PT1355673E - Vacina meningocócica multivalente preparada com um conjugado de polissacárido e proteína - Google Patents

Vacina meningocócica multivalente preparada com um conjugado de polissacárido e proteína Download PDF

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Description

ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Vacina meningocócica multivalente preparada com um conjugado de polissacárido e proteína"
Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório U.S. No. 60/263435, requerido a 23 de janeiro de 2001.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Campo do Invento O presente invento refere-se ao campo da medicina em geral, e mais especificamente, à microbiologia, imunologia, vacinas e prevenção da infeção por um patogénico bacteriano por imunização.
Sumário da Arte Relacionada A Neisseria meningitidis é uma causa principal de meningite bacteriana e sépsis por todo o mundo. A incidência de doença meningocócica endémica durante os últimos trinta anos alcança de 1 a 5 por 100000 no mundo desenvolvido, e de 10 a 25 por 100000 nos países em desenvolvimento (Reido, F.X., et. al. 1995). Durante as epidemias, a incidência de doença meningocócica aproxima-se de 1000 por 1000000. Há aproximadamente 2600 casos de meningite bacteriana por ano nos Estados Unidos e em média 330000 casos nos países em desenvolvimento. A taxa de mortes alcança entre 10 e 20%.
Os meningococos patogénicos são envolvidos por uma cápsula de polissacárido que está ligada à superfície externa da membrana do organismo. Foram identificados treze serogrupos diferentes de meningococos com base na especificidade imunológica do polissacárido capsular (Frasch, C.E., et. al. 1985). Destes treze serogrupos, cinco causam a maioria das doenças meningocócicas; estes incluem os serogrupos A, B, C, W-135 e Y. O serogrupo A é responsável pela maioria das doenças epidémicas. Os serogrupos B, C e Y causam a maioria das doenças endémicas e surtos localizados. 2 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ A mucosa naso-orofaríngea humana é o único reservatório natural conhecido de Neisseria meningitidis. A colonização ocorre quer na superfície exterior das células da mucosa quer no tecido sub-epitelial da nasofaringe. 0 transporte de meningococos pode durar meses. A disseminação de meningococos ocorre por contacto direto ou através de gotículas de ar. Os meningococos tornam-se invasivos por passagem através do epitélio da mucosa através de vacúolos fagocíticos como resultado de endocitose. A defesa do hospedeiro para os meningococos invasivos é dependente da bacteriólise mediada por complemento. Os anticorpos do soro que são responsáveis pela bacteriólise mediada por complemento são dirigidos em grande parte contra o polissacárido capsular exterior.
As vacinas à base de polissacáridos meningocócicos têm sido descritas induzirem uma resposta imune contra o polissacárido capsular. Estes anticorpos são capazes de bacteriólise mediada por complemento dos meningococos específicos de serogrupo. As vacinas de polissacáridos meningocócicos mostraram ser eficazes em crianças e adultos (Peltola, H., et. al. 1977 e Artenstein, M.S., et. ai. 1970), mas a eficácia foi limitada em bebés e crianças pequenas (Reingold, A.L., et. ai. 1985). Doses subsequentes do polissacárido em populações mais novas induziram uma resposta fraca ou nenhuma resposta de reforço (Goldschneider, I., et. al. 1973 e Gold, R., et. al. 1977) . A duração da proteção induzida pelas vacinas meningocócicas de polissacárido não é de longa termo e tem sido calculada estar entre 3 a 5 anos nos adultos e crianças acima dos quatro anos de idade (Brandt, B., et. al. 1975, Káyhty, H., et. al. 1980 e Ceesay, S. J., et. al. 1993) . Nas crianças de um a quatro anos de idade a duração da proteção é inferior a três anos (Reingold, A.L., et. al. 1985).
Os polissacáridos são incapazes de se ligarem às principais moléculas do complexo de histocompatibilidade, um pré-requisito para apresentação de antigénio e estimulação de linfócitos T auxiliares, i.e., são antigénios independentes de células T. Os polissacáridos são capazes de estimular os linfócitos B para a produção de anticorpos sem o auxílio de linfócitos T auxiliares. Em resultado da estimulação independente de T dos linfócitos B, há uma ausência de 3 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ indução por memória após imunização por estes antigénios. Os antigénios de polissacárido são capazes de induzir respostas independentes de T muito eficazes em adultos, no entanto, estas respostas independentes de T são fracas no sistema imune imaturo de bebés e crianças pequenas.
Os antigénios de polissacárido independente de T podem ser convertidos em antigénios dependentes de T por ligação covalente dos polissacáridos às moléculas de proteína ("veículos" ou "proteínas de veículo"). As células B que se ligam ao componente de polissacárido da vacina de conjugado podem ser ativadas por células T auxiliares específicas de péptidos que são uma parte da proteína de transporte conjugada. A resposta dos auxiliares T à proteína de veículo serve para aumentar a produção de anticorpos para o polissacárido. 0 polissacárido do serogrupo B tem mostrado ser fracamente ou não imunogénico na população humana (Wyle, F.A., et. al. 1972) . A ligação química do polissacárido deste serogrupo a proteínas não alterou significativamente a resposta imune em animais de laboratório (Jennings, H. J., et. al. 1981) . Pensa-se que a razão para a ausência de resposta imune do polissacárido deste serogrupo surge das similaridades estruturais entre o polissacárido do serogrupo B e as glicoproteínas hospedeiras polissialiladas, tais como as moléculas de adesão a células neuronais.
Tem sido descrita uma vacina meningocócica de conjugado à base de polissacárido do serogrupo C. Esta vacina monovalente induz uma forte resposta de anticorpos funcionais para o polissacárido capsular presente nas estirpes de N. meningitidis correspondente ao serogrupo C. Uma tal vacina é apenas capaz de proteger contra a doença causada pelas bactérias do serogrupo C.
As vacinas existentes à base de polissacárido meningocócico são de utilização limitada em crianças pequenas e não proporcionam uma proteção a longo termo em adultos. A única vacina meningocócica que tem mostrado ser capaz de induzir proteção a longo termo em todos os grupos, incluindo crianças, em risco de infeção meningocócica é à base de um polissacárido de um único serogrupo de N. meningitidis e não 4 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ proporciona qualquer proteção contra a infeção por outros serogrupos. Assim, existe a necessidade para uma vacina meningocócica de conjugado capaz de conferir proteção ampla, de longa duração, contra a doença meningocócica em crianças e adultos em risco de infeção meningocócica. Os polissacáridos meningocócicos multivalentes do presente invento resolvem esta necessidade proporcionando formulações de vacina nas quais os polissacáridos imunogénicos dos principais serogrupos imunogénicos de N. meningitidis são convertidos nos antigénios dependentes de T através de conjugações a proteínas de transporte.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona uma vacina meningocócica multivalente compreendida por quantidades imunologicamente eficazes de quatro conjugados de proteína-polissacárido distintos para utilização na proteção de um humano contra a infeção por N. meningitidis, caracterizada por cada um dos conjugados conter um polissacárido capsular diferente conjugado com uma proteína de transporte, e em que os polissacáridos capsulares são preparados a partir dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis, em que adicionalmente a proteína de transporte é ou toxóide da difteria ou CRM197. Adicionalmente, o presente invento proporciona um processo para produção de uma vacina destinada à utilização na proteção de um humano contra a infeção por N. meningitidis, caracterizado por utilizar: (i) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo A de N. meningitidis; (ii) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo C de N. meningitidis; (iii) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo W-135 de N. meningitidis; e (iv) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo Y de N. meningitidis em que o referido processo compreende a preparação separada dos referidos conjugados e a combinação dos referidos conjugados numa mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado, em que a proteína de transporte é ou toxóide da difteria ou CRM197. 5 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ São também aqui descritas composições imunológicas compreendendo dois ou mais conjugados de proteína-polissacárido, em que cada um dos conjugados compreende um polissacárido capsular de N. meningitidis conjugado com uma proteína de transporte. São adicionalmente aqui descritas composições imunológicas compreendendo dois ou mais conjugados de proteína-polissacárido distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacárido capsular de um serogrupo diferente de N. meningitidis conjugado com uma proteína de transporte. 0 presente invento proporciona vacinas para conjugados meningocócicos de polissacárido-proteína causados pelo agente patogénico Neisseria meningitidis. 0 presente invento proporciona vacinas meningocócicas mutivalentes compreendidas por quantidades imunologicamente eficazes de quarto conjugados de proteína-polissacárido distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacárido capsular diferente conjugado com uma proteína de transporte, e em que cada polissacárido capsular é selecionado a partir do grupo constituído por polissacáridos capsulares dos serogrupos A, C, W-135 e Y, em que a proteína de transporte é ou toxóide da difteria ou CRM197. São aqui descritos processos de produção de uma composição meningocócica multivalente de polissacárido-proteína compreendendo a purificação de dois ou mais polissacáridos capsulares de Neisseria meningitidis patogénica; a conjugação dos polissacáridos purificados com uma ou mais proteínas de transporte e a combinação dos conjugados para preparar a composição meningocócica multivalente de polissacárido-proteína.
Uma vacina meningocócica de conjugado de polissacárido A + C e toxóide da difteria (MenD) é descrita por Campagne G. et al. (Pediatric Infectious Disease Journal (2000): 19, 144-150). MenD mostrou ser segura entre bebés do Níger e a imunização conduziu a uma atividade de anticorpo funcional significativamente maior do que com a correspondente vacina de polissacárido. 6 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Lei Q.P. et al. (Developments in biologicals (2000): 103, 259-264) descrevem uma vacina de conjugado tetravalente compreendendo polissacáridos preparados a partir dos serotipos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis individualmente conjugados com toxóide da difteria. Eles descrevem um método de precipitação que utiliza desoxicolato/HCl que separa eficazmente o polissacárido livre e ligado na vacina de conjugado tetravalente.
Lamb D.H. et al. (Developments in biologicals (2000): 103, 251-258) descrevem a análise electroforética capilar da referida vacina meningocócica de conjugado de polissacárido-toxóide da difteria descrita por Lei Q.P. et al..
Perkins B.A. (Journal of the American Medicai Association (2000): 283, 2842-2843) descreve as vacinas meningocócicas de polissacáridos disponíveis assim como vacinas meningocócicas de conjugado em desenvolvimento e que necessitam de ser desenvolvidas, entre elas uma vacina de conjugado de A, C, W-135 e Y. É aqui descrito um processo para indução de uma resposta imunológica a polissacárido capsular de N. meningitidis que compreende a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica do invento a um humano ou animal. É aqui descrito um processo de proteção de um humano ou animal suscetível a infeção por N. meningitidis que compreende a administração de uma dose imunologicamente eficaz da vacina do invento ao humano ou animal.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO É aqui descrita uma composição imunológica de dois ou mais conjugados de proteína-polissacárido distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacárido capsular conjugado com uma proteína de transporte. Assim, são descrita composições que compreendem dois ou mais polissacáridos capsulares diferentes conjugados com uma ou mais proteína(s) de transporte. 7 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Os polissacáridos capsulares podem ser preparados por técnicas padrão conhecidas daqueles peritos na arte (ref). No presente invento, os polissacáridos capsulares são preparados a partir dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis.
Numa concretização preferida, estes conjugados meningocócicos de serogrupos são preparados por processos separados e formulados numa única formulação para administração. Por exemplo, os polissacáridos capsulares dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis são separadamente purificados.
Numa concretização preferida do presente invento, o polissacárido purificado é despolimerizado e ativado antes da conjugação com uma proteína de transporte. Numa concretização preferida do presente invento, os polissacáridos capsulares dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis são parcialmente despolimerizados utilizando condições oxidativas suaves. A despolimerização ou a despolimerização parcial dos polissacáridos pode então ser seguida por um passo de ativação. Por "ativação" pretende-se dizer o tratamento químico do polissacárido para proporcionar grupos químicos capazes de reagir com a proteína de transporte. Um processo de ativação preferido envolve o tratamento com di-hidrazida de ácido adípico em solução salina fisiológica a pH 5,0±0,1 durante aproximadamente duas horas, a 15 até 30°C. Um processo para ativação é descrito na Patente U.S. 5965714.
Uma vez ativados, os polissacáridos capsulares podem então ser conjugados com uma ou mais proteínas de transporte. Numa concretização preferida do presente invento, cada polissacárido capsular é separadamente conjugado com uma única espécie de proteína de transporte. Numa concretização preferida, os polissacáridos capsulares dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N.meningitidis são cada um separadamente conjugados com a mesma espécie de proteína de transporte.
As proteínas de transporte podem incluir toxinas bacterianas inativadas tal como o toxóide da difteria, 8 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ CRM197, toxóide do tétano, toxóide da tosse convulsa, LT de E. coli, ST de E. coli e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Podiam também ser utilizadas proteínas da membrana externa bacteriana tais como complexo c da membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação a transferrina, pneumólise, proteína A de superfície de pneumococo (PspA) ou proteína adesina de pneumococo (PsaA). Podem também ser utilizadas como proteínas de transporte, outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro de bovino (BSA) ou derivado purificado de proteína de tuberculina (PPD). As proteínas de transporte são, de preferência, proteínas que são não tóxicas e não reactogénicas e obtidas em quantidade e pureza suficientes. As proteínas de transporte devem ser sujeitas a procedimentos de conjugação padrão. Numa concretização preferida do presente invento, a toxina de difteria purificada a partir de culturas de Corynebacteria diphtheriae e quimicamente destoxifiçada utilizando formaldeido é utilizada como a proteína de transporte.
Após conjugação do polissacárido capsular com a proteína de transporte, os conjugados de polissacárido-proteína podem ser purificados (enriquecidos no que se refere à quantidade de conjugado de polissacárido-proteína) por uma variedade de técnicas. Um objetivo do passo de purificação é remover o polissacárido não ligado a partir do conjugado de polissacárido-proteína. Um método para purificação, que envolve a ultrafiltração na presença de sulfato de amónio, é descrito na Patente U.S. 6146902. Alternativamente, os conjugados podem ser purificados de proteína e polissacáridos que não reagiram por um qualquer número de técnicas padrão incluindo, inter alia, a cromatografia de exclusão por tamanhos, a centrifugação em gradiente de densidade, a cromatografia de interação hidrofóbica ou o fracionamento por sulfato de amónio. Ver, por exemplo, P.W. Anderson, et. al. (1986). J. Immunol. 137: 1181-1186. Ver também H.J. Jennings e C. Lugowski (1981) J. Immunol. 127: 1011-1018.
Após conjugação do polissacárido e da proteina de transporte, as composições imunológicas do presente invento são preparadas por combinação dos vários conjugados de polissacárido-proteína. As composições imunológicas aqui 9 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ descritas compreendem dois ou mais polissacáridos capsulares diferentes conjugados com uma ou mais proteína(s) de transporte. É também aqui descrita uma composição imunológica bivalente compreendendo polissacáridos capsulares dos serogrupos A e C de N. meningitidis separadamente conjugados com toxóide da difteria. Mais preferivelmente, o presente invento é uma composição imunológica tetravalente compreendendo polissacáridos capsulares dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis separadamente conjugados com toxóide da difteria. A preparação e utilização de proteínas de transporte, e uma variedade de procedimentos de conjugação potenciais, são bem conhecidos daqueles peritos na arte. Os conjugados do presente invento podem ser preparados por aqueles peritos utilizando as técnicas contidas no presente invento assim como a informação facilmente disponível na literatura geral. Pode também ser obtida uma orientação a partir de qualquer uma ou de todas as patentes U.S. seguintes: U.S. 4356170; U.S. 4619828; U.S. 5153312; U.S. 5422427 e U.S. 5445817.
As composições imunológicas do presente invento são produzidas por preparação em separado de conjugados de polissacárido-proteína de serogrupos meningocócicos diferentes e depois combinação dos conjugados. As composições imunológicas do presente invento são utilizadas como vacinas. A formulação de vacinas do presente invento pode ser realizada utilizando métodos reconhecidos na arte. As composições de vacina do presente invento podem conter também um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes incluem, como exemplo e não limitação, adjuvantes de alumínio, Adjuvante de Freund, BAY, DC-chol, pcpp, lípido A monofosforilo, CpG, QS-21, toxina da cólera e péptido de formilmetionilo. Ver, por exemplo, Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995 (M.F. Powell e M.J. Newman, eds., Plenum Press, NY) . O adjuvante é, de preferência, um adjuvante de alumínio, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.
Como demonstrado abaixo, as vacinas de acordo com o invento induzem uma resposta imune de tipo dependente de T em vários modelos animais, ao passo que a vacina de polissacárido induz uma resposta imune de tipo independente 10 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ de Τ. Assim, as composições aqui descritas são também instrumentos de pesquisa úteis para estudo das vias biológicas e processos envolvidos nas respostas imunes de tipo dependente de T a antigénios de N. meningitidis. A quantidade de vacina do invento a ser administrada a um humano ou animal e o regime de administração podem ser determinados de acordo com técnicas padrão bem conhecidas daqueles peritos nas artes farmacêuticas e veterinárias tendo em consideração fatores tais como o antigénio particular, o adjuvante (se presente), a idade, o sexo, o peso, a espécie e a condição do animal ou doente particular e a via de administração. No presente invento, a quantidade de polissacárido-proteina de transporte para proporcionar uma dose eficaz para vacinação contra N. meningitidis pode estar entre cerca de 0,02 pg e cerca de 5 pg por kg de peso corporal. Numa composição e método preferidos do presente invento, a dose está entre cerca de 0,1 pg e 3 pg por kg de peso corporal. Por exemplo, uma dose eficaz vai requerer menos anticorpo se o tempo decorrido após-infeção for menor, uma vez que há menos tempo para as bactérias proliferarem. De uma forma similar, uma dose eficaz vai depender da carga bacteriana na altura do diagnóstico. Podem ser consideradas para utilização terapêutica, injeções múltiplas administradas ao longo de um periodo de dias.
Os conjugados tetravalentes do presente invento podem ser administrados como uma dose única ou numa série (i.e., com um "reforço" ou "reforços"). Por exemplo, uma criança pode receber uma única dose no inicio da sua vida, depois administra-se uma dose de reforço até dez anos mais tarde, como normalmente recomendado para outras vacinas para prevenir doenças da infância. A dose de reforço vai produzir anticorpos a partir de células-B estimuladas, i.e., uma resposta anamnéstica. Isto é, a vacina multivalente de conjugado induz uma elevada resposta de anticorpo funcional primária (i.e., após uma única administração de vacina) em populações mais novas quando comparada com a vacina de polissacáridos licenciada, sendo capaz de induzir uma resposta anamnéstica (i.e., após uma administração de reforço), o que demonstra que a resposta 11 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ imune protetora induzida pela vacina multivalente de conjugado do presente invento é de longa duração.
As composições do invento podem incluir preparações liguidas para orifícios, por exemplo, para administração oral, nasal, anal, vaginal, perorai, intragástrica, na mucosa (por exemplo, na mucosa perlinqual, alveolar, gengival, olfativa ou respiratória), etc., tais como suspensões, xaropes ou elixires; e preparações para administração parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tais como suspensões ou emulsões estéreis. Prefere-se a administração intravenosa e parentérica. Tais composições podem estar em mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado tal como água, solução salina fisiológica, glucose, estéreis ou semelhantes. As composições podem também ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como agentes humectantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH, aditivos intensificadores de gelificação ou viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, corantes e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Podem ser consultados textos padrão, tal como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edição, 1985, para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida.
As composições do invento utilizadas como vacinas são adequadamente proporcionadas como preparações líquidas, por exemplo, soluções aquosas isotónicas, suspensões, emulsões ou composições viscosas que podem ser tamponadas até um pH selecionado. Se se preferir a absorção através do trato digestivo, as composições do invento podem estar na forma "sólida" de drageias, comprimidos, cápsulas, comprimidos em forma de cápsula ("caplets") e semelhante, incluindo preparações "sólidas" que são libertadas ao longo do tempo ou que têm um enchimento líquido, por exemplo, líquido coberto por gelatina, em que a gelatina é dissolvida no estômago para distribuição nos intestinos. Se for desejada a administração nasal ou respiratória (na mucosa), as composições podem estar numa forma e ser dispensadas por um dispensador de pulverização por pressão, um dispensador em bomba ou um dispensador em aerossol. Os aerossóis estão normalmente sob 12 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ pressão por meio de um hidrocarboneto. Os dispensadores de bomba podem dispensar, de preferência, uma dose medida ou uma dose tendo uma dimensão de partícula particular.
As preparações líquidas são normalmente mais fáceis de preparar do que os geles, outras composições viscosas e composições sólidas. Adicionalmente, as composições líquidas são um pouco mais adequadas para administrar, especialmente por injeção ou oralmente, a animais, crianças, particularmente crianças pequenas, e outros que tenham dificuldade em engolir uma drageia, comprimido, cápsula ou semelhante, ou em situações multidose. Por outro lado, as composições viscosas, podem ser formuladas no intervalo de viscosidade adequado para proporcionar períodos de contacto mais longos com a mucosa, tais como o revestimento da mucosa do estômago ou nasal.
Obviamente que a escolha dos veículos e outros aditivos adequados vai depender da via de administração exata e da natureza da forma de administração particular, por exemplo, a forma de administração líquida (por exemplo, se a composição se destinar a ser formulada numa solução, suspensão, gel ou numa outra forma líquida) ou a forma de administração sólida (por exemplo, se a composição se destinar a ser formulada numa drageia, comprimido, cápsula, comprimido em forma de cápsula, forma de libertação prolongada ou forma cheia de líquido).
As soluções, suspensões e geles, contêm normalmente uma maior quantidade de água (de preferência água purificada) adicionalmente ao ingrediente ativo. Podem também estar presentes, menores quantidades de outros ingredientes tais como reguladores de pH (por exemplo, uma base tal como NaOH), emulsionantes ou agentes de dispersão, agentes tamponantes, conservantes, agentes humectantes, agentes gelificantes (por exemplo, metilcelulose), corantes e/ou aromatizantes. As composições podem ser isotónicas, i.e., podem ter a mesma pressão osmótica do sangue e fluído lacrimal. A isotonicidade desejada das composições deste invento pode ser conseguida utilizando tartarato de sódio, propilenoglicol ou outros solutos inorgânicos ou orgânicos. 0 13 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ cloreto de sódio é particularmente preferido para tampões contendo iões sódio. A viscosidade das composições pode ser mantida no nivel selecionado utilizando um agente espessante farmaceuticamente aceitável. Prefere-se a metilcelulose porque está rápida e economicamente disponível sendo fácil de trabalhar. Outros agentes espessantes adequados incluem, por exemplo, goma xantana, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, carbómero e semelhante. A concentração preferida do espessante vai depender do agente selecionado. 0 ponto importante é utilizar uma quantidade que vá alcançar a viscosidade selecionada. As composições viscosas são normalmente preparadas a partir de soluções pela adição de tais agentes espessantes.
Pode-se utilizar um conservante farmaceuticamente aceitável para aumentar o prazo de validade das composições. 0 álcool benzílico pode ser adequado, embora possa ser também utilizada uma variedade de conservantes incluindo, por exemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol ou cloreto de benzalcónio. Uma concentração adequada do conservante será de 0,02% a 2% com base no peso total embora possa ser apreciável uma variação dependendo do agente selecionado.
Aqueles peritos na arte vão reconhecer que os componentes das composições devem ser selecionados para serem quimicamente inertes relativamente aos conjugados de polissacárido-proteína de transporte de N. meningitidis. O invento será adicionalmente descrito por referência aos exemplos ilustrativos, não limitantes, seguintes, que descrevem em detalhe várias concretizações preferidas do conceito inventivo. Outros exemplos deste invento serão evidentes para aqueles peritos na arte sem afastamento do âmbito do invento definido nas reivindicações. 14 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ EXEMPLOS Exemplo 1
Preparação de pós de polissacáridos capsulares purificados dos serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis
Preparação da pasta em bruto
Em separado, as culturas de sementes congeladas a húmido dos serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis foram descongeladas e recuperadas com o auxílio de meio líquido de Watson Scherp e plantadas em frascos Blake contendo meio de ágar Mueller Hinton. Os frascos Blake foram incubados a 35 até 37°C numa atmosfera de CO2 durante 15 a 19 horas. Após o período de incubação, as culturas dos frascos Blake foram retiradas e adicionadas a balões de 4L contendo meio de Watson Scherp. Os balões foram incubados a 35 até 3 7°C durante 3 a 7 horas num agitador de plataforma. Os conteúdos dos balões de 4L foram transferidos para um recipiente de fermentação contendo meio Watson Scherp. 0 recipiente de fermentação foi incubado a 35 até 37°C durante 7 a 12 horas controlando o conteúdo de oxigénio dissolvido e 0 pH com adições de suplemento de alimento e anti-espuma. Após o período de incubação, o conteúdo do recipiente de fermentação foi transferido para um tanque de 500L, adicionou-se Cetavlon e o material foi misturado durante 1 hora. As culturas tratadas com Cetavlon foram centrifugadas a aproximadamente 15000 a 17000xg, a uma velocidade de fluxo de aproximadamente 30 a 70 litros por hora. O polissacárido em bruto foi precipitado a partir do sobrenadante com uma segunda precipitação de Cetavlon. Adicionou-se Cetavlon ao sobrenadante e o material foi misturado durante, pelo menos, 1 hora à temperatura ambiente. O material foi armazenado a 1 até 5°C durante 8 a 12 horas. O polissacárido precipitado foi recolhido após centrifugação a aproximadamente 45000 até 50000xg, a uma velocidade de fluxo de 300 a 400 ml por minuto. A pasta recolhida foi armazenada a -60°C, ou a temperatura mais baixa, até ser posteriormente processada. 15 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Preparação do pó de polissacárido purificado A pasta inativada foi descongelada e transferida para um misturador. A pasta foi misturada com cloreto de cálcio 0,9M para dar uma suspensão homogénea. A suspensão foi centrifugada a aproximadamente lOOOOxg durante 15 minutos. 0 sobrenadante foi decantado através de uma almofada sem pêlos para um recipiente como o primeiro extrato. Adicionou-se à pasta um segundo volume de cloreto de cálcio 0,9M e misturou-se para dar uma suspensão homogénea. A suspensão foi centrifugada como acima e o sobrenadante combinado com o sobrenadante da primeira extração. Realizou-se um total de quatro extrações, reunindo-se os sobrenadantes. Os extratos reunidos foram concentrados por ultrafiltração utilizando unidades de ultrafiltração enroladas em espiral de 10-30kDA MWCO.
Adicionou-se ao concentrado cloreto de magnésio e o pH foi ajustado a 7,2 até 7,5 utilizando hidróxido de sódio. Adicionou-se ao concentrado DNase e RNase e incubou-se a 25 até 28°C com mistura, durante 4 horas. Adicionou-se etanol numa concentração de 30 até 50%. O ácido nucleico e a proteína precipitados foram removidos por centrifugação a lOOOOxg durante 2 horas. O sobrenadante foi recuperado e o polissacárido precipitado por adição de etanol a 80%, permitindo a este repousar durante a noite a 1 até 5°C. O álcool foi extraído e o polissacárido precipitado foi centrifugado durante 5 minutos a lOOOOxg. O polissacárido precipitado foi lavado com álcool. O polissacárido foi lavado com acetona, centrifugado durante 15 a 20 minutos a lOOOOxg. O polissacárido foi seco sob vácuo. O pó de polissacárido inicial foi dissolvido em solução de acetato de sódio. Adicionou-se cloreto de magnésio e o pH foi ajustado a 7,2 até 7,5 utilizando solução de hidróxido de sódio. Adicionou-se à solução DNase e RNase e incubou-se a 25 até 28°C com mistura durante 4 horas para remover os ácidos nucleicos residuais. Após incubação com estas enzimas, adicionou-se à mistura de polissacárido-enzima um volume igual de solução de acetato de sódio-fenol e colocou-se num agitador de plataforma a 1 até 5°C durante aproximadamente 30 minutos. A mistura foi centrifugada a lOOOOxg durante 15 a 20 minutos. A fase aquosa superior foi recuperada e guardada. Adicionou-se 16 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ à fase aquosa um volume igual de solução de acetato de sódio-fenol e extratou-se como acima. Realizou-se um total de quatro extrações para remover a proteína e a endotoxina da solução de polissacárido. Os extratos aquosos combinados foram diluídos até dez vezes com água para injeção e diafiltrados contra 10 volumes de água para injeção. Adicionou-se cloreto de cálcio ao polissacárido diafiltrado. O polissacárido foi precipitado durante a noite a 1 até 5°C por adição de etanol a 80%. O álcool sobrenadante foi removido e o polissacárido recolhido por centrifugação a lOOOOxg durante 15 minutos. O polissacárido purificado foi lavado duas vezes com etanol e uma vez com acetona. O pó lavado foi seco sob vácuo num exsicador. O pó seco foi armazenado a -30°C ou a temperatura inferior até ser processado no conjugado.
Exemplo 2
Despolimerização do pó de polissacárido capsular purificado dos serogrupos Ά, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis
Os materiais utilizados na preparação incluem pós de polissacárido capsular purificado dos serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis (preparados de acordo com o Exemplo 1), tampão de acetato de sódio 50mM estéril, pH 6,0, ácido clorídrico IN estéril, hidróxido de sódio IN estéril, peróxido de hidrogénio a 30% e solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) estéril.
Cada polissacárido de serogrupo foi despolimerizado numa reação separada. Carregou-se um tanque de aço inoxidável com até 60 g de pó de polissacárido capsular purificado. Adicionou-se ao polissacárido tampão de acetato de sódio 50mM estéril, pH 6,0, para dar uma concentração de 2,5 g de polissacárido por litro. A solução de polissacárido foi deixada misturar a 1 até 5°C durante 12 a 24 horas para dar solução. O tanque de reação foi ligado a uma unidade de permuta de calor. Adicionou-se tampão de acetato de sódio 50mM adicional, pH 6,0, para diluir o polissacárido até à concentração reacional de 1,25 g por litro. A solução de polissacárido foi aquecida até 55°C±0,1. Adicionou-se à mistura reacional uma alíquota de peróxido de hidrogénio a 17 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ 30% para dar uma concentração reacional de peróxido de hidrogénio a 1%. O curso da reação foi monitorizado seguindo-se a alteração na dimensão molecular do polissacárido ao longo do tempo. Removeram-se aliquotas da mistura reacional cada 15 a 20 minutos, injetando-se estas numa coluna HPSEC para medir a dimensão molecular do polissacárido. Quando a dimensão molecular do polissacárido alcançou a dimensão molecular alvo, a unidade de aquecimento foi desligada e a solução de polissacárido rapidamente arrefecida até 5°C por circulação através de um banho de água gelada. A solução de polissacárido despolimerizado foi concentrada até 15g por litro por ligação do tanque de reação a uma unidade de ultrafiltração equipada com cartuchos de celulose regenerada de 3000 MWCO. A solução de polissacárido despolimerizado concentrada foi diafiltrada contra 10 volumes de solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) estéril. O polissacárido despolimerizado foi armazenado a 1 até 5°C até ao passo seguinte do processo. A dimensão molecular do polissacárido despolimerizado foi determinada por passagem através de uma coluna de cromatografia de filtração em gel vendida sob a marca comercial "Ultahydrogel™ 250" que foi calibrada utilizando padrões de dimensão molecular de dextrano e por varrimento de luz laser multiângulo. A quantidade de polissacárido foi determinada pelo teor em fósforo do serogrupo A utilizando o método de Bartlet, G.R.J. (1959) Journal of Biological Chemistry, 234, pgs. 466-468, e pelo teor em ácido siálico dos serogrupos C, W-135 e Y utilizando o método de Svennerholm, L. (1955) Biochimica Biophysica Ata 24, pgs. 604-611. O teor em O-acetilo foi determinado pelo método de Hesterin, S. (1949) Journal of Biological Chemistry 180, p.249. A atividade redutora foi determinada pelo método de Park, J.T. e Johnson, M.J. (1949 Journal of Biological Chemistry 181, pgs. 149-151. A integridade estrutural do polissacárido despolimerizado foi determinada por RMN do ΤΗ e 13C de proteína. A pureza do polissacárido despolimerizado foi determinada por medição do teor em LAL (endotoxina) e do teor em peróxido de hidrogénio residual. 18 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Exemplo 3
Derivatização do polissacárido despolimerizado dos serogrupos Ά, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis
Os materiais utilizados nesta preparação incluem o polissacárido capsular despolimerizado com peróxido de hidrogénio dos serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis (preparados de acordo com o Exemplo 2), di-hidrazida de ácido adipico, l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDAC) apenas para o serogrupo A, cianoboro-hidreto de sódio, ácido clorídrico IN estéril, hidróxido de sódio IN estéril, cloreto de sódio 1M estéril e solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) estéril.
Cada polissacárido de serogrupo foi derivatizado numa reação separada. Carregou-se um tanque de aço inoxidável com o polissacárido despolimerizado purificado e diluiu-se com solução salina fisiológica a 0,85% estéril para alcançar uma concentração reacional final de 6 g de polissacárido por litro. A esta solução adicionou-se uma alíquota concentrada de di-hidrazida do ácido adipico dissolvida em solução salina fisiológica a 0,85% estéril, de forma a alcançar uma concentração reacional de 1 g por litro. Apenas para o serogrupo A, adicionou-se EDAC como uma alíquota concentrada dissolvida em solução salina fisiológica a 0,85% estéril, para alcançar uma concentração reacional de 1 g por litro. O pH foi ajustado a 5,0±0,1 e este pH foi mantido durante 2 horas utilizando ácido clorídrico IN estéril e hidróxido de sódio IN estéril à temperatura ambiente (15 a 30°C) . Após duas horas, uma alíquota concentrada de cianoboro-hidreto de sódio, dissolvida em solução salina fisiológica a 0,85% foi adicionada à mistura reacional para dar uma concentração reacional de 2 g por litro. A reação foi agitada à temperatura ambiente (15 a 30°C) durante 44 horas ± 4 horas, mantendo-se o pH a 5,5±0,5. Após este período de reação, o pH foi ajustado a 6,0±0,1 e o polissacárido derivatizado foi concentrado até 12 g de polissacárido por litro por ligação do tanque de reação a uma unidade de ultrafiltração equipada com cartuchos de celulose regenerada de 3000 MWCO. O polissacárido derivatizado concentrado foi diafiltrado contra 19 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ 30 volumes de cloreto de sódio 1M, seguidos por 10 volumes de cloreto de sódio 0,15M. O tanque foi desligado da unidade de ultrafiltração e armazenado a 1 até 5°C durante 7 dias. O tanque foi de novo ligado a uma unidade de ultrafiltração equipada com cartuchos de celulose regenerada de 3000 MWCO e diafiltrado contra 30 volumes de cloreto de sódio 1M, seguidos por 10 volumes de cloreto de sódio 0,15M. A dimensão molecular do polissacárido derivatizado, a quantidade de polissacárido e o teor em O-acetilo foram medidos pelos mesmos métodos utilizados no polissacárido despolimerizado. O teor em hidrazida foi medido pelo método do ácido 2,4,β-trinitrobenzenossulfónico de Snyder, S.L. e Sobocinski, P.Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, pgs. 282-288. A integridade estrutural do polissacárido derivatizado foi determinada por RMN do XH e 13C de protão. A pureza do polissacárido derivatizado foi determinada por medição do nivel de hidrazida não ligada, do teor em LAL (endotoxina) e do teor em cianoboro-hidreto residual.
Exemplo 4
Preparação da proteína de transporte
Preparação da proteína de toxóide da difteria em bruto
As culturas de sementes liofilizadas foram reconstituídas e incubadas durante 16 a 18 horas. Transferiu-se uma aliquota da cultura para um balão de 0,5 litros contendo meio de crescimento e o balão de cultura foi incubado a 34,5 até 36,5°C num agitador rotativo durante 7 a 9 horas. Transferiu-se uma aliquota do balão de cultura para um balão de 4 litros contendo meio de crescimento e o balão de cultura foi incubado a 34,5 até 36,5°C num agitador rotativo durante 14 a 22 horas. As culturas do balão de 4 litros foram utilizadas para inocular um fermentador contendo meios de crescimento. O fermentador foi incubado a 34,5 até 36,5°C durante 70 a 144 horas. O conteúdo do fermentador foi filtrado através de filtros de profundidade para um recipiente de recolha. Adicionou-se à colheita uma aliquota de solução de formaldeído, a 37%, para alcançar uma concentração de 0,2%. O pH foi ajustado a 7,4 até 7,6. A colheita foi filtrada através de um cartucho de filtro de 0,2 20 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ micron para frascos de 20 litros estéreis. Os frascos foram incubados a 34,5 até 36,5°C durante 7 dias. Adicionou-se a cada frasco de 20 litros uma aliquota de solução de formaldeído, a 37%, para alcançar uma concentração de 0,4%. O pH das misturas foi ajustado a 7,4 até 7,6. Os frascos foram incubados a 34,5 até 36,5°C durante 7 dias num agitador. Adicionou-se a cada frasco de 20 litros, uma aliquota de solução de formaldeído, a 37%, para alcançar uma concentração de 0,5%. O pH das misturas foi ajustado a 7,4 até 7,6. Os frascos foram incubados a 34,5 até 36,5°C durante 8 semanas. O toxóide em bruto foi testado quanto à destoxificação. Os frascos foram armazenados a 1 até 5°C durante o período de teste.
Purificação da proteína de toxóide da difteria em bruto O toxóide em bruto foi deixado aquecer até à temperatura ambiente e os conteúdos dos frascos de 20 litros foram combinados num tanque de purificação. O pH do toxóide foi ajustado a 7,2 até 7,4, adicionou-se carvão ao toxóide em bruto e misturou-se durante 2 minutos. A mistura de carvão e toxóide foi deixada repousar durante 1 hora e depois foi filtrada através de um cartucho de filtro de profundidade para um segundo tanque de purificação. Adicionou-se ao filtrado sulfato de amónio sólido para alcançar 70% de saturação. O pH foi ajustado a 6,8 até 7,2 e a solução foi deixada repousar durante 16 horas. A proteína precipitada foi recolhida por filtração e lavada com solução de sulfato de amónio com 70% de saturação, pH 7,0. O precipitado foi dissolvido em água destilada estéril e a solução de proteína foi filtrada para um recipiente de recolha de aço inoxidável. 0 pH foi ajustado a 6,8 até 7,2 e adicionou-se sulfato de amónio até 40% de saturação. O pH da solução foi ajustado a 7,0 até 7,2 e a solução foi deixada repousar durante 16 horas. O precipitado foi removido por filtração e rejeitado. Adicionou-se ao filtrado sulfato de amónio até 60% de saturação e o pH foi ajustado a 7,0 até 7,2. A mistura foi deixada repousar durante 16 horas e a proteína precipitada foi recolhida por filtração. O precipitado foi dissolvido em água destilada estéril, filtrado para remover a proteína não dissolvida e diafiltrado contra solução salina fisiológica a 0,85%. 21 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Concentração e filtração estéril da proteína de toxóide da difteria purificada A solução de proteína foi concentrada até 15 g por litro e diafiltrada contra 10 volumes de solução salina fisiológica a 0,85% utilizando um cartucho de filtro de celulose regenerada de 10000 MWCO. A solução de proteína concentrada foi esterilizada por filtração através de uma membrana de 0,2 micron. A solução de proteína foi armazenada a 1 até 5°C até ser processada em conjugado. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry, O.H. et al. (1951) Journal of Biological Chemistry 193, pgs. 265-275. A pureza da proteína foi medida pela esterilidade, teor em LAL (endotoxina) e teor em formaldeído residual.
Exemplo 5
Preparação de Conjugados monovalentes de polissacárido dos serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis e de proteína de toxóide da difteria
Os materiais utilizados nesta preparação incluem polissacárido derivatizado por ácido adípico dos serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis (preparados de acordo com o Exemplo 3), proteína de toxóide da difteria estéril (preparada de acordo com o Exemplo 4), EDAC, sulfato de amónio, ácido clorídrico IN estéril, hidróxido de sódio IN estéril e solução salina fisiológica (0,85%) estéril.
Cada conjugado de polissacárido de serogrupo foi preparado por uma reação separada. Todos os quatro conjugados foram preparados pelo processo seguinte. Um tanque de aço inoxidável foi carregado com o polissacárido derivatizado por ácido adípico purificado numa concentração reacional de 700 a 1000 pmoles de hidrazida reativa por litro e proteína de toxóide da difteria purificada numa concentração reacional de 3,8 a 4,0 g de proteína por litro. Utilizou-se solução salina fisiológica a 0,85% para diluir os materiais de partida e atingir as concentrações reacionais alvo e o pH foi ajustado 22 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ a 5,0±0,1. Adicionou-se uma aliquota de EDAC à mistura de polissacárido proteína para se alcançar uma concentração reacional de 2,28 a 2,4 g por litro. 0 pH da reação foi mantido a 5,0±0,1 durante 2 horas, a 15 até 30°C. Após duas horas, o pH foi ajustado a 7,0±0,1 utilizando hidróxido de sódio IN estéril e a reação foi armazenada a 1 até 5°C durante 16 a 20 horas. A mistura reacional foi deixada aquecer até 15 a 30°C e o recipiente reacional foi ligado a uma unidade de ultrafiltração equipada com um cartucho de celulose regenerada de 30000 MWCO. Adicionou-se sulfato de amónio sólido até 60% de saturação (para os serogrupos A, W-135 e Y) e 50% de saturação (para o serogrupo C). A mistura reacional de conjugados foi diafiltrada contra 20 volumes de solução de sulfato de amónio saturada a 60% (para os serogrupos A, W-135 e Y) e solução saturada de sulfato de amónio saturada a 50% (para o serogrupo C) , seguida por 20 volumes de solução salina fisiológica, 0,85%. O conjugado diafiltrado foi primeiramente filtrado através de uma cápsula de filtração contendo um filtro de 1,2 micron e um filtro de 0,45 micron e depois através de uma segunda cápsula de filtração contendo um filtro de 0,22 micron. A quantidade de polissacárido e o teor de O-acetilo foram medidos pelos mesmos métodos utilizados no polissacárido despolimerizado e derivatizado. A quantidade de proteína foi determinada pelo método de Lowry. A dimensão molecular do conjugado foi determinada por passagem através de uma coluna de cromatografia de filtração em gel vendida sob a marca comercial "TSK6000PW" que utilizou ADN como o marcador de volume vazio, ATP como o marcador de volume total e tiroglobulina de bovino como um marcador de referência. Adicionalmente, a dimensão molecular do conjugado que eluiu a partir da coluna TKS6000PW foi medida por varrimento de luz laser multiângulo. O caracter antigénico do conjugado foi medido por ligação ao serogrupo anti-polissacárido específico de anticorpo utilizando o método ELISA de dupla sanduíche. A pureza dos conjugados foi determinada por medição da quantidade de polissacárido não ligado (não conjugado) por eluição através de uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica, a proteína não conjugada por eletroforese 23 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ capilar, esterilidade, teor em LAL (endotoxina), teor em EDAC residual e teor em ião amónio residual.
Exemplo 6
Formulação de uma vacina meningocócica multivalente de conjugado de polissacárido A, C, W-135 e Y e toxóide da difteria
Os materiais utilizados nesta preparação incluem conjugados de polissacárido dos serogrupos A, C, W-135 e Y e toxóide da difteria (preparados de acordo com o Exemplo 5), solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) tamponada com fosfato de sódio lOOmM, estéril.
Uma alíquota de solução salina fisiológica tamponada com fosfato de sódio a 100-500mM estéril foi adicionada a solução salina fisiológica (0,85%) num tanque de armazenamento de aço inoxidável para dar uma concentração final na vacina de fosfato de sódio lOmM. Adicionou-se ao tanque de armazenamento contendo solução salina fisiológica com fosfato de sódio estéril a lOmM, uma alíquota de cada um de dois dos dos quatro conjugados meningocócicos monovalentes de polissacárido-toxóide da difteria, estéreis, para dar uma concentração final de 8 yg de cada polissacárido de serogrupo por mililitro de tampão. O conjugado tetravalente formulado foi misturado e filtrado através de um filtro de 0,2 ym para um segundo tanque de armazenamento. A quantidade de polissacárido de cada serogrupo presente na formulação multivalente foi determinada por análise do sacárido componente utilizando a cromatografia de troca aniónica de pH elevado com deteção amperométrica pulsada. A quantidade de proteína foi medida pelo método de Lowry. O pH da vacina foi medido utilizando-se um elétrodo de combinação ligado a um medidor de pH. O caráter antigénico da vacina multivalente de conjugado foi medido por ligação ao anticorpo específico de serogrupo anti-polissacárido utilizando um método ELISA de dupla sanduíche. A imunogenicidade da vacina multivalente de conjugado foi medida pela capacidade de cada conjugado presente na vacina para induzir quer uma resposta imune de IgG anti-polissacárido primária quer de reforço num 24 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ modelo animal. A pureza da vacina multivalente de conjugado foi determinada por medição da quantidade de polissacárido não ligado (não conjugado) utilizando a cromatografia de troca aniónica de pH elevado com deteção amperométrica pulsada, esterilidade, teor em LAL (endotoxina), teor pirogénico e segurança geral.
Exemplo 7
Preparação do conjugado meningocócico multivalente de polissacárido e proteína de toxóide da difteria adjuvantado com hidróxido de alumínio
Preparação do conjugado adsorvido a hidróxido de alumínio. Os materiais utilizados nesta preparação incluem os conjugados de polissacárido dos serogrupos A, C, W-135 e Y e toxóide da difteria cuja preparação foi descrita no Exemplo 5, solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) estéril e hidróxido de alumínio estéril em solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%).
Uma alíquota de cada um dos conjugados meningocócicos monovalentes de polissacárido e toxóide da difteria estéreis foi adicionada a um tanque de armazenamento contendo solução salina fisiológica para dar uma concentração final de 8 pg de cada polissacárido de serogrupo por mililitro de tampão. Adicionou-se uma alíquota de hidróxido de alumínio estéril em solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) à vacina multivalente de conjugado para se alcançar uma concentração final de 0,44 mg de ião alumínio por mililitro de vacina.
Exemplo 8
Preparação do conjugado adjuvantado com fosfato de alumínio
Os materiais utilizados nesta preparação incluem os conjugados de polissacárido dos serogrupos A, C, W-135 e Y e toxóide da difteria cuja preparação foi descrita no Exemplo 5, solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) estéril e fosfato de alumínio estéril em solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%). 25 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Uma alíquota de cada um dos conjugados meningocócicos monovalentes de polissacárido e toxóide da difteria estéreis foi adicionada ao tanque de armazenamento contendo solução salina fisiológica para dar uma concentração final de 8 pg de cada polissacárido de serogrupo por mililitro de tampão. Adicionou-se uma alíquota de fosfato de alumínio estéril em solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) à vacina multivalente de conjugado para se alcançar uma concentração final de 0,44 mg de ião alumínio por mililitro de vacina.
Exemplo 9
Imunogenicidade da vacina tetravalente de conjugado A vacina tetravalente de conjugado foi estudada quanto à sua capacidade para induzir uma resposta imune em animais de laboratório pequenos antes da avaliação na clínica. Utilizaram-se para estudar a imunogenicidade de vacinas de conjugado relativamente a vacinas de polissacárido, ratinhos, ratos e coelhos. Estes modelos animais são úteis, porque são capazes de distinguir a vacina de conjugado do correspondente polissacárido pelo seu modelo de resposta imune. A vacina de conjugado induz uma resposta imune de tipo dependente de T nestes modelos, ao passo que a vacina de polissacárido induz uma resposta imune de tipo independente de T.
Nos estudos de imunogenicidade em ratinho, o conjugado foi diluído com solução salina fisiológica (cloreto de sódio a 0,85%) para ser administrado entre um quarto e um décimo-sexto de uma dose humana. Aos ratinhos administraram-se uma ou duas doses de vacina, quer de conjugado quer de polissacárido, e recolheram-se amostras de sangue duas semanas após a vacinação. Um grupo de ratinhos serviu como um grupo de controlo não imunizado. Os anticorpos para cada um dos polissacáridos de serogrupo foram medidos por um método ELISA. As amostras de soro foram incubadas com um excesso de cada polissacárido capsular que foi ligado a uma cavidade de placa de microtitulação ELISA. Utilizou-se albumina de soro humano metilada para ligar cada polissacárido de serogrupo à cavidade de microtitulação. Após incubação, a cavidade de 26 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ microtitulação foi lavada com tampão e adicionou-se ao complexo de anticorpo-polissacárido um conjugado anticorpo-enzima secundário que se liga ao anticorpo anti-polissacárido meningocócico. A placa de microtitulação foi lavada e adicionou-se ao conjugado de anticorpo de polissacárido meningocócico-anticorpo-enzima secundário, um substrato químico. A enzima hidrolisa uma porção do substrato químico o que resulta na formação de cor. A quantidade de formação de cor é proporcional à quantidade de conjugado de anticorpo de polissacárido meningocócico-anticorpo-enzima secundário que está ligada à cavidade de microtitulação. A potência da vacina foi determinada por comparação aos antissoros de referência para cada serogrupo, a qual é medida na mesma placa de microtitulação, por um cálculo de linha paralela utilizando um ajuste de quatro parâmetros. Os antissoros de referência de ratinho foram produzidos na mesma estirpe de ratinho do que os que foram individualmente imunizados com três doses de cada vacina de conjugado de serogrupo. Aos antissoros de referência de ratinho foram atribuídos títulos com base no inverso da diluição que dá uma densidade ótica de 1,0. É apresentado na Tabela 1 um sumário dos títulos de IgG anti-polissacárido para cada serogrupo, alcançados em ratinhos Swiss-Webster que foram vacinados com duas doses quer da vacina tetravalente de conjugado, na formulação líquida e na formulação de hidróxido de alumínio, quer da correspondente vacina tetravalente de polissacárido. Os títulos de IgG foram medidos em soros agrupados de um conjunto de dez ratinhos. Utilizaram-se dois conjuntos de 10 ratinhos para medir a resposta imune a cada formulação de vacina. Os dois conjuntos foram vacinados no dia 1. No dia 15 (2 semanas após a vacinação) colheram-se amostras de sangue de um conjunto de 10 ratinhos, e o segundo conjunto de dez ratinhos foi vacinado com uma segunda dose de vacina no dia 15. Duas semanas mais tarde, no dia 29, recolheram-se amostras de sangue do segundo conjunto de 10 ratinhos e do grupo de controlo não imunizado. Todos os anticorpos foram titulados ao mesmo tempo, isto é, quer no dia 15 quer no dia 29, as amostras de sangue foram analisadas ao mesmo tempo juntamente com os controlos não imunizados e os soros de referência dos ratinhos. 27 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Tabela 1 Títulos IgG anti-polissacárido em soros agrupados de ratinhos Swiss-Webster vacinados ou com conjugado tetravalente ou com polissacárido. Grupo de Vacina Dose ug ps Anti-Men A Anti-Men C Anti-Men W-135 Anti-Men Y D15 D29 D15 D29 D15 D29 D15 D29 Conjugado (sem adjuvante) 0,25 131 2640 250 1510 1350 6100 5660 4830 Conjugado (sem adjuvante) 0,50 171 6220 416 2050 849 26000 5980 112000 Conjugado (sem adjuvante) 1,0 249 4500 525 2740 1450 16600 11300 59100 Conjugado (Hid. Alum.) 0,25 2920 4500 1010 2980 2300 33700 11600 124000 Conjugado (Hid. Alum.) 0,50 5800 9550 2280 1010 4810 71900 26400 330000 Conjugado (Hid. Alum.) 1,0 6210 9350 2630 12800 7870 94000 32700 302000 Polissacárido (sem adjuvante) 1,0 136 173 184 205 612 608 4470 3910 Não imunizado n. a. - 110 - 145 - 623 - 777 A vacina tetravalente de conjugado, quer não adjuvantada quer adjuvantada com hidróxido de alumínio, é capaz de induzir uma forte resposta imune IgG anti-polissacárido neste modelo de ratinho. 0 adjuvante de hidróxido de alumínio serve para aumentar quer a resposta primária quer a resposta de reforço em cada um dos quatro conjugados de polissacárido de serogrupo. A vacina tetravalente de polissacárido induz uma resposta imune negligenciável aos serogrupos A, C e W-135 neste modelo de ratinho relativamente ao controlo não imunizado, ao passo que o serogrupo Y induz uma resposta imune respeitável, mas não uma resposta de reforço. A vacina tetravalente de polissacárido não consegue induzir uma resposta de reforço em todos os quatro polissacáridos de serogrupo neste modelo. Este modelo pode diferenciar rapidamente entre a vacina de polissacárido e a vacina de conjugado quer pela magnitude da resposta imune quer pelo modelo de resposta de reforço em cada uma das vacinas de conjugado de serogrupo. A forma não adjuvantada da vacina tetravalente de conjugado tem sido estudada na clínica quanto à segurança e imunogenicidade em adultos jovens saudáveis e em crianças 28 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ jovens saudáveis. No estudo em adultos, os sujeitos foram vacinados com uma única dose de vacina, formulada para conter 4 pg de cada um dos quatro conjugados, como polissacárido. As amostras de sangue foram recolhidas imediatamente antes da vacinação e 28 dias após a vacinação. Os anticorpos para cada um dos conjugados de serogrupo foram medidos por uma medição ELISA que quantificou a quantidade de IgG anti-polissacárido. 0 método ELISA é muito similar ao método utilizado para medir a quantidade de anticorpo IgG presente nos soros de ratinho.
Em resumo, as amostras de soro foram incubadas em cavidades de microtitulação ELISA que foram revestidas com excesso de polissacárido meningocócico que foi ligado à placa com albumina de soro humano metilada. A quantidade de anticorpo ligado foi determinada por uma reação com anticorpo monoclonal específico de IgG anti-humano de ratinho marcado com peroxidase. Uma reação subsequente utilizando substrato de peroxidase produz um produto cromogénico que foi espectrofotometricamente medido. A densidade ótica resultante do cromóforo correlaciona-se com a quantidade de anticorpo IgG no soro que está ligada ao polissacárido meningocócico na placa de microtitulação. A quantidade de anticorpo foi calculada por comparação com um soro de referência humano (CDC 1922) com um valor atribuído utilizando um método de curva logística de 4 parâmetros. Adicionalmente, os anticorpos foram medidos quanto à sua capacidade para lisar bactérias especificas de serogrupo. As amostras de soro foram primeiramente inativadas por calor para destruir o complemento. As amostras de soro foram diluídas em diluições de duas vezes numa placa de microtitulação de 96 cavidades, estéril. As bactérias específicas de serogrupo juntamente com o complemento de coelho bebé foram adicionadas às diluições de soro e deixadas incubar. Após um período de incubação, adicionou-se um meio de revestimento de ágar à mistura de soro/complemento/bactérias. 0 revestimento de ágar foi deixado endurecer e depois incubado durante a noite a 37°C com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, contaram-se as colónias de bactérias presentes nas cavidades. 0 titulo final foi determinado pela diluição sérica recíproca que dá mais do que 50% de morte quando comparada com a média das cavidades de controlo de complemento. 29 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ É apresentado na Tabela 2 um sumário das concentrações médias de IgG anti-polissacárido para cada serogrupo e o titulo de anticorpo bactericida sérico (ABS) médio em soros adultos pré e pós vacinação com a vacina tetravalente de conjugado formulada com 4 pg de polissacárido por dose. A resposta imune a todos os quatro conjugados de serogrupo foi satisfatória, sendo comparável à resposta imune alcançada pela vacina de polissacárido licenciada em termos quer da resposta de anticorpo IgG quer da resposta de anticorpo bactericida funcional. A vacina mostrou ser segura para este grupo etário e o perfil de segurança mostrou ser similar ao da vacina de polissacárido licenciada.
Tabela 2 CMG (concentração média por grupo) de IgG anti-polissacárido e TMGs (títulos médios por grupo) de Anticorpos Bactericidas Séricos para adultos jovens saudáveis vacinados com uma vacina meningocócica tetravalente de conjugado formulada com 4 pg de polissacárido por dose. Resposta Imune por Serogrupo Npré/Npós CMG de IgG (pg/ml) [Cl 95%] TMG de ABS [Cl 95%] Pré Pós Pré Pós A 28/28 3,3 [2,3- 4,8] 38,4 [22,2- 66,4] 487 [231- 1027] 6720 [4666- 15428] C 28/28 0,4 [0,2- 0,7] 5, 5 [3,0-10,1] 16,4 [7,1- 37,7] 1560 [800- 4042] W-135 28/28 0,6 [0,3- 1,0] 5, 8 [2,9- 11,7] 10,0 [5,9- 16,9] 609 [250- 1481] Y 28/28 1,3 [0, 7-2,5] 6,8 [3,2- 14,6] 19, 0 [8, 0-41,2] 390 [143- 1061]
Em grupos etários mais novos, crianças com menos de 2 anos de idade, a resposta imune à vacina de polissacárido é fraca e estima-se que a imunidade diminua após um ano. Às crianças de 12 a 15 meses de idade administrou-se uma única dose de vacina tetravalente de conjugado formulada com 4 pg de cada polissacárido de serogrupo por dose, e a estas foi-lhes administrada uma segunda dose de vacina tetravalente de conjugado dois meses após a primeira dose. Recolheram-se 30 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ amostras de sangue antes da primeira e segunda vacinação e um mês após a segunda vacinação. As respostas de anticorpo para os quatro conjugados de serogrupo estão sumarizadas na Tabela 3. Para cada serogrupo observou-se uma resposta de reforço para anticorpo IgG e para anticorpo bactericida funcional após uma segunda dose de conjugado tetravalente. 0 nivel de anticorpo IgG induzido pela vacina de conjugado é comparável ao induzido pelo polissacárido licenciado neste grupo etário; uma resposta após 6 semanas de 3,64 pg/ml (2,96-4,49) de resposta de anticorpo IgG para o polissacárido do serogrupo C. No entanto, o nivel de anticorpo bactericida induzido pela vacina de conjugado é muito superior ao normalmente induzido pela vacina de polissacárido licenciada neste grupo etário; um titulo de ABS após 6 semanas de 7,2 (5,0-10,4) . Pensa-se que o motivo para esta discordância entre o anticorpo IgG e o anticorpo bactericida nas populações mais novas resulta do facto do polissacárido induzir uma elevada proporção de anticorpo de baixa avidez em populações mais novas. Por contrário, o conjugado parece induzir uma proporção muito maior de anticorpo de elevada avidez. Pensa-se que o anticorpo de elevada avidez é responsável pela atividade bactericida. 31 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Tabela 3 CMG (concentração média por grupo) de IgG anti-polissacárido e TMGs (títulos médios por grupo) de Anticorpos Bactericidas Séricos para crianças jovens saudáveis (1 a 2 anos de idade) vacinadas com duas doses de vacina meningocócica tetravalente de conjugado formulada com 4 pg de polissacárido por dose. Resposta Imune por Serogrupo Ni/Na/N 3 CMG de IgG (ug/ml) [Cl 95%] TMG de ABS [Cl 95%] Pré dose 1 Pré dose 2 Pós dose 2 Pré dose 1 Pré dose 2 Pós dose 2 0,2 2,1 4,4 8,7 1328 3158 A 8/8/8 [0, 1- [0,9- [2, 1- [1,4- [179- [1857- 0,4] 4,8] 9,1] 55,1] 9871] 5371] 0,2 1,0 1,5 6,7 117 304 c 8/8/8 [0, 0- [0,3- [0,6- [2, 0- [37,7- [128- 0, 7] 3,1] 3,6] 23,0] 365] 721] 0,1 0,6 1,5 6,2 22,6 430 W-135 8/8/8 [0, 1- [0,2- [0, 8- [2,2- [2, 8- [172- 0,2] 1,9] 3,1] 17,2] 185] 1076] 0,3 1,2 4,5 5,7 98,7 304 Y 8/8/8 [0,2- [0,5- [2,7- [3, 7- [20,4- [101- 0, 4] 2,8] 7,6] 8,8] 478] 920]
Adicionalmente à capacidade da vacina tetravalente de conjugado para induzir uma elevada resposta de anticorpo funcional em populações mais novas quando comparada com a vacina de polissacárido licenciada, a vacina tetravalente de conjugado é capaz de induzir uma resposta anamnéstica, o que demonstra que a proteção induzida pela vacina tetravalente de conjugado do presente invento é de longa duração. No desenvolvimento da vacina tetravalente de conjugado, os estudos foram primeiramente realizados numa formulação de conjugado bivalente AC. A vacina oferece uma cobertura mais ampla do que o atual conjugado monovalente C licenciado, no entanto, não protege contra a doença causada pelos serogrupos W-135 e Y.
Realizou-se um estudo clínico com sujeitos bebés que comparou a resposta imune da vacina bivalente de polissacárido AC versus a vacina bivalente de conjugado AC. Neste estudo, recrutou-se um terceiro grupo de bebés que serviu como grupo de controlo e que recebeu um conjugado tipo b de Haemophilus influenzae. Todos os três grupos de vacina receberam as mesmas vacinas pediátricas. 0 grupo de conjugado 32 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ bivalente AC recebeu três doses de vacina de conjugado (4 pg de polissacárido por dose) às 6, 10 e 14 semanas de idade. O grupo de polissacárido bivalente AC recebeu duas doses de uma vacina bivalente de polissacárido AC (50 pg de polissacárido por dose) às 10 e 14 semanas de idade. 0 grupo de conjugado de tipo b de Haemophilus influenzae recebeu três doses de vacina de conjugado às 6, 10 e 14 semanas de idade. Recolheram-se amostras de sangue às 6 semanas, pré-vacinação, e às 18 semanas, 4 semanas, após vacinação. Quando as crianças tinham 11 e 12 meses de idade, recolheram-se amostras de sangue e as crianças que tinham recebido ou a vacina bivalente de conjugado AC ou a vacina bivalente de polissacárido AC receberam uma dose de reforço de polissacárido AC. O motivo para a dose de reforço de polissacárido foi o de avaliar se os sujeitos iriam ou não induzir uma resposta anamnéstica. uma
Os resultados deste estudo, quer das respostas imunes primárias quer das respostas imunes de reforço de polissacárido são apresentados na Tabela 4 para a resposta de anticorpo IgG e na Tabela 5 para a resposta de anticorpo ABS. A resposta de anticorpo IgG após a série primária foi aproximadamente a mesma para as duas vacinas de polissacárido e de conjugado. No entanto, a resposta de anticorpo bactericida nos sujeitos vacinados com conjugado foi muito superior à dos sujeitos vacinados com polissacárido. Como observado nos sujeitos com um ano de idade, a vacinação de bebés com o polissacárido induz muito pouco anticorpo bactericida funcional. O anticorpo induzido pelos bebés à vacina de polissacárido é presumivelmente anticorpo de baixa avidez, ao passo que a vacina de conjugado parece induzir anticorpo de elevada avidez, o que contribui para o muito maior titulo de anticorpo bactericida. O elevado nível de anticorpo funcional induzido pela dose de reforço de vacina de polissacárido nos sujeitos que tinham recebido a vacina de conjugado na série de vacinação primária, indica que estes sujeitos tinham sido estimulados para uma resposta de anticorpo de memória ou dependente de células T. Os sujeitos que receberam a vacina de polissacárido na série de vacinação primária induziram uma resposta modesta à dose de reforço de polissacárido, o que é indicativo de uma resposta independente de células T. 33 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Tabela 4
CMG (concentração média por grupo) de IgG anti-polissacárido em bebés contra os serogrupos A e C antes e depois das séries primárias de imunização (6, 10 e 14 semanas de idade) e da vacinação de reforço com polissacárido bivalente AC administrado aos 11 e 12 meses de idade. Resposta Imune por Grupo de Vacina CMG na Vacinação Primária [Cl 95%] CMG na Vacinação de Reforço de PS [Cl 95%] N Pré Pós N Pré Pós Serogrupo A: Conjugado AC 34 3,4 [2,2-5,4] 5, 8 [4,3-8,0] 31 0,2 [0,1-0,3] 7,0 [4,0-12,0] Polissacárido AC 35 3,0 [1,7-5,3] 5, 5 [4,1-7,3] 30 0,9 [0,5-1,4] 3,1 [2,0-4,7] Conjugado HIB 36 3,2 [2,2-4,5] 0, 6 [0,4-0,8] NA NA NA Serogrupo C: Conjugado AC 31 1,6 [0,9-2,8] 2, 8 [2,0-3,9] 31 0,1 [0,1-0,2] 8,1 [4,5-14,5] Polissacárido AC 35 2,3 [1,4-3,9] 5,3 [3,8-7,4] 30 0,6 [0,3-1,0] 2, 8 [1, 7-4, 7] Conjugado HIB 36 2, 0 [1,2-3,5] 0,5 [0,3-0,7] NA NA NA 34 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
Tabela 5
TMG (título médio de grupo) de anticorpo ABS em bebés contra os serogrupos A e C antes e depois das séries primárias de imunização (6, 10 e 14 semanas de idade) e da vacinação de reforço com políssacárído bivalente AC administrado aos 11 e 12 meses de idade. Resposta Imune por Grupo de Vacina TMG na Vacinação Primária [Cl 95% ] TMG na Vacinação de Reforço de PS [Cl 95%] N Pré Pós N Pré Pós Serogrupo A: Conjugado AC 34 11, 8 [7,2-19,3] 177 [101-312] 24 10, 1 [5,6-18,0] 373 [162-853] Políssacárído AC 32 14, 7 [8,5-25,4] 7,0 [4, 7-10,5] 26 6, 1 [3, 9-9,5] 24, 1 [11-53] Conjugado HIB 35 11,2 [6,8-18,3] 6,7 [4,3-10,5] NA NA NA Serogrupo C: Conjugado AC 34 50,8 [24-107] 189 [128-278] 27 4,6 [3,6-5,6] 287 [96,2-858] Políssacárído AC 32 62, 7 [29-131] 25,4 [14,4-44,6] 26 4,1 [3,9-4,3] 14, 4 [7,9-26,1] Conjugado HIB 36 45,3 [21,9-133] 7,3 [4,7-11,3] NA NA NA
Adicionalmente aos benefícios que este invento oferece para a proteção aumentada contra a doença meningocócica em populações jovens e à proteção mais ampla contra os serogrupos A, C, W-135 e Y, o conjugado tetravalente pode proporcionar proteção para outros patogénios por indução de uma resposta de anticorpo para a proteína de transporte. Quando a vacina tetravalente de conjugado, que utiliza conjugado de toxóide da difteria, foi administrada a bebés, estes sujeitos receberam também as imunizações pediátricas de rotina, que incluíram o toxóide da difteria. Por conseguinte, nestes sujeitos não houve melhoria aparente na resposta de anticorpo para o toxóide da difteria. No entanto, quando o conjugado de toxóide da difteria foi administrado a sujeitos que não receberam concomitantemente vacinas contendo toxóide 35 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ da difteria, observou-se uma resposta de reforço mais forte ao toxóide da difteria. Estes sujeitos receberam um regime de três doses de DTP aos 2, 3 e 4 meses de idade. Neste estudo, os sujeitos receberam ou uma única dose de um conjugado bivalente AC ou uma única dose de uma vacina bivalente de polissacárido AC entre os 2 e 3 anos de idade. Recolheram-se amostras de sangue no momento da vacinação e 30 dias após a vacinação. O conjugado bivalente AC utilizou toxóide da difteria como a proteína de transporte. A resposta imune do toxóide da difteria nos dois grupos de vacina é apresentada na Tabela 6. O polissacárido não serviu para estimular uma resposta imune anti-difteria nestes sujeitos, como esperado, no entanto, observou-se uma resposta imune anti-difteria forte nos sujeitos que receberam o conjugado AC. Por conseguinte, a vacina de conjugado meningocócico pode proporcionar um benefício adicional de estimulação de uma resposta imune à proteína de transporte proporcionando assim proteção contra doenças causadas por Corynebacteria diphtheriae quando o toxóide da difteria é utilizado como a proteína de transporte.
Tabela 6
Anticorpo anti-difteria por TMG (título médio de grupo) ELISA, em UI/ml, em crianças jovens saudáveis vacinadas ou com uma vacina bivalente de conjugado de toxóide da difteria AC formulada com 4 pg de polissacárido por dose ou com uma vacina bivalente de polissacárido AC formulada com 50 pg de polissacárido por dose Resposta Imune por Grupo de Vacina Nprà/Npós Anticorpo Anti-Difteria (ELISA - Ul/ml) [Cl 95%] Pré Pós Conjugado AC 104/103 0,047 [0,036-0,060] 21,2 [11,6-38,6] Polissacárido AC 103/102 0,059 [0,045-0,076] 0,059 [0,045-0,077] 36 ΕΡ 1 355 673/ΡΤ
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Lisboa, 2012-08-27

Claims (12)

  1. ΕΡ 1 355 673/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Vacina meningocócica multivalente compreendida por quantidades imunologicamente eficazes de quatro conjugados de proteina-polissacárido distintos para utilização na proteção de um humano contra a infeção por N. meningitidis, caracterizada por cada um dos conjugados conter um polissacárido capsular diferente conjugado com uma proteína de transporte, e em que os polissacáridos capsulares são preparados a partir dos serogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis, em que adicionalmente a proteína de transporte é ou toxóide da difteria ou CRM197.
  2. 2. Vacina para utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por cada polissacárido capsular ser separadamente conjugado com a mesma espécie de proteína de transporte.
  3. 3. Vacina para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender adicionalmente um adjuvante.
  4. 4. Vacina para utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o adjuvante ser hidróxido de alumínio.
  5. 5. Vacina para utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o adjuvante ser fosfato de alumínio.
  6. 6. Vacina para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por não conter um adjuvante.
  7. 7. Processo para produção de uma vacina destinada à utilização na proteção de um humano contra a infeção por N. meningitidis, caracterizado por utilizar: (i) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo A de N. meningitidis; (ii) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo C de N. meningitidis; (iii) um conjugado de uma proteína de transporte e um polissacárido capsular do serogrupo W-135 de N. meningitidis; e (iv) um conjugado de uma proteína de transporte e um ΕΡ 1 355 673/ΡΤ 2/2 polissacárido capsular do serogrupo Y de N. meningitidis em que o referido processo compreende a preparação separada dos referidos conjugados e a combinação dos referidos conjugados numa mistura com um veiculo, diluente ou excipiente adequado, em que a proteína de transporte é ou toxóide da difteria ou CRM197.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por cada polissacárido capsular ser separadamente conjugado na mesma espécie de proteína de transporte.
  9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por compreender adicionalmente a inclusão na vacina de um adjuvante.
  10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o adjuvante ser hidróxido de alumínio.
  11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o adjuvante ser fosfato de alumínio.
  12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por a vacina não conter um adjuvante. Lisboa, 2012-08-27
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