ES2346693T3 - Enterococos probioticos que permiten mejorar la unidad. - Google Patents

Abstract

Utilización de una bacteria Enterococcus probiótica, administrada oralmente, en la preparación de un medicamento para incrementar la eficacia vacunal de una vacuna de FVH-1, FCV o FPV en un animal felino.

Description

Enterococos probióticos que permiten mejorar la inmunidad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la nutrición de los mamíferos y a los efectos de la misma sobre la respuesta inmunológica. En particular, la presente invención utiliza organismos probióticos, administrados oralmente en un animal felino, para mejorar la inmunidad tanto innata como adaptativa y para incrementar la eficacia de la vacuna en el animal.

Antecedentes de la invención

Se citan durante toda la memoria diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, y artículos técnicos y académicos. Las citaciones completas para las publicaciones no citadas por completo dentro de la memoria se proporcionan al final de la misma.

Se han definido los probióticos como microorganismos vivos que, al administrarse en cantidades adecuadas, proporcionan un efecto de salud sobre el huésped (Schrezenmeir J. et al., 2001). Se ha planteado la hipótesis de que los probióticos proporcionar sus efectos beneficiosos sobre la salud mediante el incremento de la resistencia a la colonización de las superficies mucosales por parte de las bacterias patogénicas (resistencia a la colonización) (Sanders M.E., 2003) o ejerciendo un efecto directo sobre el tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal (GALT), resultando en la producción de sustancias inmunomoduladoras (Isolauri E. et al., 2001a, y MacPherson A.J. et al., 2004).

Se han utilizado los probióticos para modular el curso de una diversidad de enfermedades infecciosas en medicina humana (Isolauri E., 2001b). En contraste, se han realizado pocos estudios en medicina veterinaria, siendo la mayoría de los estudios de veterinaria en animales grandes, en los que los probióticos se han utilizado para alterar la expulsión de patógenos fecales (Kim L.M. et al., 2001) o para mejorar parámetros de producción tales como la ganancia de peso, la tasa de conversión de alimento y la mortalidad reducida. En un estudio animal, se alimentó la cepa SF68 de Enterococcus faecium (NCIMB10415) a un grupo de cachorros vacunados con virus del moquillo canino (CDV) en comparación con un grupo de control que únicamente recibió vacunaciones (Benyacoub J. et al., 2003). Los cachorros suplementados con SF68 presentaban concentraciones totales de IgA en suero y fecales, concentraciones incrementadas en suero de IgG e IgA específicas del CDV y un porcentaje incrementado de linfocitos B circulantes en comparación con cachorros de control, demostrando un efecto potenciador de la inmunidad inducido por este probiótico.

La panleucopenia felina (FPV) es un virus que resulta en viremia seguido de enfermedad gastrointestinal severa; los cachorros de gato apropiadamente vacunados presentan inmunidad esterilizante (Richards J. et al., 2001). Sin embargo, las infecciones víricas del tracto respiratorio superior continúan siendo un problema importante en la medicina felina (Sykes J.E. et al., 1999). La rinotraqueitis felina (FHV-1) y el calicivirus felino (FCV) son los dos patógenos víricos implicados en el síndrome. Aunque las vacunas de FCV inducen una eficacia relativa >95% en los vacunados en comparación con controles no vacunados tras ser inoculados con una cepa de reto patogénica, las vacunas de FHV-1 únicamente inducen una eficacia relativa de aproximadamente 60% (Lappin M.R. et al., 2002). De esta manera, FHV-1 continúa siendo un problema significativo a pesar de la vacunación generalizada (Sykes J.E. et al., 1999). Entre los intentos realizados anteriormente para mejorar la eficacia de la vacunación se incluyen la administración intranasal, que conduce a efectos secundarios mayores (Scott F.W. et al., 1999) y la manipulación genética de las cepas virulentas, lo que conduce a una severidad reducida de la enfermedad pero no reduce la prevalencia del estado de portador (Slater E. et al., 1976). El estado de portador puede conducir a la recrudescencia o reinfección del huésped, así como a la transmisión a compañeros domésticos. Se han intentado múltiples terapias para las infecciones crónicas por FHV-1, incluyendo el interferón alfa, la trefinación, los fármacos antivíricos, la rinotomía, los glucocorticoides, los descongestionantes tópicos y los antibióticos dirigidos a infecciones bacterianas secundarias (Van Pelt D.R. et al., 1994). Sin embargo, ninguno de ellos ha sido capaz de eliminar la infección vírica crónica; por lo tanto, son comunes las recurrencias de excreción vírica y enfermedad clínica. Las respuestas inmunológicas tanto mediadas por células como mucosales de IgA se consideran importantes en la prevención y control de las infecciones por herpesvirus \alpha (Lappin M.R. et al., 2002, y Slater E. et al., 1976). Resultan necesarias vacunas de FHV-1 o respuestas a vacunaciones mejoradas para reducir la morbilidad inducida por este patógeno.

Descripción resumida de la invención

Se apreciará que el alcance de la protección es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de una bacteria Enterococcus probiótica, administrada oralmente, en la preparación de un medicamento para incrementar la eficacia de una vacuna de FHV-1, FCV o FPV en un animal felino.

En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende una o más bacterias Enterococcus probióticas, administradas oralmente, para incrementar la eficacia vacunal de una vacuna de FVH-1, FCV o FPV en un animal felino.

La modulación de la respuesta inmunológica y el incremento de la eficacia de la vacuna sirven para proteger al animal y para reducir la morbilidad y mortalidad inducidas por los patógenos.

En determinadas realizaciones, la composición es una composición alimentaria o un suplemento dietético para una mascota o animal. En diversas realizaciones, entre los organismos probióticos se incluyen por lo menos uno de entre Enterococcus spp., solos o en combinación con otros organismos probióticos, tales como Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Bifidobacterium spp., o Saccharomyces spp. En realizaciones preferentes, el organismo probiótico es Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68). Las composiciones pueden comprender ingredientes adicionales. Por ejemplo, se incluyen uno o más compuestos que incrementan adicionalmente la inmunidad, tales como 7-oxo-deshidroepiandrosterona.

En determinadas realizaciones, las composiciones se formulan para animales de compañía, tales como los gatos. En otras realizaciones, las composiciones se formulan para animales que no son de compañía, particularmente para miembros de la familia de los felinos.

También se describe un método para modular la inmunidad en un animal, que comprende administrar en el animal de manera periódica una composición que comprende uno o más organismos probióticos, tal como se ha indicado anteriormente, en una cantidad eficaz para modular la inmunidad en el animal. En algunos ejemplos, el método se aplica a un animal de compañía, tal como un gato. En otras realizaciones, el método se aplica a animales no de compañía, particularmente a miembros de la familia de los felinos.

Se describe además un método para incrementar la eficacia vacunal en un animal, que comprende administrar en el animal de manera periódica una composición que comprende uno o más organismos probióticos, tal como se ha indicado anteriormente, en una cantidad eficaz para incrementar la eficacia de la vacuna en el animal. En algunos ejemplos, la vacuna es del virus de la rinotraqueitis felina, el calicivirus felino o el virus de la panleucopenia felina. En algunos ejemplos, el método se aplica en un animal de compañía, tal como un gato. En otros ejemplos, el método se aplica a animales no de compañía, particularmente a miembros de la familia de los felinos.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes haciendo referencia a los dibujos, descripción detallada y ejemplos siguientes.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Pesos corporales (a) y puntuaciones fecales (b) durante el tiempo en cachorros de gato suplementados con 150 mg de digerido de pollo PO (placebo, n=9) ó 150 mg de digerido de pollo mezclado con 5x10^{8} cfu/día de Enterococcus faecium cepa SF68 (Tratamiento, n=9) diariamente desde las 7 semanas de edad hasta las 27 semanas de edad. Los cachorros de gato se vacunaron subcutáneamente con una vacuna de FHV-1 viva modificada^{d} disponible comercialmente a las 9 y 12 semanas de edad. Los diagramas de cajas y bigotes representan el mínimo, el máximo, la mediana y los percentiles 25 y 75. p>0,05 para todos los puntos temporales.

Figura 2. Resultados de IgA específica de FHV-1 en suero (a) y en saliva (b) en cachorros de gato con (Tratamiento) o sin (Placebo) suplementación de SF68. Las cajas con bigotes representan el mínimo, máximo, mediana y percentiles 25 y 75. p>0,05 para todos los puntos temporales.

Figura 3. Resultados de IgG específica de FHV-1 en suero en cachorros de gato con (Tratamiento) o sin (Placebo) suplementación de SF68. Las cajas con bigotes representan el mínimo, máximo, mediana y percentiles 25 y 75. p>0,05 para todos los puntos temporales.

Figura 4. Resultados de IgG específica del FCV en cachorros de gato con (Tratamiento) o sin (Placebo) suplementación de SF68. Las cajas con bigotes representan el mínimo, el máximo, la mediana y los percentiles 25 y 75. p>0,05 para todos los puntos temporales.

Figura 5. Resultados de IgG específica del FPV en cachorros de gatos con (Tratamiento) o sin (Placebo) suplementación de SF68. Las cajas con bigotes representan el mínimo, el máximo, la mediana y los percentiles 25 y 75. p>0,05 para todos los puntos temporales.

Figura 6. IgG total (a) e IgA total (b) en extractos fecales de cachorros de gato con (Tratamiento) o sin (Placebo) suplementación de SF68. Las cajas con bigotes representan el mínimo, el máximo, la mediana y los percentiles 25 y 75. p>0,05 para todos los puntos temporales.

Figura 7. El porcentaje de linfocitos seleccionados positivos para CD4 (a) y CD8 (b) en sangre periférica mediante citometría de flujo en cachorros de gato con (Tratamiento) o sin (Placebo) suplementación de SF68. Las cajas con bigotes representan el mínimo, el máximo, la mediana y los percentiles 25 y 75. *indica los puntos temporales en los que el grupo de tratamiento era significativamente superior al grupo de placebo.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas Definiciones

Se utilizan diversas expresiones referentes a aspectos de la presente invención durante la memoria y las reivindicaciones. Dichas expresiones deben recibir el significado ordinario que presentan en la técnica, a menos que se indique lo contrario. Otras expresiones definidas específicamente deben interpretarse de un modo consistente con la definición proporcionada en la presente memoria.

Pueden utilizarse las abreviaturas siguientes en la memoria y ejemplos: FHV-1, virus de la rinotraqueitis felina; FCV, calicivirus felino; FPV, virus de la panleucopenia felina; spp., especies; ELISA, ensayo de inmunosorción ligada a enzima; DM, materia seca; CFU, unidades formadoras de colonia; kg, kilogramo; BW, peso corporal.

La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto, material o composición, tal como se indica en la presente memoria, que resulta eficaz para conseguir un resultado biológico particular. Entre dichos resultados se incluyen, aunque sin limitación, mejorar la inmunidad o potenciar la eficacia vacunal en un animal. Dicha actividad eficaz puede conseguirse, por ejemplo, mediante la administración de las composiciones de la presente invención en el animal.

Dentro del contexto de la presente memoria, el término "aproximadamente" se interpreta que se refiere a opcionalmente más o menos 20%, más preferentemente opcionalmente más o menos 10%, todavía más preferentemente opcionalmente más o menos 5%, todavía más preferentemente opcionalmente más o menos 2%, todavía más preferentemente opcionalmente más o menos 1%.

La expresión "que comprende" se interpreta que se refiere a "incluye, entre otras cosas..." y no pretende referirse a "consistente de únicamente...".

La expresión "inmunidad adaptativa" o "respuesta inmunológica adaptativa" se utilizan intercambiablemente y en un sentido amplio en la presente memoria, y se refieren a la respuesta inmunológica frente al reto antigénico, incluyendo el desarrollo de memoria inmunológica. La respuesta inmunológica adaptativa incluye, sin limitación, la inmunidad humoral y celular.

La expresión "inmunidad humoral" o "respuesta inmunológica humoral" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a la producción de moléculas de inmunoglobulina en respuesta a un reto antigénico.

La expresión "inmunidad celular" o "respuesta inmunológica celular" o "inmunidad mediada por células" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria, y se refieren a la activación de linfocitos citotóxicos o linfocitos T ayudantes, células mononucleares y citoquinas en respuesta a un reto antigénico. La expresión comprende toda inmunidad adaptativa que no puede transferirse a un receptor no expuesto utilizando anticuerpos.

La expresión "inmunidad innata" se refiere a los mecanismos no específicos del cuerpo para la resistencia frente a patógenos, que no resulta incrementada tras el reto posterior con un antígeno particular.

La expresión "modula la inmunidad" o "modulación de la inmunidad" se refiere a cualquier incremento o inhibición de la capacidad del cuerpo de generar una respuesta inmunológica innata o adaptativa frente al reto antigénico, según la medición por cualquier medio adecuado de la técnica.

La expresión "eficacia vacunal" se refiere a la capacidad de una vacuna de producir un efecto terapéutico o protector deseado sobre un animal frente a un patógeno especificado. La expresión "eficacia vacunal incrementada" se refiere a cualquier mejora de la capacidad de una vacuna de producir un efecto terapéutico o protector deseado en un animal frente a un patógeno especificado, según medición por cualquier medio adecuado de la técnica.

La expresión "organismo probiótico" se refiere a cualquier organismo, particularmente a microorganismos, que ejerce un efecto beneficioso sobre el animal huésped, tal como una salud o resistencia a enfermedad incrementadas. Los organismos probióticos pueden mostrar una o más de las características no limitativas siguientes: no patogénicos o no tóxicos para el huésped; se encuentran presentes como células viables, preferentemente en grandes números; son capaces de sobrevivir, metabolizar y persistir en el ambiente gastrointestinal (por ejemplo, resistencia al pH bajo y a los ácidos y secreciones gastrointestinales); adherencia a las células epiteliales, particularmente las células epiteliales del tracto gastrointestinal; actividad microbiocida o microbiostática o presentan un efecto en las bacterias patogénicas; actividad anticarcinogénica; actividad de modulación inmunológica, particularmente potenciación inmunológica; actividad moduladora de la flora endógena; salud incrementada del tracto urogenital; actividad antiséptica en heridas o en áreas circundantes a las mismas y cicatrización incrementada de heridas; reducción de la diarrea; reducción de las reacciones alérgicas; reducción de la enterocolitis necrotizante neonatal; reducción de la enfermedad intestinal inflamatoria; y reducción de la permeabilidad intestinal (Reid G. et al., 2003; Drisko J.A. et al., 2003; y Oyetayo V.O. et al., 2004).

Un "animal de compañía" es cualquier animal domesticado, e incluye, aunque sin limitación, gatos, perros, conejos, cobayas, hurones, hámsters, ratones, gerbillos, caballos, vacas, cabras, ovejas, burros, cerdos y similares. Se ejemplifican los gatos en la presente memoria. En algunos ejemplos, el "animal" puede ser un ser humano. En otro ejemplo, la invención se refiere a animales que no son animales de compañía.

La invención se refiere a miembros de la familia Felidae, la familia de los gatos, a la que puede aplicarse la invención en casos en los que el gato se encuentre disponible para recibir la administración de la composición probiótica (por ejemplo en un parque zoológico, instalación veterinaria, reserva de caza, y similar). Además del gato doméstico, Felis cattus, la familia Felidae incluye miembros de los géneros: (1) Acinonyx, tal como el guepardo (A. jubatus), (2) Neofelis, tal como la pantera nebulosa (N. nebulosa), (3) Panthera, tal como el león (P. leo), el jaguar (P. onca), el leopardo (P. pardus), el tigre (P. tigris); (3) Uncia, tal como el leopardo nival (U. uncial); (4) Puma, tal como el león americano, el león de montaña o el puma (P. concolor), y (5) diversas especies de gatos no domesticados (Felis), incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el gato rojo de Borneo (F. badia), el caracal (F. caracal), el gato chino de montaña (F. bieti), el gato de la selva (F. chaus), el gato del desierto (F. margarita), el gato patinegro (F. nigripes), los gatos silvestres (F. sylvestris, F. lybica), el jaguarondi (F. yagouraroundi), el ocelote (F. pardalis), la oncilla (F. tigrina), el margay (F. wieldi), el serval (F. serval), el lince (F. lynx), el lince rojo (F. rufus), el gato del pajonal (F. colocolo), el gato de Geoffroy (F. geoffroyi), el gato andino (F. jacobita), el gato de pallas (F. manul), el gato kodkod (F. guigna), el gato leopardo (F. bengalensis, F. iriomotensis), el gato de cabeza plana (F. planiceps), el gato de pintas rojizas (F. rubiginosus), el gato pescador (F. viverrina) y el gato dorado africano (F. aurata). Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "felino" o "animal felino" se refiere a todos los miembros de la familia de los gatos, a menos que se indique lo contrario.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "alimento para mascotas", "composición de alimento para mascotas", "alimento animal" o "composición de alimento animal" se refiere a una composición destinada a la ingestión por un animal, y preferentemente por animales de compañía. Un "alimento para mascotas o animal completo y nutricionalmente equilibrado" es un alimento que contiene todos los nutrientes requeridos conocidos en cantidades y proporcione apropiadas basadas en las recomendaciones de las autoridades reconocidas en el campo de la nutrición animal y es, por lo tanto, capaz de servir como única fuente de ingestión de la dieta para mantener en vida o estimular la producción sin la adición de fuentes nutricionales suplementarias. Los alimentos para mascotas nutricionalmente equilibrados y las composiciones alimentarias animales son ampliamente conocidos y utilizados en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "suplemento dietético" es un producto destinado a su ingestión además de la dieta normal de un animal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "producto alimentario formulado para el consumo humano" es cualquier composición destinada a la ingestión por un ser humano.

Para los fines de redactar una memoria clara y concisa, se describen determinadas realizaciones en la presente memoria, aunque se apreciará que algunas características de dichas realizaciones pueden combinarse o separarse de manera diversa dentro del alcance de la invención.

Descripción

Los inventores han observado que la suplementación dietética con organismos probióticos, tales como Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) en cachorros de gato incrementa el número de linfocitos CD4+. Por consiguiente, diversos aspectos de la presente invención utilizan dichos resultados mediante la provisión de composiciones dietéticas que incrementan la eficacia vacunal en el animal.

Composiciones

Un aspecto de la invención proporciona composiciones que comprenden una o más bacterias Enterococcus probióticas, administradas oralmente, para incrementar la eficacia vacunal de una vacuna de FVH-1, FCV o FPV en un animal felino.

Los organismos probióticos pueden encontrarse presentes en la composición en forma de un ingrediente o activo. Los organismos probióticos pueden ser procariotas, eucariotas o arqueobacterias. En diversas realizaciones de la composición, los organismos probióticos comprenden por lo menos uno de entre cualquier cepa o subespecie adecuada de Enterococcus, solo o en combinación con otros organismos probióticos, incluidos en géneros tales como Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Bifidobacterium o Saccharomyces. Entre las especies de Enterococcus se incluyen, aunque sin limitación, Enterococcus faecium, específicamente E. faecium SF68, así como otros enterococos, tales como E. faecium DSM 10663 (M74), E. faecium GHR 017 DSM 7134, E. faecium CECT 4515, E. faecium CL15/ATCC 19434, E. faecium NCIMB 11181/DSM 5464, E. faecium 202 IMB 52/DSM 3530, E. faecium CNCM MA 17/5U, E. faecium 202 DSM 4788/ATCC53519, E. faecium 301 DSM 4789/ATCC 55593, E. faecium ATCC 19434, E. faecium EF-101 ATCC 19434 y E. faecium AK 2205 BCCM/LMG S-16555. Entre las especies de Streptococcus se incluyen, aunque sin limitación, Streptococcus faecium, Streptococcus thermophilus y Streptococcus salivarus. Entre las especies de Lactobacillus se incluyen, aunque sin limitación, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus GG (Lactobacillus rhamnosus o Lactobacillus casei subespecie rhamnosus), Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii LA1, Lactobacillus acidophilus NCFB 1748, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus acidophilus DDS-1, Lactobacillus delbrueckii subespecie delbrueckii, Lactoacillus delbrueckii subespecie bulgaricus tipo 2038, Lactobacillus acidophilus SBT-2062, Lactobacillus salivarius UCC 118, Lactobacillus paracasei ST11, y Lactobacillus paracasei subespecie paracasei F19. Entre las especies de Lactococcus se incluyen, aunque sin limitación, Lactococcus lactis y Lactococcus plantarum. Entre las especies de Bacillus se incluyen, aunque sin limitación, Bacillus subtilis. Entre las especies de Bifidobacterium se incluyen, aunque sin limitación, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium lactis. Entre las especies de Saccharomyces se incluyen, aunque sin limitación, Saccharomyces boulardii (cerevisiae).

En una realización preferente, las composiciones de la invención son composiciones alimentarias para mascotas o animales. Entre ellas se incluyen ventajosamente alimentos destinados a suministrar los requisitos dietéticos necesarios, así como piscolabis (por ejemplo galletas) u otros suplementos dietéticos. Opcionalmente, las composiciones alimentarias para mascotas o animales pueden ser una composición seca (por ejemplo bolas "kibbles"), una composición semihúmeda, una composición húmeda o cualquiera mezcla de las mismas. Las composiciones se formulan para el consumo de un animal felino, incluyendo, aunque sin limitación, un gato doméstico.

En otra realización preferente, la composición es un suplemento dietético, tal como una salsa de carne, agua de bebida, refresco, concentrado líquido, yogur, polvos, gránulos, pasta, suspensión, masticable, bocado, piscolabis, tentempié, pellet, píldora, cápsula, tableta o cualquier otra forma de administración. Los suplementos dietéticos pueden formularse especialmente para el consumo por un animal felino. En una realización detallada, el suplemento dietético puede comprender una concentración elevada de organismos probióticos, de manera que el suplemento puede administrarse en el animal en cantidades reducidas, o alternativamente, puede diluirse antes de la administración en un animal. El suplemento dietético puede requerir la mezcla con agua antes de la administración en el animal.

La composición puede refrigerarse o congelarse. Los organismos probióticos pueden premezclarse con los demás componentes de la composición para proporcionar las cantidades beneficiosas necesarias, pueden utilizarse para recubrir una composición alimentaria para mascotas, suplemento dietético o producto alimentario o puede añadirse a la composición antes de ofrecerla al animal, por ejemplo utilizando unos polvos o una mezcla.

Las composiciones de la invención comprenden organismos probióticos en una cantidad eficaz para incrementar la eficacia vacunal en un animal en el que se ha administrado la composición. Pueden formularse alimentos para mascotas para que contengan organismos probióticos en el intervalo de entre aproximadamente 10^{12} y aproximadamente 10^{11} unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de composición. Los suplementos dietéticos pueden formularse para que contengan concentraciones varias veces más altas de organismos probióticos, para que resulte posible la administración en un animal en la forma de una tableta, cápsula, concentrado líquido u otra forma de dosificación similar, o para diluirse antes de las administraciones, tal como mediante dilución en agua, pulverización o rociado sobre un alimento para mascotas, y otros modos similares de administración.

En un ejemplo, la concentración de organismos probióticos en la composición es una función de la cantidad necesaria para modular las funciones inmunológicas, incluyendo un incremento de la proporción y/o número de linfocitos CD4+ en la sangre del animal. En una realización, la concentración de organismos probióticos en la composición es una función de una cantidad necesaria para incrementar la concentración de inmunoglobulinas reactivas contra antígenos de un patógeno especificado en el suero sanguíneo, heces, secreciones, tales como leche, lágrimas y saliva. El nivel de linfocitos CD4+ y la concentración de inmunoglobulinas en el suero sanguíneo, heces, secreciones tales como leche, lágrimas y saliva del animal pueden determinarse por cualquier medio reconocido y apreciado por el experto en la materia.

Las composiciones de la invención opcionalmente pueden comprender sustancias suplementarias, tales como minerales, vitaminas, sales, condimentos, colorantes y conservantes. Entre los ejemplos no limitativos de minerales suplementarios se incluyen calcio, fósforo, potasio, sodio, hierro, cloro, boro, cobre, zinc, magnesio, manganeso, yodo, selenio y similares. Entre los ejemplos no limitativos de vitaminas suplementarias se incluyen vitamina A, diversas vitaminas B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K. También pueden incluirse suplementos dietéticos adicionales, por ejemplo niacina, ácido pantoténico, inulina, ácido fólico, biotina, aminoácidos y similares.

Las composiciones de la invención opcionalmente pueden comprender una o más sustancias suplementarias que estimulan o sostienen un sistema inmunológico sano, o además modular la inmunidad. Entre dichas sustancias se incluyen, aunque sin limitación, L-arginina, esteroides, tales como 7-oxo-deshidroepiandrosterona (7-oxo-DHEA), carotenoides, tales como antioxidantes alfa-caroteno y beta-caroteno, y hierbas o extractos herbales, tales como astrágalo y equinácea.

En diversas realizaciones, las composiciones alimentarias animales o de suplemento dietético de la invención pueden comprender, en base materia seca, entre aproximadamente 15% y aproximadamente 50% de proteína cruda, en peso de la composición. El material de proteína cruda puede comprender proteínas vegetales, tales como soja, algodón y proteínas de cacahuete o proteínas animales, tales como caseína, albúmina y proteína cárnica. Entre los ejemplos no limitativos de proteínas cárnicas útiles en la presente invención se incluyen porcino, oveja, equino, ave, pescado y mezclas de los mismos.

Las composiciones pueden comprender además, en base materia seca, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 40% de grasa, en peso de la composición. Las composiciones pueden comprender además una fuente de carbohidratos. Las composiciones pueden comprender, en una base de materia seca, entre aproximadamente 15% y aproximadamente 60% de carbohidrato, en peso de la composición. Entre los ejemplos no limitativos de dichos carbohidratos se incluyen granos o cereales, tales como arroz, maíz, sorgo, alfalfa, cebada, soja, canola, avena, trigo y mezclas de los mismos. Las composiciones también pueden comprender opcionalmente otros materiales, tales como suero seco y otros productos secundarios lácteos.

Las composiciones también pueden comprender por lo menos una fuente de fibra. Puede utilizarse una diversidad de fibras solubles o insolubles, tal como conocerá el experto ordinario en la materia. La fuente de fibra puede ser pulpa de remolacha (de remolacha azucarera), goma arábiga, goma talha, psyllium, salvado de arroz, goma de algarroba, pulpa de cítrico, pectina, fructooligosacárido adicional a la oligofructosa de cadena corta, mananoligofructosa, fibra de soja, fibra de lupina, arabinogalactano, galactooligosacárido, arabinoxilano o mezclas de los mismos. Alternativamente, la fuente de fibra puede ser una fibra fermentable. La fibra fermentable ha sido descrita previamente para proporcionar un beneficio para el sistema inmunológico de animales de compañía. También puede incorporarse fibra fermentable u otras composiciones conocidas por el experto en la materia que proporciona una composición prebiótico que podría potenciar el crecimiento de los microorganismos probióticos dentro del intestino, como adyuvante de la potenciación del beneficio proporcionado por la presente invención al sistema inmunológico de un animal.

En una realización detallada, la composición es un alimento para mascota o animal completo y nutricionalmente equilibrado. En este contexto, el alimento para mascotas puede ser un alimento húmedo, un alimento seco, o un alimento de contenido de humedad intermedio, tal como reconocería el experto en la materia de la formulación y fabricación de alimentos para mascotas. La expresión "alimento húmedo" describe alimentos para mascotas que típicamente se comercializa en latas o bolsas de papel de aluminio, y presenta un contenido de humedad típicamente comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 70% y aproximadamente 90%. La expresión "alimento seco" describe alimento para mascotas que es de una composición similar a la del alimento húmedo, pero contiene un contenido de humedad limitado, típicamente en el intervalo de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 15%, y por lo tanto se presenta, por ejemplo, en forma de bolas kibbles de tipo galleta pequeña. Las composiciones y suplementos dietéticos pueden formularse especialmente para animales adultos, o para animales de mayor edad o más jóvenes, por ejemplo un "alimento animal para cachorros" o formulación "sénior". En general, las formulaciones especializadas comprenden requisitos energéticos y nutricionales apropiados para animales en diferentes estadios del desarrollo o de edad.

Determinados aspectos de la invención se utilizan preferentemente en combinación con un alimento completo y equilibrado (por ejemplo, tal como se describen en National Research Council, Nutritional Requirements for Dogs and Cats, National Academy Press, Washington D.C., 2006, o Association of American Feed Control Officials, Official Publication, 1996). Es decir, las composiciones que comprenden organismos probióticos según determinados aspectos de la presente invención preferentemente se utilizan con un alimento comercial de alta calidad. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "alimento comercial de alta calidad" se refiere a una dieta preparada para producir una digestibilidad de los nutrientes clave de 80% o más, tal como se indica en, por ejemplo, las recomendaciones del National Research Council anteriormente indicadas, para perros y gatos, o en las directrices proporcionadas por la Association of American Feed Control Officials. Se utilizan estándares nutricionales elevados similares para otros animales.

El experto en la materia conocerá cómo determinar la cantidad apropiada de organismos probióticos que deben añadirse a una composición dada. Dichos factores que pueden considerarse se incluyen el tipo de composición (por ejemplo composición alimentaria para mascotas, suplemento dietético o producto alimentario), el consumo medio de tipos específicos de composiciones por diferentes animales y las condiciones de fabricación bajo las que se prepara la composición. Las concentraciones de organismos probióticos que deben añadirse a la composición pueden calcularse basándose en los requisitos energéticos y nutricionales del animal. Según determinados aspectos, los organismos probióticos pueden añadirse en cualquier momento durante la fabricación y/o procesamiento de la composición. Lo anterior incluye, aunque sin limitación, como parte de la formulación de la composición alimentaria para mascotas, suplemento dietético o producto alimentario formulado, o como recubrimiento aplicado a la composición alimentaria para mascotas, suplemento dietético o producto alimentario.

Las composiciones pueden prepararse según cualquier método adecuado de la técnica, tal como, por ejemplo, el descrito en Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, editor ATB Edney, capítulo por A. Rainbird, titulado "A Balanced Diet", en las páginas 57 a 74, Pergamon Press, Oxford.

Métodos

Se describen métodos para incrementar la eficacia vacunal en un animal felino que comprende administrar en el animal una composición que comprende uno o más organismos probióticos en una cantidad eficaz para incrementar la eficacia vacunal en el animal. En algunos ejemplos, la vacuna es para el virus de la panleucopenia felina, el virus de la rinotraqueitis felina o el calicivirus felino.

En ejemplos detallados, la composición es una composición alimentaria para mascotas o animal, suplemento dietético o producto alimentario tal como se ejemplifica en la presente memoria. En un ejemplo detallado adicional, entre los organismos probióticos se incluyen por lo menos uno de entre Enterococcus spp., preferentemente E. faecium, más preferentemente la cepa SF68, sola o en combinación con otro organismo probiótico, incluyendo uno o más Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Bifidobacterium spp., o Saccharomyces spp., tal como se ha indicado anteriormente.

Las composiciones pueden administrarse en el animal mediante cualquiera de entre una diversidad de vías alternativas de administración. Entre dichas vías se incluyen, aunque sin limitación, las vías oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, intragástrica, transpilórica, subcutánea, rectal y similar. Según la invención reivindicada, las composiciones se administran oralmente. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "administración oral" o "administrar oralmente" se refiere a que el animal ingiere o se dirige a un ser humano a alimentarse, o se alimenta, una o más composiciones inventivas indicadas en la presente memoria.

En el caso de que se dirija al ser humano a alimentarse de la composición, dicha dirección puede ser la de que se instruya y/o informe al ser humano que la utilización de la composición puede proporcionar y/o proporcionará el beneficio referenciado, por ejemplo el incremento de la eficacia vacunal en el animal. Dicha dirección puede ser la dirección oral (por ejemplo mediante una instrucción oral de, por ejemplo, un médico, veterinario u otro profesional sanitario, o medio de radio o televisión (es decir, un anuncio publicitario) o dirección escrita (por ejemplo mediante la dirección escrita de, por ejemplo, un médico, veterinario u otro profesional sanitario (por ejemplo prescripciones), profesional de las ventas u organización (por ejemplo mediante, por ejemplo, materiales publicitarios, folletos u otros materiales informativos), medios escritos (por ejemplo internet, correo electrónico u otro medio de tipo informático) y/o empaquetamiento asociado a la composición (por ejemplo una etiqueta presente en un recipiente que contiene la composición).

La administración puede realizarse según resulte necesaria o según se desee, por ejemplo una vez al mes, una vez a la semana, diariamente o más de una vez al día. De manera similar, la administración puede ser cada dos días, semanas, o meses, cada tres días, semanas o meses, cada cuatro días, semanas o meses, y similares. La administración puede ser múltiples veces al día. En el caso de que se utilice como suplemento de requisitos dietéticos ordinarios, la composición puede administrarse directamente en el animal o de otra manera ponerse en contacto o mezclarse con pienso o alimento diario. En el caso de que se utilice como pienso o alimento diario, la administración será bien conocida por el experto ordinario en la materia.

La administración también puede llevarse a cabo de manera regular, por ejemplo como parte de un régimen dietético en el animal. Un régimen dietético puede comprender causar la ingestión regular por el animal de una composición que comprende uno o más organismos probióticos en una cantidad eficaz para modular la inmunidad o para incrementar la eficacia vacunal en el animal. La ingestión regular puede ser una vez al día, o dos, tres, cuatro o más veces al día, con periodicidad diaria o semanal. De manera similar, la administración regular puede ser cada dos días o semanas, cada tres días o semanas, cada cuatro días o semanas, cada cinco días o semanas, o cada seis días os emanas, y en dicho régimen dietético, la administración puede ser múltiples veces al día. El objetivo de la administración regular es proporcionar al animal la dosis diaria preferente de organismos probióticos, tal como se ejemplifica en la presente memoria.

La dosis diaria de organismos probióticos puede medirse en términos de unidades formadoras de colonias (CFU) administradas por animal por día. La dosis diaria de organismos probióticos puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{12} CFU/día. Más preferentemente, la dosis diaria de organismos probióticos era de entre aproximadamente 10^{7} y aproximadamente 10^{9} CFU/día. Más preferentemente, la dosis diaria de organismos probióticos era de entre aproximadamente 10^{8} y aproximadamente 10^{9} CFU/día. Más preferentemente, la dosis diaria de organismos probióticos era de aproximadamente 10^{8} CFU/día.

La administración de las composiciones que comprenden uno o más organismos probióticos, incluyendo la administración como parte de un régimen dietético, puede abarcar un periodo de tiempo comprendido entre la gestación y la vida completa del animal.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para describir la invención en mayor detalle. Pretenden ilustrar, no limitar, la invención.

Ejemplo 1 Animales y parámetros experimentales

Población de estudio de felinos. Se obtuvieron veinte cachorros de gato SPF de seis semanas de edad de Liberty Laboratories (Liberty, NY). Se demostró que los cachorros de gato eran sero-negativos para el antígeno del virus de la leucemia felina y los anticuerpos del virus de la inmunodeficiencia felina mediante ELISA (Snap Combo, IDEXX Laboratories, Portland, ME).

Diseño experimental. Tras un periodo de equilibración de 10 días, los cachorros de gatos se aleatorizaron en dos grupos de diez cachorros de gato cada uno y el estudio de tratamiento se inició a las 7 semanas de edad. Se añadieron entre 0,25 y 0,28 gramos (\sim5x10^{9} CFU, basado en ensayos de recuento de dilución) de LBC ME5 PET E. faecium SF68 (NCIMB 10415) (Cerbios-Pharma SA, Suiza) a tubos individuales de centrífuga de polipropileno de fondo cónico de 50 ml, se taparon y se almacenaron a 4ºC durante todo el estudio. Se utilizaron preparaciones similares para alícuotas del intensificador de palatabilidad (un recubrimiento típico de alimentos para mascotas que comprende digerido de hígado como el componente principal utilizado) utilizando 150 mg en cada tubo. Se realizó un seguimiento de alícuotas para la absorción de agua y se descartaron en el caso de que apareciese cualquier agregado del probiótico o del intensificador de palatabilidad. Inmediatamente antes de la administración, se transfirió una alícuota del intensificador de palatabilidad a uno de los tubos almacenados de E. faecium SF68 (grupo de tratamiento) o un tubo vacío (grupo de placebo) y se diluyeron utilizando agua corriente a temperatura ambiente hasta un volumen total de 10 ml. Se agitaron con vórtex los contenidos durante por lo menos tres minutos y se transfirieron mediante aspiración a una jeringa de 12 cm^{3}. Inmediatamente después de agitar con vórtex la suspensión, los cachorros de gato apropiados recibieron la administración oral de 1 ml de E. faecium SF68 (dosis diaria total de 5x10^{8} CFU al día) o el intensificador de palatabilidad solo (cachorros de gato con placebo) hasta las 27 semanas de edad. Ambos grupos se alimentaron con alimento seco para cachorros de gato ad libitum (se utilizó la fórmula de crecimiento típica para cachorros de gato que satisfacía todos los requisitos de AAFCO y que estaba basado en pollo y arroz como ingredientes principales) y se alojaron en grupos en dos salas separadas para evitar la contaminación cruzada con el probiótico. A las 9 y 12 semanas de edad, todos los cachorros de gato fueron vacunados subcutáneamente con una vacuna de combinación viva modificada (Pfizer Animal Health, Exton, PA) para herpesvirus-1 felino, calicivirus y virus de la panleucopenia según recomendación de la American Association of Feline Practitioners (Richards J. et al., 2001).

Evaluación estadística. En cada fecha de muestreo, se calcularon los valores promedio de cada grupo para todos los parámetros medidos. Se analizaron las diferencias entre el grupo tratado con probiótico y el grupo de placebo utilizando un modelo ANOVA mixto apropiado para un experimento con mediciones repetidas. Se incluyo el tiempo en el modelo como variable continua. Se calcularon los porcentajes de muestras de gato positivas para la enterotoxina de C. perfringens o las toxinas A o B de C. difficile y los porcentajes de células seleccionadas positivas para marcadores de superficie celular para cada grupo de gatos durante todo el estudio y se compararon mediante una prueba t de dos colas (GRAPHPAD Prism, GRAPHPAD Software Inc., San Diego, CA). Se consideró que la significancia estadística era p<0,05.

Ejemplo 2 Recolección de muestras y seguimiento clínico

Se realizó un seguimiento diario durante el estudio de las actitudes y comportamiento de los cachorros de gato. Se midió semanalmente el peso corporal. Se recolectó sangre, saliva y heces de todos los gatos antes de iniciar la suplementación de probiótico o intensificador de palatabilidad a las 7 semanas de edad y a las 9, 15, 21 y 27 semanas de edad. Además, se recogieron heces de los cachorros de gato en el grupo de tratamiento a las 28 semanas de edad. Para cada grupo de cachorros de gato, se seleccionaron aleatoriamente 5 muestras fecales al día de la caja de arena compartida y se puntuaron utilizando una tarjeta de puntuación gráfica estandarizada y se determinaron las medias de grupo diarias. Se procesaron los extractos fecales para la medición de IgA total y de IgG total según el protocolo descrito por Benyacoub J. et al., 2003. Todas las muestras se almacenaron a -80ºC hasta el ensayo por lotes.

Las deposiciones de todos los cachorros de gato eran normales al inicio del periodo de suplementación (7 semanas de edad). Se extrajo un cachorro de gato de cada grupo del estudio por motivos no relacionados con el estudio y por lo tanto se extrajeron del análisis final de los datos. Las puntuaciones de peso corporal y fecal no eran estadísticamente diferentes en los dos grupos durante el tiempo o en cualquier punto temporal individual (figura 1).

Los recuentos de células sanguíneas completos, parámetros bioquímicos y pesos corporales eran similares entre grupos de gatos durante el curso del estudio. Las puntuaciones fecales eran similares entre grupos, sugiriendo también que la utilización de SF68 a la dosis indicada en la presente memoria no inducirá ninguna anormalidad clínica notable.

Ejemplo 3 Ensayos fecales

En cada fecha de muestreo, se sembraron en placa heces de cada cachorro de gato en ocho diluciones en serie de 10 veces en agar KF Streptococcus y se incubaron durante 48 horas a 37ºC aeróbicamente. Se recogieron diez colonias de cada tipo morfológico utilizando asas estériles y se introdujeron en 1,2 ml de medio de infusión de cerebro-corazón (BHI) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se almacenaron a -80ºC pendientes de realizar los análisis. Se llevó a cabo RAPD-PCR en aislados bacterianos de cada muestra para determinar la presencia de E. faecium SF68 viables en las deposiciones de los gatos tratados y para evaluar si el probiótico había sido transmitido accidentalmente de los cachorros de gato tratados a los cachorros de gato de control. Los parámetros del termociclador eran los siguientes: 30 ciclos de un minuto de desnaturalización a 95ºC, un minuto de hibridación a 40ºC, cuatro minutos de extensión a 72ºC. Los 25,5 \mul de mezcla de reacción incluían 2,45 \mul de tampón 10x sin magnesio (Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM), MgCl_{2} 3,22 mM, 0,4 \mul (1 unidad), ADN polimerasa Taq JumpStart (Sigma D-4184, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO), 1,9 \mul de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 \mul de cebador (100 \muM), 15,47 \mul de agua para PCR y 1 \mul de cultivo bacteriano. La secuencia del cebador utilizado era 5'-GGTTGGGTGAGAATTGCACG-3'. Se corrieron cinco a diez \mul del producto de PCR en un gel de dos por ciento de agarosa y se compararon los patrones de bandas con un control de SF68 positivo. Se utilizaron ELISAs comercialmente disponibles para determinar sin las enterotoxinas de Clostridium perfringens o las toxinas A/B de C. difficile se encontraban presentes en las heces de todos los cachorros de gato (C. perfringens (ELISA, kit nº 92-000-22) y C. difficile (ELISA, kit nº 94-0150-KT), Techlabs, Blacksburg, VA). Los cultivos fecales aeróbicos rutinarios para Salmonella spp. y Campylobacter spp. fueron realizados por el Colorado State University Diagnostic Laboratory.

Las heces de siete de nueve gatos de tratamiento eran positivos para SF68 en por lo menos un punto temporal durante el estudio. Sin embargo, no se amplificó ADN de SF68 de las heces de ningún gato tratado 1 semana después de detener la suplementación (semana 28). No se cultivaron ni Salmonella spp. ni Campylobacter spp. a partir de las heces. Todas las muestras de los gatos de placebo eran negativas para SF68 según la RAPD-PCR. El número de muestras positivas para las toxinas A/B de C. difficile o de enterotoxina de C. perfringens (Tabla 1) no variaban entre grupos durante el curso del estudio.

La expresión de Salmonella spp. y de Campylobacter spp. no resultó inducida por la suplementación de SF68. Varias muestras fecales en ambos grupos de cachorros de gato eran positivas para toxinas de C. difficile o de C. perfringens; sin embargo, no existía ninguna diferencia significativa entre el número de muestras positivas entre los grupos y los resultados positivos no se correlacionaban con la presencia de diarrea. Se detectó SF68 en las heces de la mayoría de gatos tratados durante el periodo de suplementación, pero ya no se detectó en las heces 1 semana después de detener la suplementación, indicando que el organismo persistía en los gatos sólo transitoriamente. De esta manera, la administración de SF68 utilizando la dosificación indicada en la presente memoria no presenta efectos perjudiciales y resulta segura para la administración en el periodo de tiempo estudiado.

Ejemplo 4 Ensayos inmunológicos

Se llevaron a cabo recuentos sanguíneos completos, paneles bioquímicos séricos y análisis de orina en el Clinical Pathology Laboratory en Colorado State University. Se estimaron respuestas inmunológicas humorales específicas de antígeno mediante la medición de IgG sérica específica de FHV-1, IgA específica de FHV-1, IgG específica de FCV, e IgG10 específica de panleucopenia felina en sueros, así como niveles de IgG y de IgA específicas de FHV-1 en saliva utilizando adaptaciones de ensayos ELISA anteriormente publicados (Lappin M.R. et al., 2002; y Ditmer D.A. et al., 1998). Para IgG e IgA específicas de FHV-1, se calcularon los resultados a partir de la absorbancia media para los pocillos de ensayo por triplicado para cada muestra y mediante el cálculo de las unidades ELISA en porcentaje (absorbancia media de la muestra de ensayo menos la absorbancia media de la muestra de control negativo/absorbancia media de la muestra de control positivo menos la absorbancia media de la muestra de control negativo multiplicado por 100). Para FCV y FPV, se utilizaron las absorbancias medias. Se estimaron las concentraciones totales de IgG y de IgA en sueros, extractos fecales y saliva mediante la utilización de ensayos ELISA comercialmente disponibles o mediante ensayo de inmunodifusión radial (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX).

Se evaluaron las respuestas inmunológicas celulares mediante citometría de flujo y los ensayos de proliferación de sangre completa. Se llevó a cabo citometría de flujo dentro de las 12 horas siguientes a la recolección de la sangre utilizando 500 \mul de sangre anticoagulada (EDTA) incubada a temperatura ambiente en tampón de lisis de glóbulos rojos (NH_{4}Cl 0,155 M/KHCO_{3} 0,010 M/rojo fenol 5x10^{-4} M (al 0,5%). Se lavaron las células dos veces con PBS y los pellets celulares resultantes se resuspendieron en tampón FACS que contenía PBS, azida sódica al 0,1% y suero fetal bovino al 2% para alcanzar una concentración de 1x10^{6} células/100 \mul en caso posible. Se contaron las muestras con células insuficientes en por lo menos 500 \mul de la suspensión anterior y se registró la densidad celular. Se añadieron cien \mul de cada suspensión celular a pocillos individuales en una placa de 96 pocillos de fondo redondo para la inmunotinción. Se bloqueó la unión no específica mediante la adición de suero de gato normal al 10% (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA). Se realizó la inmunotinción a 4ºC en la oscuridad en tampón FACS. Se tiñeron linfocitos para la expresión de CD4 y CD8 (vpg34; anti-CD4-fitc, vpg9; anticuerpos anti-CD8-rpe; Serotec, Raleigh, NC (Oxford, Reino Unido)) y la expresión de CD44 (IM7; anticuerpo anti-CD44-pe/cy5; Pharmingen, Franklin Lakes, NJ). Para el análisis de las células B, se inmunotiñó sangre completa lisada con anticuerpos de reactividad cruzada de B220 (ra3-b62; anticuerpo anti-B220 biotinilado; eBioscience, San Diego, CA), CD21 (b-ly4; anticuerpo anti-CD21-apc; BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y MHC de clase II (anticuerpo anti-MHC de clase II-fitc clon CAG5-3D1, Serotec, Raleigh, NC (Oxford, Reino Unido)). Se seleccionaron células para el análisis de entre poblaciones de linfocitos vivos basándose en características de dispersión directa y lateral. Los datos se recogieron en un citómetro Cyan MLE y se analizaron utilizando software Summit (Dako-Cytomation, Fort Collins, CO).

Se llevaron a cabo ensayos de proliferación por triplicado utilizando 10 \mul de sangre heparinizada completa preacondicionada mediante incubación en 100 \mul de medio tumoral completo a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 30 minutos antes de la adición del mitógeno o antígeno (medio tumoral completo: medio de Eagle modificado y suplementado con aminoácidos esenciales y no esenciales + FBS al 10%). Las células se mantuvieron en medio solo (no estimulado) o estimulado con concanavalina A (10 \mug/ml: Con A, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), o una preparación de antígeno FHV-1 (1 \mul/pocillo, preparado antes del inicio del estudio y almacenado en alícuotas a -80ºC) durante 96 horas a 37ºC con 5% de CO_{2} (Veir J.K. et al., 2005). Se pulsaron las células con 1 \muCi de timidina tritiada por pocillo y se recolectaron 18 horas después sobre esteras de filtro de fibra de vidrio (Wallac-Microbeta Perkin-Elmer, Boston, MA). Las esteras se leyeron utilizando un contador de centelleo líquido MicroBetas. Se calculó el índice de estimulación medio (recuento máximo medio por cada muestra estimulada dividido por recuento máximo medio por cada muestra no estimulada) para todas las muestras.

Los recuentos sanguíneos completos y perfiles bioquímicos se encontraban dentro de límites normales para el grupo de edad para todos los gatos en todos los puntos temporales. No existía diferencia estadística entre los grupos durante el tiempo o en cualquier punto temporal individual entre los ensayos analizados. A las 21 y 27 semanas de edad, los niveles medios de IgA específica de FHV-1 en suero y saliva eran numéricamente mayores en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo, aunque las diferencias no eran estadísticamente significativas (figura 2). A las 15, 21, y 27 semanas de edad, los niveles medios de IgG sérica específica de FHV-1 eran numéricamente mayores en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo según ambos ensayos, aunque las diferencias no eran estadísticamente significativas (figura 3). No se detectó IgG específica de FHV-1 en la saliva. Los niveles de IgG específica de FCV en suero eran similares entre grupos (figura 4). A las 15 semanas de edad, los niveles de IgG media específica de FPV del grupo de tratamiento eran numéricamente superiores a los del grupo de placebo, aunque las diferencias no eran estadísticamente significativas (figura 5).

Las concentraciones de IgG y de IgA totales en suero eran similares entre grupos (datos no mostrados). No se detectó IgG total en saliva y las concentraciones totales de IgA en saliva eran similares entre grupos (datos no mostrados). A las 27 semanas de edad, las concentraciones medias del grupo de tratamiento de IgG total en extractos fecales eran numéricamente superiores a los del grupo de placebo, aunque las diferencias no eran estadísticamente significativas (figura 6). Las concentraciones de IgA total en extractos fecales eran similares entre grupos (figura 6).

Los ensayos de proliferación utilizando concanavalina A 10 \mug/ml o 1 \mul de preparación de antígeno FHV-1 como estimulantes no dio lugar a recuentos máximos medios significativamente diferentes entre grupos en cualquier punto temporal. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para ningún marcador de superficie celular en los primeros cuatro puntos temporales (figura 7). A las 27 semanas de edad, el grupo de tratamiento (media: 13,87%) presentaba un porcentaje significativamente superior de linfocitos seleccionados positivos para CD4 que el grupo de placebo (media: 10,61%, p=0,0220). Ninguna otra comparación fue significativamente diferente.

El incremento del número de CD4+ en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de placebo sin un incremento concurrente del número de CD8+ a las 27 semanas de edad demuestra efectos moduladores inmunológicos sistémicos por parte del probiótico. La detección de parámetros de respuesta inmunológica humoral numéricamente superior en algunos tiempos de recolección sugiere que se había producido la estimulación de respuestas de Th1. Esta hipótesis se ve apoyada por los resultados del estudio de suplementación de SF68 en cachorros (Benyacoub J. et al., 2003).

Tras las vacunaciones, cada uno de los cachorros de gato desarrolló respuestas de anticuerpos séricos específicos de FHV-1, FCV y FPV que eran similares a otros estudios que indican que eran inmunocompetentes y que la vacuna viva modificada era viable (Lappin M.R. et al., 2002). Algunos de los resultados también indican que la provisión del probiótico influyó sobre las respuestas inmunológicas humorales y mediadas por células de dichos cachorros de gato. Entre ellas se incluyen la detección de recuentos de linfocitos CD4+ significativamente mayores a las 27 semanas de edad y valores medios numéricamente superiores de IgA específica de FHV-1 en suero y saliva a las 21 y 27 semanas de edad, de niveles de IgG específica de FHV-1 en suero a las 15, 21 y 27 semanas de edad, de niveles de IgG específica de FPV en suero a las 15 semanas de edad, y concentraciones totales de IgG en extractos fecales a las 27 semanas de edad en comparación con el grupo de placebo.

Referencias

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Claims (16)

1. Utilización de una bacteria Enterococcus probiótica, administrada oralmente, en la preparación de un medicamento para incrementar la eficacia vacunal de una vacuna de FVH-1, FCV o FPV en un animal felino.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el medicamento es una composición alimentaria o un suplemento dietético.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el Enterococcus probiótico es E. faecium cepa SF68.

4. Utilización según cualquier reivindicación anterior, en la que el Enterococcus probiótico se encuentra presente en una cantidad de entre por lo menos aproximadamente 10^{2} y aproximadamente 10^{11} unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de formulación.

5. Utilización según cualquiera reivindicación anterior, en la que el medicamento comprende además 7-oxo-deshidroepiandrosterona (7-oxo-DHEA).

6. Utilización según cualquier reivindicación anterior, en la que el medicamento comprende además por lo menos un tipo adicional de organismo probiótico.

7. Utilización según cualquiera reivindicación anterior, en la que el animal felino es un gato doméstico.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el incremento de la eficacia vacunal en el animal resulta de la producción incrementada de linfocitos CD4+ en el animal.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el incremento de la eficacia vacunal en el animal resulta en una concentración incrementada de inmunoglobulinas reactivas contra antígenos de un patógeno especificado en el suero sanguíneo, heces, leche, lágrimas, saliva, epitelio respiratorio o epitelio gastrointestinal del animal.

10. Composición que comprende una o más bacterias Enterococcus probióticas, administradas oralmente, para la utilización en el incremento de la eficacia vacunal de una vacuna de FVH-1, FCV o FPV en un animal felino.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que la composición es una composición alimentaria animal o suplemento dietético.

12. Composición según la reivindicación 10 ó 11, en la que el Enterococcus probiótico es E. faecium cepa SF68.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que el Enterococcus probiótico se encuentra presente en una cantidad de entre por lo menos aproximadamente 10^{2} y aproximadamente 10^{11} CFU por gramo de formulación.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que el animal felino es un gato doméstico.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en la que el incremento de la eficacia vacunal en el animal resulta en la producción incrementada de linfocitos CD4+ en el animal.

16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en la que el incremento de la eficacia vacunal en el animal resulta en una concentración incrementada de inmunoglobulinas reactivas contra antígenos de un patógeno especificado en el suero sanguíneo, heces, leche, lágrimas, saliva, epitelio respiratorio o epitelio gastrointestinal del animal.