RO122761B1 - Vaccin multivalent antimeningococic conţinând polizaharid-proteină - Google Patents

Vaccin multivalent antimeningococic conţinând polizaharid-proteină Download PDF

Info

Publication number
RO122761B1
RO122761B1 ROA200300633A RO200300633A RO122761B1 RO 122761 B1 RO122761 B1 RO 122761B1 RO A200300633 A ROA200300633 A RO A200300633A RO 200300633 A RO200300633 A RO 200300633A RO 122761 B1 RO122761 B1 RO 122761B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
polysaccharide
vaccine
protein
serogroup
conjugate
Prior art date
Application number
ROA200300633A
Other languages
English (en)
Inventor
P. Robert Ryall
Original Assignee
Aventis Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23001755&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RO122761(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Aventis Pasteur filed Critical Aventis Pasteur
Publication of RO122761B1 publication Critical patent/RO122761B1/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines

Abstract

Prezenta invenţie se referă la o compoziţie imunologică ce cuprinde două, trei sau patru conjugate distincte şi realizate separat, de polizaharidă capsulară-proteină purificată, în care fiecare dintre conjugate cuprinde aproximativ 4 miug de polizaharidă capsulară purificată de N.meningitidis din serogrupul A, C, W-135 sau Y, conjugată printr-un linker de dihidrazida acidului adipic la proteina difterică toxoidă, în care cel puţin un serogrup este W-134 sau Y, şi, mai mult, în care compoziţia imunologică respectivă este capabilă de solicitarea unui răspuns imun la om, la una sau mai multe dintre polizaharidele menţionate.

Description

Prezenta invenție se adresează domeniului medicinei generale, referindu-se mai exact la microbiologie, imunologie, vaccinuri și la prevenirea, prin imunizare, a infecției cu un agent patogen bacterian.
Este cunoscut faptul că Neisseria meningitidis reprezintă cauza principală a meningitei bacteriene și a sepsisului în întreaga lume. Incidența bolii meningococice endemice în ultimii treizeci de ani se înscrie în limite cuprinse între 1 și 5 la 100.000 în țările dezvoltate și între 10 și 25 la 100.000 în țările în curs de dezvoltare (Reido, F.X., et. al. 1995). în timpul epidemiilor, incidența bolii meningococice poate atinge 1000 de cazuri la 1.000.000. Anual, în Statele Unite se înregistrează aproximativ 2.600 de cazuri de meningită bacteriană și, în medie 330.000 de cazuri în țările în curs de dezvoltare. Rata de mortalitate este cuprinsă între 10 și 20%.
Meningococii patogeni sunt înveliți într-o capsulă polizaharidică atașată de suprafața membranei externe a microorganismului. Pe baza specificității imunologice a capsulei polizaharidice au fost identificate treisprezece serogrupuri diferite de meningococi (Frasch, C.E., și colab. 1985). Din aceste treisprezece serogrupuri, cinci provoacă majoritatea bolilor meningococice; acestea cuprind serogrupurile A, B, C, W135 și Y. Serogrupul A este responsabil de boala cu caracterul epidemic cel mai ridicat. Serogrupurile B, C și Y determină majoritatea cazurilor de boală endemică, precum și majoritatea focarelor localizate.
Singurul rezervor natural cunoscut de Neisseria meningitidis este reprezentat de mucoasa naso- și orofaringiană a omului. Colonizarea are loc atât la nivelul suprafeței exterioare a celulelor mucoasei, cât și la nivelul țesutului subepitelial al nazofaringelui. Portajul de meningococi poate dura luni de zile. Răspândirea meningococilor are loc prin contact direct sau prin ploaia de picături. Meningococii devin invazivi prin pătrunderea în epiteliul mucoasei, fiind cuprinși în vacuolele fagocitare ca urmare a endocitozei. Apărarea gazdei împotriva invaziei meningococilor depinde de liza bacteriană mediată de complement. Anticorpii serici responsabili de liza bacteriană mediată de complement sunt în mare parte direcționați împotriva capsulei externe polizaharidice.
Au fost descrise vaccinuri bazate pe polizaharidul meningococic, care determină un răspuns imun împotriva polizaharidului capsular. Acești anticorpi sunt capabili să realizeze bacterioliza mediată de complement, a meningococilor cu specificitate de serogrup. S-a constatat că vaccinurile cu polizaharid meningococic sunt eficace la copii și la adulți (Peltola, H., și colab. 1977 și Artenstein, M.S., și colab. 1970), însă eficacitatea la copii cu vârste cuprinse între 0 și 3 ani, și la copii mici este limitată (Reingold, A.L., și colab. 1985). Doze ulterioare de polizaharid administrate populației tinere determină un răspuns booster slab sau absent (Goldschneider, I., și colab. 1973 și Gold, R., și colab. 1977). Protecția determinată de vaccinurile conținând polizaharid meningococic nu este de durată și s-a estimat a fi cuprinsă între 3 și 5 ani la adulți și la copii cu vârsta de peste patru ani (Brandt, B., și colab. 1975, Kăyhty, H., și colab. 1980 și Ceesay, S. J., și colab. 1983). în cazul copiilor de la 1 la 4 ani, durata protecției este mai mică de trei ani (Reingold, A. L, și colab. 1985).
Polizaharidele sunt incapabile de a se lega la majoritatea moleculelor complexului major de histocompatibilitate, premisă obligatorie pentru prezentarea antigenului și pentru stimularea limfocitelorT-helper, și anume polizaharidele reprezintă antigene independente de celulele T. Polizaharidele pot însă stimula limfocitele B pentru producția de anticorpi fără ajutorul limfocitelor T-helper. Ca rezultat al stimulării T-independente a limfocitelor B, lipsește inducerea memoriei ca urmare a imunizării prin aceste antigene. Antigenele polizaharidice pot determina răspunsuri T-independente foarte eficiente la adult, însă aceste răspunsuri T-independente sunt slabe în cazul sistemului imun imatur al copiilor cu vârste cuprinse între 0 și 3 ani, și peste 3 ani.
RO 122761 Β1
Antigenele polizaharidice T-independente pot fi transformate în antigene T-depen- 1 dente prin legarea covalentă a polizaharidelor la molecule proteice („purtători sau „proteine purtătoare). Celulele B care se leagă de componentul polizaharidic al vaccinului conjugat 3 pot fi activate de către celulele T-helper activate specific, pentru peptidele care fac parte din proteina transportoare conjugată. Răspunsul celulelor T-helper la proteina transportoare 5 servește la creșterea producției de anticorpi sintetizați împotriva polizaharidului.
S-a constatat că polizaharidele serogrupului B sunt slab imunogene până la neimu- 7 nogeneîn cazul populației umane (Wyle, F. A., și colab. 1972). Legarea chimică a polizaharidelor acestui serogrup de proteine nu alterează semnificativ răspunsul imun la animalele 9 de laborator (Jennings, H.J., și colab. 1981). Absența răspunsului imun față de polizaharidele acestui serogrup se consideră a fi datorat asemănărilor de structură dintre polizaharidele 11 serogrupului B și glicoproteinele polisialilate ale gazdei, cum ar fi moleculele de adeziune ale celulelor neurale. 13
A fost descris și un vaccin meningococic conținând conjugat bazat pe polizaharidul serogrupului C. Acest vaccin monovalent determină un răspuns puternic, cu anticorpi 15 funcționali sintetizați împotriva polizaharidului capsular prezent pe tulpinile de N. meningitidis aparținând serogrupului C. Acest vaccin este eficient numai în protecția împotriva bolii 17 cauzate de bacterii aparținând serogrupului C.
Vaccinurile existente conținând polizaharid meningococic au o utilizare limitată la 19 copii de vârstă mică și nu conferă protecție de durată în cazul adulților. Singurul vaccin meningococic despre care s-a constatat că poate determina o protecție de durată pentru 21 toate grupele cu risc de infecție meningococică, inclusiv pentru copii, se bazează pe polizaharidul provenind de la un singur serogrup de N. meningitidis și nu oferă protecție împotriva 23 infecției cu alte serogrupuri. Prin urmare, este nevoie de un vaccin conținând conjugat meningococic care să ofere protecție cu spectru larg, de lungă durată, împotriva bolii 25 meningococice la copii și adulți cu risc de infecție meningococică. Polizaharidele meningococice polivalente din prezenta invenție rezolvă acestă nevoie prin furnizarea unor 27 formulări de vaccin, în care polizaharidele imunogene provenind de la principalele serogrupuri patogene de N. meningitidis au fost transformate în antigene T-dependente prin 29 conjugări cu proteine purtătoare.
Prezenta invenție se referă la compoziții imunologice, destinate tratamentului, 31 conținând conjugate polizaharid meningococic-proteină de la tulpini patogene de Neisseria meningitidis. 33
Prezenta invenție se referă la compoziții imunologice conținând două sau mai multe conjugate proteină-polizaharid, în care, fiecare din conjugate conține un polizaharid capsular 35 de N. meningitidis, conjugat cu o proteină purtătoare.
Prezenta invenție se referă la compoziții imunologice conținând două sau mai multe 37 conjugate polizaharid-proteină distincte, în care, fiecare din conjugate conține un polizaharid capsular, provenind de la un serogrup diferit de N. meningitidis, conjugat cu o proteină 39 purtătoare.
Prezenta invenție se referă la vaccinuri conținând conjugate polizaharid-proteină 41 produse de tulpini patogene de Neisseria meningitidis. Prezenta invenție se referă la vaccinuri meningococice polivalente alcătuite din cantități imunologic eficiente, conținând 43 două până la patru conjugate polizaharid-proteină distincte, în care, fiecare dintre conjugate conține un polizaharid capsular diferit, conjugat cu o proteină purtătoare, și în care, fiecare 45 dintre polizaharidele capsulare este ales dintr-un grup format din polizaharidele capsulare provenind de la serogrupurile A, C, W135 și Y. 47
RO 122761 Β1
Prezenta invenție se referă de asemenea și la metode de obținere a unei compoziții meningococice polivalente conținând conjugat polizaharid-proteină, aceste metode cuprinzând purificarea a două sau mai multe polizaharide capsulare provenind de la tulpini patogene de Neisseria meningitidis-, conjugarea polizaharidelor purificate cu una sau mai multe proteine purtătoare și combinarea conjugatelor, obținându-se compoziția meningococică polivalentă conținând conjugat polizaharid-proteină.
Prezenta invenție se referă, de asemenea, și la o metodă de inducere a unui răspuns imunologic față de polizaharidul capsular de N. meningitidis, această metodă conținând administrarea unei cantități eficiente imunologic la un subiect uman sau animal, din compoziția care face obiectul invenției.
Prezenta invenție se referă la un vaccin meningococic polivalent, conținând cantități imunologic eficiente de două până la patru conjugate disticte polizaharid-proteină, în care, fiecare din conjugate conține un polizaharid capsular diferit, conjugat cu o proteină transportoare, și în care fiecare polizaharid capsular este selectat din grupul format din polizaharidele capsulare de la serogrupurile A, C, W-135 și Y.
Prezenta invenție se referă și la o metodă de protecție a oamenilor și animalelor cu susceptibilitate la infecțiile cu N. meningitidis, cuprinzând în administrarea la om sau la animal, a unei doze eficiente imunologic din vaccinul ce face obiectul invenției.
Toate brevetele, cererile de brevet și alte publicații menționate aici sunt cuprinse în prezenta descriere prin referință.
Prezenta invenție are ca obiect o compoziție imunologică, conținând două sau mai multe conjugate proteină-polizaharid distincte, în care, fiecare din conjugate cuprinde un polizaharid capsular conjugat cu o proteină purtătoare. Astfel, prezenta invenție se referă la compoziții care conțin două sau mai multe polizaharide capsulare diferite, conjugate cu una sau mai multe proteine purtătoare.
Polizaharidele capsulare potfi obținute prin tehnici standard, cunoscute de specialiști, în conformitate cu prezenta invenție, polizaharidele capsulare se obțin de la N. meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y fiind de preferat.
în conformitate cu un exemplu preferat de realizare a invenției, aceste conjugate de serogrupuri meningococice se obțin prin procedee separate și se formulează ca doză unică. De exemplu, se purifică separat polizaharidele capsulare aparținând N. meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y.
în conformitate cu un exemplu preferat de realizare a invenției, polizaharidul purificat se depolimerizează și se activează înainte de conjugarea cu proteina purtătoare. în conformitate cu un exemplu de realizare a invenției mai specific, polizaharidele capsulare de N. meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y se depolimerizează parțial, în condiții de oxidare blândă.
Depolimerizarea sau depolimerizarea parțială a polizaharidelor poate fi apoi urmată de o etapă de activare. Prin „activare se înțelege tratament chimic aplicat polizaharidului, obținându-se grupări chimice capabile să reacționeze cu proteina purtătoare. O metodă de activare preferată implică tratamentul cu dihidrazida acidului adipicîn ser fiziologic la pH de 5,0+0,1, timp de aproximativ 2 h, la o temperatură de 15 până la 30°C. în brevetul US 5965714 este descris un procedeu de activare.
Odată activate, polizaharidele capsulare pot fi conjugate cu una sau mai multe proteine purtătoare. în conformitate cu un exemplu preferat de realizare a invenției, fiecare polizaharid capsular se conjugă separat cu un singur tip de proteină purtătoare. în conformitate cu un exemplu preferat de realizare a invenției, polizaharidele capsulare aparținând serogrupurilor A, C, W-135 și Y de N. meningitidis se conjugă fiecare, separat, cu același tip de proteină purtătoare.
RO 122761 Β1
Proteinele purtătoare pot fi reprezentate de toxine bacteriene inactivate, cum sunt 1 toxoidul difteric, CRM197, toxoidul tetanic, toxoidul pertussis, E. coli LT, E. coli ST și exotoxina A de la Pseudomonas aeruginosa. Pot fi de asemenea utilizate proteine apar- 3 ținând membranei externe a bacteriei, cum sunt complexul c al membranei externe (OMPC), porine, proteine ce leagă transferina, proteina pneumolitică, proteina A de suprafață a 5 pneumococului (PspA) sau proteina pneumococică de adeziune (PsaA). Mai pot fi utilizate ca proteine purtătoare și alte proteine, cum sunt ovalbumina, KLH (keyhole limpet 7 hemocyanin), albumina serică bovină (BSA) sau proteina purificată derivată din tuberculină (PPD). Proteinele purtătoare sunt reprezentate, de preferat, de proteine care nu sunt toxice 9 și nici reactogene și care pot fi obținute într-o cantitate și o puritate satisfăcătoare. E nevoie ca proteinele purtătoare să poată fi supuse la proceduri standard de conjugare. 11 în conformitate cu un exemplu preferat de realizare a invenției, se utilizează ca proteină purtătoare toxina difterică purificată provenind din culturile de Corynebacteria 13 diphtheriae și detoxifiată chimic utilizând formaldehidă.
După conjugarea polizaharidului capsular cu proteina purtătoare, conjugatele 15 polizaharid-proteină pot fi purificate (îmbogățite, din punct de vedere al cantității de conjugat polizaharid-proteină) prin diverse tehnici. Un scop al etapei de purificare îl constituie înde- 17 părtarea polizaharidului nelegatdin conjugatul polizaharid-proteină. în brevetul US 6146902 este descrisă o metodă de purificare constând în ultrafiltrare în prezența sulfatului de 19 amoniu. în mod alternativ, conjugatele pot fi purificate separat de proteina și polizaharidul nereacționate printr-o serie de tehnici standard, reprezentate, printre altele, de cromatografie 21 cu specificitate de dimensiune, centrifugare cu gradient de densitate, cromatografie cu interacții hidrofobice sau fracționare cu sulfat de amoniu. A se vedea, de exemplu P. W. 23 Anderson, și colab. (1986), J. Immunol. 137:1181-1186. A se vedea, de asemenea, H. J. Jennings și C. Lugowski (1981), J. Immunol. 127: 1011-1018. 25
După conjugarea polizaharidului cu proteina purtătoare, compozițiile imunologice ce fac obiectul prezentei invenții sunt realizate prin combinarea diverselor conjugate 27 polizaharid-proteină. Compozițiile imunologice ce fac obiectul prezentei invenții conțin două sau mai multe polizaharide capsulare diferite, conjugate cu una sau mai multe proteine 29 transportoare. Un exemplu preferat de realizare a invenției este reprezentat de o compoziție imunologică bivalentă conținând polizaharide capsulare aparținând serogrupurilor A și C de 31
N. meningitidis, conjugate separat cu toxoid difteric. Mai preferabil, obiectul prezentei invenții este reprezentat de o compoziție imunologică tetravalentă conținând polizaharide capsulare 33 aparținând serogrupurilor A, C, W-135 și Y de N. meningitidis, conjugate separat cu toxoid difteric. 35
Sunt binecunoscute de specialiști obținerea și utilizarea proteinelor transportoare și diverse procedee posibile de conjugare. Conjugatele ce fac obiectul prezentei invenții pot fi 37 obținute de specialiști utilizând indicațiile din prezenta invenție, ca și informațiile disponibile în literatura generală de specialitate. îndrumări pot fi obținute, de asemenea, din următoarele 39 brevete U.S. ale căror descrieri sunt cuprinse în întregime în prezenta descriere prin referință: US 4356170, 4619828, 5153312, 5422427 și 5445817. 41
Problema pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unei compoziții imunologice pentru prevenirea, prin imunizare, a infecției cu un agent patogen bacterian. 43
Compoziție imunologică conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde două, trei sau patru conjugate distincte și realizate separat, de 45 polizaharidă capsulară-proteină purificată, în care fiecare dintre conjugate cuprinde aproximativ 4 pg de polizaharidă capsulară purificată de N. meningitidis din serogrupul A, 47 C, W-135 și Y, conjugată printr-un linker de dihidrazidă a acidului adipic la proteina difterică
RO 122761 Β1 toxoidă, în care cel puțin un serogrup este W-135 sau Y și mai mult, în care compoziția imunologică respectivă este capabilă de solicitarea unui răspuns imun la om, la una sau mai multe din polizaharidele menționate.
Prin aplicarea invenției, se obține următorul avantaj;
- se asigură protecție de durată pentru toate grupele cu risc de infecție meningococică.
Compozițiile imunologice ce fac obiectul prezentei invenții sunt realizate prin obținerea separată de conjugate polizaharid-proteină din diferite serogrupuri meningococice, urmată apoi de combinarea conjugatelor. Compozițiile imunologice ce fac obiectul prezentei invenții pot fi utilizate ca vaccinuri. Formulări ale vaccinurilor ce fac obiectul prezentei invenții pot fi realizate utilizând metode cunoscute din stadiul tehnicii. Compozițiile de vaccin ale prezentei invenții pot conține și unul sau mai mulți adjuvanți, Adjuvanții sunt reprezentați, printre altele, de adjuvanți cu aluminiu, adjuvant Freund, BAY, DC-chol, pcpp, lipid A monofosforilat, CpG, QS-21, toxină holerică și formil metionil peptidă. A se vedea, de exemplu Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995 (M.F. Powell și M.J. Newman, edit. Plenum Press, NY). Adjuvantul este, de preferință, un adjuvant cu aluminiu precum hidroxidul de aluminiu sau fosfatul de aluminiu.
Așa cum se demonstrează mai jos, vaccinurile și compozițiile imunologice în conformitate cu invenția determină un răspuns imun tip T-dependent în diferite modele animale, în timp ce vaccinul polizaharidic determină un răspuns imun de tip T-independent. Astfel, compozițiile în conformitate cu prezenta invenție reprezintă, de asemenea, mijloace utile de cercetare în studiul căilor biologice și proceselor implicate în răspunsurile imune de tip T-dependent față de antigenele N. meningitidis.
Cantitatea de vaccin în conformitate cu prezenta invenție, administrată la om sau la animal, și schema de administrare se determină în conformitate cu tehnici standard, binecunoscute de specialiști în domeniul farmaceutic și veterinar, luându-se în considerare factori ca: antigenul specific, adjuvantul (dacă este prezent), vârsta, sexul, greutatea, specia și starea animalului sau pacientului și calea de administrare. în conformitate cu prezenta invenție, cantitatea de polizaharid-proteină purtătoare care să reprezinte o doză eficientă pentru vaccinarea împotriva N. meningitidis poate varia între aproximativ 0,02 și aproximativ 5 pg pe kilogram de greutate corporală. în conformitate cu o compoziție și cu o metodă preferate ale invenției, doza se înscrie între aproximativ 0,1 și 3 pg pe kilogram de greutate corporală. De exemplu, o doză eficientă antrenează mai puțini anticorpi dacă timpul scurs de la infecție este mai mic, deoarece bacteriile au mai puțin timp la dispoziție pentru a prolifera. în mod similar, o dozare eficientă depinde de încărcătura bacteriană în momentul diagnosticului. Poate fi luată în considerare, pentru utilizarea terapeutică, administrarea mai multor injecții pe o perioadă de câteva zile.
Conjugatele polivalente ce fac obiectul prezentei invenții pot fi administrate în doză unică sau într-o serie de administrări (cu un „booster sau mai multe). De exemplu, un copil poate primi o singură doză, timpuriu, urmată de administrarea unei doze booster cu până la zece ani mai târziu, conform recomandărilor curente în cazul altor vaccinuri destinate prevenirii bolilor copilăriei.
Dozele booster determină sinteza anticorpilor de către celulele B inițiale, ceea ce reprezintă un răspuns anamnestic. Aceasta semnifică faptul că vaccinul conținând conjugat polivalent determină un răspuns primar (urmând unei administrări unice de vaccin) cu anticorpi funcționali în rândul populației tinere, comparativ cu vaccinul polizaharidic autorizat și este capabil să determine un răspuns anamnestic (urmând unei administrări booster), demonstrând că răspunsul protector imun determinat de vaccinul conținând conjugat polivalent ce face obiectul prezentei invenții este de lungă durată.
RO 122761 Β1
Compozițiile în conformitate cu prezenta invenție pot fi reprezentate de preparate 1 lichide destinate administrării orale, nazale, anale, vaginale, peros, intragastrice, pe mucoase (de exemplu perilingual, alveolar, gingival, pe mucoasa olfactivă sau respiratorie) etc., 3 preparate sub formă de suspensii, siropuri sau elixiruri; și preparate destinate adminstrării parenterale, subcutanate, intradermice, intramusculare, intraperitoneale sau intravenoase 5 (de exemplu administrarea pe cale injectabilă), sub formă de suspensii și emulsii sterile. Se preferă administrarea intravenoasă și parenterală. Aceste compoziții pot fi în amestec cu un 7 purtător adecvat, diluant sau excipient precum apa sterilă, serul fiziologic, glucoza și altele de acest tip. Compozițiile pot fi reprezentate și de preparate liofilizate. Compozițiile pot 9 conține substanțe auxiliare, reprezentate de agenți umectanți sau emulgatori, agenți de tamponare a pH-ului, aditivi de gelificare sau de creștere a viscozității, conservanți, agenți 11 aromatizanți, coloranți etc., în funcție de calea de administrare și de preparatul dorit. în vederea obținerii de preparate adecvate, fără experimente suplimentare, se pot consulta 13 textele standard precum Remington's Pharmaceutical Science, ediția a 17-a, 1985, cuprinsă în prezenta descriere prin referință. 15
Compozițiile în conformitate cu invenția pot fi prezentate în mod convenabil ca preparate lichide, de exemplu, soluții apoase izotonice, suspensii, emulsii sau compoziții vâs- 17 coase, care pot fi tamponate cu pH ales. în cazul în care este preferată absorbția prin tractul digestiv, compozițiile în conformitate cu invenția se pot găsi sub formă solidă, de pilule, 19 tablete, capsule, casete și altele asemenea lor, inclusiv sub formă de preparate „solide retard sau care au o umplutură lichidă, de exemplu preparate cu gelatină ce acoperă 21 substanța lichidă, întrucât gelatina se dizolvă în stomac și substanța activă se eliberează în intestin. Dacă se dorește administrarea la nivelul mucoasei nazale sau respiratorii, corn- 23 pozițiile pot fi administrate prin pulverizare, cu ajutorul unui pulverizator, a unei pompe sau al unui dispozitiv de administrare a aerosolilor. în mod obișnuit, aerosolii se formulează sub 25 presiune cu ajutorul hidrocarburilor. Dispozitivele de administrare cu pompă pot elibera o doză măsurată sau o doză cu o anume dimensiune a particulelor. 27
Preparatele lichide sunt mai ușor de realizat decât gelurile, decât alte compoziții cu consistență vâscoasă sau decât compozițiile solide. în plus, compozițiile lichide sunt în 29 oarecare măsură mai ușor de administrat, în special pe cale injectabilă sau orală, la animale, la copii, mai ales la copii mici și în alte cazuri în care există dificultăți de înghițire a pilulei, 31 tabletei, capsulei etc., ori în situațiile în care se administrează mai multe doze. Compozițiile vâscoase, pe de altă parte, pot fi formulate având un nivel de viscozitate adecvat unui 33 contact prelungit cu mucoasa, de exemplu, mucoasa stomacului și mucoasa nazală.
Evident, alegerea purtătorilor adecvați și a altor aditivi depinde de calea de 35 administrare și de natura formei de administrare, de exemplu, sub formă lichidă (compoziții formulate sub formă de soluție, suspensie, gel sau altă formă lichidă), sau sub formă solidă 37 (compoziții formulate sub formă de pilule, tablete, capsule, casete, forme cu eliberare retard sau forme cu miez lichid). 39
Soluțiile, suspensiile și gelurile conțin în mod normal preponderent apă (de preferat apă purificată) pe lângă ingredientul activ. Pot fi de asemenea prezente cantități mici din alte 41 ingrediente, de tipul corectori de pH (de exemplu o bază de tipul NaOH), emulgatori sau agenți de dispersie, agenți tampon, conservanți, agenți de umidificare, agenți de gelifiere (de 43 exemplu metilceluloza), coloranți și/sau aromatizanți. Compozițiile pot fi izotonice, ceea ce înseamnă că pot avea aceeași presiune osmotică pe care o au sângele și lichidul lacrimal. 45 Izotonicitatea dorită pentru compozițiile ce fac obiectul prezentei invenții poate fi realizată utilizând tartrat de sodiu, propilenglicol, sau alte substanțe dizolvate, organice sau anor- 47 ganice. Clorura de sodiu este preferată în special pentru sistemele tampon conținând ioni de sodiu. 49
RO 122761 Β1
Viscozitatea compozițiilor poate fi menținută la nivelul dorit folosind un agent de îngroșare farmacologic acceptabil. Se preferă metilceluloza, deoarece este rapid disponibilă și din punct de vedere economic și este ușor de prelucrat. Alți agenți de îngroșare adecvați sunt reprezentați, de exemplu, de gumă xantanică, carboximetilceluloză, hidroxipropilceluloză, carbomer și alții de același tip. Concentrația preferată de agent de îngroșare depinde de agentul ales. Important este să se utilizeze cantitatea care să confere viscozitatea dorită. Compozițiile vâscoase sunt în mod normal obținute din soluții, prin adăugarea unor astfel de agenți de îngroșare.
Pentru a crește stabilitatea la depozitare, se poate întrebuința un conservant farmacologic acceptabil. Poate fi adecvată utilizarea de alcool benzilic, deși se pot folosi o varietate de conservanți, incluzând parabeni, timerozal, clorbutanol sau clorură de benzalconiu. Concentrația adecvată de conservant este cuprinsă între 0,02 și 2% din greutatea totală, deși pot exista variații semnificative, în funcție de agentul întrebuințat.
Specialiștii în domeniu recunosc faptul că componentele compoziției alese trebuie să fie inerte chimic în relația cu conjugatul proteină transportoare - polizaharid de N. meningitidis.
în continuare, prezenta invenție este descrisă prin intermediul următoarelor exemple cu rol ilustrativ, fără a fi restrictive în ceea ce privește aria de întindere a protecției, prezentând în detaliu câteva variante preferate de realizare a conceptului inventiv.
Specialiștii în domeniu vor putea imagina și alte exemple, aparținând de asemenea domeniului acestei invenții.
» în continuare, se prezintă 9 exemple de realizare a invenției.
Exemplul 1. Obținerea pulberii purificate de polizaharide capsulare de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y
Obținerea pastei brute
Se decongelează separat culturile de colecție, congelate umed, de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y și se reconstituie cu ajutorul mediului lichid Watson Scherp și se însămânțează în sticle Blake conținând mediu cu agar Mueller Hinton. Se incubează sticlele Blacke la o temperatură de 35 până la 37°C, în atmosferă de CO2, timp de 15 până la 19 h. După perioada de incubare se desprind coloniile din sticlele Blacke și se adaugă în baloane de 41 conținând mediu Watson Scherp. Se incubează baloanele la o temperatură de 35 până la 37”C, timp de 3 până la 7 h, pe un agitator tip platformă. Se transferă conținutul baloanelor de 4 I într-un vas de fermentație conținând mediu Watson ! » 1
Scherp. Vasul de fermentație se incubează la o temperatură de 35 până la 37°C, timp de 7 până la 12 h, controlând conținutul de oxigen dizolvat și pH-ul prin adăugare de suplimente nutritive și de aditivi antispumanți. După perioada de incubare, conținutul vasului de fermentație se transferă într-un rezervor de 500 I, se adaugă Cetavlon și se amestecă produsul timp de 1 h. Se centrifughează culturile tratate cu Cetavlon la aproximativ 15.000 până la 17.000 x g, la un debit de aproximativ 30 până la 70 I pe oră. Se precipită polizaharidul brut din supematant la o a doua precipitare cu Cetavlon. Se adaugă Cetavlon la supematant și se amestecă produsul timp 1 h la temperatura camerei. Produsul se depozitează la o temperatură de 1 până la 5°C timp de 8 până la 12 h. Se colectează polizaharidul precipitat prin centrifugare la aproximativ 45.000 până la 50.000 x g, la un debit de 300 până la 400 ml pe minut. Pasta colectată se depozitează la o temperatură de -60°C sau mai scăzută, până la o prelucrare ulterioară.
Obținerea polizaharidului sub formă de pulbere purificată
Se decongelează pasta inactivată și se transferă într-un mixer. Se amestecă pasta cu clorură de calciu 0,9M, obținându-se o suspensie omogenă. Suspensia se centrifughează la aproximativ 10.000 x g timp de 15 min. Se decantează supernatantul printr-un strat fără
RO 122761 Β1 fibre textile, într-un recipient, ca și primul extract. Se adaugă în pasta respectivă al doilea 1 volum de clorură de calciu 0,9 M și se amestecă, obținându-se o suspensie neomogenă. Se centrifughează suspensia ca mai sus și se combină supernatantul cu supernatantul provenit 3 din urma primei extracții. Se efectuează un total de patru extracții și se colectează împreună supernatanții. Se concentrează prin ultrafiltrare supernatanții colectați, utilizând unități de 5 filtrare cu cu bobină spiralată de tip 10-30 kDA MWCO.
Se adaugă clorură de magneziu la concentratul de mai sus și se aduce pH-ul la 7,2 7 până la 7,5, utilizând hidroxid de sodiu. Se adaugă DN-ază și RN-ază în concentratul de mai sus și se incubează la o temperatură de 25 până la 28°C, amestecându-se timp de 4 h. Se 9 adaugă etanol în concentrație de 30 până la 50%. Se îndepărtează acidul nucleic și proteina precipitate prin centrifugare la 10.000 x g timp de 2 h. Se extrage supernatantul și se 11 precipită polizaharidul prin adăugare de etanol până la 80% și se păstrează peste noapte la o temperatură de 1 până la 5°C. Se sifonează alcoolul, iar polizaharidul precipitat se centri- 13 fughează timp de 5 min, la 10.000 x g. Se spală precipitatul polizaharidic cu alcool. Se spală polizaharidul cu acetonă și se centrifughează timp de 15 până la 20 de min, la 10.000 x g. 15 Se usucă polizaharidul în vid. Poliaharidul sub formă de pulbere, inițial obținut, se dizolvă într-o soluție de acetat de sodiu. Se adaugă clorură de magneziu și se aduce pH-ul la 7,2 17 până la 7,5, utilizând o soluție de hidroxid de sodiu. Se adaugă în soluție DN-ază și RN-ază și se incubează la o temperatură de 25 până la 28’0, amestecându-se timp de 4 h, pentru 19 a se îndepărta acizii nucleici reziduali. După incubarea cu aceste enzime, se adaugă la amestecul de polizaharid-enzimă un volum egal de soluție de acetat de sodiu-fenol și se 21 pune pe un agitator tip platformă la o temperatură de 1 până la 5°C, timp de aproximativ 30 min. Se centrifughează amestecul la 10.000 x g, timp de 15 până la 20 de min. Stratul apos 23 superior se recuperează și se păstrează. Un volum egal de soluție de acetat de sodiu-fenol se adaugă în stratul apos și se extrage ca mai sus. Se efectuează un total de patru extracții, 25 îndepărtându-se proteina și endotoxina din soluția de polizaharid. Extractele apoase reunite se diluează până la de zece ori cu apă distilată injectabilă și se diafiltrează în raport cu zece 27 volume de apă distilată injectabilă. Se adaugă clorură de calciu polizaharidului diafiltrat. Polizaharidul se precipită peste noapte, la o temperatură de 1 până la 5°C, prin adăugare de 29 etanol 80%. Supernatantul alcoolic se extrage, iar polizaharidul se colectează prin centrifugare la 10.000 x g, timp de 15 min. Se spală polizaharidul purificat, de două ori cu 31 etanol și o dată cu acetonă. Pulberea spălată se usucă în vid, într-un exicator. Pulberea uscată se păstrează la -30°C sau la o temperatură mai scăzută, până la prelucrarea ei în 33 vederea obținerii conjugatului.
Exemplul 2. Depolimerizarea pulberii purificate de polizaharid capsular de Neisseria 35 meningitidis, serogrupurile A, C, W-135șiY
Materialele utilizate la această preparare sunt reprezentate de pulberile purificate de 37 polizaharid capsular de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y (obținute în conformitate cu exemplul 1), soluție tampon sterilă de acetat de sodiu 50 mM, de pH 6,0, 39 acid clorhidric steril 1N, hidroxid de sodiu 1N steril, apă oxigenată 30% și ser fiziologic steril (clorură de sodiu 0,85%). 41
Polizaharidul fiecărui serogrup se depolimerizează într-o reacție separată. Se încarcă un rezervor de oțel inoxidabil cu până la 60 g de pulbere purificată de polizaharid capsular. 43 Soluția tampon sterilă de acetat de sodiu 50 mM, de pH 6,0, se adaugă polizaharidului, obținându-se o concentrație de 2,5 g de polizaharid pe litru. Soluția de polizaharid se lasă 45 la amestecat la o temperatură de 1 până la 5°C, timp de 12 până la 24 h, pentru dizolvare.
Se conectează rezervorul de reacție la o unitate de schimb de căldură. Se adaugă o cantitate 47 suplimentară de soluție tampon de acetat de sodiu 50 mM, pH 6,0, pentru a dilua polizaharidul
RO 122761 Β1 la o concentrație de reacție de 1,25 g pe litru. Se încălzește soluția de polizaharid la 55’C±0,1.
Se adaugă un alicot de apă oxigenată 30% în amestecul de reacție, obținându-se o concentrație de reacție de 1% apă oxigenată.
Desfășurarea reacției se monitorizează prin observarea modificării în timp a dimensiunii moleculare a polizaharidului. Se prelevează alicote din amestecul de reacție la fiecare 15 până la 20 min și se injectează într-o coloană HPSEC, măsurându-se dimensiunea moleculară a polizaharidului. Când dimensiunea moleculară a polizaharidului atinge dimensiunea moleculară dorită, se oprește unitatea de încălzire și soluția de polizaharid se răcește rapid la 5’C, prin trecerea printr-o baie de apă rece. Soluția de polizaharid depolimerizat se concentrează la 15 g pe litru conectând rezervorul de reacție la o unitate de ultrafiltrare prevăzută cu cartușe de celuloză regenerată de 3000 MWCO. Soluția concentrată de polizaharid depolimerizat se diafiUrează în raport cu 10 volume de ser fiziologic steril (0,85% clorură de sodiu). Polizaharidul depolimerizat se păstrează la 1 până la 5’C până la o nouă etapă a procedeului.
Se determină dimensiunea moleculară a polizaharidului depolimerizat prin trecerea printr-o coloană de cromatografie prin filtrare în gel cu denumirea comercială de „Ultahydrogel™250, care se calibrează utilizând standarde cu dimensiunea moleculară a dextranului și prin difuziunea multiangulară a razelor laser. Pentru serogrupul A, cantitatea de polizaharid se determină în funcție de conținutul de fosfor, utilizând metoda lui Bartlet, G.R.J. (1959) Journal ofBiological Chemistry, 234, pag. 466-468 și pentru serogrupurile C, W135 și Y în funcție de conținutul de acid sialic, utilizând metoda lui Svennerholm, L. (1955) Bichimica Biophysica Acta 24, pag. 604-611. Conținutul de O-acetil se determină prin metoda lui Hersterin, S. (1949) Journal ofBiological Chemistry 180, pag. 249. Activitatea reducătoare se determină prin metoda lui Park, J. T. și a lui Johnson, M.J. (1949) Journal of Biologica! Chemistry 181, pag. 149-151. Integritatea structurală a polizaharidului depolimerizat se determină prin RMN 1H și RMN 13C al proteinei. Puritatea polizaharidului depolimerizat se determină prin măsurarea conținutului de LAL (endotoxină) și a conținutului de apă oxigenată reziduală.
Exemplul 3. Derivatizarea polizaharidului depolimerizat de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y
Materialele folosite pentru obținerea acestuia sunt reprezentate de apă oxigenată, polizaharid capsular depolimerizat de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y (obținut în conformitate cu exemplul 2), dihidrazida acidului adipic, 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidă (EDAC) doar în cazul serogrupului A, cianborohidrură de sodiu, acid clorhidric 1N steril, hidroxid de sodiu 1N steril, clorură de sodiu 1M sterilă și ser fiziologic steril (0,85% clorură de sodiu).
Polizaharidul fiecărui serogrup se derivatizează într-o reacție separată. Se încarcă un rezervor de oțel inoxidabil cu polizaharid depolimerizat purificat, se diluează cu ser fiziologic steril 0,85%, realizându-se o concentrație finală de reacție de 6 g de polizaharid pe litru. La această soluție se adaugă un alicot concentrat de hidrazidă a acidului adipic dizolvată în ser fiziologic steril 0,85%, în vederea obținerii unei concentrații de reacție de 1g pe litru. Doar pentru serogrupul A, se adaugă EDAC sub forma unui alicot concentrat dizolvat în ser fiziologic steril 0,85%, obținându-se o concentrație de reacție de 1 g pe litru. pH-ul se aduce la 5,0±0,1 și se menține la acest nivel timp de 2 h, utilizând acid clorhidric 1N steril și hidroxid de sodiu 1N steril, la temperatura camerei (15 până la 30°C). După două ore, se adaugă la amestecul de reacție un alicot concentrat de cianborohidrură de sodiu, dizolvat în ser fiziologic 0,85%, obținându-se o concentrație de reacție de 2 g pe litru. Se agită amestecul de reacție la temperatura camerei (15 până la 30°C), timp de 44 h ± 4 h,menținând pH-ul la 5,5 ±0,5.
RO 122761 Β1
După această etapă de reacție, se aduce pH-ul la 6,0±0,1, iar polizaharidul derivatizat se 1 concentrează la 12 g de polizaharid pe litru, conectând rezervorul de reacție la o unitate de ultrafiltrare prevăzută cu cartușe de celuloză regenerate 3000 MWCO. Polizaharidul deri- 3 vatizat concentrat se diafiltrează în raport cu 30 de volume de clorură de sodiu 1M, urmată de 10 volume de clorură de sodiu 0,15 M. Se deconectează rezervorul de la unitatea de 5 ultrafiltrare și se păstrează la o temperatură de 1 până la 5’C, timp de 7 zile. Se reconectează rezervorul la o unitate de ultrafiltrare echipată cu cartușe de celuloză regenerate 7 3000 MWCO, se diafiltrează în raport cu 30 de volume de clorură de sodiu 1M, urmat apoi de diafiltrarea în raport cu 10 volume de clorură de sodiu 0,15M. 9
Dimensiunea moleculară a polizaharidului derivatizat, cantitatea de polizaharid și conținutul de O-acetil se măsoară prin aceleași metode utilizate pentru polizaharidul 11 depolimerizat. Conținutul de hidrazidă se măsoară prin metoda cu acid 2,4,6-trinitrobenzensulfonic a lui Snyder, S. L. și a lui Sobocinski, P. Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, 13 pag. 282-288. Integritatea structurală a polizaharidului derivatizat se determină prin RMN 1H și RMN 13C. Puritatea polizaharidului derivatizat se determină prin măsurarea nivelului de 15 hidrazidă nelegată, conținutul de LAL (endotoxină) și conținutul de cianborohidrură reziduală.
Exemplul 4. Obținerea proteinei purtătoare 17
Obținerea proteinei brute de toxoid difteric
Se reconstituie culturile de însămânțare liofilizate și se pun la incubator timp de 16 19 până la 18 h. Se transferă un alicot de cultură într-un balon de 0,5 I conținând mediu de cultură și se incubează balonul la o temperatură de 34,5 până la 36,5°C pe un agitator rotativ, 21 timp de 7 până la 9 h. Un alicot din balonul cu cultură se transferă într-un balon de 4 I conținând mediu de cultură și se incubează apoi balonul la o temperatură de 34,5 până la 23
36,5’C pe un agitator rotativ, timp de 14 până la 22 h. Culturile din balonul de 41 se utilizează pentru a inocula un vas de fermentație conținând mediu de cultură. Vasul de fermentație se 25 incubează la o temperatură de 34,5 până la 36,5°C timp de 70 până la 144 h. Conținutul vasului de fermentație se filtrează prin filtre de adâncime într-un vas de colectare. Se adaugă 27 la produsul rezultat un alicot de soluție de formaldehidă 37%, realizând o concentrație de 0,2%. Se aduce pH-ul la 7,4 până la 7,6. Produsul recoltat se filtrează printr-un cartuș de 29 filtrare de 0,2 μ în sticle sterile de 201. Se incubează sticlele la o temperatură de 34,5 până la 36,5’C, timp de 7 zile. Se adaugă un alicot de soluție de formaldehidă 37% la fiecare din 31 sticlele de 20 I, obținându-se o concentrație de 0,4%. Se aduce pH-ul amestecurilor la 7,4 până la 7,6. Se incubează sticlele la o temperatură de 34,5 până la 36,5’C, timp de 7 zile, 33 pe un agitator. Se adaugă la fiecare din sticlele de 201 un alicot de soluție de formaldehidă 37%, realizând o concentrație de 0,5%. Se aduce pH-ul amestecului la 7,4 până la 7,6. 35
Sticlele se incubează la o temperatură de 34,5 până ia 36,5’C, timp de 8 săptămâni. Se testează pentru detoxificare toxoidul brut. Sticlele se păstrează la o temperatură de 1 până 37 la 5’C pe durata perioadei de probă.
Purificarea toxoidului difteric brut 39
Toxoidul brut se lasă la încălzit la temperatura camerei, iar conținutul sticlelor de 201 se combină într-un rezervor de purificare. pH-ul toxoidului se aduce la 7,2 până la 7,4 și se 41 adaugă cărbune la toxoidul brut, amestecându-se timp de 2 min. Amestecul toxoid cărbune se lasă în repaus timp de 1 h, apoi se filtrează printr-o cartuș de filtrare de adâncime într-un 43 al doilea rezervor de purificare. Se adaugă în filtrat sulfat de amoniu solid, obținându-se o saturație de 70%. Se aduce pH-ul la 6,8 până la 7,2 și se lasă în repaus soluția timp de 16 45
h. Proteina precipitată se colectează prin filtrare și se spală cu soluție saturată de sulfat de amoniu 70%, pH-ul 7,0. Se dizolvă precipitatul în apă distilată sterilă, iar soluția proteică se 47 filtrează într-un vas colector de oțel inoxidabil. Se aduce pH-ul la 6,8 până la 7,2 și se adaugă
RO 122761 Β1 sulfat de amoniu până la o saturație de 40%. Se aduce pH-ul soluției la 7,0 până la 7,2 și se lasă în repaus soluția timp de 16 h. Se îndepărtează precipitatul prin filtrare și se lasă deoparte. Se adaugă filtratului sulfat de amoniu până la o saturație de 60% și se aduce pH-ul la 7,0 până la 7,2. Amestecul se lasă în repaus timp de 16 h, iar precipitatul proteic se colectează prin filtrare. Se dizolvă precipitatul în apă distilată sterilă, se filtrează pentru a îndepărta proteina nedizolvată și se diafiltrează în raport cu ser fizilologic 0,85%.
Concentrarea și filtrarea sterilă a toxoidului difteric purificat
Se concentrează soluția proteică la 15 g pe litru și se diafiltrează în raport cu 10 volume de ser fiziologic 0,85%, utilizând un cartuș de filtrare din celuloză regenerată 10.000 MWCO. Soluția proteică concentrată se sterilizează prin filtrarea printr-o membrană de 0,2 μ. Soluția proteică se păstrează la 1 până la 5°C, până la utilizarea ei pentru obținerea conjugatului.
Concentrația proteică se determină prin metoda lui Lowry, O.H. et. al (1951) Journal of Biological Chemistry 193, pag. 265-275. Puritatea proteinei se determină măsurând sterilitatea, conținutul de LAL (endotoxină) și conținutul rezidual de formaldehidă.
Exemplul 5. Obținerea de conjugate monovalente proteină toxoiddifteric-polizaharid de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y
Materialele folosite pentru obținerea acestui preparat sunt reprezentate de polizaharid de Neisseria meningitidis, serogrupurile A, C, W-135 și Y derivatizat cu acid adipic (obținut în conformitate cu exemplul 3), proteină toxoid difteric sterilă (obținută în conformitate cu exemplul 4), EDAC, sulfat de amoniu, acid clorhidric 1N steril, hidroxid de sodiu 1N steril, ser fiziologic steril (0,85%).
Conjugatul polizaharidic al fiecărui serogrup se obține printr-o reacție separată. Toate cele patru conjugate se obțin prin următorul procedeu. Se încarcă un rezervor de oțel inoxidabil cu polizaharid purificat derivatizat cu acid adipid la o concentrație de reacție de 700 până la 1000 pmoli de hidrazidă reactivă pe litru și proteină toxoid difteric purificat la o concentrație de reacție de 3,8 până la 4,0 g de proteină pe litru. Se utilizează ser fiziologic 0,85%, pentru a dilua materiile prime la concentrațiile de reacție dorite și se aduce pH-ul la 5,0±0,1. Se adaugă un alicot de EDAC la amestecul proteină-polizaharid, obținându-se o concentrație de reacție de 2,28 până la 2,4 g pe litru. Se menține pH-un reacției la 5,0+0,1, timp de 2 h, la o temperatură de 15 până la 30’C. După 2 h, se aduce pH-ul la 7,0±0,1, utilizând hidroxid de sodiu 1N steril și se păstrează reacția la 1 până la 5°C, timp de 16 până la 20 h.
Se lasă să se încălzească amestecul de reacție la o temperatură de 15 până la 30“C, iar vasul de reacție se conectează la o unitate de ultrafiltrare prevăzută cu cartuș de celuloză regenerată 30.000 MWCO. Se adaugă sulfat de amoniu solid până la o saturație de 60% (pentru serogrupurile A, W-135 și Y) și până la o saturație de 50% (pentru serogrupul C). Amestecul de reacție al conjugatului se diafiltrează în raport cu 20 de volume cu soluție de sulfat de amoniu 60% saturată (pentru serogrupurile A, W-135 și Y) și cu soluție de sulfat de amoniu 50% saturată (pentru serogrupul C), urmată de diafiItrarea în raport cu 20 de volume de ser fiziologic 0,85%. Conjugatul diafiltrat se filtrează mai întâi printr-o capsulă filtrantă conținând un filtru de 1,2 μ și un filtru de 0,45 μ, urmată apoi de filtrarea printr-o a doua capsulă filtrantă cu un filtru de 0,22 μ.
Cantitatea de polizaharid și conținutul de O-acetil se determină prin aceleași metode utilizate pentru polizaharidul depolimerizatși derivatizat. Cantitatea de proteină se determină prin metoda Lowry. Dimensiunea moleculară a conjugatului se determină prin trecerea printr-o coloană cromatografică de filtrare în gel, comercializată sub denumirea „TSK6000PW, care utilizează ADN ca markeral volumului porilor și ATP ca markeral volumului total, și tiroglobulina
RO 122761 Β1 bovină ca marker de referință. De asemenea, dimensiunea moleculară a conjugatului eluat 1 din coloana TKS6000PW se măsoară prin difuzie a luminii laser multiangulară. Caracterul antigenic al conjugatului se măsoară prin legarea la anticorpi anti-polizaharid cu specificitate 3 de serogrup, utilizând metoda ELISA de tip dublu sandwich. Puritatea conjugatelor se determină prin măsurarea cantității de polizaharid nelegat (neconjugat) prin eluarea dintr-o coloană 5 cromatografică cu interacțiune hidrofobică, prin măsurarea cantității de proteine neconjugate prin electroforeză capilară, a sterilității, a conținutului de LAL (endotoxină), a conținutului de 7 EDAC rezidual și a conținutul de ioni de amoniu reziduali.
Exemplul 6. Formularea de vaccin meningococic polivalent conținând conjugat toxoid 9 difteric-polizaharid A, C, W-135 și Y
Materialele utilizate pentru obținerea acestuia sunt reprezentate de conjugate toxoid 11 difteric-polizaharid aparținând serogrupurilor A, C, W-135 și Y (preparat în conformitate cu exemplul 5), fosfat de sodiu 100mM tamponat în ser fiziologic (0,85% clorură de sodiu) steril. 13 într-un rezervor comun de oțel inoxidabil, la serul fiziologic (0,85%) se adaugă un alicot de ser fiziologic steril tamponat cu fosfat de sodiu 100-500 mM, obținându-se, în 15 vaccinul final o concentrație de fosfat de sodiu de 10 mM. Se adaugă în rezervorul comun, conținând o soluție sterilă de fostat de sodiu 10 mM în ser fiziologic, un alicot din fiecare din 17 două până la patru conjugate polizaharid meningococic monovalent-toxoid difteric sterile, obținându-se o concentrație finală de 8 pg pe mililitru de tampon, din fiecare serogrup de 19 polizaharid. Se amestecă conjugatul tetravalent formulat și se filtrează printr-un filtru de 0,2 pm într-un al doilea rezervor de volum. 21
Cantitatea din fiecare polizaharid de serogrup prezent în formularea polivalentă se determină prin analizarea componentei zaharidice, utilizând cromatografia cu schimb de 23 anioni la pH înalt cu detecție amperometrică pulsatilă. Cantitatea de proteină se măsoară prin metoda Lowry. pH-ul vaccinului se măsoară utilizând o combinație de electrozi conectați 25 la un pHmetru. Caracterul antigenic al vaccinului polivalent conjugat se determină prin legarea la anticorpi antipolizaharidici cu specificitate de serogrup, utilizând o metodă ELISA 27 de tip dublu sandwich. Imunogenicitatea vaccinului polivalent conjugat se măsoară prin capacitatea fiecărui conjugat prezent în vaccin de a determina, atât un răspuns imun de tip 29 primar, cât și un răspuns imun de tip booster prin IgG antipolizaharid, la un model animal. Puritatea vaccinului polivalent conjugat se determină prin măsurarea cantității de polizaharid 31 nelegat (neconjugat), utilizând cromatografia cu schimb de anioni la pH înalt cu detecție amperometrică pulsatilă, prin măsurarea sterilității, a conținutului de LAL (endotoxină), a 33 conținului pirogenic și a siguranței generale.
Exemplul 7. Obținerea de conjugat polizaharid meningococic polivalent-proteină 35 toxoid difteric cu adaos de hidroxid de aluminiu
Obținerea de conjugat adsorbit pe hidroxid de aluminiu 37
Materialele utilizate pentru aceasta sunt reprezentate de conjugate toxoid difteric-polizaharid aparținând serogrupurilor A, C, W-135 și Y, obținerea acestora fiind descrisă 39 în exemplul 5, ser fiziologic steril (clorură de sodiu 0,85%), hidroxid de aluminiu steril în ser fiziologic (clorură de sodiu 0,85%). 41
Se adaugă un alicot din fiecare din conjugatele polizaharid meningococic monovalent-toxoid difteric în rezervorul comun conținând ser fiziologic, obținându-se o concen- 43 trație finală de 8 pg polizaharid din fiecare serogrup, pe mililitru de tampon. Se adaugă un alicot de hidroxid de aluminiu steril în soluție de ser fiziologic (clorură de sodiu 0,85%) la 45 vaccinul polivalent conjugat, obținându-se o concentrație finală de 0,44 mg de ioni de aluminiu pe mililitru de vaccin. 47
RO 122761 Β1
Exemplul 8. Obținerea conjugatului cu adaos de fosfat de aluminiu
Materialele utilizate în acest exemplu sunt reprezentate de conjugate toxoid difteric-polizaharid aparținând serogrupurilor A, C, W-135 și Y, obținerea acestora fiind descrisă în exemplul 5, ser fiziologic steril (clorură de sodiu 0,85%) și fosfat de aluminiu steril în soluție de ser fiziologic (clorură de sodiu 0,85%).
Se adaugă un alicot din fiecare din conjugatele polizaharid meningococic monovalent-toxoid difteric în rezervorul comun conținând ser fiziologic, obținându-se o concentrație finală de 8 pg polizaharid din fiecare serogrup, pe mililitru de tampon. Se adaugă un alicot de fosfat de aluminiu steril în soluție de ser fiziologic (clorură de sodiu 0,85%) la vaccinul polivalent conjugat, obținându-se o concentrație finală de 0,44 mg de ioni de aluminiu pe mililitru de vaccin.
Exemplul 9. Imunogenicitatea vaccinului conjugat tetravalent
S-a studiat capacitatea vaccinului conjugat tetravalent de a determina un răspuns imun la animalele mici de laborator înainte de evaluarea acestuia în clinică. Pentru studiul imunogenicității vaccinurilor conjugate comparativ cu vaccinurile polizaharidice s-au utilizat șoareci, șobolani și iepuri. Se folosesc aceste modele animale, deoarece au capacitatea de a răspunde diferit la vaccinul conjugat față de cel polizaharidic corespunzător, prin tipul de răspuns imun. Vaccinul conjugat determină un răspuns imun de tip T-dependent la aceste modele, în timp ce vaccinul polizaharidic determină un răspuns imun de tip T-independent. în studiile de imunogenicitate efectuate pe șoareci, conjugatul se diluează cu ser fiziologic (clorură de sodiu 0,85%), administrându-se 1/4 până la 1/16 din doza utilizată la om. La șoareci se administrează una sau două doze de vaccin, fie conjugat, fie polizaharidic, iar probele de sânge se prelevează la două săptămâni după vaccinare. Un grup de șoareci este folosit ca grup martor neimunizat. Anticorpii la fiecare serogrup de polizaharid se măsoară prin metoda ELISA. Probele de ser se incubează cu exces din fiecare polizaharid capsular legat pe godeurile unei plăcuțe pentru ELISA. Se utilizează albumina serică umană metilată pentru legarea polizaharidului din fiecare serogrup pe godeu. După incubare, godeurile se spală cu tampon și se adaugă un conjugat anticorp-enzimă secundar, la complexul anticorp-polizaharid, care se leagă de anticorpul antipolizaharid meningococic. Se spală plăcuța cu godeuri și se adaugă un substrat chimic conjugatului polizaharid meningococic-anticorpi-anticorpi secundari-enzimă. Enzima hidrolizează o porțiune din substratul chimic, având ca rezultat apariția culorii. Intensitatea culorii este proporțională cu cantitatea de conjugat polizaharid meningococic-anticorpi-anticorpi secundari-enzimă legat de godeu. Eficacitatea vaccinului se determină prin comparație cu un antiserde referință pentru fiecare serogrup, care este determinat în aceeași plăcuță cu godeuri printr-un calcul paralel, utilizând patru parametri. Antiserul de șoarece martor se obține de la aceeași linie de șoareci, care au fost imunizați individual cu trei doze de vaccin conjugat din fiecare serogrup. Antiserurilor martor de șoarece le corespund titruri bazate pe inversarea diluției, astfel încât densitatea optică să fie 1.
în tabelul 1 este prezentat un sumar al titrurilorde IgG anti-polizaharid pentru fiecare serogrup, obținute la șoarecii Swiss-Webster care au fost vaccinați cu două doze, fie de vaccin tetravalent conjugat, atât formularea lichidă cât și formularea cu hidroxid de aluminiu, fie de vaccin tetravalent polizaharidic, corespondent. Titrurile de IgG se măsoară pe serurile reunite de la un grup de zece șoareci. Pentru determinarea răspunsului imun la fiecare formulare de vaccin, s-au folosit două seturi de câte zece șoareci. Ambele seturi au fost vaccinate în ziua 1. în ziua 15 (la două săptămâni după vaccinare) s-au recoltat probe de sânge de la un set de 10 șoareci și s-a vaccinat a doua serie de zece șoareci cu a doua doză de vaccin, în ziua 15. Două săptămâni mai târziu, în ziua 29, se prelevează probe de
RO 122761 Β1 sânge de la a doua serie de 10 șoareci și de la grupul martor, neimunizat. Toți anticorpii se 1 titrează în același timp, adică în ziua 15 și în ziua 29; probele de sânge se analizează în același timp, împreună cu grupul martor neimunizat și cu serurile de șoarece de referință. 3
Tabelul 1
Măsurarea titrurilor de IgG anti-polizaharid pe seruri reunite de la șoarecii Swiss-Webster, vaccinați fie cu conjugat tetravalent, fie cu polizaharid
Grup vaccinat Doză pg PS Anti-Men A Anti-Men C Anti-Men W135 Anti-Men Y
Z15 Z29 Z15 Z29 Z15 Z29 Z15 Z29
Conjugat (fără adjuvant) 0.25 131 2640 250 1510 1350 6100 5660 4830
Conjugat (fără adjuvant) 0,50 171 6220 416 2050 849 26000 5980 112000
Conjugat (fără adjuvant) 1,0 249 4500 525 2740 1450 16600 11300 59100
Conjugat (cu hidroxid de Al) 0,25 2920 4500 1010 2980 2300 33700 11600 124000
Conjugat (cu hidroxid de Al) 0,50 5800 9550 2280 1010 4810 71900 26400 330000
Conjugat (cu hidroxid de Al) 1,0 6210 9350 2630 12800 7870 94000 32700 302000
Polizaharid (fără adjuvant) 1,0 136 173 184 205 612 608 4470 3910
Neimunizat n.a. - 110 - 145 - 623 - 777
Vaccinul tetravalent conjugat, cu adaos sau fără adaos de hidroxid de aluminiu, poate 27 determina un răspuns imun puternic prin IgG anti-polizaharid, la această specie de șoareci. Adaosul de hidroxid de aluminiu servește la îmbunătățirea atât a răspunsului imun primar, 29 cât și a răspunsului de tip booster, la fiecare din cele patru serogrupuri de polizaharid conjugat. Vaccinul tetravalent polizaharidic determină un răspuns imun neglijabil la sero- 31 grupurile A, C și W-135, la această specie de șoarece comparativ cu grupul martor, neimunizat, spre deosebire de serogrupul Y, la care se obține un răspuns imun semnificativ, dar 33 nu determină un răspuns de tip booster. La acest model experimental, vaccinul tetravalent polizaharidic nu determină un răspuns booster la toate 4 serogrupurile de polizaharide. 35
Acest model experimental poate evidenția ușor diferența dintre vaccinul polizaharidic și vaccinul conjugat, atât prin amplitudinea răspunsului imun, cât și prin tipul de răspuns 37 booster, la fiecare dintre serogrupurile vaccinurilor conjugat.
Forma fără adjuvanți a vaccinului tetravalent conjugat s-a studiat în clinică în ceea 39 ce privește siguranța și imunogenicitatea la adulții tineri sănătoși și la copii tineri sănătoși, în cadrul studiului pentru adulți, subiecții se vaccinează cu o singură doză de vaccin, 41 conținând 4 pg din fiecare din cele patru conjugate ca și plizaharid. Se prelevează probe de sânge imediat înainte de vaccinare și la 28 de zile după vaccinare. Anticorpii sintetizați 43 împotriva fiecărui conjugat de serogrup se determină prin metoda ELISA, cuantificând cantitatea de IgG anti-polizaharid. Metoda ELISA este foarte asemănătoare metodei utilizate 45 pentru determinarea cantitativă a anticorpilor IgG prezenți în serurile de șoarece.
RO 122761 Β1
Pe scurt, probele de sânge se incubează în godeuri de microtitrare tip ELISA, acoperite cu exces de polizaharid meningococic, legat prin intermediul albuminelor serice umane metilate. Cantitatea de anticorp legat s-a determinat printr-o reacție cu peroxidază marcată a anticorpului monoclonal de șoarece specific IgG antiuman. O reacție ulterioară, utilizând peroxidaza ca substrat, generează un produs cromogenic, care poate fi măsurat spectrofotometric. Densitatea optică a substanței cromofore se corelează cu cantitatea de anticorpi IgG din ser, legată de polizaharidul meningococic de pe plăcuța cu godeuri. Cantitatea de anticorpi se calculează în funcție de valorile cunoscute ale unui ser uman de referință (CDC 1922), utilizând o metodă logistică (cu o curbă de patru parametri). în plus, se determină capacitatea anticorpilor de a liza bacteriile în funcție de serogrup. Probele de ser se inactivează mai întâi termic, pentru a distruge complementul. Se realizează o diluție binară a probelor de ser într-o plăcuță cu 96 de godeuri. Se adaugă la diluțiile de ser bacteriile cu specificitate de serogrup împreună cu complementul de pui de iepure și se lasă la incubat. După perioada de incubare, amestecul ser-complement-bacterie se acoperă cu un strat de mediu cu agar. Se lasă la întărit stratul de agar, apoi se incubează peste noapte la 37°C, într-o atmosferă cu 5% dioxid de carbon. A doua zi, se numără coloniile bacteriene prezente în godeuri. Titrul final se stabilește prin diluția serică reciprocă care a produs o distrugere mai mare de 50%, comparativ cu media godeurilor conținând martor de complement.
în tabelul 2 sunt prezentate concentrațiile medii de IgG antipolizaharidică pentru fiecare serogrup și titrul mediu de anticorpi seric bactericizi (SBA) prezenți în serul de adult, înainte și după vaccinarea cu vaccinul tetravalent conjugat, formulat cu 4 pg de polizaharid pe doză. Răspunsul imun la toate cele patru serogrupuri de conjugat este satisfăcător, ceea ce înseamnă că este comparabil cu răspunsul imun produs de vaccinul polizaharidic autorizat, în ceea ce privește atât răspunsul prin anticorpi IgG, cât și răspunsul prin anticorpi funcțional bactericizi. S-a constatat că vaccinul este sigur pentru această grupă de vârstă, iar profilul protecției este similar cu cel al vaccinului polizaharidic autorizat.
Tabelul 2
Concentrația medie de grup de IgG antipolizaharidică (GMC) și titrurile medii de grup de anticorpi serici bactericizi (GMT) pentru adulți tineri sănătoși vaccinați cu un vaccin conjugat meningococic tetravalent formulat la 4 pg de polizaharid pe doză
Răspuns imun la serogrup Npre/Np0St IgG GMC (pg/ml) [95% CI] SBA GMT [95%CI]
Pre Post Pre Post
A 28/28 3,3 [2,3-4,8] 38,4 [22,2-66,4] 487 [231-1027] 6720 [4666-15428]
C 28/28 0,4 [0,2-0,7] 5,5 [3,0-10,1] 16,4 [7,1-37,7] 1560 [800-4042]
W-135 28/28 0,6 [0,3-1,0] 5,8 [2,9-11,7] 10,0 [5,9-16,9] 609 [250-1481]
Y 28/28 1,3 [0,7-2,5] 6,8 [3,2-14,6] 19,0 [8,0-41,2] 390 [143-1061]
RO 122761 Β1
La grupurile de vârstă mai mică, copii mai mici de 2 ani, răspunsul imun la vaccinul polizaharidic este slab și s-a estimat că după un an imunitatea este în scădere. Copiilor între 12 și 15 luni li s-a administrat o singură doză de vaccin tetravalent conjugat, formulat cu 4 pg de polizaharid din fiecare serogrup, pe doză și s-a administrat apoi a doua doză de vaccin tetravalent conjugat la două luni după prima doză. Probele de sânge s-au prelevat înainte de prima și de a doua vaccinare și la o lună după a doua vaccinare. Răspunsurile prin anticorpi la conjugatele celor 4 serogrupuri sunt prezentate în tabelul 3. După a doua doză de conjugat tetravalent, s-a studiat, pentru fiecare serogrup, reacția booster pentru anticorpi IgG și pentru anticorpi cu funcție bactericidă. Nivelul de anticorpi IgG apărut în urma utilizării vaccinului conjugat este comparabil cu cel obținut în urma utilizării vaccinului autorizat, polizaharidic, pentru această grupă de vârstă: 3,64 pg/ml (2,96-4,49) anticorpi IgG răspuns la polizaharidul serogrupului C, apărut la 6 săptămâni de la vaccinare; în orice caz, nivelul de anticorpi bactericizi determinați de vaccinul conjugat este mult mai mare decât răspunsul normal determinat de vaccinul polizaharidic autorizat, pentru această grupă de vârstă: un titru SBA de 7,2 (5,0-10,4) la 6 săptămâni de la vaccinare. Cauza discrepanței dintre nivelul de anticorpi IgG și cel de anticorpi bactericizi la populația tânără se crede a rezulta din faptul că polizaharidul determină apariția unei proporții mari de anticorpi cu aviditate mică, la populația tânără. în mod contrar, conjugatul pare să determine o proporție mult mai mare de anticorpi cu aviditate mare. Se consideră că anticorpii cu aviditate mare sunt responsabili de activitatea bactericidă.
Tabelul 3 Concentrația medie de grup de IgG antipolizaharidică (GMC) și titrurile medii de grup de anticorpi serici bactericizi (GMT) pentru copii tineri sănătoși (cu vârste cuprinse între 1 și 2 ani), vaccinați cu 2 doze de vaccin conjugat meningococic tetravalent, formulat la 4 pg de polizaharid pe doză
Răspuns imun la serogrup IgG GMC (pg/ml) [95% CI] SBA GMT [95% CI]
Pre dose 1 Pre dose 2 Post dose 2 Pre dose 1 Pre dose 2 Post dose 2
A 8/8/8 0,2 [0,1-0,4] 2,1 [0,9-4,8] 4,4 [2,1-9,1] 8,7 [1,4-55,1] 1328 [179-9871] 3158 [1857-5371]
C 8/8/8 0,2 [0,0-0,7] 1,0 [0,3-3,1] 1,5 [0,6-3,6] 6,7 [2,0-23,0] 117 [37,7-365] 304 [128-721]
W-135 8/8/8 0,1 [0,1-0,2] 0,6 [0,2-1,9] 1,5 [0,8-3,11 6,2 [2,2-17,2] 22,6 [2,8-185] 430 [172-1076]
Y 8/8/8 0,3 [0,2-0,4] 1,2 [0,5-2,8] 4,5 [2,7-7,61 5,7 [3,7-8,8] 98,7 [20,4-478] 304 [101-920]
Vaccinul tetravalent conjugat, pe lângă capacitatea de a determina un răspuns cu 39 anticorpi înalt funcționali, la populațiile tinere, în comparație cu vaccinul polizaharidic autorizat, poate determina un răspuns anamnestic, demonstrând că protecția exercitată de 41 vaccinul conjugat tetravalent în conformitate cu prezenta invenție este de lungă durată. Pe parcursul dezvoltării vaccinului conjugat tetravalent, studiile au fost inițial orientate spre 43 formularea unui conjugat AC bivalent. Vaccinul oferă o acoperire mai largă, în comparație cu vaccinul monovalent C conjugat, autorizat în prezent, dar nu protejează împotriva bolii 45 cauzate de serogrupurile W135 și Y.
RO 122761 Β1
S-a efectuat un studiu clinic pe copii cu vârsta cuprinsă între 0 și 3 ani, care compară răspunsul imun la vaccinul bivalent AC polizaharidic cu răspunsul la vaccinul bivalent AC conjugat. în acest studiu este inclus și un al treilea grup de copii cu vârsta cuprinsă între 0 și 3 ani, care servește ca grup martor și care a primit un conjugat Haemophilus influenzae, tip b. Toate cele trei grupuri au primit aceleași vaccinuri pediatrice. Grupul care a primit conjugat AC bivalent, a primit trei doze de vaccin conjugat (4 pg de polizaharid pe doză), la vârsta de 6, 10 și 14 săptămâni. Grupul care a primit polizaharid AC bivalent a primit două doze de vaccin bivalent AC polizaharidic (50 pg de polizaharid pe doză), la vârsta de 10 și de 14 săptămâni. Grupul care a primit conjugat Haemophilus influenzae, tip b, a primit trei doze de vaccin conjugat, la vârsta de 6,10 și 14 săptămâni. Probele de sânge se prelevează la vârsta de 6 săptămâni, înainte de vaccinare și la 18 săptămâni, la 4 săptămâni după vaccinare. Când copii au atins vârsta de 11 până la 12 luni, se prelevează probe de sânge, iar copii care au primit fie vaccinul bivalent AC conjugat, fie vaccinul bivalent AC polizaharidic, primesc o doză booster de polizaharid AC. Motivul administrării dozei booster de polizaharid este acela de a evalua dacă subiecții dezvoltă sau nu un răspuns anamnestic.
Rezultatele acestui studiu, atât răspunsul imun primar, cât și răspunsul imun de tip booster la polizaharid, sunt prezentate în tabelul 4 pentru răspunsul cu anticorpi de tip IgG, iar în tabelul 5 pentru răspunsul cu anticorpi SBA. Răspunsul cu anticorpi IgG după primele serii este aproximativ același atât pentru vaccinul polizaharidic, cât și pentru vaccinul conjugat. în orice caz, răspunsul prin anticorpi bactericizi, la subiecții care au primit vaccin conjugat, este mult mai mare decât la subiecții care au primit vaccin polizaharidic. în conformitate cu cele constatate la subiecții în vârstă de un an, vaccinarea copiilor cu vârste cuprinse între 0 și 3 ani, cu vaccinul polizaharidic, determină apariția anticorpilor cu funcție bactericidă foarte scăzută. Anticorpii apăruți la copiii cu vârste între 0 și 3 ani, cărora li s-a administrat vaccin polizaharidic, se pare că sunt anticorpi cu aviditate scăzută, spre deosebire de vaccinul conjugat, care pare să determine apariția de anticorpi cu aviditate mare, justificându-se în felul acesta titrul mult mai mare de anticorpi bactericizi. Nivelul mare de anticorpi competenți determinat de dozele booster de vaccin polizaharidic, la pacienții care au primit vaccin conjugat în prima serie de vaccinare, indică faptul că acești subiecți au fost pregătiți pentru un răspuns prin anticorpi de memorie sau dependent de celulele T. Subiecții care au primit vaccinul polizaharidic în prima serie de vaccinare prezintă un răspuns modest la doza booster de polizaharid, ceea ce indică un răspuns independent de celulele T (T-cell independent).
Tabelul 4 Concentrația medie de grup de IgG antipolizaharidică (GMC) de IgG antipolizaharidice, la copii cu vârste cuprinse între 0 și 3 ani, sintetizați împotriva serogrupurilor A și C, înainte și după primele serii de imunizare (la vârsta de 6, 10 și 14 săptămâni) și înainte și după vaccinarea booster cu polizaharid AC bivalent administrat la vârsta de 11 până la 12 luni
Răspuns imun la grupul vaccinat Vaccinare primară GMC [95% CI] PS Vaccinare booster GMC [95% CI]
N Pre Post N Pre Post
Serogrup A:
Conjugat AC 34 3,4 [2,2-5,4] 5,8 [4,3-8,0] 31 0,2 [0,1-0,3] 7,0 [4,0-12,0]
Polizaharid AC 35 3,0 [1,7-5,3] 5,5 [4,1-7,3] 30 0,9 [0,5-1,4] 3,1 [2,0-4,7]
RO 122761 Β1
Tabelul 4 (continuare)
Răspuns imun la grupul vaccinat Vaccinare primară GMC [95% Cl] PS Vaccinare booster GMC [95% Cl]
N Pre Post N Pre Post
Serogrup A:
Conjugat HIB 36 3,2 [2,2-4,5] 0,6 [0,4-0,8] NA NA NA
Serogrup C:
Conjugat AC 31 1,6 [0,9-2,8] 2,8 [2,0-3,9] 31 0,1 [0,1-0,2] 8,1 [4,5-14,5]
Polizaharid AC 35 2,3 [1,4-3,9] 5,3 [3,8-7,4] 30 0,6 [0,3-1,0] 2,8 [1,7-4,7]
Conjugat HIB 36 2,0 [1,2-3,5] 0,5 [0,3-0,7] NA NA NA
Tabelul 5
Titrul mediu de grup (GMT) al anticorpilor SBA, la copii cu vârste cuprinse între 0 și 3 ani, sintetizați împotriva serogrupuhior A și C, înainte și după primele serii de imunizare (la vârsta de 6, 10 și 14 săptămâni) și înainte și după vaccinarea boostercu polizaharid AC bivalent administrat la vârsta de 11 până la 12 luni
Răspuns imun în grupul vaccinat Vaccinare primară GMC [95% Cl] PS Vaccinare booster GMC [95% Cl]
N Pre Post N Pre Post
Serogroup A:
Conjugat AC 34 11,8 [7,2-19,3] 177 [101-312] 24 10,1 [5,6-18,0] 373 [162-853]
Polizaharid AC 32 14,7 18,5-25,4] 7,0 [4,7-10,5] 26 6,1 [3,9-9,5] 24,1 [11-53]
Conjugat HIB 35 11,2 [6,8-18,3] 6,7 [4,3-10,5] NA NA NA
Serogrup C:
Conjugat AC 34 50,8 [24-107] 189 [128-2783 27 4,6 [3,6-5,6] 287 [96,2-858]
Polizaharid AC 32 62,7 [29-131] 25,4 [14,4-44,6] 26 4,1 [3,9-4,3] 14,4 [7,9-26,1]
Conjugat HIB 36 45,3 [21,9-133] 7,3 [4,7-11,3] NA NA NA
RO 122761 Β1
Pe lângă beneficiile pe care această invenție le oferă pentru îmbunătățirea protecției împotriva bolii meningococice la populația tânără, oferind o protecție mai largă împotriva serogrupurilor A, C, W-135 și Y, vaccinul tetravalent conjugat poate oferi protecție și față de alți patogeni, prin inducerea unui răspuns prin anticorpi sintetizați împotriva proteinei purtătoare. în cazul în care copiilor cu vârste cuprinse între 0 și 3 ani, li s-a administrat vaccin tetravalent conținând conjugat cu toxoid difteric, aceștia au primit în același timp imunizările pediatrice de rutină, care includ și administrarea de toxoid difteric. De aceea, la acești subiecți nu apare nici o îmbunătățire a răspunsului prin anticorpi la toxoid difteric. însă, în cazul în care se administrează conjugat cu toxoid difteric, la subiecți care nu au primit concomitent vaccinuri conținând toxoid difteric, s-a observat un răspuns puternic de tip booster, la toxoid difteric. Acești subiecți au primit o shemă de trei doze de DTP, la vârsta de 2, 3 și 4 luni. în cadrul acestui studiu, subiecții au primit fie o singură doză de vaccin bivalent AC conjugat, fie o singură doză de vaccin bivalent AC polizaharidic, între al doilea și al treilea an de viață. Probele de sânge se recoltează la momentul vaccinării și la 30 de zile după vaccinare. Se folosește toxoid difteric ca și proteină purtătoare pentru obținerea conjugatului bivalent AC.
Răspunsul imun la toxoidul difteric, la cele două grupuri supuse vaccinării, este prezentat în tabelul 6. Conform așteptărilor, polizaharidul nu determină stimularea unui răspuns imun antidifteric, însă s-a observat un răspuns imun puternic antidifteric, la subiecții care au primit conjugat AC. De aceea, vaccinul meningococic conjugat poate oferi un beneficiu în plus, prin stimularea unui răspuns imun față de proteina purtătoare, oferind astfel protecție împotriva bolilor provocate de Corynebacterium diphteriae, în cazul în care se utilizează toxoid difteric ca și proteină purtătoare.
Tabelul 6 Titrul mediu de grup (GMT) al anticorpilor antidifterici, determinat prin ELISA, exprimat în Ul/ml, la copii tineri sănătoși vaccinați, fie cu vaccin AC bivalent conjugat cu toxoid difteric, formulat la 4 pg de polizaharid pe doză, fie cu vaccin polizaharidic AC bivalent, formulat la 50 pg de polizaharid pe doză
Răspuns imun la grupul vaccinat Npr</Np0st Ac. antidifterici (ELISA - lU/ml) [95%CI]
Pre Post
Conjugat AC 104/103 0,047 [0,036-0,060] 21,2 [11,6-38,6]
Polizaharid AC 103/102 0,059 [0,045-0,076] 0,059 [0,045 - 0,077]
Revendicări

Claims (14)

  1. Revendicări
    1. Compoziție imunologică care cuprinde două, trei sau patru conjugate distincte și realizate separat de polizaharidă capsulară-proteină purificată, în care fiecare dintre conjugate cuprinde aproximativ 4 pg de polizaharidă capsulară purificată de N. meningitidis din serogrupul A, C, W-135 sau Y, conjugată printr-un linker de dihidrazida acidului adipic la proteina difterică toxoidă, în care cel puțin un serogrup este W-135 sau Y, și mai mult, în care compoziția imunologică respectivă este capabilă de solicitarea unui răspuns imun la om, la una sau mai multe din polizaharidele menționate.
  2. 2. Compoziție imunologică, conform revendicării 1, care mai cuprinde un adjuvant.
  3. 3. Compoziție imunologică, conform revendicării 2, în care adjuvantul menționat cuprinde un adjuvant de aluminiu.
    RO 122761 Β1
  4. 4. Compoziție imunologică, conform revendicării 3, în care respectivul adjuvant de 1 aluminiu este hidroxid de aluminiu.
  5. 5. Compoziție imunologică, conform revendicării 1, în care compoziția respectivă este 3 formulată ca un lichid steril.
  6. 6. Compoziție imunologică, conform revendicării 1, care mai cuprinde un conservant 5 acceptabil farmaceutic.
  7. 7. Compoziție imunologică, conform revendicării 6, în care conservantul acceptabil 7 farmaceutic respectiv este ales din grupul care constă din alcool benzilic, paraben, timerosal, clor butanol și clorură de benzalconiu. 9
  8. 8. Compoziție imunologică, conform revendicării 1, care cuprinde respectivele patru conjugate distincte și produse separat de polizaharida capsulară - proteină purificată, în care 11 primul conjugat cuprinde aproximativ 4 pg de polizaharida capsulară de N. meningitidis purificată din serogrupul W-135, al doilea conjugat cuprinde aproximativ 4 pg de polizaharida 13 capsulară de N. meningitidis purificată din serogrupul Y, al treilea conjugat cuprinde aproximativ 4 pg de polizaharidă capsulară de N. meningitidis purificată din serogrupul A și 15 al patrulea conjugat cuprinde aproximativ 4 pg de polizaharidă capsulară de N. meningitidis purificată din serogrupul C, și suplimentar în care fiecare din respectivele conjugate distincte 17 și produse separat de polizaharidă capsulară-proteină este capabil să solicite un răspuns imun la un om. 19
  9. 9. Compoziție imunologică, conform revendicării 8, care mai cuprinde un adjuvant.
  10. 10. Compoziție imunologică, conform revendicării 9, în care respectivul adjuvant este 21 un adjuvant de aluminiu.
  11. 11. Compoziție imunologică, conform revendicării 10, în care respectivul adjuvant de 23 aluminiu este hidroxidul de aluminiu.
  12. 12. Compoziție imunologică, conform revendicării 8, în care respectiva compoziție 25 este formulată ca un lichid steril.
  13. 13. Compoziție imunologică, conform revendicării 8, care mai cuprinde un conservant 27 acceptabil farmaceutic.
  14. 14. Compoziție imunologică, conform revendicării 13, în care respectivul conservant 29 acceptabil farmaceutic este ales din grupul care constă din alcool benzilic, paraben, timerosal, clor butanol și clorură de benzalconiu. 31
ROA200300633A 2001-01-23 2002-01-22 Vaccin multivalent antimeningococic conţinând polizaharid-proteină RO122761B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26343501P 2001-01-23 2001-01-23
PCT/US2002/001963 WO2002058737A2 (en) 2001-01-23 2002-01-22 Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO122761B1 true RO122761B1 (ro) 2010-01-29

Family

ID=23001755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ROA200300633A RO122761B1 (ro) 2001-01-23 2002-01-22 Vaccin multivalent antimeningococic conţinând polizaharid-proteină

Country Status (38)

Country Link
US (9) US8722062B2 (ro)
EP (3) EP1355673B1 (ro)
JP (6) JP2005504718A (ro)
KR (2) KR100947751B1 (ro)
CN (1) CN100556459C (ro)
AP (1) AP1897A (ro)
AU (2) AU2007216743A1 (ro)
BE (3) BE2012C050I2 (ro)
BR (1) BRPI0206672B8 (ro)
CA (1) CA2435681C (ro)
CR (1) CR7035A (ro)
CY (2) CY1113072T1 (ro)
DK (2) DK2332581T3 (ro)
EA (1) EA006947B1 (ro)
EC (1) ECSP034701A (ro)
ES (3) ES2892316T3 (ro)
FR (3) FR12C0072I2 (ro)
GE (1) GEP20053691B (ro)
HR (1) HRP20030598B1 (ro)
HU (2) HU230490B1 (ro)
IL (3) IL157060A0 (ro)
IS (1) IS6881A (ro)
LT (1) LT5177B (ro)
LU (1) LU92108I2 (ro)
LV (1) LV13128B (ro)
MX (2) MXPA03006561A (ro)
NO (1) NO20033816L (ro)
NZ (2) NZ602682A (ro)
OA (1) OA12590A (ro)
PL (1) PL226184B1 (ro)
PT (2) PT2332581E (ro)
RO (1) RO122761B1 (ro)
SI (1) SI21352A (ro)
TN (1) TNSN03041A1 (ro)
UA (1) UA92579C2 (ro)
WO (1) WO2002058737A2 (ro)
YU (1) YU66103A (ro)
ZA (1) ZA200306176B (ro)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9928196D0 (en) 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
DK2332581T3 (en) 2001-01-23 2015-10-05 Sanofi Pasteur Inc Tri- or tetravalent meningococcal polysaccharide-crm197 conjugate vaccine
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
AU2014218428B2 (en) * 2001-06-20 2016-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Capsular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
DE60328481D1 (de) * 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
AU2003299501A1 (en) * 2002-05-16 2004-05-04 Aventis Pasteur, Inc. Animal component free meningococcal polysaccharide fermentation and seedbank development
US20040096461A1 (en) * 2002-07-30 2004-05-20 Baxter Healthcare Corporation Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
BR0316271A (pt) * 2002-11-14 2005-10-11 Inst Finlay Ct De Investigacio Método para a obtenção de preparados vacinais conjugados multivalentes, composição vacinal multivalente e uso da mesma
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
CN101926988B (zh) 2003-01-30 2014-06-04 诺华疫苗和诊断有限公司 抗多种脑膜炎球菌血清组的可注射性疫苗
US9296795B2 (en) * 2003-03-07 2016-03-29 Wyeth Holdings, Llc. Polysaccharide-staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
WO2005004909A2 (en) * 2003-05-07 2005-01-20 Aventis Pasteur, Inc. Method of enhanced immunogenicity to meningococcal vaccination
CA2528007C (en) * 2003-06-02 2012-03-27 Chiron Corporation Immunogenic compositions based on microparticles comprising adsorbed toxoid and a polysaccharide-containing antigen
US20070020293A1 (en) * 2003-06-23 2007-01-25 Michon Francis J Vaccines against group neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof
CA2530434A1 (en) * 2003-06-23 2005-01-06 Aventis Pasteur, Inc. Immunization method against neisseria meningitidis serogroups a and c
CA2885040C (en) 2003-10-02 2018-10-30 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
GB0408978D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Meningococcal fermentation for preparing conjugate vaccines
AU2011204789B2 (en) * 2004-04-22 2013-07-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
PL1740217T3 (pl) * 2004-04-30 2012-03-30 Novartis Ag Szczepienie koniugatem meningokokowym
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
AU2005279821A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-09 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine
GB0419846D0 (en) 2004-09-07 2004-10-13 Chiron Srl Vaccine adjuvants for saccharides
JP2008513541A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 サノフィ パストゥール インコーポレイテッド 多価髄膜炎菌誘導体化多糖−タンパク質複合体およびワクチン
GB0428394D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
GB0505518D0 (en) 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
EP1871411A4 (en) 2005-04-18 2010-07-21 Novartis Vaccines & Diagnostic EXPRESSION OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN FOR VACCINE MANUFACTURE
PE20110072A1 (es) 2005-06-27 2011-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
US8007807B2 (en) 2005-09-01 2011-08-30 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Multiple vaccination including serogroup C meningococcus
US20070065462A1 (en) * 2005-09-21 2007-03-22 Ryall Robert P Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine
BRPI0708849B1 (pt) * 2006-03-17 2022-05-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Métodos para a preparação de conjugados imunogênicos multivalentes complexos, os referidos conjugados, e composições farmacêuticas
EP2004225B1 (en) 2006-03-22 2012-04-25 Novartis AG Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
US10828361B2 (en) 2006-03-22 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
GB0605757D0 (en) 2006-03-22 2006-05-03 Chiron Srl Separation of conjugated and unconjugated components
WO2007116409A2 (en) 2006-04-11 2007-10-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Improved vaccines comprising multimeric hsp60 peptide carriers
BRPI0811979A2 (pt) 2007-06-04 2014-10-21 Novartis Ag Formulação para vacinas de meningite
PL2200642T3 (pl) 2007-10-19 2012-09-28 Novartis Ag Preparaty szczepionek meningokokowych
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
CA2747340A1 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
US8003112B2 (en) * 2009-04-16 2011-08-23 Howard University Meningococcal and pneumococcal conjugate vaccine and method of using same
JP5781542B2 (ja) 2009-12-30 2015-09-24 ノバルティス アーゲー Ｅ．ｃｏｌｉキャリアタンパク質に結合体化した多糖免疫原
CN102802662A (zh) 2010-03-18 2012-11-28 诺华有限公司 用于脑膜炎球菌血清组b的含佐剂疫苗
WO2012025873A2 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Wyeth Llc STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
ES2744471T3 (es) * 2010-09-04 2020-02-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Ensayos de anticuerpos bactericidas para evaluar la inmunogenia y la potencia de vacunas de sacárido capsular meningocócico
JP5976652B2 (ja) 2010-09-10 2016-08-24 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体
CA2860331A1 (en) 2010-12-24 2012-06-28 Novartis Ag Compounds
CN103533954B (zh) 2011-03-02 2015-09-09 诺华股份有限公司 含较低剂量的抗原和/或佐剂的联合疫苗
WO2013009564A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Novartis Ag Tyrosine ligation process
CA2854934A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Novartis Ag Carrier molecule comprising a spr0096 and a spr2021 antigen
WO2013132043A1 (en) 2012-03-08 2013-09-12 Novartis Ag Combination vaccines with tlr4 agonists
EP2823312B1 (en) 2012-03-08 2019-08-07 GlaxoSmithKline Biologicals SA In vitro potency assay for protein-based meningococcal vaccines
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EP3485906A1 (en) 2012-03-09 2019-05-22 Pfizer Inc Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN102660602B (zh) * 2012-04-17 2015-03-25 江苏康泰生物医学技术有限公司 快速纯化细菌荚膜多糖的方法
MX2014014067A (es) 2012-05-22 2015-02-04 Novartis Ag Conjugado de serogrupo x de meningococo.
PT3421051T (pt) * 2012-08-16 2020-06-26 Pfizer Processos e composições de glicoconjugação
EP2892553A1 (en) 2012-09-06 2015-07-15 Novartis AG Combination vaccines with serogroup b meningococcus and d/t/p
CN102861326A (zh) * 2012-09-19 2013-01-09 天津康希诺生物技术有限公司 流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法
CA2894260A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Conjugates for protecting against diphtheria and/or tetanus
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
EP2976101B1 (en) * 2013-03-18 2020-08-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Method of treatment
MX2016000393A (es) 2013-07-11 2016-10-26 Novartis Ag Modificaciones de proteinas quimioenzimaticas de lisina utilizando transglutaminasa microbiana.
KR20180099912A (ko) 2013-09-08 2018-09-05 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
EP3148577B1 (en) 2014-05-24 2021-01-20 Biological E Limited Novel semi-synthetic meningococcal conjugate vaccine
US10888611B2 (en) 2015-02-19 2021-01-12 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3258850B1 (en) 2015-02-20 2020-06-24 Bayer HealthCare LLC Contrast imaging agent with dissolved gas-evolving fluid
KR20160011136A (ko) 2015-03-25 2016-01-29 한국기계연구원 내식성이 향상된 마그네슘 합금 및 이를 이용하여 제조한 마그네슘 합금 부재의 제조방법
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
PL3397324T3 (pl) 2015-12-30 2022-10-24 Ascendis Pharma A/S Automatyczny wstrzykiwacz z układem utrzymywania wkładu
KR102204927B1 (ko) 2016-07-25 2021-01-19 에스케이바이오사이언스(주) 피막 다당류-단백질 접합 백신의 품질 평가 방법
US20180064801A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for neisseria gonorrhoeae
AU2017321863A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Sanofi Pasteur, Inc. Neisseria meningitidis vaccine
SG10202111092UA (en) 2017-01-31 2021-11-29 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2019198096A1 (en) * 2018-04-11 2019-10-17 Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt. Ltd. Tetravalent meningococcal vaccine composition and process to prepare thereof
EP3632465A1 (en) 2018-10-03 2020-04-08 Sanofi Pasteur Inc. Combined immunization against meningococcal disease and human papillomavirus
US20220125908A1 (en) * 2019-02-14 2022-04-28 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Honeybee commensal snodgrassella alvi vaccine against pathogenic neisseriaceae
CN110903388B (zh) * 2019-12-03 2024-01-02 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种将脑膜炎球菌抗血清去交叉反应的方法
BR112022011714A2 (pt) 2019-12-17 2022-09-06 9286 3620 Quebec Inc Sistemas de distribuição oral com base em formação in situ de coacervados de proteína/polissacarídeo
KR102610292B1 (ko) 2021-02-10 2023-12-04 에스케이바이오사이언스(주) 스트랩토코커스 뉴모니애 다당류와 운반체 단백질의 접합체 제조 방법
US20220265805A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Sanofi Pasteur Inc. Meningococcal b recombinant vaccine
WO2023200704A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Sanofi Pasteur Inc. Protein-saccharide conjugation with sodium cyanoborohydride
WO2024030931A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Sanofi Pasteur Inc. Adjuvanted immunogenic composition against neisseria meningitidis b

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4351761A (en) 1978-05-15 1982-09-28 Research Corporation Purified antigen to test for Neisseria gonorrhoeae antibodies
US4404371A (en) 1981-01-14 1983-09-13 Battelle Memorial Institute Carboxymethylcellulose with carbonate bridges and preparation thereof
US4351762A (en) * 1981-03-10 1982-09-28 Bioresearch, Inc. Rapid, quantitative peptide synthesis using mixed anhydrides
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4619828A (en) 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
EP0109350B1 (en) 1982-11-10 1991-10-16 Mitsubishi Jukogyo Kabushiki Kaisha Nickel-chromium alloy
US4762713A (en) * 1983-07-05 1988-08-09 The University Of Rochester Boosting of immunogenic conjugate vaccinations by unconjugated bacterial capsular polymers
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
EP0200249B1 (en) 1985-04-17 1988-10-19 Akzo N.V. Method of applying a road marking composition
DE3518706A1 (de) 1985-05-24 1986-11-27 Kernforschungszentrum Karlsruhe Gmbh, 7500 Karlsruhe Verfahren zur herstellung von formkoerpern mit verbesserten, isotropen eigenschaften
US4814276A (en) * 1986-04-25 1989-03-21 Becton, Dickinson And Company Selective medium for growth of neisseria
AU640118B2 (en) 1988-12-19 1993-08-19 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US4963534A (en) * 1989-05-19 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Process for solubilizing polyanoinic bacterial polysaccharides in aprotic solvents
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
JP2631035B2 (ja) 1991-03-12 1997-07-16 アメリカ合衆国 多糖類−タンパク質複合体
SK18594A3 (en) 1991-08-16 1994-08-10 Merck & Co Inc Method of production of capsular polysacharide without lipid and endotoxine
US5314811A (en) * 1992-07-13 1994-05-24 Merck & Co., Inc. Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide
US5422427A (en) * 1991-09-17 1995-06-06 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Health And Human Services Pneumococcal fimbrial protein A
FR2682388B1 (fr) 1991-10-10 1995-06-09 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal.
SK280702B6 (sk) * 1992-05-23 2000-06-12 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Kombinovaný očkovací prostriedok obsahujúci povrch
US5445817A (en) 1992-08-21 1995-08-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines
DK0658118T3 (da) * 1992-08-31 2002-05-06 Baxter Healthcare Sa Vaccine mod Neisseria meningitidis, gruppe C
TR199701547T1 (xx) 1995-06-07 1998-03-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Polisakarit antijen protein e�leni�i i�eren a��.
US5811102A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 National Research Council Of Canada Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
US20020054884A1 (en) * 1995-06-23 2002-05-09 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Vaccine composition comprising a polysaccharide conjugate antigen adsorbed onto aluminium phosphate
PT833662E (pt) 1995-06-23 2001-09-28 Smithkline Beecham Biolog Uma composicao vacinal compreendendo um antigenio polissacaridico conjugado adsorvido a fosfato de aluminio
US6248334B1 (en) * 1997-01-08 2001-06-19 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Process for preparing conjugate vaccines including free protein and the conjugate vaccines, immunogens, and immunogenic reagents produced by this process
KR100593466B1 (ko) 1997-01-21 2007-04-25 파스퇴르 메리오 세룸 에 박신 다당류-펩타이드접합체
CA2278626C (en) 1997-01-24 2010-04-27 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Novel method for the isolation of polysaccharides
US6403306B1 (en) * 1997-04-09 2002-06-11 Emory University Serogroup-specific nucleotide sequences in the molecular typing of bacterial isolates and the preparation of vaccines thereto
WO1998047530A2 (en) 1997-04-24 1998-10-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Coupling of unmodified proteins to haloacyl or dihaloacyl derivatized polysaccharides for the preparation of protein-polysaccharide vaccines
JP4173560B2 (ja) 1997-05-28 2008-10-29 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ アミノ酸源として酵母または大豆抽出物を含み、動物起源のタンパク質複合体を含まない培養培地
WO1998058670A1 (en) * 1997-06-24 1998-12-30 Chiron Corporation Methods of immunizing adults using anti-meningococcal vaccine compositions
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
DK1051506T4 (da) 1997-12-23 2019-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Fremgangsmåder til ekstraktion og isolering af bakterielle kapselpolysaccharider til anvendelse som vacciner eller bundet til proteiner som konjugatvacciner
US7018637B2 (en) * 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
US6146902A (en) * 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
ES2347428T3 (es) 1999-02-01 2010-10-29 EISAI R&amp;D MANAGEMENT CO., LTD. Compuestos coadyuvantes inmunologicos.
AR022963A1 (es) 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Biolog Vacuna
DK2270172T3 (en) 1999-05-19 2016-02-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination Compositions of Neisseria.
GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB9925559D0 (en) 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
DE60039450D1 (de) 1999-12-02 2008-08-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Zusammensetzungen und methoden zur stabilisierung von biologischen molekülen nach lyophilisierung
US6800455B2 (en) * 2000-03-31 2004-10-05 Scios Inc. Secreted factors
HU227893B1 (en) 2000-06-29 2012-05-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine compositions
DK2332581T3 (en) * 2001-01-23 2015-10-05 Sanofi Pasteur Inc Tri- or tetravalent meningococcal polysaccharide-crm197 conjugate vaccine
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination

Also Published As

Publication number Publication date
BE2015C077I2 (ro) 2021-02-04
US9844601B2 (en) 2017-12-19
FR12C0072I2 (fr) 2013-11-01
IS6881A (is) 2003-07-22
CY2012030I2 (el) 2016-08-31
HUP0302999A2 (hu) 2003-12-29
IL225522A (en) 2016-04-21
LU92108I9 (ro) 2019-01-15
FR15C0094I2 (fr) 2017-05-19
EP2957300A3 (en) 2016-03-30
SI21352A (sl) 2004-06-30
US8734813B2 (en) 2014-05-27
NO20033816L (no) 2003-09-11
EP2957300B1 (en) 2021-07-14
US8741314B2 (en) 2014-06-03
LT5177B (lt) 2004-11-25
BE2022C502I2 (ro) 2023-04-12
IL157060A0 (en) 2004-02-08
HRP20030598A2 (en) 2005-06-30
WO2002058737A3 (en) 2003-05-22
UA92579C2 (ru) 2010-11-25
HUS1600040I1 (hu) 2019-05-28
JP5795721B2 (ja) 2015-10-14
ES2892316T3 (es) 2022-02-03
PL226184B1 (pl) 2017-06-30
LT2003071A (en) 2004-08-25
CR7035A (es) 2008-11-25
US10143757B2 (en) 2018-12-04
HU230490B1 (hu) 2016-08-29
IL225522A0 (en) 2013-06-27
PT2332581E (pt) 2015-10-16
US20030068336A1 (en) 2003-04-10
DK1355673T3 (da) 2012-09-17
IL157060A (en) 2013-04-30
PT1355673E (pt) 2012-08-31
JP2011140522A (ja) 2011-07-21
US20130216571A1 (en) 2013-08-22
FR15C0094I1 (ro) 2016-01-22
AU2007216743A1 (en) 2007-10-04
BRPI0206672B1 (pt) 2018-11-06
JP2014043475A (ja) 2014-03-13
HUP0302999A3 (en) 2011-05-30
CN100556459C (zh) 2009-11-04
NO20033816D0 (no) 2003-08-27
JP2014065745A (ja) 2014-04-17
YU66103A (sh) 2006-05-25
FR22C1001I1 (fr) 2022-02-18
CA2435681A1 (en) 2002-08-01
WO2002058737A2 (en) 2002-08-01
EP2332581A1 (en) 2011-06-15
ES2544979T3 (es) 2015-09-07
KR100947751B1 (ko) 2010-03-18
BRPI0206672B8 (pt) 2021-05-25
MX341760B (es) 2016-09-02
DK2332581T3 (en) 2015-10-05
US8999354B2 (en) 2015-04-07
US10617766B2 (en) 2020-04-14
GEP20053691B (en) 2005-12-12
EP1355673B1 (en) 2012-05-30
KR20030084913A (ko) 2003-11-01
BE2012C050I2 (ro) 2021-03-23
EP2957300A2 (en) 2015-12-23
JP2016128526A (ja) 2016-07-14
NZ622900A (en) 2015-11-27
PL373710A1 (en) 2005-09-05
EA200300827A1 (ru) 2004-06-24
US20150174259A1 (en) 2015-06-25
AP1897A (en) 2008-10-10
EP1355673A2 (en) 2003-10-29
US20130224241A1 (en) 2013-08-29
BR0206672A (pt) 2005-05-10
CN1610560A (zh) 2005-04-27
CY1113072T1 (el) 2015-08-05
LV13128B (en) 2004-07-20
US20190060475A1 (en) 2019-02-28
EA006947B1 (ru) 2006-06-30
US20130177588A1 (en) 2013-07-11
US20180154010A1 (en) 2018-06-07
LU92108I2 (fr) 2013-01-29
ZA200306176B (en) 2005-03-30
US8722062B2 (en) 2014-05-13
HRP20030598B1 (hr) 2013-05-31
NZ602682A (en) 2014-05-30
US20140308311A1 (en) 2014-10-16
FR12C0072I1 (ro) 2013-01-04
EP2332581B1 (en) 2015-07-01
OA12590A (en) 2006-06-08
KR20090029857A (ko) 2009-03-23
CY2012030I1 (el) 2015-08-05
ES2388848T3 (es) 2012-10-19
CA2435681C (en) 2011-06-21
US20160000928A1 (en) 2016-01-07
KR100947757B1 (ko) 2010-03-18
JP2014043474A (ja) 2014-03-13
MXPA03006561A (es) 2004-10-15
AP2003002829A0 (en) 2003-09-30
TNSN03041A1 (en) 2005-12-23
JP2005504718A (ja) 2005-02-17
US9173955B2 (en) 2015-11-03
ECSP034701A (es) 2003-10-28
AU2010219288A1 (en) 2010-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10617766B2 (en) Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
AU2014201676B2 (en) Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
AU2002241951A1 (en) Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine