JP2017523985A - 抗原用担体分子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗原及び担体分子を含むコンジュゲートであって、担体分子がBP-2a抗原及びspb1抗原を含む上記コンジュゲートを提供する。BP-2a及びspb1はストレプトコッカス・アガラクティエ抗原である。コンジュゲートは、コンジュゲートを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を惹起するための方法において使用し得る。コンジュゲートを含有する医薬組成物、特にワクチンも提供される。【選択図】 なし
Description
本発明は、抗原及び担体分子のコンジュゲート、並びにこれらのコンジュゲートを含むワクチンに関する。抗原は、典型的には糖類である。
糖類抗原の免疫原性を高めるための担体タンパク質へのコンジュゲーションの使用はよく知られており[例えば、参考文献1〜9等において概説されている]、特に小児ワクチン用に用いられている[10]。今日のワクチンにおいて広く用いられている3種の担体タンパク質は、破傷風トキソイド(TT)、ジフテリアトキソイド(DT)及びジフテリアトキソイド変異体のCRM197である。これらのタンパク質は、例えば連鎖球菌莢膜糖類及び髄膜炎菌莢膜糖類等の様々な糖類の担体として用いられている(例えば、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)血清型II及びIII由来の糖類の担体としてのTTの使用については参考文献11、またナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)血清型A、C、W135及びY由来の糖類の担体としてのTTの使用については参考文献12;さらに同じ髄膜炎菌糖類の担体としてのDT及びCRM197の使用については参考文献13及び14、またストレプトコッカス・アガラクティエ血清型Ia、Ib及びIII由来の糖類の担体としてのDT及びCRM197の使用については参考文献15を参照)。ワクチン中でのこれらの担体タンパク質の過剰使用について懸念が高まっており[例えば参考文献16を参照]、様々な代替的担体が提案されている(例えば参考文献17のインフルエンザ菌由来のタンパク質D)。しかし、多くの代替的担体タンパク質は、TT、DT及び/又はCRM197ほど有効ではない。従って、代替的な及び/又はより優れた担体タンパク質を見出す必要性が残されている。
従って、本発明の目的は、さらなる且つより優れた担体タンパク質、特に莢膜糖類のための担体タンパク質を提供することである。担体タンパク質をコンジュゲート中で用いて、感染又は薬物に対する防御免疫応答及び/又は治療免疫応答を誘導することができる。
本発明者らは、ストレプトコッカス・アガラクティエ(GBS)の2つの特定のポリペプチドである、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体が特に有効であることを見出した。これらの担体は用途が広く、様々な抗原、特に、例えば病原生物由来の糖類にコンジュゲートすることができる。結果として得られるコンジュゲートは、現在使用されている担体タンパク質(例えばCRM197)に基づくコンジュゲートより免疫原性であり得る。さらに、これらがGBS糖類の担体として用いられる場合、GBSに対するより高いレベルの保護免疫を提供し得る。
従って、本発明は、抗原及び担体分子を含むコンジュゲートであって、担体分子がBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む、上記コンジュゲートを提供する。担体分子は、典型的には、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを1本のポリペプチド鎖として含む(「ハイブリッド」ポリペプチド)。典型的には、抗原は糖類である。糖類は、任意の糖類、特に病原生物由来の糖類であり得る。例えば、糖類は、ストレプトコッカス・アガラクティエ、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、若しくは肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)由来の莢膜糖類、又はグルカンであり得る。糖類がストレプトコッカス・アガラクティエ由来の莢膜糖類である場合、糖類は、典型的には以下の血清型:Ia、Ib、II、III及びVの1つに由来し、特に血清型II又はVに由来する。ストレプトコッカス・アガラクティエの異なる株由来の糖類の担体としての本発明のポリペプチド担体の使用は、改善された免疫応答の提供又は複数株に対する保護の提供、これによるワクチンの適用範囲の拡大において有利であり得る。
糖類が髄膜炎菌由来の莢膜糖類である場合、これは、典型的には、以下の髄膜炎菌血清型:A、C、W135及びYの1つに由来する。糖類がグルカンである場合、これは、典型的にはラミナリンである。糖類が肺炎連鎖球菌由来の莢膜糖類である場合、これは、典型的には、以下の肺炎球菌血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33Fの1つに由来する。
異種糖類の(すなわち、例えばストレプトコッカス・アガラクティエにおいて天然には見られない糖類の)担体としての本発明のポリペプチド担体の使用は、2種以上の異なる微生物に対する保護の提供、これによるワクチン適用範囲の拡大において有利であり得る。
本発明はまた、本発明のコンジュゲートを製薬上許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。特に、本発明は、(i) 本発明によるコンジュゲート、(ii) CRM197にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型Ia、Ib及びIII由来の糖類、並びに(iii) GBS80にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型II又はV由来の糖類、を含む医薬組成物に関する。さらにより具体的に、本発明は、(i) GBS59(6XD3)-GBS1523担体にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型V由来の糖類、(ii) CRM197にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型Ia、Ib及びIII由来の糖類、並びに(iii) GBS80にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型II由来の糖類、を含む医薬組成物に関する。なおさらに具体的に、本発明は、(i) GBS59(6XD3)-GBS1523担体にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型II由来の糖類、(ii) CRM197にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型Ia、Ib及びIII由来の糖類、並びに(iii) GBS80にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型V由来の糖類、を含む医薬組成物に関する。
本発明はさらに、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、好適な哺乳動物における免疫応答を惹起する方法に関する。
本発明はさらに、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、好適な哺乳動物における免疫応答を惹起する方法に関する。
本発明は、抗原及び担体分子を含むコンジュゲートであって、担体分子がBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む、上記コンジュゲートに関わる。このコンジュゲートの特徴は、以下に詳細に記載されている。
B群連鎖球菌に関して、莢膜多糖(1つ又は複数)のみに基づくワクチンは、分類不可能な(NT)GBS感染からの最適な保護の誘発において有効ではないが、これはNT単離体が、極めて低レベルの莢膜を産生するか、又は9種の既知の血清型のいずれかから得られる抗血清とは反応しない改変された莢膜構造を有するためである。特に多糖の担体としてのGBSタンパク質抗原の使用は、非GBS担体(例えばCRM197)とは異なり、GBSタンパク質抗原がGBSに対して防御免疫応答を誘発するため、有利である。従って、ワクチン組成物におけるGBS多糖類(1つまたは複数)のタンパク質担体としての本発明のGBS担体分子の使用は、ワクチン適用範囲を増大させる。コロニー形成GBSの非流行血清型(例えば、IV型及びVII型)は、「血清型置換」と呼ばれるプロセスにおいて、現在優勢なコロニー形成血清型に対する多価ワクチンのワクチン接種を受けた集団において出現し得る。GBSワクチンにつおいて、本発明のコンジュゲートの使用はまた、血清型置換を取り巻くこのような懸念にも対処し得る。
担体分子
担体分子は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む。好ましくは、担体分子は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを1本のポリペプチド鎖として含む(「ハイブリッド」ポリペプチド)。
担体分子は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む。好ましくは、担体分子は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを1本のポリペプチド鎖として含む(「ハイブリッド」ポリペプチド)。
BP-2a
ストレプトコッカス・アガラクティエ(B群連鎖球菌、GBS)は、それぞれ別個の病原性アイランド、PI-1、PI-2a及びPI-2bによってコードされる3つの線毛変異体を有する[18、19]。各病原性アイランドは:線毛骨格タンパク質(BP);2つの補助タンパク質(AP1及びAP2);並びに線毛の会合に関与する2つのソルターゼタンパク質、をコードする、5つの遺伝子からなる。全てのGBS株は、これらの3つの病原性アイランドの少なくとも1つを有し、これらの病原性アイランドによってコードされる線毛構造タンパク質(BP、AP1及びAP2)の配列は、一般的に十分に保存されている。しかし、病原性アイランド2aによってコードされる骨格タンパク質の配列は、GBS株間で異なる。BP-2a線毛サブユニットは、少なくとも7つの分岐群を有し、これらの分岐群間の配列同一性は、48%とかなり低い。BP-2aポリペプチドは、GBS59又はSAL1486とも呼ばれる。
ストレプトコッカス・アガラクティエ(B群連鎖球菌、GBS)は、それぞれ別個の病原性アイランド、PI-1、PI-2a及びPI-2bによってコードされる3つの線毛変異体を有する[18、19]。各病原性アイランドは:線毛骨格タンパク質(BP);2つの補助タンパク質(AP1及びAP2);並びに線毛の会合に関与する2つのソルターゼタンパク質、をコードする、5つの遺伝子からなる。全てのGBS株は、これらの3つの病原性アイランドの少なくとも1つを有し、これらの病原性アイランドによってコードされる線毛構造タンパク質(BP、AP1及びAP2)の配列は、一般的に十分に保存されている。しかし、病原性アイランド2aによってコードされる骨格タンパク質の配列は、GBS株間で異なる。BP-2a線毛サブユニットは、少なくとも7つの分岐群を有し、これらの分岐群間の配列同一性は、48%とかなり低い。BP-2aポリペプチドは、GBS59又はSAL1486とも呼ばれる。
7つのBP2a分岐群の参照アミノ酸配列は、本明細書において、配列番号1(GBS 2603株由来)、配列番号2(GBS 515株由来)、配列番号3(GBS CJB111株由来)、配列番号4(GBS H36B株由来)、配列番号5(GBS CJB110株由来)、配列番号6(GBS DK21株由来)、及び配列番号7(GBS NEM316株由来)である。本発明者らは、BP-2aポリペプチドが、spb1ポリペプチドと組み合わせた場合に担体分子として有用であることを決定した。
本発明での使用のための好ましいBP-2aポリペプチドは:配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列;配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも20(例えば少なくとも25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250)個の連続したアミノ酸のフラグメント;又は配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列の前記フラグメントに対して前記同一性を有するアミノ酸配列;或いは配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列の20〜250個の連続したアミノ酸、25〜250個の連続したアミノ酸、30〜250個の連続したアミノ酸、40〜250個の連続したアミノ酸、50〜170個の連続したアミノ酸、50〜165個の連続したアミノ酸のフラグメント、を含む。本発明のBP-2aポリペプチドは、好ましくは少なくとも1つのCD4+T細胞エピトープを含む。好ましいフラグメントは、配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列のC末端から1個以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠如しており、及び/又はN末端から1個以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠如しているが、配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つのエピトープは保持している。他のフラグメントは、1つ以上のタンパク質ドメインが欠如している。
本発明のBP-2aポリペプチドは、少なくとも1つのCD4+T細胞エピトープを含む。CD4+T細胞は、Bリンパ球が抗原に対して抗体を産生するのを補助する[20]。T細胞エピトープは、経験的に(例えばPEPSCAN[21、22]又は類似の方法を使用して)同定することもできるし、又は、これらは(例えばJameson-Wolf抗原性指数[23]、マトリックスベースのアプローチ[24]、TEPITOPE[25]、ニューラルネットワーク[26]、OptiMer & EpiMer[27、28]、ADEPT[29]、T部位[30]、親水性[31]、抗原性指数[32]若しくは参考文献33において開示されている方法等を用いて)予測することもできる。
本発明での使用のための好ましいBP-2aポリペプチドは、重要なCD4+T細胞エピトープを含み得る免疫原性ドメインを含むか、又はこれらからなる。異なるBP-2a分岐群中に存在する例示的ドメインは、以下に提供される。
BP-2aタンパク質は、そのリーダーペプチドの末端とそのLPXTGアンカーの開始点の間を4つのドメイン(D1〜D4)に分けることができる。これらの4つのドメインは以下のように配列番号1〜7に含まれ、さらなるBP-2a配列中でのこれらの残基に対応する位置は、アライメントによって容易に同定することができる:
以下に同定されるドメインD3のサブフラグメント(配列番号36、38、40、42、44、46及び48)は、表面露出フラグメントである。本発明者らは、これらのD3サブフラグメントが、spb1ポリペプチドと組み合わせた場合に特に有効な担体であり得ることを同定した。
これらの表面露出フラグメント中の比較的小さなエピトープは、当業者が容易に同定し、本発明の組成物中で使用することができる。例えば、2つのモノクローナル抗体(17C4/A3及び4H11/B7、配列番号262〜269)が、515分岐群由来のD3サブフラグメント(配列番号38、配列番号2のフラグメント)中のアミノ酸411〜436(配列番号270)を含むエピトープに結合することが見出されている。以下に同定されるドメインD4のサブフラグメントは、ドメインD4のN末端に存在し、D4ドメインの残りの部分には存在しない2つのへリックス(本明細書中D4Hと呼ぶ)を含む。これらのへリックスは、表面に露出していると予測される。
従って、特定の実施形態において、本発明での使用のためのBP-2aポリペプチドは、上記ドメインから選択されるアミノ酸配列、上記ドメインの1つの少なくとも20個のアミノ酸のフラグメント、又は前記ドメイン若しくはフラグメントに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、本発明での使用のためのBP-2aポリペプチドは、D3フラグメント、又はその相同体を含む。D3フラグメントは、防御免疫応答を誘導することが示されている[34]。特に好ましい実施形態において、本発明での使用のためのBP-2aポリペプチドは、D3サブフラグメントを含むか又はこれからなる。このようなポリペプチドは、spb1ポリペプチドと組み合わせて用いられる場合に特に有効な担体であり得る。従って、本発明での使用のためのBP-2aポリペプチドは、上記で同定したドメインD3若しくはD3サブフラグメントを含むか又はこれらからなる配列番号1、2、3、4、5、6又は7のフラグメントからなり得る。本発明での使用のための特に好ましいBP-2aポリペプチドは:配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列;配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも20個(例えば、少なくとも25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個)の連続したアミノ酸のフラグメント;又は配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列の前記フラグメントに対して前記同一性を有するアミノ酸配列、を含む。本発明での使用のための他のBP-2aポリペプチドは、配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列の20個以下の連続したアミノ酸(例えば、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個以下の連続したアミノ酸)を含むか又はこれらからなるフラグメントを含む。D3サブフラグメントのフラグメント、例えば、配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列のC末端から1個以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠失している及び/又はN末端から1個以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠失しているが、配列番号36、38、40、42、44、46及び48からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つのエピトープを保持しているフラグメントが想定される。一部の場合においては、さらにより小さなフラグメントを使用してもよい。例えば、ポリペプチドは、配列番号78(配列番号3のアミノ酸411〜436)を含む配列番号3のフラグメントからなり得る。
D3フラグメント及びD3サブフラグメントは、本発明での使用のための好ましいBP-2aポリペプチドであるが、フラグメントは、ドメインD3由来のエピトープに加えて、ドメインD4、D2及び/又はD1を保持し得る。従って、本発明のポリペプチドは、上記で同定したi) ドメインD2及びD3;ii) ドメインD3及びD4;iii) ドメインD1、D2及びD3;又はiv) ドメインD2、D3及びD4を含むか又はこれらからなる配列番号1、2、3、4、5、6又は7のフラグメントからなり得る。例示的フラグメントは、以下に提供される。これらのフラグメントは、以下に示すようにドメインD2、D3、及びD4(又はD4H)の組み合わせを含む:
本発明で用いられるアミノ酸配列は、配列番号1、2、3、4、5、6若しくは7又はそのフラグメントと比較して、1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等)の保存的アミノ酸置換(すなわち1個のアミノ酸の、関連側鎖を有する別のアミノ酸との置換)を含み得る。遺伝子的にコードされるアミノ酸は、一般的に、4つのファミリー:(1) 酸性アミノ酸(すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸);(2) 塩基性アミノ酸(すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン);(3) 非極性アミノ酸(すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン);並びに(4) 非荷電極性アミノ酸(すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン)に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類される場合がある。一般的には、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物学的活性に大きな影響を与えない。ポリペプチドは、参照配列と比較して、1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等)の単一アミノ酸欠失を有し得る。ポリペプチドは、参照配列と比較して、1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等)の挿入(例えば、1、2、3、4又は5個のアミノ酸のそれぞれ)も含み得る。
好ましい実施形態において、担体は、2個以上のBP-2aポリペプチドを含む。本発明者らは、複数のBP-2aポリペプチドを含む担体は、spb1ポリペプチドと組み合わせて用いられる場合に特に有効な担体であり得ることを示した。従って、好ましい実施形態において、担体は、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個又は少なくとも7個のBP-2aポリペプチドを含む。2個以上のBP-2aポリペプチドが存在する場合、各BP-2aポリペプチドは、一般的には異なる株に由来する。
本発明のコンジュゲートは:配列番号1〜7からなる群より選択される少なくとも2つ(例えば、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ又は少なくとも7つ)のアミノ酸配列;配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列の、少なくとも20個(例えば25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はそれ以上)の連続したアミノ酸、若しくは20個以下(例えば25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個以下)の連続したアミノ酸の少なくとも2つのフラグメント;又は、配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するか、若しくは配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列の前記フラグメントに対して前記同一性を有する少なくとも2つのアミノ酸配列、を含み得る。
担体は、異なる株に由来する対応するBP-2aドメインを含み得る。例えば、担体は、2、3、4、5、6又は7種の異なる株由来のD3ドメイン又はD3サブフラグメントを含み得る。
一般的に、各BP-2aポリペプチドは、1本のポリペプチド鎖中に存在する。複数のBP-2aポリペプチドが1本のポリペプチド鎖中に存在する場合、これらはリンカーによって分離されていても良い。好適なリンカーとしては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ-グリシンリンカー(すなわち、Glyn(式中、n=2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上)を含むもの(配列番号295))、及びヒスチジンタグ(すなわち、Hisn(式中、n=3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上(配列番号296))が挙げられる。他の好適なリンカーアミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。非限定的例として、有用なリンカーとしては、GSGS(配列番号277)、GSGGGG(配列番号272)又はGSGSGGGG(配列番号273)を挙げることができる。BP-2aポリペプチド(及び場合によりリンカー)を含むポリペプチド鎖は、標準的な組換え発現技術を用いて融合ポリペプチドとして発現させることができる。本明細書中で使用される用語「1本のポリペプチド鎖」は、一般的に、全てのアミノ酸がペプチド結合により順に連結されているポリペプチド鎖を指す。「1本のポリペプチド鎖」は、通常、単一のDNA配列の発現によって生成される。しかし、代替的に又は付加的に、標準的な化学的コンジュゲーション技術を用いて(例えば、直鎖又は分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、炭水化物リンカーを用いて)、2つ以上のBP-2aポリペプチドを連結することもできる。例えば、リンカーは、リシン又はシステイン側鎖を介して結合させることができる。従って、一部の実施形態において、組換え融合タンパク質発現と化学的コンジュゲーション技術とを組み合わせて用いて、複数のBP-2aポリペプチドを含む1本のポリペプチド鎖を作製することができる。
異なるBP-2aポリペプチドは、ポリペプチド鎖中に任意の順序で存在し得る。例示的組み合わせが以下に示される。表中の各番号は、関連の配列番号を示す。
従って、本発明において使用するために適したBP-2aポリペプチドハイブリッドの例としては、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、又は配列番号87からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び前記配列に対して少なくとも70%(例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有する相同体が挙げられる。他の好適なBP-2aハイブリッドは、国際特許出願公開第WO2011/121576号中に開示されている。
spb1
本来のspb1(SAN1518;GBS1523)配列は、参考文献35において、細胞壁表面アンカーファミリータンパク質として注記された(GI:77408651又はUniprot受託番号Q8E479を参照)。用語「spb1」及び「GBS1523」は、本明細書中で互換的に用いられる。参照の目的で、COH1株において見られる完全長spb1のアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号206として示される。本発明での使用のための好ましいspb1ポリペプチドは、配列番号206のアミノ酸配列;配列番号206のアミノ酸配列の少なくとも20個(例えば25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はそれ以上)の連続したアミノ酸のフラグメント;配列番号206のアミノ酸配列の400個未満(例えば395、390、389、388、387、386、385、384、383個又はそれ未満)の連続したアミノ酸のフラグメント;又は配列番号206のアミノ酸配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号206のアミノ酸配列の前記フラグメントに対して前記同一性を有するアミノ酸配列、を含む。本発明の特定のspb1フラグメントとしては、フラグメントspb1D2+D3(実施例中でBP-2bD2+D3又はBP-2b185-468と呼ばれる)、完全長spb1のアミノ酸185〜468からなるフラグメント(特に配列番号285として示される配列番号206のアミノ酸185〜468)等が挙げられる。本発明者らは、spb1ポリペプチドが、BP-2aポリペプチドと組み合わせて用いられる場合に特に有効な担体であり得ることを示した。これらのspb1タンパク質としては、配列番号206の変異体が挙げられる。本発明のspb1ポリペプチドは、好ましくは少なくとも1つのCD4+T細胞エピトープを含む。好ましいフラグメントは、配列番号206のC末端から1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠失している及び/又はN末端から1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠失しているが、配列番号206の少なくとも1つのエピトープを保持している。他のフラグメントには、1つ以上のタンパク質ドメインが欠如している。
本来のspb1(SAN1518;GBS1523)配列は、参考文献35において、細胞壁表面アンカーファミリータンパク質として注記された(GI:77408651又はUniprot受託番号Q8E479を参照)。用語「spb1」及び「GBS1523」は、本明細書中で互換的に用いられる。参照の目的で、COH1株において見られる完全長spb1のアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号206として示される。本発明での使用のための好ましいspb1ポリペプチドは、配列番号206のアミノ酸配列;配列番号206のアミノ酸配列の少なくとも20個(例えば25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はそれ以上)の連続したアミノ酸のフラグメント;配列番号206のアミノ酸配列の400個未満(例えば395、390、389、388、387、386、385、384、383個又はそれ未満)の連続したアミノ酸のフラグメント;又は配列番号206のアミノ酸配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号206のアミノ酸配列の前記フラグメントに対して前記同一性を有するアミノ酸配列、を含む。本発明の特定のspb1フラグメントとしては、フラグメントspb1D2+D3(実施例中でBP-2bD2+D3又はBP-2b185-468と呼ばれる)、完全長spb1のアミノ酸185〜468からなるフラグメント(特に配列番号285として示される配列番号206のアミノ酸185〜468)等が挙げられる。本発明者らは、spb1ポリペプチドが、BP-2aポリペプチドと組み合わせて用いられる場合に特に有効な担体であり得ることを示した。これらのspb1タンパク質としては、配列番号206の変異体が挙げられる。本発明のspb1ポリペプチドは、好ましくは少なくとも1つのCD4+T細胞エピトープを含む。好ましいフラグメントは、配列番号206のC末端から1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠失している及び/又はN末端から1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45個又はそれ以上)のアミノ酸が欠失しているが、配列番号206の少なくとも1つのエピトープを保持している。他のフラグメントには、1つ以上のタンパク質ドメインが欠如している。
野生型spb1は、配列番号206のアミノ酸1〜30にN末端リーダー配列領域又はシグナル配列領域を含み、これはフラグメントでは除去することができる(例えば配列番号207)。代替的に又は付加的に、配列番号206のアミノ酸468〜502は、フラグメントでは除去することができる(例えば配列番号207)。代替的に又は付加的に、配列番号206のアミノ酸1〜185は、フラグメントでは除去することができる。従って、好ましい実施形態において、本発明での使用のためのspb1ポリペプチドは:配列番号207のアミノ酸配列;配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも20個(例えば25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はそれ以上)の連続したアミノ酸のフラグメント;配列番号207のアミノ酸配列の20個以下の連続したアミノ酸(例えば25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、260、270、280、290個以下、例えば283個の連続したアミノ酸)のフラグメント;又は配列番号206のアミノ酸配列に対して少なくとも70%(例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号207のアミノ酸配列の前記フラグメントに対して前記同一性を有するアミノ酸配列、を含む。特に好ましい実施形態において、spb1ポリペプチドは、配列番号207のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる。
野生型spb1配列は、配列番号206のアミノ酸468〜472に細胞壁アンカー(LPSTG)を示すアミノ酸モチーフを含む。一部の組換え宿主細胞系において、このモチーフを除去し、細胞からの組換えポリペプチドの分泌を促進することが好ましい場合がある。あるいは、細胞壁アンカーモチーフを使用して、組換え発現されたポリペプチドを細胞壁に固定することが好ましい場合がある。発現されたポリペプチドの細胞外ドメインは精製中に切断してもよいし、又は組換えポリペプチドは、最終組成物中で不活化宿主細胞若しくは細胞膜のいずれかに結合したままでもよい。配列番号206のアミノ酸419〜429に、保存されたグルタミン酸残基を含むEボックスも同定された(残基423に保存されたグルタミン酸を有する)。Eボックスモチーフは、オリゴマー線毛様構造の形成に重要である可能性があり、このためspb1の有用なフラグメントは、保存されたグルタミン酸残基を含み得る。コーディングヌクレオチド配列中のコドンのCAAからAAAへの突然変異の結果として配列番号206の位置41のグルタミン(Q)がリシン(K)に置換されている、spb1の変異体が同定されている。この置換は、spb1配列及びspb1フラグメント(例えば配列番号208)中に存在し得る。
ハイブリッドポリペプチド
典型的には、spb1ポリペプチド及びBP-2aポリペプチド(1つ又は複数)は、1本のポリペプチド鎖(「ハイブリッド」ポリペプチド)として発現される。ハイブリッドポリペプチドは、式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOHによって表すことが可能であり、式中、Aは任意のN末端アミノ酸配列であり;Bは任意のC末端アミノ酸配列であり;nは2以上の整数(例えば2、3、4、5、6等)であり;Xはそれぞれspb1ポリペプチド又はBP-2aポリペプチド(上記)のアミノ酸配列であり、少なくとも1個のXがspb1ポリペプチドであり、少なくとも1個のXがBP-2aポリペプチドであり;そしてLは任意のリンカーアミノ酸配列である。nが2である場合、X1が通常BP-2aポリペプチドであり、X2が通常spb1ポリペプチドである。nが2を上回る場合、spb1ポリペプチドはそれぞれ(2個以上存在する場合)、同一であっても異なっていてもよく、BP-2aポリペプチドはそれぞれ(2個以上存在する場合)、同一であっても異なっていてもよい。
典型的には、spb1ポリペプチド及びBP-2aポリペプチド(1つ又は複数)は、1本のポリペプチド鎖(「ハイブリッド」ポリペプチド)として発現される。ハイブリッドポリペプチドは、式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOHによって表すことが可能であり、式中、Aは任意のN末端アミノ酸配列であり;Bは任意のC末端アミノ酸配列であり;nは2以上の整数(例えば2、3、4、5、6等)であり;Xはそれぞれspb1ポリペプチド又はBP-2aポリペプチド(上記)のアミノ酸配列であり、少なくとも1個のXがspb1ポリペプチドであり、少なくとも1個のXがBP-2aポリペプチドであり;そしてLは任意のリンカーアミノ酸配列である。nが2である場合、X1が通常BP-2aポリペプチドであり、X2が通常spb1ポリペプチドである。nが2を上回る場合、spb1ポリペプチドはそれぞれ(2個以上存在する場合)、同一であっても異なっていてもよく、BP-2aポリペプチドはそれぞれ(2個以上存在する場合)、同一であっても異なっていてもよい。
それぞれのXのアミノ酸配列であるspb1ポリペプチド又はBP-2aポリペプチドは、上記に定義されるとおりである。これらのポリペプチドが、所与のspb1ポリペプチド又はBP-2aポリペプチド若しくはフラグメントに対して少なくとも特定のパーセンテージの同一性を有するアミノ酸配列を含むことについて定義される場合、同一性のレベルは、それぞれのXについて同じであリ得る。
{-X-L-}のそれぞれのnについて、リンカーアミノ酸配列-L-は、存在していても存在していなくてもよい。例えば、n=2である場合、上記ハイブリッドは、NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等であり得る。リンカーアミノ酸配列(1つまたは複数)である-L-は、典型的には短い(例えば20個以下、すなわち20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸)。例は、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ-グリシンリンカー(すなわちGlyn(式中、n=2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上)を含む(配列番号295))、及びヒスチジンタグ(すなわち、Hisn(式中、n = 3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上)(配列番号296))を含む。他の好適なリンカーアミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。有用なリンカーは、GSGS(配列番号277)、GSGGGG(配列番号272)又はGSGSGGGG(配列番号273)(ここでGly-SerジペプチドはBamHI制限部位から形成され、クローニング及び操作を助ける)、及び典型的なポリ-グリシンリンカーである(Gly)4テトラペプチド(配列番号297)である。他の好適なリンカー、特に最後のLnとして用いるためのリンカーは、Leu-Gluジペプチド又は配列番号274である。配列番号277は、異なるBP-2aポリペプチドを結合するために好ましい。配列番号272は、BP-2aポリペプチドとspb1ポリペプチドを結合するために好ましい。
-A-は、任意のN末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い(例えば40個以下、すなわち40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸)。例としては、タンパク質輸送を指令するリーダー配列、又はクローニング若しくは精製を容易にする短いペプチド配列(例えばヒスチジンタグ、すなわち、Hisn(式中、n=3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上である)(配列番号296))が挙げられる。他の好適なN末端アミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。X1がそれ自体のN末端メチオニンを欠く場合、-A-は、好ましくは、N末端メチオニンを提供する(例えば1、2、3、4、5、6、7又は8個のアミノ酸を有する)オリゴペプチドである(例えばMet-Ala-Ser、又は単一のMet残基)。好ましい-A-は、単一のMet残基である。
-B-は、任意のC末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い(例えば40個以下、すなわち39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸)。例としては、タンパク質輸送を指令する配列、クローニング若しくは精製を容易にする短いペプチド配列(例えば、ヒスチジンタグすなわちHisn(式中、n = 3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上(配列番号296)を含む、例えば配列番号275)、又はタンパク質安定性を高める配列が挙げられる。他の好適なC末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。好ましくは、-B-は存在しない。
-A-、-B-及び-L-配列が、ヒトポリペプチド配列と共通の10個以上の連続したアミノ酸を共有する配列を含まないことが好ましい。
特定の担体分子は、(i) GBSの515株、H36B株、CJB111株、2603株、CJB110株及びDK21株からなる群より選択される少なくとも1つのD3-サブフラグメント、及び(ii) spb1ポリペプチド又はそのフラグメント、の融合物を含み得る。さらに特に、担体分子は、(i) 配列番号38、配列番号42、配列番号40、配列番号36、配列番号44及び配列番号46からなる群より選択される少なくとも1つのD3サブフラグメント配列、及び(ii)配列番号207のspb1ポリペプチド、の融合物を含み得る。さらにより特に、担体分子は、(i) 配列番号38、配列番号42、配列番号40、配列番号36、配列番号44及び配列番号46からなる群より選択される少なくとも1つのD3サブフラグメント配列、及び(ii) spb1ポリペプチドのD2+D3フラグメント、特に配列番号206のアミノ酸185〜468を含むか又はこれらからなるフラグメント、の融合物を含み得る。
例示的ハイブリッドは、配列番号276に示される担体GBS59(6XD3)-GBS1523である。特定の実施形態において、本発明の担体分子は、配列番号276に対して少なくとも70%(例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列(配列番号276の長さにわたって決定される)を含む。特定のこのような実施形態において、担体分子は、少なくとも1つのspb1 CD4+T細胞エピトープと、BP-2a(515)、BP-2a(H36B)、BP-2a(CJB111)、BP-2a(2603)、BP-2a(CJB110)及びBP-2a(DK21)のそれぞれに由来する少なくとも1つのBP-2a CD4+T細胞エピトープを含む。
配列番号276のアミノ酸配列は、図12に模式的に示される。この特定の担体分子は、N末端からC末端に向けて以下の部分からなる:N末端メチオニン;515株由来のD3サブフラグメント(配列番号38);GSGSリンカー(配列番号277);H36B株由来のD3サブフラグメント(配列番号42);GSGSリンカー(配列番号277);CJB111株由来のD3サブフラグメント(配列番号40);GSGSリンカー(配列番号277);2603株由来のD3サブフラグメント(配列番号36);GSGSリンカー(配列番号277);CJB110株由来のD3サブフラグメント(配列番号44);GSGSリンカー(配列番号277);DK21株由来のD3サブフラグメント(配列番号46);GSGGGGリンカー(配列番号272);N-及びC末端欠失を有するspb1(配列番号207)。
当業者であれば、配列番号276に示すポリペプチドの配列の変異体及び配置の変動が、実施例中で示されるのと同じ有利な担体特性を示し得ることを理解するであろう。例えば、spb1ポリペプチドの配列は、「spb1」という標題の節において上記に説明したとおりに変動し得る。同様に、異なるBP-2aポリペプチドの数も変動してよく、また存在するそれぞれのBP-2aポリペプチドの配列も、「BP-2a」という標題の節において上記に説明したとおりに変動し得る。特定の実施形態において、担体は、異なる株に由来する少なくとも1個(すなわち、1、2、3、4、5、6、7個又はそれ以上)のBP-2aポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、担体は、少なくとも2個のBP-2aポリペプチドを含む。さらにより好ましくは、担体は、異なる株に由来する少なくとも4、5、6又は7個のBP-2aポリペプチドを含む。
BP-2a及びspb1ポリペプチドは、担体分子中に任意の順序で存在し得る。好ましい実施形態において、spb1ポリペプチドは、C末端に向かうか、又はC末端に存在する(すなわち、最後の-X-はspb1ポリペプチドである)。好ましい実施形態において、担体中に存在する全てのBP-2aポリペプチドは一緒にグループ化され、全てがspb1ポリペプチドに対してN末端又はC末端のいずれかにある。好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、式NH2-A-{-XBP-2a-L-}n-Xspb1-L-B-COOH(式中、nは、少なくとも1、好ましくは少なくとも2であり、それぞれのXBP-2aは異なる株に由来する)によって表すことができる。
担体は、spb1及びBP-2aポリペプチドに加えて他のポリペプチドを含み得る。例えば、担体は、GBS80及び/又はGBS67ポリペプチド、又はその相同体若しくはフラグメントを含み得る。GBS80及びGBS67ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号177-205に示される。GBS80は、Uniprotにおいて受託番号Q8E0S9として同定されるSAG0645(細胞壁表面アンカーファミリータンパク質)としても知られている。
ハイブリッドポリペプチドは、上記のとおり、組換え融合タンパク質発現法、化学的コンジュゲーション技術又は任意の組み合わせを用いて作成することができる。
非天然アミノ酸を組み込むように改変された担体分子
本発明はまた、非天然アミノ酸を組み込むように改変された担体分子にも関する。非天然アミノ酸を用いて、担体分子を別の分子にコンジュゲートすることができる。
本発明はまた、非天然アミノ酸を組み込むように改変された担体分子にも関する。非天然アミノ酸を用いて、担体分子を別の分子にコンジュゲートすることができる。
一部の代替法において、担体分子は、1個以上(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)の非天然アミノ酸を含む。非天然アミノ酸は、標準的アミノ酸で構成されるタンパク質において反応のために利用し得る官能基(例えばリシンのアミノ基又はシステインのスルフヒドリル基)とは異なる反応プロファイルを有する官能基を有し得る。このことは、化学選択的反応が、非天然アミノ酸がタンパク質に組み込まれた所定の部位で部位選択的コンジュゲーションが行われることを可能とすることを意味する。
例えば、担体分子は、1個以上のL-ホモアリルグリシン(HAG)残基を含み得る。典型的には、HAG残基は、配列中のメチオニン残基の代わりに置換されている。HAG(化学的にはL-2-アミノ-5-ヘキセン酸として知られている)はメチオニンの類似体であり、反応性アルケン部位を含む。HAGは、タンパク質合成の開始ステップ及び伸長ステップの両方においてメチオニンの代わりとなり得る。HAGは、チイル-エン機構を介して反応する、標準的アミノ酸中に見られる官能基とは異なる反応プロファイルを有するオレフィン側鎖を有する。
他の実施形態において、担体分子は、所定の部位において部位選択的コンジュゲーションが行われることを可能にする他の非天然アミノ酸を含むように改変することができる。例えば、担体分子は、1個以上(例えば1、2、3、4、5個等)のp-アセチルフェニルアラニン残基がその配列中に含まれるように改変することができる。このアミノ酸は、任意の標準的アミノ酸中には存在しないケト官能基を有し、従って、上記アミノ酸は穏やかな水性条件下でヒドラジン、アルコキシアミン及びセミカルバジドと特異的に反応して、ヒドラゾン、オキシム及びセミカルバゾン結合を生成することができる。ケト官能基を有する他のアミノ酸としては、m-アセチルフェニルアラニン及びp-ベンゾイルフェニルアラニンが挙げられ、これらの残基は同じように用いることができる。
他の実施形態において、担体分子は、例えば1個以上(例えば1、2、3、4、5個等)のp-アジドフェニルアラニン残基の組み込みにより、アジド基(これも標準的アミノ酸中では生じない)を含むように改変することができる。アジド基は、銅(I)触媒される[2+3]環付加反応を介してコンジュゲーションパートナー上のアセチレン基と反応することができる。逆に、1個以上(例えば1、2、3、4、5個等)のp-プロパルギルオキシフェニルアラニン残基の組み込みによって、非天然アセチレン基を担体タンパク質に入れることが可能であり、これを同じメカニズムを介してコンジュゲーションパートナー上のアジド基と反応させることができる。
なおさらなる実施形態において、担体分子は、1個以上(例えば1、2、3、4、5個等)のフェニルセレノシステイン残基を含むように改変することができる。この残基の過酸化水素による処理は、そのチオール基へのコンジュゲーションを可能とする。
抗原
抗原は、典型的には糖類である。抗原が糖類である場合、糖類は、任意の糖類、特に病原生物由来の糖類であり得る。本発明において使用するための例示的糖類は以下に記載される。特に、糖類は、細菌糖類(例えば細菌莢膜糖類)であり得る。代表的な細菌糖類は、図13に記載されている。
抗原は、典型的には糖類である。抗原が糖類である場合、糖類は、任意の糖類、特に病原生物由来の糖類であり得る。本発明において使用するための例示的糖類は以下に記載される。特に、糖類は、細菌糖類(例えば細菌莢膜糖類)であり得る。代表的な細菌糖類は、図13に記載されている。
糖類は、オリゴ糖類の形態で使用することができる。これらは精製多糖類の断片化により(例えば加水分解により)好都合に形成され、通常、その後に所望のサイズのフラグメントの精製が行われる。糖類は、天然源から精製することができる。多糖類の断片化は、典型的には、30未満(例えば10〜20、約10(例えば血清型Aについて);15〜25(例えば血清型W135及びYについて)、約15〜20;12〜22(例えば血清型Cについて);等)のオリゴ糖の最終平均重合度(DP)を与えるように行われる。DPは、イオン交換クロマトグラフィー又は比色アッセイによって好都合に測定することができる[36]。
加水分解を行う場合、加水分解物は、一般的に、短い長さのオリゴ糖を除去するためにサイズ分類される[37]。これは、様々な方法(例えば、限外ろ過、その後イオン交換クロマトグラフィー)で達成することができる。約6以下の重合度を有するオリゴ糖類は、好ましくは除去され(例えば、血清型Aについて)、また約4未満のものは、好ましくは除去される(例えば、血清型W135及びYについて)。
糖類の化学的加水分解は、一般的に、当技術分野において標準的な条件下での酸又は塩基のいずれかによる処理を伴う。莢膜糖類の、それらの構成単糖類への脱重合の条件は当技術分野において公知である。1つの脱重合法は、過酸化水素の使用を伴う[38]。過酸化水素を糖類に添加し(例えば1%の最終H2O2濃度を与える)、この混合物を、その後所望の鎖長低減が達成されるまで(例えば約55℃で)インキュベートする。経時的低減は、混合物からサンプルを採り、次いでサンプル中の糖類の(平均)分子サイズを測定することにより追跡することができる。その後、所望の鎖長に達したら、急速冷却により脱重合を停止させることができる。
精製の代わりに、完全合成又は部分合成によって糖類を得ることができる。
精製の代わりに、完全合成又は部分合成によって糖類を得ることができる。
抗原が糖類ではない場合、これは任意の他の抗原(すなわち、任意の免疫原又はハプテン)であってもよい。本発明のコンジュゲートは、担体分子にコンジュゲートしたハプテンに対する免疫応答を誘発することができる。ハプテンは、例えば、乱用薬物であってもよい[39]。例としては、限定するものではないが、オピエート、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツール酸塩、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタカロン、ベンゾジアゼピン、LSD、ニコチン、抗コリン薬、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神異常発現薬、鎮静剤、フェンシクリジン、サイロシビン、揮発性亜硝酸塩、及び身体的及び/又は精神的依存症を誘導する他の薬物が挙げられる。
ストレプトコッカス・アガラクティエ莢膜糖類
好ましい例示的細菌莢膜糖類として、ストレプトコッカス・アガラクティエ由来のものが挙げられる。実施例は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体が、GBS糖類用の有効な担体であり得ることを示す。さらに、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体は、有用な保護をもたらす担体特異的免疫応答を誘導し得る。
好ましい例示的細菌莢膜糖類として、ストレプトコッカス・アガラクティエ由来のものが挙げられる。実施例は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体が、GBS糖類用の有効な担体であり得ることを示す。さらに、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体は、有用な保護をもたらす担体特異的免疫応答を誘導し得る。
GBS莢膜糖類は、GBSのペプチドグリカン骨格に共有結合しており、また上記ペプチドグリカン骨格に結合している別の糖類であるB群抗原とは異なる。
GBS莢膜糖類は化学的に関連しており、全てのGBS莢膜糖類は、以下の三糖類コア:
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
を共有している。
GBS莢膜糖類は化学的に関連しており、全てのGBS莢膜糖類は、以下の三糖類コア:
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
を共有している。
様々なGBS血清型は、このコアが改変される方法によって異なる。例えば、血清型IaとIIIの差は、このコアにおいて連続する三糖類コアを結合するために、GlcNAc(Ia)又はGal(III)のいずれを使用するかによって起こる。血清型Ia及びIbはいずれもコア中にGlcNAcに結合している[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(1→]二糖を有するが、結合は、1→4(Ia)又は1→3(Ib)のいずれかである。
GBS関連疾患は、主に血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、及びVIIIから起こり、その85%超は、5種の血清型:Ia、Ib、II、III及びVによって引き起こされる。本発明は、これらの8種の血清型の1種以上に由来する糖類、特に血清型Ia、Ib、II、III、IV及びVからなる群より選択される血清型の1種以上に由来する糖類、さらにより特に、血清型Ia、Ib、II、III及びVからなる群より選択される1種以上の多糖類を使用し得る。これらの血清型のそれぞれの莢膜糖類は、三糖類コア中に:(a) 末端N-アセチル-ノイラミン酸(NeuNAc)残基(一般的にはシアル酸と呼ばれる)(全ての場合において、ガラクトース残基に2→3結合している);及び(b) N-アセチル-グルコサミン残基(GlcNAc)を含む。
5種全ての糖類は、三糖類コア中にガラクトース残基を含むが、血清型Ia、Ib、II及びIIIはまた、各反復単位中に付加的なガラクトース残基を含む。
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、血清型II莢膜糖類又は血清型V莢膜糖類を含む。実施例は、本発明のBP-2a/spb1担体が、血清型II莢膜糖類及び血清型V莢膜糖類用の特に有効な担体であり、またCRMより有効であり得ることを示す。特に好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、血清型II莢膜糖類を含む。実施例は、本発明のBP-2a/spb1担体が、血清型II莢膜糖類用の特に有効な担体であり得ることを示す。
本発明により使用される糖類は、それらの天然型であってもよく、又は改変されていてもよい。例えば、糖類は、天然の莢膜糖類より短くてもよく、又は化学的に改変されていてもよい。特に、本発明において用いられる血清型V莢膜糖類は、参考文献40及び41に記載されるように改変され得る。例えば、血清型V莢膜糖類は、実質的に脱シアル化されている。脱シアル化GBS血清型V莢膜糖類は、精製GBS血清型V莢膜糖類を穏やかな酸性条件下で処理(例えば0.1M硫酸、80℃にて60分間)することにより、又は参考文献40に記載されるように、ノイラミニダーゼによる処理によって調製することができる。従って、本発明により使用される糖類は、天然に見出されるような実質的に完全長の莢膜多糖であってもよく、又は天然の長さより短くてもよい。完全長多糖類を、例えば穏やかな酸中での加水分解、加熱、サイズ分類クロマトグラフィー等によって脱重合させて、本発明での使用のためのより短いフラグメントを与えることもできる。特に、本発明において使用される血清型II及び/又はIII莢膜糖類は、参考文献42及び43に記載されているように脱重合させることができる。
糖類は、天然に見出される莢膜糖類と比較して化学的に改変されていてよい。例えば、糖類は、脱-O-アセチル化(部分的に又は完全に)、脱-N-アセチル化(部分的に又は完全に)、N-プロピオネート化(部分的に又は完全に)等されていてもよい。脱-アセチル化は、コンジュゲーションの前、最中又は後に起こり得るが、好ましくはコンジュゲーションの前に起こる。特定の糖類により、脱-アセチル化は、免疫原性に影響を及ぼす場合もあれば、影響を及ぼさない場合もある。様々な血清型のGBS糖類上のO-アセチル化の関連性は参考文献44に論じられており、一部の実施形態において、7、8及び/又は9位におけるシアル酸残基のO-アセチル化は、コンジュゲーションの前、最中及び後に、例えば保護/脱保護、再アセチル化等によって保持される。しかし、典型的には、本発明において使用されるGBS糖類は、7、8及び/又は9位におけるシアル酸残基のO-アセチル化を実質的に有さない。特に、GBS糖類が以下に記載される塩基抽出により精製された場合、O-アセチル化は、典型的には失われる。脱-アセチル化等の影響は、日常的なアッセイによって評価することができる。
莢膜糖類は、参考文献45に記載されているとおり、公知技術によって精製することができる。典型的な方法は、塩基抽出、遠心分離、ろ過、RNase/DNase処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、及びさらなる限外ろ過を伴う。細菌細胞壁を切断して細胞壁成分を遊離させる酵素ムタノリシン(mutanolysin)によるGBS細胞の処理も有用である。
代替法として、参考文献46中に記載されている精製法を用いることができる。この方法は、塩基抽出、エタノール/CaCl2処理、CTAB沈殿、及び再可溶化を伴う。さらなる代替的方法は、参考文献47に記載されている。
髄膜炎菌莢膜糖類
本発明の担体で使用するための例示莢膜糖類としては、髄膜炎菌由来のものが挙げられる。この生物の莢膜多糖類に基づき、例えばA、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y及びZ等の様々な髄膜炎菌の血清型が同定されている。本発明における糖類は、これらの血清型のいずれに由来するものであっても良い。典型的には、糖類は、以下の髄膜炎菌血清型A、C、W135及びYの1つに由来する。
本発明の担体で使用するための例示莢膜糖類としては、髄膜炎菌由来のものが挙げられる。この生物の莢膜多糖類に基づき、例えばA、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y及びZ等の様々な髄膜炎菌の血清型が同定されている。本発明における糖類は、これらの血清型のいずれに由来するものであっても良い。典型的には、糖類は、以下の髄膜炎菌血清型A、C、W135及びYの1つに由来する。
血清型C、W135及びY
髄膜炎菌由来の莢膜多糖類を調製するための技術は長年知られており、典型的には、多糖類沈殿(例えばカチオン性界面活性剤を使用する)、エタノール分別、冷フェノール抽出(タンパク質を除去するため)及び超遠心分離(LPSを除去するため)のステップを含む方法を伴う[例えば、参考文献48を参照]。
髄膜炎菌由来の莢膜多糖類を調製するための技術は長年知られており、典型的には、多糖類沈殿(例えばカチオン性界面活性剤を使用する)、エタノール分別、冷フェノール抽出(タンパク質を除去するため)及び超遠心分離(LPSを除去するため)のステップを含む方法を伴う[例えば、参考文献48を参照]。
より好ましい方法[49]は、多糖類沈殿の後、低級アルコールを用いた沈殿多糖類の可溶化を伴う。沈殿は、テトラブチルアンモニウム塩及びセチルトリメチルアンモニウム塩(例えば臭化物塩)、又はヘキサジメトリンブロミド塩及びミリスチルトリメチルアンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤を用いて達成することができる。セチルトリメチルアンモニウムブロミド(「CTAB」)が特に好ましい[50]。沈殿物の可溶化は、低級アルコール(例えばメタノール、プロパン-1-オール、プロパン-2-オール、ブタン-1-オール、ブタン-2-オール、2-メチル-プロパン-1-オール、2-メチル-プロパン-2-オール、ジオール等)を用いて達成することができるが、CTAB-多糖類複合体を可溶化するためにはエタノールが特に好適である。沈殿多糖類にエタノールを加えて、50%〜95%の最終エタノール濃度(エタノール及び水の総含有量に対して)を与えることができる。
再可溶化後、多糖類をさらに処理して夾雑物を除去することができる。これは、微量のコンタミネーションも許容不可能な状況(例えばヒトワクチン製造用)において特に重要である。これは、典型的には、1回以上のろ過ステップ(例えば、深層ろ過(活性炭を介したろ過を用いてもよい)、サイズろ過及び/又は限外ろ過)を伴う。一旦ろ過して夾雑物を除去すると、多糖類は、さらなる処理及び/又は加工のために沈殿させることができる。これは、(例えばカルシウム塩又はナトリウム塩の添加により)カチオンを交換することによって、好都合に達成することができる。精製後、以下に記載されるように莢膜糖類を担体タンパク質にコンジュゲートさせる。髄膜炎菌糖類の精製及びコンジュゲーションのための更なる代替法は、参考文献38及び51に開示されている。精製の代わりに、本発明の莢膜糖類は、完全合成又は部分合成によって得ることができる(例えば、Hib合成は参考文献52に開示されており、MenA合成は参考文献53に開示されている)。
糖類は、化学的に改変することが可能であり、例えば、O-アセチル化されてもよく、又は脱-O-アセチル化されてもよい。任意のこのような脱-O-アセチル化又は高アセチル化は、糖類中の特定の位置に存在し得る。例えば、大部分の血清型C株は、シアル酸残基のC-7位及び/又はC-8位にO-アセチル基を有するが、臨床的単離株の約15%には、これらのO-アセチル基が欠如している[54、55]。アセチル化は、保護効力に影響を及ぼすと考えられない(例えば、Menjugate(商標)製品とは異なり、NeisVac-C(商標)製品は脱-O-アセチル化糖類を用いるが、いずれのワクチンも有効である)。血清型W135糖類は、シアル酸-ガラクトース二糖単位のポリマーである。血清型Y糖類は、二糖反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清型W135糖類に類似している。血清型C糖類と同様に、MenW135及びMenY糖類は種々のO-アセチル化を有するが、7位及び9位のシアル酸に有する[56]。任意のこのような化学的改変は、好ましくはコンジュゲーション前に起こるが、代替的に又は付加的に、コンジュゲーション中に起こリ得る。
異なる血清型由来の糖類は、好ましくは別々に精製され、その後、コンジュゲーションの前または後のいずれかに組み合わせることができる。
血清型A
本発明のコンジュゲートは、血清型A莢膜糖類抗原を含み得る。この糖類は、血清型C、W135及びYと構造的には異なるが(血清型C、W135及びYの莢膜は、シアル酸(N-アセチル-ノイラミン酸、NeuAc)に基づくが、血清型Aの莢膜は、シアル酸の天然の前駆体であるN-アセチル-マンノサミンに基づく)、血清型C、W135及びYと同じ方法(上記参照)で精製及びコンジュゲートされ得る。血清型A糖類は、加水分解に特に感受性であり、その水性媒体中での不安定性は、(a) 血清型Aに対する液体ワクチンの免疫原性が経時的に低下し、また(b) 糖加水分解産物のワクチン中への放出に起因して品質管理がより難しい、ことを意味する。
本発明のコンジュゲートは、血清型A莢膜糖類抗原を含み得る。この糖類は、血清型C、W135及びYと構造的には異なるが(血清型C、W135及びYの莢膜は、シアル酸(N-アセチル-ノイラミン酸、NeuAc)に基づくが、血清型Aの莢膜は、シアル酸の天然の前駆体であるN-アセチル-マンノサミンに基づく)、血清型C、W135及びYと同じ方法(上記参照)で精製及びコンジュゲートされ得る。血清型A糖類は、加水分解に特に感受性であり、その水性媒体中での不安定性は、(a) 血清型Aに対する液体ワクチンの免疫原性が経時的に低下し、また(b) 糖加水分解産物のワクチン中への放出に起因して品質管理がより難しい、ことを意味する。
天然のMenA莢膜糖類は、C3及びC4に部分的O-アセチル化を有する(α1→6)-結合N-アセチル-D-マンノサミン-1-ホスフェートのホモポリマーである。主なグリコシド結合は、D-マンノサミンのC1のヘミアセタール基とC6のアルコール基が関与する1-6ホスホジエステル結合である。平均鎖長は93モノマーである。これは、以下の式:
を有する。
天然の血清型A糖類の免疫原性活性を保持しているが、水中ではるかに安定である改変糖類抗原が調製されている。単糖単位の炭素3及び4に結合しているヒドロキシル基は、ブロッキング基で置換される[参考文献57及び58]。
ヒドロキシルの代わりにブロッキング基を有する単糖単位の数は変動し得る。例えば、全ての又は実質的に全ての単糖単位がブロッキング基を有していてもよい。あるいは、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又は90%の単糖単位がブロッキング基を有していてもよい。少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30個の単糖単位がブロッキング基を有していてもよい。
同様に、単糖単位上のブロッキング基の数は変動し得る。例えば、任意の特定の単糖単位上のブロッキング基の数は、1個又は2個であり得る。
末端単糖単位は、その天然のヒドロキシルの代わりにブロッキング基を有していても、有していなくてもよい。さらなる反応(例えばコンジュゲーション)のための操作を提供するため、末端単糖単位上に遊離アノマーヒドロキシル基を保持することが好ましい。アノマーヒドロキシル基を、還元的アミノ化(例えばNaBH3CN/NH4Clを用いる)によってアミノ基(-NH2又は-NH-E(式中、Eは窒素保護基である))に変換し、その後、他のヒドロキシル基がブロッキング基に変換された後に再生することができる。
ヒドロキシル基を置換するためのブロッキング基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して(すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を別の基と置換することにより)直接得ることができる。ブロッキング基として作用するヒドロキシル基の好適な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カーボネート、エステル、エーテル(例えばシリルエーテルまたはアルキルエーテル)及びアセタールである。このようなブロッキング基の幾つかの具体例は、アリル、アロック(alloc)、ベンジル、BOM、t-ブチル、トリチル、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等である。直接得ることが不可能であり、ヒドロキシル基を完全に置換する他のブロッキング基としては、C1-12アルキル、C3-12アルキル、C5-12アリール、C5-12アリール-C1-6アルキル、NR1R2(R1及びR2は以下の段落に定義される)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6アルキル)、CN、CF3、CCl3等が挙げられる。
典型的なブロッキング基は、式-O-X-Y又は-OR3のブロッキング基であり、式中、Xは、C(O)、S(O)又はSO2であり;Yは、C1-12アルキル、C1-12アルコキシ、C3-12シクロアルキル、C5-12アリール又はC5-12アリール-C1-6アルキル(これらのそれぞれは、場合によりF、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6アルキル)、CN、CF3又はCCl3から独立して選択される1、2又は3個の基で置換されていてもよい)であり;又はYは、NR1R2であり;R1及びR2は、H、C1-12アルキル、C3-12シクロアルキル、C5-12アリール、C5-12アリール-C1-6アルキルから独立して選択され;又はR1及びR2は、一緒になって、C3-12飽和複素環式基を形成していてよく;R3は、C1-12 アルキル又はC3-12 シクロアルキル(これらのそれぞれは、場合によりF、Cl、Br、CO2(C1-6アルキル)、CN、CF3又はCCl3から独立して選択される1、2又は3個の基で置換されていてもよい)であり、;又はR3は、C5-12アリール又はC5-12アリール-C1-6アルキル(これらのそれぞれは、場合によりF、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6アルキル)、CN、CF3又はCCl3から選択される1、2、3、4又は5個の基で置換されていてもよい)である。R3がC1-12アルキル又はC3-12シクロアルキルである場合、これは、典型的には上記に定義した1、2又は3個の基で置換されている。R1及びR2が、一緒になって、C3-12飽和複素環式基を形成する場合、これは、R1及びR2が、窒素原子と一緒になって、3〜12の間の任意の数の炭素原子(例えばC3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)を含む飽和複素環式基を形成することを意味する。上記の複素環式基は、窒素原子以外に1又は2個のヘテロ原子(例えばN、O又はS)を含有し得る。C3-12飽和複素環式基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニル及びアジリジニルである。
ブロッキング基-O-X-Y及び-OR3は、ヒドロキシル基と、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニル等との反応等の標準的な誘導体化法によって-OH基から調製することができる。従って、-O-X-Y中の酸素原子は、通常はヒドロキシル基の酸素原子であり、-O-X-Y中の-X-Y基は、通常、ヒドロキシル基の水素原子を置換する。
あるいは、ブロッキング基は、Mitsonobu型置換等の置換反応を介して到達可能であり得る。ヒドロキシル基からブロッキング基を調製するためのこれらの及び他の方法は、よく知られている。
本発明において使用するための具体的なブロッキング基は、-OC(O)CF3[59]及びカルバメート基OC(O)NR1R2(R1及びR2は、C1-6アルキルから独立して選択される)である。典型的には、R1及びR2はいずれもメチルである(すなわちブロッキング基は-OC(O)NMe2である)。カルバメートブロッキング基は、グリコシド結合の安定化効果を有し、穏やかな条件下で調製することができる。
特に好ましいブロッキング基は、-OC(O)CH3である[58]。このブロッキング基を有する改変髄膜炎菌血清型A糖類における4位及び/又は3位の割合は、変動し得る。例えば、ブロッキング基を有する4位の割合は、約0%、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は約100%であってよく、少なくとも80%〜約100%が好ましい。同様に、ブロッキング基を有する3位の割合は、約0%、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は約100%であってよく、少なくとも80%〜約100%が好ましい。典型的には、ブロッキング基を有する4位及び3位の割合は、各位置において大体同じである。言い換えれば、ブロッキング基を有する4位とブロッキング基を有する3位との比は約1:1である。しかし、一部の実施形態において、ブロッキング基を有する4位の割合は、ブロッキング基を有する3位の割合に対して変動し得る。例えば、ブロッキング基を有する4位のブロッキング基を有する3位に対する比は、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3又は1:2であり得る。同様に、ブロッキング基を有する3位のブロッキング基を有する4位に対する比は、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3又は1:2であり得る。
典型的な改変MenA糖類はn個の単糖単位を含み、ここで少なくともh%の単糖単位は3位及び4位のいずれにも-OH基を有さない。hの値は、24以上(例えば25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99又は100)であり、通常は50以上である。不在-OH基は、上記に定義したブロッキング基である。
他の典型的な改変MenA糖類は単糖単位を含み、ここで少なくともs個の単糖単位は、3位に-OHを有さず、且つ4位に-OHを有さない。sの値は、少なくとも1(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)である。不在-OH基は、上記に定義したブロッキング基である。
本発明での使用のための好適な改変MenA糖類は、以下の式:
(式中、
nは、1〜100の整数(特に5〜25、通常は15-25の整数)であり;
Tは、式(A)又は(B):
で表され、
各Z基は、OH又は上記に定義したブロッキング基から独立して選択され;
各Q基は、OH又は上記に定義したブロッキング基から独立して選択され;
Yは、OH又は上記に定義したブロッキング基から選択され;
Eは、H又は窒素保護基であり;
またここでQ基の約7%超(例えば8%、9%、10%又はそれ以上)はブロッキング基である)を有する。
nは、1〜100の整数(特に5〜25、通常は15-25の整数)であり;
Tは、式(A)又は(B):
各Z基は、OH又は上記に定義したブロッキング基から独立して選択され;
各Q基は、OH又は上記に定義したブロッキング基から独立して選択され;
Yは、OH又は上記に定義したブロッキング基から選択され;
Eは、H又は窒素保護基であり;
またここでQ基の約7%超(例えば8%、9%、10%又はそれ以上)はブロッキング基である)を有する。
一部の実施形態において、式(A)中の炭素1に結合しているヒドロキシル基は、上記に定義したブロッキング基で置換される。一部の実施形態において、式(B)中のEは、リンカー又は本発明の担体分子である。Eがリンカーである場合、リンカーは、本発明の担体分子に共有結合することができる。
n+2個のZ基のそれぞれは、互いに同一であっても異なっていてもよい。同様に、n+2個のQ基のそれぞれは、互いに同一であっても異なっていてもよい。全てのZ基がOHであってもよい。あるいは、Z基の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%又は60%がOAcであってもよい。典型的には、Z基の約70%がOAcであり、残りのZ基がOH又は上記に定義したブロッキング基である。Q基の少なくとも約7%はブロッキング基である。典型的には、Q基の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又はさらに100%がブロッキング基である。
グルカン
糖類は、グルカンであってもよい。グルカンは、とりわけ真菌の細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。α-グルカンは、グルコースサブユニット間に1個以上のα-結合を含むが、β-グルカンは、グルコースサブユニット間に1個以上のβ-結合を含む。本発明により使用されるグルカンはβ結合を含み、またβ結合のみを含んでいてもよい(すなわちα結合を含まない)。
糖類は、グルカンであってもよい。グルカンは、とりわけ真菌の細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。α-グルカンは、グルコースサブユニット間に1個以上のα-結合を含むが、β-グルカンは、グルコースサブユニット間に1個以上のβ-結合を含む。本発明により使用されるグルカンはβ結合を含み、またβ結合のみを含んでいてもよい(すなわちα結合を含まない)。
グルカンは、1個以上のβ-1,3-結合及び/又は1個以上のβ-1,6-結合を含み得る。これは、1個以上のβ-1,2-結合及び/又はβ-1,4-結合も含み得るが、通常、その唯一のβ結合は、β-1,3-結合及び/又はβ-1,6-結合である。グルカンは、分岐鎖であっても直鎖であってもよい。
完全長天然β-グルカンは不溶性であり、メガダルトン範囲の分子量を有する。本発明のコンジュゲートにおいては可溶性グルカンを用いることが好ましい。可溶化は、長い不溶性グルカンを断片化することによって達成することができる。これは、加水分解によって達成することができるか、又は、さらに好都合には、グルカナーゼによる(例えばβ-1,3-グルカナーゼ又はβ-1,6-グルカナーゼによる)消化によって達成することができる。代替法として、単糖構成単位を結合することにより、短いグルカンを合成的に調製することができる。
低分子量グルカン、特に100kDa未満(例えば80、70、60、50、40、30、25、20又は15kDa未満)の分子量を有するグルカンが好ましい。また、例えば、60個以下(例えば59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4個)のグルコース単糖単位を含むオリゴ糖類を用いることも可能である。この範囲内で、10〜50個又は20〜40個の単糖単位を有するオリゴ糖類が好ましい。
グルカンは、真菌グルカンであってもよい。「真菌グルカン」は、一般的には真菌から得られるが、特定のグルカン構造が、真菌及び非真菌(例えば細菌、下等植物又は藻類)の両方において見出される場合には、非真菌生物を代替源として使用してもよい。従って、グルカンは、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)等のカンジダ(Candida)菌、又はコシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、トリコフィトン・ベルコスム(Trichophyton verrucosum)、ブラストマイセス・デルマティディス(Blastomyces dermatidis)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、パラコシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)若しくはピチウム・インシジオスム(Pythiumn insidiosum)の細胞壁に由来し得る。
真菌β-グルカンの様々な供給源が存在する。例えば、純粋β-グルカンが市販されており、例えば、プスツラン(Calbiochem社)は、ウンビリカリア・パプロサ(Umbilicaria papullosa)から精製されるβ-1,6-グルカンである。β-グルカンは、真菌の細胞壁から様々な方法で精製することができる。例えば、参考文献60は、細胞壁マンナンを含まない、カンジダ由来の水溶性β-グルカン抽出物を調製するための2ステップ手順(NaClO酸化及びDMSO抽出を伴う)について開示している。得られた生成物(「カンジダ可溶性β-D-グルカン」すなわち「CSBG」)は、主に、直鎖β-1,6-グルカン部分を有する直鎖β-1,3-グルカンで構成される。同様に、参考文献61は、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)由来のGG-zymの製造について開示している。カンジダ・アルビカンス由来のこのようなグルカンとしては、(a) β-1,3-グルカン側鎖及び平均重合度約30を有するβ-1,6-グルカン、及び(b) β-1,6-グルカン側鎖及び平均重合度約4を有するβ-1,3-グルカン、が挙げられる。
本発明の一部の実施形態において、グルカンは、例えばラミナリンに見られるような、幾つかのβ-1,6分岐を有するβ-1,3グルカンである。ラミナリンは、褐色藻類及び海藻において見出される。ラミナリンのβ(1-3):β(1-6)比は、異なる供給源間で変動し、例えばエイセニア・ビシクリス(Eisenia bicyclis)のラミナリンでは3:2と低いが、ラミナリア・ディジティタータ(Laminaria digititata)のラミナリンでは7:1と高い[62]。従って、本発明で用いられるグルカンは、1.5:1〜7.5:1(例えば、約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1又は7:1)のβ(1-3):β(1-6)比を有し得る。場合により、グルカンは、末端マンニトールサブユニット(例えば1,1-α-結合マンニトール残基)を有し得る[63]。また、グルカンは、マンノースサブユニットも含み得る。
他の実施形態において、グルカンは、カードランに見られるように、専ら又は主に、β-1,3結合を有する。これらのグルカンは、他の結合を含むグルカン、特にβ-1,3結合とより大きな割合のβ-1,6結合を含むグルカンより優れた保護を誘発し得る。従って、グルカンは、β-1,3-結合グルコース残基のみで構成されていてもよい(例えば、専ら1,3結合を有する直鎖β-D-グルコピラノース)。しかし、場合により、グルカンは、β-1,3-結合グルコース残基ではない単糖残基を含んでいてもよく、例えば、β-1,6-結合グルコース残基を含み得る。β-1,3-結合グルコース残基とこれらの他の残基との比は、少なくとも8:1(例えば≧9:1、≧10:1、≧11:1、≧12:1、≧13:1、≧14:1、≧15:1、≧16:1、≧17:1、≧18:1、≧19:1、≧20:1、≧25:1、≧30:1、≧35:1、≧40:1、≧45:1、≧50:1、≧75:1、≧100:1等)であるべきであり、及び/又は1個以上(例えば≧1、≧2、≧3、≧4、≧5、≧6、≧7、≧8、≧9、≧10、≧11、≧12等)の、β-1,3結合のみによって他の残基に結合している少なくとも5個(例えば≧5、≧6、≧7、≧8、≧9、≧10、≧11、≧12、≧13、≧14、≧15、≧16、≧17、≧18、≧19、≧20、≧30、≧40、≧50、≧60個等)の隣接非末端残基の配列が存在する。「非末端」という語は、その残基がグルカンの遊離端に存在していないことを意味する。一部の実施形態において、隣接非末端残基は、担体分子、リンカー又は以下に記載される他のスペーサーに結合した任意の残基を含んでいなくてもよい。β-1,3結合のみによって他の残基に結合している5個の隣接非末端残基の存在により、例えば、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)に対する保護的抗体応答を提供し得る。
さらなる実施形態において、コンジュゲートは、2つの異なるグルカン(例えば、1.5:1〜7.5:1のβ(1-3):β(1-6)比を有する第1のグルカン、及び専ら又は主にβ-1,3結合を有する第2のグルカン)を含み得る。例えば、コンジュゲートは、ラミナリングルカンとカードラングルカンの両方を含み得る。
β-グルカンが、β-1,3結合とβ-1,6結合の両方を所望の比及び/又は順序で含む場合、このグルカンは、天然に見出すことができるか(例えばラミナリン)、又は人工的に作製することができる。例えば、β-グルカンは、全体的に又は部分的に、化学合成によって作製することができる。β-1,3/β-1,6グルカンの化学合成のための方法は、例えば、参考文献64〜74から公知である。β-1,3結合とβ-1,6結合の両方を所望の比で含むβ-グルカンはまた、入手可能なグルカンから出発して、これを、所望の比及び/又は順序が達成されるまでβ-1,6-グルカナーゼ(グルカンエンド-1,6-β-グルコシダーゼ、1,6-β-D-グルカングルカノヒドロラーゼ等としても知られている;EC 3.2.1.75)、又はβ-1,3-グルカナーゼ(例えばエキソ-1,3-グルカナーゼ(EC 3.2.1.58)若しくはエンド-1,3-グルカナーゼ(EC 3.2.1.39))で処理することによって作製することもできる。
β-1,3-結合グルコースのみを含有するグルカンが望ましい場合、β-1,6-グルカナーゼが最終的に純粋なβ-1,3グルカンを生じるため、β-1,6-グルカナーゼ処理を完了するまで続行することができる。しかし、さらに好都合には、純粋β-1,3-グルカンを使用してもよい。これらは、例えば(1→3)-β-D-グルカン合成酵素(このうち幾つかは、例えば細菌、酵母、植物及び菌類等の多くの生物由来のものが公知である)を用いて、化学的及び/又は酵素的合成によって合成的に作製することができる。β-1,3グルカンの化学合成のための方法は、例えば参考文献75〜78から公知である。合成の有用な代替法として、カードラン(アグロバクテリウム属(Agrobacterium)(以前はアルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)変種ミクソゲネス(myxogenes)として知られていた)由来の直鎖β-1,3-グルカン;例えばSigma-Aldrich社からカタログC7821として市販されている)、又はパラミロン(ユーグレナ(Euglena)由来のβ-1,3-グルカン)等の天然β-1,3-グルカンを使用してもよい。高レベルのβ-1,3-グルカンを産生する生物は当技術分野で公知であり、例えば参考文献79及び80のアグロバクテリウム、又は参考文献81のユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)がある。
ラミナリン及びカードランは、典型的には自然界において、高分子量の(例えば、少なくとも100kDaの分子量を有する)ポリマーとして見出される。これらは、多くの場合、水性媒体中で不溶性である。従って、それらの天然型において、これらは免疫化に十分に適してはいない。このため、本発明は、より短いグルカン、例えば60個以下(例えば、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4個)のグルコース単糖単位を含むグルカンを使用することができる。2〜60個の範囲内の数のグルコース残基(例えば、10〜50又は20〜40個のグルコース単位)を有するグルカンを使用することができる。25〜30個のグルコース残基を有するグルカンが特に有用である。好適なグルカンは、例えば天然グルカンの酸加水分解により、又は、例えばグルカナーゼ(例えばβ-1,3-グルカナーゼ)による酵素的消化によって形成することができる。11〜19個(例えば13〜19個、また特に15個又は17個)のグルコース単糖単位を有するグルカンも有用である。特に、以下の構造(A)又は(B)を有するグルカンが、本発明において使用するために具体的に想定される:
(式中、n+2は、2〜60の範囲内(例えば10〜50又は2〜40)である。好ましくは、n+2は、25〜30又は11〜19の範囲内(例えば13〜17)である。本発明者らは、n+2 = 15が好適であることを見出した。)
(式中、nは、0〜9の範囲内(例えば1〜7又は2〜6)である。好ましくは、nは、3〜4又は1〜3の範囲内である。本発明者らは、n = 2が好適であることを見出した。)
一部の実施形態において、グルカンは単一分子種である。これらの実施形態において、全てのグルカン分子は配列に関して同一である。従って、全てのグルカン分子は、それらの構造的特性(分子量等を含む)に関して同一である。典型的には、この型のグルカンは、例えば上記の方法を用いる化学合成によって得られる。例えば、参考文献76は、単一β-1,3結合種の合成について記載している。あるいは、他の実施形態において、グルカンを天然のグルカン(例えば上記のラミナリア・ディジタータ、アグロバクテリウム又はユーグレナ由来のグルカン)から得ることも可能であり、ここでグルカンは所要の単一分子種が得られるまで精製される。このようにして精製された天然グルカンは市販されている。単一分子種のグルカンは、グルカンサンプルの多分散性(Mw/Mn)を測定することによって同定することができる。このパラメータは、例えば参考文献82に記載されているように、SEC-MALLSにより好都合に測定することができる。本発明のこの実施形態において使用するための好適なグルカンは、約1(例えば1.01以下)の多分散性を有する。天然グルカン(例えばカードラン)の溶解性は、イオン性基を(例えば硫酸化により、特にカードラン中のO-6に)導入することによって増大させることができる。このような改変を本発明で用いてもよいが、これらはグルカンの抗原性を変化させる可能性があるため、理想的には回避される。糖類がグルカンである場合、これは、典型的にはラミナリンである。
肺炎連鎖球菌莢膜糖類
上記のとおり、糖類は、細菌莢膜糖類であってもよい。さらなる例示的細菌莢膜糖類としては、肺炎連鎖球菌由来のものが挙げられる。
上記のとおり、糖類は、細菌莢膜糖類であってもよい。さらなる例示的細菌莢膜糖類としては、肺炎連鎖球菌由来のものが挙げられる。
糖類が肺炎連鎖球菌由来の莢膜糖類である場合、これは、典型的には、以下の肺炎球菌血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33Fの1つに由来し、好ましくは1、5、6B、14、19F及び23Fの1つに由来する。肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖類は、8個までの糖残基を含有し得る反復オリゴ糖単位を含む。主要な肺炎連鎖球菌血清型についてのオリゴ糖単位は、参考文献83及び84中に記載されている。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)莢膜糖類
さらなる例示的細菌莢膜糖類として、黄色ブドウ球菌由来のもの、特に黄色ブドウ球菌5型及び8型の莢膜多糖が挙げられる。5型及び8型莢膜多糖の構造は、参考文献85及び86において:
5型:→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型:→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
として記載されている。
さらなる例示的細菌莢膜糖類として、黄色ブドウ球菌由来のもの、特に黄色ブドウ球菌5型及び8型の莢膜多糖が挙げられる。5型及び8型莢膜多糖の構造は、参考文献85及び86において:
5型:→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型:→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
として記載されている。
最近のNMR分光法データ[87]は、これらの構造の、以下への修正を導いた:
5型:→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型:→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
多糖類は、天然に見出される莢膜多糖に対して化学的に改変されたものであってもよい。
5型:→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型:→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
多糖類は、天然に見出される莢膜多糖に対して化学的に改変されたものであってもよい。
例えば、多糖類は、脱-O-アセチル化(部分的に又は完全に)、脱-N-アセチル化(部分的に又は完全に)、N-プロピオネート化(部分的に又は完全に)等されていてもよい。脱-アセチル化は、コンジュゲーションの前、最中又は後に起こり得るが、典型的にはコンジュゲーション前に起こる。特定の多糖類により、脱-アセチル化が免疫原性に影響を及ぼす場合もあれば、影響を及ぼさない場合もある。例えば、NeisVac-C(商標)ワクチンは脱-O-アセチル化多糖類を用いるが、Menjugate(商標)はアセチル化されており、しかしいずれのワクチンも有効である。脱-アセチル化等の影響は、日常的なアッセイによって評価することができる。例えば、黄色ブドウ球菌の5型又は8型莢膜多糖上のO-アセチル化の関連性は、参考文献88に論じられている。この文献中で、天然多糖類は、75%のO-アセチル化を有すると言われている。これらの多糖類は、多糖骨格とO-アセチル基の両方に対する抗体を誘導した。0%のO-アセチル化を有する多糖類も、依然として多糖骨格に対する抗体を誘発した。いずれの型の抗体も、O-アセチル含有量が異なる黄色ブドウ球菌株に対してオプソニン作用を示した。従って、本発明において使用される5型又は8型莢膜多糖は、0〜100%のO-アセチル化を有し得る。
多糖類のO-アセチル化度は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばプロトンNMRにより(例えば参考文献89、90、91又は92に記載されているように)決定することができる。さらなる方法は、参考文献93に記載されている。類似の方法を用いて、多糖類のN-アセチル化度を決定することができる。O-アセチル基は加水分解により(例えば無水ヒドラジン[94]又はNaOH[88]等の塩基を用いた処理によって)除去することができる。類似の方法を用いて、N-アセチル基を除去することができる。5型及び/又は8型莢膜多糖上の高レベルのO-アセチル化を維持するため、O-アセチル基の加水分解をもたらす処理、例えば極端なpHでの処理は最小限に抑えられる。
莢膜多糖類は、本明細書中の参考文献中に記載されているような、公知技術によって精製することができる。典型的な方法は、黄色ブドウ球菌細胞のフェノール-エタノール不活化、遠心分離、リゾスタフィン処理、RNase/DNase処理、遠心分離、透析、プロテアーゼ処理、さらなる透析、ろ過、エタノール/CaCl2による沈殿、透析、凍結乾燥、アニオン交換クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィー、透析及び凍結乾燥を伴う[95]。代替的方法は、黄色ブドウ球菌細胞のオートクレーブ、多糖類含有上清の限外ろ過、濃縮、凍結乾燥、タイコ酸を除去するためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる処理、さらなる限外ろ過、ダイアフィルトレーション、高速サイズ排除液体クロマトグラフィー、透析及び凍結乾燥を伴う[96]。
しかし、本発明は、天然源から精製された多糖類に限定されるものではなく、多糖類は、完全合成又は部分合成等の他の方法によって得ることができる。
しかし、本発明は、天然源から精製された多糖類に限定されるものではなく、多糖類は、完全合成又は部分合成等の他の方法によって得ることができる。
他の細菌莢膜糖類
さらなる例示的細菌莢膜糖類としては、b型インフルエンザ菌、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)チフスVi及びクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)由来の莢膜糖類が挙げられる。
さらなる例示的細菌莢膜糖類としては、b型インフルエンザ菌、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)チフスVi及びクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)由来の莢膜糖類が挙げられる。
ストレプトコッカス・ピオゲネス炭水化物
本発明は、非莢膜細菌糖類を用いることもできる。例示的非莢膜細菌糖類は、ストレプトコッカス・ピオゲネスGAS炭水化物(GAS細胞壁多糖類、又はGASPとしても知られている)である。この糖類は、α-(1→2)及びα-(1→3)の交互の結合からなるL-ラムノピラノース(Rhap)骨格、並びにラムノース環に交互にβ-(1→3)-結合したD-N-アセチルグルコサミン(GlcpNAc)残基を有する分岐構造を特徴とする([97])。
本発明は、非莢膜細菌糖類を用いることもできる。例示的非莢膜細菌糖類は、ストレプトコッカス・ピオゲネスGAS炭水化物(GAS細胞壁多糖類、又はGASPとしても知られている)である。この糖類は、α-(1→2)及びα-(1→3)の交互の結合からなるL-ラムノピラノース(Rhap)骨格、並びにラムノース環に交互にβ-(1→3)-結合したD-N-アセチルグルコサミン(GlcpNAc)残基を有する分岐構造を特徴とする([97])。
GAS炭水化物は、一般的にはその天然型で存在するが、改変されていてもよい。例えば、糖類は、天然GAS炭水化物より短くてもよく、又は化学的に修飾されていてもよい。
従って、本発明により使用される糖類は、天然に見出されるような実質的に完全長のGAS炭水化物であっても、天然の長さより短くてもよい。完全長多糖類を、例えば穏やかな酸中の加水分解、加熱、サイズ分類クロマトグラフィー等によって脱重合させ、本発明での使用のためのより短いフラグメントを得ることができる。ワクチン中で使用するために、GAS炭水化物上の末端単位に対応すると考えられる短いフラグメントが提案されている[98]。従って、本発明において短いフラグメントが想定される。しかし、実質的に完全長の糖類を使用することが好ましい。GAS炭水化物は、典型的には、約10、特に約7.5〜8.5kDaの分子量を有する。分子量は、HPLC、例えばプルラン標準に対してTSKゲル G3000SW カラム(Sigma社)を用いるSEC-HPLC(例えばPolymer Standard Service社から入手可能なもの[99])によって測定することができる。糖類は、天然に見出されるGAS炭水化物に対して化学的に改変されていてもよい。例えば、糖類は、脱-N-アセチル化(部分的に又は完全に)、N-プロピオネート化(部分的に又は完全に)等されていてもよい。例えば免疫原性に対する脱-アセチル化等の影響は、日常的なアッセイによって評価することができる。
II型及びV型糖類コンジュゲートの製造
莢膜糖類は、公知技術により、例えば、Wessels et al.(J Clin Invest、1990 86:1428-33)又はWessels et al.(Infect Immun 1989、57:1089-94)に記載されているとおりに精製することができる。典型的な精製プロセスは、塩基抽出、遠心分離、ろ過、RNase/DNase処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、及びさらなる限外ろ過を伴う。細菌細胞壁を切断して細胞壁成分を遊離させる酵素ムタノリシンによるGBS細胞の処理も有用である。
莢膜糖類は、公知技術により、例えば、Wessels et al.(J Clin Invest、1990 86:1428-33)又はWessels et al.(Infect Immun 1989、57:1089-94)に記載されているとおりに精製することができる。典型的な精製プロセスは、塩基抽出、遠心分離、ろ過、RNase/DNase処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、及びさらなる限外ろ過を伴う。細菌細胞壁を切断して細胞壁成分を遊離させる酵素ムタノリシンによるGBS細胞の処理も有用である。
代替法として、WO2006/082527号に記載されている精製法を使用することができる。この方法は、塩基抽出、エタノール/CaCl2処理、CTAB沈殿、及び再可溶化を伴う。さらなる抽出及び精製法は当技術分野において公知であり、例えば、WO 2009/081276に記載されているものがある。
コンジュゲート
本発明は、抗原及び担体分子を含むコンジュゲートに関し、ここで担体分子は、spb1ポリペプチド及び少なくとも1個のBP-2aポリペプチドを含む。特に、担体分子は、spb1ポリペプチド及び少なくとも1個のBP-2aポリペプチド、少なくとも2個のBP-2aポリペプチド、特に3、4、5、6又は7個のBP-2aポリペプチド又はそのフラグメントを含む融合タンパク質である。
本発明は、抗原及び担体分子を含むコンジュゲートに関し、ここで担体分子は、spb1ポリペプチド及び少なくとも1個のBP-2aポリペプチドを含む。特に、担体分子は、spb1ポリペプチド及び少なくとも1個のBP-2aポリペプチド、少なくとも2個のBP-2aポリペプチド、特に3、4、5、6又は7個のBP-2aポリペプチド又はそのフラグメントを含む融合タンパク質である。
担体分子は、直接又はリンカーを介して抗原に共有結合的にコンジュゲートさせることができる。所望の場合は任意の好適なリンカーを用いて、任意の好適なコンジュゲーション反応を用いることができる。
抗原の担体への結合は、好ましくは、例えば担体タンパク質中のリシン残基又はアルギニン残基の側鎖中の-NH2基を介する。抗原が遊離アルデヒド基を有する場合、この遊離アルデヒド基は、担体中のアミンと反応して還元的アミノ化によりコンジュゲートを形成することができる。担体への結合は、例えばシステイン残基の側鎖中の-SH基を介していてもよい。代替的に、抗原は、リンカー分子を介して担体に結合し得る。
抗原は、典型的には、コンジュゲーションの前に活性化又は官能化される。活性化は、例えば、CDAP(例えば1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート[100、101等])等のシアン化試薬を伴い得る。他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUを用いる(参考文献7の序文も参照)。
例えば参考文献102及び103に記載されているとおり、タンパク質への直接結合は、抗原の酸化の後、タンパク質による還元的アミノ化を含み得る。
リンカー基を介した結合は、任意の公知の方法(例えば、参考文献104及び105に記載されている方法)を用いて行うことができる。典型的には、リンカーは、糖類抗原のアノマー炭素を介して結合する。好ましいタイプの結合はアジピン酸リンカーであり、これは、遊離NH2基(例えばアミノ化によって糖類に導入される)を、(例えばジイミド活性化を用いて)アジピン酸と結合させ、その後、得られた抗原-アジピン酸中間体にタンパク質を結合させることによって形成することができる[5、106、107]。類似の好ましいタイプの結合はグルタル酸リンカーであり、これは、同じ方法で遊離-NH2基をグルタル酸と結合することによって形成することができる。アジピン酸リンカー及びグルタル酸リンカーは、抗原に直接(すなわち、遊離基(例えば遊離-NH2基)を抗原に予め導入することなく)結合させ、その後得られた抗原-アジピン酸/グルタル酸中間体にタンパク質を結合させることによって形成してもよい。別の好ましいタイプの結合はカルボニルリンカーであり、これは、改変抗原の遊離ヒドロキシル基をCDI[108、109]と反応させ、その後タンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成することができる。他のリンカーとしては、β-プロピオンアミド[110]、ニトロフェニル-エチルアミン[111]、ハロゲン化ハロアシル[112]、グリコシド結合[113]、6-アミノカプロン酸[114]、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネート(SPDP)[115]、アジピン酸ジヒドラジドADH[116]、C4〜C12部分[117]等が挙げられる。カルボジイミド縮合も使用することができる[118]。
二官能性リンカーを使用して、抗原中のアミン基(例えばアミノ化によって抗原に導入される)に結合するための第1の基と、担体に結合するための(典型的には担体中のアミンに結合させるための)第2の基を提供することができる。あるいは、第1の基は、抗原に直接(すなわち、抗原に基(例えばアミン基)を予め導入することなく)結合させることができる。
一部の実施形態において、二官能性リンカー中の第1の基は、このようにして、抗原上のアミン基(-NH2)と反応することができる。この反応は、典型的にはアミンの水素の求電子置換を伴う。他の実施形態において、二官能性リンカー中の第1の基は、直接抗原と反応することができる。両実施形態において、二官能性リンカー中の第2の基は、典型的には、担体上のアミン基と反応することができる。この反応は、同様に、典型的にはアミンの求電子置換を伴う。
抗原及び担体の両方との反応がアミンを含む場合、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式X-L-X(式中:2つのX基は互いに同一であり、且つアミンと反応することが可能であり;Lはリンカー中の結合部分である)で表されるホモ二官能性リンカーを使用することができる。同様に、式X-L-X(式中:2つのX基は異なり、且つアミンと反応することが可能であり;Lはリンカー中の結合部分である)で表されるヘテロ二官能性リンカーを使用してもよい。好ましいX基は、N-オキシスクシンイミドである。Lは、好ましくは式L'-L2-L'(式中、L'はカルボニルである)を有する。好ましいL2基は、1〜10個の炭素原子(例えばC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)を有する直鎖アルキル、例えば-(CH2)4-又は-(CH2)3-である。
同様に、抗原との反応が直接結合を含み、担体との反応がアミンを含む場合も、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式X-L-X(式中:2つのX基は互いに同一であり、且つ抗原/アミンと反応することが可能であり;Lはリンカー中の結合部分である)で表されるホモ二官能性リンカーを使用することができる。同様に、式X-L-X(式中:2つのX基は異なり、一方は抗原と反応し、他方はアミンと反応することが可能であり;Lはリンカー中の結合部分である)で表されるヘテロ二官能性リンカーを使用してもよい。好ましいX基は、N-オキシスクシンイミドである。Lは、好ましくは式L'-L2-L'(式中、L'はカルボニルである)を有する。好ましいL2基は、1〜10個の炭素原子(例えばC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)を有する直鎖アルキル、例えば-(CH2)4-又は-(CH2)3-である。
先行する2つの段落に記載された二官能性リンカーにおいて使用するための他のX基は、HO-L-OHと組み合わせた場合にエステルを形成するもの(例えばノルボラン、p-ニトロ安息香酸、及びスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド)である。本発明での使用のためのさらなる二官能性リンカーとしては、ハロゲン化(例えば塩化)アクリロイル及びハロゲン化ハロアシルが挙げられる。
リンカーは、一般的には、抗原への結合中に、抗原に対してモル過剰で添加される。
抗原が担体分子に(場合によりリンカーを介して)結合する単一の基を有し、担体が異なる抗原/リンカー分子に結合する複数の基を有する場合、結果として得られるコンジュゲートは「星状」構造を形成し得る。この構造は、中心の担体分子と、この担体から(場合によりリンカーを介して)放射状に広がる複数の抗原分子とを含む。抗原が、担体分子に(場合によりリンカーを介して)結合する2個以上の基を有し、担体が、異なる抗原/リンカー分子に結合する2個以上の基を有する場合、結果として得られるコンジュゲートは、「網状」構造を形成し得る。この構造は、抗原分子により(場合によりリンカーを介して)連結された担体分子のネットワークを含む。
コンジュゲートは、例えば1:5〜5:1の比率範囲内の、過剰の担体(w/w)又は過剰の抗原(w/w)を有し得る。過剰の(例えば0.2:1〜0.9:1の範囲内)、又は等重量の担体タンパク質を有するコンジュゲートが典型的である。コンジュゲートは、少量の遊離(すなわち、非コンジュゲート化)担体を含み得る。所与の担体タンパク質が、本発明の組成物中に遊離形態及びコンジュゲート化形態の両方で存在する場合、非コンジュゲート化形態は、好ましくは組成物全体中の担体タンパク質の総量の5%以下であり、より好ましくは(重量で)2%未満で存在する。
コンジュゲートが本発明の医薬組成物中に含まれる場合、この組成物は、免疫原として遊離担体タンパク質も含み得る[119]。
コンジュゲーション後、遊離抗原及びコンジュゲート化抗原を分離することができる。多くの好適な方法、例えば疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外ろ過、ダイアフィルトレーション等が存在する[参考文献120、121等も参照]。タンジェンシャルフロー限外ろ過が好ましい。
コンジュゲート中の糖部分は、好ましくは、上記に定義される低分子量糖類又はオリゴ糖類である。オリゴ糖類は、典型的にはコンジュゲーション前にサイズ分類される。
本コンジュゲートは、好ましくは水及び/又は生理学的バッファーに可溶である。
本コンジュゲートは、好ましくは水及び/又は生理学的バッファーに可溶である。
コンジュゲーション
本発明は、それぞれ担体タンパク質にコンジュゲートされたGBS血清型Ia、Ib、II、III及びV由来の莢膜糖類であるコンジュゲートに関する。一般的に、糖類の担体への共有コンジュゲーションは、糖類をT-非依存抗原からT-依存抗原へと変換し、これにより、免疫学的記憶のプライミングを可能とするため、糖類の免疫原性を高める。コンジュゲーションは、特に小児ワクチンのために有用であり、周知技術である。GBS糖類のコンジュゲーションは、広く報告されている(例えば、Paoletti et al.(1990) J Biol Chem 265:18278-83を参照)。多糖類は免疫原性であるが、担体タンパク質への多糖類のコンジュゲーションは、免疫原性を改善するか、又は高めることができる。従って、本明細書中で使用される用語「担体」は、抗原(例えば多糖類)にコンジュゲートされて好適な動物に投与された場合、その動物において免疫応答(特に防御免疫応答)を誘導するか又は高め、抗原(例えば上記の多糖類)に特異的に結合する抗体の産生を誘発する免疫原性物質を指す。GBS糖類のコンジュゲーションのための典型的な先行技術方法は、典型的には、精製糖類の担体タンパク質(例えば破傷風トキソイド(TT)又はCRM197)への還元的アミノ化を伴う(Wessels et al.(1990) J Clin Invest 86:1428-33)。還元的アミノ化は、担体中のアミノ酸の側鎖上のアミン基と糖類中のアルデヒド基とが関与する。GBS莢膜糖類は、それらの天然型においてアルデヒド基を含まないため、アルデヒド基は、典型的にはコンジュゲーション前に、糖類のシアル酸残基の一部(例えば5〜40%、特に10〜30%、好ましくは約20%)の酸化(例えば過ヨウ素酸酸化)によって生成される。この方法で調製されたコンジュゲートワクチンは、GBS血清型Ia、Ib、II、III、及びVのそれぞれについて、ヒトにおいて安全且つ免疫原性であることが示されている(Paoletti & Kasper(2003) Expert Opin Biol Ther 3:975-84)。典型的には、本発明の免疫原性組成物中の全てのコンジュゲートを、この方法で調製することができる。しかし、本発明が脱シアル化された血清型V莢膜糖類を用いる場合、コンジュゲーション前に、糖類のガラクトース残基の一部(例えば5〜40%、特に10〜30%、好ましくは約20%)の酸化(例えば過ヨウ素酸酸化)によってこの糖類中にアルデヒド基を生成させることができる。代替的なコンジュゲーション法は、二官能性リンカーと組み合わせた、糖類中の(脱-N-アセチル化から得られるか又はアミンの導入後の)-NH2基の使用を伴う。一部の実施形態において、本発明の免疫原性組成物中の1種以上のコンジュゲートをこの方法で調製することができる。さらなる代替的方法は、穏やかな脱アミノ的分解によるII型又はIII型莢膜糖類の脱重合から得られる末端2,5-アンヒドロ-D-マンノース残基の遊離アルデヒド基を利用し、還元的アミノ化によるコンジュゲーションに用いるものである。一部の実施形態において、本発明の免疫原性組成物中の1種以上のコンジュゲートをこの方法で調製することができる。一部の実施形態において、担体と抗原は、例えば、WO13065009又はWO13003555に記載されているように、ソルターゼ媒介ライゲーションによってコンジュゲートすることができる。
本発明は、それぞれ担体タンパク質にコンジュゲートされたGBS血清型Ia、Ib、II、III及びV由来の莢膜糖類であるコンジュゲートに関する。一般的に、糖類の担体への共有コンジュゲーションは、糖類をT-非依存抗原からT-依存抗原へと変換し、これにより、免疫学的記憶のプライミングを可能とするため、糖類の免疫原性を高める。コンジュゲーションは、特に小児ワクチンのために有用であり、周知技術である。GBS糖類のコンジュゲーションは、広く報告されている(例えば、Paoletti et al.(1990) J Biol Chem 265:18278-83を参照)。多糖類は免疫原性であるが、担体タンパク質への多糖類のコンジュゲーションは、免疫原性を改善するか、又は高めることができる。従って、本明細書中で使用される用語「担体」は、抗原(例えば多糖類)にコンジュゲートされて好適な動物に投与された場合、その動物において免疫応答(特に防御免疫応答)を誘導するか又は高め、抗原(例えば上記の多糖類)に特異的に結合する抗体の産生を誘発する免疫原性物質を指す。GBS糖類のコンジュゲーションのための典型的な先行技術方法は、典型的には、精製糖類の担体タンパク質(例えば破傷風トキソイド(TT)又はCRM197)への還元的アミノ化を伴う(Wessels et al.(1990) J Clin Invest 86:1428-33)。還元的アミノ化は、担体中のアミノ酸の側鎖上のアミン基と糖類中のアルデヒド基とが関与する。GBS莢膜糖類は、それらの天然型においてアルデヒド基を含まないため、アルデヒド基は、典型的にはコンジュゲーション前に、糖類のシアル酸残基の一部(例えば5〜40%、特に10〜30%、好ましくは約20%)の酸化(例えば過ヨウ素酸酸化)によって生成される。この方法で調製されたコンジュゲートワクチンは、GBS血清型Ia、Ib、II、III、及びVのそれぞれについて、ヒトにおいて安全且つ免疫原性であることが示されている(Paoletti & Kasper(2003) Expert Opin Biol Ther 3:975-84)。典型的には、本発明の免疫原性組成物中の全てのコンジュゲートを、この方法で調製することができる。しかし、本発明が脱シアル化された血清型V莢膜糖類を用いる場合、コンジュゲーション前に、糖類のガラクトース残基の一部(例えば5〜40%、特に10〜30%、好ましくは約20%)の酸化(例えば過ヨウ素酸酸化)によってこの糖類中にアルデヒド基を生成させることができる。代替的なコンジュゲーション法は、二官能性リンカーと組み合わせた、糖類中の(脱-N-アセチル化から得られるか又はアミンの導入後の)-NH2基の使用を伴う。一部の実施形態において、本発明の免疫原性組成物中の1種以上のコンジュゲートをこの方法で調製することができる。さらなる代替的方法は、穏やかな脱アミノ的分解によるII型又はIII型莢膜糖類の脱重合から得られる末端2,5-アンヒドロ-D-マンノース残基の遊離アルデヒド基を利用し、還元的アミノ化によるコンジュゲーションに用いるものである。一部の実施形態において、本発明の免疫原性組成物中の1種以上のコンジュゲートをこの方法で調製することができる。一部の実施形態において、担体と抗原は、例えば、WO13065009又はWO13003555に記載されているように、ソルターゼ媒介ライゲーションによってコンジュゲートすることができる。
タンパク質-タンパク質コンジュゲーション
本発明のコンジュゲートは、タンパク質-タンパク質コンジュゲーションの利用を含み、タンパク質にコンジュゲートしたタンパク質を含み得る。特に、BP-2aポリペプチドは、spb1ポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。代替的に又は付加的に、本発明のタンパク質担体分子をタンパク質抗原にコンジュゲートさせてもよい。任意の適切な方法を使用して本発明のコンジュゲートを作製することができる。例えば、好適な方法を以下に詳述する。
本発明のコンジュゲートは、タンパク質-タンパク質コンジュゲーションの利用を含み、タンパク質にコンジュゲートしたタンパク質を含み得る。特に、BP-2aポリペプチドは、spb1ポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。代替的に又は付加的に、本発明のタンパク質担体分子をタンパク質抗原にコンジュゲートさせてもよい。任意の適切な方法を使用して本発明のコンジュゲートを作製することができる。例えば、好適な方法を以下に詳述する。
本発明のコンジュゲート中のタンパク質-タンパク質結合は、任意の適切な技術を用いて生成することが可能であり、当業者であれば、このような好適な技術を認識するであろう。好適な架橋剤の例としては、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、及びスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)が挙げられる(例えば、[122、123]を参照)。他の方法としては、参考文献124、125及び126に記載されているものが挙げられる。好ましいコンジュゲート剤は、SATA及びスルホ-SMCCであり、いずれもPierce Chemical Co.社(ロックフォード、イリノイ州)から入手可能である。
ペプチド-タンパク質担体コンジュゲートは、従来の架橋剤(例えばカルボジイミド)を用いて形成することもできる。カルボジイミドの例は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド(CMC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)及び1-エチル-3-(4-アゾニア-44-ジメチルペンチル)カルボジイミドである。他の好適な架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒド及び無水コハク酸である。一般的には、例えばホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミド-エステル、ホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性ハロゲン化アルキル、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性アリールハロゲン化物、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体及びホモ二官能性光反応性化合物等の多数のホモ二官能性剤のいずれも使用することができる。同様に、例えば、ヘテロ二官能性化合物、例えば、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基を有する化合物、アミン反応性基と光反応性基を有する化合物、及びカルボニル反応性基とスルフヒドリル反応性基を有する化合物も挙げられる。
このようなホモ二官能性架橋剤の具体例としては、二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、ジスクシンイミジルスベレート、及びジスクシンイミジルタートレート);二官能性イミド-エステル(ジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデート、及びジメチルスベリミデート);二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤(1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン、ビスマレイミドヘキサン、及びビス-N-マレイミド-1,8-オクタン);二官能性アリールハロゲン化物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン及び4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロフェニルスルホン);二官能性光反応性剤(例えばビス-[β-(4-アジドサリシルアミド)エチル]ジスルフィド);二官能性アルデヒド(ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びアジプアルデヒド);二官能性エポキシド(例えば1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル);二官能性ヒドラジド(アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、及びコハク酸ジヒドラジド);二官能性ジアゾニウム(o-トリジン、ジアゾ化ベンジジン及びビス-ジアゾ化ベンジジン);二官能性アルキルハロゲン化物(N1,N'-エチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N1,N'-ヘキサメチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N1,N'-ウンデカメチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、並びにベンジルハロゲン化物及びハロマスタード(例えば、α1,α'-ジヨード-p-キシレンスルホン酸及びトリ(2-クロロエチル)アミン)がそれぞれ挙げられる。
ペプチドへのタンパク質のコンジュゲーションを生じさせるために使用することができる一般的なヘテロ二官能性架橋剤の例としては、限定するものではないが、例えば、SMCC(スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、SIAB(N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート)、SMPB(スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、GMBS(N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル)、MPBH(4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド)、M2C2H(4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシル-ヒドラジド)、SMPT(スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン)、及びSPDP(N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)が挙げられる。架橋は、還元的アミノ化により、カルボニル基をアミン基又はヒドラジド基に結合させることによって達成することができる。
非天然アミノ酸を組み込むように改変された担体分子の作製及びコンジュゲーション
1個以上の非天然アミノ酸残基を担体分子中に組み込む場合、これは、標準的な方法を用いて行うことができる。1つのこのような方法は、特定のコドンに対するアミノアシルtRNAシンテターゼがtRNAを非天然アミノ酸にコンジュゲートするように操作され、この非天然アミノ酸が翻訳中に担体に組み込まれるように改変された宿主細胞の使用を含む[このような技術の概説については、参考文献127を参照]。あるいは、一部の方法は、天然の同族アミノ酸が存在しない場合に一部の非天然アミノ酸が天然の細胞機構によってタンパク質に組み込まれるという事実を利用する。この第2のタイプの方法の例は、HAGの組み込みにおいて見られる。非天然アミノ酸がHAGである場合、チイル-エンコンジュゲーションが用いられる[例えば、参考文献128を参照]。
1個以上の非天然アミノ酸残基を担体分子中に組み込む場合、これは、標準的な方法を用いて行うことができる。1つのこのような方法は、特定のコドンに対するアミノアシルtRNAシンテターゼがtRNAを非天然アミノ酸にコンジュゲートするように操作され、この非天然アミノ酸が翻訳中に担体に組み込まれるように改変された宿主細胞の使用を含む[このような技術の概説については、参考文献127を参照]。あるいは、一部の方法は、天然の同族アミノ酸が存在しない場合に一部の非天然アミノ酸が天然の細胞機構によってタンパク質に組み込まれるという事実を利用する。この第2のタイプの方法の例は、HAGの組み込みにおいて見られる。非天然アミノ酸がHAGである場合、チイル-エンコンジュゲーションが用いられる[例えば、参考文献128を参照]。
コンジュゲートを含む混合物
本発明のコンジュゲートは、さらなる抗原と混合することができる。これらのさらなる抗原は、本発明の他のコンジュゲートであってもよく、又はこれらは他の抗原であってもよい。
本発明のコンジュゲートは、さらなる抗原と混合することができる。これらのさらなる抗原は、本発明の他のコンジュゲートであってもよく、又はこれらは他の抗原であってもよい。
例えば、コンジュゲートの混合物が想定される。通常、コンジュゲートの混合物は、医薬組成物として提供される。これらの混合物中のコンジュゲートの少なくとも1つは、本発明の(すなわち担体分子がBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む)コンジュゲートである。これらの混合物中の他のコンジュゲート(1つ又は複数)も本発明のコンジュゲートであり得る。しかし、他のコンジュゲート(1つ又は複数)が本発明のコンジュゲートではない場合、担体分子は、任意の好適な担体タンパク質(以下に記載される)であってよい。
好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含まない担体分子を含むコンジュゲートと混合される。例えば、特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、担体分子としてCRM197を含むコンジュゲートと混合される。実施例は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体分子が、CRM197を含むさらなるコンジュゲートと組み合わせた場合に特に有効であり得ることを示す。同様に、特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、担体分子としてGBS80を含むコンジュゲートと混合することができる。実施例は、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体分子が、GBS80を含むさらなるコンジュゲートと組み合わせた場合に特に有効であり得ることを示す。特に好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、GBS80を含むコンジュゲート及びCRM197を含むコンジュゲートと混合される。
本発明のコンジュゲートを他のコンジュゲートと混合する場合、他のコンジュゲートは、好ましくは本発明のコンジュゲート中の抗原と同じ病原体由来の抗原を含む。例えば、BP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体にコンジュゲートした病原体由来の第1の抗原(例えば糖類抗原)、及び別の担体分子にコンジュゲートした同じ病原体由来の第2の抗原(さらに恐らく同じ病原体由来の第3の抗原、及び第4の抗原等)を含む混合物が想定される。第2の抗原は、異なる血清型に由来していてもよい。このようにして、本発明の担体分子の有利な特性を利用して、多数の異なる抗原に特異的な広範な免疫応答を誘導することが可能であり得る。
例えば、好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも1つのコンジュゲートがBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体を含むコンジュゲート混合物を含み、この混合物がストレプトコッカス・アガラクティエ血清型Ia、Ib、II、III、V由来の2種以上の莢膜糖類を含む、医薬組成物を提供する。好ましい実施形態において、混合物は、これらの糖類の4種、又は5種全てを含む。特定の実施形態において、本発明のBP-2a及びspb1担体にコンジュゲートするのは、血清型V糖類、又はさらにより特に、血清型II糖類である。
他の実施形態において、本発明は:(a) 第1の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型Ia由来の莢膜糖類であるコンジュゲート;(b) 第2の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型Ib由来の莢膜糖類であるコンジュゲート;(c) 第3の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型III由来の莢膜糖類であるコンジュゲート;(d) 第4の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型II由来の莢膜糖類であるコンジュゲート;並びに(e) 第5の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型V由来の莢膜糖類であるコンジュゲート、を含み、第1、第2、第3、第4又は第5の担体タンパク質の少なくとも1つが本発明のBP-2a及びspb1担体である免疫原性組成物を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、CRM197にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ糖類Ia、Ib及びIII、GBS80にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型V由来の糖類、及び本発明のBP-2a及びspb1担体にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型II由来の糖類を含む医薬組成物を提供する。あるいは、血清型II糖類はGBS80にコンジュゲートしていてもよく、また血清型V糖類は本発明のBP-2a及びspb1担体にコンジュゲートしていてもよい。
さらなる実施形態において、本発明は、以下のものを含む医薬組成物を提供する:(a) 第1の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型Ia由来の莢膜糖類であるコンジュゲート、(b) 第2の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型Ib由来の莢膜糖類であるコンジュゲート、(c) 第3の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型III由来の莢膜糖類であるコンジュゲート(第1、第2及び第3の担体タンパク質は、破傷風トキソイド(TT)、ジフテリアトキソイド(DT)、GBS80、GBS67及びCRM197からなる群より選択される);並びに、(d) 第4の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型II由来の莢膜糖類であるコンジュゲート、及び(e) 第5の担体タンパク質にコンジュゲートしたGBS血清型V由来の莢膜糖類であるコンジュゲート(第4又は第5の担体タンパク質の一方は、破傷風トキソイド(TT)、ジフテリアトキソイド(DT)、GBS67、CRM197及びGBS80からなる群から選択され、第4又は第5の担体タンパク質の他方は、(i) 配列番号38、配列番号42、配列番号40、配列番号36、配列番号44及び配列番号46からなる群より選択される少なくとも1つのD3サブフラグメント配列と、(ii) 配列番号206のアミノ酸185〜468を含むか、又はこれからなる、spb1ポリペプチドのD2+D3フラグメント、との融合物を含む)。
代替的実施形態において、髄膜炎菌の2種以上の血清型に由来するコンジュゲートの混合物、例えば、血清型A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等由来の糖類を含む組成物が想定される。典型的には、上記混合物は、血清型A、C、W135及びY由来の糖類を含むコンジュゲートの混合物である。これらの混合物中のコンジュゲートの少なくとも1つは、本発明のコンジュゲートである(すなわち担体分子がBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む)。典型的には、これらの混合物中の他のコンジュゲート(1つ又は複数)も本発明のコンジュゲートである。しかし、他のコンジュゲート(1つ又は複数)が本発明のコンジュゲートではない場合、担体分子は、任意の好適な担体タンパク質(以下に記載される)であってよく、典型的には、各コンジュゲートにおいて同じ担体分子である。
好適な担体タンパク質は、細菌毒素(例えばジフテリア毒素又は破傷風毒素)、又はトキソイド若しくはその変異体である。CRM197ジフテリア毒素変異体[129]が好適であり得る。他の好適な担体タンパク質としては、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体[130]、合成ペプチド[131、132]、熱ショックタンパク質[133、134]、百日咳タンパク質[135、136]、サイトカイン[137]、リンホカイン[137]、ホルモン[137]、成長因子[137]、ヒト血清アルブミン(典型的には組換えの)、様々な病原体由来抗原から誘導される複数のヒトCD4+T細胞エピトープを含む人工タンパク質[20](例えばN19[138])、インフルエンザ菌由来のタンパク質D[139-141]、肺炎球菌表面タンパク質PspA[142]、ニューモリシン[143]又はその非毒性誘導体[144]、鉄取り込みタンパク質[145]、クロストリジウム・ディフィシル由来の毒素A又はB[146]、GBSタンパク質[147]、GASタンパク質[148]等が挙げられる。
単一の担体タンパク質は、2種以上の多糖類抗原を有し得る[149、150]。この目標を達成するため、コンジュゲーションプロセスの前に異なる糖類を混合することができる。しかし、典型的には、各糖について別々のコンジュゲートが存在し、異なる糖類はコンジュゲーション後に混合される。別々のコンジュゲートは、同じ担体、特にBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む同じ担体をベースとし得る。
混合物は、タンパク質も含み得る。例えば、混合物は、ストレプトコッカス・アガラクティエ又はタンパク質を含み得る[例えば147、151-153]。
混合物は、タンパク質も含み得る。例えば、混合物は、ストレプトコッカス・アガラクティエ又はタンパク質を含み得る[例えば147、151-153]。
さらなる抗原(1つ又は複数)は、非-ストレプトコッカス・アガラクティエ病原体由来の抗原を含み得る。従って、本発明の組成物は、例えば、付加的な細菌、ウイルス又は寄生生物抗原等の1種以上の非-ストレプトコッカス・アガラクティエ抗原をさらに含み得る。これらは、以下のものから選択することができる:
- 肺炎連鎖球菌由来の糖類抗原[例えば参考文献154-156;参考文献163の第22及び23章]。
- A型肝炎ウイルス由来の抗原(例えば不活化ウイルス)[例えば157、158;参考文献163の第15章]。
- B型肝炎ウイルス由来の抗原(例えば表面抗原及び/又はコア抗原)[例えば158、159;参考文献163の第16章]。
- C型肝炎ウイルス由来の抗原[例えば160]。
- 肺炎連鎖球菌由来の糖類抗原[例えば参考文献154-156;参考文献163の第22及び23章]。
- A型肝炎ウイルス由来の抗原(例えば不活化ウイルス)[例えば157、158;参考文献163の第15章]。
- B型肝炎ウイルス由来の抗原(例えば表面抗原及び/又はコア抗原)[例えば158、159;参考文献163の第16章]。
- C型肝炎ウイルス由来の抗原[例えば160]。
- ボルデテラ・パータシス(Bordetella pertussis)由来の抗原(例えば百日咳ホロ毒素(PT))、及びボルデテラ・パータシス由来の線維状赤血球凝集素(FHA)(場合によりパータクチン並びに/又は凝集源2及び3と組み合わせても)[例えば参考文献161及び162;参考文献163の第21章]。
- ジフテリア抗原(例えばジフテリアトキソイド)[例えば参考文献163の第13章]。
- 破傷風抗原(例えば破傷風トキソイド)[例えば参考文献163の第27章]。
- B型インフルエンザ菌由来の糖類抗原[例えば参考文献163の第14章]。
- 髄膜炎菌の血清型B由来のタンパク質抗原[例えば参考文献164-169]。
- ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)由来の抗原[例えば164-167]。
- ジフテリア抗原(例えばジフテリアトキソイド)[例えば参考文献163の第13章]。
- 破傷風抗原(例えば破傷風トキソイド)[例えば参考文献163の第27章]。
- B型インフルエンザ菌由来の糖類抗原[例えば参考文献163の第14章]。
- 髄膜炎菌の血清型B由来のタンパク質抗原[例えば参考文献164-169]。
- ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)由来の抗原[例えば164-167]。
- クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)由来の抗原[例えば170、171、172、173、174、175、176]。
- クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)由来の抗原[例えば177]。
- ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)由来の抗原[例えば178]。
- ポリオ抗原(1つ又は複数)[例えば179、180;参考文献163の第24章](例えばIPV)。
- 狂犬病抗原(1つ又は複数)[例えば181](例えば凍結乾燥した不活化ウイルス)[例えば182、RabAvert(商標)]。
- クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)由来の抗原[例えば177]。
- ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)由来の抗原[例えば178]。
- ポリオ抗原(1つ又は複数)[例えば179、180;参考文献163の第24章](例えばIPV)。
- 狂犬病抗原(1つ又は複数)[例えば181](例えば凍結乾燥した不活化ウイルス)[例えば182、RabAvert(商標)]。
- 麻疹、流行性耳下腺炎及び/又は風疹抗原[例えば参考文献163の19、20及び26章]。
- インフルエンザ抗原(1つ又は複数)[例えば参考文献163の第17及び18章](例えば血球凝集素及び/又はノイラミニダーゼ表面タンパク質)。
- モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)由来の抗原[例えば183]。
- ストレプトコッカス・ピオゲネス(A群ストレプトコッカス)由来の抗原[例えば184、185、186]。
- 表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)由来の抗原[例えば、参考文献187、188及び189に記載されているとおり、ATCC-31432株、SE-360株及びSE-10株から得ることができるI、II及び/又はIII型莢膜多糖]。
- インフルエンザ抗原(1つ又は複数)[例えば参考文献163の第17及び18章](例えば血球凝集素及び/又はノイラミニダーゼ表面タンパク質)。
- モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)由来の抗原[例えば183]。
- ストレプトコッカス・ピオゲネス(A群ストレプトコッカス)由来の抗原[例えば184、185、186]。
- 表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)由来の抗原[例えば、参考文献187、188及び189に記載されているとおり、ATCC-31432株、SE-360株及びSE-10株から得ることができるI、II及び/又はIII型莢膜多糖]。
糖類又は炭水化物抗原が用いられる場合、典型的には、免疫原性を高めるために担体にコンジュゲートしている。担体分子は、本発明の担体(すなわちBP-2aポリペプチド及びspb1ポリペプチドを含む担体)であり得る。あるいは、担体分子は、任意の好適な(例えば上記の)担体タンパク質であってもよい。B型インフルエンザ菌、髄膜炎菌及び肺炎球菌糖類抗原のコンジュゲーションがよく知られている。
毒性タンパク質抗原は、必要であれば無毒化していても良い(例えば化学的及び/又は遺伝子的手段による百日咳毒素の解毒[162])。
毒性タンパク質抗原は、必要であれば無毒化していても良い(例えば化学的及び/又は遺伝子的手段による百日咳毒素の解毒[162])。
組成物中にジフテリア抗原を含める場合、破傷風抗原及び百日咳抗原も含めることが典型的である。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリア抗原及び百日咳抗原も含めることが典型的である。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリア抗原及び破傷風抗原も含めることが典型的である。
抗原はアルミニウム塩に吸着させることができる。組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも1μg/mlの濃度で存在する。一般的には、任意の所与の抗原の濃度が、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分である。
本発明の組成物中でタンパク質抗原を使用することの代替法として、抗原をコードする核酸を使用することができる[例えば参考文献190-198]。このため、本発明の組成物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸(通常、例えばプラスミドの形態のDNA)で置換され得る。
実際には、本発明の組成物中に含まれる抗原の数には上限が存在し得る。本発明の組成物中の抗原の数(本発明のコンジュゲートを含む)は、20種未満、19種未満、18種未満、17種未満、16種未満、15種未満、14種未満、13種未満、12種未満、11種未満、10種未満、9種未満、8種未満、7種未満、6種未満、5種未満、4種未満、又は3種未満であり得る。組成物中の本発明のコンジュゲートの数は、6種未満、5種未満、又は4種未満であり得る。
本コンジュゲートを含む医薬組成物
本発明は、(a) 本発明のコンジュゲート、及び(b) 製薬上許容される担体、を含む医薬組成物を提供する。このような担体についての徹底的な議論は、参考文献199において得られる。
本発明は、(a) 本発明のコンジュゲート、及び(b) 製薬上許容される担体、を含む医薬組成物を提供する。このような担体についての徹底的な議論は、参考文献199において得られる。
微生物感染は身体の様々な領域に影響を及ぼすため、本発明の組成物は、様々な形態に調製することができる。例えば、組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製することができる。注射前に液体ビヒクル中に溶解又は懸濁させるのに適した固体形態を調製することもできる。組成物は、局所投与用に(例えば、軟膏剤、クリーム剤又は粉末剤として)調製することができる。組成物は、経口投与用に(例えば、場合により風味付けされた錠剤若しくはカプセル剤、又はシロップ剤として)調製することもできる。組成物は、肺内投与用に(例えば微粉末又はスプレーを用いる吸入剤として)調製することもできる。組成物は、坐剤又はペッサリーとして調製することもできる。組成物は、経鼻投与、経耳投与又は眼内投与用に(例えば点滴剤として、スプレー剤として、又は粉末剤として[例えば200])調製することもできる。組成物をマウスウォッシュに含めてもよい。組成物は凍結乾燥させてもよい。
医薬組成物は、好ましくは無菌である。医薬組成物は、好ましくは発熱物質非含有である。医薬組成物は、好ましくは、例えばpH6〜pH8、一般的には約pH7に緩衝されている。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達デバイスも提供する。このデバイスは、例えば、シリンジ又は吸入剤であり得る。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達デバイスも提供する。このデバイスは、例えば、シリンジ又は吸入剤であり得る。
本発明の医薬組成物は、好ましくは、免疫学的有効量の抗原を含む免疫原性組成物である。「免疫学的有効量」は、その量の個体への投与が、単回用量で又は一連の用量の一部として、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療対象の個体の健康状態及び身体状態、年齢、治療対象の個体の分類群(例えば非ヒト霊長類、霊長類等)、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、医学的状態の処置医による評価、及び他の関連因子に応じて変動する。上記の量は、日常的な試験を介して決定することができる比較的広い範囲内に入ることが予想される。投薬治療は、単回投与スケジュールであっても、複数回投与スケジュール(例えばブースター投与を含む)であってもよい。組成物は、他の免疫調節剤と組み合わせて投与することができる。
本発明の組成物は、製剤化されると被験体に直接投与することができる。治療対象の被験体は動物であってよく;特にヒト被験体を治療することができる。
本発明の免疫原性組成物は、治療的に(すなわち、既存の感染症を治療するため)又は予防的に(すなわち、さらなる感染症を予防するため)用いることができる。
本発明の免疫原性組成物は、治療的に(すなわち、既存の感染症を治療するため)又は予防的に(すなわち、さらなる感染症を予防するため)用いることができる。
免疫原性組成物は、組成物の投与を受ける患者において誘発される免疫応答(体液性及び/又は細胞性)を高めるように機能し得るさらなるアジュバントを含み得る。本発明で使用し得るアジュバントとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる:
・鉱物含有組成物(例えばカルシウム塩及びアルミニウム塩(又はそれらの混合物)等)。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム(例えば参考文献201に開示されている「CAP」粒子)が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩等が挙げられ、これらの塩は、任意の好適な形態(例えばゲル、結晶、非晶質等)をとる。これらの塩への吸着が好ましい。鉱物含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化することもできる[202]。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントを使用し得る。これらの名称は慣習的なものであるが、いずれも存在する実際の化合物の正確な記載ではないため、便宜上のためにのみ用いられる(例えば参考文献285の第9章を参照)。本発明は、アジュバントとして一般的に用いる「水酸化物」アジュバント又は「リン酸塩」アジュバントのいずれかを使用することができる。「水酸化アルミニウム」として知られるアジュバントは、典型的には、通常は少なくとも部分的に結晶性のオキシ水酸化アルミニウム塩である。「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、少量の硫酸塩も含む場合が多い(すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム)。これらは沈殿によって得ることが可能であり、沈殿中の反応条件及び濃度は、塩中のリン酸塩とヒドロキシルの置換度に影響を与える。本発明は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を用いることができる。この場合、水酸化アルミニウムよりも多くのリン酸アルミニウムが存在し得る(例えば重量比は少なくとも2:1(例えば≧5:1、≧6:1、≧7:1、≧8:1、≧9:1等))。患者に投与するための組成物中のAl+++の濃度は、好ましくは10mg/ml未満(例えば≦5mg/ml、≦4mg/ml、≦3mg/ml、≦2mg/ml、≦1mg/ml等)である。好ましい範囲は、0.3〜1mg/mlである。1用量当たり最大0.85mgが好ましい。
・広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらに花においても見出されるステロールグリコシド及びトリテルペノイドグリコシドの不均一な群であるサポニン[参考文献285の第22章]。キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaia saponaria Molina)の木の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、スミラックス・オルナタ(Smilax ornata)(サルサプリラ)、ジプソフィラ・パニクラタ(Gypsophilla paniculata)(ブライズベール)、及びサポナリア・オフィシアナリス(Saponaria officianalis)(ソープルート)由来のものを商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント製剤としては、精製製剤(例えばQS21)並びに脂質製剤(例えばISCOM)が挙げられる。QS21は、Stimulon(商標)として販売されている。サポニン組成物は、HPLC及びRP-HPLCを用いて精製される。これらの技術を用いて、QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B及びQH-C等の特定の精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはQS21である。QS21の製造方法は、参考文献203に開示されている。サポニン製剤は、ステロール(例えばコレステロール)も含み得る[204]。サポニンとコレステロールとの組み合わせを用いて、免疫賦活複合体(ISCOM)と呼ばれる独特の粒子を形成することができる[参考文献285の第23章]。ISCOMは、典型的にはリン脂質(例えばホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリン)も含む。任意の公知のサポニンを、ISCOM中で用いることができる。好ましくは、ISCOMは、QuilA、QHA及びQHCの1種以上を含む。ISCOMは、参考文献204〜206にさらに記載されている。場合により、ISCOMは、付加的な界面活性剤を欠如し得る[207]。サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献208及び209に見出すことができる。
・細菌ADPリボシル化毒素(例えば大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「LT」、コレラ毒素「CT」、又は百日咳毒素「PT」)及びその無毒化誘導体(例えばLT-K63及びLT-R72として知られる変異体毒素[210])。無毒化ADPリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は参考文献211に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は参考文献212に記載されている。
・生体接着剤及び粘膜付着剤、例えばエステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア[213]又はキトサン及びその誘導体[214]。
・生体接着剤及び粘膜付着剤、例えばエステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア[213]又はキトサン及びその誘導体[214]。
・場合により(例えばSDSで)負に荷電した表面を有するように処理されているか、又は(例えばCTAB等のカチオン性界面活性剤で)正に荷電した表面を有するように処理されている、生分解性且つ非毒性の材料(例えばポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)が好ましい)から形成される微粒子(すなわち、直径で約100nmから約150μm、より好ましくは直径で約200nmから約30μm、又は直径で約500nmから約10μmの粒子)。
・リポソーム(参考文献285の第13章&14章)。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献215〜217に記載されている。
・リポソーム(参考文献285の第13章&14章)。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献215〜217に記載されている。
・ムラミルペプチド、例えばN-アセチルムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(「thr-MDP」)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルムラミル-L-Al-D-イソグル-L-Ala-ジパルミトキシプロピルアミド(「DTP-DPP」又は「Theramide(商標)」)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(「MTP-PE」)。
・ポリオキシドニウムポリマー[218、219]又は他のN-酸化ポリエチレン-ピペラジン誘導体。
・メチルイノシン5'-モノリン酸塩(「MIMP」)[220]。
・ポリオキシドニウムポリマー[218、219]又は他のN-酸化ポリエチレン-ピペラジン誘導体。
・メチルイノシン5'-モノリン酸塩(「MIMP」)[220]。
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物[221]、例えば、以下の式:
(式中、Rは、水素、直鎖又は分岐鎖、非置換又は置換、飽和又は不飽和アシル基、アルキル基(例えばシクロアルキル基)、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を含む群から選択される)を有するもの又はその製薬上許容可能な塩若しくは誘導体。例として、限定するものではないが、カスアリン、カスアリン-6-α-D-グルコピラノース、3-エピ-カスアリン、7-エピ-カスアリン、3,7-ジエピ-カスアリン等が挙げられる。
・CD1dリガンド、例えばα-グリコシルセラミド[222-229](例えばα-ガラクトシルセラミド)、フィトスフィンゴシン含有α-グリコシルセラミド、OCH、KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオール]、CRONY-101、3''-O-スルホ-ガラクトシルセラミド等。
・ガンマイヌリン[230]又はその誘導体、例えばアルガムリン。
・ガンマイヌリン[230]又はその誘導体、例えばアルガムリン。
・水中油型エマルション。様々なかかるエマルションが知られており、これらは、典型的には少なくとも1種の油と少なくとも1種の界面活性剤を含み、ここで油(1種又は複数種)及び界面活性剤(1種又は複数種)は生分解性(代謝可能性)且つ生体適合性である。エマルション中の油滴は、一般的には直径5μm未満であり、サブミクロンの直径を有する場合もあり、これらの小さなサイズは、安定なエマルションを提供するためのマイクロフルイダイザーにより達成される。ろ過滅菌に供し得るため、220nm未満のサイズを有する液滴が好ましい。
・免疫賦活オリゴヌクレオチド、例えば、CpGモチーフ(リン酸結合によってグアノシン残基に結合している非メチル化シトシン残基を含むジヌクレオチド配列)若しくはCpIモチーフ(イノシンに結合しているシトシンを含むジヌクレオチド配列)、又は二本鎖RNAを含むもの、又は回文構造配列を含むオリゴヌクレオチド、又はポリ(dG)配列を含むオリゴヌクレオチド。免疫賦活オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド修飾/類似体(例えばホスホロチオエート修飾)を含んでいてよく、二本鎖であっても、(RNAを除き)一本鎖であってもよい。参考文献231、232及び233は、可能な類似体置換(例えば、グアノシンの、2'-デオキシ-7-デアザグアノシンとの置換)について開示している。CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献234〜239においてさらに考察されている。CpG配列は、TLR9を対象とする配列であり得る(例えば、モチーフGTCGTT又はTTCGTT[240])。CpG配列は、Th1免疫応答を誘導するために特異的であってもよく(例えばCpG-A ODN(オリゴデオキシヌクレオチド))、又はB細胞応答を誘導するためにより特異的であってもよい(例えばCpG-B ODN)。CpG-A及びCpG-B ODNは、参考文献241〜243において考察されている。好ましくは、CpGは、CpG-A ODNである。好ましくは、CpGオリゴヌクレオチドは、受容体認識のためその5’末端が接近可能であるように構築される。場合により、2つのCpGオリゴヌクレオチド配列をそれらの3’末端で結合して「イムノマー(immunomer)」を形成してもよい。例えば、参考文献240及び244〜246を参照。有用なCpGアジュバントは、ProMune(商標)(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)としても知られるCpG7909である。別のCpGアジュバントはCpG1826である。CpG配列の使用の代わりに又はこれに加えて、TpG配列を使用することが可能であり[247]、これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGモチーフを含んでいなくてもよい。免疫賦活オリゴヌクレオチドは、ピリミジンに富むものであってもよい。例えば、免疫賦活オリゴヌクレオチドは、2個以上の連続チミジンヌクレオチド(例えば参考文献247に開示されているTTTT)を含んでいてもよく、及び/又は>25%(例えば>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)のチミジンを有するヌクレオチド組成を有していてもよい。例えば、免疫賦活オリゴヌクレオチドは、2個以上の連続シトシンヌクレオチド(例えば参考文献247に開示されているCCCC)を含んでいてもよく、及び/又は>25%(例えば>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)のシトシンを有するヌクレオチド組成を有していてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGモチーフを含んでいなくてもよい。免疫賦活オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも20個のヌクレオチドを含む。これらは100個未満のヌクレオチドを含み得る。
免疫賦活オリゴヌクレオチドをベースとする特に有用なアジュバントは、IC31(商標)として公知である[248]。このように、本発明で用いられるアジュバントは、(i) 少なくとも1個の(好ましくは複数の)CpIモチーフを含むオリゴヌクレオチド(例えば15〜40個のヌクレオチド)と、(ii) ポリカチオン性ポリマー(例えば少なくとも1個の(好ましくは複数の)Lys-Arg-Lysトリペプチド配列(1つまたは複数)を含むオリゴペプチド(例えば5〜20個のアミノ酸))との混合物を含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、26-mer配列5'-(IC)13-3'(配列番号98)を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオン性ポリマーは、11-merアミノ酸配列KLKLLLLLKLK(配列番号99)を含むペプチドであってもよい。
・3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(「3dMPL」、「MPL(商標)」としても公知)[249-252]。水性条件において、3dMPLは、異なるサイズを有する(例えば、直径<150nm又は>500nmを有する)ミセル凝集体又は粒子を形成することができる。これらのいずれか又は両方を本発明で使用することが可能であり、日常的なアッセイによって、より優れた粒子を選択することができる。より小さい(例えば、3dMPLの透明な水性懸濁液を与えるために十分に小さい)粒子は、それらの優れた活性により、本発明による使用に好ましい[253]。好ましい粒子は、220nm未満、より好ましくは200nm未満又は150nm未満又は120nm未満の平均粒径を有し、100nm未満の平均粒径を有する場合もあり得る。しかしほとんどの場合、平均粒径は、50nmを下回らない。
・イミダゾキノリン化合物(例えばイミキモド(「R-837」)[254、255]、レシキモド(「R-848」)[256])及びそれらの類似体;並びにその塩(例えば塩酸塩)。免疫賦活イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献257〜261に見出すことができる。
・チオセミカルバゾン化合物(例えば参考文献262に開示されているもの)。活性化合物を製剤化、製造、及びスクリーニングする方法もまた、参考文献262に記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン(例えばTNF-α)の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
・トリプタンスリン化合物(例えば参考文献263に開示されるもの)。活性化合物を製剤化、製造、及びスクリーニングする方法もまた、参考文献263に記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン(例えばTNF-α)の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
・トリプタンスリン化合物(例えば参考文献263に開示されるもの)。活性化合物を製剤化、製造、及びスクリーニングする方法もまた、参考文献263に記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン(例えばTNF-α)の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
・ヌクレオシド類似体、例えば:(a) イサトラビン(ANA-245;7-チア-8-オキソグアノシン):
及びそのプロドラッグ;(b) ANA975;(c) ANA-025-1;(d) ANA380;(e) 参考文献264-266に開示されている化合物及びロキソリビン(7-アリル-8-オキソグアノシン)[267]。
・参考文献268中に開示されている化合物、例えば:アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン(THIQ)化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン(ABIQ)化合物[269、270]、ヒドラフタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物[271]、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、及びベンズアゾール化合物[272]等。
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばRC-529[273、274]。
・ホスファゼン、例えば、参考文献275及び276に記載されるポリ[ジ(カルボキシラートフェノキシ)ホスファゼン](「PCPP」)。
・ホスファゼン、例えば、参考文献275及び276に記載されるポリ[ジ(カルボキシラートフェノキシ)ホスファゼン](「PCPP」)。
・置換尿素、又は参考文献277において定義される、式I、II又はIIIで表される化合物例えば「ER 803058」、「ER 803732」、「ER 804053」、「ER 804058」、「ER 804059」、「ER 804442」、「ER 804680」、「ER 804764」、「ER 803022」又は「ER 804057」:
例えば:
若しくはその塩。
・大腸菌に由来するリピドAの誘導体、例えばOM-174(参考文献278及び279に記載)。
・リン酸含有非環式骨格に結合している脂質を含む化合物、例えばTLR4アンタゴニストE5564[280、281]:
・リン酸含有非環式骨格に結合している脂質を含む化合物、例えばTLR4アンタゴニストE5564[280、281]:
これらの及び他のアジュバント活性物質は、参考文献285及び286により詳細に考察されている。
組成物中の抗原とアジュバントは、典型的には混合されている。
組成物は、2種以上の前記アジュバントを含み得る。例えば、これらは、水中油エマルションと3dMPLの両方等を有利に含み得る。
組成物は、2種以上の前記アジュバントを含み得る。例えば、これらは、水中油エマルションと3dMPLの両方等を有利に含み得る。
本発明で有用な特定の水中油エマルションアジュバントとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる:
・スクアレン、Tween 80、及びスパン85のサブミクロンエマルション。エマルションの組成(体積で)は、約5%のスクアレン、約0.5%のポリソルベート80、及び約0.5%のスパン85であり得る。重量においては、これらの比は、4.3%のスクアレン、0.5%のポリソルベート80、及び0.48%のスパン85となる。このアジュバントは、参考文献285の第10章及び参考文献286の第12章により詳細に記載されているとおり、「MF59(登録商標)」[282-284]として公知である。MF59(登録商標)エマルションは、クエン酸塩イオン(例えば10mMクエン酸ナトリウムバッファー)を有利に含む。
・スクアレン、Tween 80、及びスパン85のサブミクロンエマルション。エマルションの組成(体積で)は、約5%のスクアレン、約0.5%のポリソルベート80、及び約0.5%のスパン85であり得る。重量においては、これらの比は、4.3%のスクアレン、0.5%のポリソルベート80、及び0.48%のスパン85となる。このアジュバントは、参考文献285の第10章及び参考文献286の第12章により詳細に記載されているとおり、「MF59(登録商標)」[282-284]として公知である。MF59(登録商標)エマルションは、クエン酸塩イオン(例えば10mMクエン酸ナトリウムバッファー)を有利に含む。
・スクアレン、トコフェロール、及びTween 80のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。スパン85(例えば1%で)及び/又はレシチンも含み得る。これらのエマルションは、2〜10%のスクアレン、2〜10%のトコフェロール及び0.3〜3%のTween 80を有していてよく、スクアレン:トコフェロールの重量比は、好ましくは≦1である(この重量比がより安定なエマルションをもたらすため)。スクアレンとTween 80は、約5:2の体積比で存在し得る。1種のこのようなエマルションは、Tween 80をPBSに溶解することによって2%溶液を与え、次いで90mlのこの溶液を5gのDL-α-トコフェロール及び5mlのスクアレンの混合物と混合し、その後この混合物をマイクロ流体化することによって作製することができる。結果として得られるエマルションは、サブミクロンの油滴(例えば、100〜250nm、好ましくは約180nmの平均粒径を有する油滴)を有し得る。
・スクアレン、トコフェロール、及びTriton界面活性剤(例えばTriton X-100)のエマルション。このエマルションは3d-MPLも含み得る(以下参照)。このエマルションは、リン酸バッファーを含有し得る。
・ポリソルベート(例えばポリソルベート80)、Triton界面活性剤(例えばTriton X-100)及びトコフェロール(例えばα-トコフェロールスクシネート)を含むエマルション。このエマルションは、これらの3つの成分を、約75:11:10の質量比で含んでいてよく(例えば750μg/mlのポリソルベート80、110μg/mlのTriton X-100及び100μg/mlのα-トコフェロールスクシネート)、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分の任意の寄与を含むはずである。このエマルションはスクアレンも含み得る。このエマルションは3d-MPLも含み得る(以下参照)。水相は、リン酸バッファーを含有し得る。
・スクアラン、ポリソルベート80及びポロキサマー401(「Pluronic(商標) L121」)のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中で製剤化することができる。このエマルションは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「SAF-1」アジュバント[287](0.05-1%のThr-MDP、5%のスクアラン、2.5%のプルロニックL121及び0.2%のポリソルベート80)中でトレオニル-MDPと共に使用されている。このエマルションは、「AF」アジュバント[288](5%のスクアラン、1.25%のプルロニックL121及び0.2%のポリソルベート80)のように、Thr-MDPなしで用いることもできる。マイクロ流体化が好ましい。
・0.5〜50%の油、0.1〜10%のリン脂質、及び0.05〜5%の非イオン性界面活性剤を有するエマルション。参考文献289に記載されているとおり、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
・サブミクロンの、代謝不可能油(例えば軽鉱油)と少なくとも1種の界面活性剤(例えばレシチン、Tween 80又はSpan 80)の水中油エマルション。添加剤(例えば、QuilA サポニン、コレステロール、サポニン-親油性コンジュゲート(例えば、グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの添加によって生成される、参考文献290中に記載されるGPI-0100)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド及び/又はN,N-ジオクタデシル-N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミン)が含まれ得る。
・サポニン(例えばQuilA又はQS21)とステロール(例えばコレステロール)がヘリックスミセルとして会合しているエマルション[291]。
・サポニン(例えばQuilA又はQS21)とステロール(例えばコレステロール)がヘリックスミセルとして会合しているエマルション[291]。
本発明の免疫原性組成物で使用するための特定のアジュバントとしては、EP2459216号(参照により本明細書中に組み込まれる)に開示されているMF59(登録商標)、ミョウバン及び/又はtoll様受容体7(TLR7)アゴニスト等が挙げられる。
医学的治療及び使用
本発明はまた、医薬における使用のための(例えば、好適な哺乳動物において抗体応答を惹起することにおいて使用するための)本発明のコンジュゲートも提供する。本発明はまた、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、好適な哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法も提供する。本発明はまた、好適な哺乳動物における微生物感染を予防又は治療するための医薬の製造における本発明のコンジュゲートの使用も提供する。
本発明はまた、医薬における使用のための(例えば、好適な哺乳動物において抗体応答を惹起することにおいて使用するための)本発明のコンジュゲートも提供する。本発明はまた、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、好適な哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法も提供する。本発明はまた、好適な哺乳動物における微生物感染を予防又は治療するための医薬の製造における本発明のコンジュゲートの使用も提供する。
これらの方法及び使用により惹起される免疫応答は、一般的には抗体応答、好ましくは防御的抗体応答を含む。抗原免疫化後の抗体応答を評価するための方法は、当技術分野において周知である。抗体応答は、好ましくはIgA又はIgG応答である。免疫応答は、予防的免疫応答及び/又は治療的免疫応答であり得る。哺乳動物は、好ましくはヒト、特にヒトの女性、さらに特に、妊娠中のヒトの女性である。
治療的処置の効力は、本発明の組成物の投与後に微生物感染をモニタリングすることによって試験することができる。予防的処置の効力は、本組成物の投与後の、抗原に対する免疫応答(例えば抗-抗原抗体)をモニタリングすることによって試験することができる。
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射(例えば皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、又は組織の間質空間への注射)、又は直腸投与、経口投与、膣内投与、局所投与、経皮投与、皮内投与、眼内投与、鼻腔内投与、経耳投与又は肺内投与によって達成することができる。注射又は鼻腔内投与が好ましい。本発明を使用して、全身免疫及び/又は粘膜免疫を誘発することができる。
本発明により調製されるワクチンを使用して、子供と大人の両方を治療することができる。従って、被験体は、1歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳、又は少なくとも55歳であり得る。ワクチンの投与を受ける特定の被験体は、高齢者(例えば≧50歳、≧55歳、≧60歳、及び≧65歳)、又は若年者(例えば≦5歳)である。しかし、ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではなく、集団においてより一般的に使用することができる。
治療は、単回投与スケジュールであっても複数回投与スケジュールであってもよい。複数回投与は、一次免疫化スケジュール及び/又は追加免疫化スケジュールにおいて使用することができる。複数回投与スケジュールでは、様々な用量を、同一経路又は異なる経路により(例えば一次免疫化は非経口で追加免疫化は粘膜、一次免疫化は粘膜で追加免疫化は非経口等により)与えることができる。2回以上の用量(典型的には2回用量)の投与は、免疫学的にナイーブな患者において特に有用である。複数回投与は、典型的には、少なくとも1週間(例えば約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間等)あけて投与される。
本発明の使用及び方法は、特に、抗原が由来する生物によって引き起こされる感染症を治療し/感染症から保護するために有用である。例示的使用/方法は以下に考察される。
ストレプトコッカス・アガラクティエ莢膜糖類
本使用及び方法は、ストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる疾患の予防及び/又は治療のためであってよい。実施例は、本発明の担体分子が、ストレプトコッカス・アガラクティエ糖類用の特に有効な担体であることを示す。さらに、担体のBP-2a及びspb1ポリペプチドは、保護的な担体特異的免疫応答を誘導することを助けることができる場合もある。本発明の担体タンパク質を含む免疫原性組成物は、(i) ストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる感染性疾患を治療又は予防するための方法;又は(ii) 被験体においてストレプトコッカス・アガラクティエに対する免疫応答を誘導するための方法;又は(iii) ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症から保護するため、又は感染症の症状を低減するために被験体にワクチン接種する方法、において使用するためのものであってよく、これらの方法は、治療上有効量の前記組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、本発明の担体タンパク質を含む免疫原性組成物は、幼児において、ストレプトコッカス・アガラクティエに対する保護免疫をもたらす方法、又はストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる疾患から保護する方法、において使用するためのものであってよく、ここで幼児は、妊娠中に治療上有効量の本組成物が投与された女性の子供として生まれた幼児である。ストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる疾患は、早発性疾患(EOD)及び/又は遅発性疾患(LOD)であり得る。
本使用及び方法は、ストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる疾患の予防及び/又は治療のためであってよい。実施例は、本発明の担体分子が、ストレプトコッカス・アガラクティエ糖類用の特に有効な担体であることを示す。さらに、担体のBP-2a及びspb1ポリペプチドは、保護的な担体特異的免疫応答を誘導することを助けることができる場合もある。本発明の担体タンパク質を含む免疫原性組成物は、(i) ストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる感染性疾患を治療又は予防するための方法;又は(ii) 被験体においてストレプトコッカス・アガラクティエに対する免疫応答を誘導するための方法;又は(iii) ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症から保護するため、又は感染症の症状を低減するために被験体にワクチン接種する方法、において使用するためのものであってよく、これらの方法は、治療上有効量の前記組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、本発明の担体タンパク質を含む免疫原性組成物は、幼児において、ストレプトコッカス・アガラクティエに対する保護免疫をもたらす方法、又はストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる疾患から保護する方法、において使用するためのものであってよく、ここで幼児は、妊娠中に治療上有効量の本組成物が投与された女性の子供として生まれた幼児である。ストレプトコッカス・アガラクティエによって引き起こされる疾患は、早発性疾患(EOD)及び/又は遅発性疾患(LOD)であり得る。
髄膜炎菌莢膜糖類
本使用及び方法は、髄膜炎菌によって引き起こされる疾患(例えば髄膜炎、敗血症等)の予防及び/又は治療のためのものであり得る。
本使用及び方法は、髄膜炎菌によって引き起こされる疾患(例えば髄膜炎、敗血症等)の予防及び/又は治療のためのものであり得る。
グルカン
グルカン(及び特にβ-グルカン)は、ほぼ全ての病原性菌類(特に免疫不全被験体における感染に関与するもの)の、さらにまた、細菌病原体及び原生動物における必須の且つ主要な多糖構成成分であるため、抗グルカン免疫は、広範囲の病原体及び疾患に対する効力を有し得る。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)による免疫化後に惹起される抗グルカン血清は、カンジダ・アルビカンスと交差反応性である。これらのヒト感染性真菌病原体に対する化学療法は不十分であり、抗菌薬耐性が出現し、予防的及び治療的ワクチンに対する必要性が徐々に認識されてきているため、広いスペクトルの免疫が特に有用である。
グルカン(及び特にβ-グルカン)は、ほぼ全ての病原性菌類(特に免疫不全被験体における感染に関与するもの)の、さらにまた、細菌病原体及び原生動物における必須の且つ主要な多糖構成成分であるため、抗グルカン免疫は、広範囲の病原体及び疾患に対する効力を有し得る。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)による免疫化後に惹起される抗グルカン血清は、カンジダ・アルビカンスと交差反応性である。これらのヒト感染性真菌病原体に対する化学療法は不十分であり、抗菌薬耐性が出現し、予防的及び治療的ワクチンに対する必要性が徐々に認識されてきているため、広いスペクトルの免疫が特に有用である。
本発明の使用及び方法は、カンジダ種(例えばカンジダ・アルビカンス(C. albicans));クリプトコッカス種(例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス(C. neoformans));エンテロコッカス種(Enterococcus)(例えばエンテロコッカス・フェカリス(E. faecalis));ストレプトコッカス種(例えば肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans)、ストレプトコッカス・アガラクティエ及びストレプトコッカス・ピオゲネス(S. pyogenes);リーシュマニア種(Leishmania)(例えばリーシュマニア・メジャー(L. major));アカンタモエバ種(Acanthamoeba)(例えばアカンタモエバ・カステラーニ(A. castellani));アスペルギルス(Aspergillus)種(例えばアスペルギルス・フミガツス(A. fumigatus)及びアスペルギルス・フラバス(A. flavus));ニューモシスティス種(Pneumocystis)(例えばニューモシスティス・カリニイ(P. carinii));マイコバクテリウム種(Mycobacterium)(例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス(M. tuberculosis);シュードモナス種(Pseudomonas)(例えばシュードモナス・アエルギノーサ(P. aeruginosa));スタフィロコッカス種(Staphylococcus)(例えば黄色ブドウ球菌(S. aureus));サルモネラ種(Salmonella)(例えばサルモネラ・チフィムリウム(S.typhimurium));コッキディオイデス種(Coccidioides)(例えばコッキディオイデス・イミティス(C. immitis));トリコフィトン種(Trychophyton)(例えばトリコフィトン・ベルコスム(T. verrucosum));ブラストマイセス種(Blastomyces)(例えばブラストマイセス・デルマティディス(B. dermatidis);ヒストプラズマ種(Histoplasma)(例えばヒストプラズマ・カプスラーツム(H. capsulatum);パラコッキディオイデス種(Paracoccidioides)(例えばパラコッキディオイデス・ブラシリエンシス(P. brasiliensis));ピシウム種(Pythium)(例えばピシウム・インシディオスム(P. insidiosum));及びエシェリヒア種(Escherichia)(例えばエシェリヒア・コリ(E. coli)(大腸菌))の感染を治療する/これらの感染から保護するために特に有用である。
本発明の使用及び方法は、限定するものではないが、カンジダ症(例えば、肝脾カンジダ症、侵襲的カンジダ症、慢性皮膚粘膜カンジダ症及び播種性カンジダ症等);カンジダ血症;アルペルギルス症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、スポロトリクム症及び他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ニューモシスティス症、鵞口瘡、結核症、マイコバクテリア症、呼吸器感染症、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、敗血症(sepsis)、敗血症(septicaemia)、皮膚及び内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス熱、胃腸炎及び溶血性尿毒症症候群等の疾患を予防/治療するために特に有用である。抗カンジダ・アルビカンス(C. albicans)活性は、AIDS患者における感染症を治療するために特に有用である。
本発明のコンジュゲートは、複数の病原体に対する同時免疫化のため、非グルカン抗原と組み合わせて単一組成物にすることができる。組み合わせワクチンを作製する代わりに、コンジュゲートを、他のワクチンと実質的に同時に(例えば、同じ医療相談、又は医療専門家若しくはワクチンセンターへの受診中に)患者に投与してもよい。これらの組み合わせワクチンの使用のための、又は同時投与のための抗原としては、例えば、ストレプトコッカス・アガラクティエ、黄色ブドウ球菌及び/又はシュードモナス・アエルギノーサ、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、髄膜炎菌(例えば血清型A、C、W135及び/又はYの糖類又はコンジュゲート化糖類)、肺炎連鎖球菌(例えば糖類又はコンジュゲート化糖類)由来の免疫原等が挙げられる。
本発明のコンジュゲートは、特に患者が既に感染している場合、抗菌剤と組み合わせて用いることができる。抗菌剤は即時の治療効果を与えるが、本コンジュゲートは、より長期間持続する効果を与える。好適な抗菌剤としては、限定するものではないが、アゾール系(例えばフルコナゾール、イトラコナゾール)、ポリエン系(例えばアンホテリシンB)、フルシトシン、及びスクアレンエポキシダーゼ阻害剤(例えばテルビナフィン)[参考文献292も参照]が挙げられる。抗菌剤及び本コンジュゲートは、別々に投与してもよく、組み合わせて投与してもよい。別々に投与される場合、これらは、典型的には互いに7日間以内に投与される。コンジュゲートの最初の投与の後、抗菌剤を2回以上投与し得る。
ストレプトコッカス・ピオゲネス莢膜糖類
本使用及び方法は、A群ストレプトコッカスによって引き起こされる疾患の予防及び/又は治療のためのものであり得る。
本使用及び方法は、A群ストレプトコッカスによって引き起こされる疾患の予防及び/又は治療のためのものであり得る。
肺炎連鎖球菌莢膜糖類
本使用及び方法は、肺炎球菌によって引き起こされる疾患(例えば髄膜炎、敗血症、肺炎等)の予防及び/又は治療のためのものであり得る。
本使用及び方法は、肺炎球菌によって引き起こされる疾患(例えば髄膜炎、敗血症、肺炎等)の予防及び/又は治療のためのものであり得る。
定義
本発明の実施は、別に示されない限り、当技術分野における技能の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、参考文献199及び293〜299等を参照のこと。
本発明の実施は、別に示されない限り、当技術分野における技能の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、参考文献199及び293〜299等を参照のこと。
「GI」ナンバリングを上記で使用する。GI番号、すなわち「GenInfo Identifier」は、NCBIのデータベースに配列が加えられたときにNCBIによって処理される各配列記録に連続的に割り当てられる一連の数字である。GI番号は、配列記録の受託番号とは異なる。配列が更新されると(例えば修正のため、又はさらなる注釈又は情報を追加するため)、その配列は新たなGI番号を受ける。このため、所与のGI番号と関連する配列は決して変わらない。
抗原「ドメイン」が欠如している場合、これは、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン等の欠如を伴い得る。
抗原「ドメイン」が欠如している場合、これは、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン等の欠如を伴い得る。
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は、Xのみからなるか、又は何か付加的なものを含み得る(例えばX+Y)。用語「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」は、組成物、方法又は構造が、付加的な成分、ステップ及び/又は部分を含み得ることを意味するが、これは上記付加的な成分、ステップ及び/又は部分が、請求される組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合だけである。用語「からなる(consisting of)」は、一般的には、請求される発明が、特許請求の範囲において具体的に列挙される構成要素(均等論が適用可能である限り、それらの均等物を含み得る)に限定されることを意味すると理解される。
数値xに関する用語「約」は、例えば、その値の+2の標準偏差を意味する。特定の実施形態において、「約」は、特定の技術の範囲内の許容可能な変動及び許容度として理解される。例えば、測定可能な値(例えば、量、持続時間等)について言及する場合、この値は、特定された値から±20%又は±10%、好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、さらにより好ましくは±0.1%の変動を包含し得るが、これは、このような変動が開示された方法を実施するために適切であるためである。
「実質的に」との語は、「完全に」を除外するものではなく、例えばYを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。例えば、Yを「実質的に含まない」は、5%以下のY、4%以下のY、3%以下のY、2%以下のY、1%以下のY、又は0.1%以下のYを含む組成物として理解することができる。必要であれば、「実質的に」との語は、本発明の定義から欠如していてもよい。
アミノ酸に関して、用語「標準」は、そのアミノ酸が、普遍的遺伝子コードによってコードされる20種のアミノ酸(すなわちアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、プロリン、トリプトファン、トレオニン、チロシン及びバリン)の1つであることを意味する。
本明細書中で使用される「a」及び「the」は、文脈によって別に明確に示されない限り、単数と複数の両方を含むと理解される。
本明細書中で使用される「a」及び「the」は、文脈によって別に明確に示されない限り、単数と複数の両方を含むと理解される。
本明細書中で使用される用語「フラグメント」は、別の配列の一部である配列を指す。核酸又はアミノ酸配列の文脈において用いられる場合、用語「フラグメント」及び「サブシーケンス」は互換的に用いられる。これらの用語は、インタクトな又は完全な野生型ポリペプチドの一部又は部分であるが、インタクトな又は完全な野生型ポリペプチドより少ないアミノ酸残基を含む一部又は部分を指すために用いられる。このため、この用語は、野生型又は参照ポリペプチドの1以上の領域に対応する切断アミノ酸配列又はより短いアミノ酸配列を指す。当業者には明らかであるが、このようなフラグメントは、参照配列の切断フラグメント又はより短いフラグメントであり、このようなフラグメントは、例えば「タグ」配列(例えば、Hisタグ又はグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ)、リンカー配列等を含む融合ポリペプチドを形成するために参照ポリペプチド中には見出されない付加的配列を含むように改変されていてもよい。従って、このような改変されたフラグメントにおいて、フラグメントのN末端アミノ酸のアミノ基は、参照ポリペプチド中でそれが結合しているアミノ酸のカルボキシル基にぺプチド結合によって結合されておらず、及び/又はフラグメントのC末端アミノ酸のカルボキシル基は、参照ポリペプチド中でそれが結合しているアミノ酸のアミノ基にぺプチド結合によって結合されていない。第1のポリペプチドと第2のポリペプチドの同一性パーセントは、一般的に、第1及び第2のポリペプチド間のマッチした位置の数を計数し、その数を最も短いポリペプチドの全長で割り、その後得られた値に100を掛けることによって決定される。ポリペプチドのフラグメントについては、この値は、通常、約100%となるように決定されるため、ほとんど意味を有さない。従って、本発明のフラグメントの文脈において、用語「参照ポリペプチドの割合」(パーセントで表される)を用いることができる。参照ポリペプチドの割合は、フラグメントと参照ポリペプチド間のマッチした位置の数を計数し、その数を参照ポリペプチドの全長で割り、その後得られた値に100を掛けることによって計算される。特に、フラグメントは、参照ポリペプチドの配列の90、80、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25%未満又は20%未満の配列を含む。
具体的に記載されない限り、2種以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合のいずれかの特定の順序を必要としない。従って、成分を任意の順序で混合することができる。3種の成分が存在する場合、2種の成分を互いに組み合わせて、その後この組み合わせを第3の成分と組み合わせることができる。
動物(及び特にウシ)材料が細胞の培養液中で用いられる場合、これらは、感染性海綿状脳症(TSE)のない供給源、特に牛海綿状脳症(BSE)のない供給源から得るべきである。全体として、細胞を、動物由来物質の完全不存在下で培養することが好ましい。
ある化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、好適なプロドラッグで代替的に置換され得る。
2つのアミノ酸配列間の配列同一性パーセントへの言及は、整列させた場合、そのパーセンテージのアミノ酸が2つの配列の比較において同一であることを意味する。一般的には、配列同一性パーセントは、同一のアミノ酸の数をより長い配列中のアミノ酸の総数で割ることによって計算される。このアライメント及び相同性パーセント又は配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム(例えば参考文献300の節7.7.18中に記載されているもの)を用いて決定することができる。好ましいアライメントは、12のギャップオープンペナルティ及び2のギャップ伸長ペナルティ、62のBLOSUMマトリックスでアフィンギャップサーチを用いるSmith-Watermanホモロジーサーチアルゴリズムにより決定される。Smith-Watermanホモロジーサーチアルゴリズムは、参考文献301に開示されている。
本明細書中で提供される全てのGenBank受託番号は、本出願の出願日に入手可能なバージョンで参照により組み込まれる。
本明細書中で提供される全てのGenBank受託番号は、本出願の出願日に入手可能なバージョンで参照により組み込まれる。
[実施例1:GBS59(6XD3)-GBS1523融合物]
融合タンパク質「GBS59(6XD3)-GSG4-1523」の遺伝子(配列番号276)は、プライマー59pipeF(配列番号278)、59GSG41523.R(配列番号281)を用いて、59(6XD3)の遺伝子を(再びgeneart社から購入した合成遺伝子から)増幅し、またプライマー59GSG41523.F(配列番号280)及び1523pipe.R(配列番号279)を用いて、gbs1523遺伝子をGBS COHI株のゲノムDNAから増幅することによる、PIPEクローニングによって生成した。GSG4リンカー(配列番号272)に対応する18bpの重複領域(配列番号282)を含む2つのI-PCRを、pET15 TEVベクター-PCR(N末端6XHIS-TEVタグ(配列番号79及び275として開示される「6XHIS」)をコードする)を用いるPIPE反応中で同時使用し、大腸菌のHK100株中で共形質転換した。正確な配列は、得られたクローンのDNA配列決定により確認された。
融合タンパク質「GBS59(6XD3)-GSG4-1523」の遺伝子(配列番号276)は、プライマー59pipeF(配列番号278)、59GSG41523.R(配列番号281)を用いて、59(6XD3)の遺伝子を(再びgeneart社から購入した合成遺伝子から)増幅し、またプライマー59GSG41523.F(配列番号280)及び1523pipe.R(配列番号279)を用いて、gbs1523遺伝子をGBS COHI株のゲノムDNAから増幅することによる、PIPEクローニングによって生成した。GSG4リンカー(配列番号272)に対応する18bpの重複領域(配列番号282)を含む2つのI-PCRを、pET15 TEVベクター-PCR(N末端6XHIS-TEVタグ(配列番号79及び275として開示される「6XHIS」)をコードする)を用いるPIPE反応中で同時使用し、大腸菌のHK100株中で共形質転換した。正確な配列は、得られたクローンのDNA配列決定により確認された。
タグなし59(6XD3)-GSG4-1523融合タンパク質を生成するため、プライマー596xD3 NheI F(配列番号283)及び1523 XhoI Stop R(配列番号284)を用いて、59(6XD3)-GSG4-1523遺伝子を、pET15-TEV-59(6XD3)-GSG4-1523クローン(配列番号272として開示される「GSG4」)からさらに増幅した。PCR生成物をNheI/XhoI制限酵素で切断し、予め同じ制限酵素で消化したpET24b+ベクター(novagen社)へとライゲーションした。このライゲーション反応で、大腸菌DH5a細胞中に形質転換され、このクローンの正確な配列は、DNA配列決定により確認された。
pET24-59(6XD3)-GSG4-1523クローン(カナマイシン耐性)を、BL21(DE3)t1耐性株(NEB)中に形質転換した。タンパク質発現は、1つの単一コロニーをLB-PTK+カナマイシン培地中に播種し、IPTGの添加によりタンパク質発現を誘導することによって達成された。
組換えタンパク質発現のため、1mM IPTGによるpETクローンの誘導後、培養を25℃で5時間維持した。全ての組換えタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過により精製された。手短に言えば、細胞を遠心分離により回収し、10mMイミダゾール、1mg/mlリゾチーム、0.5 mg/ml DNAse及びCOMPLETE阻害剤カクテル(Roche社)をPBS中に含む「溶解バッファー」に溶解した。溶解物を遠心分離により清澄化し、10mMイミダゾールを含むPBS中で前平衡化したHis-Trap HPカラム(Armesham Biosciences社)上にアプライした。20mMイミダゾールバッファー及び50mMイミダゾールバッファーを使用した2回の洗浄ステップ後、250mMイミダゾールを含む同バッファーを用いてタンパク質溶出を行った。次いで溶出したタンパク質を濃縮し、PBS中で前平衡化したHiLoaD 16/60 Superdex 75(Amersham Biosciences社)上にロードした。
[実施例2:GBS59(6XD3)-GBS1523による免疫化は保護をもたらす]
GBS59(6XD3)-GBS1523-HIS融合物を、様々なGBSチャレンジ株に対する保護をもたらすその能力について試験した。別々の群のマウスをGBS59(6XD3)-GBS1523-HIS融合物で免疫化し、その後異なるGBS59アレルを発現する、又はGBS1523を発現する異なるGBSチャレンジ株でチャレンジした。PBSによる免疫化を陰性対照として用いた。表5に示されるとおり、融合物中のGBS59抗原及びGBS1523抗原の存在は、GBS59を発現する株に対する保護及びGBS1523を発現する株に対する保護をもたらした。
GBS59(6XD3)-GBS1523-HIS融合物を、様々なGBSチャレンジ株に対する保護をもたらすその能力について試験した。別々の群のマウスをGBS59(6XD3)-GBS1523-HIS融合物で免疫化し、その後異なるGBS59アレルを発現する、又はGBS1523を発現する異なるGBSチャレンジ株でチャレンジした。PBSによる免疫化を陰性対照として用いた。表5に示されるとおり、融合物中のGBS59抗原及びGBS1523抗原の存在は、GBS59を発現する株に対する保護及びGBS1523を発現する株に対する保護をもたらした。
重要なことに、GBS1523を含む融合物は、異なるGBS59アレルを発現する株に対して、WO2011/121576に開示されるGBS59(6XD3)融合物によって得られる保護と同等の保護をもたらし、GBS1523の添加が免疫原性にマイナスの影響を与えないことを示している。
[実施例3:GBS PS-IIのための担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲート]
GBS II型多糖類の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を、他の担体タンパク質と比較した。マウスの群に、3回用量のミョウバン中の関連糖類コンジュゲートを、1用量当たり1μgタンパク質の用量で投与した。表6に示されるとおり、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、GBS II型多糖用の特に有効な担体であり、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIで免疫化したマウスの100%が、GBS II型5401株によるチャレンジを生き延びた。注目すべきことに、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIによりもたらされる保護は、CRM-IIによってもたらされる保護(85%生存)より大きく、GBS80-IIによってもたらされる保護(78%生存)より大きかった。さらに、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIは、III型COH1株及びIa型515株によるチャレンジに対して優れた保護をもたらした(それぞれ100%生存、40%生存)。
GBS II型多糖類の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を、他の担体タンパク質と比較した。マウスの群に、3回用量のミョウバン中の関連糖類コンジュゲートを、1用量当たり1μgタンパク質の用量で投与した。表6に示されるとおり、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、GBS II型多糖用の特に有効な担体であり、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIで免疫化したマウスの100%が、GBS II型5401株によるチャレンジを生き延びた。注目すべきことに、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIによりもたらされる保護は、CRM-IIによってもたらされる保護(85%生存)より大きく、GBS80-IIによってもたらされる保護(78%生存)より大きかった。さらに、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIは、III型COH1株及びIa型515株によるチャレンジに対して優れた保護をもたらした(それぞれ100%生存、40%生存)。
組成物によって誘発される、II型糖類に特異的な抗体の力価は図1に示される。GBS59(6XD3)-GBS1523-IIは、高力価の特異的抗体を誘発し、この力価は、CRM-IIによって誘発される力価と同等か又はより高い。先と同様に、これらのデータは、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIにより示される、例えばCRM-IIと比較して増加した保護が、単にGBS抗原を含む担体タンパク質の存在の結果に過ぎないわけではないことを示すため、有意である。そうではなく、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、担体分子として有効であり、II型糖類抗原に特異的な免疫応答を高める。GBS59(6XD3)-GBS1523-II組成物によって誘発されるGBS59及びGBS1523に特異的な抗体の力価を図2に示す。
[実施例4:GBS PS-Vのための担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲート]
GBS V型多糖類の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を、他の担体タンパク質と比較した。マウスの群に、3回用量のミョウバン中の関連糖類コンジュゲートを、1用量当たり1μgタンパク質の用量で投与した。表7に示されるとおり、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、GBS V型多糖類の特に有効な担体であり、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vで免疫化したマウスの86%が、GBS V型CJB111株によるチャレンジを生き延びた。さらに、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vは、III型COH1株によるチャレンジに対して優れた保護をもたらした(60%生存)。
GBS V型多糖類の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を、他の担体タンパク質と比較した。マウスの群に、3回用量のミョウバン中の関連糖類コンジュゲートを、1用量当たり1μgタンパク質の用量で投与した。表7に示されるとおり、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、GBS V型多糖類の特に有効な担体であり、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vで免疫化したマウスの86%が、GBS V型CJB111株によるチャレンジを生き延びた。さらに、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vは、III型COH1株によるチャレンジに対して優れた保護をもたらした(60%生存)。
[実施例5:担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523の、破傷風トキソイド、CRM197及びGBS80に対する効力]
GBS II型及びV型多糖類の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を、TT、CRM197及びGBS80とも比較した。8匹のマウスの群に、3回用量のミョウバン中の関連糖類コンジュゲートを、1用量当たり1μg糖類及び400μgミョウバンの用量で投与した。表8に示されるとおり、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIによる免疫化は、II型5401株によるチャレンジに対して、CRM-II及びGBS80-IIより大きな保護をもたらし、さらにまた、TT-IIより大きな保護をもたらした。
GBS II型及びV型多糖類の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を、TT、CRM197及びGBS80とも比較した。8匹のマウスの群に、3回用量のミョウバン中の関連糖類コンジュゲートを、1用量当たり1μg糖類及び400μgミョウバンの用量で投与した。表8に示されるとおり、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIによる免疫化は、II型5401株によるチャレンジに対して、CRM-II及びGBS80-IIより大きな保護をもたらし、さらにまた、TT-IIより大きな保護をもたらした。
図3は、この研究において異なるコンジュゲートによって誘発される抗II型糖類抗体の幾何平均力価を示す。GBS59(6XD3)-GBS1523-IIによって誘発される力価は、CRM-II及びGBS80-IIの場合より大きかった。これらのデータは、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIにより示される、例えばCRM-IIと比較して増加した保護が、単にGBS抗原を含む担体タンパク質の存在の結果に過ぎないわけではないことを示すため、有意である。そうではなく、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、担体分子として有効であり、II型糖類抗原に特異的な免疫応答を高める。
図4は、この研究において異なるコンジュゲートによって誘発される抗V型糖類抗体の幾何平均力価を示す。GBS59(6XD3)-GBS1523-Vによって誘発される力価は、CRM-V及びGBS80-Vの場合より大きかった。これらのデータは、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vにより示される、例えばCRM-Vと比較して増加した保護が、単にGBS抗原を含む担体タンパク質の存在の結果に過ぎないわけではないことを示すため、有意である。そうではなく、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、担体分子として有効であり、V型糖類抗原に特異的な免疫応答を高める。
試験した組成物により誘発された、V型糖類に特異的な抗体の力価を図5に示す。GBS59(6XD3)-GBS1523-Vは高力価の特異的抗体を誘発し、この力価は、CRM-Vによって誘発される力価と同等か又はより高かった。先と同様に、これらのデータは、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vにより示される、例えばCRM-Vと比較して増加した保護が、単にGBS抗原を含む担体タンパク質の存在の結果に過ぎないわけではないことを示すため、有意である。そうではなく、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートは、担体分子として有効であり、V型糖類抗原に特異的な免疫応答を高める。
GBS59(6XD3)-GBS1523-V組成物によって誘発される、GBS59及びGBS1523に特異的な抗体の力価を図6に示す。
GBS59(6XD3)-GBS1523-V組成物によって誘発される、GBS59及びGBS1523に特異的な抗体の力価を図6に示す。
[実施例6:全てのGBSタンパク質が有効な担体タンパク質であるとは限らない]
他のGBSタンパク質の、担体タンパク質として機能する能力を、莢膜多糖モデルとしてラミナリンを用いて試験した。以下のタンパク質:CRM197、GBS01132、GBS01157、GBS52(uniprot Q8E0S8);GBS150及びSAN1516(GBS線毛島由来の補助タンパク質を含む)をラミナリンにコンジュゲートし、先に記載したとおり、マウスを免疫化するために用いた。1つのタンパク質(GBS52)だけが、ベンチマークとして使用されるラミナリン-CRM197コンジュゲートと同等の抗ラミナリンIgG力価を誘発する担体タンパク質として機能することができた(図7)。従って、GBSタンパク質抗原の、例えばCRM197の代わりに担体タンパク質として機能する能力は、それらの免疫応答を誘導する能力とは無関係である。
他のGBSタンパク質の、担体タンパク質として機能する能力を、莢膜多糖モデルとしてラミナリンを用いて試験した。以下のタンパク質:CRM197、GBS01132、GBS01157、GBS52(uniprot Q8E0S8);GBS150及びSAN1516(GBS線毛島由来の補助タンパク質を含む)をラミナリンにコンジュゲートし、先に記載したとおり、マウスを免疫化するために用いた。1つのタンパク質(GBS52)だけが、ベンチマークとして使用されるラミナリン-CRM197コンジュゲートと同等の抗ラミナリンIgG力価を誘発する担体タンパク質として機能することができた(図7)。従って、GBSタンパク質抗原の、例えばCRM197の代わりに担体タンパク質として機能する能力は、それらの免疫応答を誘導する能力とは無関係である。
[実施例7:多価ワクチン中の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲート-保護]
GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートを、他の担体-糖類コンジュゲートと組み合わせて使用した場合のその効力について試験した。特に、GBS59(6XD3)-GBS1523-II及びGBS59(6XD3)-GBS1523-Vコンジュゲートを、CRMにコンジュゲートしたIa、Ib及びIII型GBS糖類を含む三価ワクチン、及びGBS80コンジュゲートと組み合わせた。これらの四価及び五価組成物によってもたらされる保護を、三価ワクチンをCRM197及びGBS80にコンジュゲートした血清型II及びV糖類と組み合わせて含む組成物と比較した。
GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートを、他の担体-糖類コンジュゲートと組み合わせて使用した場合のその効力について試験した。特に、GBS59(6XD3)-GBS1523-II及びGBS59(6XD3)-GBS1523-Vコンジュゲートを、CRMにコンジュゲートしたIa、Ib及びIII型GBS糖類を含む三価ワクチン、及びGBS80コンジュゲートと組み合わせた。これらの四価及び五価組成物によってもたらされる保護を、三価ワクチンをCRM197及びGBS80にコンジュゲートした血清型II及びV糖類と組み合わせて含む組成物と比較した。
表9及び10は、単独で又は他の糖類コンジュゲートと組み合わせて投与した場合の、II型及びV型糖類の両方の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートの効力を示す。GBS59(6XD3)-GBS1523-IIは、コンジュゲートを個別に投与する場合、CRM-II及びGBS80-IIより優れた、血清型II 5401株に対する保護をもたらす(67%及び69%生存に対して90%生存)。血清型II 5401株に対する改善された保護は、GBS59(6XD3)-GBS1523-IIコンジュゲートを、三価CRM-Ia/Ib/III組成物と組み合わせた場合に維持される。GBS59(6XD3)-GBS1523-II及びCRM-Ia/Ib/IIIを含む四価組成物は、CRM-II及びCRM-Ia/Ib/IIIを含む組成物より高い保護(73%生存に対して81%生存)をもたらす。この保護は、GBS80-Vを加えて五価組成物を生成した場合にさらに増加する(96%生存)。
さらに、GBS59(6XD3)-GBS1523-Vは、CRM-Vによりもたらされる保護と同等の、血清型V CJB111株に対する強い保護をもたらす。GBS59(6XD3)-GBS1523-Vは、三価CRM-Ia/Ib/III組成物と組み合わせて四価組成物及び五価組成物を生成した場合にも有効である。
これらのデータはまた、GBS59(6XD3)-GBS1523担体を含む多価組成物が特に有効であり、また先行技術での担体であるCRMに依存する組成物によって示される担体誘導性抑制に悩まされないことを示唆する。マウスモデルにおいて高レベルのCRM197を使用した場合に、恐らくは担体誘導性エピトープ抑制(CIES)に起因して、血清型II 5401株に対する顕著な量の保護が喪失した(保護は73%から48%まで低下した。)。対照的に、表9及び10は、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートを含む五価組成物のそれぞれが、対応する四価組成物と比較して増加した保護をもたらしたことを示す。これは、担体分子にとって特に有利な性質であり、様々な異なる生物、及び生物の様々な異なる株に対する保護をもたらすための有効な多価組成物の開発を可能とする。
GBS59(6XD3)-GBS1523-II及びGBS59(6XD3)-GBS1523-Vコンジュゲートはまた、三価CRM-Ia/Ib/III組成物及びGBS80コンジュゲートと組み合わせた場合に異種株に対する保護をもたらすそれらの能力についても試験された。以下の表11及び12に示されるとおり、上記コンジュゲートによりもたらされた保護は中程度であったが、PBS並びにGBS59(6XD3)-GBS1523及びGBS80タンパク質自体によってもたらされた保護より大きかった。
[実施例8:多価ワクチン中の担体としてのGBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲート- 抗体力価]
4つのさらなる研究において、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートが多価ワクチンにおいて血清型II及び血清型V糖類に対する抗体応答を増強する能力を、CRMと比較した。
4つのさらなる研究において、GBS59(6XD3)-GBS1523コンジュゲートが多価ワクチンにおいて血清型II及び血清型V糖類に対する抗体応答を増強する能力を、CRMと比較した。
図8は、様々な異なる多価ワクチン組成物によって誘発される、II型糖類に特異的な抗体の力価を示す(「Triv.」は、CRM-Ia/Ib/III三価ワクチンを指す)。GBS59(6XD3)-GBS1523担体を含む組成物によって誘発された力価は、CRM-コンジュゲートを含む対応する組成物によって誘発された力価より大きかった。重要なことには、五価GBS59(6XD3)-GBS1523担体組成物では、多糖干渉は観察されなかった。完全CRM197コンジュゲート組成物では、恐らくは特定のマウスモデルにおいて使用された高レベルのCRM197に由来する担体免疫エピトープ抑制の結果として、より分散した免疫応答が見られる。
図9は、様々な異なる多価ワクチン組成物によって誘発される、V型糖類に特異的な抗体の力価を示す(「Triv.」は、CRM-Ia/Ib/III三価ワクチンを指す)。GBS59(6XD3)-GBS1523担体を含む組成物によって誘発された力価は、CRM-コンジュゲートを含む対応する組成物によって誘発された力価より大きかった。重要なことに、五価GBS59(6XD3)-GBS1523担体組成物では、多糖干渉は観察されなかった。
図10及び11は、図8及び9に示されるデータの一部のさらなる統計的分析を示す。GBS59(6XD3)-GBS1523担体が、CRM197組成物より統計的に有意により有効であったことがわかる。
全てのGBS単離体は線毛を有するため、マウスにおいて保護を与え、3つのタンパク質(線毛1の骨格タンパク質(GBS80)及び線毛2bの骨格タンパク質(GBS1523)並びに線毛2aの6つの骨格変異体のキメラ融合物(GBS59))の組み合わせは、より広範囲のGBS単離体に対する保護を与える可能性があり、GBS感染症の予防のためのより効率的な解決策となる。
3つのタンパク質の混合物と比較して、融合タンパク質のアプローチは、実質的な利点を与える:融合タンパク質は、より規定された生成物であり、また、組換え発現及び精製ステップの数を低下させ、ワクチンの費用及び実現可能性に関して差をもたらす。線毛2aキメラタンパク質と線毛2b骨格タンパク質との融合物は、各ドメインが個々に正しくフォールディングしている高発現且つ安定な抗原をもたらした。
組換えキメラは、単独で又はGBS多糖類とコンジュゲートして、線毛2b変異体又は線毛2a変異体を有するGBS株のいずれかでチャレンジされたマウスにおいて強い保護を与えた。
[実施例9 - spb1のドメイン(BP-2b、GBS1523)]
防御免疫応答を誘導するエピトープは、免疫原性タンパク質中の特定のドメインに限定されている。ドメインが同定されると、ワクチンの観点からは重要でない領域が欠如したワクチン抗原として使用するため、これらのドメインを組換え型で発現させることができる。タンパク質ドメインを用いる利点の1つは、これらが典型的には構造的に秩序化されており、in vitroで容易に取り扱うことが可能であり、2つ以上の免疫原性ドメインを有する合成融合タンパク質の構築をさらに簡単にすることである。このため、融合タンパク質のspb1(GBS1523)領域をさらに最適化し得るか否かを決定するために、構造的ワクチン技術を適用し、保護エピトープを有する最小ドメインを定義した。
防御免疫応答を誘導するエピトープは、免疫原性タンパク質中の特定のドメインに限定されている。ドメインが同定されると、ワクチンの観点からは重要でない領域が欠如したワクチン抗原として使用するため、これらのドメインを組換え型で発現させることができる。タンパク質ドメインを用いる利点の1つは、これらが典型的には構造的に秩序化されており、in vitroで容易に取り扱うことが可能であり、2つ以上の免疫原性ドメインを有する合成融合タンパク質の構築をさらに簡単にすることである。このため、融合タンパク質のspb1(GBS1523)領域をさらに最適化し得るか否かを決定するために、構造的ワクチン技術を適用し、保護エピトープを有する最小ドメインを定義した。
組換えタンパク質のクローニング、発現及び精製
予測されるN末端シグナルペプチド及びC末端膜貫通ドメインを有さない線毛2b骨格タンパク質BP-2b30-468(完全長spb1)、及びN末端ドメイン1を欠如しているBP-2b185-468(BP-2bD2+D3、配列番号285)、並びに3つの単一ドメイン(D130-184、D2185-356、D3347-468、配列番号287、289、291)をコードする遺伝子を、GBS COH1株(SAN-_1518)からPCR増幅し、pET21b+ベクター中にクローン化し、C末端His-タグ化タンパク質として発現させた。LB培地、又はBiosilta EnBase培地中で増殖させた大腸菌BL21(DE3)(Novagen社)細胞中でタンパク質を発現させた。可溶性タンパク質を、Tris(pH7.5)、300mM NaCl、10mMイミダゾール中で可溶化した細胞溶解sigma試薬を用いることによって抽出し、FF-Crude His-Trap HPニッケルキレーティングカラムにより精製した(Amersham Bioscience社)。300mMイミダゾールで溶出した組換えタンパク質を限外ろ過により10mg/mlまで濃縮し、50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mM NaCl中で前平衡化したHiLoaD 26/60 Superdex 75(Amersham Biosciences社)上にロードした。純粋画分中のタンパク質存在量を、BCAアッセイ(Pierce社)で定量した。
予測されるN末端シグナルペプチド及びC末端膜貫通ドメインを有さない線毛2b骨格タンパク質BP-2b30-468(完全長spb1)、及びN末端ドメイン1を欠如しているBP-2b185-468(BP-2bD2+D3、配列番号285)、並びに3つの単一ドメイン(D130-184、D2185-356、D3347-468、配列番号287、289、291)をコードする遺伝子を、GBS COH1株(SAN-_1518)からPCR増幅し、pET21b+ベクター中にクローン化し、C末端His-タグ化タンパク質として発現させた。LB培地、又はBiosilta EnBase培地中で増殖させた大腸菌BL21(DE3)(Novagen社)細胞中でタンパク質を発現させた。可溶性タンパク質を、Tris(pH7.5)、300mM NaCl、10mMイミダゾール中で可溶化した細胞溶解sigma試薬を用いることによって抽出し、FF-Crude His-Trap HPニッケルキレーティングカラムにより精製した(Amersham Bioscience社)。300mMイミダゾールで溶出した組換えタンパク質を限外ろ過により10mg/mlまで濃縮し、50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mM NaCl中で前平衡化したHiLoaD 26/60 Superdex 75(Amersham Biosciences社)上にロードした。純粋画分中のタンパク質存在量を、BCAアッセイ(Pierce社)で定量した。
細菌株、培地、及び増殖条件
ストレプトコッカス・アガラクティエ株を、Todd Hewitt Broth(Difco Laboratories社)、又は5%ヒツジ血液を添加したトリプチカーゼダイズ寒天中で、5%CO2中、37℃で増殖させた。
マウス活性母系免疫化モデル
以前に記載されたとおりに(Maione et al、2005)、GBS感染症のマウス母系免疫化/仔チャレンジモデルを用いて抗原の防御効力を確認した。手短に言えば、5匹のCD-1雌マウス(6〜8週齢)の群を、1、21及び35日目に、PBS又はミョウバン製剤中1用量当たり20μgのタンパク質のいずれかで免疫化した。マウスは、最後の免疫化の3日後に出産した。出生から48時間以内に、90%死亡率を引き起こすように計算された1回用量のGBS細菌(COH1株)を、仔に腹腔内注射した。マウスを毎日モニタリングし、マウスが、ノバルティス動物福祉政策(Novartis Animal Welfare Policies)に従って研究のために予め確立された規定の人道的エンドポイントを示した場合には安楽死させた。フィッシャーの精密検定を用いて統計的分析を行った。
以前に記載されたとおりに(Maione et al、2005)、GBS感染症のマウス母系免疫化/仔チャレンジモデルを用いて抗原の防御効力を確認した。手短に言えば、5匹のCD-1雌マウス(6〜8週齢)の群を、1、21及び35日目に、PBS又はミョウバン製剤中1用量当たり20μgのタンパク質のいずれかで免疫化した。マウスは、最後の免疫化の3日後に出産した。出生から48時間以内に、90%死亡率を引き起こすように計算された1回用量のGBS細菌(COH1株)を、仔に腹腔内注射した。マウスを毎日モニタリングし、マウスが、ノバルティス動物福祉政策(Novartis Animal Welfare Policies)に従って研究のために予め確立された規定の人道的エンドポイントを示した場合には安楽死させた。フィッシャーの精密検定を用いて統計的分析を行った。
相補ベクターの構築及び部位特異的突然変異誘発
ピリンタンパク質BPの表面曝露エピトープを標的とするモノクローナル抗体が、個々のBPドメイン、BP完全長タンパク質、BPD2+D3並びに単一ドメインD1、D2及びD3を認識し得る可能性を検証するため、ウェスタンブロッティングにより試験した。
ピリンタンパク質BPの表面曝露エピトープを標的とするモノクローナル抗体が、個々のBPドメイン、BP完全長タンパク質、BPD2+D3並びに単一ドメインD1、D2及びD3を認識し得る可能性を検証するため、ウェスタンブロッティングにより試験した。
モノクローナル抗体(mAb)による免疫ブロットから得られた結果を図13に示す。個々のドメインの検出可能な染色なしに、D2+D3タンパク質フラグメント及び完全spb1の予測分子量に対応する特異的バンドが観察された。対照として、本発明者らは、BPの全ての組換えサブドメインを検出することが可能な、完全長組換えBPに対して惹起されたマウス血清を使用した(データは示さず)。この結果は、モノクローナル抗体が、完全長の結晶化BPD2+D3中に含まれるエピトープを認識するが、別個のD2及びD3ドメインは認識しないことを示唆している。これらのデータは、個別のドメインD2又はD3が正しくフォールディングしていないことを示唆している。いずれの抗体も、完全長野生型BP-2bタンパク質(組換えの又はGBSによって発現される天然の)及び組換えD2+D3タンパク質フラグメントは検出することができるが、D2又はD3の単一の組換えドメインは検出することができない。
BP-2b D2+D3 は、完全長タンパク質の免疫学的特性を保持する
最後に、BPD2+D3の免疫学的特性を、完全長タンパク質及び単一のD1ドメインと比較して研究するため、精製組換えタンパク質を独立して用いて、CD1マウスを免疫化し、それぞれの保護活性を、活性母系マウス免疫化/新生仔チャレンジモデルにおいて試験した。チャレンジのため、本発明者らは、その表面上に高レベルのBP-2b タンパク質を発現するGBS COH1株を使用した。以下に示すとおり、BPD2+D3 構築物は、完全長タンパク質と同等のレベルまでin vivo保護を与え、BP-2b中の保護エピトープがタンパク質のこの部分に特異的に集中しており、他方、D1ドメインはマウスにおける保護には不要であると考えられることを示唆している。図14は、完全長spb1(GBS1523)及びspb1D2+D3(GBS1523D2+D3)は強く認識するが、spb1D1(GBS1523D1)は認識しないヒト患者由来の血清によるウェスタンブロッティングを示す。
最後に、BPD2+D3の免疫学的特性を、完全長タンパク質及び単一のD1ドメインと比較して研究するため、精製組換えタンパク質を独立して用いて、CD1マウスを免疫化し、それぞれの保護活性を、活性母系マウス免疫化/新生仔チャレンジモデルにおいて試験した。チャレンジのため、本発明者らは、その表面上に高レベルのBP-2b タンパク質を発現するGBS COH1株を使用した。以下に示すとおり、BPD2+D3 構築物は、完全長タンパク質と同等のレベルまでin vivo保護を与え、BP-2b中の保護エピトープがタンパク質のこの部分に特異的に集中しており、他方、D1ドメインはマウスにおける保護には不要であると考えられることを示唆している。図14は、完全長spb1(GBS1523)及びspb1D2+D3(GBS1523D2+D3)は強く認識するが、spb1D1(GBS1523D1)は認識しないヒト患者由来の血清によるウェスタンブロッティングを示す。
例示的GBS59(6xD3)-GBS1523D2+D3の配列は、配列番号293として提供される。GBS59の7つのD3サブドメイン及びGBS1523のD2+D3ドメインを含む本発明のさらなる例示的担体であるGBS59(7xD3SUB)-GBS1523D2+D3の配列は、配列番号294として提供される。GBS1523のドメインD1、D2及びD3の変異配列は、配列番号288、290及び292に提供される。
Claims (15)
- 抗原及び担体分子を含むコンジュゲートであって、担体分子がストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)BP-2aポリペプチド及びストレプトコッカス・アガラクティエspb1ポリペプチドを含む、上記コンジュゲート。
- spb1ポリペプチドが
(a)配列番号206のアミノ酸配列;
(b)(a)のアミノ酸185〜468からなるフラグメント;又は
(c)(a)若しくは(b)に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1記載のコンジュゲート。 - BP-2aポリペプチドが
(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択されるアミノ酸配列;
(b)配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46及び配列番号48からなる群より選択されるアミノ酸配列;
(c)(a)の200個未満の連続したアミノ酸のフラグメント;又は
(d)(a)、(b)若しくは(c)に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1又は2記載のコンジュゲート。 - 担体分子が、ストレプトコッカス・アガラクティエの異なる株由来の2種以上のBP-2aポリペプチドを1本のポリペプチド鎖として含む、請求項1、2又は3記載のコンジュゲート。
- 担体分子が、1本のポリペプチド鎖として:
(i) 配列番号36のアミノ酸配列、又は配列番号36に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むBP-2aポリペプチド;
(ii) 配列番号38のアミノ酸配列、又は配列番号38に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むBP-2aポリペプチド;
(iii) 配列番号40のアミノ酸配列、又は配列番号40に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むBP-2aポリペプチド;
(iv) 配列番号42のアミノ酸配列、又は配列番号42に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むBP-2aポリペプチド;
(v) 配列番号44のアミノ酸配列、又は配列番号44に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むBP-2aポリペプチド;及び
(vi) 配列番号46のアミノ酸配列、又は配列番号46に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むBP-2aポリペプチド;及び
(vii) 配列番号206のアミノ酸185〜468を含むspb1ポリペプチド
を含む、請求項4記載のコンジュゲート。 - ポリペプチド鎖が式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH
[式中、Aは任意のN-末端アミノ酸配列であり;Bは任意のC-末端アミノ酸配列であり;nは2以上の整数(例えば2、3、4、5、6等)であり;XはそれぞれBP-2aポリペプチド又はspb1ポリペプチドのアミノ酸配列であって、少なくとも1個のXがBP-2aポリペプチドであり、少なくとも1個のXがspb1ポリペプチドであり;そしてLは任意のリンカーアミノ酸配列である]
のものである、請求項4又は5記載のコンジュゲート。 - ポリペプチド鎖が、配列番号276に対して少なくとも70%(例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%)の同一性を有するアミノ酸配列、特に配列番号276のアミノ酸配列を含む、請求項4〜6のいずれか1項記載のコンジュゲート。
- 抗原が糖類である、請求項1〜7のいずれか1項記載のコンジュゲート。
- 糖類がストレプトコッカス・アガラクティエ由来の莢膜糖類である、請求項8記載のコンジュゲート。
- 糖類がストレプトコッカス・アガラクティエの血清型II又はV由来の莢膜糖類である、請求項9記載のコンジュゲート。
- 医薬における使用のための、請求項1〜10のいずれか1項記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載のコンジュゲートを製薬上許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物。
- Ia、Ib、II、III及びV型からなる群より選択されるストレプトコッカス・アガラクティエの少なくとも2つの血清型由来の糖類を含むコンジュゲート混合物を含有する、請求項12記載の医薬組成物。
- (i)CRM197にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型Ia、Ib及びIII由来の糖類、及び(ii)GBS80にコンジュゲートしたストレプトコッカス・アガラクティエ血清型II又はV由来の糖類、を含有する、請求項13記載の医薬組成物。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載のコンジュゲート、又は請求項12〜14のいずれか1項記載の医薬組成物の免疫学的有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を惹起するための方法。
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