JP6170932B2 - ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含むキャリア分子 - Google Patents

Description

この出願は、２０１１年１１月７日に出願された米国仮出願第６１／５５６，４５６号；および２０１１年１２月２日に出願された米国仮出願第６１／５６６，４０７号の利益を主張する。上記出願の教示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。

技術分野
本発明は、抗原およびキャリア分子の結合体、ならびにこれらの結合体を含むワクチンに関する。抗原は、典型的には糖である。

発明の背景
糖抗原の免疫原性を増進するための、キャリアタンパク質への結合体化の使用は周知であり［例えば、参考文献１〜９などにおいて総説されている］、特に、小児科ワクチンに用いられている［１０］。今日のワクチンにおいて広く用いられている３つのキャリアタンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、およびジフテリアトキソイド改変体のＣＲＭ１９７である。これらのタンパク質は、多様な糖、特に、髄膜炎菌莢膜糖のためのキャリアとして用いられている（例えば、参考文献１１における、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖のためのキャリアとしてのＴＴの使用；ならびに参考文献１２および１３のそれぞれにおける、同じ糖のためのキャリアとしてのＤＴおよびＣＲＭ１９７を参照されたい）。ワクチンにおけるこれらのキャリアタンパク質の過剰使用については、憂慮がなされており［例えば、参考文献１４を参照されたい］、多様な代替的なキャリアが示唆されている（例えば、参考文献１５におけるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するプロテインＤ）。しかし、多くの代替的なキャリアタンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、および／またはＣＲＭ１９７ほど有効ではない。したがって、代替的なキャリアタンパク質および／またはより良好なキャリアタンパク質を見出すことが依然として必要とされている。

欧州特許第０４７７５０８号明細書 米国特許第５，３０６，４９２号明細書 国際公開第９８／４２７２１号

Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ２８〜３６ ＡｈｍａｄおよびＣｈａｐｎｉｃｋ、Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ（１９９９）１３：１１３〜３３， ｖｉｉ ＢｕｔｔｅｒｙおよびＭｏｘｏｎ、Ｊ Ｒ Ｃｏｌｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄ （２０００）３４：１６３〜８

したがって、さらなるキャリアタンパク質および良好なキャリアタンパク質、特に、髄膜炎菌莢膜糖のためのキャリアタンパク質を提供することが本発明の目的である。キャリアタンパク質は、感染または薬物に対する防御的免疫応答および／または治療的免疫応答を誘導するための結合体において用いることができる。

本発明者らは、２つの特定のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原であるｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含むタンパク質が、有効なキャリアであることを見出した。これらのキャリアは多目的的であり、多様な抗原、特に、例えば、病原性生物に由来する糖へと結合体化することができる。結果として得られる結合体は、現在用いられているキャリアタンパク質、例えば、ＣＲＭ１９７に基づく結合体より免疫原性でありうる。さらに、それらは、糖が由来する病原体に対する高レベルの防御的免疫をもたらしうる。

したがって、本発明は、抗原およびキャリア分子を含む結合体であって、キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む結合体を提供する。キャリア分子は、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として含むことが典型的である。抗原は、糖であることが典型的である。糖は、任意の糖であってよく、特に、病原性生物に由来する糖であってよい。例えば、糖は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する莢膜糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するグルカンまたは莢膜糖でありうる。糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する莢膜糖である場合、糖は、以下の髄膜炎菌血清群：Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのうちの１つに由来することが典型的である。糖が、グルカンである場合、糖は、ラミナリンであることが典型的である。糖が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する莢膜糖である場合、糖は、以下の肺炎球菌の血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆのうちの１つに由来することが典型的である。しかし、いくつかの実施形態では、糖が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する莢膜糖ではない。

本発明はまた、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせた本発明の結合体を含む医薬組成物にも関する。

本発明は、哺乳動物において免疫応答をもたらすための方法であって、本発明の結合体または医薬組成物を、哺乳動物へと投与するステップを含む方法にさらに関する。

本発明は、非天然アミノ酸を含むように修飾されたキャリア分子にさらに関する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
抗原およびキャリア分子を含む結合体であって、上記キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む、結合体。
（項目２）
上記ｓｐｒ００９６抗原が、配列番号１または配列番号２に対して５０％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の結合体。
（項目３）
上記ｓｐｒ２０２１抗原が、配列番号３に対して５０％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１または項目２に記載の結合体。
（項目４）
上記キャリア分子が、上記ｓｐｒ００９６抗原および上記ｓｐｒ２０２１抗原を単一のポリペプチド鎖として含む、上記項目のいずれかに記載の結合体。
（項目５）
上記ポリペプチド鎖が、式ＮＨ _２ −Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ _ｎ −Ｂ−ＣＯＯＨのポリペプチド鎖であり、式中、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２またはそれより大きい（例えば、２、３、４、５、６など）整数であり、各Ｘは、ｓｐｒ００９６抗原またはｓｐｒ２０２１抗原のアミノ酸配列であり、ここで、少なくとも１つのＸは、ｓｐｒ００９６抗原であり、少なくとも１つのＸは、ｓｐｒ２０２１抗原であり、Ｌは、任意選択のリンカーのアミノ酸配列である、項目４に記載の結合体。
（項目６）
ｎが２である、項目５に記載の結合体。
（項目７）
Ｘ _１ がｓｐｒ００９６抗原であり、Ｘ _２ がｓｐｒ２０２１抗原である、項目６に記載の結合体。
（項目８）
上記ポリペプチド鎖が、配列番号９に対して５０％またはそれを超える（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．５％超）同一性を有するアミノ酸配列、特に、配列番号９のアミノ酸配列を含む、項目７に記載の結合体。
（項目９）
上記抗原が糖である、上記項目のいずれかに記載の結合体。
（項目１０）
上記糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する莢膜糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するグルカンまたは莢膜糖である、項目９に記載の結合体。
（項目１１）
上記糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹに由来する莢膜糖である、項目１０に記載の結合体。
（項目１２）
上記抗原がハプテンである、項目１から８のいずれかに記載の結合体。
（項目１３）
上記ハプテンが、アヘン剤、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツレート、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタクワロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用薬、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神作用薬、鎮静剤、フェンシクリジン、プシロシビン、揮発性亜硝酸塩、ならびに物理的依存および／または精神的依存を誘導する他の薬物である、項目１２に記載の結合体。
（項目１４）
医薬における使用のための、上記項目のいずれかに記載の結合体。
（項目１５）
上記項目のいずれかに記載の結合体を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む医薬組成物。
（項目１６）
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む結合体の混合物を含む、項目１５に記載の医薬組成物。
（項目１７）
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む上記結合体が、各糖について別個の結合体である、項目１６に記載の医薬組成物。
（項目１８）
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む上記結合体が、同じキャリアに基づく、項目１７に記載の医薬組成物。
（項目１９）
上記同じキャリアが、項目１から８のいずれかに記載のキャリア分子である、項目１８に記載の医薬組成物。
（項目２０）
哺乳動物において免疫応答をもたらすための方法であって、項目１から１４のいずれかに記載の結合体または項目１５から１９のいずれかに記載の医薬組成物を、上記哺乳動物へと投与するステップを含む、方法。

図１は、本発明において用いられる代表的な細菌性糖の反復単位を提供する。 図１は、本発明において用いられる代表的な細菌性糖の反復単位を提供する。 図２は、多様な肺炎球菌タンパク質へと結合体化されたラミナリンの免疫原性と、基準キャリアであるＣＲＭ１９７へと結合体化されたラミナリンの免疫原性とを比較する。 図３は、本発明のラミナリン結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と比較する。 図４は、本発明の多様な肺炎球菌の糖および髄膜炎菌の糖による結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と比較する。 図５は、本発明の肺炎球菌による結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と比較する。 図６は、肺炎球菌血清型５感染に対する防御的免疫についてのモデルにおいて、本発明の肺炎球菌による結合体の効果を、参照のＣＲＭ１９７結合体の効果と比較する。 図６は、肺炎球菌血清型５感染に対する防御的免疫についてのモデルにおいて、本発明の肺炎球菌による結合体の効果を、参照のＣＲＭ１９７結合体の効果と比較する。 図７は、肺炎球菌血清型５感染に対する防御的免疫についてのモデルにおいて、本発明の肺炎球菌による結合体、参照のＣＲＭ１９７結合体、ならびに肺炎球菌の糖およびキャリアが単独の場合およびこれらを併せた場合の効果を比較する。 図７は、肺炎球菌血清型５感染に対する防御的免疫についてのモデルにおいて、本発明の肺炎球菌による結合体、参照のＣＲＭ１９７結合体、ならびに肺炎球菌の糖およびキャリアが単独の場合およびこれらを併せた場合の効果を比較する。 図８〜１０は、本発明の髄膜炎菌血清群Ａによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。図９および１０では、ＳＢＡ力価を、各バーの上方に示す。 図８〜１０は、本発明の髄膜炎菌血清群Ａによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。図９および１０では、ＳＢＡ力価を、各バーの上方に示す。 図８〜１０は、本発明の髄膜炎菌血清群Ａによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。図９および１０では、ＳＢＡ力価を、各バーの上方に示す。 図１１は、本発明の髄膜炎菌血清群Ｃによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。 図１２は、本発明の髄膜炎菌血清群Ｗ１３５による結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。 図１３は、本発明の髄膜炎菌血清群Ｙによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。 図１４は、本発明の髄膜炎菌血清群Ｃによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体およびｓｐｒ１４１６結合体の免疫原性と比較する。 図１５は、本発明の髄膜炎菌血清群Ｃによる結合体に対するＴ細胞の応答を、参照のＣＲＭ１９７結合体およびｓｐｒ１４１６結合体に対するＴ細胞の応答と比較する。 図１６は、ｌ−ホモアリルグリシン残基が、通常はメチオニンを含む位置にあるタンパク質へと組み込まれる（配列番号９と対比した配列番号２０）ように、宿主細胞内で発現させた本発明のキャリアについての質量分析トレースを示す。 図１７は、本発明の髄膜炎菌血清群Ａによる結合体の免疫原性を、参照のＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と、単独で、かつ、他の髄膜炎菌の結合体と組み合わせて比較する。 図１８は、図１７の研究における他の髄膜炎菌の結合体の免疫原性を比較する。 図１８は、図１７の研究における他の髄膜炎菌の結合体の免疫原性を比較する。 図１８は、図１７の研究における他の髄膜炎菌の結合体の免疫原性を比較する。

本発明は、抗原およびキャリア分子を含む結合体であって、キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む結合体に関する。この結合体の特色については、以下で詳細に記載する。

本発明はまた、非天然アミノ酸を組み込むように修飾されたキャリア分子も伴う。また、例示的な修飾およびキャリアタンパク質についても、以下で詳細に記載する。

キャリア分子
キャリア分子は、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む。キャリア分子は、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として含むことが典型的である。

ｓｐｒ００９６抗原
参考文献１６では、元の「ｓｐｒ００９６」ポリペプチド配列が、「仮説的タンパク質」（ＧＩ：１５９０２１４０を参照されたい）として注記された。本明細書では、言及を目的として、Ｒ６株において見出される全長ｓｐｒ００９６のアミノ酸配列を、配列番号１として示す。

本発明のｓｐｒ００９６抗原は、少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｂリンパ球が抗原に対する抗体を産生することを支援する［１７］。Ｔ細胞エピトープは、経験的に同定する（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［１８、１９］または類似の方法を用いて）こともでき、予測する（例えば、ジェイムソン−ウォルフによる抗原性指数（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）［２０］、行列ベースの手法［２１］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２２］、ニューラルネットワーク［２３］、ＯｐｔｉＭｅｒ ＆ ＥｐｉＭｅｒ［２４，２５］、ＡＤＥＰＴ［２６］、Ｔ部位［２７］、親水性［２８］、抗原性指数［２９］、または参考文献３０において開示されている方法などを用いて）こともできる。

本発明と共に用いるのに好ましいｓｐｒ００９６抗原は、（ａ）配列番号１に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号１のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ００９６ポリペプチドは、配列番号１の改変体（例えば、配列番号２；下記を参照されたい）を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１に由来する少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１の少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを保持する一方で、配列番号１のＣ末端に由来する１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５以上）、および／または配列番号１のＮ末端に由来する１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを除外する。１つの適切な断片は、天然のリーダーペプチド配列を除外する配列番号１４である。ｓｐｒ００９６抗原は、配列番号１に由来する単一のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープからなってもよい。

本明細書では、配列番号１と比べてそのＣ末端の近傍に挿入を伴うｓｐｒ００９６の改変体形態が、配列番号２である。参考文献３１では、免疫化のためのこの改変体の使用が報告されており（参考文献３１の配列番号１５０）、この改変体が、ＬｙｓＭドメインタンパク質と注記されている。したがって、本発明と共に用いるためのｓｐｒ００９６抗原は、（ａ）配列番号２に対して、５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号２のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含みうる。これらのポリペプチドは、配列番号２の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２に由来する少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２の少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを保持する一方で、配列番号２のＣ末端に由来する１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５以上）、および／または配列番号２のＮ末端に由来する１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを除外する。１つの適切な断片は、天然のリーダーペプチド配列を除外する配列番号１５である。配列番号２の免疫原性断片は、参考文献３１の表１において同定されている。ｓｐｒ００９６抗原は、配列番号２に由来する単一のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープからなってもよい。

ｓｐｒ００９６抗原は、ダイマー、例えば、ホモダイマーの形態で用いることができる。

ｓｐｒ２０２１抗原
参考文献１６では、元の「ｓｐｒ２０２１」ポリペプチド配列が、一般ストレスタンパク質（Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）「ＧＳＰ−７８１」（ＧＩ：１５９０４０６２を参照されたい）として注記された。本明細書では、言及を目的として、Ｒ６株において見出される全長ｓｐｒ２０２１のアミノ酸配列を、配列番号３として示す。

本発明のｓｐｒ２０２１抗原は、少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む。

本発明と共に用いるのに好ましいｓｐｒ２０２１抗原は、（ａ）配列番号３に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号３のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ２０２１ポリペプチドは、配列番号３の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３に由来する少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号３の少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを保持する一方で、配列番号３のＣ末端に由来する１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５以上）、および／または配列番号３のＮ末端に由来する１もしくは複数のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを除外する。１つの適切な断片は、天然のリーダーペプチド配列を除外する配列番号４である。ｓｐｒ００９６抗原は、配列番号３に由来する単一のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープからなってもよい。

参考文献３１は、ｓｐｒ２０２１について、ＧｂｐＢに対して相同性を有する４５ｋＤａの分泌タンパク質として注記し、免疫原としてのその使用について開示している（参考文献３１の配列番号２４３；ＳＰ２２１６）。ｓｐｒ２０２１の免疫原性断片は、参考文献３１の表１（７３頁）において同定されている。ｓｐｒ２０２１の別の有用な断片は、参考文献３２の配列番号１（本明細書における配列番号３のアミノ酸２８〜２７８）として開示されている。

ハイブリッドポリペプチド
ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原は、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として発現させることが典型的である。ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ_２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ［式中、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上（例えば、２、３、４、５、６など）の整数であり、各Ｘは、ｓｐｒ００９６抗原またはｓｐｒ２０２１抗原のアミノ酸配列であり（上記の通り）、ここで、少なくとも１つのＸは、ｓｐｒ００９６抗原であり、少なくとも１つのＸは、ｓｐｒ２０２１抗原であり、Ｌは、任意選択のリンカーのアミノ酸配列である］で表すことができる。通例、ｎは２である。ｎが２である場合、Ｘ_１は通例、ｓｐｒ００９６抗原であり、Ｘ_２は通例、ｓｐｒ２０２１抗原である。ｎが２を超える場合、各ｓｐｒ００９６抗原（複数のｓｐｒ００９６抗原が存在する場合）は、同じ場合もあり、異なる場合もあり、各ｓｐｒ２０２１抗原（複数のｓｐｒ２０２１抗原が存在する場合）は、同じ場合もあり、異なる場合もある。

各Ｘのアミノ酸配列であるｓｐｒ００９６抗原またはｓｐｒ２０２１抗原は、上記で規定した通りである。これらの抗原を、（ａ）所与の配列に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有すること；および／または（ｂ）所与の配列のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むこととの関連で規定する場合、（ａ）における同一性のレベルおよび（ｂ）における「ｎ」の値は、各Ｘについて同じでありうる。

各−Ｘ−部分の野生型形態内のリーダーペプチド配列は、ハイブリッドタンパク質内に含まれる場合もあり、除外される場合もある。いくつかの実施形態では、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に配置された−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除くリーダーペプチドを欠失させる、すなわち、Ｘ_１のリーダーペプチドは保持するが、Ｘ_２・・・Ｘ_ｎのリーダーペプチドは除外する。これは、全てのリーダーペプチドを欠失させ、Ｘ_１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として用いることと同等である。

｛−Ｘ−Ｌ−｝のｎの各場合について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在する場合もあり、存在しない場合もある。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッド体は、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨなどでありうる。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１のアミノ酸である）ことが典型的である。例は、クローニングを容易とする短いペプチド配列であるポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙ_ｎ［配列中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上］を含む）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓ_ｎ［配列中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上］）を含む。当業者には、他の適切なリンカーアミノ酸配列が明らかであろう。有用なリンカーは、ＢａｍＨＩ制限部位から形成され、したがって、クローニングおよび操作の一助となる、Ｇｌｙ−Ｓｅｒジペプチドを伴うＧＳＧＧＧＧ（配列番号５）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号６）であり、（Ｇｌｙ）_４テトラペプチドは、典型的なポリグリシンリンカーである。特に、最終Ｌ_ｎとして用いるのに適する他のリンカーは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕジペプチドまたは配列番号７である。

−Ａ−とは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。−Ａ−は、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸である）ことが典型的である。例には、タンパク質輸送を方向付けるリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易とする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓ_ｎ［配列中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上］）が含まれる。当業者には、他の適切なＮ末端アミノ酸配列が明らかであろう。Ｘ_１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、Ｎ末端メチオニン、例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または単一のＭｅｔ残基をもたらすオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸を伴う）であることが好ましい。

−Ｂ−とは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。−Ｂ−は、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸である）ことが典型的である。例には、タンパク質輸送を方向付ける配列、クローニングもしくは精製を容易とする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、配列番号８などのＨｉｓ_ｎ［配列中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上］を含む）、またはタンパク質の安定性を増進する配列が含まれる。当業者には、他の適切なＣ末端アミノ酸配列が明らかであろう。

ハイブリッド体の例には、ｓｐｒ００９６−ｓｐｒ２０２１（例えば、配列番号９）またはｓｐｒ２０２１−ｓｐｒ００９６（例えば、配列番号１０）のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。ハイブリッド体はまた、配列番号９または１０に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列も含みうる。ハイブリッド体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むことが典型的である。ハイブリッド体はまた、配列番号９に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列も含みうる。

特殊な実施形態では、キャリア分子が、（ａ）配列番号２に由来する１または複数の（例えば、１、２、３、４、５など）ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープと、（ｂ）配列番号３に由来する１または複数の（例えば、１、２、３、４、５など）ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープとを含む。

非天然アミノ酸を組み込むように修飾されたキャリア分子
本発明はまた、非天然アミノ酸を組み込むように修飾されたキャリア分子も含む。非天然アミノ酸を用いて、キャリア分子を別の分子へと結合体化することができる。

いくつかの代替物では、キャリア分子が、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０などの）非天然アミノ酸を含む。非天然アミノ酸は、標準アミノ酸からなるタンパク質中で反応するのに利用可能な官能基とは異なる反応プロファイルを伴う官能基（例えば、リシンのアミノ基またはシステインのスルフヒドリル（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ）基）を有しうる。これは、今度は、化学選択的反応により、非天然アミノ酸がタンパク質へと組み込まれた所定の部位において実施される部位選択的結合体化が可能となることを意味する。

特殊な実施形態では、キャリア分子が、１または複数のＬ−ホモアリルグリシン（ＨＡＧ）残基を含む。配列中のメチオニン残基に代えて、ＨＡＧ残基で置換することが典型的である。化学的にＬ−２−アミノ−５−ヘキセン酸として公知のＨＡＧは、メチオニンの類似体であり、反応性のアルケン部位を含有する。タンパク質合成の開始ステップおよび伸長ステップのいずれにおいても、ＨＡＧでメチオニンを置換することができる。ＨＡＧは、標準アミノ酸において見出される官能基と異なる反応プロファイルを有するオレフィン側鎖を有し、チオール−エン（ｔｈｉｙｌ−ｅｎｅ）機構を介して反応する。

他の実施形態では、キャリア分子を修飾して、部位選択的結合体化が所定の部位で実施されることを可能とする他の非天然アミノ酸が含まれ得る。例えば、１または複数の（例えば、１、２、３、４、５などの）ｐ−アセチルフェニルアラニン残基がその配列内に含まれるように、キャリア分子を修飾することができる。このアミノ酸は、標準アミノ酸のうちのいずれにも存在しないケト官能基を有し、したがって、穏やかな水性条件下で、とりわけ、ヒドラジン、アルコキシアミン、およびセミカルバジドと反応して、ヒドラゾン連結、オキシム連結、およびセミカルバゾン連結を生成させうる。ケト官能基を伴う他のアミノ酸には、ｍ−アセチルフェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイルフェニルアラニンが含まれ、これらの残基は同じ様式で用いることができる。

他の実施形態では、例えば、１または複数の（例えば、１、２、３、４、５などの）ｐ−アジドフェニルアラニン残基を組み込むことによりキャリア分子を修飾して、アジド基（これもまた、標準アミノ酸では発生しない）が含まれ得る。アジド基は、銅（Ｉ）触媒［２＋３］付加環化反応を介して、結合体化パートナー上のアセチレン基と反応しうる。逆に、１または複数の（例えば、１、２、３、４、５などの）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン残基を組み込み、次いで、これを、同じ機構を介して、結合体化パートナー上のアジド基と反応させることにより、天然に存在しないアセチレン基をキャリアタンパク質に作出することも可能である。

なおさらなる実施形態では、キャリア分子を修飾して、１または複数の（例えば、１、２、３、４、５などの）フェニルセレノシステイン残基を含むこともできる。この残基の過酸化水素による処理は、その、チオール基への結合体化を可能とする。

本発明の例示的な修飾キャリア分子では、ｓｐｒ００９６抗原が、（ａ）配列番号１に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号１のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの１または複数が、ＨＡＧで置きかえられている。例えば、キャリア分子は、配列番号１６に示される配列を有しうる。

本明細書では、配列番号１と比べてそのＣ末端の近傍に挿入を伴うｓｐｒ００９６の改変体形態が、配列番号２である。したがって、本発明と共に用いるためのｓｐｒ００９６抗原は、（ａ）配列番号２に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号２のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの１または複数が、ＨＡＧで置きかえられている。例えば、キャリア分子は、配列番号１７に示される配列を有しうる。本発明の修飾キャリア分子の他の例または同じ例では、ｓｐｒ２０２１抗原が、（ａ）配列番号３に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号３のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの１または複数が、ＨＡＧで置きかえられている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの２つ以上、３つ以上、または４つ以上が、ＨＡＧで置きかえられている。例えば、キャリア分子は、配列番号１８に示される配列を有しうる。

ｓｐｒ２０２１の改変体形態は、天然のリーダーペプチド配列を除外する配列番号４である。したがって、本発明と共に用いるためのｓｐｒ２０２１抗原は、（ａ）配列番号４に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号４のうちの少なくとも「ｎ」（ここで、「ｎ」は、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）の連続アミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの１または複数が、ＨＡＧで置きかえられている。例えば、キャリア分子は、配列番号１９に示される配列を有しうる。

修飾キャリア分子のさらなる例には、上記で規定したハイブリッドポリペプチドであって、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの１または複数が、ＨＡＧで置きかえられたハイブリッドポリペプチドが含まれる。例えば、ハイブリッドポリペプチドは、ｓｐｒ００９６−ｓｐｒ２０２１（例えば、配列番号９）もしくはｓｐｒ２０２１−ｓｐｒ００９６（例えば、配列番号１０）のアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０に対して、５０％以上の（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の）同一性を有するアミノ酸配列を含むことが可能であり、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの１または複数が、ＨＡＧで置きかえられている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド内のメチオニン残基のうちの２つ以上または３つ以上が、ＨＡＧで置きかえられている。例えば、キャリア分子は、配列番号２０または２１に示される配列を有しうる。特殊な実施形態では、キャリア分子が、（ａ）配列番号２に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５など）ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ；および／または（ｂ）配列番号３に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５など）ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む。

これらの技法はまた、他の公知の非天然アミノ酸へも適用することができ、他のキャリア分子へもさらに適用することができる。したがって、上記の実施形態では、キャリア分子が、これらの他のキャリア分子のうちのいずれか１つでありうる。好ましいキャリア分子には、ジフテリア毒素もしくは破傷風毒素、またはこれらのトキソイドもしくは変異体などの細菌性毒素が含まれる。これらは一般に、結合体ワクチンにおいて用いられる。ジフテリア毒素の変異体であるＣＲＭ_１９７は、特に好ましい［３３］。また、破傷風トキソイドの断片Ｃも用いることができる［３４］。他のキャリア分子には、上記のｓｐｒ００９６またはｓｐｒ２０２１などの抗原が含まれる。さらなる適切なキャリア分子には、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体［３５］、合成ペプチド［３６、３７］、熱ショックタンパク質［３８、３９］、百日咳タンパク質［４０、４１］、サイトカイン［４２］、リンホカイン［１５０］、ホルモン［１５０］、成長因子［１５０］、Ｎ１９［４４］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するプロテインＤ［４５〜４７］、ニューモリシン［４８］、またはその非毒性誘導体［４９］、肺炎球菌の表面タンパク質であるＰｓｐＡ［５０］、鉄取込みタンパク質［５１］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡまたはＢ［５２］、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［５３］など、多様な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４３］が含まれる。

抗原
抗原は、糖であることが典型的である。抗原が糖である場合、糖は、任意の糖であってよく、特に、病原性生物に由来する糖でありうる。本発明において用いられる例示的な糖については、下記で記載する。特に、糖は、細菌性糖、例えば、細菌性莢膜糖でありうる。代表的な細菌性糖を、図１に記載する。

糖は、オリゴ糖の形態で用いることができる。これらは、精製された多糖（例えば、加水分解により）を断片化し、通例ではその後、所望のサイズの断片を精製することにより簡便に形成される。糖は、天然の供給源から精製することができる。精製に対する代替法として、糖は、全合成により得ることもでき、部分合成により得ることもできる。

抗原が糖でない場合、抗原は、任意の他の抗原、すなわち、任意の免疫原またはハプテンでありうる。本発明の結合体は、キャリア分子へと結合体化されたハプテンに対する免疫応答を誘発しうる。ハプテンは、例えば、乱用薬物でありうる［５４］。例には、アヘン剤、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツレート（ｂａｒｂｉｔｕａｔｅ）、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタクワロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用薬、抗精神病薬、トリプタミン、他の精神作用薬（ｐｓｙｃｈｏｍｉｍｅｔｉｃ ｄｒｕｇ）、鎮静剤、フェンシクリジン、プシロシビン（ｐｓｉｌｏｃｙｂｉｎｅ）、揮発性亜硝酸塩、ならびに物理的依存および／または精神的依存を誘導する他の薬物が含まれるがこれらに限定されない。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜糖
糖は、細菌性莢膜糖でありうる。例示的な細菌性莢膜糖には、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する細菌性莢膜糖が含まれる。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜多糖に基づき、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、およびＺを含め、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの多様な血清群が同定されている。本発明における糖は、これらの血清群のうちのいずれかに由来しうる。糖は、以下の髄膜炎菌血清群：Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのうちの１つに由来することが典型的である。

莢膜糖は一般に、オリゴ糖の形態で用いられる。これらは、精製された莢膜多糖（例えば、加水分解により）を断片化し、通例ではその後、所望のサイズの断片を精製することにより簡便に形成される。

多糖の断片化は、オリゴ糖における最終平均重合度（ＤＰ）を、３０未満（例えば、血清群Ａについて１０〜２０の間、好ましくは約１０；血清群Ｗ１３５およびＹについて１５〜２５の間、好ましくは約１５〜２０；血清群Ｃについて１２〜２２の間など）とするように実施することが典型的である。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色アッセイ［５５］により簡便に測定することができる。

加水分解を実施する場合は一般に、長さの短いオリゴ糖を除去するために、加水分解物を分取する（ｓｉｚｅ）［５６］。これは、限外濾過の後のイオン交換クロマトグラフィーなど、多様な様式で達成することができる。血清群Ａについては、重合度が約６以下のオリゴ糖を除去することが好ましく、血清群Ｗ１３５およびＹについては、重合度が約４未満のオリゴ糖を除去することが好ましい。

糖の化学的加水分解は一般に、当技術分野で標準的な条件下における、酸または塩基による処理を伴う。当技術分野では、莢膜糖をそれらの構成要素である単糖へと脱重合させるための条件が公知である。１つの脱重合法は、過酸化水素の使用［５７］を伴う。過酸化水素を糖へと添加し（例えば、最終Ｈ_２Ｏ_２濃度を１％とするように）、次いで、所望の鎖の長さの短縮が達成されるまで混合物をインキュベートする（例えば、約５５℃で）。時間をかけた短縮の後、混合物から試料を取り出し、次いで、試料中の糖の（平均）分子サイズを測定する。次いで、所望の鎖長に達したら、急速な冷却により脱重合を停止させることができる。

血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ
莢膜多糖を髄膜炎菌から調製するための技法は多年にわたり公知であり、多糖の沈殿ステップ（例えば、カチオン性洗浄剤を用いる）、エタノールによる画分化ステップ、低温フェノールによる抽出ステップ（タンパク質を除去するための）、および超遠心分離ステップ（ＬＰＳを除去するための）［例えば、参考文献５８を参照されたい］を含むプロセスを伴うことが典型的である。

より好ましいプロセス［５９］は、多糖の沈殿の後で、低級アルコールを用いる、沈殿させた多糖の可溶化を伴う。沈殿は、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）、またはヘキサジメトリン臭化物塩およびミリスチルトリメチルアンモニウム塩などのカチオン性洗浄剤を用いて達成することができる。セチルトリメチルアンモニウム臭化物（「ＣＴＡＢ」）が、特に好ましい［６０］。沈殿させた材料の可溶化は、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどの低級アルコールを用いて達成することができるが、ＣＴＡＢ−多糖複合体を可溶化するにはエタノールが特に適する。エタノールを、沈殿させた多糖へと添加して、５０％〜９５％の間の最終エタノール濃度（エタノールおよび水の全含量に基づく）とすることができる。

再可溶化の後、夾雑物を除去するために、多糖をさらに処理することができる。微小な夾雑であってもなお許容されない状況（例えば、ヒトワクチンを産生するための状況）では特に、これが重要である。これは、１または複数の濾過ステップを伴うことが典型的である。例えば、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）を介する濾過、サイズ濾過、および／または限外濾過を用いることができる。

夾雑物を除去するために濾過したら、さらなる処理および／または加工のために多糖を沈殿させることができる。これは、カチオンを交換することにより（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩を添加することにより）簡便に達成することができる。

精製の後、莢膜糖を、以下で記載されるキャリアタンパク質へと結合体化する。

髄膜炎菌の糖を精製および結合体化するためのさらなる方法および代替法は、参考文献５７および６１において開示されている。

精製に対する代替法として、本発明の莢膜糖は、全合成により得ることもでき、部分合成により得ることもでき、例えば、Ｈｉｂの合成は、参考文献６２において開示されており、ＭｅｎＡの合成は、参考文献６３において開示されている。

糖は、化学修飾することができる、例えば、糖は、Ｏ−アセチル化することもでき、Ｏ−脱アセチル化することもできる。任意のこのようなＯ−脱アセチル化または過剰アセチル化は、糖内の特定の位置に存在させることができる。例えば、大半の血清群Ｃ株は、シアル酸残基のＣ−７位および／またはＣ−８位にＯ−アセチル基を有するが、臨床分離株のうちの約１５％は、これらのＯ−アセチル基を欠く［６４、６５］。アセチル化は、防御の有効性に影響を及ぼさないと考えられる（例えば、製品Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）とは異なり、製品ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）では、Ｏ−脱アセチル化された糖を用いているが、いずれのワクチンも有効である）。血清群Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトースによる二糖単位のポリマーである。血清群Ｙの糖は、二糖による反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除き、血清群Ｗ１３５の糖と類似する。血清群Ｃの糖と同様に、ＭｅｎＷ１３５の糖およびＭｅｎＹの糖のＯ−アセチル化は可変性であるが、シアル酸の７位および９位におけるＯ−アセチル化である［６６］。任意のこのような化学的修飾は、結合体化の前に施すことが好ましいが、代替的にまたは加えて、結合体化時に施すこともできる。

異なる血清群に由来する糖は、個別に精製することが好ましく、次いで、結合体化の前に組み合わせることもでき、結合体化の後で組み合わせることもできる。

血清群Ａ
本発明の結合体は、血清群Ａの莢膜糖抗原を含み得る。糖は、構造的に異なる（血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの莢膜が、シアル酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸；ＮｅｕＡｃ）に基づくのに対し、血清群Ａの莢膜は、シアル酸の天然の前駆体であるＮ−アセチル−マンノースアミンに基づく）が、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの場合と同じ様式で精製および結合体化することができる（上記を参照されたい）。血清群Ａの糖は特に加水分解を受けやすく、水性媒体中のその不安定性は、（ａ）液体ワクチンの血清群Ａに対する免疫原性が時間と共に減衰すること、および（ｂ）糖の加水分解産物のワクチンへの放出に起因して、品質管理がより困難であることを意味する。

天然のＭｅｎＡ莢膜糖は、Ｃ３およびＣ４において部分的なＯ−アセチル化を伴う（α１→６）連結Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノースアミン−１−リン酸のホモポリマーである。主要なグリコシド結合は、Ｄ−マンノースアミンのＣ１のヘミアセタール基およびＣ６のアルコール基を伴う１−６ホスホジエステル結合である。平均鎖長は、９３モノマーである。天然のＭｅｎＡ莢膜糖は、以下：

の式を有する。

天然の血清群Ａの糖の免疫原性活性を保持しながら、水中ではるかにより安定的な修飾糖抗原が調製されている。単糖単位の炭素３および４に付いたヒドロキシル基が、ブロック基で置きかえられている［参考文献６７および６８］。

ヒドロキシルに代えてブロック基を有する単糖単位の数は、変化させることができる。例えば、全てのまたは実質的に全ての単糖単位は、ブロック基を有しうる。代替的に、単糖単位のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、ブロック基を有しうる。少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の単糖単位は、ブロック基を有しうる。

同様に、単糖単位上のブロック基の数も、変化させることができる。例えば、任意の特定の単糖単位上のブロック基の数は、１つの場合もあり、２つの場合もある。

末端の単糖単位は、その天然のヒドロキシルの代わりに、ブロック基を有する場合もあり、有さない場合もある。さらなる反応（例えば、結合体化）の機会をもたらすためには、末端の単糖単位上に遊離アノマーヒドロキシル基を保持することが好ましい。アノマーヒドロキシル基は、還元的アミノ化により（例えば、ＮａＢＨ_３ＣＮ／ＮＨ_４Ｃｌを用いる）アミノ基（−ＮＨ_２または−ＮＨ−Ｅ［式中、Ｅは、窒素保護基である］）へと転換し、次いで、他のヒドロキシル基をブロック基へと転換した後で再生することができる。

ヒドロキシル基を置きかえるブロック基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して、すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を別の基で置きかえることにより、直接接触可能である。ブロック基として作用するヒドロキシル基の適切な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カーボネート、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）、およびアセタールである。このようなブロック基のいくつかの特定の例は、アリル、Ａｌｌｏｃ（Ａｌｏｃ）、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接接触可能ではないが、ヒドロキシル基を完全に置きかえる他のブロック基には、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_３〜１２アルキル、Ｃ_５〜１２アリール、Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキル、ＮＲ^１Ｒ^２（Ｒ^１およびＲ^２については、以下の段落で規定する）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３などが含まれる。

典型的なブロック基は、式：−Ｏ−Ｘ−Ｙまたは−ＯＲ^３［式中、Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳＯ_２であり；Ｙは、それらの各々を、所望により、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から独立に選択される１つ、２つ、または３つの基で置換しうる、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_１〜１２アルコキシ、Ｃ_３〜１２シクロアルキル、Ｃ_５〜１２アリール、またはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルであるか；またはＹは、ＮＲ^１Ｒ^２であり；Ｒ^１およびＲ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_３〜１２シクロアルキル、Ｃ_５〜１２アリール、Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立に選択されるか；またはＲ^１とＲ^２が結びついて、Ｃ_３〜１２飽和複素環基を形成することができ；Ｒ^３は、それらの各々を、所望により、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から独立に選択される１つ、２つ、または３つの基で置換しうる、Ｃ_１〜１２アルキルまたはＣ_３〜１２シクロアルキルであるか；またはＲ^３は、それらの各々を、所望により、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの基で置換しうる、Ｃ_５〜１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルである］のブロック基である。Ｒ^３が、Ｃ_１〜１２アルキルまたはＣ_３〜１２シクロアルキルである場合、Ｒ^３を、上記で規定した１つ、２つ、または３つの基で置換することが典型的である。Ｒ^１とＲ^２が結びついて、Ｃ_３〜１２飽和複素環基を形成する場合は、Ｒ^１およびＲ^２が、窒素原子と一緒に、３〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含有する飽和複素環基を形成することが意図される。複素環基は、窒素原子以外に、１つまたは２つのヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、またはＳなど）を含有しうる。Ｃ_３〜１２飽和複素環基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニル、およびアジリジニルである。

ブロック基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ^３は、ヒドロキシル基の、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニルなどとの反応など、標準的な誘導体化手順により、−ＯＨ基から調製することができる。よって、−Ｏ−Ｘ−Ｙ内の酸素原子が通例、ヒドロキシル基の酸素原子である一方で、−Ｏ−Ｘ−Ｙ内の−Ｘ−Ｙ基は通例、ヒドロキシル基の水素原子を置きかえる。

代替的に、ブロック基は、光延型置換などの置換反応を介しても接触可能でありうる。ヒドロキシル基からブロック基を調製するこれらの方法および他の方法は周知である。

本発明において用いられる特定のブロック基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ_３［６９］およびカルバメート基ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２［式中、Ｒ^１およびＲ^２は、Ｃ_１〜６アルキルから独立に選択される］である。Ｒ^１およびＲ^２は、いずれもメチルである、すなわち、ブロック基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ_２であることが典型的である。カルバメートブロック基は、グリコシド結合に対する安定化効果を有し、穏和な条件下で調製することができる。

特に好ましいブロック基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３である［６８］。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａの修飾糖内で、このブロック基を有する４位および／または３位の比率は、変化させることができる。例えば、ブロック基を有する４位の比率は、約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または約１００％であってよく、少なくとも８０％および約１００％が好ましい。同様に、ブロック基を有する３位の比率は、約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または約１００％であってよく、少なくとも８０％および約１００％が好ましい。ブロック基を有する４位および３位の比率は、各位置においてほぼ同じであることが典型的である。言い換えれば、ブロック基を有する４位の、ブロック基を有する３位に対する比は、約１：１である。しかし、いくつかの実施形態では、ブロック基を有する４位の比率を、ブロック基を有する３位の比率と比べて変化させることができる。例えば、ブロック基を有する４位の、ブロック基を有する３位に対する比は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、または１：２でありうる。同様に、ブロック基を有する３位の、ブロック基を有する４位に対する比は、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、または１：２でありうる。

典型的な修飾ＭｅｎＡ糖は、ｎ個の単糖単位を含有し、単糖単位のうちの少なくともｈ％が、３位および４位のいずれにおいても−ＯＨ基を有さない。ｈの値は２４以上（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００）であり、通例５０以上である。−ＯＨが非存在の基は、上記で規定したブロック基である。

他の典型的な修飾ＭｅｎＡ糖は、単糖単位のうちの少なくともｓ個が、３位において−ＯＨを有さず、かつ、４位においても−ＯＨを有さない単糖単位を含む。ｓの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。−ＯＨが非存在の基は、上記で規定したブロック基である。

本発明と共に用いるのに適する修飾ＭｅｎＡ糖は、式：

を有し、式中、
ｎは、１〜１００の整数（特に、５〜２５の整数、通例、１５〜２５の整数）であり、
Ｔは、式（Ａ）または（Ｂ）：

であり、式中、
各Ｚ基は、ＯＨまたは上記で規定したブロック基から独立に選択され、
各Ｑ基は、ＯＨまたは上記で規定したブロック基から独立に選択され、
Ｙは、ＯＨまたは上記で規定したブロック基から選択され、
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり、
Ｑ基のうちの約７％超（例えば、８％、９％、１０％以上）は、ブロック基である。いくつかの実施形態では、式（Ａ）中の炭素１に付いたヒドロキシル基が、上記で規定したブロック基で置きかえられている。いくつかの実施形態では、式（Ｂ）のＥが、本発明のリンカーまたはキャリア分子である。Ｅがリンカーである場合は、リンカーを、本発明のキャリア分子へと共有結合的に結合させることができる。

ｎ＋２個のＺ基の各々は、互いと同じ場合もあり、異なる場合もある。同様に、ｎ＋２個のＱ基の各々は、互いと同じ場合もあり、異なる場合もある。全てのＺ基は、ＯＨでありうる。代替的に、Ｚ基のうちの少なくとも１０％、２０、３０％、４０％、５０％、または６０％は、ＯＡｃでもありうる。Ｚ基のうちの約７０％は、ＯＡｃであり、Ｚ基のうちの残りは、ＯＨまたは上記で規定したブロック基であることが典型的である。Ｑ基のうちの少なくとも約７％は、ブロック基である。Ｑ基のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、なおまたは１００％は、ブロック基であることが典型的である。

グルカン
糖は、グルカンでありうる。グルカンとは、とりわけ真菌細胞壁内で見出されるグルコース含有多糖である。α−グルカンが、グルコースサブユニット間の１または複数のα連結を包含するのに対し、β−グルカンは、グルコースサブユニット間の１または複数のβ連結を包含する。本発明に従い用いられるグルカンは、β連結を包含し、β連結のみを含有しうる（すなわち、α連結は含有しない）。

グルカンは、１もしくは複数のβ−１，３連結および／または１もしくは複数のβ−１，６連結を含みうる。グルカンはまた、１または複数のβ−１，２連結および／またはβ−１，４連結も含みうるが、通常そのβ連結は、専らβ−１，３連結および／またはβ−１，６連結となる。

グルカンは、分枝状の場合もあり、直鎖状の場合もある。

天然の全長β−グルカンは、不溶性であり、分子量がメガダルトン範囲にある。本発明の結合体では、可溶性グルカンを用いることが好ましい。可溶化は、長鎖の不溶性グルカンを断片化することにより達成することができる。これは、加水分解により達成することもでき、より簡便には、グルカナーゼで消化することにより（例えば、β−１，３−グルカナーゼまたはβ−１，６−グルカナーゼにより）達成することもできる。代替法として述べると、短鎖のグルカンは、単糖の構成要素を結びつけることを介して、合成により調製することもできる。

低分子量のグルカンが好ましく、特に、分子量が１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、または１５ｋＤａ未満）のグルカンが好ましい。また、例えば、６０以下の（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４）グルコース単糖単位を含有するオリゴ糖を用いることも可能である。この範囲内では、１０〜５０単糖単位の間または２０〜４０単糖単位の間のオリゴ糖が好ましい。

グルカンは、真菌グルカンでありうる。「真菌グルカン」は一般に真菌から得られるが、特定のグルカン構造が真菌および非真菌のいずれにおいて（例えば、細菌、下等植物、または藻類において）も見出される場合は、非真菌生物を代替的な供給源として用いることができる。したがって、グルカンは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなどのＣａｎｄｉｄａ属の細胞壁に由来する場合もあり、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、またはＰｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍに由来する場合もある。

真菌β−グルカンの多様な供給源が存在する。例えば、純粋なβ−グルカンは、市販されており、例えば、プスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ ｐａｐｕｌｌｏｓａから精製されるβ−１，６−グルカンである。β−グルカンは、真菌細胞壁から多様な様式で精製することができる。例えば、参考文献７０は、細胞壁マンナンを含まない、水溶性のβ−グルカン抽出物をＣａｎｄｉｄａ属から調製するための２ステップの手順であって、ＮａＣｌＯによる酸化およびＤＭＳＯによる抽出を伴う手順を開示する。結果として得られる産物（「Ｃａｎｄｉｄａ属の可溶性β−Ｄ−グルカン」または「ＣＳＢＧ」）は主に、直鎖状のβ−１，６−グルカン部分を伴う直鎖状のβ−１，３−グルカンからなる。同様に、参考文献７１は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃａｌｂｉｃａｎｓ）からのＧＧ−ｚｙｍの産生を開示する。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するこのようなグルカンには、（ａ）β−１，３−グルカン側方鎖を伴い、平均重合度が約３０であるβ−１，６−グルカン、および（ｂ）β−１，６−グルカン側方鎖を伴い、平均重合度が約４であるβ−１，３−グルカンが含まれる。

本発明のいくつかの実施形態では、グルカンが、例えば、ラミナリンにおいて見られる通り、いくつかのβ−１，６分枝を伴うβ−１，３グルカンである。ラミナリンは、褐藻類および海藻において見出される。ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）比は、異なる供給源の間で変化する。例えば、ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）比は、Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓのラミナリンでは、３：２という低値であるが、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔｉｔａｔａのラミナリンでは、７：１という高値である［７２］。したがって、本発明と共に用いられるグルカンのβ（１−３）：β（１−６）比は、１．５：１〜７．５：１の間、例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、または７：１でありうる。所望により、グルカンは、末端のマンニトールサブユニット、例えば、１，１−α連結マンニトール残基を有しうる［７３］。グルカンはまた、マンノースサブユニットも含みうる。

他の実施形態では、カードランにおいて見られる通り、グルカンが、もっぱらまたは主にβ−１，３連結を有する。これらのグルカンは、他の連結を含むグルカン、特に、β−１，３連結およびより大きな比率のβ−１，６連結を含むグルカンより良好な保護を誘発しうる。したがって、グルカンは、β−１，３連結グルコース残基（例えば、もっぱら１，３連結を伴う直鎖状のβ−Ｄ−グルコピラノース）だけからなりうる。しかし、所望により、グルカンは、β−１，３連結グルコース残基でない単糖残基も含むことができる。例えば、グルカンは、β−１，６連結グルコース残基も含むことができる。β−１，３連結グルコース残基の、これらの他の残基に対する比は、少なくとも８：１（例えば、≧９：１、≧１０：１、≧１１：１、≧１２：１、≧１３：１、≧１４：１、≧１５：１、≧１６：１、≧１７：１、≧１８：１、≧１９：１、≧２０：１、≧２５：１、≧３０：１、≧３５：１、≧４０：１、≧４５：１、≧５０：１、≧７５：１、≧１００：１など）であるものとし、かつ／またはβ−１，３連結のみにより他の残基へと連結された、少なくとも５つの（例えば、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、≧２０、≧３０、≧４０、≧５０、≧６０などの）隣接する非末端残基の１もしくは複数の（例えば、≧１、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２などの）配列が存在する。「非末端」とは、残基が、グルカンの遊離端に存在しないことを意図する。いくつかの実施形態では、隣接する非末端残基は、以下で記載されるキャリア分子、リンカー、または他のスペーサーへとカップリングされたいずれの残基も含まないものでありうる。β−１，３連結のみにより他の残基へと連結された、５つの隣接する非末端残基の存在は、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御的抗体応答をもたらしうる。

さらなる実施形態では、結合体は、２つの異なるグルカン、例えば、β（１−３）：β（１−６）比が１．５：１〜７．５：１の間である第１のグルカンと、もっぱらまたは主にβ−１，３連結を有する第２のグルカンとを含むことができる。例えば、結合体は、ラミナリングルカンおよびカードラングルカンの両方を含むことができる。

β−グルカンがβ−１，３連結およびβ−１，６連結の両方を、所望の比および／または配列で含む場合、このグルカンは、天然（例えば、ラミナリン）で見出すこともでき、人工的に作製することもできる。例えば、このグルカンは、全体的に化学合成で作製することもでき、部分的に化学合成で作製することもできる。β−１，３／β−１，６グルカンを化学合成するための方法は、例えば、参考文献７４〜８４から公知である。β−１，３連結およびβ−１，６連結の両方を所望の比で含むβ−グルカンはまた、利用可能なグルカンから出発して作製し、所望の比および／または配列が達せられるまで、それをβ−１，６−グルカナーゼ（また、グルカンｅｎｄｏ−１，６−β−グルコシダーゼ、１，６−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼなどとしても公知；ＥＣ３．２．１．７５）またはβ−１，３−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．５８）またはｅｎｄｏ−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．３９）など）で処理することもできる。

β−１，６−グルカナーゼにより、純粋なβ−１，３グルカンが最終的にもたらされるので、β−１，３連結グルコースだけを含有するグルカンを所望する場合は、β−１，６−グルカナーゼ処理を完遂することができる。しかし、純粋なβ−１，３−グルカンを用いうるとより簡便である。これらは、合成により作製することができ、化学的および／または酵素的合成により、例えば、多くの生物（細菌、酵母、植物、および真菌を含めた）に由来するそのうちのいくつかが公知である（１→３）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを用いて作製することができる。β−１，３グルカンを化学合成するための方法は、例えば、参考文献８５〜８８から公知である。合成に対する有用な代替法として述べると、カードラン（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｖａｒ．ｍｙｘｏｇｅｎｅｓとして既に公知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する直鎖状のβ−１，３−グルカン；例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている；型番：Ｃ７８２１）またはパラミロン（Ｅｕｇｌｅｎａ属に由来するβ−１，３−グルカン）など、天然のβ−１，３−グルカンを用いることができる。当技術分野では、高レベルのβ−１，３−グルカンを産生する生物、例えば、参考文献８９および９０のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、または参考文献９１のＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓが公知である。

ラミナリンおよびカードランは、例えば、天然において、分子量が少なくとも１００ｋＤａの高分子量ポリマーとして見出されることが典型的である。それらは、水性媒体中でしばしば不溶性である。したがって、それらの天然の形態では、それらは免疫化に十分に適していない。したがって、本発明では、より短いグルカン、例えば、６０以下のグルコース単糖単位（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４）を含有するグルカンを用いることができる。２〜６０の範囲の多数のグルコース残基、例えば、１０〜５０の間、または２０〜４０の間のグルコース単位を有するグルカンを用いることができる。２５〜３０グルコース残基を伴うグルカンが特に有用である。適切なグルカンは、例えば、天然のグルカンを酸加水分解することにより形成することもでき、例えば、β−１，３−グルカナーゼなどのグルカナーゼによる酵素的消化により形成することもできる。また、１１〜１９のグルコース単糖単位、例えば、１３〜１９のグルコース単糖単位を伴うグルカンも有用であり、特に、１５または１７のグルコース単糖単位を伴うグルカンも有用である。特に、以下の構造（Ａ）または（Ｂ）：

を有するグルカンが、とりわけ、本発明における使用に想定される。

いくつかの実施形態では、グルカンが単一の分子種である。これらの実施形態では、全てのグルカン分子が配列との関連で同一である。したがって、全てのグルカン分子は、分子量などを含めたそれらの構造的特性との関連で同一である。グルカンのこの形態は、化学合成により、例えば、上記の方法を用いて得られることが典型的である。例えば、参考文献８６は、単一のβ−１，３連結分子種の合成について記載している。代替的に、他の実施形態では、グルカンを、天然のグルカンから得ることができ、例えば、グルカンは、上記のＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＥｕｇｌｅｎａ属に由来し得、グルカンは、必要とされる単一の分子種が得られるまで精製される。この様式で精製された天然のグルカンは、市販されている。単一の分子種であるグルカンは、グルカン試料の多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定することにより同定することができる。このパラメータは、例えば、参考文献９２において記載されるＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより簡便に測定することができる。本発明のこの実施形態における使用に適するグルカンの多分散性は、約１、例えば、１．０１以下である。

カードランなど、天然グルカンの溶解度は、イオン性基を導入すること（例えば、硫酸化、特にカードランのＯ−６における硫酸化）により増大させることができる。このような修飾は、本発明と共に用いうるが、グルカンの抗原性を変化させうるので、回避することが理想的である。

糖がグルカンである場合、糖は、ラミナリンであることが典型的である。

Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜糖
上記で論じた通り、糖はまた、細菌性莢膜糖でもありうる。さらなる例示的な細菌性莢膜糖には、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する細菌性莢膜糖が含まれる。しかし、いくつかの実施形態では、糖が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する莢膜糖ではない。

糖がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する莢膜糖である場合、糖は、以下の肺炎球菌の血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆのうちの１つに由来することが典型的であり、１、５、６Ｂ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆに由来することが好ましい。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する莢膜多糖は、最大で８つの糖残基を含有しうる反復オリゴ糖単位を含む。主要なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型のオリゴ糖単位は、図１ならびに参考文献９３および９４に記載されている。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖
さらなる例示的な細菌性莢膜糖には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（「ＧＢＳ」）に由来する細菌性莢膜糖が含まれる。莢膜糖は、ＧＢＳのペプチドグリカン骨格へと共有結合的に連結されており、ペプチドグリカン骨格に付いた別の糖であるＢ群抗原とは異なる。

ＧＢＳ莢膜糖は、化学的には関連しているが、抗原的には大きく異なる。全てのＧＢＳ莢膜糖は、以下の三糖コア：
β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ（１→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１→４）β−Ｄ−Ｇｌｃｐ
を共有する。

多様なＧＢＳ血清型は、このコアが修飾される様式により異なる。血清型Ｉａと血清型ＩＩＩとの差違は、例えば、連続する三糖コアを連結するための、このコアにおけるＧｌｃＮＡｃ（Ｉａ）またはＧａｌ（ＩＩＩ）の使用から生じる。血清型ＩａおよびＩｂはいずれも、コア内のＧｌｃＮＡｃへと連結された［α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ（２→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］二糖を有するが、連結は、１→４連結（Ｉａ）または１→３連結（Ｉｂ）のいずれかである。

ＧＢＳ関連疾患は、主に血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから生じ、８５％超が、５つの血清型：Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶにより引き起こされる。本発明では、これらの４つの血清型のうちの１つに由来する糖を用いることができる。これらの４つの血清型の各々の莢膜糖には、（ａ）全ての場合において、ガラクトース残基へと２→３連結される、末端のＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基（一般にシアル酸と称する）；および（ｂ）三糖コア内のＮ−アセチル−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）が含まれる。

４つの糖全てが、三糖コア内にガラクトース残基を含むが、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、およびＩＩＩはまた、各反復単位内にさらなるガラクトース残基も含有する。

本発明に従い用いられる糖は、それらの天然形態の場合もあり、修飾されている場合もある。例えば、糖は、天然の莢膜糖より短い場合もあり、化学修飾される場合もある。特に、本発明で用いられる血清型Ｖの莢膜糖は、参考文献９５および９６において記載される通りに修飾することができる。例えば、実質的に脱シアル化された血清型Ｖの莢膜糖である。脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖は、参考文献９５において記載される通り、ＧＢＳ血清型Ｖの精製莢膜糖を、穏やかな酸性条件（例えば、０．１Ｍの硫酸、８０℃で６０分間にわたる）下で処理することにより調製することもでき、ノイラミニダーゼで処理することにより調製することもできる。したがって、本発明に従い用いられる糖は、天然で見出される、実質的に全長の莢膜多糖の場合もあり、天然の長さより短い場合もある。全長多糖は、例えば、弱酸中の加水分解、加熱、分取クロマトグラフィーなどにより脱重合させて、本発明と共に用いるためのより短い断片をもたらすことができる。特に、本発明で用いられる血清型ＩＩおよび／またはＩＩＩの莢膜糖は、参考文献９７および９８において記載される通りに脱重合させることができる。

糖は、天然で見出される莢膜糖に照らして化学修飾することができる。例えば、糖は、Ｏ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的にまたは完全に）などを施すことができる。脱アセチル化は、結合体化前に施すこともでき、結合体化時に施すこともでき、結合体化後に施すこともできるが、結合体化前に施すことが好ましい。特定の糖に応じて、脱アセチル化は、免疫原性に影響を及ぼす場合もあり、免疫原性に影響を及ぼさない場合もある。Ｏ−アセチル化の、多様な血清型におけるＧＢＳ糖に対する関連性は、参考文献９９において論じられており、いくつかの実施形態では、７位、８位、および／または９位におけるシアル酸残基のＯ−アセチル化が、結合体化前、結合体化時、および結合体化後に、例えば、保護／脱保護、再アセチル化などにより保持される。しかし、本発明で用いられるＧＢＳ糖は、７位、８位、および／または９位におけるシアル酸残基のＯ−アセチル化を実質的に有さないことが典型的である。特に、ＧＢＳ糖が、以下で記載される塩基抽出により精製されている場合、Ｏ−アセチル化は失われることが典型的である。脱アセチル化などの効果は、日常的なアッセイにより評価することができる。

参考文献１００において記載される通り、莢膜糖は、公知の技法により精製することができる。典型的なプロセスは、塩基抽出、遠心分離、濾過、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、アニオン交換クロマトグラフィー、およびさらなる限外濾過を伴う。また、細菌細胞壁を開裂させて、細胞壁成分を遊離させる酵素であるムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）によるＧＢＳ細胞の処理も有用である。

代替法として述べると、参考文献１０１において記載される精製プロセスも用いることができる。これは、塩基抽出、エタノール／ＣａＣｌ_２処理、ＣＴＡＢ沈殿、および再可溶化を伴う。さらなる代替的プロセスは、参考文献１０２において記載されている。

Ｓ．ａｕｒｅｕｓの莢膜糖
さらなる例示的な細菌性莢膜糖には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来する細菌性莢膜糖、特に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの５型莢膜多糖および８型莢膜多糖が含まれる。５型莢膜多糖および８型莢膜多糖の構造は、参考文献１０３および１０４において、
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（３ＯＡｃ）−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
として記載された。

近年のＮＭＲ分光法データ［１０５］は、これらの構造の修正：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３ＯＡｃ）−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ（１→
をもたらした。

多糖は、天然で見出される莢膜多糖に照らして化学修飾することができる。

例えば、多糖には、Ｏ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（部分的にまたは完全に）などを施すことができる。脱アセチル化は、結合体化前に施すこともでき、結合体化時に施すこともでき、結合体化後に施すこともできるが、典型的には、結合体化前に施す。特定の多糖に応じて、脱アセチル化は、免疫原性に影響を及ぼす場合もあり、免疫原性に影響を及ぼさない場合もある。例えば、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）ワクチンでは、Ｏ−脱アセチル化多糖を用いるのに対し、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）はアセチル化されているが、いずれのワクチンも有効である。脱アセチル化などの効果は、日常的なアッセイにより評価することができる。例えば、Ｏ−アセチル化の、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの５型莢膜多糖または８型莢膜多糖に対する関連性は、参考文献１０６において論じられている。この文献では、天然の多糖が、７５％のＯ−アセチル化を有すると述べられている。これらの多糖は、多糖骨格およびＯ−アセチル基の両方に対する抗体を誘導した。Ｏ−アセチル化が０％の多糖も依然として、多糖骨格に対する抗体を誘発した。いずれの種類の抗体も、それらのＯ−アセチル含量が異なるＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対してオプソニン性であった。したがって、本発明で用いられる５型莢膜多糖または８型莢膜多糖は、０〜１００％の間でＯ−アセチル化されうる。

多糖のＯ−アセチル化の程度は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、プロトンＮＭＲにより決定することができる（例えば、参考文献１０７、１０８、１０９、または１１０において記載されている）。さらなる方法は、参考文献１１１において記載されている。同様の方法を用いて、多糖のＮ−アセチル化の程度も決定することができる。Ｏ−アセチル基は、加水分解により、例えば、無水ヒドラジン［１１２］またはＮａＯＨ［１０６］などの塩基で処理することにより除去することができる。同様の方法を用いて、Ｎ−アセチル基を除去することができる。５型莢膜多糖および／または８型莢膜多糖において高レベルのＯ−アセチル化を維持するためには、Ｏ−アセチル基の加水分解をもたらす処理、例えば、極端なｐＨでの処理を最小化する。

莢膜多糖は、本明細書の参考文献において記載される公知の技法により精製することができる。典型的なプロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞のフェノール−エタノールによる不活化、遠心分離、リソスタフィン処理、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ処理、遠心分離、透析、プロテアーゼ処理、さらなる透析、濾過、エタノール／ＣａＣｌ_２による沈殿、透析、凍結乾燥処理、アニオン交換クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥処理、サイズ排除クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥処理を伴う［１１３］。代替的プロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞のオートクレーブ処理、多糖を含有する上清の限外濾過、濃度、凍結乾燥、テイコ酸を除去するためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる処理、さらなる限外濾過、透析濾過、高速サイズ除外液体クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥処理を伴う［１１４］。

しかし、本発明は、天然の供給源から精製される多糖に限定されず、多糖は、全合成または部分合成など、他の方法により得ることもできる。

他の細菌性莢膜糖
さらなる例示的な細菌性莢膜糖には、ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ Ｖｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する細菌性莢膜糖が含まれる。

Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの炭水化物
本発明はまた、細菌性非莢膜糖も用いることができる。例示的な細菌性非莢膜糖は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＧＡＳ炭水化物（また、ＧＡＳ細胞壁多糖またはＧＡＳＰとしても公知）である。この糖は、交互のアルファ−（１→２）連結およびアルファ−（１→３）連結からなる、Ｌ−ラムノピラノース（Ｒｈａｐ）骨格と、交互のラムノース環にベータ−（１→３）結合したＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃｐＮＡｃ）残基とを伴う分枝状構造を特色とする（［１１５］）。

ＧＡＳ炭水化物は一般に、その天然の形態にあるが、修飾されている可能性がある。例えば、糖は、天然のＧＡＳ炭水化物より短い場合もあり、化学修飾される場合もある。

したがって、本発明に従い用いられる糖は、天然で見出される、実質的に全長のＧＡＳ炭水化物の場合もあり、天然の長さより短い場合もある。全長多糖は、例えば、弱酸中の加水分解、加熱、分取クロマトグラフィーなどにより脱重合させて、本発明と共に用いるためのより短い断片をもたらすことができる。ＧＡＳ炭水化物上の末端の単位に対応すると考えられる短い断片の、ワクチンにおける使用について提起されている［１１６］。したがって、本発明では、短い断片が想定される。しかし、実質的に全長の糖を用いることが好ましい。ＧＡＳ炭水化物の分子量は、約１０、特に、約７．５〜８．５ｋＤａであることが典型的である。分子量は、ＨＰＬＣ、例えば、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（Ｓｉｇｍａ）を用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから市販されているプルラン標準物質などのプルラン標準物質に照らして測定することができる［１１７］。

糖は、天然で見出されるＧＡＳ炭水化物に照らして化学修飾することができる。例えば、糖は、Ｎ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（部分的にまたは完全に）などを施すことができる。脱アセチル化などの、例えば、免疫原性に対する効果は、日常的なアッセイにより評価することができる。

結合体
本発明は、抗原およびキャリア分子を含む結合体であって、キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む結合体を包含する。

キャリア分子は、抗原へと直接共有結合的に結合体化することもでき、リンカーを介して共有結合的に結合体化することもできる。所望の場合、任意の適切な結合体化反応を、任意の適切なリンカーと共に用いることができる。

抗原のキャリアへの付着は、例えば、キャリアタンパク質のリシン残基またはアルギニン残基の側鎖内の−ＮＨ_２基を介することが好ましい。抗原が、遊離アルデヒド基を有する場合は、これを、キャリア中のアミンと反応させて、還元的アミノ化により、結合体を形成することができる。キャリアへの付着はまた、例えば、システイン残基の側鎖内の−ＳＨ基を介してもよい。代替的に、抗原は、リンカー分子を介してキャリアへと付着させることができる。

抗原は、結合体化前に活性化させるかまたは機能化することが典型的である。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［１１８、１１９など］）などのシアニル化試薬を伴いうる。他の適切な技法では、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ（また、参考文献７の序説も参照されたい）を用いる。

例えば、参考文献１２０および１２１において記載される通り、タンパク質への直接的な連結は、抗原の酸化の後に、タンパク質を伴う還元的アミノ化を含みうる。

リンカー基を介する連結は、任意の公知の手順、例えば、参考文献１２２および１２３において記載される手順を用いて作製することができる。リンカーは、糖抗原のアノマー炭素を介して付着させることが典型的である。好ましい種類の連結は、遊離−ＮＨ_２基（例えば、アミノ化により糖へと導入される）を、アジピン酸とカップリングし（例えば、ジイミド活性化を用いて）、次いで、タンパク質を、結果として得られる抗原−アジピン酸中間体へとカップリングすることにより形成されうるアジピン酸リンカーである［５、１２４、１２５］。同様の好ましい種類の連結は、遊離−ＮＨ_２基を、グルタル酸と、同じ様式でカップリングすることにより形成されうるグルタル酸リンカーである。アジピン酸リンカーおよびグルタル酸リンカーはまた、抗原への直接的なカップリング、すなわち、遊離基、例えば、遊離−ＮＨ_２基の、抗原へのあらかじめの導入を伴わないカップリングの後、タンパク質を、結果として得られる抗原−アジピン酸／グルタル酸中間体とカップリングすることによっても形成することができる。別の好ましい種類の連結は、修飾抗原の遊離ヒドロキシル基の、ＣＤＩとの反応［１２６、１２７］の後、カルバメート連結を形成するタンパク質との反応により形成されうるカルボニルリンカーである。他のリンカーには、β−プロピオンアミド［１２８］、ニトロフェニル−エチルアミン［１２９］、ハロゲン化ハロアシル［１３０］、グリコシド連結［１３１］、６−アミノカプロン酸［１３２］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［１３３］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［１３４］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［１３５］などが含まれる。また、カルボジイミド縮合も用いることができる［１３６］。

二官能性リンカーを用いて、抗原内のアミン基へとカップリングするための第１の基（例えば、アミノ化により抗原へと導入される）およびキャリアへとカップリングするための第２の基（典型的には、キャリア中のアミンへとカップリングするための）をもたらすことができる。代替的に、第１の基を抗原へと直接的に、すなわち、基、例えば、アミン基を抗原へとあらかじめ導入せずに、カップリングすることができる。

したがって、いくつかの実施形態では、二官能性リンカー内の第１の基が、抗原上のアミン基（−ＮＨ_２）と反応することが可能である。この反応は、アミンの水素に対する求電子置換を伴うことが典型的である。他の実施形態では、二官能性リンカー内の第１の基が、抗原と直接反応することが可能である。いずれのセットの実施形態でも、二官能性リンカー内の第２の基は、キャリア上のアミン基と反応しうることが典型的である。この反応もまた、アミンの求電子置換を伴うことが典型的である。

抗原およびキャリアのいずれとの反応もアミンを伴う場合は、二官能性リンカーを用いることが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘのホモ二官能性リンカー［式中、２つのＸ基は、互いと同じであり、アミンと反応することが可能であり；Ｌは、リンカー内の連結部分である］を用いることができる。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘ［式中、２つのＸ基は、異なり、アミンと反応することが可能であり；Ｌは、リンカー内の連結部分である］のヘテロ二官能性リンカーも用いることができる。好ましいＸ基は、Ｎ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、式Ｌ’−Ｌ^２−Ｌ’［式中、Ｌ’は、カルボニルである］を有することが好ましい。好ましいＬ^２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ_２）_４−または−（ＣＨ_２）_３−である。

同様にまた、抗原との反応が直接的なカップリングを伴い、キャリアとの反応がアミンを伴う場合も、二官能性リンカーを用いることが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘ［式中、２つのＸ基は、互いと同じであり、抗原／アミンと反応することが可能であり；Ｌは、リンカー内の連結部分である］のホモ二官能性リンカーを用いることができる。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘ［式中、２つのＸ基は、異なり、１つのＸ基は、抗原と反応しうる一方、他のＸ基は、アミンと反応することが可能であり；Ｌは、リンカー内の連結部分である］のヘテロ二官能性リンカーも用いることができる。好ましいＸ基は、Ｎ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、式Ｌ’−Ｌ^２−Ｌ’［式中、Ｌ’は、カルボニルである］を有することが好ましい。好ましいＬ^２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ_２）_４−または−（ＣＨ_２）_３−である。

２つの前出の段落で記載した、二官能性リンカーにおける使用のための他のＸ基は、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのＨＯ−Ｌ−ＯＨと組み合わされるとエステルを形成するＸ基である。

本発明と共に用いるためのさらなる二官能性リンカーには、ハロゲン化アクリロイル（例えば、塩化アクリロイル）およびハロゲン化ハロアシルが含まれる。

抗原へのカップリング時には一般に、リンカーを、抗原へとモル過剰で添加する。

抗原が、キャリア分子へと連結された（所望により、リンカーを介して）単一の基を有し、キャリアが、異なる抗原／リンカー分子へと連結された複数の基を有する場合、結果として得られる結合体は、「星」構造を形成しうる。この構造は、中央のキャリア分子を、キャリアから放射状に延びる（所望により、リンカーを介して）複数の抗原分子と共に含む。抗原が、キャリア分子へと連結された（所望により、リンカーを介して）１つより多い基を有し、キャリアが、異なる抗原／リンカー分子へと連結された１つより多い基を有する場合、結果として得られる結合体は、「網目」構造を形成しうる。この構造は、抗原分子により接続された（所望により、リンカーを介して）キャリア分子の網目構造を含む。

結合体は、例えば、１：５〜５：１の比の範囲で過剰なキャリア（ｗ／ｗ）または過剰な抗原（ｗ／ｗ）を有しうる。過剰なキャリアタンパク質を伴う結合体は、例えば、０．２：１〜０．９：１の範囲または等重量であることが典型的である。結合体には、少量の遊離（すなわち、結合体化されていない）キャリアを含み得る。所与のキャリアタンパク質が、本発明の組成物中に、遊離形態および結合体化形態の両方で存在する場合、結合体化されていない形態は、全体としての組成物中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であることが好ましく、２％未満（重量で）で存在することがより好ましい。

結合体が、本発明の医薬組成物中に含まれる場合、組成物はまた、免疫原としての遊離キャリアタンパク質も含みうる［１３７］。

結合体化後、遊離抗原と結合体化抗原とを分離することができる。例えば、疎水性クロマトグラフィー、接線流限外濾過、透析濾過など、多くの適切な方法が存在する［また、参考文献１３８、１３９なども参照されたい］。接線流限外濾過が好ましい。

結合体内の糖部分は、上記で規定した低分子量の糖またはオリゴ糖であることが好ましい。オリゴ糖は、結合体化前に分取することが典型的である。

結合体は、水中および／または生理学的緩衝液中で可溶性であることが好ましい。

非天然アミノ酸を組み込むように修飾されたキャリア分子の作製および結合体化
１または複数の非天然アミノ酸残基をキャリア分子へと組み込む場合は、標準的な手順を用いて実施することができる。このような方法の１つは、特定のコドンのためのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが、ｔＲＮＡを非天然アミノ酸へと結合体化するように操作され、次いで、翻訳時にキャリア内に組み込まれる、改変宿主細胞の使用を含む［このような技法の総説については、参考文献１４０を参照されたい］。代替的に、いくつかの手順は、天然の同族アミノ酸が存在しない場合、いくつかの非天然アミノ酸が、天然の細胞機構によりタンパク質へと組み込まれるという事実を利用する。この第２の種類の手順の例は、ＨＡＧの組込みにおいて観察される。ここで、いくつかの細胞において、細胞のメチオニンが低量であるかまたは細胞にメチオニンが存在しない場合、天然の細胞機構は、タンパク質合成の開始ステップおよび伸長ステップにおいて、メチオニンに代えてＨＡＧを組み込む。タンパク質を発現させるために用いられる多くの宿主細胞は、メチオニンについて原栄養性である、すなわち、細胞は、このアミノ酸を新規に合成しうる。したがって、メチオニン栄養素要求株である細胞を用いることにより、メチオニンレベルを、メチオニンに代えてＨＡＧがタンパク質へと組み込まれるような低レベルまで低下させることが可能である。メチオニン要求性宿主細胞の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ）およびＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｒｙｓｔａｌ（ＮＥＢ）が含まれるが、当業者には他の適する株もすぐに明らかであろう。

キャリア分子を結合体化するのに用いられる結合体化法／反応は、非天然アミノ酸内の官能基に適するものとする。例えば、非天然アミノ酸がＨＡＧである場合は、チオール−エン結合体化を用いる［例えば、参考文献１４１を参照されたい］。

結合体を含む混合物
本発明の結合体は、さらなる抗原と混合することができる。これらのさらなる抗原は、本発明の他の結合体であってよく、これらは他の抗原であってよい。

例えば、結合体の混合物が想定される。これらの混合物中の結合体のうちの少なくとも１つは、本発明の結合体である、すなわち、キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む。また、これらの混合物中の他の結合体（複数可）も、本発明の結合体であることが典型的である。しかし、他の結合体（複数可）が本発明の結合体でない場合、キャリア分子は、任意の適切なキャリアタンパク質（以下で記載される）であってよく、各結合体内で同じキャリア分子であることが典型的である。

例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１つより多い血清群に由来する結合体の混合物が想定される。例えば、組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなどに由来する糖を含む。混合物は、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む結合体の混合物であることが典型的である。これらの混合物中の結合体のうちの少なくとも１つは、本発明の結合体である、すなわち、キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む。また、これらの混合物中の他の結合体（複数可）も、本発明の結合体であることが典型的である。しかし、他の結合体（複数可）が本発明の結合体でない場合、キャリア分子は、任意の適切なキャリアタンパク質（以下で記載される）であってよく、各結合体内で同じキャリア分子であることが典型的である。

適するキャリアタンパク質は、ジフテリア毒素もしくは破傷風毒素、またはこれらのトキソイドもしくは変異体などの細菌性毒素である。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素の変異体［１４２］が特に適することを見出した。他の適切なキャリアタンパク質には、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体［１４３］、合成ペプチド［１４４、１４５］、熱ショックタンパク質［１４６、１４７］、百日咳タンパク質［１４８、１４９］、サイトカイン［１５０］、リンホカイン［１５０］、ホルモン［１５０］、成長因子［１５０］、ヒト血清アルブミン（組換えであることが典型的）、Ｎ１９［１５１］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するプロテインＤ［１５２〜１５４］、肺炎球菌の表面タンパク質であるＰｓｐＡ［１５５］、ニューモリシン［１５６］、またはその非毒性誘導体［１５７］、鉄取込みタンパク質［１５８］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡまたはＢ［１５９］、ＧＢＳタンパク質［１６０］、ＧＡＳタンパク質［１６１］など、多様な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１７］が含まれる。

単一のキャリアタンパク質は、１つより多い多糖抗原を保有しうるであろう［１６２、１６３］。この目標を達成するためには、結合体化プロセスの前に、異なる糖を混合することができる。しかし、各糖には別個の結合体が存在し、異なる糖は結合体化後に混合されることが典型的である。別個の結合体は、同じキャリア、特に、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む同じキャリアに基づいてよい。

本発明の混合物は、例えば、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する各糖に別個の結合体の混合物であってよく、ここで、血清群Ａの結合体は、本発明の結合体である、すなわち、キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含み、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの結合体は、本発明の結合体ではない。この実施形態では、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの結合体内のキャリア分子は、ＣＲＭ１９７であることが典型的である。

混合物が、血清群ＡおよびＣの両方に由来する莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１を超える（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上である）ことが好ましい。

混合物が血清群Ｙならびに血清群ＣおよびＷ１３５の一方または両方に由来する莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は１を超え（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上であり）、かつ／またはＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は１未満である（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５以下である）ことが好ましい。

血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖に好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。比は、２：１：１：１であることが典型的である。

混合物はまた、タンパク質も含みうる。例えば、混合物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂに由来するタンパク質［例えば、参考文献１６４〜１６９］またはＯＭＶ調製物［例えば、参考文献１７０〜１７３など］を含むことができる。

さらなる抗原（複数可）は、非Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ病原体に由来する抗原を含みうる。したがって、本発明の組成物は、さらなる細菌性抗原、ウイルス性抗原、または寄生生物性抗原を含めた１または複数の非Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原をさらに含みうる。これらは、以下から選択することができる：
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する糖抗原［例えば、参考文献１７４〜１７６；参考文献１８３の２２章および２３章］。
・不活化ウイルスなど、Ａ型肝炎ウイルスに由来する抗原［例えば、１７７、１７８；参考文献１８３の１５章］。
・表面抗原および／またはコア抗原など、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原［例えば、１７８、１７９；参考文献１８３の１６章］。
・Ｃ型肝炎ウイルスに由来する抗原［例えば、１８０］。
・所望により、また、ペルタクチンおよび／または凝集原２および３とも組み合わせた、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）など、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する抗原［例えば、参考文献１８１および１８２；参考文献１８３の２１章］。
・ジフテリアトキソイドなどのジフテリア抗原［例えば、参考文献１８３の１３章］。
・破傷風トキソイドなどの破傷風抗原［例えば、参考文献１８３の２７章］。
・Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来する糖抗原［例えば、参考文献１８３の１４章］
・Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する抗原［例えば、１６４〜１６７］
・Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原［例えば、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０］。
・Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する抗原［例えば、１９１］。
・Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来する抗原［例えば、１９２］。
・ＩＰＶなど、ポリオ抗原（複数可）［例えば、１９３、１９４；参考文献１８３の２４章］。
・凍結乾燥させた不活化ウイルス［例えば、１９６、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］など、狂犬病抗原（複数可）［例えば、１９５］。
・麻疹抗原、ムンプス抗原、および／または風疹抗原［例えば、参考文献１８３の１９章、２０章、および２６章］。
・ヘマグルチニン表面タンパク質および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質など、インフルエンザ抗原（複数可）［例えば、参考文献１８３の１７章および１８章］。
・Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに由来する抗原［例えば、１９７］。
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）に由来する抗原［例えば、１９８、１９９、２００］。
・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）に由来する抗原［例えば、１６０、２０１〜２０３］。
・Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに由来する抗原［例えば、参考文献２０４、２０５、および２０６において記載されている、株ＡＴＣＣ−３１４３２、ＳＥ−３６０、およびＳＥ−１０から取得可能なＩ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型莢膜多糖］。

糖抗原または炭水化物抗原を用いる場合は、免疫原性を増進するために、キャリアへと結合体化することが典型的である。キャリア分子は、本発明のキャリア、すなわち、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含むキャリアでありうる。代替的に、キャリア分子は、任意の適切なキャリアタンパク質、例えば、上記のキャリアタンパク質でもありうる。Ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ糖抗原、髄膜炎菌糖抗原、および肺炎球菌糖抗原の結合体化は周知である。

必要な場合は、毒性タンパク質抗原を解毒化することができる（例えば、化学的手段および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の解毒化［１８２］）。

ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合は、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことも典型的である。同様に、破傷風抗原が含まれる場合は、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことも典型的である。同様に、百日咳抗原が含まれる場合は、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことも典型的である。

抗原は、アルミニウム塩へと吸着させることができる。

組成物中の抗原は、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在することが典型的である。一般に、所与の任意の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分であるものとする。

本発明の組成物中でタンパク質抗原を用いることに対する代替法として述べると、抗原をコードする核酸を用いることができる［例えば、参考文献２０７〜２１５］。したがって、本発明の組成物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸で置きかえることができる（通例、例えば、プラスミドの形態にあるＤＮＡ）。

実際的に述べると、本発明の組成物中に含まれ得る抗原の数には上限がありうる。本発明の組成物中の抗原（本発明の結合体を含めた）の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、または３未満でありうる。組成物中の本発明の結合体の数は、６未満、５未満、または４未満でありうる。

結合体を含む医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明の結合体と、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。このようなキャリアについての完全な議論は、参考文献２１６において参照可能である。

微生物感染は、体内の多様な領域を侵すので、本発明の組成物は、多様な形態で調製することができる。例えば、組成物は、溶液または懸濁液としての注射剤として調製することができる。また、注射前に液体のビヒクル中に溶存または懸濁させるのに適する固体形態も調製することができる。局所投与用に組成物を、例えば、軟膏剤、クリーム、または散剤として調製することができる。経口投与用に組成物を、例えば、錠剤またはカプセル剤として調製することもでき、シロップ（所望により、風味をつけて）として調製することもできる。肺へ投与するために組成物を、例えば、微細な粉末またはスプレーを用いる吸入器として調製することができる。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製することができる。鼻、耳、または眼への投与のために組成物を、例えば、滴下剤として、スプレーとして、または散剤［例えば、２１７］として調製することができる。組成物は、口腔洗浄剤中に含ませることができる。組成物は、凍結乾燥させることができる。

医薬組成物は、無菌であることが好ましい。医薬組成物は、発熱物質を含まないことが好ましい。医薬組成物は、例えば、ｐＨ６〜ｐＨ８の間、一般に、約ｐＨ７で緩衝化することが好ましい。

本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達デバイスも提供する。デバイスは、例えば、注射器または吸入器でありうる。

本発明の医薬組成物は、免疫学的有効量の抗原を含むという点で、免疫原性組成物であることが好ましい。「免疫学的有効量」とは、単回用量での免疫学的有効量の個体への投与、または一連の用量の一部としての免疫学的有効量の個体への投与が、処置または予防に有効であることを意味する。免疫学的有効量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長動物、霊長動物など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、処置する医師による医学的状態についての評価、および他の関連する要因に応じて変化する。免疫学的有効量は、慣例的な治験を介して決定しうる比較的広い範囲内に収まることが予測される。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよく、複数回用量スケジュール（例えば、追加抗原量を含めた）であってもよい。組成物は、他の免疫調節剤と共に投与することができる。

調合したら、本発明の組成物を、被験体へと直接投与することができる。処置される被験体は、動物であってもよいが、特に、ヒト被験体を処置することができる。

本発明の免疫原性組成物は、治療的に（すなわち、既存の感染を処置するために）用いることもでき、予防的に（すなわち、将来の感染を予防するために）用いることもできる。治療的免疫化は、免疫無防備状態の被験体におけるＣａｎｄｉｄａ属感染を処置するのに特に有用である。

免疫原性組成物は、組成物を受容する患者において誘発された免疫応答（体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を増進するように機能しうる、さらなるアジュバントを含み得る。本発明と共に用いられうるアジュバントには、以下が挙げられるがこれらに限定されない。

・カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはこれらの混合物）を含めた無機質含有組成物。カルシウム塩には、リン酸カルシウム（例えば、参考文献２１８において開示されている「ＣＡＰ」粒子）が含まれる。アルミニウム塩には、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが含まれ、アルミニウム塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど）を取る。これらの塩への吸着が好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子としても調合することができる［２１９］。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを用いることができる。これらの名称は従来のものであるが、いずれも存在する実際の化合物についての正確な記載ではないので、簡便さのみのために用いられる（例えば、参考文献３０２の９章を参照されたい）。本発明では、アジュバントとして一般に用いられる「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントのうちのいずれかを用いることができる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウム（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートスルフェート）であり、これは、少量の硫酸塩も含有することが多い。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度が、塩中のヒドロキシルの、ホスフェートへの置換の程度に影響する。本発明では、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム両方の混合物を用いることができる。この場合、水酸化アルミニウムよりリン酸アルミニウムが多くてよい、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比でありうる。患者へと投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌの間である。１用量当たり最大０．８５ｍｇが好ましい。

・広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、茎、根、および花においてさえ見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であるサポニン［参考文献３０２の２２章］。Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（ソープルート）に由来するサポニンも購入することができる。サポニンアジュバント処方物には、ＱＳ２１などの精製処方物のほか、ＩＳＣＯＭなどの脂質処方物も含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技法を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含めた特定の精製画分が同定されている。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。参考文献２２０では、ＱＳ２１を作製する方法が開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールも含むことができる［２２１］。サポニンとコレステロールとの組合せを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる［参考文献３０２の２３章］。ＩＳＣＯＭはまた典型的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も包含する。あらゆる公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣのうちの１または複数を包含することが好ましい。参考文献２２１〜２２３では、ＩＳＣＯＭがさらに記載されている。所望により、ＩＳＣＯＭは、さらなる洗浄剤を欠くこともできる［２２４］。参考文献２２５および２２６では、サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説を見出すことができる。

・細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（例えばＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性腸内毒素「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）、ならびにＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として公知の変異体毒素［２２７］など、これらの解毒化誘導体。参考文献２２８では、解毒化ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用が記載されており、参考文献２２９では、非経口アジュバントとしての使用が記載されている。

・エステル化されたヒアルロン酸のマイクロスフェア［２３０］またはキトサンおよびその誘導体［２３１］などの生体接着剤および粘膜接着剤。

・生分解性で非毒性である材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）であって、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましく、所望により、負に帯電させた表面を有するように処理される（例えばＳＤＳにより）か、または正に帯電させた表面を有するように処理された（例えばＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤）材料から形成される微粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、または直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。

・リポソーム（参考文献３０１の１３および１４章）。参考文献２３２〜２３４では、アジュバントとしての使用に適するリポソーム処方物の例が記載されている。

・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、またはＴｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）などのムラミルペプチド。

・ポリオキシドニウムポリマー［２３５、２３６］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。

・メチルイノシン５’−一リン酸（「ＭＩＭＰ」）［２３７］。

・以下の式：

［式中、Ｒは、水素、直鎖状または分枝状で、非置換または置換で、飽和または不飽和のアシル基、アルキル（例えばシクロアルキル）基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基を含む群から選択される］を有するピロリジジン化合物またはこれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体など、ポリヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｘｌａｔｅｄ）ピロリジジン化合物［２３８］。例には、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが含まれるがこれらに限定されない
・α−グリコシルセラミド［２３９〜２４６］（例えばα−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなどのＣＤ１ｄリガンド。

・アルガムリンなどのガンマイヌリン［２４７］またはその誘導体。

・水中油型エマルジョン。多様なこのようなエマルジョンが公知であり、それらには典型的に、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤であって、生分解性（代謝性）および生体適合性である油（複数可）および界面活性剤（複数可）が含まれる。エマルジョン中の油滴は一般的に直径が５μｍ未満であり、直径がなおサブミクロンの可能性もあり、これらの小型のサイズは、安定的なエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーにより達成される。サイズが２２０ｎｍ未満の液滴は、濾過滅菌にかけうるので好ましい。

・ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によりグアノシン残基へと連結された非メチル化シトシン残基を含有するジヌクレオチド配列）、またはＣｐＩモチーフ（イノシンへと連結されたシトシンを含有するジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、または回文配列を含有するオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性オリゴヌクレオチド。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含むことができ、二本鎖または（ＲＮＡの場合を除き）一本鎖でありうる。参考文献２４８、２４９、および２５０は、可能な類似体置換、例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置き換えを開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献２５１〜２５６においてさらに論じられている。ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ［２５７］など、ＴＬＲ９へと方向付けられうる。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）など、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的であってもよく、またはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど、Ｂ細胞応答を誘導するのにより特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献２５８〜２６０において論じられている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであることが好ましい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体を認識するために接触可能であるように構築することが好ましい。所望により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端でつなぎ「イムノマー」を形成してもよい。例えば参考文献２５７および２６１〜２６３を参照されたい。有用なＣｐＧアジュバントは、またＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知のＣｐＧ７９０９である。別の有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列を使用することの代替法として、またはこれに加えて述べると、ＴｐＧ配列を使用することもでき［２６４］、これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくともよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンに富んでもよい。例えば免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つより多い連続するチミジンヌクレオチド（例えば参考文献２６４において開示されるＴＴＴＴ）を含んでもよく、かつ／または＞２５％のチミジン（例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してもよい。例えば免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つより多い連続するシトシンヌクレオチド（例えば参考文献２６４において開示されるＣＣＣＣ）を含んでもよく、かつ／または＞２５％のシトシン（例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくともよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも２０ヌクレオチドを含むであろう。それらは、１００より少ないヌクレオチドを含みうる。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドに基づく、特に有用なアジュバントは、ＩＣ３１（商標）として公知である［２６５］。したがって、本発明と共に用いられるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（そして、好ましくは複数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０の間のヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つの（そして、好ましくは複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むオリゴペプチド（例えば、５〜２０の間のアミノ酸）などのポリカチオン性ポリマーとの混合物を含みうる。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列である５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号１）を含むデオキシヌクレオチドでありうる。ポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）を含むペプチドでありうる。

・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」；また、「ＭＰＬ（商標）」としても公知の）［２６６〜２６９］。水性条件において、３ｄＭＰＬは、例えば直径が＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍである、異なるサイズのミセル凝集物または粒子を形成しうる。これらの一方または両方を、本発明と共に使用することができ、日常的アッセイによりより良好な粒子を選択することができる。本発明に従う使用のためには、それらの優れた活性のために、より小型の（例えば３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液をもたらすのに十分な程度に小型の）粒子が好ましい［２７０］。好ましい粒子の平均直径は、２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満であり、なお１００ｎｍ未満でもありうる。しかし、大半の場合、平均直径が５０ｎｍ未満となることはないであろう。

・Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８３７」）［２７１、２７２］、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８４８」）［２７３］、およびそれらの類似体；ならびにこれらの塩（例えば塩酸塩）などのイミダゾキノリン化合物。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献２７４〜２７８において見出すことができる。

・参考文献２７９において開示されるチオセミカルバゾン化合物などのチオセミカルバゾン化合物。参考文献２７９にはまた、活性化合物を調合し、製造し、これについてスクリーニングする方法も記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生させるためにヒト末梢血単核細胞を刺激するときに特に有効である。

・参考文献２８０において開示されるトリプタントリン化合物などのトリプタントリン化合物。参考文献２８０にはまた、活性化合物を調合し、製造し、これについてスクリーニングする方法も記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生させるためにヒト末梢血単核細胞を刺激するときに特に有効である。

・（ａ）Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献２８１〜２８３において開示される化合物などのヌクレオシド類似体。

・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［２８４］。

・アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［２８６、２８７］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［２８８］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンズアゾール化合物［２８９］を含め、参考文献２８５において開示される化合物。

・ＲＣ−５２９などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体［２９０、２９１］。

・例えば参考文献２９２および２９３において記載されるポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）などのホスファゼン。

・参考文献２９４において規定される、置換尿素または式Ｉ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ：

の化合物またはその塩、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、ＥＲ８０４０５８’、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、ＥＲ８０３０２２、または「ＥＲ８０４０５７」、例えば：

など
・ＯＭ−１７４など、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来する脂質Ａの誘導体（参考文献２９５および２９６において記載される）。

・ＴＬＲ４アンタゴニストであるＥ５５６４など、リン酸含有非環状骨格へと連結された脂質を含有する化合物［２９７、２９８］：

これらのアジュバント活性物質および他のアジュバント活性物質は、参考文献３０２および３０３においてより詳細に論じられている。

組成物中の抗原とアジュバントとは、混合されることが典型的である。

組成物は、前記アジュバントのうちの２つ以上を含んでもよい。例えば、それらは、水中油型エマルジョンおよび３ｄＭＰＬなどの両方を含み得ると有利である。

本発明と共に有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントには、以下が含まれるがこれらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルジョン。エマルジョンの容量による組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ ８５でありうる。重量では、これらの比が、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ ８５となる。このアジュバントは、参考文献３０２の１０章および参考文献３０３の１２章においてより詳細に記載される通り、「ＭＦ５９」として公知である［２９９〜３０１］。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を包含すると有利である。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ ８０によるエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を含むことができる。エマルジョンはまた、Ｓｐａｎ ８５（例えば１％で）および／またはレシチンを含むこともできる。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ ８０を有してもよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、これがより安定的なエマルジョンを提供するので、≦１であることが好ましい。スクアレンとＴｗｅｅｎ ８０とは、約５：２の容量比で存在させることができる。１つのこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解させて２％の溶液をもたらし、次いで、９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで、この混合物をマイクロフルイダイズすることにより作製することができる。結果として得られるエマルジョンは、例えば平均直径が１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍであるサブミクロンの油滴を有しうる。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によるエマルジョン。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照されたい）も含むことができる。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有しうる。

・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比で含むことができ、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分のあらゆる寄与を包含するものとする。エマルジョンはまた、スクアレンも含むことができる。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照されたい）も含むことができる。水性相は、リン酸緩衝液を含有しうる。

・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）によるエマルジョン。エマルジョンは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中で調合することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［３０４］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）中でトレオニル−ＭＤＰと共に用いられている。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバント［３０５］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）中のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに用いることもできる。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献３０６において記載される通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。

・非代謝性油（軽鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）など）と少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ ８０など）とによるサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（参考文献３０７において記載され、脂肪族アミンを、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、デスアシルサポニンへと付加することにより作製されるＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤も含まれ得る。

・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えばコレステロール）とをヘリックスミセルとして会合させたエマルジョン［３０８］。

医療処置および使用
本発明はまた、例えば、哺乳動物において抗体応答をもたらすのに用いられる医薬における使用のための本発明の結合体も提供する。

本発明はまた、哺乳動物において免疫応答をもたらすための方法であって、本発明の結合体または医薬組成物を哺乳動物へと投与するステップを含む方法も提供する。

本発明はまた、哺乳動物における微生物感染を予防または処置するための薬剤の製造における本発明の結合体の使用も提供する。

これらの方法および使用によりもたらされる免疫応答には一般に、抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が含まれるであろう。当技術分野では、抗原による免疫化後における抗体応答を評価するための方法が周知である。抗体応答は、ＩｇＡ応答またはＩｇＧ応答であることが好ましい。免疫応答は、予防的な場合もあり、かつ／または治療的な場合もある。哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。

治療的処置の有効性は、本発明の組成物の投与後における微生物感染をモニタリングすることにより調べることができる。予防的処置の有効性は、組成物の投与後における抗原に対する免疫応答（例えば、抗抗原抗体）をモニタリングすることにより調べることができる。

本発明の組成物は一般に、患者へと直接投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋内注射、または組織の間質空間への注射）により達成することもでき、直腸投与、経口投与、膣への投与、局所投与、経皮投与、皮内投与、眼への投与、鼻への投与、耳への投与、または肺への投与により達成することもできる。注射または鼻腔内投与が好ましい。

本発明を用いて、全身免疫および／または粘膜免疫を誘発することができる。

本発明に従い調製されるワクチンを用いて、小児および成人の両方を処置することができる。したがって、被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でありうる。ワクチンを施されるのに好ましい被験体は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳であり、好ましくは≧６５歳である）または若齢者（例えば≦５歳）である。ワクチンは、これらの群だけに適するわけではなく、集団内でより一般的に使用することができる。

処置は、単回用量スケジュールによって施してもよく、または複数回用量スケジュールによって施してもよい。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールにおいて使用することができる。複数回用量スケジュールでは、多様な用量を、例えば非経口初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜初回刺激および非経口追加刺激など、同じ経路により施してもよく、または異なる経路により施してもよい。免疫学的にナイーブな患者では、１回より多い用量の投与（代表的には、２回の用量）が特に有用である。複数回用量は典型的に、少なくとも１週間（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）隔てて投与される。

本発明の使用および方法は、抗原が由来する生物により引き起こされる感染を処置する／感染に対して防御するために、特に有用である。例示的な使用／方法については、下記で論じる。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜糖
使用および方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる疾患、例えば、髄膜炎、敗血症などの予防および／または処置のための使用および方法でありうる。

グルカン
グルカン（そして特にβ−グルカン）は、ほぼ全ての病原性真菌、特に免疫無防備状態の被験体における感染に関与する病原性真菌の不可欠であり、かつ、主要な多糖構成成分であり、また細菌病原体および原生生物においても存在するため、抗グルカン免疫は、広範にわたる病原体および疾患に対して有効でありうる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる免疫化後にもたらされる抗グルカン血清は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと交差反応性である。これらのヒトに対して感染性である真菌性作用因子に対して化学療法は不十分であり、抗真菌薬耐性が出現して予防用ワクチンおよび治療用ワクチンに対する必要性がますます認識されているため、スペクトルの広い免疫が特に有用である。

本発明の使用および方法は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなどのＣａｎｄｉｄａ属種；Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓなどのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属種；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種；Ｌ．ｍａｊｏｒなどのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ属種；Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉなどのＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ属種；Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｌａｖｕｓなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種；Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉなどのＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属種；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種；Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種；Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属種；Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓなどのＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属種；Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍなどのＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種；Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓなどのＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ属種；Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍなどのＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属種；Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなどのＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属種；Ｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍなどのＰｙｔｈｉｕｍ属種；ならびにＥ．ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種の感染に対して処置／防御するために特に有用である。

本使用および本方法は、カンジダ症（肝脾カンジダ症、侵襲性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症、および播種性カンジダ症を含めた）；カンジダ血症；アスペルギルス症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、スポロトリコーシス（ｓｐｏｒｏｔｈｒｙｃｈｏｓｉｓ）および他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジウム症、パラコクシジウム症、ニューモシスチス症、鵞口瘡、結核、ミコバクテリア症、呼吸器感染症、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ、ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、皮膚リーシュマニア症および内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス、胃腸炎、ならびに溶血性尿毒症症候群が含まれるがこれらに限定されない疾患を予防／処置するために特に有用である。抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ活性は、ＡＩＤＳ患者における感染を処置するために特に有用である。

本発明の結合体を、グルカン以外の抗原と共に、複数の病原体に対する同時的免疫化のための単一の組成物へと組み合わせることができる。組合せワクチンの作製に対する代替法として述べると、結合体は、患者へと、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、保健専門家またはワクチン接種施設への同じ診察時または来院時に）投与することができる。これらの組合せワクチンにおける使用のための抗原または共時的投与のための抗原には、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、および／またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｕｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹの糖または結合体化された糖など）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（糖または結合体化された糖など）などに由来する免疫原が含まれる。

本発明の結合体は、特に、患者が既に感染している場合、抗真菌剤と共に用いることができる。抗真菌剤が即時的治療効果をもたらすのに対し、結合体は、長期持続効果をもたらす。適切な抗真菌剤には、アゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール）、ポリエン（例えば、アムホテリシンＢ）、フルシトシン、およびスクアレンエポキシダーゼ阻害剤（例えば、テルビナフィン）が含まれるがこれらに限定されない［また、参考文献３０９も参照されたい］。抗真菌剤および結合体は、別個に投与することもでき、組み合わせて投与することもできる。別個に投与される場合、抗真菌剤および結合体は、互いから７日間以内に投与されることが典型的である。結合体の１回目の投与の後、抗真菌剤は、１回より多く投与することができる。

Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜糖
本使用および本方法は、肺炎球菌により引き起こされる疾患、例えば、髄膜炎、敗血症、肺炎などを予防および／または処置するための使用および方法でありうる。

定義
本発明の実施では、別段に示されない限り、当技術分野の範囲内にある、化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法を使用する。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、参考文献２１６および３１０〜３１６などを参照されたい。

上記では、「ＧＩ」による番号付けが用いられている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」とは、そのデータベースに配列が追加された場合に、ＮＣＢＩにより処理される各配列記録へと連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、配列記録の受託番号と類似しない。配列が更新される（例えば修正のために、またはさらなる注記もしくは情報を追加するために）と、新たなＧＩ番号が与えられる。したがって、与えられたＧＩ番号と関連する配列は、決して変更されない。

抗原「ドメイン」を除外する場合、これは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインなどのシグナルペプチドの除外を伴いうる。

「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のほか、「〜からなる」を包摂し、例えばＸ「を含む」組成物は、Ｘからもっぱらなってもよく、またはさらなる何か、例えばＸ＋Ｙを包含してもよい。

数値ｘとの関連における「約」という用語は、任意選択であり、例えばｘ±１０％を意味する。

「実質的に」という語は、「完全に」を除外せず、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から取り除くことができる。

アミノ酸との関連における「標準」という用語は、アミノ酸が、普遍的な遺伝子コードによりコードされる２０のアミノ酸、すなわち、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、プロリン、トリプトファン、トレオニン、チロシン、およびバリンのうちの１つであることを意味する。

別段に言明されない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合する任意の特定の順序を必要としない。したがって、任意の順序で成分を混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いと組み合わせ、次いで、この組合せを、第３の成分と組み合わせることなどができる。

動物（そして、特に、ウシ）材料を細胞の培養で用いる場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない供給源から得るべきであり、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体として、動物由来材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。

組成物の一部として化合物を体内へと投与する場合は代替的に、この化合物を、適切なプロドラッグで置きかえることもできる。

２つのアミノ酸配列間の配列同一性百分率に対する言及は、アラインメントしたとき、２つの配列を比較すると、この百分率にわたるアミノ酸が同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献３１７の７．７．１８節において記載されているソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。好ましいアライメントは、ギャップオープンペナルティーを１２、ギャップエクステンションペナルティーを２、ＢＬＯＳＵＭ行列を６２とするアフィンギャップ検索を用いるスミス−ウォーターマンによる相同性検索アルゴリズムにより決定される。スミス−ウォーターマンによる相同性検索アルゴリズムは、参考文献３１８において開示されている。

Ａ．結合体の作製および精製
以下で記載する通りに、血清型５に由来する肺炎球菌莢膜糖であるラミナリン、ならびに血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する髄膜炎菌莢膜オリゴ糖を、多様で公知の被験キャリアタンパク質へと結合体化し、精製した。

Ｌａｍ−９６／２０２１：ラミナリンは、参考文献３１９の方法に従い、リン酸緩衝食塩水中で、活性化ラミナリンを、多糖エステル基の、タンパク質に対するモル比３０、タンパク質濃度２〜１０ｍｇ／ｍｌで用いて、配列番号９へと結合体化した。結合体は、キャリアタンパク質上のヒスチジンタグを用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。精製は、真空供給源を用いて、ヒスチジンでタグ付けされたタンパク質の小スケール精製のための、あらかじめパッケージ化された９６ウェルフィルタープレートであるＨｉｓ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ ＨＰプレート（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により実施した。精製された結合体は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ；タンパク質含量についてのＭｉｃｒｏＢＣＡ；および糖含量についてのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより特徴決定した。２つのロットは、以下の特性：

を有した。

同じ方法により、ラミナリンを、配列番号１０（Ｌａｍ−２０２１／９６）へと結合体化した。比較のため、ラミナリンを、以下のキャリアタンパク質：ＣＲＭ１９７、ｓｐｒ０５６５Ｂ（配列番号１１）、ｓｐｒ１４１６（配列番号１２）、ｓｐｒ１４１８（配列番号１３）、ｓｐｒ２０２１（配列番号３）、およびｓｐｒ００９６（配列番号１）へも同様に結合体化した。

ＭｅｎＡ−９６／２０２１、Ｃ−９６／２０２１、Ｗ−９６／２０２１、およびＹ−９６／２０２１：参考文献３２０において記載される方法を用いて、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する髄膜炎菌莢膜オリゴ糖を、配列番号９へと結合体化した。結合体は、上記のＩＭＡＣにより精製した。精製された結合体は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ＭｉｃｒｏＢＣＡ、およびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより特徴決定した。代表的な結合体は、以下の特性：

を有した。

比較のため、参考文献３２０において記載される方法を用いて、これらの糖を、ＣＲＭ１９７へも同様に結合体化した。また、糖：タンパク質が大きい（本明細書の以下では、「高グリコシル化」）ＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７結合体も、この方法を用いて作製した。また、血清群Ｃに由来する髄膜炎菌莢膜オリゴ糖も、ｓｐｒ１４１６（配列番号１２）へと結合体化した。

５型肺炎球菌−９６／２０２１：血清型５に由来する肺炎球菌莢膜糖を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラム内で分取し、ＮａＩＯ_４を含む、ｐＨ７．２での１０ｍＭのＮａＰｉ、５００ｍＭ ＮａＣｌの溶液中で、室温で一晩にわたり酸化させた（ＰＳ反復単位のモル数の３０％のモル数）。材料は、水に対する、６〜８ｋＤａのカットオフ膜による透析を介して精製した。結合体化は、ｐＨ８．４での１００ｍＭのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７、１００ｍＭ ＮａＣｌの中で酸化された糖（５ｍｇ／ｍｌ）を用いる還元的アミノ化により、糖：タンパク質比１：１（ｗ／ｗ）およびタンパク質：ＮａＢＨ_３ＣＮ比１：１（ｗ／ｗ）として、３７℃で４８時間にわたり実行した。結合体は、固体の硫酸アンモニウム（５００ｇ／ｌ）を、粗製結合体溶液へと添加し、混合物を０℃で３０分間にわたり保持して、結合体を沈殿させ、次いで、遠心分離し、ペレットを、ｐＨ７．２の１０ｍＭ ＮａＰｉ中に溶解させることにより精製した。

精製された結合体は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ＭｉｃｒｏＢＣＡ、およびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより特徴決定した。代表的な結合体は、以下の特性：

を有した。

比較のため、この糖を、ＣＲＭ１９７へ同様に結合体化した。

Ｂ．他のラミナリン−肺炎球菌タンパク質結合体と比較したＬａｍ−９６／２０２１の免疫原性
Ｌａｍ−９６／２０２１結合体の免疫原性を、肺炎球菌タンパク質抗原に由来する他のキャリアタンパク質へと結合体化されたラミナリンと比較した。略述すると、１、１４、および２８日目に、ミョウバンアジュバントを伴うかまたは伴わない糖結合体（糖用量５μｇ）を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスへと皮下投与した。４２日目にマウスから採血し、ＥＬＩＳＡにより、特異的抗ラミナリン抗体を測定した（結合体化されていないラミナリンでコーティングしたプレートを用いて［３２１］）。

結果を、図２に示し、垂直の点線により別個の研究を描示する。第１の研究では、Ｌａｍ−９６／２０２１結合体が、肺炎球菌タンパク質抗原であるｓｐｒ０５６５Ｂ、ｓｐｒ１４１６、およびｓｐｒ１４１８に基づくラミナリン結合体より免疫原性であった。結合体はまた、ＣＲＭ１９７に基づく基準ラミナリン結合体よりも免疫原性であった（図２における第１の研究に由来するデータと、第３の研究に由来するデータとを組み合わせた図３を参照されたい）。第２の研究では、ｓｐｒ２０２１単独に基づくラミナリン結合体の免疫原性が、この参照結合体の免疫原性より小さかった。第３の研究では、Ｌａｍ−９６／２０２１結合体が、ｓｐｒ００９６単独に基づくラミナリン結合体より免疫原性であった。結合体はまた、ミョウバンアジュバントの存在下および非存在下のいずれにおいても、ＣＲＭ１９７に基づく参照結合体より免疫原性であることも典型的であった。

Ｃ．９６／２０２１に基づく他の糖結合体の免疫原性
ＭｅｎＡ−９６／２０２１、Ｃ−９６／２０２１、Ｗ−９６／２０２１、およびＹ−９６／２０２１、ならびに５型肺炎球菌−９６／２０２１結合体の免疫原性を、ラミナリン結合体と同じスケジュールを用いて調べ、ＣＲＭ１９７に基づく参照結合体と比較した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、１用量当たり２μｇのＭｅｎＡ糖、１μｇのＭｅｎＣ糖、１μｇのＭｅｎＷ糖、および１μｇのＭｅｎＹ糖で免疫化した。ＥＬＩＳＡアッセイ（結合体化されていない天然多糖でコーティングしたプレートを用いる）により、特異的抗多糖抗体を決定した。

結果を、図４に示し、垂直線／水平線により別個の研究を描示する。第１の研究では、５型肺炎球菌−９６／２０２１結合体が、免疫原性であることが示された。結合体は、ミョウバンの存在下において、ＣＲＭ１９７に基づく参照結合体より免疫原性であった（図５で報告される関連の免疫原性研究で、ミョウバンによる同様の結果が見られた）。第２の研究では、ＭｅｎＡ−９６／２０２１、Ｃ−９６／２０２１、Ｗ−９６／２０２１、およびＹ−９６／２０２１が、免疫原性であることが示され、この免疫原性は、参照結合体の免疫原性と同等であるかまたはそれよりも良好であった。

Ｄ．５型肺炎球菌−９６／２０２１結合体は防御的免疫をもたらす
肺炎球菌血清型５感染に対する防御的免疫のマウスモデルにおいて、５型肺炎球菌−９６／２０２１結合体を、５型肺炎球菌−ＣＲＭ１９７参照結合体と比較した。この実験では、０、１４、および２８日目において、マウス１０匹の群を、異なる免疫原（アジュバントとしてミョウバンを伴うかまたは伴わない）で腹腔内免疫化した。ＰＢＳ単独およびＰＢＳ／ミョウバンのそれぞれで免疫化された２つのマウス群を、陰性対照として用いた。最終回の免疫化の２週間後、全ての群を、致死量の５型肺炎球菌株（ＳＴＲＥＰ−５）で腹腔内感染させた。防御の有効性は、菌血症の低減および死亡率の尺度を用いて評価した。感染の２４時間後、免疫化された群の各々において菌血症レベルを評価し、対照群の菌血症レベルと比較した。死亡率は、感染後１０日間にわたり追跡した。

結果を、図６に報告する。いずれの結合体も、ミョウバンアジュバントの存在下では、１μｇおよび０．２５μｇの用量で、完全な防御を付与した。しかし、アジュバントの非存在下において死亡に対する防御を付与することが可能なのは、５型肺炎球菌−９６／２０２１結合体のみであった。

関連の研究では、これらの結合体を、糖または９６／２０２１キャリアタンパク質単独の場合およびこれらを併せた場合と比較した。いずれの結合体も、完全な防御（５型肺炎球菌−９６／２０２１結合体）またはほぼ完全な防御（５型肺炎球菌−ＣＲＭ１９７）をもたらした。これに対し、糖およびキャリア（単独の場合または併せた場合）は有効でなかった（図７）。

Ｅ．ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体の免疫原性
ａ）ＣＲＭ１９７または９６／２０２１へと結合体化されたＭｅｎＡオリゴ糖；ｂ）ミョウバンを伴うかまたは伴わない、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体、およびＭｅｎＹ−９６／２０２１結合体の組合せを投与されたマウスから、２回目の免疫化後における血清をプールした。これらのプールを、ＥＬＩＳＡにより、抗血清群Ａ抗体の力価について調べた。莢膜多糖に対して誘発された抗体の機能性は、ウサギ補体（ｒＳＢＡ）を用いる血清殺菌アッセイにより評価した。

図８は、プールされた血清についての結果を示す。ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体は、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７結合体より免疫原性であった。ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体は、対応するＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体、およびＭｅｎＹ結合体と組み合わせても、免疫原性を維持した。２回目の免疫化後における、個々のマウスに由来する血清を調べても、同様の観察がなされた（図９、バーの上方にＳＢＡ力価）。

別の研究では、ａ）ＣＲＭ１９７または９６／２０２１へと結合体化されたＭｅｎＡオリゴ糖；ｂ）ミョウバンを伴うかまたは伴わない、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体の、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７結合体、ＭｅｎＷ−ＣＲＭ１９７結合体、およびＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７結合体との組合せを投与された個々のマウスから、２回目の免疫化後における血清をプールした。これらのプールを、ＥＬＩＳＡにより、抗血清群Ａ抗体の力価について調べた。ここでもまた、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体は、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７結合体より免疫原性であった（図１０、バーの上方にＳＢＡ力価）。ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体は、それらをＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７結合体、ＭｅｎＷ−ＣＲＭ１９７結合体、およびＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７結合体と組み合わせても、免疫原性を維持した。

Ｆ．ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体の免疫原性
ａ）ＣＲＭ１９７または９６／２０２１へと結合体化されたＭｅｎＣオリゴ糖；ｂ）ミョウバンを伴うかまたは伴わない、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体、およびＭｅｎＹ−９６／２０２１結合体の組合せを投与されたマウスから、２回目の免疫化後における血清をプールした。これらのプールを、ＥＬＩＳＡにより、抗血清群Ｃ抗体の力価について調べた。莢膜多糖に対して誘発された抗体の機能性を、ウサギ補体（ｒＳＢＡ）を用いる血清殺菌アッセイにより評価した。

図１１は、プールされた血清についての結果を、バーの上方のＳＢＡ力価と共に示す図である。ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体の免疫原性は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７結合体の免疫原性より大きいかまたはこれらと同等であると考えられた。ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体は、対応するＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体、およびＭｅｎＹ結合体と組み合わせても、免疫原性を維持した。

Ｇ．ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体の免疫原性
ａ）ＣＲＭ１９７または９６／２０２１へと結合体化されたＭｅｎＷオリゴ糖；ｂ）ミョウバンを伴うかまたは伴わない、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体、およびＭｅｎＹ−９６／２０２１結合体の組合せを投与されたマウスから、２回目の免疫化後における血清をプールした。これらのプールを、ＥＬＩＳＡにより、抗血清群Ｗ抗体の力価について調べた。

図１２は、プールされた血清についての結果を示す図である。ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体の免疫原性は、ＭｅｎＷ−ＣＲＭ１９７結合体の免疫原性より大きい（ミョウバンを伴わない場合）か、またはこれらと同等（ミョウバンを伴う場合）であると考えられる。ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体は、対応するＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体、およびＭｅｎＹ結合体と組み合わせても、免疫原性を維持した。

Ｈ．ＭｅｎＹ−９６／２０２１結合体の免疫原性
ａ）ＣＲＭ１９７または９６／２０２１へと結合体化されたＭｅｎＹオリゴ糖；ｂ）ミョウバンを伴うかまたは伴わない、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体、ＭｅｎＷ−９６／２０２１結合体、およびＭｅｎＹ−９６／２０２１結合体の組合せを投与されたマウスから、２回目の免疫化後における血清をプールした。これらのプールを、ＥＬＩＳＡにより、抗血清群Ｙ抗体の力価について調べた。

図１３に示される通り、ＭｅｎＹ−９６／２０２１結合体の免疫原性は、ＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７結合体の免疫原性と同等であると考えられ、対応するＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体、およびＭｅｎＹ結合体と組み合わせても、免疫原性を維持する。

Ｉ．ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体に対するＴ細胞の応答
ＣＲＭ１９７、９６／２０２１、またはｓｐｒ１４１６へと結合体化されたＭｅｎＣオリゴ糖に対するＴ細胞の応答を比較した。この実験では、０、１４、および２８日目において、ＣＤ１マウス８匹の群を、異なる免疫原（ミョウバンを伴わない１μｇの糖用量）で皮下免疫化した。ＰＢＳ単独および結合体化されていないＭｅｎＣオリゴ糖（１μｇの糖用量）のそれぞれで免疫化された２つのマウス群を陰性対照として用いた。最終回の免疫化の２１日間後、各マウスに由来する血清を、ＥＬＩＳＡにより、抗多糖抗体について調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗原特異的再刺激後に、細胞内染色多色ＦＡＣＳによりＴ細胞のサイトカインプロファイルを解析するために、各群３匹ずつのマウスから脾臓を単離した。

ＥＬＩＳＡの結果を図１４に報告する。ＭｅｎＣ−９６／２０２１結合体の免疫原性は、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７およびＭｅｎＣ−ｓｐｒ１４１６結合体の免疫原性より大きいかまたはこれらと同等であると考えられた。ＣＲＭ１９７および９６／２０２１はＴ細胞応答を誘導したが、ｓｐｒ１４１６はＴ細胞応答を誘導しなかった（図１５）。

Ｊ．ＨＡＧを組み込む９６／２０２１の調製
標準的な手順を用いて、配列番号９の９６／２０２１ハイブリッドをコードする核酸（ベクターｐＥＴ２１＋またはベクターｐＥＴ２４＋（Ｍｅｒｃｋ）内）で、メチオニン要求性のＥ．ｃｏｌｉ株であるＢ８３４（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ）およびＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｒｙｓｔａｌ（ＮＥＢ）のコンピテント細胞を形質転換した。

ＨＡＧを組み込むタンパク質を産生させるためには、正確なメチオニン濃度が制御されうるように、細胞を合成培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉａ）へと接種した。メチオニンを含有しないＡＢ４複合培地またはＭ９最小培地を、宿主および／または発現プラスミドを維持するために必要に応じて抗生物質を補充した基本培地として用いた。各培地の組成は、以下の通りである：
メチオニンを伴わないＡＢ４：
２倍濃度のＡＢ４ｂａｓｅ：１ｇ／Ｌのアラニン、０．８５８ｇ／Ｌのアルギニン、０．６５ｇ／Ｌのアスパラギン、０．６５６ｇ／Ｌのアスパラギン酸、０．２０２ｇ／Ｌのシステイン、０．８０６ｇ／Ｌのグルタミン、０．８１２ｇ／Ｌのグルタミン酸、１．０３６ｇ／Ｌのグリシン、０．２６ｇ／Ｌのヒスチジン、０．５９４ｇ／Ｌのイソロイシン、１．１７６ｇ／Ｌのロイシン、０．８０６ｇ／Ｌのリシン、０．５５４ｇ／Ｌのフェニルアラニン、０．４７６ｇ／Ｌのプロリン、４．１０８ｇ／Ｌのセリン、０．６２２ｇ／Ｌのトレオニン、０．２２２ｇ／Ｌのトリプトファン、０．５ｇ／Ｌのチロシン、０．８３ｇ／Ｌのバリン、１ｇ／Ｌのアデニン、０．８５８ｇ／Ｌのグアノシン、０．６５ｇ／Ｌのチミン、０．６５６ｇ／Ｌのウラシル、１０００ｍｌの水。

１０００倍濃度のＶｉｔ Ｍｉｘ：１ｇ／Ｌのリボフラビン、１ｇ／Ｌのナイアシンアミド、１ｇ／Ｌの塩化ピリドキシン、１ｇ／Ｌのチアミン、１０００ｍｌの水。

２０００倍濃度の微量元素：５．６ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、４．０ｇ／ＬのＭｎＣｌ_４．４Ｈ_２Ｏ、５．６ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、３．０ｇ／ＬのＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４、０．６ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１０００ｍｌの水。

グルコース（２５％）：２５０ｇ／Ｌのグルコース、１０００ｍｌの水。

最終ＡＢ４培地（１倍濃度）：２．０倍濃度のＡＢ４ｂａｓｅ５００ｍｌ、３８６．５ｍｌの水、２０倍濃度のＰＢＳ １００ｍｌ、１ｍｌのＶｉｔ Ｍｉｘ、０．５ｍｌの微量元素、１２ｍｌのグルコース（２５％）。

Ｍ９：
溶液Ｉ：２００ｇ／Ｌのグルコース、４．９ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．２８ｇ／ＬのＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、１０００ｍｌの水。

溶液ＩＩ（ｐＨ７．４）：７０ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、３０ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、６ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）２ＳＯ_４、１０００ｍｌの水。

最終培地を作製するために、溶液Ｉ／ＩＩを、比８５：５：１０（Ｈ_２Ｏ：溶液Ｉ：溶液ＩＩ）で混合した。

９６／２０２１発現ベクターを保有するＢ８３４（ＤＥ３）株またはＴ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｒｙｓｔａｌ株を、メチオニンを０．１７６ｇ／Ｌまで補充したＡＢ４基本培地またはＭ９基本培地へと接種した。２５℃、１８０ｒｐｍで振とうしながら、ＤＵ５３０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）により測定されるＯＤ６００が１．６に達するまで細胞を成長させた。この時点で、４℃、１０，０００ｇで３０分間にわたり遠心分離することにより細胞をペレット化させ、細胞ペレットからメチオニンを除去するために、メチオニンを伴わない新鮮な基本培地中で２回にわたり洗浄した。この後、ペレットを再懸濁させ、基本培地の新鮮な培養物へと接種し、今回は、最初の成長段階においてメチオニンが存在した濃度と同じ濃度までＨＡＧを補充した（この培地にはメチオニンを添加しなかった）。９６／２０２１ハイブリッドタンパク質の発現を誘導するために、培養物には、ＩＰＴＧを、１ｍＭまで補充し、２５℃、１８０ｒｐｍで振とうしながら、さらに３〜６時間にわたりインキュベートした。

結果として得られる細胞を溶解させ、ＩＭＡＣカラムを用いてタンパク質を精製し、透析によりあらゆる残留イミダゾールを除去した。次いで、質量分析により、精製されたタンパク質の質量を測定し（図１６を参照されたい）、配列番号２０（すなわち、各メチオニンが、Ｌ−ホモアリルグリシンで置換された配列番号９）のタンパク質の予測された重量にほぼ対応する質量を有することを確認した。これは、ＨＡＧの存在下およびメチオニンの非存在下におけるタンパク質の発現により、９６／２０２１の発現時において、ＨＡＧによるメチオニンに代わる置換が引き起こされることを示した。

免疫化研究（１）
一般的なアッセイプロトコール：下記に記載するスケジュールに従い、皮下注射によりＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。注射容量は２００μｌであり、注射は、ミョウバンリン酸アジュバントを含有した。

結合体は、以下の特性：

を有した。

３回目の免疫化の後における、血清群Ａの莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体力価および血清群ＡのＦ８２３８株に対する血清殺菌抗体力価を、図１７に示す。血清群Ａによる結合体は、免疫原性であり、殺菌抗体を誘導した。ＣＲＭ１９７結合体のうちのいずれかを、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する他のＣＲＭ１９７結合体と組み合わせると、応答は、依然として対照を十分に上回るが、わずかに低減された。これに対し、ＭｅｎＡ−９６／２０２１結合体を、これらの結合体と組み合わせても、低減はほとんどまたは全く見られなかった。したがって、９６／２０２１のキャリアとしての使用は、血清群Ａの結合体とこれらの結合体との間のあらゆる免疫干渉を低減することを支援しうる。

３回目の免疫化の後における、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体力価ならびにこれらの血清群に由来する特定の株に対する血清殺菌抗体力価を図１８に示す。９６／２０２１の血清群Ａのためのキャリアとしての使用は、これらの他の多糖に対する免疫応答に影響を及ぼさなかった。

本発明を、例のみを目的として記載してきたが、本発明の範囲および精神の範囲内にとどまりながら、改変を施しうることが理解されるであろう。

Claims (10)

1. 抗原およびキャリア分子を含む結合体を含む、前記抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、前記キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を単一のポリペプチド鎖として含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号９のアミノ酸配列に対して９０％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、組成物。
2. 前記抗原が糖である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する莢膜糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するグルカンまたは莢膜糖である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹに由来する莢膜糖である、請求項３に記載の組成物。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む医薬組成物。
6. 血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む結合体の混合物を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む前記結合体が、各糖について別個の結合体である、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖を含む前記結合体が、同じキャリアに基づく、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記同じキャリアが、請求項１に記載のキャリア分子である、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 哺乳動物において免疫応答をもたらすための組成物であって、請求項１から４のいずれかに記載の組成物または請求項５から９のいずれかに記載の医薬組成物を含む、組成物。