80-II quand les conjugués sont administrés individuellement (90% de survie par rapport à 67% et 69%) . La protection améliorée contre la souche 5401 de sérotype-II est maintenue quand les conjugués GBS59(6XD3)-GBS1523-II sont combinés avec la composition trivalente CRM-Ia/Ib/III. Une composition tétravalente comprenant GBS59(6XD3)-GBS1523-II et CRM-Ia/Ib/III fournit une protection supérieure à une composition comprenant CRM-II et CRM-Ia/Ib/III (81% de survie par rapport à 73% de survie) . Cette protection est encore accrue quand GBS80-V est ajouté pour générer une composition pentavalente (96% de survie).
En plus, GBS59(6XD3)-GBS1523-V apporte une forte protection contre la souche CJB111 de sérotype-V qui est comparable à la protection fournie par CRM-V. GBS59(6XD3)-GBS1523-V est aussi efficace quand il est combiné à la composition trivalente CRM-Ia/Ib/III pour générer des compositions tétravalente et pentavalente.
Ces données suggèrent également que les compositions multivalentes comprenant le support GBS59(6XD3)-GBS1523 sont particulièrement efficaces et ne souffrent pas de la suppression induite par le support, présentée par les compositions reposant sur les CRM supports de l'art antérieur. Une quantité significative de protection contre la souche 5401 de sérotype-II a été perdue quand des taux élevés de CRM197 ont été utilisés (protection abaissée de 73% à 48%) dans un modèle murin, éventuellement dus à une suppression épitopique induite par le support (CIES). Au contraire, les tableaux 9 et 10 montrent que chacune des compositions pentavalentes comprenant des conjugués GBS59(6XD3)-GBS1523 fournit une protection accrue par rapport à la composition tétravalente comparable. Ceci constitue un attribut particulièrement avantageux pour une molécule support et permet le développement de compositions multivalentes efficaces pour apporter une protection contre des gammes de différents different organismes, et des gammes de différentes souches organismes.
Les conjugués GBS59(6XD3)-GBS1523-II et GBS59(6XD3)-GBS1523-V ont été aussi testés au niveau de leur capacité à fournir une protection contre les souches hétérologues quand ils sont combinés à la composition trivalente CRM-Ia/Ib/III et aux conjugués GBS80. Comme le montrent les tableaux 11 et 12 ci-dessous, bien que la protection apportée par les conjugués fut modeste, elle fut supérieure à la protection apportée par le PBS et les protéines GBS59(6XD3)-GBS1523 et GBS80 elles-mêmes .
Tableau 11
Protection fournie contre les autres souches par les vaccins multivalents
Tableau 12
Protection fournie contre les autres souches par les vaccins multivalents.
Exemple 8 : Conjugué GBS59 (6XD3)-GBS1523 comme support dans des vaccins multivalents - titres d'anticorps
Dans quatre autres études, la capacité du conjugué GBS59(6XD3)-GBS1523 à augmenter la réponse des anticorps aux saccharides de sérotype-II et de sérotype-V dans le contexte des vaccins multivalents a été comparée à CRM.
La Figure 8 montre les titres d'anticorps spécifiques pour le saccharide de type II déclenchés par une série de compositions vaccinales multivalentes différentes (« Triv. » désigne le vaccin trivalent CRM-Ia/Ib/lII). Le titre déclenché par les compositions comprenant le support GBS59(6XD3)-GBS1523 a été supérieur à celui suscité par des compositions correspondantes comprenant des conjugués de CRM. De manière importante, l'interférence entre polysaccharide n'a pas été observée pour les compositions supports pentavalentes GBS59(6XD3)-GBS1523. Dans les compositions de conjugués entièrement CRM197, une réponse immunitaire plus dispersée est visible, ce qui est potentiellement le résultat d'une suppression de l'épitope immunitaire par le support provenant des taux élevés de CRM197 utilisés dans le modèle murin spécifique.
La Figure 9 montre les titres d'anticorps spécifiques pour le saccharide de type V déclenchés par une série de de compositions vaccinales multivalentes différentes (« Triv. » désigne le vaccin trivalent CRM-Ia/Ib/III) . Le titre déclenché par les compositions comprenant le support GBS59(6XD3)-GBS1523 a été supérieur à celui suscité par des compositions correspondantes comprenant des conjugués de CRM. De manière importante, l'interférence entre polysaccharide n'a pas été observée pour les compositions supports pentavalentes GBS59 (6XD3)-GBS1523.
Les Figures 10 et 11 fournissent une analyse statistique complémentaire de certaines de données illustrées sur les Figures 8 et 9. On peut y voir que les supports GBS59(6XD3)~ GBS1523 étaient statistiquement significativement plus efficaces que les compositions CRM197.
Puisque tous les isolats de GBS portent des pili, conférant une protection chez la souris, la combinaison de trois protéines (les protéines de squelette du pilus 1 (GBS80) et 2b (GBS1523) et la fusion chimérique des 6 variants de squelette du pilus 2a (GBS59)) peut potentiellement protéger contre une gamme plus large d'isolats de GBS, ce qui représente une solution plus efficace pour la prévention des infections GBS.
Par rapport aux mélanges des trois protéines, l'approche avec la protéine de fusion offre des avantages substantiels : c'est un produit plus défini et il réduit le nombre d'étapes d'expression recombinante et de purification, ce qui fait la différence en termes de coût et de faisabilité pour le vaccin. La fusion de la protéine chimérique du pilus 2a avec la protéine de squelette de pilus 2b a donné un antigène stable et fortement exprimé dans lequel chaque domaine se plie individuellement correctement.
Les chimères recombinantes, seules ou conjuguées avec des polysaccharides GBS, ont conféré une forte protection chez les souris mises à l'épreuve avec l'une quelconque des souches de GBS portant des variants du pilus 2b ou pilus 2a.
Exemple 9 - Domaines de spbl (BP-2b, GBS1523)
Les épitopes induisant des réponses immunitaires protectrices sont restreints à des domaines spécifiques à l'intérieur d'une protéine immunogénique. Une fois que les domaines sont identifiés, ils peuvent être exprimés sous une forme recombinante, pour une utilisation sous forme d'antigènes vaccinaux dépourvus des régions qui ne sont pas pertinentes du point de vue vaccinal. Un des avantages obtenus en travaillant avec les domaines de protéine est qu'ils sont typiquement ordonnés structurellement et peuvent être facilement manipulés in vitro, en simplifiant encore la construction des protéines de fusion synthétique hébergeant deux domaines immunogéniques ou plus. Par conséquent, pour déterminer si la région spbl (GBS1523) de la protéine de fusion pourrait être encore optimisée, on a appliqué la vaccinologie structurelle pour définir le domaine minimal portant les épitopes protecteurs.
Clonage, expression et purification des protéines recombinantes
Des gènes codant la protéine de squelette de pilus 2b BP-2b3o-468 (spbl de longueur entière) sans le peptide signal N- terminal prédit et le domaine transmembranaire C-terminal, et codant BP—2bi85-468 (BP-2bD2+D3/ SEQ ID N° : 285) , dépourvu du domaine 1 N-terminal, et les trois domaines uniques (DI30-184/ D2185-356, D3347-468/ SEQ ID N° : 287, 289, 291) ont été amplifiés par PCR à partir de la souche C0H1 de GBS (SAN_1518) , clonés dans le vecteur pET21b+ et exprimés sous forme de protéines C-terminales étiquetées His. Les protéines ont été exprimées dans des cellules BL21 (DE3) de E. coli (Novagen) cultivées dans LB, ou dans le milieu Biosilta Enbase. Les protéines solubles ont été extraites en utilisant le réactif sigma lysant les cellules, solubilisé dans Tris pH 7,5, 300 mM de
NaCl, 10 mM d'imidazole, et purifié par une colonne HP de chélation au nickel FF-Crude His-Trap (Amersham Bioscience). Les protéines recombinantes éluées avec 300 mM d'imidazole, ont été concentrées par ultrafiltration jusqu'à 10 mg\ml et chargées sur une colonne Superdex 75 HiLoad 26/60 (Amersham
Biosciences) pré-équilibrée dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 75 mM de NaCl. L'abondance de la protéine dans les fractions pures a été quantifiée avec l'essai BCA (Pierce).
Souches bactériennes, milieux et conditions de croissance
Des souches de S. agalactiae ont été cultivées à 37 °C dans 5% de CO2 dans un bouillon de Todd Hewitt (Difco Laboratories) ou dans la gélose de soja trypticase supplémentée avec 5% de sang de brebis.
Modèle murin d'immunisation maternelle active
Un modèle murin d'immunisation maternelle / de mise à l'épreuve des nourrissons par infection GBS a été utilisé pour vérifier l'efficacité protectrice des antigènes, comme décrit précédemment (Maione et al, 2005) . En bref, des groupes de 5 souris femelles CD-I (âgées de 6-8 semaines) ont été immunisées les jours 1, 21 et 35 avec soit du PBS soit 20 pg de protéine par dose dans des formulations à l'alun. Des souris ont été engendrées 3 jours après la dernière immunisation. Dans les 48 h suivant la naissance, les nourrissons ont reçu des injections intrapéritonéales avec une dose de bactéries GBS (souche COH1) calculée pour provoquer une mortalité de 90%. Les souris ont été surveillées chaque jour et enthanasiées quand elles étaient dans des phases terminales humaines définies, préétablies pour l'étude en accord avec les principes de bien être animal appliqués par Novartis. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant le test d'exactitude de Fisher.
Construction des vecteurs de complémentation et mutagenèse dirigée
Pour étudier la possibilité que des anticorps monoclonaux ciblant les épitopes exposés en surface de la protéine BP piline puissent reconnaître des domaines individuels de BP, la protéine de longueur entière BP, BPD2+D3 et des domaines uniques Dl, D2 et D3 ont été testés par western blot.
Les résultats obtenus grâce au transfert immunologique avec les mAbs sont indiqués sur la Fig. 13. Des bandes spécifiques correspondant au poids moléculaire escompté du fragment de protéine D2+D3 et au spbl entier ont été observées, aucune coloration des domaines individuels n'étant détectable. Comme témoin, on a utilisé des sérums de souris dirigés contre la BP recombinante de longueur entière, qui est capable de détecter tous les sous-domaines recombinants de BP (données non représentées). Ce résultat suggère que les anticorps monoclonaux reconnaissent les épitopes qui sont inclus dans BPD2+D3 de longueur entière et cristallisé mais pas dans des domaines D2 et D3 séparés. Ces données suggèrent que les domaines individuels D2 ou D3 ne se plient pas correctement. Les deux anticorps peuvent détecter la protéine BP-2b de type sauvage de longueur entière ; recombinante ou native exprimée par GBS et le fragment de protéine recombinante D2+D3, mais pas les domaines recombinants individuels D2 ou D3. BP-2bD2+D3 conserve les propriétés immunologiques de la protéine de longueur entière
Enfin, pour étudier les propriétés immunologiques de BPd2+d3 par rapport à la protéine de longueur entière et le domaine individuel Dl, les protéines recombinantes purifiées ont été utilisées indépendamment pour immuniser des souris CD1 et l'activité de protection de chacune a été testée dans un modèle murin d'immunisation maternelle active/de mise à l'épreuve néonatale de nourrissons. Pour la mise à l'épreuve, nous avons utilisé la souche C0H1 de GBS exprimant un taux élevé de protéine BP-2b à sa surface. Comme on le voit ci-dessous, l'hybride BPd2+d3 a conféré une protection in vivo à un niveau comparable à celui de la protéine de longueur entière, ce qui suggère que les épitopes protecteurs dans BP-2b sont spécifiquement concentrés dans cette portion de la protéine, alors que le domaine Dl semble inutile pour la protection chez les souris. La Figure 14 présente un western blot avec du sérum provenant d'un patient humain qui reconnaît fortement spbl de longueur entière (GBS1523) et spblD2+D3 (GBS1523D2+d3) mais pas spblDi (GBS1523di) .
La séquence d'un exemple de GBS59 (6xD3)-GBS1523d2+d3 est donnée en tant que SEQ ID: 293. La séquence d'un autre exemple de support de l'invention comprenant sept sous-domaines D3 de GBS59 et les domaines D2+D3 de GBS1523, GBS59 (7xD3Sub) -GBS1523D2+d3 est indiquée en tant que SEQ ID: 294. Les variantes de séquences des domaines GBS1523 Dl, D2 et D3 sont indiquées en tant que SEQ ID N° : 288, 290 et 292.
LISTE DES SEQUENCES SEQ ID N° : 1 (GBS59 2603) SEQ ID N° : 2 (GBS59 515) SEQ ID N° : 3 (GBS59 cjbl 11) SEQ ID N° : 4 (GBS59 h36b) SEQ ID N° : 5 (GBS59 CJB110) SEQ ID N° : 6 (GBS59 DK21) SEQ ID N° : 7 (GBS59 NEM316) SEQ ID N°: 8 (Dl 2603) SEQ ID N° : 9 (D2 2603) SEQ ID N° : 10 (D3 2603) SEQ IDN° : 11 (D4 2603) SEQ ID N° : 12 (Dl 515) SEQ ID N° : 13 (D2 515) SEQ ID N° : 14(D3 515) SEQ ID N° : 15(D4 515) SEQ ID N° : 16 (cjbl 11 Dl) SEQ ID N° : 17 (cjbl 11 D2) SEQ ID N° : 18 (cjbl 11 D3) SEQ ID N° : 19 (cjbl 11 D4) SEQ ID N° : 20 (h36b Dl) SEQ ID N° : 21 (h36b D2) SEQ ID N° : 22 (h36b D3) SEQ ID N° : 23 (h36b D4) · SEQ ID N° : 24 (CJB110D1) SEQ ID N° : 25 (CJB110 D2) SEQ ID N° : 26 (CJB110D3) SEQ ID N° : 27 (CJB110 D4) SEQ ID N°: 28 (DK21 Dl) SEQ ID N° : 29 (DK21 D2) SEQ ID N° : 30 (DK21 D3) SEQ ID N° : 31 (DK21 D4) SEQ ID N° : 32 (Dl NEM316) SEQ ID N° : 33 (D2 NEM316) SEQ ID N° : 34 (D3 NEM316) SEQ ID N° : 35 (D4 NEM316) SEQ ID N° : 36 (2603 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 37 (2603 D4H) SEQ ID N° : 38 (515 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 39(515D4H) SEQ ID N° : 40 (cjbl 11 Sous-fragment D3) SEQ ID N°: 41 (cjblllD4H) SEQ ID N° : 42 (h36b Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 43 (h36b D4H) SEQ ID N° : 44 (CJB110 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 45 (CJB110 D4H) SEQ ID N° : 46 (DK21 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 47 (DK21 D4H) SEQ ID N° : 48 (NEM316 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 49 (DK21 D4H) SEQ ID N° : 50 (2603 D3+D4) SEQ ID N° : 51 (2603 D3+D4H) SEQ ID N° : 52 (2603 D2+D3+D4) SEQ ID N° : 53 (2603 D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 54 (515 D3 + D4) SEQ ID N° : 55 (515 D3+D4H) SEQ ID N° : 56 (515 D2+D3+D4) SEQ ID N° : 57 (515 D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 58 (cjbl 11 D3+D4) SEQ ID N° : 59 (cjbl 11 D3+D4H) SEQ ID N° : 60 (cjbl 11 D2+D3+D4) SEQ ID N° : 61 (cjbl 11 D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 62 (h36b D3+D4) SEQ ID N° : 63 (h36b D3+D4H) SEQ ID N° : 64 (h36b D2+D3+D4) SEQ ID N° : 65 (h36b D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 66 (CJB110 D3+D4) SEQ ID N° : 67 (CJB110 D3+D4H) SEQ ID N° : 68 (CJB110 D2+D3+D4) SEQ ID N° : 69 (CJB110 D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 70 (DK21 D3+D4) SEQ ID N° : 71 (DK21 D3+D4H) SEQ ID N° : 72 (DK21 D2+D3+D4) SEQ ID N° : 73 (DK21 D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 74 (NEM316 D3+D4) * SEQ ID N° : 75 (NEM316 D3+D4H) SEQ ID N° : 76 (NEM316 D2+D3+D4) SEQ ID N° : 77 (NEM316 D2+D3+D4H) SEQ ID N° : 78 (515 fragment court de D3) SEQ ID N° : 79 (étiquette his) SEQ ID N° : 80 (lieur) SEQIDN0 : 81 (lieur) SEQ ID N° : 82 (beur) SEQ ID N° : 83 (Fusion E) SEQ ID N° : 84 (Fusion F) SEQ ID N° : 85 (Fusion G) SEQ ID N° : 86 (Fusion H) SEQ ID N° : 87 (Fusion I) SEQ ID N° : 88 (codant la Fusion E) SEQ ID N° : 89 (codant la Fusion F) SEQ ID N° : 90 (codant la Fusion G) SEQ ID N° : 91 (codant la Fusion H) SEQ ID N° : 92 (codant la Fusion I) SEQ ID N° : 93 (codant la Fusion E - E. Coli optimisée) SEQ ID N° : 94 (codant la Fusion F - E. Coli optimisée) SEQ ID N° : 95 (codant la Fusion G - E. Coli optimisée) SEQ ID N° : 96 (codant la Fusion H - E. Coli optimisée) SEQ ID N° : 97 (codant la Fusion I - E. Coli optimisée) SEQ ID N° : 98 (adjuvant IC) SEQ ID N° : 99 (adjuvent peptidique polycationique) SEQ ID N° : 100 (codant GBS59 2603) SEQ ID N° : 101 (codant GBS59 515) SEQ ID N° : 102 (codant GBS59 cjbl 11) SEQ ID N° : 103 (codant GBS59 h36b) SEQ ID N° : 104 (codant GBS59 CJB110) SEQ ID N° : 105 (codant GBS59 DK21) SEQ ID N° : 106 (codant GBS59 NEM316) SEQ ID N° : 107 (codant 2603 Dl) SEQ ID N° : 108 (codant 2603 D2) SEQ ID N° : 109 (codant 2603 D3) SEQ ID N° : 110 (codant 2603 D4) SEQ ID N° : 111 (codant 515 Dl) SEQ ID N° : 112 (codant 515 D2) SEQ ID N° : 113 (codant 515 D3) SEQ ID N° : 114 (codant 515 D4) SEQ ID N° : 115 (codant cjbl 11 Dl) SEQ ID N° : 116 (codant cjbl 11 D2) SEQ ID N° : 117 (codant cjbl 11 D3) SEQ ID N° : 118 (codant cjb 111 D4) SEQ ID N° : 119 (codant h36b Dl) SEQ ID N° : 120 (codant h36b D2) SEQ ID N° : 121 (codant h36b D3) SEQ ID N° : 122 (codant h36b D4) SEQ ID N° : 123 (codant CJB 110 Dl) SEQ ID N° : 124 (codant CJB 110 D2) SEQ ID N° : 125 (codant CJB110 D3) SEQ ID N° : 126 (codant CJB 110 D4) SEQ ID N° : 127 (codant DK21 Dl) SEQ ID N° : 128 (codant DK21 D2) SEQ ID N° : 129 (codant DK21 D3) SEQ ID N° : 130 (codant DK21 D4) SEQ ID N° : 131 (codant NEM316 Dl) SEQ ID N° : 132 (codant NEM316 D2) SEQ ID N° : 133 (codant NEM316 D3) SEQ ID N° : 134 (codant NEM316 D4) SEQ ID N° : 135 (codant 2603 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 136 (codant 2603 D4H) SEQ ID N° : 137 (codant 515 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 138 (codant 515 D4H) SEQ ID N° : 139 (codant cjbl 11 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 140 (codant cjbl 11 D4H) SEQ ID N° : 141 (codant h36b Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 142 (codant h36b D4H) SEQ ID N° : 143 (codant CJB 110 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 144 (codant CJB110 D4H) SEQ ID N° : 145 (codant DK21 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 146 (codant DK21 D4H) SEQ ID N° : 147 (codant NEM316 Sous-fragment D3) SEQ ID N° : 148 (codant NEM316 D4H) SEQ ID N° : 149 (codant 2603 D3+D4) SEQ ID N° : 150 (codant 2603 D3+D4H) SEQ ID N° : 151 (codant 2603 D2+D3+D4) 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GBS67 515) SEQ ID N° : 196 (fragment N-terminal de GBS67 515) SEQ ID N° : 197 (GBS67 NEM316) SEQ ID N° : 198 (fragment N-terminal de GBS67 NEM316) SEQ ID N° : 199 (fragment N-terminal de GBS67 NEM316) SEQ ID N° : 200 (GBS67 DK21) SEQ ID N° : 201 (fragment N-terminal de GBS67 DK21) SEQ ID N° : 202 (fragment N-terminal de GBS67 DK21) SEQ ID N° : 203 (GBS67 CJB110) SEQ ID N° : 204 (fragment N-terminal de GBS67 CJB110) SEQ ID N° : 205 (fragment N-terminal de GBS67 CJB110) SEQ ID N° : 206 (GBS1523 COH1) SEQ ID N° : 207 (GBS 1523 COH1 sans la région de la séquence signal) SEQ ID N° : 208 (GBS 1523 COH1 sans mutation en position 41) SEQ ID N° : 209 (GBS80-GBS1523 hybride) SEQ ID N° : 210 (GBS80-GBS1523 hybride) SEQ ID N° : 211 (GBS80-GBS1523 hybride) SEQ ID N° : 212 (GBS80-GBS1523 hybride) SEQ ID N° : 213 (GBS104 2603) SEQ ID N° : 214 (GBS1524) SEQ ID N° : 215 (GBS3 2603) SEQ ID N° : 216 (GBS3 2603 sans la région de la séquence signal) SEQ ID N° : 217 (GBS3 2603 hélice enroulée et segments riches en proline) SEQ ID N° : 218 (GBS3 2603 séquence signal et hélice enroulée) SEQ ID N° : 219 (GBS3 2603 segment hélice enroulée) SEQ ID N° : 220 (GBS3 2603 séquence signal, hélice enroulée et segment riche en proline) SEQ ID N° : 221 (GBS3 515) SEQ ID N° : 222 (GBS3 cjbl 11) SEQ ID N° : 223 (GBS3 cohl) SEQ ID N° : 224 (SAN1485 cohl) SEQ ID N° : 225 (GBS 147 2603) SEQ ID N° : 226 (GBS328 2603) SEQ ID N° : 227 (GBS84 2603) SEQ ID N° : 228-261 (amorces) SEQ ID N° : 262 (4H11/B7-VH séquence d’ADN) SEQ ID N° : 263 (4H11/B7-VH séquence d’acides aminés) SEQ ID N° : 264 (4H1 l/B7-VLk séquence d’ADN) SEQ ID N° : 265 (4H1 l/B7-VLk séquence d’acides aminés) SEQ ID N° : 266 (17C4/A3-VH séquence d’ADN) SEQ ID N° : 267 (17C4/A3-VH séquence d’acides aminés) SEQ ID N° : 268 (17C4/A3-VLk séquence d’ADN) SEQ ID N° : 269 (17C4/A3-VLk séquence d’acides aminés) SEQ ID N° : 270 (épitope de D3 lié par 4H11/B7 et 17C4/A3) SEQ ID N° : 271 (RrgB) SEQ ID N° : 272 (GSGGGG lieur) SEQ ID N° : 273 (GSGSGGGG lieur) SEQ ID N° : 274 (lieur avec dipeptide Leu-Glu) SEQ ID N° : 275 (étiquette Histidine) SEQ ID N° : 276 (GBS59(6XD3)GBS1523) SEQ ID N° : 277 (GSGS lieur) SEQ ID N° : 278 (amorce PCR 59pipeF) SEQ ID N° : 279 (amorce PCR 1523pipeR) SEQ ID N° : 280: (amorce PCR 59GSG41523.F) SEQ ID N° : 281: (amorce PCR 59GSG41523.R) SEQ ID N° : 282: (région de chevauchement) SEQ ID N° : 283: (amorce PCR 596xD3 Nhel F) SEQ ID N° : 284: (amorce PCR 1523 Xhol Stop R) SEQ ID N° : 285: (GBS1523D2+d3) SEQ ID N° : 286: (GBS1523d2+d3 avec séquence N-terminale additionnelle) SEQ ID N° : 287: (GBS1523di) SEQ ID N° : 288: (GBS1523di Variant) SEQ ID N° : 289: (GBS1523D2) SEQ ID N° : 290: (GBS1523D2 Variant) SEQ ID N° : 291: (GBS1523D3) SEQ ID N° : 292: (GBS1523D3 Variant) SEQ ID N° : 293: (GBS59(6xD3)-GBS1523D2+d3 protéine de fusion) SEQ ID N° : 294: (GBS59(7xD3sub)-GBS1523D2+d3 protéine de fusion) SEQ ID N° : 295:
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Claims (15)

  1. BE2015/5496 REVENDICATIONS BE2015/5496
    1. Conjugué comprenant un antigène et une molécule support, dans lequel la molécule support comprend un polypeptide BP-2a de Streptococcus agalactiae et un polypeptide spbl de Streptococcus agalactiae.
  2. 2. Conjugué selon la revendication 1, dans lequel le polypeptide spbl comprend : (a) la séquence d'acides aminés de SEQ ID N° : 206 ; ou (b) un fragment se composant des acides aminés 185 à 468 de (a) ; ou (c) une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec (a) ou (b).
  3. 3. Conjugué selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel le polypeptide BP-2a comprend : (a) une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 1, SEQ ID N° : 2, SEQ ID N° : 3, SEQ ID N° : 4, SEQ ID N° : 5, SEQ ID N° : 6 et SEQ ID N° : 7 ; ou (b) une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID N° : 36, SEQ ID N° : 38, SEQ ID N° : 40, SEQ ID N° : 42, SEQ ID N° : 44, SEQ ID N0 : 46 et SEQ ID N° : 48 ; ou (c) un fragment de moins de 200 acides aminés contigus de (a) ; ou (d) une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec (a), (b) ou (c).
  4. 4. Conjugué selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel la molécule support comprend 2 polypeptides BP-2 ou plus, dérivés de souches différentes de Streptococcus agalactiae en tant que polypeptide monocaténaire.
  5. 5. Conjugué selon la revendication 4, dans lequel molécule support comprend, comme polypeptide monocaténaire : (i) un polypeptide BP-2a comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 36, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec la SEQ ID N° : 36 ; (ii) un polypeptide BP-2a comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 38, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec la SEQ ID N° : 38 ; (iii) un polypeptide BP-2a comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 40, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec la SEQ ID N° : 40 ; (iv) un polypeptide BP-2a comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 42, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec la SEQ ID N° : 42 ; (v) un polypeptide BP-2a comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 44, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec la SEQ ID N° : 44 ; et (vi) un polypeptide BP-2a comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 46, ou une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% avec la SEQ ID N° : 46 ; et (vii) un polypeptide spbl compernant les acides aminés 185 à 468 de la SEQ ID N° : 206.
  6. 6. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 4 à 5, dans lequel la chaîne du polypeptide est de formule NH2-A-{-X-L-}jj-B-COOH, dans laquelle : A est une séquence d'acides aminés N-terminale optionnelle ; B est.une séquence d'acides aminés C-terminale optionnelle ; n est un entier de 2 ou plus (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, etc.) ; chaque X est une séquence d'acides aminés d'un polypeptide BP-2a ou d'un polypep spbl, dans laquelle au moins un X est un polypeptide BP-2a et au moins un X est un polypeptide spbl ; et L est une séquence de liaison d'acides aminés optionnelle.
  7. 7. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans lequel la chaîne du polypeptide comprend une séquence d'acides aminés ayant une identité d'au moins 70% (par exemple d'au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%) avec la SEQ ID N° : 276, en particulier une séquence d'acides aminés de la SEQ ID N° : 276.
  8. 8. Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'antigène est un saccharide.
  9. 9. Conjugué selon la revendication 8, dans lequel le saccharide est un saccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae.
  10. 10. Conjugué selon la revendication 9, dans lequel le saccharide est un saccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae de sérotype II ou V.
  11. 11. Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes pour une utilisation en médecine.
  12. 12. Composition pharmaceutique comprenant un conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
  13. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, comprenant un mélange de conjugués comprenant des saccharides provenant au moins de deux sérotypes de Streptococcus agalactiae choisis dans le groupe constitué par les types Ib, II, III et V.
  14. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, comprenant (i) des saccharides de Streptococcus agalactiae de sérotype la, Ib et III conjugués à CRM197 et (ii). un saccharide de Streptococcus agalactiae de sérotype II ou V conjugué à GBS80.
  15. 15. Procédé permettant de déclencher une réponse immunitaire chez un mammifère comprenant l'administration d'une quantité efficace immunologiquement d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 au mammifère.
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