PT959905E - Conjugados de polissacárido e péptido - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "CONJUGADOS DE POLISSACÁRIDO E PÉPTIDO" A presente invenção refere-se a um conjugado de polissacárido e péptido e com um processo para a sua produção. Numa forma de realização particular da invenção, o conjugado utiliza polissacáridos bacterianos ou fúngicos e, por isso, pode ser útil para fins de vacinas.

Os polissacáridos constituem uma família ampla de moléculas poliméricas que são úteis em vários campos técnicos. Em alguns casos, precisam de estar acoplados a um polipéptido, e. g., proteína ou péptido. Por exemplo, os polissacáridos são utilizados em técnicas de diagnóstico ou purificação como um meio de matriz para os reagentes peptídicos. Os polissacáridos não imunogénicos, tal como o dextrano, também são úteis para apresentar péptidos pequenos ao sistema imune, como descrito no documento EP 326111. Na verdade, os péptidos têm de ser ligados a transportadores proteicos ou têm de ser administrados com um adjuvante, sendo os compostos de alumínio os adjuvantes mais vulgarmente utilizados. No entanto, péptidos pequenos misturados, adsorvidos ou precipitados com estes adjuvantes podem ser obstruídos pelo gel de alumínio e portanto, não estão disponíveis para o sistema imune. Para ultrapassar este problema, o documento EP 326111 descreve que os péptidos podem ser conjugados com polissacáridos não imunogénicos. Esses conjugados, na presença de compostos de alumínio, são capazes de potenciar uma resposta imune contra a unidade peptídica. 1

No campo da vacinação, também é muito interessante conjugar polipéptidos e. g., péptido ou proteína, com polissacáridos imunogénicos, isto quando se procura uma resposta imune aos polissacáridos. Com efeito, a cápsula e a parede celular das bactérias (e também a parede celular de fungos) são, essencialmente, constituídas por polissacáridos compostos por unidades de repetição muito específicas que têm sequências dos epitopos que, normalmente, não são encontradas em mamíferos e podem mediar a imunogenicidade. Assim, os polissacáridos, e. g., polissacáridos capsulares já foram utilizados como vacinas contra doenças bacterianas, tais como meningite, pneumonia e febre tifoide.

No entanto, existe um grande problema quando se utiliza polissacáridos como vacinas. Embora se tenha comprovado serem imunogénicos i. e., por outras palavras, potenciam uma resposta imune quando administrados como tal a um mamífero, mesmo que esta resposta possa ser pobre, são específicos na medida em que pertencem ao pequeno número de antigénios que são capazes de induzir a produção de células B sem a ajuda de células T. Assim, são chamados independentes de T. A resposta imune induzida por antigénios independentes de T é caracterizada por uma série de características, entre as quais: (i) A resposta primária é mais fraca e ocorre mais cedo do que a resposta a antigénios dependentes de T; (ii) A resposta dos anticorpos não se consolida na produção de IgG elevada, com aumento de afinidade, como observado com antigénios dependentes de T; 2 iii) A memória imune correspondentes, a antigénios independentes de T é pobre e, por isso, como a memória imune é a chave da resposta imune secundária que constitui a base do principio da vacinação, um antigénio independente de T é um antigénio pobre para induzir uma resposta imune protectora de longo prazo; e (iv) Os bebés são incapazes de responder a polissacáridos antes de um ou dois anos de idade.

De modo a induzir uma resposta imune secundária, os antigénios independentes de T necessitam de estar acoplados covalentemente a uma proteína transportadora, tal como a toxina da difteria ou do tétano que conferem ao antigénio o carácter dependente de T, 0 seu conjugado pode ser complementado, então, com um adjuvante, como um composto de alumínio ou adjuvante de Freund completo ou incompleto (estes dois últimos, exclusivamente para utilização em mamíferos que não seres humanos), de modo que a resposta imunológica é melhorada (efeito adjuvante).

Pelo termo "transportador" significa-se uma molécula que, quando covalentemente ligada a um antigénio, e. g., um polissacárido, é capaz de promover uma resposta dependente de T ao antigénio. Essa resposta é demonstrada por um esquema de vacinação compreendendo, pelo menos, duas injecções do conjugado antigénio-transportador, com dias, semanas ou meses de intervalo (de imunização e de reforço). Após a primeira injecção (imunização), é evidenciada uma resposta fraca dos anticorpos, enquanto que, a resposta dos anticorpos é potenciada a um nível elevado após a injecção de reforço. Essa resposta ampliada não vai ser observada com o controlo negativo constituído pelo 3 antigénio não conjugado. Vários métodos de conjugação já estão disponíveis na técnica. Os grupos funcionais de polissacáridos normalmente envolvidos podem ser grupos amina, hidroxilo ou carboxilo, localizados ao longo da cadeia, ou grupos aldeído terminais ou ao longo da cadeia. Os grupos funcionais de polipéptidos normalmente envolvidos podem ser grupos amina ou carboxilo, terminais ou presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos ou mesmo grupos tiol.

De um modo geral, os conjugados de polissacáridos podem apresentar três tipos de estrutura dependendo da localização dos grupos funcionais do polissacárido (ao longo da cadeia ou na extremidade) e do transportador, que estão envolvidos na ligação. Estes tipos de estrutura são chamados para facilidade de descrição, "SOL" ou "Orelha", "Ancinho" e "Rede". Estão ilustrados na Figura 1, em que (A), (B e) (C), respectivamente, correspondem aos tipos "Sol" (neoglicoconjugado) , "Ancinho" e "Rede". No tipo "Sol" , um polissacárido está ligado a uma proteína ou péptido através de um grupo reactivo exclusivamente localizado numa extremidade da cadeia de polissacárido. Normalmente, isto envolve um grupo carbonilo localizado na extremidade redutora da cadeia de polissacárido. Várias cadeias de polissacárido podem estar ligadas à proteína, envolvendo, geralmente, a ligação um grupo amina transportado, e. g., por um resíduo de lisina. Esses conjugados também são definidos como neoglicoconjugados. A título de exemplo, um conjugado deste tipo é obtido em Alonso de Velasco et al., Infect. Immun. (1995) 63: 961, Paradiso et al., Vaccíne Research (1993) 2(4): 239, e 4 patente U.S. N° 4356170 de Jennings.

No tipo "Ancinho", os péptidos estão ligados ao longo da cadeia de polissacárido. Um exemplo deste tipo é proporcionado em Lett et al., Infect. Immun. (1994) 6_2: 785, e mais apropriadamente, Lett et al., Infect. Immun. (1995) 6_3: 2645 e Kõnen-Waisman et al., J. Immunol. (1995): 5977. A ligação envolve o grupo amina do único resíduo de lisina interno à sequência peptídica e/ou o grupo amina terminal.

No tipo "Rede", as proteínas e o polissacárido estão reticulados. Isto é possibilitado devido ao facto de ser utilizada uma proteína em vez de um péptido (geralmente grupos amina ou ácido localizados ao longo da proteína) e por os grupos reactivos situados ao longo da cadeia do polissacárido estarem envolvidos. Um conjugado deste tipo está descrito na patente U.S. N° 4673574 de Anderson. Schneerson et al., J. Exp. Med. (1980) 152: 361 também descrevem um método de conjugação que leva a um tipo "Rede". Utiliza CNBr e, como um ligante, di- hidrazida do ácido adípico (ADH). Os grupos hidroxilo presentes ao longo de toda a cadeia de polissacárido e os grupos amina da cadeia lateral da proteína estão todos eles envolvidos.

Cada dessas estruturas pode ser obtida de acordo com uma variedade de processos de conjugação. A ligação pode ser uma ligação directa, como na patente U.S. N° 4673574 de Anderson, patente U.S. N° 4356170 de Jennings, Lett et al., ou Kdnen-

Waisman et al. A ligação também pode ser uma ligação indirecta em que é utilizada uma molécula ligante como ilustrado por

Schneerson et al. Além de um ligante, também se pode utilizar um espaçador, como descrito em Alonso de Velasco et al., ou

Paradiso et al., (para o polissacárido pneumocócico). Podem 5 estar envolvidos vários grupos funcionais presentes no polissacárido, proteína, ligante e, opcionalmente, espaçador.

Algumas das referências do estado da técnica citadas acima são apresentadas com mais pormenor como segue:

Em Alonso de Velasco et al., o transportador é um péptido com cerca de 20 resíduos de aminoácidos que compreende um único resíduo de cisteína em cada extremidade. O polissacárido de Streptococcus pneumoniae 17F é primeiro derivatizado na extremidade redutora, por aminação redutiva com diaminopropano na presença de NaCNBH3. Em seguida, o polissacárido derivatizado é bromoacetilado com bromoacetato de N-succinimidilo como um ligante e o polissacárido, assim activado, é acoplado ao grupo tiol do único resíduo de cisteína N- ou C-terminal do péptido. É, assim, obtido um conjugado simples.

Em Lett et al., (1994), polissacáridos de S. mutans ou de Saccharomyces cerevisiae são, primeiro, oxidados com periodato, de forma a criar grupos aldeído ao longo de toda a cadeia do polissacárido. Em seguida, o polissacárido oxidado é acoplado directamente por aminação redutiva a um péptido, na presença de

NaCNBH3.

Em Paradiso et al., são utilizados dois polissacáridos: um polissacárido pneumocócico e o fosfato de polirribitol (PRP) de Haemophilus influenzae. Por hidrólise ácida do polissacárido pneumocócico, é, primeiro, criado um grupo aldose na extremidade da cadeia do polissacárido. São, em seguida, adicionados grupos amina na extremidade da cadeia por aminação redutiva com diaminometano na presença de piridino borano. O polissacárido 6 derivatizado é activado com diéster succinimidílico de ácido adípico e acoplado a grupos amina de proteína ou péptido: voltando ao PRP, este último é, primeiro, submetido a clivagem oxidativa utilizando periodato. São assim criados grupos aldeído nas duas extremidades. 0 PRP oxidado é, então, acoplado aos grupos amina da proteína e do péptido. Em ambos os casos, é criada uma estrutura "Sol".

Em Konen-Waisman et al., o polissacárido Vi e péptidos (nenhum dos quais contém um resíduo de cisteína) ou proteínas são acoplados directamente na presença de cloridrato de (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDAC): os grupos carboxilo do polissacárido e os grupos amina da proteína ou péptidos estão envolvidos na conjugação. Como resultado, é criada uma estrutura "Rede" quando é utilizada a proteína. Quando se utiliza péptidos, a estrutura depende do número do resíduos de aminoácidos que têm grupos de amina. Pode ser uma simples estrutura "Rede" ou uma estrutura "Ancinho".

Como pode ser facilmente compreendido, quando a conjugação envolve grupos funcionais presentes ao longo de toda a cadeia de polissacárido, tal leva a um conjugado reticulado se o transportador for uma proteína (vários grupos amina ou carboxilo na proteína estão disponíveis para ligação). Se o transportador do polipéptido contém um único sítio de ligação (esta situação é muito frequente quando é suficientemente pequeno), o seu conjugado apresenta uma estrutura "Ancinho" (que também pode ser obtida se o polipéptido contiver alguns sítios de ligação e a conjugação for realizada com controlo próximo e apertado, para que reaja um único grupo funcional do polipéptido). Quando o método de conjugação utiliza grupos carboxilo ou amina de um polipéptido de ocorrência natural (ou de um seu fragmento), este 7 último é bastante pequeno para se obter uma estrutura "Ancinho", uma vez que os grupos carboxilo ou amina são frequentemente encontrados em polipéptidos. 0 documento EP 471543 descreve um processo para a produção de um conjugado de polissacárido em que o polissacárido (polissacárido de pneumo 6B) é acoplado a um péptido cíclico (cPND9) e um transportador (OmpC). 0 conjugado de polissacárido-péptido produzido como um produto intermediário é como a seguir: PS-O-CO-NH-R-NH-CO-S-péptidO. 0 conjugado é utilizado para induzir uma resposta imune contra o péptido, utilizando um polissacárido como transportador imunogénico. 0 documento EP 186576 descreve um processo caracterizado por o polissacárido e o péptido serem primeiro derivatizados antes da conjugação, sendo introduzido na cadeia de proteína um grupo tiol reactivo.

Foi agora desenvolvido um novo método de conjugação que pode facilmente produzir uma estrutura "Ancinho", ao utilizar o grupo tiol de um resíduo de cisteína. Uma vez que os resíduos de cisteína são menos frequentes do que o ácido aspártico e a lisina, este método é, portanto, adequado para conjugar péptidos maiores.

Como transportador, os péptidos têm algumas vantagens em relação às proteínas, uma vez que podem ser facilmente purificados quando produzidos biologicamente ou sintetizados e, portanto, são mais puros e mais definidos. Contrariamente às proteínas transportadoras que também podem ter propriedades nocivas (toxicidade), os péptidos podem ser derivados dessas proteínas de forma a apresentar só a propriedade transportadora.

Contudo, os conjugados de polissacárido-péptido conhecidos na técnica são menos imunogénicos do que os seus parceiros polissacárido-proteína e, definitivamente, exigem adjuvantação. Surpreendentemente, o conjugado de polissacárido-péptido produzido pelo novo método tem boa imunogenicidade. Uma das razões para isso reside no facto de a unidade de péptido ter um tamanho suficiente. A presente invenção refere-se a um processo para conjugação de (i) um péptido contendo, pelo menos, seis resíduos de aminoácidos, sendo, pelo menos um deles, um resíduo de cisteína a (ii) um polissacárido compreendendo, pelo menos, quatro unidades de repetição, compreendendo o referido processo:

A (i) Activação do polissacárido com um ligante bifuncional de fórmula R1-A-R2 em que Rl é um grupo maleimidilo, A é uma cadeia carbonada aromática ou alifática substituída ou não e R2 é um grupo succinimidilo, de modo que R2 reage com os grupos amina do polissacárido e obtém-se um polissacárido activado; e (ii) Conjugação do polissacárido activado com o péptido, de modo que Rl reage com o grupo tiol do resíduo de cisteína e é obtido um conjugado, em que uma pluralidade de entidades peptídicas são introduzidas aleatoriamente ao longo de toda a cadeia do polissacárido por ligação covalente; ou 9 Β (i) Derivatização do polissacárido com um espaçador de fórmula (II) R3-B-R4 em que R3 é um grupo funcional capaz de reagir com grupos amina, carboxilo ou hidroxilo, B é uma cadeia carbonada aromática ou alifática e R4 é um grupo amina, de modo que R3 reage com os grupos amina, carboxilo ou hidroxilo do polissacárido e é obtido um polissacárido derivatizado, em que uma pluralidade de entidades espaçadoras são introduzidas aleatoriamente ao longo de toda a cadeia do polissacárido; (ii) Activação do polissacárido derivatizado com um ligante bifuncional de fórmula R1-A-R2 em que Rl é um grupo maleimidilo, A é uma cadeia carbonada aromática ou alifática substituída ou não e R2 é um grupo succinimidilo, de modo que R2 reage com R4 e obtém-se um polissacárido activado; e (iii) Conjugação do polissacárido activado com o péptido, de modo que Rl reage com o grupo tiol do resíduo de cisteína do péptido e é obtido um conjugado, em que uma pluralidade de entidades peptídicas são introduzidas aleatoriamente ao longo de toda a cadeia do polissacárido por ligação covalente. A cadeia A não deve ser nem muito curta (para evitar impedimento estereoquímico) nem muito longa (para evitar interferência com as partes imunogénicas). Assim, a cadeia A compreende de 1 a 12, de modo preferido, de 3 a 8 átomos de carbono e é de um modo mais preferido, seleccionada de C2-C8 alcileno, fenileno, C7-C12 aralcileno, C2-C8 alquilo, fenilo, C7- 10 C]_2 aralquilo, C6 alcanoíloxilo e benzilcarboniloxilo, em que alquilo, fenilo, alcileno e fenileno podem estar substituídos ou não.

Tal como aqui explicado acima, o polissacárido pode ser derivatizado com um espaçador antes da conjugação. Assim, pode fazer-se reagir o polissacárido, primeiro, com um espaçador de fórmula (II) R3-B-R4, em que R3 é um grupo funcional capaz de reagir com grupos amina, carboxilo ou hidroxilo, B é uma cadeia carbonada aromática ou alifática e R4 é um grupo amina capaz de reagir com o grupo succinimidilo R2 do ligante utilizado no passo de conjugação subsequente. A cadeia B pode ser uma cadeia carbonada, de um modo preferido carbonilo, C1-C2 alquilo ou alcileno ou dicarbonilo.

De um modo preferido R3 é um grupo amina ou uma reacção química possuindo um grupo amino, por exemplo, um grupo hidrazida, í. e., NH2-NH-CO-.

Um aspecto adicional da invenção refere-se a o conjugado produzido pelo processo acima referido para indução de uma resposta imune contra a unidade de polissacárido do conjugado.

Uma vez que os grupos amina, carboxilo ou hidroxilo nativos são encontrados nas unidades de repetição e, portanto, estão presentes ao longo de toda a cadeia de polissacárido, um conjugado da invenção apresenta, tipicamente, uma estrutura em ancinho como aqui descrita acima. Consequentemente, pode ser proporcionada uma definição alternativa e equivalente para o conjugado da invenção como a seguir. 11

Dito de outra forma, um conjugado da invenção compreende uma cadeia de polissacárido composta por unidades de repetição e uma pluralidade de unidades de péptido, contendo cana unidade um resíduo de cisteína e estando covalentemente ligada aleatoriamente ao longo da cadeia de polissacárido, através de uma ligação indirecta envolvendo o grupo tiol do resíduo de cisteína e um grupo amina, hidroxilo ou carboxilo do polissacárido, sendo a referida ligação indirecta obtida através de um ligante ou de uma unidade espaçador-ligante desde que a entidade espaçadora da unidade espaçador-ligante esteja ligada ao grupo amina, hidroxilo ou carboxilo do polissacárido.

Por "péptido" entende-se uma cadeia de aminoácidos com pelo menos, 6 e, vantajosamente, não mais do que cerca de 200 resíduos de aminoácidos. O péptido contém, com vantagem, pelo menos 10, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 15, de um modo mais preferido, pelo menos cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Com vantagem, contém no máximo cerca de 150, de um modo preferido no máximo cerca de 100 ou no máximo cerca de 50 resíduos de aminoácidos. Um péptido preferido contém de cerca de 50 a 150 resíduos de aminoácidos.

Para utilização na presente invenção, o péptido pode conter um ou vários resíduos de cisteína. Os resíduos de cisteína proporcionam a ligação do ligante ao péptido. A utilização de um resíduo de cisteína para o acoplamento aumenta a selectividade do acoplamento uma vez que a quantidade de resíduos de cisteína num péptido é, geralmente, baixa. O ou os resíduos de cisteína podem estar localizados em cada extremidade do péptido ou ser internos à cadeia do péptido, desde que a ligação a este sítio não interfira com a estrutura e as propriedades do péptido. Independentemente da quantidade de cisteína, é preferido que um 12 resíduo de cisteína esteja localizado na extremidade N- ou exterminai .

De um modo mais preferido, o péptido contém dois resíduos de cisteína, estando cada um deles localizado numa extremidade, ou um único resíduo de cisteína localizado numa das extremidades, sendo esta última alternativa a mais preferida.

Toda a sequência de aminoácidos do péptido pode ocorrer naturalmente como tal ou como parte de um polipéptido maior. Também pode ser constituída por uma sequência de ocorrência natural que é prolongada na extremidade N- ou C-terminal ou em ambas as extremidades por um resíduo de cisteína adicional.

Para utilização como um transportador num conjugado de vacina, o péptido, com vantagem, contém, pelo menos, um epitopo dependente de células T e vai portanto permitir o desenvolvimento de uma resposta imune protectora contra o polissacárido que é um antigénio dependente de T, após administração do conjugado, e. g., a um mamífero.

Para utilização na presente invenção, o péptido pode ser sintetizado quimicamente ou produzido por recombinação. Qualquer dos métodos pode ser alcançado de forma convencional.

Um conjugado da invenção pode compreender um só péptido; neste caso as unidades de péptido ao longo de toda a cadeia do polissacárido são idênticas umas às outras. Também pode compreender vários péptidos e. g., tendo epitopos diferentes. É, contudo, preferido um número limitado de: não mais de 6 e de um modo mais preferido 2 ou 3. Enquanto um primeiro péptido tem um epitopo dependente de T, um segundo péptido pode ter um 13 epitopo B.

Os polissacáridos utilizados nos conjugados da presente invenção podem ser de qualquer tipo. Numa forma de realização da invenção, os conjugados são feitos para fins de vacinas e, portanto, os polissacáridos adequados são polissacáridos capsulares, polissacáridos derivados de lipopolissacáridos (LPS ou LOS) da parede celular de bactérias Gram negativas, como a 0-cadeia lateral especifica e também polissacáridos das paredes celulares de fungos. Por exemplo, os polissacáridos podem derivar de bactérias incluindo Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, Staphylococci, Streptococci, particularmente S. pneumoniae, Klebsiellae, e. g., K. pneumoniea, Salmonella, e. g., S. typhi e paratyphi, Escherichia coli Κχ, Κχοο, 0157:H7,

Neisseriae, e. g., N. meningitidis, Shigellae, e. g., S. dysenteriae, somnei e flexneri, Haemophilus, e. g., H. influenzae tipo b, e de fungos como Candida, Cryptococcus neoformans e Hansenula.

Os polissacáridos são constituídos por unidades de repetição. Para utilização em conjugados da invenção, um polissacárido compreende, pelo menos, 4 unidades de repetição, de um modo preferido até 3000. Especialmente para utilização como ingrediente de vacinas, um polissacárido é, de um modo preferido constituído por 4 a 1000 unidades de repetição, de um modo mais preferido de 7 a 700 unidades de repetição, de um modo ainda mais preferido de 50 a 200 unidades de repetição.

Uma unidade de repetição é característica de um dado polissacárido e, assim, a composição e peso molecular da unidade de repetição vai variar muito de um polissacárido para outro. 14

Por exemplo, enquanto que a unidade de repetição da maioria dos polissacáridos capsulares compreende grupos hidroxilo e carboxilo, alguns deles contêm grupos amina (e. g., serotipo 1 de Streptococcus pneumoniae), outros não (por exemplo serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae), alguns deles contém N-acetilos (e. g.r serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae), outros não (e. g., serotipo 6B de Streptococcus pneumoniae). Também a titulo de exemplo, o peso molecular de polissacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae tipos 3 e 4 são, respectivamente, de 360 e 847. Assim, não há correspondência geral entre a quantidade de unidades de repetição e o peso molecular do polissacárido que pode ser globalmente aplicado, independentemente da composição do polissacárido. Contudo, pode indicar-se independentemente que um polissacárido para utilização na presente invenção tem um peso molecular preferido na gama média de 10000 a 500000. O peso molecular de um polissacárido é sempre expresso como um valor médio, uma vez que um polissacárido é constituído por uma população de moléculas de tamanho heterogéneo.

Os polissacáridos podem ser sintetizados quimicamente ou purificados a partir de uma fonte natural, se esta existir, de acordo com métodos convencionais. Por exemplo, no caso de polissacáridos bacterianos ou fúngicos, estes últimos podem ser extraídos dos microrganismos e tratados para remover as moléculas tóxicas, se necessário. Um método particularmente útil foi descrito por Gotschlich et ai., J. Exp. Med. (1969) 129: 1349.

Os polissacáridos podem ser utilizados como sintetizados ou purificados. Também podem ser despolimerizados antes da utilização. De facto, os polissacáridos capsulares nativos têm, 15 geralmente, um peso molecular superior a 500000. Quando é preferido utilizar polissacáridos capsulares de peso molecular mais baixo e. g., 10000 a 20000 em média, os polissacáridos tal como purificados podem ser submetidos a fragmentação. Para este fim, estão disponíveis métodos convencionais; e. g., o documento WO 93/7178 descreve um método de fragmentação por oxidação redutiva.

Os grupos hidroxilo, carboxilo ou amina do polissacárido que estão envolvidos na ligação podem ser grupos funcionais nativos. Alternativamente, podem ter sido introduzidos artificialmente por tratamento especifico.

Os grupos amina podem ter sido criados por hidrólise ácida ou básica controlada de grupos N-acilo nativos e. g., grupos N-acetilo.

Os grupos funcionais amina também podem ter sido introduzidos por derivatização com uma unidade espaçadora ligada aos grupos amina, hidroxilo ou carboxilo nativos, sendo preferidos estes dois últimos para este fim. Tipicamente, o espaçador é uma molécula bifuncional que é capaz de reagir numa extremidade com os grupos hidroxilo, carboxilo ou amina nativos do polissacárido e na outra com o ligante. Assim o espaçador proporciona um grupo amina funcional.

Os compostos a ser utilizados como espaçadores ou ligantes são aqui adicionalmente definidos adiante. Contudo, fica já indicado que o ligante é uma molécula bifuncional que tem um comprimento apropriado de modo a que as unidades de péptido e polissacárido não interfiram uma com a outra, e g., quando apresentadas ao sistema imune. A unidade ligante está com 16 vantagem ligada ao resíduo de cisteína do péptido através de uma ligação tio éter e a grupos hidroxilo do polissacárido através de uma ligação éter ou éster, a grupos amina através de uma ligação amida ou carbamato, a grupos carboxilo através de uma ligação éster, amida ou carbamato. A natureza e intensidade da resposta imune que pode ser potenciada por uma vacina conjugada da invenção, podem ser grandemente influenciadas pela razão péptidorpolissacárido. É essencial que os epitopos B presentes no polissacárido e os epitopos dependentes de T transportados pelo péptido estejam disponíveis e sejam correctamente apresentados ao sistema imune. Assim, ambos os tipos de epitopos têm de estar presentes em quantidade suficiente e equilibrada de modo a evitar, por exemplo, impedimento estereoquímico dos epitopos do polissacárido pelas unidades peptídicas. De modo a optimizar a resposta imune, é indicado que é adequada uma razão de 1 mole de péptido por 1 a 50 moles de unidades de repetição. De um modo preferido, esta razão é de 1 mole de péptido por 3 a 30 moles de unidades de repetição; de um modo mais preferido, esta razão é de 1 mole de péptido por 5 a 20 moles de unidades de repetição.

Os conjugados da invenção são particularmente úteis no domínio da vacinação para eliciar uma resposta imune protectora de longo prazo contra um microrganismo patogénico do qual é derivado o polissacárido imunogénico.

Portanto, a invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de um conjugado da invenção, conjuntamente com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Também pode conter outros ingredientes, como um 17 adjuvante, e. g., um composto de alumínio. Os compostos de alumínio adequados incluem hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio. Numa forma de realização preferida, não é necessário utilizar um adjuvante para melhorar a imunogenicidade de um conjugado da invenção. Uma composição de acordo com a invenção pode ser administrado por qualquer via convencional em utilização no campo das vacinas. A escolha da via de administração depende de uma série de parâmetros, tal como o adjuvante utilizado.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um processo para conjugação de um péptido que tem, pelo menos, seis resíduos de aminoácidos, de pelo menos um dos quais é um resíduo de cisteína, a uma cadeia de polissacárido, i. a. uma cadeia de polissacárido imunogénica, compreendendo pelo menos, quatro unidades de repetição, que compreende o acoplamento do péptido a um ligante através do grupo tiol do resíduo de cisteína e acoplamento do polissacárido ao referido ligante através (a) dos grupos amina, hidroxilo ou carboxilo nativos da cadeia de polissacárido ou (b) dos grupos amina criados por hidrólise dos grupos N-acilo nativos da cadeia de polissacárido ou (c) dos grupos funcionais introduzidas na cadeia de polissacárido por derivatização com uma unidade espaçadora ligada aos grupos amina, hidroxilo ou carboxilo nativos da cadeia de polissacárido.

Um processo preferido é primeiro fazer reagir o ligante com o polissacárido ou um polissacárido derivatizado que proporciona um polissacárido activado, i. e. um polissacárido que tem uma molécula de ligante que proporciona um grupo funcional para o acoplamento ao péptido. Num segundo passo, faz-se reagir este polissacárido activado com o péptido onde o grupo funcional do 18 ligante, í. e. Ri, reage com o grupo tiol de um resíduo de cisteína do péptido.

Um processo vantajoso de acordo com a invenção compreende fazer reagir o polissacárido com um ligante bifuncional em condições que permitem a introdução de unidades de ligante no polissacárido numa quantidade suficiente de modo que no passo (ii) do processo, é produzido um conjugado que contém um mole de péptido por 1 a 50 moles de unidades de repetição, de um modo preferido um mole de péptido por 3 a 30 moles de unidades de repetição, de um modo mais preferido, um mole de péptido por 5 a 20 moles de unidades de repetição. De modo semelhante, o processo alternativo compreende fazer reagir o polissacárido com um péptido activado em condições que permitem a introdução de unidades de péptido activado no polissacárido numa quantidade suficiente tal que no passo (iv) do processo é produzido um conjugado que tem as características aqui descritas acima.

Os compostos que são úteis como ligante incluem ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleiimido-metilo), butirato de N-succinimidil-4-(4-maleiimido-fenilo), 4-maleiimido-butirato de N-succinimidilo, 3-maleiimido-benzoato de N-succinimidilo. invenção incluem diamino-hexano, semicarbazida e

Compostos úteis como espaçador na presente cisteamina, cisteína, diaminas, e. g., di-hidrazida do ácido adípico (ADH), ureia, cistamina.

Quando introduzidos cisteamina é utilizada como grupos tiol no polissacárido. espaçador, são Neste caso, os 19 ligantes úteis a serem utilizados em combinação incluem, por exemplo, compostos de bis maleimidilo, tal como bis maleimido hexano.

Para se obter um conjugado que apresenta uma razão péptido:polissacárido apropriada como aqui descrito acima, está dentro dos conhecimentos de um especialista na matéria testar um ajuste de condições reaccionais e. g., a concentração dos reagentes envolvidos na derivatização e/ou passos de activação. São proporcionadas outras orientações como se segue:

Quando se faz reagir os grupos amina do polissacárido, a reacção é de um modo preferido realizada na presença de um composto carbodiimida e. g., cloridrato de (3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (EDAC) a um pH de 4 a 7, desde que o grupo funcional do ligante ou do espaçador que está envolvido na reacção seja carboxilo.

Quando se faz reagir os grupos carboxilo do polissacárido, a reacção é, de um modo preferido, realizada na presença de um composto carbodiimida como acima, desde que o grupo funcional do ligante ou do espaçador que está envolvido na reacção seja um grupo amina. A razão molar de unidades de repetição do polissacárido:carbodiimida está, com vantagem, na gama de 0,2 a 1, de um modo preferido, na gama de 0,1 a 1, de um modo mais preferido na gama de 0,2 a 0,6. Como pode ser facilmente compreendido, por ajustamento desta razão pode ser controlada a quantidade de unidades de péptido por unidades de repetição.

Quando os grupos amino do polissacárido reagem com 20 succinimidilo, a reacção é, com vantagem, realizada a pH de 6 a 9, de um modo preferido, a de cerca de 7,5. Quando se utiliza condições experimentais apropriadas (e. g., excesso de ligante), a reacção é praticamente imediata i. e., dentro de cerca de 5 min. Se o polissacárido utilizado na reacção for um polissacárido nativo que tem grupos amina, a única possibilidade de controlar a quantidade de substituição por grupos succinimidilo é utilizar condições experimentais adversas (caso contrário, a reacção ocorre imediatamente e todos os grupos amina são substituídos), tal como uma maior diluição do meio reaccional ou uma baixa quantidade de ligante. Isto permite ajustar a razão de péptido para unidades de repetição na gama apropriada. Se se utilizar hidrólise ou derivatização para introduzir grupos amina no polissacárido, esta razão pode ser facilmente controlada por controlo do aparecimento dos grupos amina no polissacárido.

Quando são feitos reagir grupos hidroxilo do polissacárido, a reacção é conseguida, de um modo preferido, na presença de um composto cianogénio, a pH desde 8 a 12, se este composto é o brometo de cianogénio; ou a pH desde 6 a 10, de um modo preferido desde 6 a 8, se o composto é o tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio. A razão molar unidades de repetição do polissacárido: composto cianogénio é, vantajosamente, no intervalo de 0,1 a 3, de um modo preferido no intervalo de 0,1 a 2.

Por realização do método da invenção, é obtido um conjugado em que unidades de polissacárido e de péptido estão ligadas através de uma unidade de ligante ou uma combinação de espaçador e de ligante, em que o ligante ou a unidade ligante/espaçador tem um comprimento óptimo e em que a ligação polissacárido- 21 péptido é estável. Além disso, é obtido um conjugado em que a razão de péptido para unidades de repetição de polissacárido é ideal para fins de imunização. A invenção é adicionalmente ilustrada como se segue: EXEMPLO 1: Preparação de um péptido 105 mer sintético com a seguinte sequência:

Cys Leu Tyr Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser

Gly Gly Ser Vai Asn Ala Pro Met Pro Glu Asn Gly Gin Thr Glu

Asn Asn Asp.Trp Ile Leu Met Gly Ser Thr Gin Glu Glu Ala Lys

Lys Asn Ala Met.Asn His Lys Asn Asn Gin Arg Ile Ser Gly Phe

Ser Gly Phe Phe Gly.Glu Glu Asn Gly Lys Gly His Asn Gly Ala

Leu Asn Leu Asn Phe Asn.Gly Lys Ser Ala Gin Asn Arg Phe Leu

Leu Thr Gly Gly Thr Asn Leu.Asn Gly Lys Ile Ser Vai Thr Gin

Gly

O péptido foi sintetizado utilizando uma química FastMoc com um sintetizador de péptidos automatizado (modelo 431A, Applied Biosystems). A fase sólida era uma resina Rink (0,13 mM

TentaGel S RAM Spezial, 0,15 mM g 1, Rapp Polymere, Tubingen,

Alemanha), que dá um péptido capeado com amida C-terminal. A síntese utiliza aminoácidos protegidos com Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil) com protecção lateral com O-t-butil- (para ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e o grupo tirosino carboxilo ou hidroxilo), tritil-(para o grupo amina ou imino de histidina, asparagina e glutamina); t-butiloxicarbonil- (para o grupo amina da lisina), ou PMC (pentametilcromano-6-sulfonil) (para o grupo imina da 22 arginina). A activação e o acoplamento foram realizados na presença de hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-3,3, 3- tetrametilurónio (HBTU)/diisopropiletilamina. Nos ciclos 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 e 104- 105, foi realizado o duplo acoplamento e os grupos amina livres foram bloqueados por acetilação com anidrido acético. Após o último ciclo, o péptido foi desprotegido com piperidina e o produto final foi acetilado N-terminalmente utilizando anidrido acético. A desprotecção da cadeia lateral e clivagem do suporte de resina foram realizadas com 1,2-etanoditiol a 2,1% (v/v), tioanisole a 4,2% (v/v), água a 4,2% (v/v), fenol a 6,2% (v/v) e ácido trifluoroacético (TFA) a 83% (v/v) durante 3 horas à temperatura ambiente. A resina foi removida por filtração e adicionou-se trietilsilano gota a gota até a solução ficar incolor. A solução foi, então, incubada durante 3 horas à temperatura ambiente. 360 mg de péptido em bruto foram recuperados após precipitação com éter t-butil metilico a que se seguiu centrifugação e liofilização. Dissolveu-se 130 mg do péptido em bruto em 40 mL de etilmorfolina 50 mM, pH 8,3 contendo ditiotreitol 50 mM e incubou-se, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. O pH foi ajustado para 3,5 com TFA a 10% e o péptido foi purificado por HPLC de fase inversa (Pep-S, C2/C18, tamanho do poro 100 Á, 12 pm 22,5 mm x 25 cm, Pharmacia) utilizando um gradiente (25 a 45% (v/v) de -1 -1 acetomtnlo, TFA a 0,1% (10 mL min , gradiente de 0,33% min O péptido eluiu como um pico a cerca de 25% de acetonitrilo, e o pico foi liofilizado (73 mg) antes de utilização adicional. Uma 23 análise por HPLC e espectrometria de massa mostrou que mais de 65% do produto final correspondia à sequência desejada. A sequência N-terminal foi confirmada por sequencial de Edman N-terminal da amostra retirada antes da acetilação N-terminal. EXEMPLO 2: Conjugado de polissacárido do serogrupo C de N. meningitidis-péptido

Um pó seco de polissacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis, daqui em diante referido como polissacárido C, foi obtido por um processo de extracção como descrito por Gotschlich et al., J. Exp. Med. (1969) 129: 1349. Cem mg de polissacárido C foram dissolvidos em NaCl 0,2 M até uma concentração final de 11,1 mg/mL (solução A). Em paralelo, foi preparada uma solução de di-hidrazida do ácido adipico (ADH) 0,2 M em NaCl 0,2 M (solução B) . Também foi preparada uma solução 0,5 M de etil dimetil aminopropil carbodiimida (EDAC) em NaCl 0,2 M (solução C). Nove mL de solução A, 10 mL de solução B e 1 mL de solução C são misturados para dar uma preparação contendo 5 mg/mL de polissacárido C, ADH a 0,125 M e EDAC a 0,025 M. Adicionou-se HC1 0,1 M para ajustar o pH a 6,5, este pH foi mantido durante todo o período de reacção de 45 minutos. A temperatura era cerca de 20 °C. A reacção foi parada por 40 pL de NaOH 0,1 N que aumentaram o pH para 7,1. A mistura reaccional foi dialisada contra NaCl 0,5 M, fosfato 10 mM e depois água e subsequentemente foi liofilizada. O tamanho do polissacárido C derivatizado foi controlado numa coluna de HPCL de exclusão TSK 4000 (fabricante Tosohaas). 24

Os resultados demonstraram que não tinha ocorrido despolimerização durante a derivatização.

Durante a derivatização, cerca de 3,4% de unidades de repetição foram derivatizadas com um grupo NH2. 0 produto liofilizado foi dissolvido em tampão fosfato 0,02 M, pH 7, até uma concentração de 6,25 mg/mL e desgaseifiçado. O éster N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GBMS) foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) sob azoto numa concentração de 25 mg/mL e em seguida adicionado ao polissacárido C derivatizado em igual quantidade. A mistura reaccional foi agitada durante 90 minutos à temperatura ambiente em atmosfera de azoto. O polissacárido C activado foi purificado por cromatografia em coluna de exclusão em Sephadex G50. A fracção de exclusão foi recuperada e concentrada até cerca de 7,5 mg/mL por ultrafiltração (membrana Amicon 30K). A solução concentrada foi desgaseifiçada.

Vinte mg de péptido obtido como no Exemplo 1 foram dissolvidos em água numa concentração de 10 mg/mL sob azoto. Um mL e meio da solução de péptido foi adicionado a 1,2 mL da preparação contendo 0 polissacárido C activado, de modo que a razão de (resíduos maleiimido)/(resíduos tiol) ascendesse a 2. As misturas reaccionais foram mantidas, de um dia para o outro, com agitação, à temperatura ambiente. Em seguida, os resíduos maleiimido que não reagiram foram inactivados por adição de 0,010 mL de mercaptoetanol. O produto conjugado foi purificado numa coluna de Sepharose 4BCL. As fracções eluídas foram analisadas quanto à presença de 25 sacáridos (ácido siálico) e péptidos. As fracções que responderam positivamente em ambos os ensaios foram combinadas. A quantidade de resíduos de ácido siálico foi determinada de acordo com o método de doseamento descrito em Svennerholm L., Biochem. Biophys. Acta (1957) 2_4: 604 e a quantidade de péptido foi determinada de acordo com o método de Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. Foi demonstrado que a razão (péptido)/(unidades de repetição do polissacárido C) mole/mole era 1:18 (correspondente a uma razão peso/peso de 1,8:1). EXEMPLO 3: Conjugado de polissacárido de S. pneumoniae-péptido

Um pó seco de polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae de tipo 4, daqui em diante referido como polissacárido Pneumo 4, é obtido por um processo de extracção como descrito no pedido de patente WO 82/01995 "Procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins à base de polyosides ainsi purifiés". Cem mg de polissacárido Pneumo 4 foram dissolvidos em NaCl 0,2 M até uma concentração final de 11,1 mg/mL (solução A). Em paralelo, foi preparada uma solução de di-hidrazida de ácido adípico (ADH) em NaCl 0,2 M numa concentração de 0,25 M (solução B) . Também se preparou uma solução de etil dimetil aminopropil carbodiimida (EDAC) em NaCl 0,2 M numa concentração de 0,5 M (solução C) . Misturou-se 9 mL de solução A, 10 mL de solução B e 1 mL de solução C para dar uma preparação contendo 5 mg/mL de polissacárido Pneumo 4, ADH a 0,125 M e EDAC a 0,025 M. Adicionou-se HC1 1 N até pH 4,9; este pH foi mantido durante todo o período de reacção de 30 minutos. A temperatura era cerca 26 de 25 °C. A reacção foi parada por adição de 0,28 mL de NaOH 1 N. O pH foi aumentado para 7,5. A mistura reaccional foi dialisada contra NaCl 0,5 M e depois água e posteriormente foi liofilizada. O tamanho do polissacárido Pneumo 4 derivatizado foi controlado numa coluna de HPLC de exclusão TSK 4000 (fabricante Tosohaas). Não ocorreu despolimerização durante a derivatização.

Durante a derivatização, cerca de 8,2% de unidades de repetição do polissacárido Pneumo 4 foram derivatizadas com um grupo -NH2. O produto liofilizado foi dissolvido em NaCl 0,05 M na concentração de 2,76 mg/mL e desgaseifiçado. O éster N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GBMS) foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) sob azoto numa concentração de 25 mg/mL. Adicionou-se 1,75 mL da solução de GMBS a 16 mL da solução de polissacárido sob azoto. A mistura reaccional foi deixada com agitação, durante 5 horas, a temperatura ambiente em atmosfera de azoto. O polissacárido Pneumo 4 activado foi purificado numa coluna de exclusão em Sephadex G50. A fracção de exclusão foi recuperada e concentrada até cerca de 7 mg/mL numa membrana 30K (Amicon). A solução concentrada foi desgaseifiçada.

Vinte mg de péptido obtido como no Exemplo 1 foram dissolvidos em NaCl 0,1 M, tampão fosfato 0,01 M pH 7,5, numa concentração de 4,6 mg/mL sob azoto. Por um lado, 2,2 mL da solução de péptido foram adicionados a 1,25 mL de preparação 27 contendo o polissacárido Pneumo 4 activado, de modo que a razão (resíduos maleiimidilo)/(grupos tiol) fosse igual a 1 (conjugado de Pneumo 4-péptido-l). As misturas reaccionais foram mantidas, durante 6 horas, com agitação à temperatura ambiente em atmosfera de azoto, depois, de um dia para o outro, a +4 °C. Em seguida, os resíduos maleiimidilo que não reagiram foram inactivados por adição de 0,005 mL de mercaptoetanol a cada mistura reaccional.

Os conjugados foram purificados numa coluna de Sepharose 4BCL. As fracções eluídas foram analisadas quanto à presença de açúcares e péptidos. As fracções que responderam positivamente em ambos os ensaios foram combinadas. A quantidade de açúcar foi determinada de acordo com o método de doseamento descrito em Dubois et al., Anal. Chem. (1956) 3_: 350, e a quantidade de péptido foi determinada de acordo com o método de Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. A razão (unidades de repetição de (péptido/polissacárido) mole/mole é de 1:30 para o conjugado de Pn 4-péptido-l (que corresponde a uma razão p/p de 0,4:1). EXEMPLO 4: Conjugado de polissacárido do serogrupo Ά de N. meningitidis-péptido

Um pó seco de polissacárido capsular de Neisseria meningitidis do serogrupo A, designado polissacárido A, a seguir, é obtido por um processo de extracção, como descrito por Gottschlich et al., J. Exp. Med. (1969) 129 1349. Cento mg de polissacárido A foram dissolvidos em água numa concentração final de 5 mg/mL (solução A) . Em paralelo, foi preparada uma 28 solução de brometo de cianogénio (CNBr) em água numa concentração de 67 mg/mL (solução B) . Também foi preparada uma

solução de di-hidrazida do ácido adipico (ADH) em NaHCC>3 0,5 M numa concentração de 150 mg/mL (solução C). Vinte da solução A e 0,75 mL de solução C foram misturados para dar uma preparação com uma razão de polissacárido/CNBr peso/peso que é igual a 1. Adicionou-se NaOH 0,1 N até um pH de 10,8; este valor de pH foi mantido durante todo o período de reacção de 60 minutos. A temperatura era de cerca de 20°C.

Em seguida o pH foi diminuído para 8,5 por adição de 0,15 mL de HC1 0,1 N. Dezassete mL de solução C foram adicionados para que o a razão ADH/polissacárido peso/peso fosse igual a 3,5. O pH foi mantido durante 15 minutos. Em seguida a mistura reaccional foi deixada de um dia para o outro com agitação a + 4°C. Adicionou-se 0,1 mL de HC1 1 N para diminuir o pH para 7. A mistura reaccional foi dialisada contra NaCl 0,5 M e depois água e posteriormente foi liofilizada. O tamanho do polissacárido A derivatizado foi controlado numa coluna de HPLC de exclusão TSK 4000 (fabricante Tosohaas). Não ocorreu despolimerização no decurso da derivatização.

Durante a derivatização, cerca de 2,5% de unidades de repetição de polissacárido A foram derivatizados com um grupo -NH2.

Em seguida o processo de Exemplo 2 foi utilizado para activar o polissacárido A derivatizado e para conjugar o polissacárido activado ao péptido obtido como no Exemplo 1. 29 EXEMPLO 5: Estudos de imunogenicidade com o conjugado do serogrupo C de N. meningitidis obtido no Exemplo 2 A utilidade do péptido do Exemplo 1 como transportador num conjugado com polissacárido é demonstrada como a seguir.

Murganhos NMRI de seis semanas receberam por via subcutânea uma das seguintes composições num volume de 0,5 mL (cada injecção) e por via intraperitoneal, caso em que foi utilizado um adjuvante: a) 5 pg de polissacárido C (sem péptido) nos dias 1, 15 e 29, na ausência de adjuvante, b) 5 pg de polissacárido C (sem péptido) conjuntamente com adjuvante complete de Freund no dia 1, e nos dias 15 e 29 conjuntamente com adjuvante incompleto de Freund, c) 5 pg de polissacárido C e 9 pg de péptido conjuntamente com adjuvante complete de Freund no dia 1, e nos dias 15 e 29 conjuntamente com adjuvante incompleto de Freund, d) o conjugado obtido no Exemplo 2 contendo 1 pg de polissacárido C e 1,8 pg de péptido, nos dias 1, 15 e 29 na ausência de adjuvante, (e) o conjugado obtido no Exemplo 2 contendo 5 pg de polissacárido C e 9 pg de péptido, nos dias 1, 15 e 29 na ausência de adjuvante, (f) o conjugado obtido no Exemplo 2 contendo 5 pg de polissacárido C e 9 pg de péptido conjuntamente com adjuvante 30 completo de Freund, no dia 1 e, nos dias 15 e 29, o conjugado obtido no Exemplo 2, conjuntamente com adjuvante incompleto de Freund; e g) um conjugado de 5 pg de polissacárido C, conjuntamente com anatoxina da difteria (DT) .

Nos dias 15, 29 e 43 (calculados a partir do dia da primeira imunização), é colhida uma amostra de sangue e os anticorpos anti-polissacárido C são titulados por ELISA. Os resultados estão sumariados na tabela seguinte.

Tabela 1

Composto injectado Dose de polissacárido injectada (pg) Dose de péptido injectada (ug) Dia após a imunização Amostra de sangue colhida no dia Titulo de anticorpo anti-polissacárido (unidade ELISA) 1 15 10 (a) 5 15 29 32 29 43 115 1 15 22 (b) 5 15 29 39 29 43 74 1 15 24 (c) 5 9 15 29 34 29 43 47 1 15 32 (d) 1 1,8 15 29 1052 29 43 630 1 15 56 (e) 5 9 15 29 321 29 43 516 1 15 1006 (f) 5 9 15 29 2854 29 43 2492 1 15 13 (g) 5 15 29 1197 29 43 1531 31 A resposta de anticorpos ao polissacárido C não conjugado é extremamente fraca em cada caso e não aumenta com o tempo, enquanto a resposta ao polissacárido C conjugado com DT ou com o péptido é satisfatória. Com o conjugado da presente invenção é obtido um efeito de reforço após a segunda injecção, sendo uma indicação de uma resposta imune persistente. A resposta do conjugado de polissacárido-péptido C é equivalente à resposta obtida com o conjugado de polissacárido C-DT. EXEMPLO 6: Estudos de imunogenicidade com o conjugado de S. pneumoniae obtido no Exemplo 3 0 conjugado preparado no Exemplo 3 com uma razão (p/p) de péptido para polissacárido de 0,4:1 (correspondente a uma razão de péptido por unidades de repetição de 1:30 (mole/mole)) foi testada em murganhos utilizando o protocolo do Exemplo 5. Era imunogénico em murganhos na presença de adjuvante e resultou num efeito de reforço após a segunda injecção. Os resultados estão aqui apresentados a seguir na Tabela 2. 32

Tabela 2

Composto injectado

Dose de polissacárido injectada (hg)

Dose de péptido injectada(hg)

Dia após a imunização

Amostra de sangue colhida no dia PS tipo Pneumo 4 + adjuv. PS tipo Pneumo 4 + péptido + adjuv. Con j . péptido Pn4-1 + adjuv. Soro fisiológico 5 5 5 1 15 29 15 29 43

Titulo de anticorpo anti- polissacárido (unidade ELISA) <10 <10 <10 1,9 1,9 1 15 29 1 15 29 1 15 29

Lisboa, 29 de Janeiro de 2010 15 29 43 15 29 43 15 29 43 ~18 ~24 <10 ~61 458 2601 <10 <10 <10 33

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para conjugação de (i) um péptido contendo, pelo menos, seis resíduos de aminoácidos, sendo, pelo menos um deles, um resíduo de cisteína, a (ii) um polissacárido compreendendo, pelo menos, quatro unidades de repetição, compreendendo o referido processo: (i) Activação do polissacárido com um ligante bifuncional de fórmula R1-A-R2, em que Rl é um grupo maleimidilo, A é uma cadeia carbonada aromática ou alifática substituída ou não, e R2 é um grupo succinimidilo, de modo que R2 reage com os grupos amina do polissacárido e obtendo um polissacárido activado; e (ii) Conjugação do polissacárido activado com o péptido, de modo que Rl reage com o grupo tiol do resíduo de cisteína e é obtido um conjugado, em que uma pluralidade de entidades peptídicas são introduzidas aleatoriamente ao longo de toda a cadeia do polissacárido por ligação covalente; ou (i) Derivatização do polissacárido com um espaçador de fórmula (II) R3-B-R4, em que R3 é um grupo funcional capaz de reagir com grupos amina, carboxilo ou hidroxilo, B é uma cadeia carbonada 1 aromática ou alifática e R4 é um grupo amina, de modo que R3 reage com os grupos amina, carboxilo ou hidroxilo do polissacárido e é obtido um polissacárido derivatizado, em que uma pluralidade de entidades espaçadoras são introduzidas aleatoriamente ao longo de toda a cadeia do polissacárido; (ii) Activação do polissacárido derivatizado com um ligante bifuncional de fórmula R1-A-R2, em que Rl é um grupo maleimidilo, A é uma cadeia carbonada aromática ou alifática substituída ou não, e R2 é um grupo succinimidilo, de modo que R2 reage com R4 obtendo um polissacárido activado; e (iii) Conjugação do polissacárido activado com o péptido de modo que Rl reage com o grupo tiol do resíduo de cisteína do péptido e é obtido um conjugado, em que uma pluralidade de entidades peptídicas são introduzidas aleatoriamente ao longo de toda a cadeia do polissacárido por ligação covalente.
2. 2. Processo de acordo com reivindicação 1, em que o péptido contém de seis a duzentos resíduos de aminoácidos, incluindo o resíduo de cisteína.
3. 3. Processo de acordo com reivindicação 2, em que o péptido contém de quinze a cem resíduos de aminoácidos, incluindo o resíduo de cisteína.
4. 4. Processo de acordo com reivindicação 3, em que o péptido contém de vinte a cinquenta resíduos de aminoácidos, 2 incluindo o resíduo de cisteína.
5. 5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o resíduo de cisteína está localizado na extremidade N- ou C-terminal do péptido.
6. 6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que em que o péptido contém um epitopo dependente de T.
7. 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o polissacárido é um polissacárido nativo seleccionado da cadeia específica de 0 de lipopolissacáridos bacterianos, lipopolissacáridos bacterianos destoxifiçados e polissacáridos capsulares.
8. 8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o polissacárido é derivado de um polissacárido nativo compreendendo grupos N-acetilo, por hidrólise ácida ou básica controlada.
9. 9. Processo de acordo com reivindicação 7 ou 8, em que o polissacárido é derivado de um polissacárido nativo seleccionado de um polissacárido capsular.
10. 10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o polissacárido é constituído por 4 a 3000 unidades de repetição.
11. 11. Processo de acordo com reivindicação 10, em que o polissacárido é constituído por 4 a 1000 unidades de repetição 3
12. 12. Processo de acordo com reivindicação 11, em que o polissacárido é constituído por 7 a 700 unidades de repetição.
13. 13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, em que o ligante de fórmula (I) é seleccionado do grupo consistindo em ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleiimido-metilo), butirato de N-succinimidil-4-(4-maleiimido-fenilo), 4-maleiimido-butirato de N-succinimidilo, 3-maleiimido-benzoato de N-succinimidilo e éster N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS).
14. 14. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, em que o espaçador de fórmula (II) é di-hidrazida do ácido adípico (ADH).
15. 15. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, em que é realizada conjugação, de modo que o conjugado dela obtido contém desde um mole de péptido para cinquenta moles de unidades de repetição (1:50) até um mole de péptido para um mole de unidades de repetição (1:1).
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que é realizada conjugação, de modo que o conjugado dela obtido contém desde um mole de péptido para trinta moles de unidades de repetição (1:30) até um mole de péptido para três moles de unidades de repetição (1:3).
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que é realizada conjugação, de modo que o conjugado dela obtido contém desde um mole de péptido para vinte moles de unidades de repetição (1:20) até um mole de péptido para 4 cinco moles de unidades de repetição (1:5).
18. 18. Composição farmacêutica compreendendo um conjugado produzido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, conjuntamente com um diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
19. 19. Composição de acordo com a reivindicação 18, que não compreende qualquer adjuvante.
20. 20. Conjugado produzido pelo processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, para indução de uma resposta imune contra a unidade de polissacárido do conjugado. Lisboa, 29 de Janeiro de 2010 5