BRPI0206672B1 - composição imunológica, vacina conjugada tetravalente e vacina meningocócica multivalente - Google Patents

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Abstract

"vacina conjugada de proteína de polissacarídeo meningocócico multivalente". a presente invenção refere-se a uma vacina combinada que oferece ampla proteção contra doenças meningocócicas causadas pela neisseria meningitidis bacteriana patogênica. a vacina é compreendida de quatro conjugados de polissacarídeo-proteína distintos que são formulados como uma dose única da vacina. os polissacarídeos capsulares purificados dos sorogrupos a, c, w-135, e y de neisseria meningitidis são quimicamente ativados e seletivamente ligados a uma proteína veículo através de uma ligação química covalente, formando conjugados de polissacarídeo- proteína capazes de eliciar imunidade duradoura a uma variedade de cepas de n. meningitidis em crianças bem como em adultos.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA, VACINA CONJUGADA TETRAVALENTE E VACINA MENINGOCÓCICA MULTIVALENTE (51) int-CI.: A61K 47/64; A61K 39/095; A61K 39/116; A61K 39/39; A61K 47/02; (...).
(52) CPC: A61K 47/6415; A61K 39/095; A61K 39/116; A61K 39/39; A61K 47/02; (...).
(30) Prioridade Unionista: 23/01/2001 US 60/263,435.
(73) Titular(es): SANOFI PASTEUR, INC.
(72) lnventor(es): ROBERT P. RYALL.
(86) Pedido PCT: PCT US2002001963 de 22/01/2002 (87) Publicação PCT: WO 2002/058737 de 0V08/2002 (85) Data do Início da Fase Nacional: 23/07/2003 (57) Resumo: VACINA CONJUGADA DE PROTEÍNA DE POLISSACARÍDEO MENINGOCÓCICO MULTIVALENTE. A presente invenção refere-se a uma vacina combinada que oferece ampla proteção contra doenças meningocócicas causadas pela Neisseria meningitidis bacteriana patogênica. A vacina é compreendida de quatro conjugados de polissacarídeo-proteína distintos que são formulados como uma dose única da vacina. Os polissacarídeos capsulares purificados dos sorogrupos A, C, W-135, e Y de Neisseria meningitidis são quimicamente ativados e seletivamente ligados a uma proteína veículo através de uma ligação química covalente, formando conjugados de polissacarídeo- proteína capazes de eliciar imunidade duradoura a uma variedade de cepas de N. meningitidis em crianças bem como em adultos.
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA, VACINA CONJUGADA TETRAVALENTE E VACINA MENINGOCÓCICA MULTIVALENTE.
Este pedido reivindica o benefício do pedido provisional U.S. n° 60/263.435, depositado em 23 de janeiro de 2001.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo da medicina, geralmente, e mais especificamente a microbiologia, imunologia, vacinas e prevenção de infecções por um patogênio por imunização.
Sumário da Técnica Relacionada
Meningitidis Neisseria é uma causa conducente da meningite bacteriana e sepsia por todo o mundo. A incidência de doença meningocócica endêmica durante os últimos trinta anos varia de 1 a 5 por 100.000 no mundo desenvolvido, e de 10 a 25 por 100.000 em países em desenvolvimento (Reido, F. X. e outros, 1995). Durante a epidemia a incidência de doença meningocócica aproxima-se de 1000 por 1000.000. Existem aproximadamente 2.600 casos de meningite bacteriana por ano nos Estados Unidos, e uma média de 330.000 casos em países em desenvolvimento. A taxa de fatalidade do caso varia entre 10 e 20%.
Os meningococos patogênicos são envolvidos por uma cápsula de polissacarídeo que é ligada a superfície da membrana externa do organismo. Treze sorogrupos diferentes de meningococos têm sido identificados na base da especificidade imunológica do polissacarídeo capsular (Frasch, C. E., e outros, 1985). Desses treze sorogrupos, cinco causam a maioria das doenças meningocócicas; esses incluem sorogrupos A, B, C, W-135, e Y. O sorogrupo A é responsável pela maioria das doenças epidêmicas. Os sorogrupos B, C e Y causam a maioria das doenças endêmicas e afloramento localizado.
A mucosa naso-orofaríngea humana é o único reservatório conhecido natural de Neisseria meningitidis. A colonização ocorre igualmente na superfície exterior da célula mucosal e no tecido sub-epitelial da nasofaPetição 870180067876, de 06/08/2018, pág. 27/37
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ringe. A permanência do meningococo pode durar durantes meses. A propagação do meningococo ocorre por contato direto ou através das gotas de ar. O meningococo torna-se invasivo passando-se através do epitélio mucosal através dos vacúolos fagocíticos como um resultado da endocitose. A 5 defesa do hospedeiro do meningococo invasivo é dependente da bacteriólise mediada por complemento. Os anticorpos de soro que são responsáveis pela bacteriólise mediada por complemento estão direcionados em grande parte contra o polissacarídeo capsular externo.
As vacinas com base em polissacarídeo meningocócico têm sido 10 descritas as quais eliciam uma resposta imune contra o polissacarídeo capsular. Esses anticorpos são suscetíveis à bacteriólise mediada por complemento do meningococo específico de sorogrupo. As vacinas de polissacarídeo meningocócicas foram mostradas serem eficazes em crianças e adultos (Peltola, H. e outros, 1977 e Artenstein, M. S., e outros, 1970), porém a efi15 cácia foi limitada em bebês e crianças (Reingold, A.L. e outros 1985). As doses subseqüentes do polissacarídeo em populações muito jovens eliciaram uma resposta fraca ou não incentivadora (Goldschneider, I., e outros, 1973 e Gold, R. e outros, 1977). A duração da proteção eliciada pelas vacinas de polissacarídeo meningocócicas não é duravelmente prolongada, e
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tem sido estimado ser entre 3 a 5 anos em adultos e crianças acima de quatro anos de idade (Brandt, B. e outros, 1975, Kãyhty, H. e outros, 1980, e Ceesay, S, J, e outros, 1993). Para crianças de um a quatro anos de idade a duração da proteção é menor do que três anos (Reingold, A.L. e outros 1985).
Os polissacarídeos são incapazes de aglutinar-se às moléculas do complexo de histocompatibilidade principal, um pré-requisito para a apresentação do antígeno e estimulação dos linfócitos auxiliares T, isto é, eles são antígenos independentes de células T. Os polissacarídeos são capazes de estimular os linfócitos B para produção de anticorpos sem o auxílio 30 dos linfócitos auxiliares T. Como um resultado da estimulação T (in)dependente dos linfócitos B, existe uma falta de indução a memória seguinte à imunização por esses antígenos. Os antígenos de polissacarídeo
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são capazes de eliciar respostas T-independentes muito eficaz em adultos, porém essas respostas T-independentes são fracas no sistema imune imaturo de bebês e crianças.
Os antígenos de polissacarídeo T-independente podem ser con5 vertidos para antígenos T-dependente por ligação covalente dos polissacarídeos para moléculas de proteína (veículos ou proteínas veículo). As células B que aglutinam o componente de polissacarídeo da vacina conjugada pode ser ativada pelas células T auxiliares específicas para peptídeos que são uma parte da proteína veículo conjugada. A resposta auxiliar T à 10 proteína veículo serve para aumentar a produção de anticorpo para o polissacarídeo.
O polissacarídeo B de sorogrupo tem sido mostrado ser insuficiente a não imunogênico na população humana (Wyle, F.A. e outros, 1972). A ligação química deste polissacarídeo de sorogrupo às proteínas não tem 15 significantemente alterado a resposta imune em animais de laboratório (Jennings, H., J. e outros, 1981). A razão para a necessidade de resposta imune a este polissacarídeo B de sorogrupo é considerada aumentar a partir das similaridades estruturais entre o polissacarídeo B do sorogrupo e glicoproteínas hospedeiras polissililadas, tal como as moléculas de adesão de 20 célula neural.
Uma vacina conjugada meningocócica com base no polissacarídeo C do sorogrupo tem sido descrita. Esta vacina monovalente elicia uma forte resposta de anticorpo funcional ao polissacarídeo capsular presente nas cepas de Λ/. meningitidis correspondendo ao sorogrupo C. Uma tal vaci25 na é somente càpaz de proteger contra a doença causada pela bactéria do sorogrupo C.
As vacinas existentes com base em polissacarídeo meningocócico são de uso limitado em crianças e não fornecem proteção por um tempo prolongado em adultos. A única vacina meningocócica que tem sido 30 mostrada capaz de eliciar proteção por um tempo prolongado em todos os grupos, incluindo crianças, em risco de infecção meningocócica é com base em um polissacarídeo de um único sorogrupo de N. meningitidis e fornece
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Figure BRPI0206672B1_D0007
• · · nenhuma proteção contra a infecção por outros sorogrupos. Desse modo, uma necessidade existe para uma vacina conjugada meningocócica capaz de conferir ampla proteção duradoura contra doença meningocócica em crianças e adultos em risco de infecção meningocócica. Os polissacarídeos 5 meningocócicos multivalentes da presente invenção resolvem esta necessidade fornecendo-se formulações de vacinas nas quais os polissacarídeos imunogênicos dos sorogrupos patogênicos principais de A/, meningitidis têm sido convertidos para antígenos T-dependentes através de conjugações para proteínas veículos.
Sumário da Invenção
A presente invenção fornece composições imunológicas para o tratamento de conjugados de proteína- polissacarídeo meningocócico causado pela Neissería menngitidis patogênica.
A presente invenção fornece composições imunológicas com15 preendendo dois ou mais conjugados de polissacarídeo de proteína, onde cada dos conjugados compreendem um polissacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína veículo.
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A presente invenção fornece composições imunológicas compreendendo dois ou mais conjugados de polissacarídeo de proteína distin20 tos, onde cada dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorogrupo diferente de N. meningitidis conjugado a uma proteína veículo.
A presente invenção fornece vacinas para conjugados de proteína e polissacarídeo meningocócico causado pela Neissería meningitidis patogênica. A presente invenção fornece vacinas meningocócicas multiva25 lentes compreendidas de quantidades imunologicamente eficazes de dois a quatro conjugados de polissacarídeo- proteína distintos, onde cada dos conjugados contêm um polissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína veículo, e onde cada polissacarídeo capsular é selecionado a partir do grupo consistindo em polissacarídeo capsular dos sorogrupos A, C, W30 135 eY.
A presente invenção também fornece métodos para a fabricação de uma composição de proteína de polissacarídeo meningocócico multiva-
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lente compreendendo purificar dois ou mais polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis patogênica; conjugar os polissacarídeos purificados a uma ou mais proteínas veículos e combinar os conjugados para preparar a composição de proteína de polissacarídeo meningocócico multivalente.
A presente invenção ainda fornece um método para induzir uma resposta imunológica ao polissacarídeo capsular de N. meningitidis compreendendo administrar uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunológica da invenção a um animal ou ser humano.
A presente invenção fornece uma vacina meningocócica multi10 valente compreendida de quantidades imunologicamente eficazes de dois a quatro conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, onde cada dos conjugados contém um polissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína veículo, e onde cada polissacarídeo capsular é selecionado a partir do grupo consistindo em polissacarídeo capsular dos sorogrupos A, C, W15 135 eY.
A presente invenção fornece um método para proteger um ser humano ou animal suscetível a infecção de N. meningitidis compreendendo administrar uma dose imunologicamente eficaz da vacina da invenção ao ser humano ou animal.
Todas patentes, publicações de patente e outras publicações recitadas aqui estão por meio das quais incorporadas por referência em sua totalidade.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção compreende uma composição imunológica de dois ou mais conjugados de polissacarídeo de proteína distintos, onde cada dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular conjugado a uma proteína veículo. Desse modo, a presente invenção inclui composições que compreendem dois ou mais polissacarídeos capsulares diferentes conjugados a uma ou mais proteínas veículos.
Os polissacarídeos capsulares podem ser preparados por técnicas padrão conhecidas por aqueles versados na técnica (referência). Na presente invenção, os polissacarídeos capsulares preparados de sorogru-
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pos A, C. W-135 e Y de N. meningitidis são preferidos.
Em uma modalidade preferida, esses conjugados de sorogrupo meningocócico são preparados por processos separados e formulados em uma formulação de dosagem única. Por exemplo, os polissacarídeos cap5 sulares dos sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis são separadamente purificados.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, o polissacarídeo purificado é despolimerizado e ativado antes da conjugação a uma proteína veículo. Em uma modalidade preferida da presente invenção, os 10 polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis são parcialmente despolimerizados empregando condições oxidativas moderadas.
A despolimerização ou despolimerização parcial dos polissacarídeos pode então ser seguida por uma etapa de ativação. Por ativação é 15 entendido o tratamento químico do polissacarídeo para fornecer grupos químicos capazes de reagir com a proteína veículo. Um método de ativação preferido envolve o tratamento com diidrazida de ácido adípico em solução salina fisiológica em pH 5,0 + 0,1 durante aproximadamente duas horas em 15 a 30°C. Um processo para ativação é descrito na Patente U.S. n° 20 5.965.714.
Uma vez ativado, os polissacarídeos capsulares podem então ser conjugados a uma ou mais proteínas veículos. Em uma modalidade preferida da presente invenção cada polissacarídeo capsular é separadamente conjugado a uma única espécie de proteína veículo. Em uma modali25 dade preferida os polissacarídeos capsulares dos sorogrupos A, C, w-135 e
Y de N. meningitidis são cada separadamente conjugados às mesmas espécies de proteínas veículos.
As proteínas veículos podem incluir toxinas bacterianas desativadas tal como toxóide da difteria, CRM197, toxóide do tétano, toxóide da 30 coqueluche, E. coii LT, E.coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. As proteínas da membrana externa bacteriana tal como, complexo c da membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de aglutinação de transferri-
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na, pneumólise, proteína A de superfície pneumocócica (PspA), ou proteína de adesina pneumocócica (PsaP), podem também ser empregadas. Outras proteínas, tal como, ovalbumina, hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou derivado de proteína purifi5 cada de tuberculina (PPD) podem também ser empregados como proteínas veículos. As proteínas veículos são preferivelmente proteínas que são nãotóxicas e não-reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza suficiente. As proteínas veículos deveríam ser responsáveis pelos procedimentos de conjugação padrão. Em uma modalidade preferida da presente invenção a 10 toxina de difteria purificada de culturas de Corynebacteria diphtheriae e quimicamente desintoxicada empregando formaldeído é empregada como a proteína veículo.
Após a conjugação do polissacarídeo capsular a proteína veículo, os conjugados de polissacarídeo- proteína podem ser purificados (en15 riquecidos com respeito a quantidade de conjugados de polissacarídeoproteína) por uma variedade de técnicas. Um objetivo da etapa de purificação é remover o polissacarídeo não-ligado do conjugado de polissacarídeoproteína. Um método para purificação, envolvendo ultrafiltração na presença de sulfato de amônio, é descrito na Patente U.S. n° 6.146.902. Alternativa20 mente, os conjugados podem ser purificados sem a proteína não reagida e polissacarídeo por qualquer das várias técnicas padrão incluindo, entre outras coisas, cromatografia de exclusão de tamanho, centrifugação de gradiente de densidade, cromatografia de interação hidrofóbica ou fracionamento de sulfato de amônio. Observe, por exemplo, P.W. Anderson, e outros (1986) J. Immunol., 137: 1181- 1186. Observe também H. J. Jennings e
C. Lugowski (1981). J. Immunol., 127: 1011 - 1018.
Após a conjugação do polissacarídeo e proteína veículo as composições imunológicas da presente invenção são feitas combinando-se os vários conjugados de polissacarídeo- proteína. As composições imunoló30 gicas da presente invenção compreendem dois ou mais polissacarídeos capsulares diferentes conjugados a uma ou mais proteínas veículos. Uma modalidade preferida da presente invenção é uma composição imunológica bivalente compreendendo polissacarídeos capsulares dos sorogrupos A e C de N. meningitidis separadamente conjugados ao toxóide de difteria. Mais preferivelmente, a presente invenção é uma composição imunológica tetravalente compreendendo polissacarídeos capsulares dos sorogrupos A, C, 5 W-135 e Y de N. meningitidis separadamente conjugados ao toxóide de difteria.
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A preparação e uso das proteínas veículos, e uma variedade de procedimentos de conjugação potencial, são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os conjugados da presente invenção podem ser pre10 parados por tais pessoas versadas empregando os ensinamentos contidos na presente invenção bem como informações facilmente disponíveis na literatura geral. A orientação pode também ser obtida a partir de qualquer uma ou todas das seguintes patentes U.S., os ensinamentos dos quais estão por meio das quais incorporados em sua totalidade por referência: U.S.
4.356.170, U.S. 4.619.828, U.S. 5.153.312, U.S. 5.422.427 e U.S.
5.445.817.
As composições imunológicas da presente invenção são feitas separadamente preparando-se conjugados de polissacarídeo- proteína de diferentes sorogrupos meningocócicos e em seguida combinando-se os 20 conjugados. As composições imunológicas da presente invenção podem ser empregadas como vacinas. A formulação das vacinas da presente invenção pode ser concluída empregando métodos reconhecidos na técnica. As composições de vacina da presente invenção podem também conter um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes incluem, por modo de exemplo e não limitação, 25 adjuvantes de alumínio, adjuvantes de Freund, BAY, DC-chol, pcpp, lipídeo
A de monofosforila, CpG, QS-21, toxina do cólera e peptídeo de metionil formila. Observe, por exemplo, Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995 (M.F. Powell and M. J. Newman, eds. Plenum Pressm NY). O adjuvante é preferivelmente um adjuvante de alumínio, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.
Como demonstrado abaixo, as composições imunológicas e de vacinas de acordo com a invenção eliciam uma resposta imune tipo
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T-dependente em vários modelos de animais, ao mesmo tempo em que a vacina de polissacarídeo elicia uma resposta imune tipoT (in)dependente. Desse modo, as composições da invenção são também ferramentas de pesquisa úteis para estudar as passagens biológicas e processos envolvi5 dos nas respostas imunes tipo T-dependente aos antígenos de N. meningitidis.
A quantidade da vacina da invenção a ser administrada para um ser humano ou animal e o regime de administração podem ser determinados de acordo com as técnicas padrão bem conhecidas por aqueles de experi10 éncia ordinária nas técnicas veterinárias e farmacêuticas levando em consideração tais fatores com o antígeno particular, o adjuvante (se presente), a idade, sexo, peso, espécies e condições do paciente ou animal particular, e a via de administração. Na presente invenção, a quantidade de veículo de polissacarídeo- proteína para fornecer uma dose eficaz para a vacinação 15 contra N. meningitidis pode ser dentre cerca de 0,02 pg a cerca de 5 pg por kg em peso corpóreo. Em um método e composição preferida da presente invenção a dosagem é entre cerca de 0,1 pg a 3 pg por peso corpóreo. Por exemplo, uma dosagem eficaz exigirá menos anticorpo se o tempo pósinfecção decorrido é menor mesmo que haja menos tempo para a bactéria 20 proliferar. Da mesma maneira uma dosagem eficaz dependerá da carga bacteriana e o tempo da diagnose. Múltiplas injeções administradas durante um período de dias poderia ser considerado para uso terapêutico.
Os conjugados multivalentes da presente invenção podem ser administrados como uma dose única ou em uma série (isto é, com um re25 forço ou reforços). Por exemplo, uma criança poderia receber uma dose única na infância, em seguida ser administrado uma dose de reforço até dez anos mais tarde, como é correntemente recomendado para outras vacinas para prevenir doenças da infância.
A dose de reforço criará anticorpos de células B iniciadoras, isto é, uma resposta anamnéstica. Isto é, a vacina conjugada multivalente elicia uma resposta de anticorpo funcional primária elevada (isto é, seguinte a uma única administração da vacina) em populações muito jovens quando
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comparados a vacinas de polissacarídeo licenciadas, e é capaz de eliciar uma resposta anamnéstica (isto é, seguinte a uma administração de reforço) demonstrando que a resposta imune protetora eliciada pela vacina conjugada multivalente da presente invenção é duradoura.
As composições da invenção podem incluir preparações líquidas para orifícios, por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrico, mucosal (por exemplo, perlingual, alveolar, gengival, olfatório ou mucosa respiratória) etc., administração tal como suspensões, xaropes ou elixires; e, preparações para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, in10 tramuscular, intraperitoneal ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tal como emulsões ou suspensões estéreis. As administrações intravenosa e parenteral são preferidas. Tais composições podem ser misturadas com um veículo, diluente ou excipiente adequado tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose e outros. As composições podem tam15 bém ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares tal como agentes de umectação e emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, aditivos de realce de viscosidade ou gelificação, conservantes, agentes aromatizantes, corantes e outros, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Os textos padrões, tal como Remingtoris
Pharmaceutical, 17- edição, 1985, incorporado aqui por referência, podem
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ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida.
As composições da invenção são convenientemente fornecidas como preparações líquidas, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, sus25 pensões, emulsões ou composições viscosas que podem ser tamponadas em um pH selecionado. Se a absorção do trato digestivo é preferida, as composições da invenção podem estar na forma sólida de pílulas, tabletes, cápsulas, caplet e outros, incluindo preparações sólidas que são liberadas por um tempo prolongado ou que têm um carregamento líquido, por 30 exemplo, líquido revestido de gelatina, por meio do qual a gelatina é dissolvida no estômago para a liberação da goma. Se a administração nasal ou respiratória (mucosal) é desejada, as composições podem estar em uma
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forma e aviadas por um distribuidor spray de compressão, distribuidor de bomba ou distribuidor aerossol. Os aerossóis são freqüentemente sob pressão através de um hidrocarboneto. Os distribuidores de bomba podem preferivelmente aviar uma dose medida ou uma dose tendo um tamanho de
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partícula particular.
As preparações líquidas são normalmente mais fáceis de preparar do que os géis, outras composições viscosas, e composições sólidas. Adicionalmente, as composições líquidas são um pouco mais convenientes para administrar, especialmente por injeção ou oralmente, a animais, crian10 ças, particularmente crianças pequenas, e outros os quais possam ter dificuldade em engolir uma pílula, tablete, cápsula ou outros, ou em situações de multi-dose. As composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas na faixa de viscosidade apropriada para fornecer períodos de contato prolongados com a mucosa, tal como o revestimento do estômago ou muco15 sa nasal.
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Obviamente, a escolha de veículosadequados e outros aditivos dependerá da via de administração exata e da natureza da forma de dosagem particular, por exemplo, dosagem líquida para (por exemplo, se a composição é para ser formulada em uma solução, uma suspensão, gel ou outra 20 forma líquida), ou forma de dosagem sólida (por exemplo, se a composição é para ser formulada como uma pílula, tablete, cápsula, caplet, forma de liberação prolongada ou forma carregada de líquido).
As soluções, suspensões e géis, normalmente contêm uma quantidade maior de água (preferivelmente água purificada) além do ingre25 diente ativo. As quantidades menores de outros ingredientes tal como ajustadores de pH (por exemplo, uma base tal como NaOH), agentes emulsificadores ou de dispersão, agentes de tamponamento, conservantes, agentes de umectação, agentes de geleificação (por exemplo, metilcelulose), corantes e/ou aromatizantes podem também estar presentes. As composições 30 podem ser isotônicas, isto é, podem ter a mesma pressão osmótica como fluído lacrimal e sanguíneo.
A isotonicidade desejada das composições desta invenção pode ser obtida empregando tartarato de sódio, propileno glicol ou outros solutos orgânicos ou inorgânicos. Cloreto de sódio é particularmente preferido para tampões contendo íons de sódio.
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A viscosidade das composições pode ser mantida no nível sele5 cionado empregando um agente de espessamento farmaceuticamente aceitável. Metilcelulose é preferido porque é facilmente e economicamente disponível e é fácil de se trabalhar. Outros agentes de espessamento adequados incluem, por exemplo, goma de xantano, carboximetil celulose, hidroxipropil celulose carbômero, e similares. A concentração preferida do 10 engrossador dependerá do agente selecionado. O ponto importante é usar uma quantidade que obtenha a viscosidade selecionada. As composições viscosas são normalmente preparadas a partir de soluções pela adição de tais agentes de engrossamento.
Um conservante farmaceuticamente aceitável pode ser empre15 gado para aumentar a vida de prateleira das composições. O álcool de benzila pode ser adequado, embora uma variedade de conservantes incluindo, por exemplo, parabeno, timerosal, clorobutanol, ou cloreto de benzalcônio, possa também ser empregado. Uma concentração adequada do conservante será de 0,02% a 2% com base no peso total embora possa haver va20 riação apreciável dependendo do agente selecionado.
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Aqueles versados na técnica reconhecerão que os componentes das composições devem ser selecionados por serem quimicamente inertes com respeito aos conjugados veículosde polissacarídeo- proteína de Λ/. meningitidis.
A invenção será ainda descrita por referência aos seguintes exemplos ilustrativos, não limitantes, apresentando em detalhes várias modalidades preferidas do conceito inventivo. Outros exemplos desta invenção serão aparentes àqueles versados na técnica sem afastar-se do espírito da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de Pós de Polissacarídeo Capsular Purificado de sorogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis.
Preparação da Pasta Bruta
Separadamente, as culturas de semente congelada úmida de sorogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis foram descongeladas e recuperadas com o auxílio do meio Watson Scherp e cultivadas nas garrafas Blake contendo meio de ágar Mueller Hinton. Os Blakes foram incuba10 dos em 35 a 37°C em uma atmosfera de CO2 durante 15 a 19 horas. Seguinte ao período de incubação, o desenvolvimento das garrafas Blaker foi desalojado e adicionado em frascos de 4 L contendo meio Watson Scherp. Os frascos foram incubados em 35 a 37°C durante 3 a 7 horas em um agitador de plataforma. Os conteúdos dos frascos de 4 L foram transferidos para 15 um vaso de fermentação contendo meio Watson Scherp. O vaso de fermentação foi incubado em 35 a 37°C durante 7 a 12 horas controlando o conteúdo de oxigênio dissolvido e pH com adições de alimento de suplemento e antiespuma. Após o período de incubação, os conteúdos do vaso de fermentação foram transferidos para um tanque de 500 L, Cetavlon foi 20 adicionado, e o material misturado durante uma hora. O desenvolvimento tratado com Cetavlon foi centrifugado em aproximadamente 15.000 a 17.000 xg em uma taxa de fluxo de aproximadamente 30 a 70 litros por hora. O polissacarídeo bruto foi precipitado pelo sobrenadante com uma segunda precipitação de Cetavlon. Cetavlon foi adicionado ao sobrenadante e o material 25 misturado durante pelo menos uma hora em temperatura ambiente. O material foi armazenado em 1 a 5°C durante 8 a 12 horas. O polissacarídeo precipitado foi coletado para centrifugação em aproximadamente 45.000 a 50.000 xg em uma taxa de fluxo de 300 a 400 ml por minuto. A pasta coletada foi armazenada em -60°C ou menos até que também processada.
Preparação do Pó de Polissacarídeo Purificado
A pasta desativada foi descongelada e transferida para um misturador. A pasta foi misturada com 0,9 M de cloreto de cálcio para pro-
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duzir uma suspensão homogênea. A suspensão foi centrifugada em aproximadamente 10.000 xg durante 15 minutos. O sobrenadante foi decantado através de uma almofada sem fios em um recipiente como o primeiro extrato. Um segundo volume de 0,9 M de cloreto de cálcio foi adicionado à pasta, e misturado para produzir uma suspensão homogênea. A suspensão foi centrifugada como acima, e o sobrenadante combinado com o sobrenadante da primeira extração. Um total de quatro extrações foi realizado, e os sobrenadantes agrupados. Os extratos agrupados foram concentrados por ultrafiltração empregando unidades de ultrafiltração enroladas em aspirai 10-30k DA MWCO.
O cloreto de magnésio foi adicionado ao concentrado, e o pH ajustado de 7,0 para 7,5 empregando hidróxido de sódio. Dnase e Rnase foram adicionados ao concentrado, e incubados de 25 a 28°C com misturação durante 4 horas. O etanol foi adicionado em uma concentração de 30 a 50%. A proteína e ácido nucléico precipitado foram removidos por centrifugação em 10.000 xg durante duas horas. O sobrenadante foi recuperado e o polissacarídeo foi precipitado adicionando-se etanol em 80% e permitindo descansar durante a noite em 1 a 5°C. O álcool foi tirado com sifão, e o polissacarídeo precipitado foi centrifugado durante 5 minutos em 10.000 xg. O polissacarídeo precipitado foi lavado com álcool. O polissacarídeo foi lavado com acetona, centrifugado em 15 a 20 minutos em 10.000 xg. O polissacarídeo foi secado sob vácuo. O pó de polissacarídeo inicial foi dissolvido em solução de acetato de sódio. O cloreto de magnésio foi adicionado e o pH ajustado de 1,2. para 7,5 empregando soluções de hidróxido de sódio. Dnase e Rnase foram adicionados à solução e incubados de 25 a 28°C com mistura durante 4 horas para remover os ácidos nucléicos residuais. Após incubação com essas enzimas, um volume igual de solução de acetato-fenol de sódio foi adicionado à mistura de polissacarídeo- enzima, e colocado em um agitador de plataforma de 1 a 5°C durante aproximadamente 30 minutos. A mistura foi centrifugada em 10.000 xg durante 15 a 20 minutos. A camada aquosa superior foi recuperada e preservada. Um volume igual de solução de acetato-fenol de sódio foi adicionado à camada aquosa, e extraído como
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acima. Um total de quatro extrações foi realizado para remover a proteína e endotoxina da solução de polissacarídeo. Os extratos aquosos combinados foram diluídos até dez vezes com água para injeção, e diafiltrados junto com 10 volumes de água para injeção. O cloreto de cálcio foi adicionado ao po5 lissacarídeo diafiltrado. O polissacarídeo foi precipitado durante a noite a 1 a 5°C adicionando-se etanol em 80%. O sobrenadante de álcool foi retirado, e o polissacarídeo coletado por centrifugação em 10.000 xg durante 15 minutos. O polissacarídeo purificado foi lavado duas vezes com etanol, e uma vez com acetona. O pó lavado foi secado sob vácuo em um dessecador. O 10 pó secado foi armazenado em 30°C ou menos até que processado no conjugado.
Exemplo 2
Despolimerização de Pó de Polissacarídeo Capsular Purificado de sorogrupos de A, C, W-135 e Y de Neisseria Meningitidis.
Os materiais empregados na preparação incluem pós de polissacarídeo capsular purificado de sorogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria Meningitidis (preparados de acordo com o Exemplo 1), 50 mM de tampão de acetato de sódio estéril, pH 6,0, 1N de ácido clorídrico estéril, 1N de hidróxido de sódio estéril, 30% de peróxido de hidrogênio, e solução salina fisio20 lógica estéril (0,85% de cloreto de sódio).
Cada polissacarídeo do sorogrupo foi despolimerizado em uma reação separada. Um tanque de aço inoxidável foi carregado com até 60 g de pó de polissacarídeo capsular purificado. 50 mM de tampão de acetato de sódio estéril, pH 6,0 foi adicionado ao polissacarídeo para produzir uma 25 concentração de 2,5 g de polissacarídeo por litro. A solução de polissacarídeo foi permitida misturar a 1 a 5°C durante 12 a 24 horas para efetuar a solução. O tanque de reação foi conectado a uma unidade permuta de calor. 50 mM de tampão de acetato de sódio adicional, pH 6,0, foi adicionado para diluir o polissacarídeo para concentração de reação de 1,25 g por litro. A 30 solução de polissacarídeo foi aquecida em 55°C + 0,1. Uma alíquota de 30% de peróxido de hidrogênio foi adicionada à mistura de reação para produzir uma concentração de reação de 1% de peróxido de hidrogênio.
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Ο curso da reação foi monitorado seguindo-se a alteração no tamanho molecular do polissacarídeo durante o tempo. A cada 15 a 20 minutos, as alíquotas foram removidas da mistura de reação e injetadas em uma coluna de HPSEC para medir o tamanho molecular do polissacarídeo.
Quando o tamanho molecular do polissacarídeo atingiu o tamanho molecular alvo, a unidade de aquecimento foi desligada e a solução de polissacarídeo rapidamente resfriada em 5°C por circulação através de um banho de água congelada. A solução de polissacarídeo despolimerizada foi concentrada para 15 g por litro conectando-se o tanque de reação a uma unidade 10 de ultrafiltração equipada com cartuchos de celulose regenerados 3000 MWCO. A solução de polissacarídeo despolimerizada concentrada foi diafiltrada junto com 10 volumes de solução salina fisiológica estéril (0,85% de cloreto de sódio). O polissacarídeo despolimerizado foi armazenado a 1 a 5°C até a próxima etapa do processo.
O tamanho molecular do polissacarídeo despolimerizado foi determinado pela passagem através de uma coluna de cromatografia de filtração de gel vendida sob o nome comercial Ultahydrogel®250 que foi calibrada empregando padrões de tamanho molecular de dextrano e por dispersão de luz a laser de multiângulo. A quantidade de polissacarídeo foi 20 determinada pelo conteúdo fosforoso para sorogrupo A empregando o método de Bartlet, G.R.J. (1959) Journal of Biological Chemistry, 234, pp 466468, e pelo conteúdo de ácido siálico para os sorogrupos C, W-135 e Y empregando o método de Svennerholm, L. (1955) Biochimica Biophysica Acta 24, pp 604- 611.0 conteúdo de O-acetila foi determinado pelo método de 25 Hesterin, S. (1949) Journal of Biological Chemistry 180, p. 249. A atividade de redução foi determinada pelo método de Park, J.T. e Johnson, M.J. (1949) Journal of Biological Chemistry 181, pp. 149- 151. A integridade estrutural do polissacarídeo despolimerizado foi determinada por proteína 1H e 13C RMN. A pureza do polissacarídeo despolimerizado foi determinada me30 dindo-se o conteúdo de LAL (endotoxina) e o conteúdo de peróxido de hidrogênio residual.
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Exemplo 3
Derivatização de Polissacarídeo Despolimerizado de Sorogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis
Os materiais empregados nesta preparação incluem sorogrupos
A, C, W-135 e Y de polissacarídeos capsulares despolimerizados de peróxido de hidrogênio de Neisseira meningitidis (preparado de acordo com o Exemplo 2), diidrazida de ácido adípico, carbodiimida de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil) (EDAC) para sorogrupo A somente, cianoborohidreto de sódio, 1N de ácido clorídrico estéril, 1 N de hidróxido de sódio estéril, 1 M 10 de cloreto de sódio estéril, e solução salina fisiológica estéril (0,85% de cloreto de sódio).
Cada polissacarídeo de sorogrupo foi derivado em uma reação separada. Um tanque de aço inoxidável foi carregado com o polissacarídeo despolimerizado purificado, e diluído com 0,85% de solução salina fisiológi15 ca estéril para obter uma concentração de reação final de 6 g de polissacarídeo por litro. A esta solução, foi adicionada uma alíquota concentrada de diidrazida de ácido adípico dissolvida em 0,85% de solução salina fisiológica estéril, a fim de obter uma concentração de reação de 1 g por litro. Para sorogrupo A somente, EDAC foi adicionado como uma alíquota concentrada 20 dissolvida em 0,85% de solução salina fisiológica estéril, para obter uma concentração de reação de 1 g por litro. O pH foi ajustado para 5,0 ± 0,1, e este pH foi mantido durante duas horas empregando 1N de ácido clorídrico estéril e 1 N de hidróxido de sódio estéril em temperatura ambiente (15 a 30°C). Após duas horas, uma alíquota concentrada de cianoborohidreto de 25 sódio, dissolvida em 0,85% de solução salina fisiológica, foi adicionada à mistura de reação para obter uma concentração de reação de 2 g por litro. A reação foi agitada em temperatura ambiente (15 a 30°C) durante 44 horas + 4 horas ao mesmo tempo em que mantendo o pH em 5,5+ 0,5. Seguinte a este período da reação, o pH foi ajustado para 6,0 + 0,1, e o polissacarídeo 30 derivado foi concentrado para 12 g de polissacarídeo por litro conectandose o tanque de reação em uma unidade de ultrafiltração equipada com um cartucho de celulose regenerado 3000 MWCO. O polissacarídeo derivado • · ·
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concentrado foi diafiltrado junto com 30 volumes de 1M de cloreto de sódio, seguido por 10 volumes de 0,15 M de cloreto de sódio. O tanque foi desconectado da unidade de ultrafiltração e armazenado em 1 a 5°C durante 7 dias. O tanque foi novamente conectado a uma unidade de ultrafiltração 5 equipada com cartuchos de celulose regenerados de 3000 MWCO, e diafiltrado junto com 30 volumes de 1 M de cloreto de sódio, seguido por 10 volumes de 0,15 M de cloreto de sódio.
O tamanho molecular do polissacarídeo derivado, a quantidade de polissacarídeo, e o conteúdo de O-acetila foram medidos pelos mesmos 10 métodos empregados no polissacarídeo despolimerizado. O conteúdo de hidrazida foi medido pelo método de ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico de Snyder, S. L. e Sobocinski, P.Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, pp 282-288. A integridade estrutural do polissacarídeo derivado foi determinada pelo próton 1H e 13C RMN. A pureza do polissacarídeo derivado foi de15 terminada medindo-se o nível de hidrazida não ligada, o conteúdo de LAL (endotoxina), e o conteúdo de cianoborohidreto residual.
Exemplo 4
Preparação da Proteína veículo.
Preparação da Proteína de Toxóide de Difteria Bruta
As culturas de semente liofilizadas foram reconstituídas e incubadas durante 16 a 18 horas. Uma alíquota da cultura foi transferida para um frasco de 0,5 litro contendo meio de desenvolvimento, e o frasco de cultura foi incubado em 34,5 a 36,5°C em um agitador giratório durante 7 a 9 horas. Uma alíquota do frasco de cultura foi transferida para um frasco de 4 25 litros contendo o meio de desenvolvimento, e o frasco de cultura foi incubado em 34,5 a 36,5°C em um agitador giratório durante 14 a 22 horas. As culturas do frasco de 4 litros foram empregadas para inocular um meio de desenvolvimento contendo fermentador. O fermentador foi incubado em 34,5 a 36,5°C durante 70 a 144 horas. Os conteúdos do fermentador foram 30 filtrados através de filtros profundos em um vaso de coleção. 37% de uma alíquota de solução de formaldeído, foram adicionados à colheita para obter uma concentração de 0,2%. O pH foi ajustado para 7,4 a 7,6. A colheita foi
Figure BRPI0206672B1_D0035
• · filtrada através de um cartucho de filtro de 0,2 mícron em garrafas de 20 litros estéreis. As garrafas foram incubadas em 34,5 a 36,5°C durante 7 dias. 37% de uma alíquota de solução de formaldeído, foram adicionados a cada garrafa de 20 litros para obter uma concentração de 0,4%. O pH das 5 misturas foi ajustado para 7,4 a 7,6. As garrafas foram incubadas em 34,5 a
36,5°C durante 7 dias em um agitador. 37% de uma alíquota de solução de formaldeído, foram adicionados a cada garrafa de 20 litros para obter uma concentração de 0,5%. O pH das misturas foi ajustado de 7,4 para 7,6. As garrafas foram incubadas em 34,5 a 36,5°C durante 8 semanas. O toxóide 10 bruto foi testado para desintoxicação. As garrafas foram armazenadas em 1 a 5°C durante o período do teste.
Purificação da Proteína de Toxóide de Difteria Bruto
O toxóide bruto foi permitido aquecer em temperatura ambiente, e os conteúdos das garrafas de 20 litros foram combinados em um tanque 15 de purificação. O pH do toxóide foi ajustado para 7,2 a 7,4, e carvão foi adicionado ao toxóide bruto e misturado durante 2 minutos. A mistura de toxóide e carvão foi permitida descansar durante uma hora e foi, em seguida, filtrada através de um cartucho de filtro profundo em um segundo tanque de purificação. O sulfato de amônio sólido foi adicionado ao filtrado para obter 20 70% de saturação. O pH foi ajustado para 6,8 a 7,2, e a solução foi permitida descansar durante 16 horas. A proteína precipitada foi coletada por filtração e lavada com 70% de solução de sulfato de amônio de saturação, pH 7,0. O precipitado foi dissolvido em água destilada estéril, e a solução de proteína foi filtrada em um vaso de coleção de aço inoxidável. O pH foi ajus25 tado de 6,8 para 7,2, e o sulfato de amônio foi adicionado em 40% de saturação. O pH da solução foi ajustado de 7,0 para 7,2, e a solução foi permitida descansar durante 16 horas. O precipitado foi removido por filtração e descartado. O sulfato de amônio foi adicionado ao filtrado em 60% de saturação, e o pH ajustado de 7,0 para 7,2. A mistura foi permitida descansar durante 16 ho30 ras, e a proteína precipitada foi coletada por filtração. O precipitado foi dissolvido em água destilada estéril, filtrado para remover a proteína não dissolvida, e diafiltrado junto com 0,85% de solução salina fisiológica.
Figure BRPI0206672B1_D0036
Concentração e Filtração Estéril da Proteína de Toxóide de Difteria Purificada
A solução de proteína foi concentrada para 15 g por litro e diafiltrada junto com 10 volumes de 0,85% de solução salina fisiológica empregando um cartucho de filtro de celulose regenerado 10.000 MWCO. A solu5 ção de proteína concentrada foi esterilizada por filtração através de uma membrana de 0,2 mícron. A solução de proteína foi armazenada em 1 a 5°C até que processada no conjugado.
A concentração da proteína foi determinada pelo método de Lowry, OH. E outros, (1951) Journal of Biological Chemistry 193, pp 26510 275. A pureza da proteína foi medida por esterilidade, conteúdo de LAL (endotoxina), e conteúdo de formaldeído residual.
Exemplo 5
Preparação de Conjugados Monovalentes de Polissacarídeo de Sorogrupos A, C, W-135, e Y de Neisseria meningitidis para proteína de toxóide de difte15 ria.
Os materiais empregados nesta preparação incluem polissacarídeo derivado de ácido adípico de sorogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria Meningitidis (preparado de acordo com o Exemplo 3), proteína de toxóide de difteria estéril (preparada de acordo com o Exemplo 4), EDAC, sulfato de 20 amônio, 1N de ácido clorídrico estéril, 1N de hidróxido de sódio estéril, e solução salina fisiológica estéril (0,85%).
Cada sorogrupo de polissacarídeo conjugado foi preparado por uma reação separada. Todos os quatro conjugados foram preparados pelos seguintes processos. Um tanque de aço inoxidável foi carregado com polis25 sacarídeo derivado de ácido adípico purificado em uma concentração de reação de 700 a 1000 gmoles de hidrazida reativa por litro e proteína de toxóide de difteria purificada em uma concentração de 3,8 a 4,0g de proteína por litro. A solução salina fisiológica 0,85%, foi empregada para diluir os materiais de partida para as concentrações de reação alvo e o pH foi ajus30 tado para 5,0 ± 0,1. Uma alíquota de EDAC foi adicionada à mistura de proteína de polissacarídeo para alcançar uma concentração de reação de 2,28 a 2,4g por litro. O pH da reação foi mantido em 5,0 + 0,1 durante duas horas em 15 a 30°C. Após duas horas, o pH foi ajustado para 7,0 ±0,1 empregando hidróxido de sódio 1N estéril, e a reação foi armazenada em 1 a 5°C durante 16 a 20 horas.
A mistura de reação foi permitida aquecer em 15 a 30°C e o vaso de reação foi conectado a uma unidade de ultrafiltração equipada com um cartucho de celulose regenerado de 30.000 MWCO. O sulfato de amônio de sólido foi adicionado a 60% de saturação (para sorogrupos A, W-135 e
Y) e 50% de saturação (para sorogrupo C). A mistura de reação conjugada foi diafiltrada junto com 20 volumes de 60% de solução de sulfato de amônio 10 saturada (para sorogrupos A, W-135 e Y) e 50% de solução de sulfato de amônio saturada (para sorogrupo C), seguido por 20 volumes de solução salina fiosiológica, 0,85%. O conjugado diafiltrado foi primeiro filtrado através de uma cápsula de filtro contendo um filtro de 1,2 mícron e um de 0,45 mícron e, em seguida, através de uma segunda cápsula de filtro contendo 15 um filtro de 0,22 mícron.
A quantidade de polissacarídeo e conteúdo de O-acetila foram
Figure BRPI0206672B1_D0037
medidos pelo mesmo método empregado nos polissacarídeos derivados e despolimerizado. A quantidade de proteína foi determinada pelo método de Lowry. O tamanho molecular do conjugado foi determinado por passagem 20 através de uma coluna de cromatografia de filtração de gel vendido sob o nome comercial TSK6000PW que empregou DNA como o marcador de volume vazio, ATP como o marcador de volume total, e tiroglobulina bovina como um marcador de referência. Além disso, o tamanho molecular do conjugado eluído da coluna TKS6000PW foi medido por luz dispersão de luz 25 laser de multiângulo. O caráter antigênico do conjugado foi medido por ligação ao anticorpo específico de sorogrupo antipolissacarídeo empregando o método double-sandwich ELISA. A pureza dos conjugados foi determinada medindo-se a quantidade de polissacarídeos não ligados (não conjugados) por eluição através de uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbi30 ca, proteína não conjugada por eletroforese capilar, esterilidade, conteúdo de LAL (endotoxina), conteúdo EDAC residual e conteúdo de íon de amônio residual.
Figure BRPI0206672B1_D0038
Exemplo 6
Formulação de uma Vacina Conjugada Toxóide de Difteria de Polissacarídeo Meningocócica Multivalente A, C, W-135, e Y.
Os materiais empregados nesta preparação incluem conjugados de toxóide de difteria- polissacarídeo de sorogrupos A, C, W-135, e Y (preparado de acordo com o Exemplo 5), solução salina fisiológica tamponada de fosfato de sódio de 100 mM (0,85% de cloreto de sódio).
Uma alíquota de solução salina fisiológica tamponada de fosfato de sódio 100-500 mM estéril foi adicionada à solução salina fisiológica 10 (0,85%) em um tanque volumoso de aço inoxidável para produzir uma concentração de vacina final de fosfato de sódio de 10 mM. Uma alíquota de cada dos dois a quatro dos conjugados toxóides de difteria- polissacarídeo meningocócico monovalente estéril foi adicionada ao tanque volumoso contendo 10 mM de solução salina fisiológica de fosfato de sódio estéril 15 para produzir uma concentração final de 8 pg de cada polissacarídeo de sorogrupo por mililitro de tampão. O conjugado tetravalente formulado foi misturado e filtrado através de um filtro de 0,2 pm em um segundo tanque volumoso.
Figure BRPI0206672B1_D0039
A quantidade de cada polissacarídeo de sorogrupo presente na 20 formulação multivalente foi determinada pela análise de sacarídeo do componente empregando cromatografia de permuta de ânion de pH elevado com detecção amperométrica de reforço. A quantidade da proteína foi medida pelo método de Lowry. O pH da vacina foi medido empregando uma combinação de eletrodo conectado a um metro do pH. O caráter antigênico 25 da vacina conjugada multivalente foi medido por ligação do anticorpo específico de sorogrupo de antipolissacarídeo empregado um método doublesandwich ELISA. A imunogenicidade da vacina conjugada multivalente foi medida pela capacidade de cada conjugado presente na vacina para eliciar a ligação de uma resposta imune IgG de antipolissacarídeo regulador e pri30 mário em um modelo de animal. A pureza da vacina conjugada multivalente foi determinada medindo-se a quantidade de polissacarídeo não ligado (não conjugado) empregando cromatografia de permuta de ânion de pH elevado com detecção amperométrica de reforço, esterilidade, conteúdo de LAL (endotoxina), conteúdo pirogênico, e proteção em geral.
Exemplo 7
Figure BRPI0206672B1_D0040
Preparação de Conjugado de Proteína Toxóide de Difteria de Polissacarídeo 5 Meningocócico Multivalente Auxiliado por Hidróxido de Alumínio.
A preparação do conjugado absorvido pelo hidróxido de alumínio. Os materiais empregados nesta preparação incluem preparação de conjugados de toxóides de difteria de polissacarídeo de sorotipos A, C, W-135 e Y descritas no Exemplo 5, solução salina fisiológica estéril (0,85% 10 de cloreto de sódio), e hidróxido de alumínio estéril na solução salina fisiológica (0,85% de cloreto de sódio).
Uma alíquota de cada dos conjugados de toxóides de difteria de polissacarídeo meningocócico monovalente foi adicionada ao tanque volumoso contendo solução salina fisiológica para produzir uma concentração 15 final de 8 pg de cada polissacarídeo de sorogrupo por mililitro de tampão.
Uma alíquota de hidróxido de alumínio estéril na solução salina fisiológica (0,85% de cloreto de sódio) foi adicionada à vacina conjugada multivalente para alcançar uma concentração final de 0,44 mg de íon de alumínio por mililitro de vacina.
Exemplo 8
Figure BRPI0206672B1_D0041
Preparação de Conjugado de Fosfato de Alumínio Adiuvante.
Os materiais empregados nesta preparação incluem a preparação de conjugados de toxóides de difteria-polissacarídeo de sorogrupos A, C, W-135 e Y, descrita no Exemplo 5, solução salina fisiológica estéril 25 (0,85% de cloreto de sódio), e fosfato de alumínio estéril na solução salina fisiológica (0,85% de cloreto de sódio).
Uma alíquota de cada dos conjugados de toxóides de difetriapolissacarídeo meningocócico monovalente estéril foi adicionada ao tanque pão. Uma alíquota de fosfato de alumínio estéril na solução salina fisiológica (0,85% de cloreto de sódio) foi adicionada à vacina conjugada multivalente volumoso contendo solução salina fisiológica para produzir uma concentra30 ção final de 8 pg de cada polissacarídeo de sorogrupo por mililitro de tam24
Figure BRPI0206672B1_D0042
para alcançar uma concentração final de 0,44 mg de íon de alumínio por mililitro de vacina.
Exemplo 9
Figure BRPI0206672B1_D0043
Imunogenicidade da Vacina Conjugada Tetravalente
A vacina conjugada tetravalente foi estudada por sua capacidade de eliciar uma resposta imune em pequenos animais de laboratório antes da avaliação na clínica. Camundongos, ratos e coelhos têm sido empregados para estudo da imunogenicidade das vacinas conjugadas relativas às vacinas de polissacarídeos. Esses modelos em animais são úteis, por que 10 eles são capazes de distinguir a vacina conjugada do polissacarídeo correspondente por seu padrão de resposta imune. A vacina conjugada elicia uma resposta imune tipo T-dependente nesses modelos, ao mesmo tempo em que a vacina de polissacarídeo elicia uma resposta imune tipo Tdependente.
Figure BRPI0206672B1_D0044
Nos estudos de imunogenicidade de camundongos, o conjugado foi diluído com solução salina fisiológica (0,85% de cloreto de sódio) para administrar entre um quarto a um sexto de uma dose humana. Aos camundongos foram administrados uma ou duas doses de vacina, ou conjugada ou de polissacarídeo, e espécimes de sangue foram tomados duas semanas 20 após vacinação. Um grupo de camundongos serviu como um grupo de controle não-imunizado. Os anticorpos para cada um dos polissacarídeos de sorogrupo foram medidos por um método ELISA. As amostras de soro foram incubadas com excesso de cada polissacarídeo capsular que foi ligado à uma cavidade de placa de microtitulação ELISA. A albumina de soro huma25 no metilado foi empregada para ligar cada polissacarídeo de sorogrupo à cavidade de microtitulação. Seguindo a incubação a cavidade de microtítulo foi lavada com tampão, e um segundo conjugado de enzima-anticorpo foi adicionado ao complexo de anticorpo-polissacarídeo que liga o anticorpo de anticorpo-secundário de polissacarídeo meningocócico. A enzima hidroliza uma porção do substrato químico que resulta na formação da cor. A quantipolissacarídeo antimeningocócico. A placa de microtitulação foi lavada, e um substrato químico foi adicionado ao conjugado de anticorpo-enzima de
Figure BRPI0206672B1_D0045
dade da formação de cor é proporcional à quantidade de conjugado de anticorpo-enzima de anticorpo-secundário meningocócico polissacarídeo que está ligado a cavidade da microtitulação. A potência da vacina foi determinada comparando-se o antisoro de referência para cada sorogrupo, que é 5 medido na mesma placa de microtitulação, por um cálculo de linha paralela empregando um ajuste de quatro parâmetros. O camundongo de referência de anti-soro foi gerado na mesma cepa de camundongos que foram individualmente imunizados com três doses de cada sorogrupo conjugado de vacina. Os camundongos de referência de anti-soro foram designados com 10 base em titulações no inverso da diluição produzindo uma densidade óptica de 1,0.
Apresentados na tabela 1 é um sumário de títulos igG de antipolissacarídeos para cada sorogrupo alcançado em camundongos SwissWebster que foram vacinados com duas doses de ou a vacina conjugada
Figure BRPI0206672B1_D0046
tetravalente, ambas formulação de hidróxido de alumínio e líquida, ou a vacina de polissacarídeo tetravalente correspondente. As titulações IgG foram medidas em soros agrupados de uma série de dez camundongos. Duas séries de 10 camundongos foram empregadas para medir a resposta imune para cada formulação de vacina. Ambas séries foram vacinadas no dia 1.
No dia 15 (duas semanas após vacinação) o espécime de sangue foi tomado de um grupo de 10 camundongos, e o segundo grupo de dez camundongos foi vacinado com uma segunda dose de vacina no dia 15. Duas semanas após o dia 29, o espécime de sangue foi tomado do segundo grupo de camundongos, e do grupo de controle não imunizado. Todos anticorpos foram titulados ao mesmo tempo, isto é, ambos espécime de sangue do dia e 29 foram ensaiados no mesmo tempo prolongado com os controles não imunizados e o soro de referência dos camundongos.
Tabela 1
Titulações IgG de Antipolissacarídeo nos Soros Agrupados de Camundongos Swiss-Webster Vacinados ou com Conjugado
Figure BRPI0206672B1_D0047
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A vacina conjugada tetravalente, ambas não adjuvantes e adju-
Figure BRPI0206672B1_D0048
vantes com hidróxido de alumínio, é capaz de eliciar uma forte resposta imune IgG de antipolissacarídeos nestes modelos de camundongos. O hidróxido de alumínio adjuvante serve para fornecer ambas respostas a pri5 mária e de reforço para cada dos quatro sorogrupos de conjugados de polissacarídeos. As vacinas de polissacarídeos tetravalentes eliciam uma resposta imune insignificante para sorogrupos A, C, e W-135 nestes modelos de camundongos relativos ao controle não imunizados, ao mesmo tempo em que os sorogrupos Y eliciam uma resposta imune considerável, porém não 10 uma resposta de reforço. A vacina de polissacarídeo tetravalente falha para eliciar uma resposta de reforço para todos quatros sorogrupos de polissacarídeos neste modelo. Este modelo pode facilmente diferenciar entre a vacina de polissacarídeo e a vacina conjugada ambas pela magnitude do modelo da resposta imune e a resposta de reforço para cada dos sorogrupos de 15 vacinas conjugadas.
A forma não adjuvante da vacina conjugada tetravalente tem sido estudada na clínica para proteção e imunogenicidade em adultos jovens sadios ou crianças jovens sadias. Nos adultos estudados, os indivíduos foram vacinados com uma dose única de vacina, formuladas para conter 20 4pg de cada dos quatro conjugados, como polissacarídeos. Os espécimes de sangue foram tomados imediatamente antes para vacinação e 28 dias após a vacinação. Os anticorpos para cada dos conjugados de sorogrupos foram medidos por uma medição ELISA que quantifica a quantidade de igG de antipolissacarídeos. O método ELISA é muito similar ao método empre25 gado para medir a quantidade se o anticorpo igG presente em soro de camundongos.
Brevemente, as amostras de soro foram incubadas em cavidade de microtitulação ELISA que foram revestidas com excesso de polissacarídeos meningocócicos que foram ligados à placa com albumina de soro hu30 mano metilado. A quantidade de anticorpo ligado foi determinada por uma reação com anticorpos monoclonais específicos de IgG anti-humano de camundongo rotulados com peroxidase. Uma reação subseqüente empregan28
Figure BRPI0206672B1_D0049
do substrato de peroxidase gerou um produto cromogênico que foi espectrofotometricalmente medido. A densidade óptica resultante do cromóforo
Figure BRPI0206672B1_D0050
correlaciona-se com a quantidade de anticorpo IgG no soro que está ligado ao polissacarídeo meningocócico nas placas de microtitulação. A quantida5 de de anticorpo foi calculada comparando-se a um soro de referência humana (CDC 1922) com um valor designado empregando método de curva logística de 4 parâmetros. Além disso, os anticorpos foram medidos para sua capacidade de bactéria específica de sorogrupo lise. As amostras de soro são primeiro desativadas a quente para completar a destruição. As 10 amostras de soro são diluídas duas vezes por diluições em uma placa de microtitulação de 96 cavidades estéril. As bactérias específicas de sorogrupo junto com complementos de filhotes de coelhos foram adicionadas às diluições de soro e permitiu-se incubar. Após um período de incubação, um veículo revestido por ágar foi adicionado ao soro/complemento/mistura as 15 bactérias. Permitiu-se endurecer, o revestimento de ágar e em seguida foi incubado durante a noite em 37°C com 5% de dióxido de carbono. O dia seguinte, as colônias de bactérias presentes nas cavidades foram contadas. A titulação final foi determinada pela diluição de soro recíproca produzindo mais do que 50% de morte quando comparado aos meios das cavidades de 20 controle do complemento.
É apresentado na Tabela 2 um sumário das concentrações igG das mídias de antipolissacarídeos para cada sorogrupos e as mídias de titulação de anticorpos bactericidas de soro (SBA) em pré-soros adultos e após a vacinação com a vacina conjugada tetravalente formulada em 4 μg 25 de polissacarídeos por dose. A resposta imune para todos os quatro sorogrupos conjugados foram satisfatória, que é comparável com a resposta imune alcançada pela vacina de polissacarídeo licenciada em termos de ambos anticorpos IgG e respostas de anticorpos bactericidas funcionais. A vacina foi constatada ser segura para este grupo de idade e o perfil seguro 30 foi constatado ser similar para aqueles das vacinas de polissacarídeos licenciadas.
·· ···
Figure BRPI0206672B1_D0051
Tabela 2
GMMC IgG Antipolissacarídeo (concentração média do grupo) GMts de Anticorpos de Soro-Bactericida (titulação médio do grupo) para adultos saudáveis jovens vacinados com uma vacina conjugada meningocócica tetrava-
Figure BRPI0206672B1_D0052
lente formulada em 4 pg por dose por polissacarídeo.
Resposta imune por sorogrupo Npré/Npós IgG GMC (pg/ml) [95% Cl] SBA GMT [95%CI]
Pré Pós Pré Pós
A 28/28 3.3 [2,3-4,8] 38,4 [22,2-66,4] 487 [231-1027] 6720 [4666- 15428]
C 28/28 0,4 [0,2-0,71 5,5 [3,0-10,1] 16,4[7,1-37,7] 1560[800-4042]
W-135 28/28 0,6[0,3-1,0] 5,8(2,9-11,7] 10,0(5,9-16,9] 609(250-1481]
Y 28/28 1,3(0,7-2,51 6,8(3,2-14,6] 19,0(8,0-41,2] 390(143-1061]
Em grupos de idade mais jovens, crianças com menos do que 2 anos de idade, a resposta imune à vacina de polissacarídeos é fraca e a imunidade tem sido estimada para diminuir após 1 ano. Crianças de 12 a 15 meses de idade foram administradas uma dose única de vacina conjugada tetravalente formulada em 4 pg de cada sorogrupo de polissacarídeo por dose, e elas foram administradas com uma segunda dose de vacina de conjugado tetravalente dois meses seguidos à primeira dose. Os espécimes de sangue foram tomados antes das primeira e segunda vacinações, e um mês após a segunda vacinação. As respostas do anticorpo para os quatro sorogrupos conjugados são sumarizadas na Tabela 3. Para cada sorogrupo uma resposta de reforço para anticorpo IgG e para aticorpos bactericidas funcionais foi observada seguindo uma Segunda dose de conjugado tetravalente. O nível de anticorpo IgG eliciou pela vacina conjugada, ser comparável àquela eliciada pelo polissacarídeo licenciado para este grupo de idade; uma resposta após 6 semanas de 3,64 pg/ml (2,96-4,49) a resposta de anticorpo IgG para polissacarídeos de sorogrupo C. Entretanto, o nível de anticorpos bactericidas eliciados pelas vacinas conjugadas é muito maior do que o que é normalmente eliciado pela vacina de polissacarídeo licenciada
Figure BRPI0206672B1_D0053
para este grupo de idade; uma titulação SBA de 6 semanas após de 7,2 (5,0-10,4). Acha-se que a razão para esta discordância entre anticorpo IgG e anticorpo bactericida nas populações mais jovens resulta do polissacarídeo eliciando uma proporção elevada de anticorpos de atividade baixa nas 5 populações mais jovens. Inversamente, os conjugados aparecem para eliciar uma proporção muito maior de anticorpos de atividade elevada. Os anticorpos de atividade elevada são considerados serem responsáveis por esta atividade bactericida.
Tabela 3
GMC IgG antipolissacarídeos (concentração média do grupo) e GMTs de Anticorpos de Bactericidas de Soro (grupos de titulação média) para Crianças Sadias Jovens (1 a 2 anos de idade) vacinadas com Duas Doses de Vacina Conjugada Meningocócica Tetravalente Formulada em 4 pg por Dose por Polissacarídeos.
Resposta Imune por Sorogrupo Ni/N2/N 3 IgG GMC (pg/ml) [95% Cl] SBA GMT [95% Cl]
Pré-dose 1 Pré-dose 2 Pós-dose 2 Pré-dose 1 Pré-dose 2 Pós-dose 2
A 8/8/8 0,2 [0,Ι- Ο,4] 2,1 [0,9- 4,8] 4,4 [2,1- 9,1] 8,7 [1,4- 55,1] 1328 [179- 9871] 3158 [1857- 5371]
C 8/8/8 0,2 [0,0- 0,7] 1,0 [0,3- 3,1] 1,5 [0,6- 3,6] 6,7 [2,0- 23,0] 117 [37,7- 365] 304 [128- 721]
W-135 8/8/8 0,1 [0,Ι- Ο,2] 0,6 [0,2- 1,9] 1,5 [0,8- 3,1] 6,2 [2,2- 17,2] 22,6 [2,8- 185] 430 [172- 1076]
Y 8/8/8 0,3 [0,2- 0,4] 1,2 [0,5- 2,8] 4,5 [2,7- 7,6] 5,7 [3,7- 8,8] 98,7 [20,4- 478] 304 [101- 920]
Além da capacidade da vacina conjugada tetravalente eliciar uma resposta do anticorpo funcional elevada em populações jovens comparadas com vacinas de polissacarídeos licenciadas, a vacina conjugada tetravalente é capaz de eliciar uma resposta anamnéstica, demonstrando que a proteção eliciada pela vacina conjugada tetravalente da presente inven-
Figure BRPI0206672B1_D0054
ção é de vida longa. No desenvolvimento da vacina conjugada tetravalente, os estudos foram primeiro conduzidos em uma formulação de conjugados AC bivalente. A vacina oferece cobertura mais ampla do que o conjugado monovalente C licenciado, porém não protege contra doenças causadas por 5 sorogrupos W-135 e Y.
Figure BRPI0206672B1_D0055
Um estudo clínico foi realizado com indivíduos criança que comparados a resposta imune a vacina de polissacarideos AC bivalente versus a vacina conjugada AC bivalente. Neste estudo, o terceiro grupo de crianças foram envolvidas para servir como um grupo de controle e eles receberam 10 um conjugado b tipo Haemophilus influenzae. Todos os três grupos de vacina receberam as mesmas vacinas pediátricas. Os grupos conjugados AC bivalentes receberam três doses de vacinas conjugadas (4qg de polissacarídeos por dose) em 6, 10, e 14 semanas de idade. O grupo polissacarídeo AC bivalante recebeu duas doses de uma vacina de polissacarídeo AC bi15 valente (50μg de polissacarideos por dose) em 10 e 14 semanas de idade.
O grupo conjugado b tipo Haemophilus influenzae recebeu três doses de vacina conjugada em 6, 10, e 14 semanas de idade. O espécime de sangue foi tomado em 6 semanas, pré-vacinação, e em 18 semanas, 4 semanas após a vacinação. Quando as crianças estiveram com 11 a 12 meses de 20 idade, as espécimes de sangue foram tomadas e a criança que tem recebido ou o conjugado AC bivalente ou a vacina de polissacarídeo AC recebeu uma dose de reforço de polissacarídeo AC. A razão da dose de reforço de polissacarídeo foi avaliar se o indivíduo não eliciaria uma resposta aneméstica.
Os resultados deste estudo, ambas respostas imune de reforço e primária estão apresentadas na Tabela 4 para a resposta de anticorpo IgG e tabela 5 para a resposta de anticorpo SBA. A resposta de anticorpo IgG após as séries primárias foi aproximadamente a mesma durante ambos o polissacarídeo e a vacina conjugada. Entretanto, a resposta do anticorpo bactericida nos indivíduos vacinados conjugados foi muito maior do que os indivíduos vacinados com polissacarideos. Como observado com os indivíduos com um ano de idade, a vacinação de crianças com o polissacarídeo
Figure BRPI0206672B1_D0056
Figure BRPI0206672B1_D0057
induz a poucos anticorpos bactericidas funcionais. O anticorpo induzido pelas crianças para a vacina de polissacarídeo é anticorpo avidez presumivelmente baixa, ao mesmo tempo em que, as vacinas conjugadas aparecem para eliciar o anticorpo de atividade elevada, desse modo a contagem para a titulação é muito maior do anticorpo bactericida. O nível elevado de anticorpos funcionais eliciado pela dose de reforço da vacina de polissacarídeo nos indivíduos que têm recebido a vacina conjugada na primeira série de vacinação, indica que esses indivíduos têm sido prevenidos para uma memória ou resposta do anticorpo dependente de célula T. Os indivíduos que receberam a vacina de polissacarídeos na primeira série de vacinação eliciaram um resposta modesta à dose de reforço de polissacarídeos, que é indicativo de uma resposta independente de célula T.
Tabela 4
GMC IgC de Antipolissacarídeos (concentração média do grupo) em crianças contra Sorogrupos A e C antes e após ambos a imunização de séries primárias (6, 10 e 14 semanas de idade) e a vacinação de reforço com polissacarídeos AC bivalente produzido em 11 a 2 meses de idade.
Resposta imune por grupo de vacina GMC vacinação primária GMC [95% de Cl] GMC vacinação de reforço PS [95% de Cl]
N Pré Pós N Pré Pós
Soroqrupo A:
Conjugado AC 34 3,4 [2,2-5,4] 5,8 [4,3-8,0] 31 0,2 [0,1-0,3] 7,0 [4,0-12,0]
Polissacarídeo AC 35 3,0 [1,7-5,3] 5,5 [4,1-7,3] 30 0,9 [0,5-1,4] 3,1 [2,0-4,7]
Conjugado HIB 36 3,2 [2,2-4,5] 0,6 [0,4-0,8] NA NA NA
Sorogrupo C:
Conjugado AC 31 1,6 [0,9-2,8] 2,8 [2,0-3,9] 31 0,1 [0,1-0,2] 8,1 [4,5-14,5]
Polissacarídeo AC 35 2,3 [1,4-3,9] 5,3 [3,8-7,4] 30 0,6 [0,3-1,0] 2,8 [1,7-4,7]
Conjugado HIB 36 2,0 [1,2-3,5] 0,5 [0,3-0,7] NA NA NA
Figure BRPI0206672B1_D0058
Figure BRPI0206672B1_D0059
Tabela 5
GMT de Anticorpo SBA (grupo de titulação média) em crianças contra sorogrupos A e C antes e após ambos a imunização de séries primárias (6, 10 e 14 semanas de idade) e vacinação de reforço com polissacarídeo AC biva-
Figure BRPI0206672B1_D0060
lente produzindo em 11 a 12 meses de idade.
Resposta imune por grupo de vacina GMC vacinação primária GMC [95% de Cl] GMC vacinação de reforço PS [95% de Cl]
N Pré Pós N Pré Pós
Sorogrupo A:
Conjugado AC 34 11,8[7,2-19,31 177(101-312] 24 10,1 [5,6-18,0] 373[162-853]
Polissacarídeo AC 32 14,7[8,5-25,4] 7,0(4,7-10,5] 26 6,1 [3,9-9,5] 24,1 [11-53]
Conjugado HIB 35 11,2[6,8-18,3] 6,7[4,3-10,5] NA NA NA
Sorogrupo C:
Conjugado AC 34 50,8[24-107] 189[128-278] 27 4,6(3,6-5,6] 287[96,2-858]
Polissacarídeo AC 32 62,7 [29-131] 25,4(14,4-44,6] 26 4,1 [3,9-4,3] 14,4[7,9-26,1]
Conjugado HIB 36 45,3[21,9-133] 7,3(4,7-11,3] NA NA NA
• 10
Além dos benefícios que esta invenção oferece para melhorar a proteção contra doença meningocócica em populações jovens e a proteção mais ampla contra sorogrupos A, C, W-135 e Y, o conjugado tetravalente pode fornecer proteção para outros patógenos induzindo-se uma resposta anticorpo a proteína veículo. Quando a vacina conjugada tetravalente, empregando conjugado toxóide de difteria, foi administrada para crianças, esses indivíduos também receberam as imunizações pediátricas de rotina, que inclui a toxóide difteria. Por esse motivo, nesses indivíduos não existe melhora aparente na resposta do anticorpo para toxóide difteria. Entretanto, quando o conjugado de toxóide de difteria foi administrado para indivíduos que não receberam toxóide de difteria concomitante contendo vacinas, uma resposta de reforço forte para toxóide difteria foi observado. Esses indivíduos que receberam o regimentos de três doses de DTP em 2, 3, e 4 meses de idade. Neste estudo, os indivíduos receberam ou dose única de um conjugado AC bivalente ou uma dose única da vacina de polissacarídeo AC bivalente entre 2 e 3 anos de idade. Os espécimes de sangue foram tomados
Figure BRPI0206672B1_D0061
Figure BRPI0206672B1_D0062
no tempo de vacinação e 30 dias após a vacinação. O conjugado AC bivalente empregado para toxóide de difteria empregado como veículo de proteína.
A resposta imune de toxóide difetria nos dois grupos está apresentada na Tabela 6. O polissacarídeo não serve para estimular uma resposta imune antidifteria nesses indivíduos como esperado, entretanto uma resposta imune de antidifteria foi observada para indivíduos recebendo o conjugado AC. Portanto, a vacina conjugada meningocócica pode fornecer um benefício adicionado de estimulação de uma resposta imune para proteína veículo por esse motivo fornecendo proteção contra doenças causadas por Corynebacteria diphtheriae quando o toxóide de difteria é empregado como uma proteína veículo.
Tabela 6
Anticorpo de Anti-difteria por GMT ELISA (grupo de titulação média) em lU/ml em crianças sadias vacinadas com um conjugado de toxóide ou com uma vacina conjugada toxóide de difteria AC formulada em 4 pg como polissacarídeo por dose ou uma vacina de polissacarídeo AC bivalente em 50pg como polissacarídeo por dose
Resposta imune grupo de vacina por Npré/Npós Anticorpo de antidifteria (ELISA -lU/ml) (95% de Cl)
Pré Pós
Conjugado AC 104/103 0,047 [0,036-0,060] 21,2 [11,6-38,6]
Polissacarídeo 103/102 0,059 [0,045-0,076] 0,059 [0,045-0,077]
Figure BRPI0206672B1_D0063
··
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Claims (36)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição imunológica, caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de quatro conjugados de proteína-polissacarídeo capsular distintos e feitos separadamente, em que o primeiro conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de Neisseria meningitidis do sorogrupo W-135 conjugado a uma proteína veículo purificada, o segundo conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis do sorogrupo Y conjugado a uma proteína veículo purificada, o terceiro conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis do sorogrupo A conjugado a uma proteína veículo purificada, e o quarto conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis do sorogrupo C conjugado a uma proteína veículo purificada, em que a composição imunológica tem a capacidade de eliciar em crianças de menos de dois anos de idade uma resposta de IgG no soro primária e uma resposta de anticorpos bactericidas de soro para cada um dos polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis, em que a dita resposta de anticorpos bactericidas de soro é maior do que a eliciada pela vacina de polissacarídeo licenciada, não conjugada, capsular meningocócica A, C, W-135 e Y tetravalente, e adicionalmente em que a composição imunológica tem a capacidade de eliciar uma resposta de IgG anamnéstica impulsionadora para cada um dos polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis.
2. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
3 polissacarídeo capsular distintos e feitos separadamente, em que o primeiro conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de Neisseria meningitidis do sorogrupo W-135 conjugado a uma proteína veículo purificada, o segundo conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis do sorogrupo Y conjugado a uma proteína veículo purificada, o terceiro conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis do sorogrupo A conjugado a uma proteína veículo purificada, e o quarto conjugado compreende polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis do sorogrupo C conjugado a uma proteína veículo purificada, em que a vacina conjugada tetravalente tem a capacidade de eliciar em crianças de menos de dois anos de idade uma resposta de IgG no soro primária e uma resposta de anticorpos bactericidas de soro para cada um dos polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis, em que a dita resposta de anticorpos bactericidas de soro é maior do que a eliciada pela vacina de polissacarídeo licenciada, não conjugada, capsular meningocócica A, C, W-135 e Y tetravalente, e adicionalmente em que a vacina conjugada tetravalente tem a capacidade de eliciar uma resposta de IgG anamnéstica impulsionadora para cada um dos polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis.
3. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante de alumínio.
4. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é hidróxido de alumínio.
5. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.
6. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita proteína veículo é uma espécie de proteíPetição 870180067876, de 06/08/2018, pág. 28/37 na veículo única.
7. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é selecionada do grupo consistindo em toxóide da difteria, CRM197 e toxóide do tétano.
8. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é toxóide da difteria.
9. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é CRM197.
10. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita composição imunológica é formulada como um líquido estéril.
11. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável.
12. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o dito conservante farmaceuticamente aceitável é timerosal.
13. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo é toxóide do tétano.
14. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polissacarídeo capsular de cada um dos sorogrupos é despolimerizado.
15. Composição imunológica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada um dos polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis é derivatizado com diidrazida de ácido adípico.
16. Vacina conjugada tetravalente, caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de quatro conjugados de proteínaPetição 870180067876, de 06/08/2018, pág. 29/37
17. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
18. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante de alumínio.
19. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é hidróxido de alumínio.
20. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.
21. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita proteína veículo é uma espécie de proteína veículo única.
22. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicaPetição 870180067876, de 06/08/2018, pág. 30/37 ção 21, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é selecionada do grupo consistindo em toxóide da difteria, CRM197 e toxóide do tétano.
23. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é toxóide da difteria.
24. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é CRM197.
25. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ser formulada como um líquido estéril.
26. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável.
27. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o dito conservante farmaceuticamente aceitável é timerosal.
28. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita espécie de proteína veículo única é toxóide do tétano.
29. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polissacarídeo capsular de cada um dos sorogrupos é despolimerizado.
30. Vacina conjugada tetravalente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que cada um dos polissacarídeos capsulares de sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis é derivatizado com diidrazida de ácido adípico.
31. Vacina meningocócica multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende quantidades imunologicamente eficazes de quatro conjugados de proteína de polissacarídeos distintos para uso na proteção de um humano contra infecção por N. meningitidis, onde cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína veí
Petição 870180067876, de 06/08/2018, pág. 31/37 culo, e onde os polissacarídeos capsulares são preparados dos sorogrupos A, C, W-135 e Y de N. meningitidis, em que adicionalmente a proteína veículo é toxóide de difteria ou CRM197.
32. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 31, caracte5 rizada pelo fato de que cada polissacarídeo capsular é separadamente conjugado às mesmas espécies de proteína veículo.
33. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
34. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 33, caracte10 rizada pelo fato de que o adjuvante é hidróxido de alumínio.
35. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.
36. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que a vacina não contém um adjuvante.
Petição 870180067876, de 06/08/2018, pág. 32/37
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