JP4290766B2 - 多糖―ペプチド複合体 - Google Patents
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Description
本発明は、多糖−ペプチド複合体（conjugate）およびその製造法に関する。本発明の格別な具体例において、該複合体は、細菌性または真菌性多糖類を使用しており、したがって、ワクチンとして有用である。
多糖類は、種々の技術分野で有用な高分子物質の１つの広いファミリーを構成している。いくつかの場合では、それらを、例えば、蛋白質またはペプチドのようなポリペプチドと結合させることが要求される。例えば、多糖類はペプチド試薬用のマトリックス媒体として診断または精製技術で使用されている。デキストランのような非免疫原性多糖類も、ＥＰ３２６１１１に記載されているように免疫系に小ペプチドを与えるのに有用である。実際、ペプチドは、蛋白質担体に結合させるか、アジュバントと共に投与すべきであり、最も一般的なアジュバントはアルミニウム化合物である。しかしながら、これらのアジュバントと、混合、吸着または沈澱させた小ペプチドはアルミニウムゲルによって妨害されることがあり、そのため、免疫系に利用できない。この問題を克服するため、ＥＰ３２６１１１は、ペプチドを非免疫原性多糖と結合（conjugate）させることができることを教示している。アルミニウム化合物の存在下で、このような複合体は、該ペプチド部分に対する免疫応答を惹起することができる。
ワクチンの分野でも、例えば、ペプチドまたは蛋白質のようなポリペプチドを免疫原性多糖類と結合させることに高い関心が寄せられており、該多糖類に対する免疫応答が追求されている。事実、細菌の莢膜および細胞壁（真菌の細胞壁も）は、哺乳動物には通常見られないエピトープ・モチーフを有し、免疫原性を伝達できる非常に特異的な繰り返し単位から構成される多糖類を必須として構築されている。したがって、例えば、莢膜多糖類のような多糖類は、髄膜炎、肺炎、腸チフスのような細菌性疾患に対するワクチンとして既に使用されている。
しかしながら、多糖類をワクチンとして使用する場合、１つの大きな問題がある。多糖類が免疫原性であること、すなわち、換言すれば、多糖類は、それ自体哺乳動物に投与すると、たとえ、不十分であっても、免疫応答を惹起することが証明されているが、多糖類は、それらがＴ−細胞の助けなしにＢ−細胞産生を誘発できる数少ない抗原に属する点で特異的である。したがって、多糖類はＴ−独立性と呼ばれる。
Ｔ−独立性抗原によって誘発される免疫応答は多くの態様によって特徴付けられ、とりわけ、
（ｉ）一次応答が、Ｔ−依存性抗原に対する応答よりも弱く、早い；
（ii）抗体応答が、Ｔ−依存性抗原で見られるような親和性増加を伴う高ＩｇＧ産生に成熟しない；
（iii）Ｔ−独立性抗原に対応する免疫記憶は乏しく、免疫記憶はワクチン接種原理の根底を構成する二次免疫応答のキイであるので、Ｔ−独立性抗原は、長期の保護免疫応答を誘発するためには不十分な抗原である；および
（iv）幼児は、１または２歳前は、多糖類に対して応答できない。
二次免疫応答を誘発させるためには、Ｔ−独立性抗原は、ジフテリアまたは破傷風トキシンのような、抗原にＴ−依存性特性を与える担体蛋白質と共有結合させることが必要である。これらの複合体は、ついで、免疫応答を増強させるために、アルミニウム化合物またはフロインドの完全もしくは不完全アジュバント（後の２つは、もっぱらヒト以外の哺乳動物に使用される）のようなアジュバントで補足してもよい（アジュバント効果）。
「担体」なる用語は、抗原、例えば、多糖に共有結合した場合に、該抗原に対するＴ−依存性応答を促進できる分子を意味する。そのような応答は、抗原−担体複合体の、日、週または月を分けた少なくとも２回の接種（初回免疫およびブースター）をすることからなるワクチン接種計画により示される。最初の接種（初回免疫）により、弱い抗体応答が示され、ブースター接種により、高レベルの抗体応答が惹起される。このような拡大された応答は、非結合抗原によって構成される陰性対照では見られない。
種々の結合方法が、既に当該分野において利用されている。通常関与する多糖官能性基は、鎖に沿って位置するアミノ、カルボキシルまたはヒドロキシ基か、末端または鎖に沿ったアルデヒド基よい。通常関与するポリペプチド官能性基は、末端またはアミノ酸側鎖に存在するアミノまたはカルボキシル基でよく、またはチオール基であってもよい。
一般的な方法においては、多糖複合体は、結合に関与する官能性基の多糖（鎖に沿うか、末端か）および担体の両方における位置に応じて３つの型の構造を示しうる。これらの構造型は、記載の便宜上、「太陽（Sun）」または「耳（Ear）」、「レーキ（Rake）」および「格子（Lattice）」型と称される。それらを図１に示す。図１中、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、各々、「太陽」（ネオ複合糖質）、「レーキ」および「格子」型を示す。
「太陽」型においては、多糖は、もっぱら多糖鎖の末端に位置している反応性基を介して蛋白質またはペプチドと結合している。通常、これには多糖鎖の還元性末端に位置しているカルボキシル基が関与する。蛋白質に幾つかの多糖鎖が結合でき、結合には、通常、例えば、リジン残基が有するアミノ基が関与する。そのような複合体もネオ複合糖質と定義される。例えば、この型の複合体は、Alonso de Velasco et al., Infect. Immun.（1995）63:961;Paradiso et al., Vaccine Research（1993）2（4）:239;およびJenningsの米国特許第４，３５６，１７０号で完成されている。
「レーキ」型においては、ペプチドは、多糖鎖に沿って結合している。この型の例は、Lett et al., Infect. Immun.（1995）62:785、さらに適切には、Lett et al., Infect. Immun.（1995）63:2645およびKoenen-Waisman et al., J. Immunol.（1995）:5977に記載されている。結合は、ペプチド鎖の内部または末端アミノ基の１つのリジン残基が関与する。
「格子」型においては、蛋白質および多糖が架橋している。これは、ペプチドよりも蛋白質を使用すること（通常、蛋白質に沿ってアミノまたは酸基が位置する）および多糖鎖に沿って位置する反応性基が関与することにより可能となる。この型の複合体は、Andersonの米国特許第４，６７３，５７４号に記載されている。J. Exp. Med.（1980）152:361も「格子」型を導く結合方法を記載している。これは、ＣＮＢrを使用し、リンカーとしてアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を使用する。全て多糖鎖に沿って存在するヒドロキシ基および蛋白質の側鎖アミノ酸が関与する。
これらの構造の各々が種々の結合方法で完成できる。結合は、Andersonの米国特許第４，６７３，５７４号、Jenningsの米国特許第４，３５６，１７０号、Lett et al.またはKoenen-Waisman et al.に記載の直接結合でよい。また、結合は、Schneerson et al.によって説明さていれるようなリンカー分子を使用する間接結合でもよい。リンカーに加えて、Alonso de Valsesco et al.またはParadiso et al.（肺炎球菌多糖について）に記載されるようなスペーサーも使用できる。多糖、蛋白質、リンカーおよび所望によりスペーサーに存在する種々の官能性基が関与できる。
上記で引用した幾つかの先行文献には、以下のとおり、さらに詳細に記載されている。
Alonso de Velasco et al.において、担体は、どちらかの末端に１つのシステイン残基を含む約２０アミノ酸残基のペプチドである。ストレプトコッカス・ニウモニア（Streptococcus penumoniae）１７Ｆ多糖を、まず、ＮaＣＮＢＨ3の存在下、ジアミノプロパンで還元アミノ化して還元末端を誘導体化する。この誘導体化した多糖を、リンカーとしてＮ−スクシンイミジルブロモ酢酸でブロモアセチル化し、こうして活性化された多糖を、ペプチドのＮ−またはＣ−末端の１つのシステイン残基のチオール基と結合させる。
Lett et al.（１９９４）では、エス・ミュータンス（S. mutans）またはサッカロミセス・セレビシア（Saccaromyce cerevisiae）多糖をまず、過ヨウ素酸塩で酸化して多糖鎖に沿ってアルデヒド基を形成させる。ついで、この酸化多糖を、ＮaＣＮＢＨ3の存在下、還元アミノ化によりペプチドと直接結合させる。
Paradiso et al.においては、２つの多糖類を使用する。肺炎球菌多糖およびヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）のポリリビトールリン酸（ＰＲＰ）である。肺炎球菌の酸性加水分解により、アルドース基が多糖鎖の末端に形成される。ついで、ピリジンボランの存在下、ジアミノメタンで還元アミノ化し、鎖端にアミノ基を付加する。この誘導体化された多糖を、アジピン酸のスクシンイミジルジエステルで活性化し、蛋白質またはペプチドのアミノ酸基と結合させる。ＰＲＰについては、これをまず、過ヨウ素酸塩を用いる酸化開裂に付し、両端にアルデヒド基を形成させる。ついで、酸化ＰＲＰを蛋白質およびペプチドのアミノ基と結合させる。両方の場合とも、「太陽」構造が形成される。
Koenen-Waisman et al.では、Ｖi多糖およびペプチド（どちらもシステイン残基を含有していない）または蛋白質を（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）の存在下に直接一緒に結合させている。この結合には、多糖のカルボキシル基と、蛋白質またはペプチドのアミノ基が関与している。その結果、蛋白質を使用する場合、「格子」構造が形成される。ペプチドを使用する場合、構造は、アミノ基を有するアミノ酸の数に依存する。構造は、単純な「格子」構造か、「レーキ」構造である。
容易に理解できるように、結合に関与する官能性基が全て多糖に沿って存在する場合、担体が蛋白質（蛋白質の幾つかのアミノ基またはカルボキシル基が結合に利用される）であれば、これは架橋複合体を導く。もし、ポリペプチド担体が１つの結合部位を含むのであれば（これは、十分に小さい場合、しばしば起こる）、その複合体は、「レーキ」構造を示す（もし、結合を密閉系で、ポリペプチドの１つの官能性基のみが反応するような難しい制御をすれば、これは、ポリペプチドがいくつかの結合部位を有する場合にも起こる）。結合方法が、天然のポリペプチド（またはそのフラグメント）のカルボキシル基またはアミノ基を使用する場合、カルボキシル基またはアミノ基はポリペプチド上に頻繁に存在するので、「レーキ」構造を得るためには後者は非常に少ない。
この度、システイン残基のチオール基を使用して、「レーキ」構造を簡単に製造できる結合方法を見出した。システイン残基は、リジンやアスパラギン酸よりも頻度が少ないので、この方法は大きなペプチドの結合に適している。
生物学的に製造され、または合成された場合、ペプチドは容易に精製でき、したがって、より純粋で明確であるから、担体として、ペプチドは蛋白質よりも幾つかの有利な点を有している。有害な性質（毒性）を有しうる担体蛋白質と異なり、ペプチドは担体の性質のみを発揮するようにこれらの蛋白質から誘導することができる。
しかしながら、当該分野に公知の多糖−ペプチド複合体は、対応するそれらの多糖−蛋白質複合体よりも免疫原性が少なく、明らかにアジュバントの使用が必要である。驚くべきことに、この新規方法で作った多糖−ペプチド複合体は、良好な免疫原性を有している。この点についての１つの理由は、ペプチド部分が十分なサイズを有していることである。
したがって、本発明は、
（ｉ）少なくとも６つのアミノ酸残基からなり、そのうちの少なくとも１つがシステイン残基であるペプチド部分、
（ii）少なくとも４つの繰り返し単位からなる多糖鎖、および
（iii）該システイン残基のチオール基と結合し、かつ（ａ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基、または（ｂ）該多糖鎖の天然のＮ−アシル基の加水分解で生じたアミノ基、または（ｃ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基に結合するスペーサー部分から由来する該多糖鎖に誘導された官能性基と結合したリンカー部分からなることを特徴とする、多糖が有利に免疫原性である多糖−ペプチド複合体に関する。
天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基は該繰り返し単位に見出され、したがって、全て多糖鎖に沿って存在するので、本発明の複合体は典型的にはっ上記した「レーキ」構造を示す。したがって、本発明の複合体について以下の別の同等な定義を与えることもできる。
換言すると、本発明の複合体は、繰り返し単位から構成される多糖鎖と、複数のペプチド部分とからなり、ペプチドの各部分が、システイン残基を含有し、かつ多糖鎖に沿ってランダムに、システイン残基のチオール基と、多糖のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基が関与する間接結合を介して共有結合しており、間接結合は、リンカーまたはスペーサー−リンカー部分を介して完成され、ただし、スペーサー体またスペーサー−リンカー部分が多糖のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基と結合している。
「ペプチド」なる用語は、少なくとも６個、有利には２００個以下のアミノ酸残基を有するアミノ酸鎖を意味する。ペプチドは、有利には、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも約１５個、さらに好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸残基を含有する。有利には、最大約１５０個、好ましくは最大１００個または最大約５０個のアミノ酸残基を含む。好ましいペプチド鎖は、約５０〜１５０個のアミノ酸残基を含有する。
本発明で使用するには、ペプチドは１個または数個のシステイン残基を含有してよい。システイン残基は、リンカーとペプチドの結合を提供する。結合にシステイン残基を使用することは、通常ペプチドのシステイン残基の量が低いので結合の選択性が増強される。システイン残基はペプチドの端部またはペプチド鎖の中のいずれかに存在できるが、ただし、この部位での結合がペプチドの構造および性質によって妨げられてはならない。システインの量と関係なく、１つのシステイン残基がＮ−またはＣ−末端に位置することが好ましい。
より好ましくは、ペプチドは２つのシステイン残基を含み、その各々が１端に位置するか、どちらかの端に１つのシステイン残基が存在し、この後者が最も好ましい。
ペプチドの全アミノ酸配列は天然のままでもよく、また、より大きいポリペプチドの一部でもよい。ペプチドは、そのＮ−またはＣ−末端あるいは両方がさらなるシステイン残基によって延長されている天然の配列によって構成されていてもよい。
ワクチン複合体での担体として使用するために、ペプチドは、有利には少なくとも１つのＴ−依存性エピトープを含有し、したがって、例えば、哺乳動物に複合体を投与すると、Ｔ−依存性抗原となる多糖に対する長期の保護免疫応答の発達を可能にする。
本発明で用いるには、ペプチドは化学的に合成しても、また、組替え手段によって製造してもよい。いずれの方法も、常法に従って行うことができる。
本発明の複合体は、１つのペプチドを含んでもよく、この場合、多糖鎖に沿って存在するペプチド部分は全て相互に同じである。また、複合体は、例えば、異なるエピトープを有する数個のペプチドを含んでいてもよい。しかし、少ない数のペプチドが好ましく、好ましくは６個以下、さらに好ましくは２または３個である。第１のペプチドがＴ−依存性エピトープを有し、一方、第２のペプチドがＢ−エピトープを有していてもよい。
本発明の複合体において使用する多糖類は、いずれの種類のものでもよい。本発明の一具体例において、複合体はワクチン用に製造され、したがって、適当な多糖類には、莢膜多糖類、Ｏ−特異性側鎖のようなグラム陰性細菌の細胞壁リポ多糖類（ＬＰＳまたはＬＯＳ）から誘導される多糖類および真菌細胞壁多糖類が包含される。例えば、多糖類は、シウドモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）のようなシウドモナス属（Pseudomonas）、スタフィロコッカス属（Staphylococci）、ストレプトコッカス属（Streptococci）、特にストレプトコッカス・ニウモニア（S. pneumoniae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、例えば、クレブシエラ・ニウモニア（Klebsiella pneumoniea）、サルモネラ属（Salmonellae）、例えば、サルモネラ・チフィ（S. typhi）およびサルモネラ・パラチフィ（S. paratyphi）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
Ｋ1、Ｋ100、０１５７：Ｈ７、ナイセリア属（Neisseriae）、例えば、ナイセリア・メニンギティディス（N. meningitidis）、シゲラ属（Shigella）、例えば、シゲラ・ディセンテリア（S. dysenteriae）、シゲラ・ソムネイ（S. somnei）およびシゲラ・フレクセネリ（S. flexneri）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（H. influenzae）・タイプｂを包含する細菌およびカンジダ属（Candida）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus heoformans）およびハンセヌラ属（Hansenula）のような真菌から誘導できる。
多糖類は繰り返し単位から構成される。本発明の複合体で使用するには、多糖類は少なくとも４つ、好ましくは３，０００までの繰り返し単位を含む。特に、ワクチン成分として使用するには、多糖類は、好ましくは、４〜１，０００、さらに好ましくは７〜７００、最も好ましくは５０〜２００の繰り返し単位から構成される。
繰り返し単位は、所定の多糖類の特徴であり、その組成および分子量は多糖類によって大きく変化する。例えば、大部分の莢膜多糖類の繰り返し単位は、ヒドロキシおよびカルボキシル基からなるが、それらのいくつかはアミノ基を含むが（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型１）、他のものは含まない（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型１４）；そのいくかはＮ−アセチルを含むが（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型１４）、他のものはそうではない（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型６Ｂ）。また、一例として、ストレプトコッカス・ニウモニア・タイプ３および４の莢膜多糖類の分子量は、各々、３６０および８４７である。かくして、多糖組成に関係なく、繰り返し単位の量と、多糖類の分子量との間には、世界的に適応できる一般的な対応はない。しかし、本発明で使用する多糖は、好ましくは、平均分子量１０，０００〜５００，０００を有することを独立して示すことができる。多糖は一様でないサイズの分子の集団で構成されるので、多糖の分子量は常に平均値で表される。
多糖類は、常法に従って、化学的に合成しても、もし存在するのであれば、天然源から精製してもよい。例えば、細菌または真菌多糖類の場合、微生物から抽出し、要すれば、毒性部分を除去する処理をすることができる。特に有用な方法は、Gotshlich et al., J. Exp. Med.（1969）129:1349に記載されている。
多糖類は、合成または精製して使用できる。それらはまた、使用前に解重合することもできる。事実、天然の莢膜多糖類は通常、分子量が５００，０００を超える。例えば、平均１０，０００〜２０，０００の低分子量の莢膜多糖類を使用することが好ましい場合、精製された多糖類を破砕（fragmentation）に付してもよい。この目的のため、公知の方法が利用でき、例えば、ＷＯ９３／７１７８は還元酸化による破砕法を記載している。
結合に関与する多糖のヒドロキシ、カルボキシルまたはアミノ基は天然の官能性基とすることができる。また、それらは、特異的な処理により人工的に導入されていてもよい。アミノ基は、天然のＮ−アシル基、例えば、Ｎ−アセチル基の制御された酸性または塩基性加水分解で形成されていてもよい。
ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ基等を包含する官能性基（好ましくは、アミノ基）は、天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシルに結合したスペーサー部分を誘導する際に導入してもよく、この目的のためには後２者の基が好ましい。典型的には、スペーサーは、その一端で多糖の天然のヒドロキシ、カルボキシルまたはアミノ基と反応で基、他端がリンカーと反応できる二官能性分子である。かくして、スペーサーは、限定するものではないが、ヒドロキシ、カルボキシルおよびアミノ基を包含する官能性基を与える。スペーサーによって導入される他の有用な官能性基は、以下に詳細に説明するチオール基であってもよい。
以上で記載した以外の官能性基も、特異的処理により導入できる。例えば、隣接するヒドロキシ基を持つ２つの炭素原子間の炭素−炭素結合を開裂する過ヨウ素酸処理により、アルデヒド基を、全て多糖鎖に沿って導入できる。過ヨウ素酸処理は、好ましくは、鎖がそのような開裂に影響されない多糖、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンスからの多糖に行う。
アルデヒド基を複合体形成の目的で全て鎖に沿って導入する場合、用いるリンカーはアミノ基を提供する。
スペーサーおよびリンカーとして使用する化合物を、以下にさらに説明する。しかし、ここで説明することは、リンカーが、例えば、免疫系に与えたときに、ペプチドと多糖部分が相互に妨害しないように適当な長さを有する二官能性分子であるということである。リンカー部分は、有利には、ペプチドのシステインと、ジスルフィド架橋またはチオエーテル結合を介して結合し、多糖のヒドロキシ基とエーテルまたはエステル結合を介して、アミノ基とアミドまたはカルバメート結合を介して、カルボキシル基とエステル、アミドまたはカルバメート結合を介して、またはアルデヒド基と還元イミン結合を介して結合する。
本発明の複合体によって惹起される免疫応答の性質および強度は、ペプチド：多糖の割合に大きく影響されうる。多糖に存在するＢ−エピトープと、ペプチドが担持するＴ−依存性エピトープが免疫系に利用され、正しく提供されることが必須である。かくして、両方のタイプのエピトープが、十分に、かつ、例えば、多糖エピトープのペプチド部分による立体障害を避けられるようなバランスの取れた量で存在すべきである。免疫応答を最適化するため、ペプチド１モルにつき、１〜５０モルの繰り返し単位の割合が適当である。好ましくは、この割合は、ペプチド１モルにつき、３〜３０モルの繰り返し単位であり、さらに好ましくは、この割合は、ペプチド１モルにつき、５〜２０モルの繰り返し単位である。
本発明の複合体は、当該免疫原性多糖が由来する病原性微生物に対する長期免疫保護を惹起するワクチンの分野で特に有用である。
したがって、本発明はまた、治療的または予防的有効量の本発明の複合体と、医薬上許容される希釈剤または担体とからなる医薬組成物も提供する。かかる組成物は常法により製造される。また、組成物は、例えば、アルミニウム化合物のようなアジュバントのごとき他の成分を含有することもできる。適当なアルミニウム化合物には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムが包含される。好ましい具体例においては、本発明の複合体の免疫原性を増強するためのアジュバントの使用は必要ない。本発明の組成物は、ワクチン分野で使用される通常の投与経路によって投与できる。投与経路の選択は、アジュバントの使用のような多くのパラメーターに依存する。
本発明のさらなる態様は、少なくとも６つのアミノ酸残基を有し、そのうちの少なくとも１つがシステイン残基であるペプチドを、少なくとも４つの繰り返し単位からなる多糖鎖、とりわけ、免疫原性と結合させる方法であって、該システイン残基のチオール基を介してリンカーとカップリングさせ、また、多糖鎖を、（ａ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基、または（ｂ）該多糖鎖の天然のＮ−アシル基の加水分解で生じたアミノ基、または（ｃ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基に結合するスペーサー部分から由来する該多糖鎖に誘導された官能性基を介して該リンカーとカップリングさせることを特徴とする方法に関する。
好ましくは、リンカーをまず、多糖または誘導体化された多糖と反応させて、活性化多糖、すなわち、ペプチドとカップリングする官能性基を与えるリンカーを持つ多糖を得る。第二の工程において、この活性化多糖をペプチドと反応させ、リンカーの官能性基、すなわち、Ｒ1と、ペプチドのシステイン残基のチオール基とを反応させる。
換言すると、システイン残基を含有するペプチドを、少なくとも４つの繰り返し単位を有する多糖、とりわけ、免疫原性多糖と結合する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）チオール基と反応できる二官能性リンカーで多糖を活性化し、複数のリンカーが多糖鎖に沿って共有結合でランダムに導入された活性化多糖を得、ついで
（ii）工程（ｉ）で得られた活性化多糖を、ペプチドと反応させてペプチド体が、それらのシステイン残基を介してリンカー部分と共有結合した複合体を得るか、
（iii）ペプチドをチオール基と反応できる二官能性リンカーで活性化し、ついで
（iv）（iii）で得られた活性化ペプチドを多糖と反応させて、複数の活性化ペプチド体が共有結合により多糖鎖に沿ってランダムに導入された複合体を得ることからなる。
好ましい方法は、工程（ｉ）および（ii）に従うものである。
本発明の有利な方法は、工程（ii）において、ペプチド１モル当たり、繰り返し単位１〜５０モル、好ましくは、ペプチド１モル当たり、繰り返し単位３〜３０モル、さらに好ましくは、ペプチド１モル当たり、繰り返し単位５〜２０モルを含む複合体を製造するのに十分な量の多糖上のリンカー部分導入が行える条件下で、多糖を二官能性リンカーと反応させることからなる。同様に、別法は、工程（iv）において上記した特徴を有する複合体を製造するのに十分な量の多糖上の活性化ペプチドの導入が行える条件下で、多糖と活性化ペプチドを反応させることからなる。
有利なリンカーは、式（Ｉ）Ｒ１−Ａ−Ｒ２で示されるもので、式中、Ｒ１はチオール基と反応できる官能性基、Ａは、芳香族鎖または、好ましくは、例えば、置換されているか、されていない炭素鎖のような脂肪族鎖、Ｒ２は、多糖の官能性基と反応できる官能性基を意味する。
鎖Ａは、短すぎても（立体障害を避けるため）、長すぎても（免疫原性部分の妨害を避けるため）いけない。すなわち、鎖Ａは、１〜１２、好ましくは３〜８の炭素数からなり、さらに好ましくは、Ｃ2−Ｃ8アルキレン、フェニレン、Ｃ7−Ｃ12アラルキレン、Ｃ2−Ｃ8アルキル、フェニル、Ｃ7−Ｃ12アラルキル、Ｃ6アルカニルオキシおよびベンジルカルボニルオキシから選択され、アルキル、フェニル、アルキレンおよびフェニレンは置換されていても、されていなくてもよい。
Ｒ１は、好ましくはチオール基、α，β−不飽和カルボニルまたはイミジル基、アシルハロゲンまたはアルキルハライド、ここにハロゲン原子はＢr、ＣlまたはＩである。より好ましい具体例では、Ｒ１はα，β−不飽和カルボニルまたはイミジル基、特に、マレイイミジル基である。
Ｒ２は、多糖との結合を提供するリンカーの官能基である。すなわち、Ｒ２は、とりわけ、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシまたはアルデヒド基と反応できる基である。好ましくは、Ｒ２は、アミノ、カルバモイル、アミノカルバモイル、カルボキシル、ヒドロキシ、スクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）およびスルホスクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル）から選択される。リンカーをアミノ基と反応させる場合、Ｒ２は、好ましくは、カルボキシル、スクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）およびスルホスクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル）である。リンカーを、ヒドロキシ、カルボキシルまたはアルデヒド基と反応させる場合、Ｒ２は、好ましくは、アミノ基またはアミノ基を有する化学基、例えば、Ｒ２はヒドラジド基、すなわち、ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−である。
リンカーとして有用な化合物には、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（４−マレイイミジルフェニル）ブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−３−マレイイミドベンゾエートが包含される。
上記したごとく、多糖は、結合前にスペーサーで誘導体化することができる。すなわち、多糖は、まず、式（II）Ｒ３−Ｂ−Ｒ４のスペーサーと反応させることができる。式中、Ｒ３は、アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシと反応できる官能基、Ｂは芳香族または脂肪族鎖、Ｒ４は、さらなる結合工程において使用するリンカーのＲ２と反応できる官能基を意味する。
鎖Ｂは炭素鎖、好ましくは、カルボニル、Ｃ1−Ｃ12アルキルまたはアルキレンあるいはジカルボニルである。
好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、独立して、アミノ基またはアミノ基を有する化学基、例えば、ヒドラジド基、すなわち、ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−である。
本発明のスペーサーとして有用な化合物には、システアミン、システイン、ヂアミン、例えば、ジアミノヘキサン、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ウレア、セミカルバジドおよびシスタミンが包含される。
スペーサーとしてシステアミンまたはシステインを使用する場合、チオール基を多糖に導入する。この場合、組み合わせて使用する有用なリンカーには、例えば、ビスマレイイミドヘキサンのようなビスマレイイミジル化合物が包含される。
本明細書に記載の適当なペプチド：多糖比を示す複合体を得るために、反応条件、例えば、誘導体化および／または活性化工程に関与する試薬の濃度をテストし、調整することは当業者が適宜行える範囲のものである。さらなるガイダンスを以下に示す。
多糖のアミノ基が反応する場合、反応は、好ましくは、カルボジイミド化合物、例えば、（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）の存在下、pＨ４〜７で行われる。ただし、反応に関与するリンカーまたはスペーサーの官能基はカルボキシルである。
多糖のカルボキシル基が反応する場合、反応は、好ましくは、上記のようなカルボジイミド化合物の存在下で行われる。ただし、反応に関与するリンカーまたはスペーサーの官能基は、アミノ基である。
多糖の繰り返し単位：カルボジイミドのモル比は、有利には、０．１〜２、好ましくは０．１〜１、より好ましくは０．２〜０．６の範囲である。容易に理解できるごとく、この比を調整することにより、繰り返し単位当たりのペプチドの量を調節できる。
多糖のアミノ基がスクシンイミジルまたはスルホスクシンイミジルと反応する場合、反応は、有利には、pＨ６〜９、好ましくは約７．５で行われる。スクシンイミジル基はアミノ基とだけ反応する。適当な実験条件を使用する場合（例えば、過剰のリンカー）、ほとんど即座、すなわち、約５分以内に反応する。反応に使用する多糖がアミノ基を有する天然多糖であれば、スクシンイミジル基の置換量を調節する唯一の可能性は、反応溶媒の希釈を高めるか、またはリンカーの量を低減するような不利な実験条件を使用する（さもないと、反応が即座に起こり、全てのアミノ基が置換される）。これにより、ペプチドの繰り返し単位に対する割合を調整することが可能となる。多糖上にアミノ基を誘導するために加水分解または誘導体化を使用する場合、この割合は、多糖上でのアミノ基の出現を調節することにより、容易に調節できる。
多糖のヒドロキシ基を反応させる場合、反応は好ましくは、シアン化合物の存在下、この化合物が臭化シアンであれば、pＨ８〜１２で、この化合物が１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム・テトラフルオロアセテートであれば、pＨ６〜１０、好ましくは、６〜８で行われる。多糖繰り返し単位：シアノ化合物のモル比は、有利には、０．１〜３、好ましくは０．１〜２の範囲である。
多糖鎖に沿って存在するアルデヒド基が反応する場合、反応は好ましくは、シアノボロヒドリド、例えば、ＮaＣＮＢＨ3の存在下、pＨ６．５〜８で行われる。
本発明の方法を実施することにより、多糖とペプチド部分が、リンカーまたはリンカーとスペーサーとの組み合わせを介して結合し、リンカーまたはリンカー／スペーサー部分が最適な長さを有し、多糖−ペプチド結合が安定である複合体が得られる。さらに、多糖の繰り返し単位に対するペプチドの比が免疫目的に最適な複合体が得られる。
以下、本発明をさらに説明する。
実施例１
以下の配列を有する合成１０５マー・ペプチドの調製
このペプチドは、自動ペプチド合成器（モデル４３１Ａ、Applied Biosystems）で、FastMoc試薬を用いて合成した。固相は、Ｃ−末端アミド・キャップ・ペプチドを生ずるRink樹脂（０．１３ｍＭ TentaGel S RAM Spezial，０．１５ｍＭ g-1，Rapp Polymere，Tuebingen，Germany）であった。合成には、Ｏ−ｔ−ブチル−（アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンカルボキシルまたはヒドロキシ基について）、トリチル−（ヒスチジン、アスパラギンおよびグルタミンアミノまたはイミノ基について）、ｔ−ブチルオキシカルボニル−（リジンアミノ基について）またはＰＭＣ（ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）（アルギニンイミノ基について）側鎖保護と共に、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護アミノ酸を使用した。
活性化およびカップリングは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−３，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミンの存在下に行った。１−２、４、１０−１３、１７、２７、３２、４９、５９、６６、７５−７８、８４−８５、８８、９６−９７および１０４−１０５サイクルにおいて、ダブルカップリングを行い、遊離のアミノ基を無水酢酸でアシル化してブロックした。最後のサイクルの後、ペプチドをピペリジンで脱保護し、最終生成物を無水酢酸でＮ−末端アセチル化した。
側鎖の脱保護および樹脂担体からの開裂は、２．１％（ｖ／ｖ）１，２−エタンジオール、４．２％（ｖ／ｖ）チオアニソール、４．２％（ｖ／ｖ）水、６．２％（ｖ／ｖ）フェノールおよび８３％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して室温にて３時間行った。樹脂を濾去し、溶液が無色になるまでトリエチルシランを滴下した。ついで、この溶液を室温で３時間インキュベートした。ｔ−ブチルメチルエーテルで沈澱させ、ついで遠心分離し、凍結乾燥して粗ペプチド（３６０ｍｇ）を回収した。粗ペプチド（１３０ｍｇ）を、５０ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭエチルモルホリン（４０ｍｌ、pＨ８．３）に溶解し、室温で一夜インキュベートした。１０％ＴＦＡでpＨを３．５に調整し、アセトニトリルの２５〜４５％（ｖ／ｖ）グラジエント、０．１％ＴＦＡ（１０ｍｌ分-1）、グラジエント０．３３％分-1を用いる逆相ＨＰＬＣ（Pep-S，C2/C8，100Å pore size，12μm 22.5mm×25cmm,Pharmacia）でペプチドを精製した。ペプチドは、約２５％アセトニトリルにおいて１つのピークとして溶出し、さらに使用する前に、このピーク（７３ｍｇ）を凍結乾燥した。ＨＰＬＣによる分析およびマス・スペクトル分析は、最終生成物の６５％以上が所望の配列に相当したことを示した。Ｎ−末端配列は、Ｎ−末端アセチル化前に取り出した試料のＮ−末端エドマン・シーケンシングによって確認した。
実施例２
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ多糖−ペプチド複合体
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃからの莢膜多糖（以下、多糖Ｃと称する）の乾燥粉末を、Gotschlich et al, J. Exp. Med.（1969）129:1349に記載される抽出法により得た。多糖Ｃ１００ｍｇを０．２Ｍ ＮaＣlに溶解し、最終濃度１１．１ｍｇ／ｍｌとした（溶液Ａ）。並行して、０．２Ｍ ＮaＣl中、０．２Ｍアジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）の溶液を調製した（溶液Ｂ）。０．２Ｍ ＮaＣl中、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）の０．５Ｍ溶液も調製した（溶液Ｃ）。９ｍｌの溶液Ａ、１０ｍｌの溶液Ｂおよび１ｍｌの溶液Ｃを混合し、５ｍｇ／ｍｌの多糖Ｃ、０．１２５ＭのＡＤＨおよび０．０２５ＭのＥＤＡＣを含有する調製物を得た。０．１Ｍ ＨＣlを添加してpＨを６．５に調整し、このpＨを４５分間の全反応期間中維持した。温度は約２０℃であった。
反応を、４０μlの０．１Ｎ ＮaＯＨにより停止させた。pＨは７．１に上昇した。反応混合物を０．５Ｍ ＮaＣl、１０ｍＭリン酸塩、ついで水に対して透析し、凍結乾燥した。
誘導体化された多糖ＣのサイズをＨＰＬＣ排除カラムＴＳＫ４０００（Tosohaas製）で調節した。その結果、誘導体化の間、解重合が起こらなかったことが示された。
誘導体化の間、約３．４％の繰り返し単位がＮＨ2基によって誘導体化された。
凍結乾燥生成物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（pＨ７）に濃度６．２５ｍｇ／ｍｌで溶解し、脱気した。窒素雰囲気下、Ｎ−（γ−マレイイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、濃度２５ｍｇ／ｍｌで溶解し、ついで等量の誘導体化多糖Ｃに添加した。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で９０分間撹拌した。活性化多糖ＣをセファデックスＧ５０排除カラムクロマトグラフィーで精製した。排除フラクションを回収し、限外濾過（３０Ｋ Amicon膜）により約７．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮した溶液を脱気した。
実施例１で得られたペプチド２０ｍｇを、窒素雰囲気下、濃度１０ｍｇ／ｍｌで水に溶解した。このペプチド溶液１．５ｍｌを、活性化多糖Ｃを含有する調製物１．２ｍｌに、マレイイミド残基／チオール残基の比が２となるように添加した。反応混合物を室温で撹拌しながら一夜保持した。ついで、０．０１０ｍｌのメルカプトエタノールを添加して、未反応のマレイイミド残基を不活性化した。
複合体生成物を４ＢＣＬセファロースカラムで精製した。糖類（シアル酸）およびペプチドの存在について、溶出フラクションを分析した。両方の分析で陽性反応を示したフラクションを貯めた。
シアル酸残基の量はSvennerholm L., Biochem. Biophys. Acta（1957）24:604に記載された投薬量法（dosage method）で、また、ペプチドの量はLowry et al, J. Biol. Chem.（1951）193:265の方法に従って測定した。（ペプチド）／（多糖Ｃの繰り返し単位）の比（モル／モル）は１：１８（重量／重量比１．８：１に相当）であることが示された。
実施例３
エス・ニウモニアエ多糖−ペプチド複合体
ストレプトコッカス・ニウモニアエ４型からの莢膜多糖（以下、ニウモ４多糖と称する）の乾燥粉末をＷＯ８２／０１９９５号記載の抽出法により得た。ニウモ４多糖１００ｍｇを最終濃度１１．１ｍｇ／ｍｌで０．２Ｍ ＮaＣlに溶解した（溶液Ａ）。並行して、０．２Ｍ ＮaＣl中、０．２５Ｍアジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）の溶液を調製した（溶液Ｂ）。０．２Ｍ ＮaＣl中、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）の０．５Ｍ溶液も調製した（溶液Ｃ）。９ｍｌの溶液Ａ、１０ｍｌの溶液Ｂおよび１ｍｌの溶液Ｃを混合し、５ｍｇ／ｍｌのニウモ４多糖、０．１２５ＭのＡＤＨおよび０．０２５ＭのＥＤＡＣを含有する調製物を得た。１Ｎ ＨＣlを添加してpＨを４．９に調整し、このpＨを３０分間の全反応期間中維持した。温度は約２５℃であった。
反応を、０．２８ｍｌの１Ｎ ＮaＯＨにより停止させた。pＨは７．５に上昇した。反応混合物を０．５Ｍ ＮaＣlついで水に対して透析し、凍結乾燥した。
誘導体化されたニウモ４多糖のサイズをＨＰＬＣ排除カラムＴＳＫ４０００（Tosohaas製）で調節した。誘導体化の間、解重合が起こらなかった。
誘導体化の間、約８．２％のニウモ４多糖の繰り返し単位がＮＨ2基によって誘導体化された。
凍結乾燥生成物を０．０５Ｍ ＮaＣlに濃度２．７６ｍｇ／ｍｌで溶解し、脱気した。窒素雰囲気下、Ｎ−（γ−マレイイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、濃度２５ｍｇ／ｍｌで溶解した。このＧＭＢＳ溶液１．７５ｍｌを、窒素雰囲気下、該多糖溶液１６ｍｌに添加した。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で５時間撹拌した。活性化ニウモ４多糖をセファデックスＧ５０排除カラムクロマトグラフィーで精製した。排除フラクションを回収し、限外濾過（３０Ｋ Amicon膜）により約７ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮した溶液を脱気した。
実施例１で得られたペプチド２０ｍｇを窒素雰囲気下、濃度４．６ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＮaＣlおよび０．０１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７）に溶解した。一方、このペプチド溶液２．２ｍｌを、活性化ニウモ４多糖を含有する調製物１．２５ｍｌに、マレイイミド残基／チオール残基の比が１となるように添加した（ニウモ４−ペプチド−１複合体）。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で撹拌しながら６時間、ついで＋４℃で一夜保持した。ついで、０．００５ｍｌのメルカプトエタノールを各反応混合物に添加して、未反応のマレイイミド残基を不活性化した。
複合体生成物をセファロース４ＢＣＬカラムで精製した。糖類およびペプチドの存在について、溶出フラクションを分析した。両方の分析で陽性反応を示したフラクションを貯めた。
糖の量はDubois et al, Anal. Chem.（1956）３:350に記載された投薬量法（dosagemethod）で、また、ペプチドの量はLowry et al, J. Biol. Chem.（1951）193:265の方法に従って測定した。（ペプチド／多糖）の繰り返し単位の比（モル／モル）はＰｎ４−ペプチド−１複合体について１：３０（ｗ／ｗ比０．４：１に相当）であった。
実施例４
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ多糖−ペプチド複合体
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａからの莢膜多糖（以下、多糖Ａと称する）の乾燥粉末を、Gotschlich et al, J. Exp. Med.（1969）129:1349に記載される抽出法により得た。多糖Ａ１００ｍｇを水に溶解し、最終濃度５ｍｇ／ｍｌとした（溶液Ａ）。並行して、水中、臭化シアン（ＣＮＢr）の濃度６７ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した（溶液Ｂ）。０．５Ｍ ＮaＨＣＯ3中、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）の濃度１５０ｍｇ／ｍｌ溶液も調製した（溶液Ｃ）。２０ｍｌの溶液Ａおよび０．７５ｍｌの溶液Ｂを混合し、多糖／ＣＮＢrの重量／重量比１の調製物を得た。０．１Ｍ ＮaＯＨを添加してpＨを１０．８に調整し、このpＨを６０分間の全反応期間中維持した。温度は約２０℃であった。
０．１５ｍｌの０．１Ｎ ＨＣlでpＨを８．５に下げた。。１７ｍｌの溶液Ｃを添加し、ＡＤＨ／多糖の重量／重量比を３．５とした。このpＨを１５分間維持した。反応混合物を＋４℃で撹拌下に一夜保持した。０．１ｍｌの１Ｎ ＨＣlを加えてpＨを７に低下させた。反応混合物を０．５Ｍ ＮaＣlついで水に対して透析し、凍結乾燥した。
誘導体化された多糖ＡのサイズをＨＰＬＣ排除カラムＴＳＫ４０００（Tosohaas製）で調節した。誘導体化の間、解重合が起こらなかった。
誘導体化の間、約２．５％の多糖Ａの繰り返し単位がＮＨ2基によって誘導体化された。
実施例２の方法を使用して誘導体化された多糖Ａを活性化し、実施例１で得られたペプチドに活性化多糖Ａを結合させた。
実施例５
実施例２で得られたナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ複合体を用いた免疫原性試験
多糖複合体における担体としての実施例１のペプチドの有用性は、つぎのようにして示される。
容量０．５ｍｌ（各注射）の皮下経路およびアジュバントを使用した場合は、腹腔内経路で以下の組成物の１つを１６週令のＮＭＲＩマウスに投与した。
a）アジュバントなしで、５μｇの多糖Ｃ（ペプチドなし）を第１、１５および２９日に；
ｂ）第１日は、フロイントの完全アジュバントと共に、第１５および２９日は、フロイントの不完全アジュバントと共に５μｇの多糖C（ペプチドなし）；
ｃ）第１日は、フロイントの完全アジュバントと共に、第１５および２９日は、フロイントの不完全アジュバントと共に、多糖Ｃ５μｇおよびペプチド９μｇ；
ｄ）アジュバントなしで、多糖Ｃ１μｇおよびペプチド１．８μｇを含有する実施例２で得られらた複合体を第１、１５および２９日に；
ｅ）アジュバントなしで、多糖Ｃ５μｇおよびペプチド９μｇを含有する実施例２の複合体を第１、１５および２９日に；
ｆ）第１日は、フロイントの完全アジュバントと共に、多糖Ｃ５μｇおよびペプチド９μｇを含有する実施例２で得られた複合体、第１５および２９日は、フロイントの不完全アジュバントと共に実施例２で得られた複合体；
ｇ）ジフテリア抗毒素（ＤＴ）と一緒の多糖Ｃ５μｇの複合体。
第１５、２９および４３日（第１の免疫日から計算）に、血液試料を採取し、抗多糖Ｃ抗体をＥＬＩＳＡにより力価測定した。結果を次表にまとめる。
いずれの場合も、非複合体多糖Ｃに対する抗体応答は、非常に弱く、時間をかけても増加しないが、ＤＴまたはペプチドと結合した多糖Ｃに対する応答は十分である。本発明の複合体を用いると、第２の注射後、ブースター効果が得られ、持続性の免疫応答であることを示している。多糖Ｃ−ペプチド複合体の応答は多糖Ｃ−ＤＴ複合体で得られる応答と同等である。
実施例６
実施例３で得られたエス・アウレウス複合体を用いた免疫原性試験
ペプチド：多糖の比（ｗ／ｗ）０．４：１（繰り返し単位当たりのペプチドの比率（モル／モル）１：３０）の実施例３で調製した複合体を実施例５のプロトコールを用いてマウスにおいてテストした。これは、アジュバントの存在下でマウスにおいて免疫原性であり、第２の注射後、ブースター効果をもたらした。結果を表２に示す。
多糖類は、種々の技術分野で有用な高分子物質の１つの広いファミリーを構成している。いくつかの場合では、それらを、例えば、蛋白質またはペプチドのようなポリペプチドと結合させることが要求される。例えば、多糖類はペプチド試薬用のマトリックス媒体として診断または精製技術で使用されている。デキストランのような非免疫原性多糖類も、ＥＰ３２６１１１に記載されているように免疫系に小ペプチドを与えるのに有用である。実際、ペプチドは、蛋白質担体に結合させるか、アジュバントと共に投与すべきであり、最も一般的なアジュバントはアルミニウム化合物である。しかしながら、これらのアジュバントと、混合、吸着または沈澱させた小ペプチドはアルミニウムゲルによって妨害されることがあり、そのため、免疫系に利用できない。この問題を克服するため、ＥＰ３２６１１１は、ペプチドを非免疫原性多糖と結合（conjugate）させることができることを教示している。アルミニウム化合物の存在下で、このような複合体は、該ペプチド部分に対する免疫応答を惹起することができる。
ワクチンの分野でも、例えば、ペプチドまたは蛋白質のようなポリペプチドを免疫原性多糖類と結合させることに高い関心が寄せられており、該多糖類に対する免疫応答が追求されている。事実、細菌の莢膜および細胞壁（真菌の細胞壁も）は、哺乳動物には通常見られないエピトープ・モチーフを有し、免疫原性を伝達できる非常に特異的な繰り返し単位から構成される多糖類を必須として構築されている。したがって、例えば、莢膜多糖類のような多糖類は、髄膜炎、肺炎、腸チフスのような細菌性疾患に対するワクチンとして既に使用されている。
しかしながら、多糖類をワクチンとして使用する場合、１つの大きな問題がある。多糖類が免疫原性であること、すなわち、換言すれば、多糖類は、それ自体哺乳動物に投与すると、たとえ、不十分であっても、免疫応答を惹起することが証明されているが、多糖類は、それらがＴ−細胞の助けなしにＢ−細胞産生を誘発できる数少ない抗原に属する点で特異的である。したがって、多糖類はＴ−独立性と呼ばれる。
Ｔ−独立性抗原によって誘発される免疫応答は多くの態様によって特徴付けられ、とりわけ、
（ｉ）一次応答が、Ｔ−依存性抗原に対する応答よりも弱く、早い；
（ii）抗体応答が、Ｔ−依存性抗原で見られるような親和性増加を伴う高ＩｇＧ産生に成熟しない；
（iii）Ｔ−独立性抗原に対応する免疫記憶は乏しく、免疫記憶はワクチン接種原理の根底を構成する二次免疫応答のキイであるので、Ｔ−独立性抗原は、長期の保護免疫応答を誘発するためには不十分な抗原である；および
（iv）幼児は、１または２歳前は、多糖類に対して応答できない。
二次免疫応答を誘発させるためには、Ｔ−独立性抗原は、ジフテリアまたは破傷風トキシンのような、抗原にＴ−依存性特性を与える担体蛋白質と共有結合させることが必要である。これらの複合体は、ついで、免疫応答を増強させるために、アルミニウム化合物またはフロインドの完全もしくは不完全アジュバント（後の２つは、もっぱらヒト以外の哺乳動物に使用される）のようなアジュバントで補足してもよい（アジュバント効果）。
「担体」なる用語は、抗原、例えば、多糖に共有結合した場合に、該抗原に対するＴ−依存性応答を促進できる分子を意味する。そのような応答は、抗原−担体複合体の、日、週または月を分けた少なくとも２回の接種（初回免疫およびブースター）をすることからなるワクチン接種計画により示される。最初の接種（初回免疫）により、弱い抗体応答が示され、ブースター接種により、高レベルの抗体応答が惹起される。このような拡大された応答は、非結合抗原によって構成される陰性対照では見られない。
種々の結合方法が、既に当該分野において利用されている。通常関与する多糖官能性基は、鎖に沿って位置するアミノ、カルボキシルまたはヒドロキシ基か、末端または鎖に沿ったアルデヒド基よい。通常関与するポリペプチド官能性基は、末端またはアミノ酸側鎖に存在するアミノまたはカルボキシル基でよく、またはチオール基であってもよい。
一般的な方法においては、多糖複合体は、結合に関与する官能性基の多糖（鎖に沿うか、末端か）および担体の両方における位置に応じて３つの型の構造を示しうる。これらの構造型は、記載の便宜上、「太陽（Sun）」または「耳（Ear）」、「レーキ（Rake）」および「格子（Lattice）」型と称される。それらを図１に示す。図１中、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、各々、「太陽」（ネオ複合糖質）、「レーキ」および「格子」型を示す。
「太陽」型においては、多糖は、もっぱら多糖鎖の末端に位置している反応性基を介して蛋白質またはペプチドと結合している。通常、これには多糖鎖の還元性末端に位置しているカルボキシル基が関与する。蛋白質に幾つかの多糖鎖が結合でき、結合には、通常、例えば、リジン残基が有するアミノ基が関与する。そのような複合体もネオ複合糖質と定義される。例えば、この型の複合体は、Alonso de Velasco et al., Infect. Immun.（1995）63:961;Paradiso et al., Vaccine Research（1993）2（4）:239;およびJenningsの米国特許第４，３５６，１７０号で完成されている。
「レーキ」型においては、ペプチドは、多糖鎖に沿って結合している。この型の例は、Lett et al., Infect. Immun.（1995）62:785、さらに適切には、Lett et al., Infect. Immun.（1995）63:2645およびKoenen-Waisman et al., J. Immunol.（1995）:5977に記載されている。結合は、ペプチド鎖の内部または末端アミノ基の１つのリジン残基が関与する。
「格子」型においては、蛋白質および多糖が架橋している。これは、ペプチドよりも蛋白質を使用すること（通常、蛋白質に沿ってアミノまたは酸基が位置する）および多糖鎖に沿って位置する反応性基が関与することにより可能となる。この型の複合体は、Andersonの米国特許第４，６７３，５７４号に記載されている。J. Exp. Med.（1980）152:361も「格子」型を導く結合方法を記載している。これは、ＣＮＢrを使用し、リンカーとしてアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を使用する。全て多糖鎖に沿って存在するヒドロキシ基および蛋白質の側鎖アミノ酸が関与する。
これらの構造の各々が種々の結合方法で完成できる。結合は、Andersonの米国特許第４，６７３，５７４号、Jenningsの米国特許第４，３５６，１７０号、Lett et al.またはKoenen-Waisman et al.に記載の直接結合でよい。また、結合は、Schneerson et al.によって説明さていれるようなリンカー分子を使用する間接結合でもよい。リンカーに加えて、Alonso de Valsesco et al.またはParadiso et al.（肺炎球菌多糖について）に記載されるようなスペーサーも使用できる。多糖、蛋白質、リンカーおよび所望によりスペーサーに存在する種々の官能性基が関与できる。
上記で引用した幾つかの先行文献には、以下のとおり、さらに詳細に記載されている。
Alonso de Velasco et al.において、担体は、どちらかの末端に１つのシステイン残基を含む約２０アミノ酸残基のペプチドである。ストレプトコッカス・ニウモニア（Streptococcus penumoniae）１７Ｆ多糖を、まず、ＮaＣＮＢＨ3の存在下、ジアミノプロパンで還元アミノ化して還元末端を誘導体化する。この誘導体化した多糖を、リンカーとしてＮ−スクシンイミジルブロモ酢酸でブロモアセチル化し、こうして活性化された多糖を、ペプチドのＮ−またはＣ−末端の１つのシステイン残基のチオール基と結合させる。
Lett et al.（１９９４）では、エス・ミュータンス（S. mutans）またはサッカロミセス・セレビシア（Saccaromyce cerevisiae）多糖をまず、過ヨウ素酸塩で酸化して多糖鎖に沿ってアルデヒド基を形成させる。ついで、この酸化多糖を、ＮaＣＮＢＨ3の存在下、還元アミノ化によりペプチドと直接結合させる。
Paradiso et al.においては、２つの多糖類を使用する。肺炎球菌多糖およびヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）のポリリビトールリン酸（ＰＲＰ）である。肺炎球菌の酸性加水分解により、アルドース基が多糖鎖の末端に形成される。ついで、ピリジンボランの存在下、ジアミノメタンで還元アミノ化し、鎖端にアミノ基を付加する。この誘導体化された多糖を、アジピン酸のスクシンイミジルジエステルで活性化し、蛋白質またはペプチドのアミノ酸基と結合させる。ＰＲＰについては、これをまず、過ヨウ素酸塩を用いる酸化開裂に付し、両端にアルデヒド基を形成させる。ついで、酸化ＰＲＰを蛋白質およびペプチドのアミノ基と結合させる。両方の場合とも、「太陽」構造が形成される。
Koenen-Waisman et al.では、Ｖi多糖およびペプチド（どちらもシステイン残基を含有していない）または蛋白質を（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）の存在下に直接一緒に結合させている。この結合には、多糖のカルボキシル基と、蛋白質またはペプチドのアミノ基が関与している。その結果、蛋白質を使用する場合、「格子」構造が形成される。ペプチドを使用する場合、構造は、アミノ基を有するアミノ酸の数に依存する。構造は、単純な「格子」構造か、「レーキ」構造である。
容易に理解できるように、結合に関与する官能性基が全て多糖に沿って存在する場合、担体が蛋白質（蛋白質の幾つかのアミノ基またはカルボキシル基が結合に利用される）であれば、これは架橋複合体を導く。もし、ポリペプチド担体が１つの結合部位を含むのであれば（これは、十分に小さい場合、しばしば起こる）、その複合体は、「レーキ」構造を示す（もし、結合を密閉系で、ポリペプチドの１つの官能性基のみが反応するような難しい制御をすれば、これは、ポリペプチドがいくつかの結合部位を有する場合にも起こる）。結合方法が、天然のポリペプチド（またはそのフラグメント）のカルボキシル基またはアミノ基を使用する場合、カルボキシル基またはアミノ基はポリペプチド上に頻繁に存在するので、「レーキ」構造を得るためには後者は非常に少ない。
この度、システイン残基のチオール基を使用して、「レーキ」構造を簡単に製造できる結合方法を見出した。システイン残基は、リジンやアスパラギン酸よりも頻度が少ないので、この方法は大きなペプチドの結合に適している。
生物学的に製造され、または合成された場合、ペプチドは容易に精製でき、したがって、より純粋で明確であるから、担体として、ペプチドは蛋白質よりも幾つかの有利な点を有している。有害な性質（毒性）を有しうる担体蛋白質と異なり、ペプチドは担体の性質のみを発揮するようにこれらの蛋白質から誘導することができる。
しかしながら、当該分野に公知の多糖−ペプチド複合体は、対応するそれらの多糖−蛋白質複合体よりも免疫原性が少なく、明らかにアジュバントの使用が必要である。驚くべきことに、この新規方法で作った多糖−ペプチド複合体は、良好な免疫原性を有している。この点についての１つの理由は、ペプチド部分が十分なサイズを有していることである。
したがって、本発明は、
（ｉ）少なくとも６つのアミノ酸残基からなり、そのうちの少なくとも１つがシステイン残基であるペプチド部分、
（ii）少なくとも４つの繰り返し単位からなる多糖鎖、および
（iii）該システイン残基のチオール基と結合し、かつ（ａ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基、または（ｂ）該多糖鎖の天然のＮ−アシル基の加水分解で生じたアミノ基、または（ｃ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基に結合するスペーサー部分から由来する該多糖鎖に誘導された官能性基と結合したリンカー部分からなることを特徴とする、多糖が有利に免疫原性である多糖−ペプチド複合体に関する。
天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基は該繰り返し単位に見出され、したがって、全て多糖鎖に沿って存在するので、本発明の複合体は典型的にはっ上記した「レーキ」構造を示す。したがって、本発明の複合体について以下の別の同等な定義を与えることもできる。
換言すると、本発明の複合体は、繰り返し単位から構成される多糖鎖と、複数のペプチド部分とからなり、ペプチドの各部分が、システイン残基を含有し、かつ多糖鎖に沿ってランダムに、システイン残基のチオール基と、多糖のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基が関与する間接結合を介して共有結合しており、間接結合は、リンカーまたはスペーサー−リンカー部分を介して完成され、ただし、スペーサー体またスペーサー−リンカー部分が多糖のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基と結合している。
「ペプチド」なる用語は、少なくとも６個、有利には２００個以下のアミノ酸残基を有するアミノ酸鎖を意味する。ペプチドは、有利には、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも約１５個、さらに好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸残基を含有する。有利には、最大約１５０個、好ましくは最大１００個または最大約５０個のアミノ酸残基を含む。好ましいペプチド鎖は、約５０〜１５０個のアミノ酸残基を含有する。
本発明で使用するには、ペプチドは１個または数個のシステイン残基を含有してよい。システイン残基は、リンカーとペプチドの結合を提供する。結合にシステイン残基を使用することは、通常ペプチドのシステイン残基の量が低いので結合の選択性が増強される。システイン残基はペプチドの端部またはペプチド鎖の中のいずれかに存在できるが、ただし、この部位での結合がペプチドの構造および性質によって妨げられてはならない。システインの量と関係なく、１つのシステイン残基がＮ−またはＣ−末端に位置することが好ましい。
より好ましくは、ペプチドは２つのシステイン残基を含み、その各々が１端に位置するか、どちらかの端に１つのシステイン残基が存在し、この後者が最も好ましい。
ペプチドの全アミノ酸配列は天然のままでもよく、また、より大きいポリペプチドの一部でもよい。ペプチドは、そのＮ−またはＣ−末端あるいは両方がさらなるシステイン残基によって延長されている天然の配列によって構成されていてもよい。
ワクチン複合体での担体として使用するために、ペプチドは、有利には少なくとも１つのＴ−依存性エピトープを含有し、したがって、例えば、哺乳動物に複合体を投与すると、Ｔ−依存性抗原となる多糖に対する長期の保護免疫応答の発達を可能にする。
本発明で用いるには、ペプチドは化学的に合成しても、また、組替え手段によって製造してもよい。いずれの方法も、常法に従って行うことができる。
本発明の複合体は、１つのペプチドを含んでもよく、この場合、多糖鎖に沿って存在するペプチド部分は全て相互に同じである。また、複合体は、例えば、異なるエピトープを有する数個のペプチドを含んでいてもよい。しかし、少ない数のペプチドが好ましく、好ましくは６個以下、さらに好ましくは２または３個である。第１のペプチドがＴ−依存性エピトープを有し、一方、第２のペプチドがＢ−エピトープを有していてもよい。
本発明の複合体において使用する多糖類は、いずれの種類のものでもよい。本発明の一具体例において、複合体はワクチン用に製造され、したがって、適当な多糖類には、莢膜多糖類、Ｏ−特異性側鎖のようなグラム陰性細菌の細胞壁リポ多糖類（ＬＰＳまたはＬＯＳ）から誘導される多糖類および真菌細胞壁多糖類が包含される。例えば、多糖類は、シウドモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）のようなシウドモナス属（Pseudomonas）、スタフィロコッカス属（Staphylococci）、ストレプトコッカス属（Streptococci）、特にストレプトコッカス・ニウモニア（S. pneumoniae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、例えば、クレブシエラ・ニウモニア（Klebsiella pneumoniea）、サルモネラ属（Salmonellae）、例えば、サルモネラ・チフィ（S. typhi）およびサルモネラ・パラチフィ（S. paratyphi）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
Ｋ1、Ｋ100、０１５７：Ｈ７、ナイセリア属（Neisseriae）、例えば、ナイセリア・メニンギティディス（N. meningitidis）、シゲラ属（Shigella）、例えば、シゲラ・ディセンテリア（S. dysenteriae）、シゲラ・ソムネイ（S. somnei）およびシゲラ・フレクセネリ（S. flexneri）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（H. influenzae）・タイプｂを包含する細菌およびカンジダ属（Candida）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus heoformans）およびハンセヌラ属（Hansenula）のような真菌から誘導できる。
多糖類は繰り返し単位から構成される。本発明の複合体で使用するには、多糖類は少なくとも４つ、好ましくは３，０００までの繰り返し単位を含む。特に、ワクチン成分として使用するには、多糖類は、好ましくは、４〜１，０００、さらに好ましくは７〜７００、最も好ましくは５０〜２００の繰り返し単位から構成される。
繰り返し単位は、所定の多糖類の特徴であり、その組成および分子量は多糖類によって大きく変化する。例えば、大部分の莢膜多糖類の繰り返し単位は、ヒドロキシおよびカルボキシル基からなるが、それらのいくつかはアミノ基を含むが（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型１）、他のものは含まない（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型１４）；そのいくかはＮ−アセチルを含むが（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型１４）、他のものはそうではない（例、ストレプトコッカス・ニウモニアエ血清型６Ｂ）。また、一例として、ストレプトコッカス・ニウモニア・タイプ３および４の莢膜多糖類の分子量は、各々、３６０および８４７である。かくして、多糖組成に関係なく、繰り返し単位の量と、多糖類の分子量との間には、世界的に適応できる一般的な対応はない。しかし、本発明で使用する多糖は、好ましくは、平均分子量１０，０００〜５００，０００を有することを独立して示すことができる。多糖は一様でないサイズの分子の集団で構成されるので、多糖の分子量は常に平均値で表される。
多糖類は、常法に従って、化学的に合成しても、もし存在するのであれば、天然源から精製してもよい。例えば、細菌または真菌多糖類の場合、微生物から抽出し、要すれば、毒性部分を除去する処理をすることができる。特に有用な方法は、Gotshlich et al., J. Exp. Med.（1969）129:1349に記載されている。
多糖類は、合成または精製して使用できる。それらはまた、使用前に解重合することもできる。事実、天然の莢膜多糖類は通常、分子量が５００，０００を超える。例えば、平均１０，０００〜２０，０００の低分子量の莢膜多糖類を使用することが好ましい場合、精製された多糖類を破砕（fragmentation）に付してもよい。この目的のため、公知の方法が利用でき、例えば、ＷＯ９３／７１７８は還元酸化による破砕法を記載している。
結合に関与する多糖のヒドロキシ、カルボキシルまたはアミノ基は天然の官能性基とすることができる。また、それらは、特異的な処理により人工的に導入されていてもよい。アミノ基は、天然のＮ−アシル基、例えば、Ｎ−アセチル基の制御された酸性または塩基性加水分解で形成されていてもよい。
ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ基等を包含する官能性基（好ましくは、アミノ基）は、天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシルに結合したスペーサー部分を誘導する際に導入してもよく、この目的のためには後２者の基が好ましい。典型的には、スペーサーは、その一端で多糖の天然のヒドロキシ、カルボキシルまたはアミノ基と反応で基、他端がリンカーと反応できる二官能性分子である。かくして、スペーサーは、限定するものではないが、ヒドロキシ、カルボキシルおよびアミノ基を包含する官能性基を与える。スペーサーによって導入される他の有用な官能性基は、以下に詳細に説明するチオール基であってもよい。
以上で記載した以外の官能性基も、特異的処理により導入できる。例えば、隣接するヒドロキシ基を持つ２つの炭素原子間の炭素−炭素結合を開裂する過ヨウ素酸処理により、アルデヒド基を、全て多糖鎖に沿って導入できる。過ヨウ素酸処理は、好ましくは、鎖がそのような開裂に影響されない多糖、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンスからの多糖に行う。
アルデヒド基を複合体形成の目的で全て鎖に沿って導入する場合、用いるリンカーはアミノ基を提供する。
スペーサーおよびリンカーとして使用する化合物を、以下にさらに説明する。しかし、ここで説明することは、リンカーが、例えば、免疫系に与えたときに、ペプチドと多糖部分が相互に妨害しないように適当な長さを有する二官能性分子であるということである。リンカー部分は、有利には、ペプチドのシステインと、ジスルフィド架橋またはチオエーテル結合を介して結合し、多糖のヒドロキシ基とエーテルまたはエステル結合を介して、アミノ基とアミドまたはカルバメート結合を介して、カルボキシル基とエステル、アミドまたはカルバメート結合を介して、またはアルデヒド基と還元イミン結合を介して結合する。
本発明の複合体によって惹起される免疫応答の性質および強度は、ペプチド：多糖の割合に大きく影響されうる。多糖に存在するＢ−エピトープと、ペプチドが担持するＴ−依存性エピトープが免疫系に利用され、正しく提供されることが必須である。かくして、両方のタイプのエピトープが、十分に、かつ、例えば、多糖エピトープのペプチド部分による立体障害を避けられるようなバランスの取れた量で存在すべきである。免疫応答を最適化するため、ペプチド１モルにつき、１〜５０モルの繰り返し単位の割合が適当である。好ましくは、この割合は、ペプチド１モルにつき、３〜３０モルの繰り返し単位であり、さらに好ましくは、この割合は、ペプチド１モルにつき、５〜２０モルの繰り返し単位である。
本発明の複合体は、当該免疫原性多糖が由来する病原性微生物に対する長期免疫保護を惹起するワクチンの分野で特に有用である。
したがって、本発明はまた、治療的または予防的有効量の本発明の複合体と、医薬上許容される希釈剤または担体とからなる医薬組成物も提供する。かかる組成物は常法により製造される。また、組成物は、例えば、アルミニウム化合物のようなアジュバントのごとき他の成分を含有することもできる。適当なアルミニウム化合物には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムが包含される。好ましい具体例においては、本発明の複合体の免疫原性を増強するためのアジュバントの使用は必要ない。本発明の組成物は、ワクチン分野で使用される通常の投与経路によって投与できる。投与経路の選択は、アジュバントの使用のような多くのパラメーターに依存する。
本発明のさらなる態様は、少なくとも６つのアミノ酸残基を有し、そのうちの少なくとも１つがシステイン残基であるペプチドを、少なくとも４つの繰り返し単位からなる多糖鎖、とりわけ、免疫原性と結合させる方法であって、該システイン残基のチオール基を介してリンカーとカップリングさせ、また、多糖鎖を、（ａ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基、または（ｂ）該多糖鎖の天然のＮ−アシル基の加水分解で生じたアミノ基、または（ｃ）該多糖鎖の天然のアミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基に結合するスペーサー部分から由来する該多糖鎖に誘導された官能性基を介して該リンカーとカップリングさせることを特徴とする方法に関する。
好ましくは、リンカーをまず、多糖または誘導体化された多糖と反応させて、活性化多糖、すなわち、ペプチドとカップリングする官能性基を与えるリンカーを持つ多糖を得る。第二の工程において、この活性化多糖をペプチドと反応させ、リンカーの官能性基、すなわち、Ｒ1と、ペプチドのシステイン残基のチオール基とを反応させる。
換言すると、システイン残基を含有するペプチドを、少なくとも４つの繰り返し単位を有する多糖、とりわけ、免疫原性多糖と結合する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）チオール基と反応できる二官能性リンカーで多糖を活性化し、複数のリンカーが多糖鎖に沿って共有結合でランダムに導入された活性化多糖を得、ついで
（ii）工程（ｉ）で得られた活性化多糖を、ペプチドと反応させてペプチド体が、それらのシステイン残基を介してリンカー部分と共有結合した複合体を得るか、
（iii）ペプチドをチオール基と反応できる二官能性リンカーで活性化し、ついで
（iv）（iii）で得られた活性化ペプチドを多糖と反応させて、複数の活性化ペプチド体が共有結合により多糖鎖に沿ってランダムに導入された複合体を得ることからなる。
好ましい方法は、工程（ｉ）および（ii）に従うものである。
本発明の有利な方法は、工程（ii）において、ペプチド１モル当たり、繰り返し単位１〜５０モル、好ましくは、ペプチド１モル当たり、繰り返し単位３〜３０モル、さらに好ましくは、ペプチド１モル当たり、繰り返し単位５〜２０モルを含む複合体を製造するのに十分な量の多糖上のリンカー部分導入が行える条件下で、多糖を二官能性リンカーと反応させることからなる。同様に、別法は、工程（iv）において上記した特徴を有する複合体を製造するのに十分な量の多糖上の活性化ペプチドの導入が行える条件下で、多糖と活性化ペプチドを反応させることからなる。
有利なリンカーは、式（Ｉ）Ｒ１−Ａ−Ｒ２で示されるもので、式中、Ｒ１はチオール基と反応できる官能性基、Ａは、芳香族鎖または、好ましくは、例えば、置換されているか、されていない炭素鎖のような脂肪族鎖、Ｒ２は、多糖の官能性基と反応できる官能性基を意味する。
鎖Ａは、短すぎても（立体障害を避けるため）、長すぎても（免疫原性部分の妨害を避けるため）いけない。すなわち、鎖Ａは、１〜１２、好ましくは３〜８の炭素数からなり、さらに好ましくは、Ｃ2−Ｃ8アルキレン、フェニレン、Ｃ7−Ｃ12アラルキレン、Ｃ2−Ｃ8アルキル、フェニル、Ｃ7−Ｃ12アラルキル、Ｃ6アルカニルオキシおよびベンジルカルボニルオキシから選択され、アルキル、フェニル、アルキレンおよびフェニレンは置換されていても、されていなくてもよい。
Ｒ１は、好ましくはチオール基、α，β−不飽和カルボニルまたはイミジル基、アシルハロゲンまたはアルキルハライド、ここにハロゲン原子はＢr、ＣlまたはＩである。より好ましい具体例では、Ｒ１はα，β−不飽和カルボニルまたはイミジル基、特に、マレイイミジル基である。
Ｒ２は、多糖との結合を提供するリンカーの官能基である。すなわち、Ｒ２は、とりわけ、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシまたはアルデヒド基と反応できる基である。好ましくは、Ｒ２は、アミノ、カルバモイル、アミノカルバモイル、カルボキシル、ヒドロキシ、スクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）およびスルホスクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル）から選択される。リンカーをアミノ基と反応させる場合、Ｒ２は、好ましくは、カルボキシル、スクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）およびスルホスクシンイミジル（例、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル）である。リンカーを、ヒドロキシ、カルボキシルまたはアルデヒド基と反応させる場合、Ｒ２は、好ましくは、アミノ基またはアミノ基を有する化学基、例えば、Ｒ２はヒドラジド基、すなわち、ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−である。
リンカーとして有用な化合物には、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（４−マレイイミジルフェニル）ブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−３−マレイイミドベンゾエートが包含される。
上記したごとく、多糖は、結合前にスペーサーで誘導体化することができる。すなわち、多糖は、まず、式（II）Ｒ３−Ｂ−Ｒ４のスペーサーと反応させることができる。式中、Ｒ３は、アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシと反応できる官能基、Ｂは芳香族または脂肪族鎖、Ｒ４は、さらなる結合工程において使用するリンカーのＲ２と反応できる官能基を意味する。
鎖Ｂは炭素鎖、好ましくは、カルボニル、Ｃ1−Ｃ12アルキルまたはアルキレンあるいはジカルボニルである。
好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、独立して、アミノ基またはアミノ基を有する化学基、例えば、ヒドラジド基、すなわち、ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−である。
本発明のスペーサーとして有用な化合物には、システアミン、システイン、ヂアミン、例えば、ジアミノヘキサン、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ウレア、セミカルバジドおよびシスタミンが包含される。
スペーサーとしてシステアミンまたはシステインを使用する場合、チオール基を多糖に導入する。この場合、組み合わせて使用する有用なリンカーには、例えば、ビスマレイイミドヘキサンのようなビスマレイイミジル化合物が包含される。
本明細書に記載の適当なペプチド：多糖比を示す複合体を得るために、反応条件、例えば、誘導体化および／または活性化工程に関与する試薬の濃度をテストし、調整することは当業者が適宜行える範囲のものである。さらなるガイダンスを以下に示す。
多糖のアミノ基が反応する場合、反応は、好ましくは、カルボジイミド化合物、例えば、（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）の存在下、pＨ４〜７で行われる。ただし、反応に関与するリンカーまたはスペーサーの官能基はカルボキシルである。
多糖のカルボキシル基が反応する場合、反応は、好ましくは、上記のようなカルボジイミド化合物の存在下で行われる。ただし、反応に関与するリンカーまたはスペーサーの官能基は、アミノ基である。
多糖の繰り返し単位：カルボジイミドのモル比は、有利には、０．１〜２、好ましくは０．１〜１、より好ましくは０．２〜０．６の範囲である。容易に理解できるごとく、この比を調整することにより、繰り返し単位当たりのペプチドの量を調節できる。
多糖のアミノ基がスクシンイミジルまたはスルホスクシンイミジルと反応する場合、反応は、有利には、pＨ６〜９、好ましくは約７．５で行われる。スクシンイミジル基はアミノ基とだけ反応する。適当な実験条件を使用する場合（例えば、過剰のリンカー）、ほとんど即座、すなわち、約５分以内に反応する。反応に使用する多糖がアミノ基を有する天然多糖であれば、スクシンイミジル基の置換量を調節する唯一の可能性は、反応溶媒の希釈を高めるか、またはリンカーの量を低減するような不利な実験条件を使用する（さもないと、反応が即座に起こり、全てのアミノ基が置換される）。これにより、ペプチドの繰り返し単位に対する割合を調整することが可能となる。多糖上にアミノ基を誘導するために加水分解または誘導体化を使用する場合、この割合は、多糖上でのアミノ基の出現を調節することにより、容易に調節できる。
多糖のヒドロキシ基を反応させる場合、反応は好ましくは、シアン化合物の存在下、この化合物が臭化シアンであれば、pＨ８〜１２で、この化合物が１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム・テトラフルオロアセテートであれば、pＨ６〜１０、好ましくは、６〜８で行われる。多糖繰り返し単位：シアノ化合物のモル比は、有利には、０．１〜３、好ましくは０．１〜２の範囲である。
多糖鎖に沿って存在するアルデヒド基が反応する場合、反応は好ましくは、シアノボロヒドリド、例えば、ＮaＣＮＢＨ3の存在下、pＨ６．５〜８で行われる。
本発明の方法を実施することにより、多糖とペプチド部分が、リンカーまたはリンカーとスペーサーとの組み合わせを介して結合し、リンカーまたはリンカー／スペーサー部分が最適な長さを有し、多糖−ペプチド結合が安定である複合体が得られる。さらに、多糖の繰り返し単位に対するペプチドの比が免疫目的に最適な複合体が得られる。
以下、本発明をさらに説明する。
実施例１
以下の配列を有する合成１０５マー・ペプチドの調製
活性化およびカップリングは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−３，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミンの存在下に行った。１−２、４、１０−１３、１７、２７、３２、４９、５９、６６、７５−７８、８４−８５、８８、９６−９７および１０４−１０５サイクルにおいて、ダブルカップリングを行い、遊離のアミノ基を無水酢酸でアシル化してブロックした。最後のサイクルの後、ペプチドをピペリジンで脱保護し、最終生成物を無水酢酸でＮ−末端アセチル化した。
側鎖の脱保護および樹脂担体からの開裂は、２．１％（ｖ／ｖ）１，２−エタンジオール、４．２％（ｖ／ｖ）チオアニソール、４．２％（ｖ／ｖ）水、６．２％（ｖ／ｖ）フェノールおよび８３％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して室温にて３時間行った。樹脂を濾去し、溶液が無色になるまでトリエチルシランを滴下した。ついで、この溶液を室温で３時間インキュベートした。ｔ−ブチルメチルエーテルで沈澱させ、ついで遠心分離し、凍結乾燥して粗ペプチド（３６０ｍｇ）を回収した。粗ペプチド（１３０ｍｇ）を、５０ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭエチルモルホリン（４０ｍｌ、pＨ８．３）に溶解し、室温で一夜インキュベートした。１０％ＴＦＡでpＨを３．５に調整し、アセトニトリルの２５〜４５％（ｖ／ｖ）グラジエント、０．１％ＴＦＡ（１０ｍｌ分-1）、グラジエント０．３３％分-1を用いる逆相ＨＰＬＣ（Pep-S，C2/C8，100Å pore size，12μm 22.5mm×25cmm,Pharmacia）でペプチドを精製した。ペプチドは、約２５％アセトニトリルにおいて１つのピークとして溶出し、さらに使用する前に、このピーク（７３ｍｇ）を凍結乾燥した。ＨＰＬＣによる分析およびマス・スペクトル分析は、最終生成物の６５％以上が所望の配列に相当したことを示した。Ｎ−末端配列は、Ｎ−末端アセチル化前に取り出した試料のＮ−末端エドマン・シーケンシングによって確認した。
実施例２
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ多糖−ペプチド複合体
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃからの莢膜多糖（以下、多糖Ｃと称する）の乾燥粉末を、Gotschlich et al, J. Exp. Med.（1969）129:1349に記載される抽出法により得た。多糖Ｃ１００ｍｇを０．２Ｍ ＮaＣlに溶解し、最終濃度１１．１ｍｇ／ｍｌとした（溶液Ａ）。並行して、０．２Ｍ ＮaＣl中、０．２Ｍアジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）の溶液を調製した（溶液Ｂ）。０．２Ｍ ＮaＣl中、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）の０．５Ｍ溶液も調製した（溶液Ｃ）。９ｍｌの溶液Ａ、１０ｍｌの溶液Ｂおよび１ｍｌの溶液Ｃを混合し、５ｍｇ／ｍｌの多糖Ｃ、０．１２５ＭのＡＤＨおよび０．０２５ＭのＥＤＡＣを含有する調製物を得た。０．１Ｍ ＨＣlを添加してpＨを６．５に調整し、このpＨを４５分間の全反応期間中維持した。温度は約２０℃であった。
反応を、４０μlの０．１Ｎ ＮaＯＨにより停止させた。pＨは７．１に上昇した。反応混合物を０．５Ｍ ＮaＣl、１０ｍＭリン酸塩、ついで水に対して透析し、凍結乾燥した。
誘導体化された多糖ＣのサイズをＨＰＬＣ排除カラムＴＳＫ４０００（Tosohaas製）で調節した。その結果、誘導体化の間、解重合が起こらなかったことが示された。
誘導体化の間、約３．４％の繰り返し単位がＮＨ2基によって誘導体化された。
凍結乾燥生成物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（pＨ７）に濃度６．２５ｍｇ／ｍｌで溶解し、脱気した。窒素雰囲気下、Ｎ−（γ−マレイイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、濃度２５ｍｇ／ｍｌで溶解し、ついで等量の誘導体化多糖Ｃに添加した。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で９０分間撹拌した。活性化多糖ＣをセファデックスＧ５０排除カラムクロマトグラフィーで精製した。排除フラクションを回収し、限外濾過（３０Ｋ Amicon膜）により約７．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮した溶液を脱気した。
実施例１で得られたペプチド２０ｍｇを、窒素雰囲気下、濃度１０ｍｇ／ｍｌで水に溶解した。このペプチド溶液１．５ｍｌを、活性化多糖Ｃを含有する調製物１．２ｍｌに、マレイイミド残基／チオール残基の比が２となるように添加した。反応混合物を室温で撹拌しながら一夜保持した。ついで、０．０１０ｍｌのメルカプトエタノールを添加して、未反応のマレイイミド残基を不活性化した。
複合体生成物を４ＢＣＬセファロースカラムで精製した。糖類（シアル酸）およびペプチドの存在について、溶出フラクションを分析した。両方の分析で陽性反応を示したフラクションを貯めた。
シアル酸残基の量はSvennerholm L., Biochem. Biophys. Acta（1957）24:604に記載された投薬量法（dosage method）で、また、ペプチドの量はLowry et al, J. Biol. Chem.（1951）193:265の方法に従って測定した。（ペプチド）／（多糖Ｃの繰り返し単位）の比（モル／モル）は１：１８（重量／重量比１．８：１に相当）であることが示された。
実施例３
エス・ニウモニアエ多糖−ペプチド複合体
ストレプトコッカス・ニウモニアエ４型からの莢膜多糖（以下、ニウモ４多糖と称する）の乾燥粉末をＷＯ８２／０１９９５号記載の抽出法により得た。ニウモ４多糖１００ｍｇを最終濃度１１．１ｍｇ／ｍｌで０．２Ｍ ＮaＣlに溶解した（溶液Ａ）。並行して、０．２Ｍ ＮaＣl中、０．２５Ｍアジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）の溶液を調製した（溶液Ｂ）。０．２Ｍ ＮaＣl中、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）の０．５Ｍ溶液も調製した（溶液Ｃ）。９ｍｌの溶液Ａ、１０ｍｌの溶液Ｂおよび１ｍｌの溶液Ｃを混合し、５ｍｇ／ｍｌのニウモ４多糖、０．１２５ＭのＡＤＨおよび０．０２５ＭのＥＤＡＣを含有する調製物を得た。１Ｎ ＨＣlを添加してpＨを４．９に調整し、このpＨを３０分間の全反応期間中維持した。温度は約２５℃であった。
反応を、０．２８ｍｌの１Ｎ ＮaＯＨにより停止させた。pＨは７．５に上昇した。反応混合物を０．５Ｍ ＮaＣlついで水に対して透析し、凍結乾燥した。
誘導体化されたニウモ４多糖のサイズをＨＰＬＣ排除カラムＴＳＫ４０００（Tosohaas製）で調節した。誘導体化の間、解重合が起こらなかった。
誘導体化の間、約８．２％のニウモ４多糖の繰り返し単位がＮＨ2基によって誘導体化された。
凍結乾燥生成物を０．０５Ｍ ＮaＣlに濃度２．７６ｍｇ／ｍｌで溶解し、脱気した。窒素雰囲気下、Ｎ−（γ−マレイイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、濃度２５ｍｇ／ｍｌで溶解した。このＧＭＢＳ溶液１．７５ｍｌを、窒素雰囲気下、該多糖溶液１６ｍｌに添加した。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で５時間撹拌した。活性化ニウモ４多糖をセファデックスＧ５０排除カラムクロマトグラフィーで精製した。排除フラクションを回収し、限外濾過（３０Ｋ Amicon膜）により約７ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮した溶液を脱気した。
実施例１で得られたペプチド２０ｍｇを窒素雰囲気下、濃度４．６ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＮaＣlおよび０．０１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７）に溶解した。一方、このペプチド溶液２．２ｍｌを、活性化ニウモ４多糖を含有する調製物１．２５ｍｌに、マレイイミド残基／チオール残基の比が１となるように添加した（ニウモ４−ペプチド−１複合体）。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で撹拌しながら６時間、ついで＋４℃で一夜保持した。ついで、０．００５ｍｌのメルカプトエタノールを各反応混合物に添加して、未反応のマレイイミド残基を不活性化した。
複合体生成物をセファロース４ＢＣＬカラムで精製した。糖類およびペプチドの存在について、溶出フラクションを分析した。両方の分析で陽性反応を示したフラクションを貯めた。
糖の量はDubois et al, Anal. Chem.（1956）３:350に記載された投薬量法（dosagemethod）で、また、ペプチドの量はLowry et al, J. Biol. Chem.（1951）193:265の方法に従って測定した。（ペプチド／多糖）の繰り返し単位の比（モル／モル）はＰｎ４−ペプチド−１複合体について１：３０（ｗ／ｗ比０．４：１に相当）であった。
実施例４
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ多糖−ペプチド複合体
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａからの莢膜多糖（以下、多糖Ａと称する）の乾燥粉末を、Gotschlich et al, J. Exp. Med.（1969）129:1349に記載される抽出法により得た。多糖Ａ１００ｍｇを水に溶解し、最終濃度５ｍｇ／ｍｌとした（溶液Ａ）。並行して、水中、臭化シアン（ＣＮＢr）の濃度６７ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した（溶液Ｂ）。０．５Ｍ ＮaＨＣＯ3中、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）の濃度１５０ｍｇ／ｍｌ溶液も調製した（溶液Ｃ）。２０ｍｌの溶液Ａおよび０．７５ｍｌの溶液Ｂを混合し、多糖／ＣＮＢrの重量／重量比１の調製物を得た。０．１Ｍ ＮaＯＨを添加してpＨを１０．８に調整し、このpＨを６０分間の全反応期間中維持した。温度は約２０℃であった。
０．１５ｍｌの０．１Ｎ ＨＣlでpＨを８．５に下げた。。１７ｍｌの溶液Ｃを添加し、ＡＤＨ／多糖の重量／重量比を３．５とした。このpＨを１５分間維持した。反応混合物を＋４℃で撹拌下に一夜保持した。０．１ｍｌの１Ｎ ＨＣlを加えてpＨを７に低下させた。反応混合物を０．５Ｍ ＮaＣlついで水に対して透析し、凍結乾燥した。
誘導体化された多糖ＡのサイズをＨＰＬＣ排除カラムＴＳＫ４０００（Tosohaas製）で調節した。誘導体化の間、解重合が起こらなかった。
誘導体化の間、約２．５％の多糖Ａの繰り返し単位がＮＨ2基によって誘導体化された。
実施例２の方法を使用して誘導体化された多糖Ａを活性化し、実施例１で得られたペプチドに活性化多糖Ａを結合させた。
実施例５
実施例２で得られたナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ複合体を用いた免疫原性試験
多糖複合体における担体としての実施例１のペプチドの有用性は、つぎのようにして示される。
容量０．５ｍｌ（各注射）の皮下経路およびアジュバントを使用した場合は、腹腔内経路で以下の組成物の１つを１６週令のＮＭＲＩマウスに投与した。
a）アジュバントなしで、５μｇの多糖Ｃ（ペプチドなし）を第１、１５および２９日に；
ｂ）第１日は、フロイントの完全アジュバントと共に、第１５および２９日は、フロイントの不完全アジュバントと共に５μｇの多糖C（ペプチドなし）；
ｃ）第１日は、フロイントの完全アジュバントと共に、第１５および２９日は、フロイントの不完全アジュバントと共に、多糖Ｃ５μｇおよびペプチド９μｇ；
ｄ）アジュバントなしで、多糖Ｃ１μｇおよびペプチド１．８μｇを含有する実施例２で得られらた複合体を第１、１５および２９日に；
ｅ）アジュバントなしで、多糖Ｃ５μｇおよびペプチド９μｇを含有する実施例２の複合体を第１、１５および２９日に；
ｆ）第１日は、フロイントの完全アジュバントと共に、多糖Ｃ５μｇおよびペプチド９μｇを含有する実施例２で得られた複合体、第１５および２９日は、フロイントの不完全アジュバントと共に実施例２で得られた複合体；
ｇ）ジフテリア抗毒素（ＤＴ）と一緒の多糖Ｃ５μｇの複合体。
第１５、２９および４３日（第１の免疫日から計算）に、血液試料を採取し、抗多糖Ｃ抗体をＥＬＩＳＡにより力価測定した。結果を次表にまとめる。
実施例６
実施例３で得られたエス・アウレウス複合体を用いた免疫原性試験
ペプチド：多糖の比（ｗ／ｗ）０．４：１（繰り返し単位当たりのペプチドの比率（モル／モル）１：３０）の実施例３で調製した複合体を実施例５のプロトコールを用いてマウスにおいてテストした。これは、アジュバントの存在下でマウスにおいて免疫原性であり、第２の注射後、ブースター効果をもたらした。結果を表２に示す。
Claims (20)
- （ｉ）少なくとも６つのアミノ酸残基を有しており、そのうちの少なくとも１つがシステイン残基であるペプチドを、（ii）少なくとも４つの繰り返し単位を含む多糖と結合させる方法であって、
Ａ．（ｉ）式（Ｉ）Ｒ１−Ａ−Ｒ２（式中、Ｒ１は、マレイミジル基であり、Ａは、置換されているかまたは置換されていない芳香族または脂肪族炭素鎖であり、Ｒ２は、スクシンイミジル基であって多糖のアミノ基と反応する）で示される二官能性リンカーで多糖を活性化して、活性化多糖を得ること；および
（ii）Ｒ１がシステイン残基のチオール基と反応するように該活性化多糖をペプチドと結合させて、複合体を得ること（ここで、複数のペプチド体が多糖鎖に沿って共有結合でランダムに導入される）；または
Ｂ．（ｉ）式（II）Ｒ３−Ｂ−Ｒ４（式中、Ｒ３は、アミノ基、カルボキシル基またはヒドロキシル基と反応することができる官能基であって多糖のアミノ基、カルボキシル基またはヒドロキシル基と反応し、Ｂは、芳香族または脂肪族炭素鎖であり、Ｒ４は、アミノ基である）で示されるスペーサーで多糖を誘導体化して、誘導体化多糖を得ること（ここで、複数のスペーサー体が多糖鎖に沿ってランダムに導入される）；
（ii）式（Ｉ）Ｒ１−Ａ−Ｒ２（式中、Ｒ１は、マレイミジル基であり、Ａは、置換されているかまたは置換されていない芳香族または脂肪族炭素鎖であり、Ｒ２は、スクシンイミジル基であってＲ４と反応する）で示される二官能性リンカーで該誘導体化多糖を活性化して、活性化多糖を得ること；
（iii）Ｒ１がペプチドのシステイン残基のチオール基と反応するように該活性化多糖をペプチドと結合させて、複合体を得ること（ここで、複数のペプチド体が多糖鎖に沿って共有結合でランダムに導入される）
を含む方法。 - ペプチドが、システイン残基を含め、６〜２００アミノ酸残基を含有する請求項１記載の方法。
- ペプチドが、システイン残基を含め、１５〜１００アミノ酸残基を含有する請求項２記載の方法。
- ペプチドが、システイン残基を含め、２０〜５０アミノ酸残基を含有する請求項３記載の方法。
- システイン残基が、ペプチドのＮ−またはＣ−末端に位置する請求項１〜４いずれか１つに記載の方法。
- ペプチドが、Ｔ−依存性エピトープを含有する請求項１〜５いずれか１つに記載の方法。
- 多糖が、細菌性リポ多糖類のＯ−特異性鎖、無毒化細菌性リポ多糖類および莢膜多糖類から選択される天然多糖である請求項１〜６いずれか１つに記載の方法。
- 多糖が、制御された酸性または塩基性加水分解によるＮ−アセチル基を含む天然多糖から由来する請求項１〜７いずれか１つに記載の方法。
- 多糖が莢膜多糖から選択される天然物である請求項７または８記載の方法。
- 多糖が４〜３０００繰り返し単位からなる請求項１〜９いずれか１つに記載の方法。
- 多糖が４〜１０００繰り返し単位からなる請求項１０記載の方法。
- 多糖が７〜７００繰り返し単位からなる請求項１１記載の方法。
- 式（Ｉ）で示されるリンカーが、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（４−マレイイミジルフェニル）ブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−３−マレイイミドベンゾエートおよびＮ−（γ−マレイイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）からなる群から選択される請求項１〜１２いずれか１つに記載の方法。
- 式（II）で示されるスペーサーがアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である請求項１〜１３いずれか１つに記載の方法。
- 得られる複合体がペプチド１モルにつき５０モルの繰り返し単位（１：５０）から、ペプチド１モルにつき１モルの繰り返し単位（１：１）までを含有するように結合が行われる請求項１〜１４いずれか１つに記載の方法。
- 得られる複合体がペプチド１モルにつき３０モルの繰り返し単位（１：３０）から、ペプチド１モルにつき３モルの繰り返し単位（１：３）までを含有するように結合が行われる請求項１５に記載の方法。
- 得られる複合体がペプチド１モルにつき２０モルの繰り返し単位（１：２０）から、ペプチド１モルにつき５モルの繰り返し単位（１：５）までを含有するように結合が行われる請求項１６に記載の方法。
- 請求項１〜１７いずれか１つに記載の方法によって生成される複合体および医薬上許容される希釈剤または担体を含む、免疫応答を惹起するための組成物。
- アジュバントを含まない請求項１８記載の組成物。
- 請求項１〜１７いずれか１つに記載の方法によって生成される、複合体の多糖部分に対する免疫応答を誘発するための複合体。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9844601B2 (en) | 2001-01-23 | 2017-12-19 | Sanofi Pasteur Inc. | Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040001842A1 (en) * | 1997-05-12 | 2004-01-01 | Dov Michaeli | Immunogenic compositions to the CCK-B/gastrin receptor and methods for the treatment of tumors |
| DE19821859A1 (de) * | 1998-05-15 | 1999-12-09 | M Alexander Schmidt | Darstellung immunogener (Kapsel-)Polysaccharid-Konjugate durch orientierte Kupplung synthetischer T-Zell-Epitope zur Erzeugung von Vakzinen gegen N.meningitidis |
| US7223845B2 (en) | 1998-06-16 | 2007-05-29 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Synthetic glycosulfopeptides and methods of synthesis thereof |
| AU773542B2 (en) * | 1998-06-16 | 2004-05-27 | Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The | Glycosulfopeptides and methods of synthesis and use thereof |
| US6858211B1 (en) * | 1998-07-20 | 2005-02-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccines against Escherichia coli O157 infection |
| US7723296B2 (en) | 2001-01-18 | 2010-05-25 | Genzyme Corporation | Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof |
| US20030091574A1 (en) | 2001-03-23 | 2003-05-15 | Gevas Philip C. | Combination treatment of pancreatic cancer |
| US20090191232A1 (en) | 2001-05-04 | 2009-07-30 | Gevas Philip C | Combination therapy for the treatment of tumors |
| US20030035806A1 (en) * | 2001-05-11 | 2003-02-20 | D'ambra Anello J. | Novel meningitis conjugate vaccine |
| GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
| GB0220198D0 (en) * | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture |
| US6695447B1 (en) | 2002-09-30 | 2004-02-24 | Eastman Kodak Company | Ink jet recording element |
| US20050118199A1 (en) * | 2003-10-07 | 2005-06-02 | Esser Mark T. | Process for covalently conjugating polysaccharides to microspheres or biomolecules |
| WO2006032980A1 (en) | 2004-09-22 | 2006-03-30 | Receptor Biologix, Inc. | Monoclonal antibolies to progastrin |
| TWI264608B (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-21 | Delta Electronics Inc | Light tunnel module |
| ES2346693T3 (es) * | 2005-10-06 | 2010-10-19 | Nestec S.A. | Enterococos probioticos que permiten mejorar la unidad. |
| TW200745163A (en) * | 2006-02-17 | 2007-12-16 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Peptides that block the binding of IgG to FcRn |
| FR2899110A1 (fr) * | 2006-03-31 | 2007-10-05 | Sanofi Pasteur Sa | Polysaccharides capsulaires de type 5 et de type 8 des souches surproductrices de staphylococcus aureus |
| LT2457920T (lt) | 2007-01-18 | 2018-02-12 | Genzyme Corporation | Oligosacharidai, apimantys aminooksigrupę, ir jų konjugatai |
| EA201070231A1 (ru) * | 2007-08-09 | 2010-10-29 | Синтоникс Фармасьютикалз, Инк. | Иммуномодулирующие пептиды |
| JP2009242372A (ja) * | 2008-03-11 | 2009-10-22 | Yokohama City Univ | 均一な糖鎖構造を有するエリスロポエチン誘導体 |
| WO2010014909A1 (en) * | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunomodulatory peptides |
| JP5658167B2 (ja) | 2008-12-16 | 2015-01-21 | ジェンザイム・コーポレーション | オリゴ糖−タンパク複合体 |
| NZ597007A (en) | 2009-05-14 | 2013-09-27 | Sanofi Pasteur | Meningococcus vaccine containing lipooligosaccharide (los) from modified strains of l6 immunotype neisseria meningitidis |
| EP2429658B1 (fr) | 2009-05-14 | 2016-04-20 | Sanofi Pasteur | Procédé pour adjuver le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à gram-négatif |
| GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| WO2013082149A1 (en) | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Case Western Reserve University | Polysaccharide therapeutic conjugates |
| WO2015184453A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | Case Western Reserve University | Retinylamine derivitives for treatment of ocular disorders |
| US11129845B2 (en) | 2014-06-18 | 2021-09-28 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
| US10925980B2 (en) | 2014-08-04 | 2021-02-23 | Case Western Reserve University | Molecular probes and methods of use |
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Cited By (3)
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