ES2262667T3 - Probioticos nuevos para aplicaciones en alimento para animales de compañia. - Google Patents
Probioticos nuevos para aplicaciones en alimento para animales de compañia.Info
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Abstract
Cepa probiótica que es Lactobacillus reuteri NCC2581 (NCMC I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (NCMC I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (NCMC I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (NCMC I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (NCMC I-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (NCMC I-2453).
Description
Probióticos nuevos para aplicaciones en alimento
para animales de compañía.
La presente invención está relacionada con
bacterias ácido lácticas y, en particular, con microorganismos de
los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus
(Enterococcus) que han sido aislados y seleccionados por su
potencial probiótico. Se proporciona un método para la obtención de
dichas cepas probióticas. La presente invención también está
relacionada con un método de preparación de composiciones de
alimento para animales de compañía cuyo propósito es mejorar la
salud de estos animales, y con las composiciones que contienen las
mismas cepas.
El bienestar de los animales de compañía está
estrechamente relacionado con su alimentación. Una alimentación
adecuada debe conllevar una mascota sana y en forma. La composición
del alimento, además de aportar valor nutricional, ejerce una
influencia sobre el equilibrio de la microflora intestinal y puede
provocar o prevenir trastornos gastrointestinales. Por lo tanto, es
crucial conocer el tubo gastrointestinal y los procesos digestivos
de los animales sanos para la comprensión de una práctica
alimentaria adecuada. Los gatos y los perros son carnívoros y por
esta razón presentan un tubo digestivo corto y un tránsito del bolo
alimenticio rápido.
De entre los constituyentes de la microflora
gastrointestinal de gatos y perros se pueden recuperar los
siguientes microorganismos: Bacteroides sp, Clostridium sp.,
Enterobacteriaceae, Bifidobacteruim sp., Lactobacillus sp.,
Streptococcus sp., Staphylococcus sp. Y levaduras.
El número y la composición de esta flora
endógena tienden a ser bastante estables a pesar de que la edad y,
en menor medida, el alimento pueden modificarlos. Los ácidos
gástricos, la bilis, la peristalsis intestinal y la inmunidad local
son factores que se consideran importantes en la regulación de la
flora bacteriana del intestino delgado de los seres humanos y de
otros mamíferos.
Los trastornos gastrointestinales caninos y
felinos a menudo están asociados con una proliferación bacteriana y
con la producción de enterotoxinas generadas por bacterias
patógenas.
La investigación de los últimos años se ha
centrado en algunas cepas valiosas de bacterias ácido lácticas y en
el uso potencial de las mismas como agentes probióticos. Se
considera que los probióticos son preparaciones microbianas viables
que promueven la salud de los mamíferos al preservar la microflora
intestinal natural. Se piensa que los probióticos se adhieren a la
mucosa intestinal, colonizan el tubo intestinal y de esta manera
evitan la adhesión de microorganismos perjudiciales a la mucosa. Un
prerrequisito para su acción consiste en que deben alcanzar la
mucosa intestinal en una forma adecuada y viable y, especialmente,
no ser destruidas a causa del bajo pH del estómago. Más
concretamente, la fisiología del tubo digestivo de gatos y perros
difiere de la de los humanos. Por ejemplo, el pH medio del estómago
es aproximadamente de 3,4 en los perros y de 4,2 en los gatos.
La publicación de Hartemink, R. y Rombouts, F.M.
("Comparison of media for the detection of bifidobacteria,
lactobacilli and total anaerobes from faecal samples", Journal of
Microbiological Methods, 1999, vol. 36, p. 181-192)
trata acerca de los medios utilizados para la detección y
caracterización de cepas microbianas.
El artículo de Fujisawa, T. Y Mitsuoka, T.
("Homofermentative Lactobacillus species predominantly
isolated from canine feces", Journal of Veterinary Medical
Science, 1996, vol. 58, no. 6, p. 591-593) revela
el aislamiento de cepas de Lactobacillus a partir de heces
caninas.
US 5922375 se refiere al aislamiento de una cepa
de Bifidobacterium a partir de las heces de un lactante y al
suplemento de alimentos con dicha cepa. En este documento el pienso
está suplementado con una cepa probiótica aislada a partir de
humanos.
WO 9608261 relata la inclusión de
microorganismos probióticos y un portador en productos de
alimentación animal de manera que los microorganismos alcanzan el
intestino grueso donde se desarrollan. Los microorganismos
probióticos obtenidos a partir de colecciones de cultivos
disponibles comercialmente o de aislados de heces humanas son
utilizados para alimentar ratones y cerdos.
WO 99/17788 describe un método para tratar o
evitar la candidiasis en un animal mediante la administración de una
cepa probiótica. Estas cepas probióticas utilizadas provienen de una
diversidad de fuentes que incluyen el yogur, las heces humanas o
animales y las abejas melíferas.
Finalmente, a pesar de que US 5968569 revela la
inclusión de un microorganismo probiótico en un cereal de alimento
para animales de compañía, donde las fuentes comerciales de los
microorganismos provienen de productos lácteos o de heces
infantiles, ni la misma ni el resto de técnicas disponibles
proporcionan información acerca de cepas pensadas específicamente
para la salud de animales de compañía.
En consecuencia, es necesario proporcionar cepas
bacterianas nuevas que estén especialmente adaptadas para animales
de compañía y que hayan sido seleccionadas por sus elevadas
propiedades probióticas beneficiosas para la salud animal. También
es necesario incorporar estas cepas en una composición de alimento
para animales de compañía.
De acuerdo con un primer aspecto de la
invención, se proporciona un microorganismo probiótico nuevo de las
bacterias ácido lácticas seleccionado por su capacidad de sobrevivir
en el tubo gastrointestinal de un animal de compañía y colonizarlo,
y por su capacidad de ejercer una actividad probiótica beneficiosa
para la salud de las mascotas.
La cepa probiótica se puede seleccionar a partir
de lactobacilos, bifidobacterias o enterococos.
La cepa probiótica puede seleccionarse a partir
del grupo formado por: Lactobacillus reuteri, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis,
Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus
paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum y
Bifidobacterium spp., Enterococcus faecium y Enterococcus
spp.
En una realización preferida la cepa probiótica
es seleccionada a partir del grupo formado por Lactobacillus
reuteri (NCC2581; CNCM I-2448), Lactobacillus
reuteri (NCC2592; CNCM I-2450),
Lactobacillus rhamnosus (NCC2583; CNCM
I-2449), Lactobacillus reuteri (NCC2603; CNCM
I-2451), Lactobacillus reuteri (NCC2613; CNCM
I-2452) y Lactobacillus acidophilus
(NCC2628; CNCM I-2453).
La cepa bacteriana nueva se puede utilizar en
cualquier cantidad desde aproximadamente 1,0E+04 hasta
aproximadamente 1,0E+12 ufc/animal y día, preferiblemente desde
1,0E+05 hasta aproximadamente 1,0E+11 ufc/animal y día y más
preferiblemente desde 1,0E+07 hasta aproximadamente 1,0E+10
ufc/animal y día.
La cepa bacteriana descrita anteriormente puede
utilizarse para preparar una composición cuya aplicación es el
tratamiento y/o la prevención de trastornos asociados a la
colonización del tubo gastrointestinal de animales de compañía por
microorganismos patógenos.
La cepa bacteriana descrita anteriormente puede
utilizarse también para preparar una composición cuya aplicación
sea la de regular la respuesta inmunitaria de los animales de
compañía. El término "regular" la respuesta inmunitaria
significa que las bacterias descritas anteriormente poseen la
capacidad de estimular ciertas funciones inmunitarias importantes
para la salud del animal o bien modular otras funciones inmunitarias
que pueden estar potencialmente implicadas en enfermedades
inmunitarias como inflamación, alergia, etc. La estimulación o
modulación de estas funciones inmunitarias se puede conseguir
utilizando diferentes combinaciones de las cepas bacterianas antes
descritas.
En un aspecto, la invención proporciona un
método de obtención de cepas probióticas para gatos y perros que
comprende los siguientes pasos:
a) aislamiento de bacterias ácido lácticas a
partir de heces de gato y perro
b) selección de cepas con capacidad de crecer
produciendo al menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de
sales biliares y con capacidad de crecer produciendo al menos
1,0E+06 ufc/ml tras dos horas a un pH que oscila entre 3,4 y
4,2.
La invención proporciona también un método para
preparar una composición de alimento para gatos o para perros cuya
función es mantener o mejorar la salud general del tubo
gastrointestinal, la piel, el pelo y el sistema inmunitario de una
mascota. El método comprende los siguientes pasos:
a) aislamiento de bacterias ácido lácticas a
partir de heces de gato y perro
b) selección de cepas con capacidad de crecer
produciendo al menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0%
de sales biliares y con capacidad de crecer produciendo al menos
1,0E+06 ufc/ml tras dos horas a un pH que oscila entre 3,4 y 4,2
c) incorporación de la cepa(s)
seleccionada(s) en una composición de alimento para gatos o
para perros.
Se puede llevar a cabo un método para el
tratamiento o prevención de trastornos asociados a la colonización
del tubo gastrointestinal por microorganismos patógenos. El método
comprende el paso de alimentar a un animal de compañía con una
composición de alimento para mascotas que contiene por lo menos una
cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Se puede llevar a cabo un método para la
regulación de la respuesta inmunitaria de los animales de compañía,
método que comprende el paso de alimentar a un animal de compañía
con una composición de alimento para mascotas que contiene por lo
menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Se puede llevar a cabo un método para mejorar o
reducir los efectos del envejecimiento en un animal de compañía,
método que comprende el paso de alimentar a un animal de compañía
con una composición de alimento para mascotas que contiene por lo
menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Estos microorganismos seleccionados tienen un
impacto beneficioso particular sobre el tubo gastrointestinal de
los animales de compañía, sobre su piel o pelo, sobre su sistema
inmunitario y sobre los efectos del envejecimiento.
Tienen un impacto beneficioso particular sobre
los patógenos intestinales como cepas de Salmonella
typhimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteriaea u
otras enterobacteriaceas patógenas que colonizan animales de
compañía, o parásitos como helmintos (Toxocara spp.),
protozoos (Cryptosporidium spp., Giardia spp.,
Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma
gondii,...) o levaduras.
Estos microorganismos, combinados con el
alimento, ejercen particularmente sus efectos probióticos
beneficiosos sobre la palatabilidad, la digestión y la salud del
intestino, la función inmunitaria y las condiciones sanitarias. En
el último caso ejercen los efectos beneficiosos al contribuir en la
reducción del volumen fecal y una desodorización, por lo menos
parcial, de las heces caninas. Por lo tanto, de acuerdo con un
segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para
preparar una composición de alimento para animales de compañía que
contiene un microorganismo con una actividad probiótica elevada en
animales de compañía y que es capaz de sobrevivir en el tubo
gastrointestinal de un animal de compañía que haya ingerido dicho
microorganismo, e incluso colonizarlo.
Por consiguiente, la invención está relacionada
con un método de preparación de una composición de alimento para
animales de compañía dirigida a la salud del tubo gastrointestinal
de las mascotas, que contiene por lo menos una cepa probiótica
aislada de la manera antes descrita y que está asociada a un
vehículo ingerible o a una matriz farmacéutica.
Se puede utilizar una composición de alimento
para animales de compañía dirigida a la regulación de la respuesta
inmunitaria de las mascotas, que contiene por lo menos una cepa
probiótica aislada de la manera antes descrita y que está asociada
a un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
La invención también está relacionada con un
método de preparación de una composición de alimento para animales
de compañía dirigida a la mejora o reducción de los efectos del
envejecimiento en las mascotas, que contiene por lo menos una cepa
probiótica aislada de la manera antes descrita y que está asociada a
un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
Finalmente, la invención está relacionada con un
método de preparación de una composición de alimento para animales
de compañía dirigida a la salud de la piel y el pelo de las
mascotas, que contiene por lo menos una cepa probiótica aislada de
la manera antes descrita y que está asociada a un vehículo ingerible
o una matriz farmacéutica.
En una realización, el vehículo ingerible está
formado por una composición de alimento para animales de compañía
nutricionalmente equilibrada. Dicha composición contiene
preferiblemente una cantidad suficiente de la cepa aislada para que
proporcione de manera efectiva el efecto profiláctico antes
mencionado cuando se administra la composición en forma de comida
completa a una mascota.
En la siguiente descripción la abreviatura ufc
("unidad formadora de colonias") designa el número de células
bacterianas reveladas en los recuentos microbiológicos sobre placas
de agar.
Además, "NCC" designa Nestlé Culture
Collection, colección de cultivos Nestlé, (Nestlé Research Center,
Vers-chez-les-Blanc,
Laussane, Suiza).
En relación con el primer objeto de la presente
invención se analizaron y seleccionaron 20 lactobacilos y 18
bifidobacterias aisladas a partir de heces felinas y caninas según
parámetros tecnológicos y fisiológicos.
Se llevó a cabo un primer análisis in
vitro en busca de aplicaciones potenciales (véanse los ejemplos
1 y 2): características de crecimiento, tolerancia a la acidez
gástrica a diferentes pH y a diferentes concentraciones de las
sales biliares presentes en el duodeno esperables en gatos y
perros.
Es más, se demostró claramente la buena
supervivencia de células liofilizadas a 4 y 20ºC en dos medios
crioprotectores diferentes, como indicó un ensayo de conservación
acelerado.
Estas cepas se pueden caracterizar por tiempos
de generación cortos, recuentos elevados durante la fase
estacionaria (más de 1,0E+08 ufc/ml) y estabilidad en altos números
tras 8 y 24 h postinoculación, estabilidad frente a la
liofilización seguida de unas condiciones de conservación
cualesquiera, resistencia a concentraciones biliares fisiológicas
del duodeno (2% de bilis) y una baja inhibición cuando se cultivan
en presencia de hasta un 4% de bilis. Además, para seleccionar las
bacterias representativas de la diversidad investigada se tuvieron
en cuenta resultados de análisis de DNA.
Las cepas destinadas a la salud de gatos y
perros pueden proliferar hasta por lo menos 1,0E+06 ufc/ml en
presencia de hasta un 2,0% de sales biliares. También pueden
proliferar hasta por lo menos 1,0E+06 ufc/ml después de 2 h en un pH
que oscila entre 3,4 y 4,2.
Las cepas bacterianas de acuerdo con la presente
invención pueden seleccionarse a partir del grupo formado por:
Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii,
Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium spp.,
Enterococcus faecium y Enterococcus spp.
Las siguientes cepas, Lactobacillus
reuteri NCC2581, Lactobacillus rhamnosus NCC2583,
Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri
NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 y Lactobacillus
acidophilus NCC2628, fueron depositadas por ejemplo bajo el
Tratado de Budapest en la Collection Nationale de Culture de
Micro-organismes, 25 rue du docteur Roux, 75724
París, Francia, el 19 de abril de 2000, bajo las siguientes
referencias: CNCM I-2448, CNCM
I-2449, CNCM I-2450, CNCM
I-2451, CNCM I-2452 y CNCM
I-2453, respectivamente. Todas las restricciones
respecto a la disponibilidad de estos depósitos serán retiradas con
la primera publicación de esta solicitud u otra solicitud que
reivindique prioridad frente a esta.
- -
- Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
- -
- Bastoncillos bastante cortos y gruesos
- -
- Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
- -
- Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
- -
- Crecimiento con NaCl al 5% y 10%
- -
- Fermentación de los azúcares: L-arabinosa, galactosa, D-glucosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
- -
- Bastoncillos bastante cortos y gruesos
- -
- Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+)
- -
- Catalasa (-)
- -
- Fermentación de todos los azúcares característicos de Lb. rhamnosus.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
- -
- Bastoncillos bastante cortos y gruesos
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- Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
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- Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
- -
- Crecimiento con NaCl al 5% y 10%
- -
- Fermentación de los azúcares: L-arabinosa, galactosa, D-glucosa, D-xilosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
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- Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
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- Bastoncillos bastante cortos y gruesos
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- Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
- -
- Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
- -
- Crecimiento con NaCl al 5 y 10%
- -
- Fermentación de todos los azúcares característicos de Lb. reuteri.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
- -
- Bastoncillos bastante cortos y gruesos
- -
- Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
- -
- Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
- -
- Crecimiento con NaCl al 5 y 10%
- -
- Fermentación de los azúcares: L-arabinosa, D-glucosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
- -
- Bastoncillos bastante cortos y gruesos
- -
- Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
- -
- Catalasa (-)
- -
- Fermentación de los azúcares: D-glucosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
También se analizó la actividad probiótica
potencial en animales de compañía de tres lactobacilos aislados a
partir de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tres lactobacilos de
perros (NCC2603, NCC2613, NCC2628), una bifidobacteria de gatos
(NCC2627) y una bifidobacteria de perros (NCC2657) (véanse los
ejemplos 3 y 4).
En otra realización la presente invención está
relacionada con un método que utiliza cepas bacterianas como se ha
descrito anteriormente para la preparación de una composición
alimentaria capaz de mejorar o mantener la salud de las
mascotas.
Estas cepas se pueden utilizar en su forma
viable, en su forma inactivada, como un sobrenadante de un cultivo
o fracciones del mismo, por ejemplo, paredes celulares,
peptidoglicanos, citoplasma, proteínas purificadas, metabolitos
funcionales o moléculas bioactivas.
Son utilizadas preferiblemente en una cantidad
de aproximadamente desde 1,0E+04 ufc/g hasta aproximadamente 1,0E+11
ufc/g, preferiblemente desde 1,0E+05 ufc/g hasta aproximadamente
1,0E+10 ufc/g y más preferiblemente desde 1,0E+06 ufc/g hasta
aproximadamente 1,0E+09 ufc/g.
En una realización preferida estas cepas se
pueden utilizar como complementos alimenticios para mejorar la
calidad del alimento para mascotas y pueden incluirse en cantidades
que oscilan entre 1,0E+04 ufc/g y 1,0E+11 ufc/g aproximadamente.
Cuando se utilizan como complementos alimenticios pueden estar
encapsulados o suministrarse en forma de polvos y pueden estar
empaquetados junto a una comida principal o separados de ella, sea
húmeda o seca. A modo de ejemplo, un polvo que contiene los
microorganismos seleccionados se puede empaquetar en bolsitas, en
forma de polvo o en un gel o lípido u otro portador adecuado. Estas
unidades empaquetadas separadamente se pueden suministrar junto a
una comida principal o en envases multiunidad para su uso con una
comida principal o una golosina, de acuerdo con las instrucciones de
usuario. En otro ejemplo, las cepas probióticas pueden
suministrarse en una unidad de empaquetado multicámara junto a un
segundo componente ingerible, por ejemplo un alimento troceado
húmedo, o con un contenido de humedad medio, o un lote de porciones
secas en forma de bolsa flexible del tamaño de una comida. Una
primera cámara de la bolsa contiene la cepa probiótica y una segunda
cámara separada y sellada contiene el segundo componente
ingerible.
Estos microorganismos seleccionados ejercen un
impacto beneficioso particular en los animales de compañía en su
tubo gastrointestinal, piel o pelo, sistema inmunitario, salud
dental u oral, huesos y efectos del envejecimiento.
También mejoran la palatabilidad de la comida,
la digestión, la función inmunitaria y las condiciones sanitarias
(reducción del volumen fecal y parcial desodorización de las heces
caninas) en las mascotas.
La presente invención también está relacionada
con un método de preparación de una composición de alimento para
animales de compañía destinada a mejorar o mantener la salud de
estos animales, que contiene por lo menos una cepa probiótica con
los rasgos antes descritos, asociada a un vehículo ingerible o una
matriz farmacéutica.
Se puede administrar a la mascota al menos una
cepa bacteriana con los rasgos anteriores como suplemento de su
dieta normal o como componente de un alimento para mascotas
nutricionalmente completo.
La composición del alimento nutricionalmente
completo preparada según un método de acuerdo con la invención puede
estar en forma de polvo seco o de producto de alimento para mascotas
húmedo, refrigerado o de conservación sin refrigerar. Estos
alimentos para mascotas pueden producirse mediante métodos conocidos
en el campo, siempre y cuando allí donde se desee que haya actividad
de microorganismos se tenga cuidado en asegurar su supervivencia.
Además de las cepas bacterianas y/o su medio fermentado, estos
alimentos para mascotas pueden incluir una fuente, o varias, de
almidón, proteína o lípido.
Algunos ejemplos de fuentes de almidón
apropiadas son grano y legumbres, como el maíz, el arroz, el trigo,
la cebada, la avena, la soja o mezclas de éstos.
Las fuentes proteicas apropiadas pueden
seleccionarse de cualquier fuente animal o vegetal adecuada; por
ejemplo carne y harina de carne, harina de aves, harinas de
pescado, concentrados de proteína de soja, proteínas lácteas,
gluten y similares. En el caso de animales de edad avanzada es
preferible que la fuente proteica contenga una proteína de alta
calidad.
Las fuentes lipídicas apropiadas incluyen carnes
y grasas animales y vegetales.
La elección de las fuentes de almidón, proteína
o lípidos estará determinada en gran medida por los requisitos
nutricionales del animal, por consideraciones de palatabilidad y por
el tipo de producto empleado. En el caso de animales de edad
avanzada es preferible que el alimento contenga, en proporción,
menos grasa que el alimento para mascotas más jóvenes. Además, las
fuentes de almidón pueden ser una o varias del grupo formado por
arroz, cebada, trigo y maíz.
Además, también se pueden incorporar al alimento
para mascotas, en el modo que se desee, otros ingredientes
diferentes adicionales como, por ejemplo, azúcar, sales, especias,
condimentos, vitaminas, minerales, agentes aromatizantes, grasas y
similares.
Un proceso adecuado para preparar alimento seco
para mascotas es la extrusión, aunque se puede utilizar la cocción
al horno u otros procesos similares. El alimento seco, cuando es
sometido a extrusión, normalmente resulta en forma troceada. Si se
utiliza un carbohidrato prebiótico éste puede mezclarse con el resto
de ingredientes del alimento seco antes de ser procesado. Un
proceso adecuado se describe en la Solicitud de patente europea núm.
0850569. Si se utiliza un microorganismo probiótico y se desea que
el producto final presente actividad, es mejor que el organismo
recubra el alimento seco o bien que se encuentre dentro de él. Se
describe un proceso adecuado en la Solicitud de patente europea
núm.0862863. En los casos en que no sea necesaria la supervivencia
del microorganismo éste puede añadirse a la mezcla de
preextrusión.
En el caso de alimentos húmedos, se pueden
utilizar los procesos descritos en las patentes
estadounidenses
4.781.939 y 53132.137 para producir productos cárnicos simulados. Las revelaciones de estas patentes están incorporadas mediante cita. También se puede utilizar otros procedimientos para generar productos en trozos como, por ejemplo, la cocción en un horno de vapor. Por otro lado, para obtener productos en barra se puede emulsionar un material cárnico apropiado y producir una emulsión de carne a la que se le añade un agente gelificante adecuado y se calienta antes de introducirla en latas u otros recipientes. Del mismo modo que en la obtención de alimento seco, la especie probiótica se puede añadir al preparado de alimento antes de ser cocinado o calentado o en cualquier fase adecuada o conveniente del proceso de producción, siempre y cuando la supervivencia del producto probiótico escogido no sea imprescindible.
4.781.939 y 53132.137 para producir productos cárnicos simulados. Las revelaciones de estas patentes están incorporadas mediante cita. También se puede utilizar otros procedimientos para generar productos en trozos como, por ejemplo, la cocción en un horno de vapor. Por otro lado, para obtener productos en barra se puede emulsionar un material cárnico apropiado y producir una emulsión de carne a la que se le añade un agente gelificante adecuado y se calienta antes de introducirla en latas u otros recipientes. Del mismo modo que en la obtención de alimento seco, la especie probiótica se puede añadir al preparado de alimento antes de ser cocinado o calentado o en cualquier fase adecuada o conveniente del proceso de producción, siempre y cuando la supervivencia del producto probiótico escogido no sea imprescindible.
La cantidad de prebiótico en el alimento para
mascotas es preferiblemente menos de un 20% en peso y, más
preferiblemente, menos de un 10% en peso. Por ejemplo, el prebiótico
puede constituir desde un 0,1% hasta un 5% en peso del alimento. En
aquellos alimentos para mascotas que utilizan achicoria como el
prebiótico ésta puede comprender desde un 0,5% hasta un 10% en peso
de la mezcla de alimento; más preferiblemente desde un 1% hasta un
5% en peso.
Los alimentos para mascotas pueden contener
otros agentes activos como por ejemplo ácidos grasos de cadena
larga. Los ácidos grasos de cadena larga adecuados son el ácido
alfa-linoléico, el ácido
gamma-linoléico, el ácido linoléico, el ácido
eicosapentanoico y el ácido docosahexanoico. Los aceites de pescado
representan una fuente apropiada de ácidos eicosapentanoicos y de
ácido docosahexanoico. El aceite de borraja, el aceite de pepitas de
grosella negra y el aceite de onagra son fuentes adecuadas de ácido
gamma-linoléico. Los aceites de cártamo, girasol,
maíz y soja son fuentes adecuadas de ácido linoléico.
En caso de que sea necesario, los alimentos para
animales de compañía se suplementan con minerales y vitaminas para
que sean nutricionalmente completos.
Más aún, si se desea, la cepa bacteriana puede
estar encapsulada en una matriz glucídica, lipídica o polisacárida.
También puede estar recubierta, como se describe en EP 862 863.
Es preferible utilizar la nueva cepa probiótica
de manera que el alimento para mascotas contenga preferiblemente de
unas 1,0E+04 hasta 1,0E+10 células del microorganismo probiótico por
gramo de alimento; más preferiblemente de unas 1,0E+06 hasta
1,0E+08 células de microorganismo probiótico por gramo. El alimento
para mascotas puede contener de un 0,005% a un 10% en peso de la
mezcla del microorganismo probiótico. Preferiblemente contiene de un
0,2% a un 6% en peso y más preferiblemente de un 1% a un 6% en
peso.
La cantidad de alimento que debe consumir el
animal de compañía para obtener un efecto beneficioso depende del
tipo de mascota, de su tamaño y de su edad. Sin embargo, la cantidad
que sería adecuada habitualmente para proporcionar una cantidad
diaria de entre unas 1,0E+03 y 1,0E+14 ufc de por lo menos una cepa
de bacteria ácido láctica y/o el medio de fermentación equivalente.
La administración preferida para perros es aproximadamente de
1,0E+09 a 1,0E+14 ufc/día y para gatos de 1,0E+07 a 1,0E+10
ufc/día.
La composición preparada mediante un método de
acuerdo con la invención presenta una actividad probiótica elevada
y/o parece ser particularmente efectiva en la mejora y el
mantenimiento de una función digestiva saludable en los animales de
compañía, y en la mejora y mantenimiento de su tubo
gastrointestinal, piel y pelo, sistema inmunitario y salud en
general. Esta composición también posee un carácter beneficioso
sobre los efectos del envejecimiento en gatos y perros.
El alcance de la presente invención no debe
limitarse a las realizaciones aquí descritas. Los ejemplos están
precedidos de una breve descripción de las figuras.
Figura 1: Proliferación linfocítica de células
mononucleares periféricas (PMBC) caninas tras la estimulación con
mitógenos o ésteres de forbol. Se estimularon PMBC de perros adultos
alimentados durante cuatro semanas con (barritas negras) o sin
(barritas blancas) L. acidophilus NCC2628 con diferentes
mitógenos a las dosis indicadas en el gráfico (\mug/ml). Los
mitógenos son: PHA (fitohemaglutinina), ConA (Concanavalina A) y
PWM (mitógeno de filotaca o "pokeweed"). El éster de forbol es
PMA/iono (forbol miristato acetato y ionomicina). *=P<0,05, test
de Student.
Figura 2: Citocinas producidas por leucocitos
caninos estimulados con diferentes cepas de probióticos. Los
leucocitos de perros adultos normales fueron estimulados durante 18
h con diferentes cepas de lactobacilos aislados a partir de animales
de compañía. Los cultivos control solo contenían medio (control
negativo) o un aislado de lactobacilo humano ST11 (control
positivo). La identificación de citocinas se llevó a cabo mediante
RT-PCR. Su cuantificación se realizó mediante el
cribado de los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio y la
determinación del píxel relativo de cada banda utilizando el
software NIH Image. Los resultados están expresados en forma de dos
experimentos independientes y en unidades arbitrarias. (A)
IL-12, (B) IL-10, (C) IFN\gamma,
(D) TGF\beta.
Se analizó el uso probiótico potencial de
numerosas cepas (de la Colección de Cultivos Nestlé = NCC) en gatos
y perros. Concretamente, se evaluó el potencial de crecimiento, la
resistencia a la liofilización con el consiguiente almacenamiento y
la tolerancia a la acidez gástrica y a diferentes concentraciones de
sales biliares del tubo gastrointestinal de gatos y perros en el
caso de aquellos 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias aislados a
partir de heces felinas y caninas que se presentan en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacilos
| Código | Código | Código | Origen especie | Tipo de | NH3 de | Ácido | Identificado |
| NCC | CNCM | animal | ingesta | arginina | láctico | con API50CH | |
| 2578 | - - | LB1-1 | Gato | Mixta | - | L | L. animalis/ruminis |
| 2581 | I-2448 | LB1-2 | Gato | Mixta | + | D/L | L. reuteri |
| 2583 | I-2449 | LK1-1 | Gato | Mixta | - | D/L | L. rhamnosus |
| 2586 | - - | LK1-2 | Gato | Mixta | + | D/L | L. reuteri |
| 2590 | - - | LH2-1 | Gato | Seca | - | D/L | L. acidophilus |
| 2592 | I-2450 | LR1-1 | Gato | Mixta | + | D/L | L. reuteri |
| 2594 | - - | LS1-1 | Gato | Mixta | - | L | L. animalis/ruminis |
| 2597 | - - | LA2-5 | Perro | Húmeda | - | L | L. animalis |
| 2600 | - - | LC2-5 | Perro | Húmeda | - | D/L | L. fermentum/reuteri |
| 2603 | I-2451 | LE2-5 | Perro | Húmeda | - | L | L. reuteri |
| 2606 | - - | LF2-6 | Perro | Seca | + | D/L | L. reuteri |
| 2609 | - - | LH2-6 | Perro | Seca | + | D/L | L. reuteri |
| 2613 | I-2452 | LH2-7 | Perro | Seca | + | D/L | L. reuteri |
| 2616 | - - | L1-1-1 | Perro | Mixta | + | D/L | L. reuteri/fermentum |
| 2619 | - - | L1-1-2 | Perro | Mixta | - | D/L | L. acidophilus |
| 2621 | - - | L3-1-2 | Perro | Mixta | - | L | L. animalis/ruminis |
| 2625 | - - | L7-1-3 | Perro | Mixta | - | L | L. animalis/ruminis |
| 2628 | I-2453 | LA1-5 | Perro | Mixta | - | D/L | L. acidophilus |
| 2632 | - - | LA1-6 | Perro | Mixta | + | D/L | L. reuteri/fermentum |
| 2636 | - - | LB1-5 | Perro | Mixta | - | L | L. animalis/ruminis |
Bifidobacterias
| Código NCC | Código | Origen especie animal | Tipo de ingesta | Especie |
| 2623 | CO2-5 | Gato | Seca | Bifidobacterium |
| 2627 | CG2-5 | Gato | Seca | Bif. adolescentis |
| 2630 | CH2-5 | Gato | Seca | Bif. adolescentis |
| 2633 | CE3-1 | Gato | Seca | Bif. adolescentis |
| 2635 | CC1-5 | Gato | Mixta | Bif. longum/suis |
| 2637 | CE4-1 | Gato | Seca | Bif. adolescentis |
| 2640 | CB3-5 | Gato | Seca | Bif. adolescentis |
| 2643 | CJ2-6 | Gato | Seca | Bif. adolescentis |
| 2647 | D5-3-5 | Perro | Húmeda | Bif. adolescentis |
| 2651 | D8-3-6 | Perro | Seca | Bif. animalis/lactis |
| 2654 | D9-3-7 | Perro | Seca | Bif. animalis/lactis |
| 2657 | D6-3-6 | Perro | Seca | Bifidobacterium |
| 2660 | D7-3-5 | Perro | Seca | Bifidobacterium |
| 2663 | DB3-1 | Perro | Seca | Bifidobacterium |
| 2667 | DC3-1 | Perro | Seca | Bifidobacterium |
| 2671 | DA1-3 | Perro | Mixta | Bif. animalis/lactis |
| 2674 | DA3-1 | Perro | Seca | Bifidobacterium |
| 2677 | DD3-1 | Perro | Seca | Bif. adolescentis |
Todos los 20 lactobacilos y las 18
bifidobacterias fueron aislados a partir de gatos y perros que
siguieron diferentes dietas, tal como muestra la Tabla 1. La
identificación inicial se determinó según características
morfológicas y fisiológicas. Se utilizaron los sistemas
API-50CH y Rapid-ID32A (BioMérieux)
para lactobacilos y bifidobacterias, respectivamente. Las cepas
puras se congelaron y se depositaron a -80ºC en la Colección de
Cultivos Nestlé (NCC).
Todas las bacterias fueron cultivadas en medio
líquido para los ensayos. Se conservó una muestra de cada cepa
reactivada a -80ºC en 1 ml de medio crioprotector (40% glicerol +
60% LL). Los cultivos se mantuvieron mediante el subcultivo semanal
de un inóculo 1% en 10 ml de medio de cultivo y mediante incubación
anaeróbica a 37ºC.
Los lactobacilos se cultivaron en MRS durante 18
horas. Las bifidobacterias se cultivaron o bien en MRS +
hidrocloruro de L-cisteína 0,05% (p/v)
(MRS-C) durante 32 horas o en BHI + hidrocloruro de
L-cisteína 0,05% (BHI-C) durante 48
horas empezando con un inóculo 5%.
Todos los cultivos se conservaron a +4ºC entre
las diferentes transferencias. En general, la anaerobiosis se obtuvo
mediante un sistema anaeróbico de dióxido de
carbono-hidrógeno (GasPak, Becton Dickinson, EEUU).
Las bifidobacterias se mantuvieron siempre en estas jarras durante
el periodo de almacenamiento.
Este cribado in vitro se basó en las
características de producción para una aplicación industrial de
células viables, su habilidad para sobrevivir las condiciones
gastrointestinales inhibidoras o perjudiciales y su diversidad
genómica. A través de RAPD y ribotipificación se tuvieron en cuenta
la diversidad de las cepas y la similitud genómica de aquellas cepas
no caracterizadas.
Es preciso identificar las cepas que son capaces
de producir un alto número de células rápidamente. Su ciclo de
crecimiento bacteriano puede caracterizarse por una fase de latencia
corta, un tiempo de generación corto, recuentos máximos altos y una
fase estacionaria larga. Por tanto, las cepas fueron comparadas
teniendo en cuenta tres variables: la duración de la fase de
latencia, su tiempo de generación (en horas) y sus recuentos
máximos; es decir, las características más importantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon 200 ml de caldo de cultivo MRS
preincubado a 37ºC con un 1% de un subcultivo fresco. Se recogieron
muestras post-inoculación de un ml, cada hora,
durante ocho horas. SE tomó una muestra final tras 24 h. Se
hicieron diez diluciones seriadas en TS de un ml de cada muestra
para la enumeración. Los cultivos se sembraron en agar MRS (técnica
de vertido en placas), anaeróbicamente, a 37ºC durante 48 horas.
Todas las placas con número de colonia entre el 30 y el 350 se
registraron como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml de
cultivo y, por tanto, se tuvieron en cuenta para las
enumeraciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En ensayos preliminares, todas las cepas se
enumeraron tras 24 h de crecimiento en caldos de cultivo
MRS-C y TPYG. Los resultados se expresaron en
ufc/ml. Las curvas de crecimiento se establecieron mediante la
determinación de la cantidad de células en el caso de siembra sobre
MRS-C tras 0, 4, 12, 24, 32 y 48 horas, de acuerdo
con el protocolo descrito para lactobacilos. Con el fin de
determinar la influencia del medio de subcultivo y de la
optimización de la desgasificación del medio de cultivo, este ensayo
se llevó a cabo:
- \bullet
- a partir de un subcultivo en BHI-C, conservado 48 h a 4ºC e inoculado en MRS-C
- \bullet
- a partir de un subcultivo en BHI-C, conservado 48 h a 4ºC e inoculado en MRS-C bien desgasificado (extracción del oxígeno optimizada por introducción del medio en autoclave dos veces y almacenamiento directo en jarras de anaerobiosis)
- \bullet
- a partir de un cultivo fresco, en MRS e inoculado en MRS-C bien desgasificado y almacenado bajo condiciones anaeróbicas previamente al experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
| lactobacilos | ||||
| Sustrato | Composición | pH | Referencias | |
| MRS | MRS sin azúcar (Difco) | 35 g/l | 6,5 | De Man and al. (1960) |
| Glucosa | 20 g/l | |||
| Agua destilada | 1,000 ml |
| bifidobacterias | ||||
| Sustrato | Composición | pH | Referencias | |
| MRS-C | MRS sin azúcar (Difco) | 35 g/l | 6,0 | Pacher and Kneifel (1996) |
| Glucosa | 20 g/l | |||
| HCl L-cisteína (Fluka) | 0,5 g/l | |||
| Agua destilada | 1,000 ml | |||
| Tripticasa (BBL) | 50 g/l | 7,0 | ||
| TPYG | Peptona (Difco) | 5 g/l | ||
| (Extracto de Levadura | Extracto de levadura | 20 g/l | ||
| Peptona Tripticasa) | (Difco) | |||
| Glucosa (Merck) | 4 g/l | |||
| HCl L-cisteína (Fluka) | 1 g/l | |||
| Agua destilada | 1,000 ml |
Los medios sólidos se obtuvieron por adición de
agar Difco Bacto (15 g/l). Los medios se introdujeron en autoclave
a 121ºC durante 15 min. Los medios líquidos para bifidobacterias se
conservaron en condiciones anaeróbicas o se desgasificaron antes de
su utilización.
Los microorganismos, al ser ingeridos, deben
sobrevivir en las condiciones del estómago y duodeno para poder
ejercer una actividad beneficiosa en el tubo gastrointestinal del
animal. El pH gástrico y las sales biliares son los principales
componentes reguladores de la flora bacteriana. Por estos motivos es
necesario realizar ensayos acerca del grado de resistencia de las
cepas a la acidez y la bilis.
La fisiología del tubo digestivo de gatos y
perros es diferente de la de los humanos. El pH medio en gatos y
perros era de 3,4 y 4,2, respectivamente. Se recomendó para los
ensayos el uso de una bilis de animal de compañía reconstituida
(Tabla 4). La concentración biliar en el intestino delgado oscila
entre 0,5 y 2% cuando se ingiere alimento.
De acuerdo con valores de pH extremos
encontrados en gatos y perros, los recuentos de viables tras 10 min
a pH 2,6 y tras 2 h a pH 3,4 (cepas aisladas a partir de perros) o
pH 4,2 (cepas aisladas a partir de gatos) no deberían estar por
debajo de 1,0E+06 ufc/ml.
Todos los lactobacilos fueron inoculados al 1%
en caldo de cultivo MRS y cultivados anaeróbicamente a 37ºC durante
toda la noche. Las bifidobacterias, inoculadas al 5% en
BHI-C, se cultivaron 48 horas a 37ºC en condiciones
de anaerobiosis. Los cultivos se distribuyeron en tubos de reacción
(Eppendorf) de 2 ml y se centrifugaron a 3.500 x g/10 min/20ºC. Las
células se lavaron tres veces con solución Ringer. El análisis de
la resistencia a las condiciones acídicas del estómago se realizó
in vitro en tres jugos gástricos simulados con niveles de pH
de 2,6, 3,4 y 4,2 ajustados con HCl (Merck). Se utilizó material de
filtración desechable (Nalgene) en todas las esterilizaciones por
filtración. La supervivencia de cada suspensión bacteriana fue
estudiada mediante la adición de 1 ml en una serie de 5 ml de jugo
gástrico simulado (diferentes pH) suplementado con 1,5 ml de una
solución de NaCl 0,5%.
Las muestras se incubaron a 37ºC y los
organismos viables se enumeraron a:
- \bullet
- 0, 1, 5, 10 minutos con el jugo gástrico de pH 2,6
- \bullet
- 0, 1, 30, 60, 120, 180 minutos cuando el jugo gástrico tenía un pH de 3,4 (para cepas aisladas a partir de perros) o de 4,2 (para cepas aisladas a partir de gatos).
Se diluyeron muestras en tampón fosfato (pH
7,0), se dispusieron en placas sobre agar MRS-C y se
enumeraron.
| Nombre del sustrato | Composición | pH |
| Jugo gástrico | pepsina porcina 0,3% p/v (Sigma) | 2,1; 3,4 ó 4,2 |
| NaCl 0,5% p/v | ||
| HCl (Merck): para ajustar el pH |
Se determinó la evolución de los recuentos de
viables de lactobacilos cultivados durante 18 horas en presencia de
varias concentraciones de bilis animal reconstituida.
Hubo dos recuentos de viables que se
consideraron significativamente diferentes cuando la desviación de
su log_{10} estaba por encima de 0,25. Cada cepa se definió según
dos variables:
\bullet la concentración máxima de sales
biliares ensayada cuando no se encontró una diferencia significativa
con el control
\bullet la tasa del descenso de viabilidad
cuando la concentración biliar en el medio de cultivo aumenta.
Las cepas caracterizadas por una pérdida
superior a un log_{10} de sus recuentos de viables cuando la
concentración biliar aumenta en pasos de un 1% se consideraron
sensibles a la bilis. Se consideró aceptable una reducción superior
a un log_{10} entre células cultivadas en presencia de bilis 0 y
2% y a un log_{10} por porcentaje adicional de bilis (superior al
2%). Además, para producir un efecto en el tubo gastrointestinal
solo se deben seleccionar aquellas cepas que produzcan más de
1,0E+06 ufc/ml cuando son cultivadas en presencia de hasta un 2% de
sales biliares.
Se preparó bilis animal reconstituida a partir
de gatos y perros de la manera que se indica en la Tabla 4 y se
esterilizó por filtración antes de ser utilizado. En un primer
ensayo, los lactobacilos se cultivaron anaeróbicamente durante 24
horas en caldo de cultivo MRS a 37ºC y se transfirieron a caldo MRS
fresco con 0, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 2 y 4% de bilis animal reconstituida
estéril durante otras 18 horas adicionales. Se hicieron diez
diluciones seriadas de las muestras en TS para enumeración. Las
diluciones 1,0E-03 y 1,0E-05 se
dispusieron en placas de agar MRS mediante un WASP ("Whitley
Automatic Spiral Plater"; Don Whitley Scientific Limited,
Inglaterra). Una vez secas, las placas se invirtieron e incubaron 48
h a 37ºC en jarras de anaerobiosis.
Floch et al. (1972) definieron que una
inhibición es significativa cuando se reducen al menos 2 log del
ensayo comparados con el crecimiento en el tubo control. Partiendo
de esta definición, todos los lactobacilos sensibles a
concentraciones biliares del primer ensayo y dos lactobacilos
resistentes a un 4% bilis se analizaron de igual manera en
presencia de 0, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 y 4% de bilis. El objetivo del
segundo ensayo era la repetibilidad y estableció si el número de
bacterias viables descendía fuertemente con el incremento de la
concentración biliar.
Por otro lado, resaltó que estas cepas son
resistentes a la bilis durante este periodo de 18 h. Las curvas de
crecimiento se establecieron en presencia de sales biliares para
determinar si la fase de latencia y la tasa de crecimiento se veían
afectadas. Se llevaron a cabo ensayos con lactobacilos cultivados en
caldo MRS suplementado con un 1% de bilis animal reconstituida, de
acuerdo con el protocolo descrito en anteriores mediciones de
crecimiento.
Se realizaron subcultivos de bifidobacterias que
se cultivaron durante 32 horas a 37ºC anaeróbicamente utilizando
caldo MRS-C con 0, 1, 2, 3 y 4% de bilis animal
reconstituida. Se aplicó en las diluciones 1,0E-03,
1,0E-04 y 1,0E-05 el mismo método de
enumeración empleado en los lactobacilos.
| Compuestos | \mumol/ml | mg/ml | % total |
| Taurodesoxicolato (Sigma) | 14,00 | 7,00 | 18,0 |
| Taurocolato (Sigma) | 59,00 | 30,40 | 74,0 |
| Colato (Fluka) | 0,14 | 0,06 | 0,2 |
| Tauroquenodesoxicolato (Sigma) | 6,90 | 3,45 | 8,0 |
Se evaluó la evolución de la supervivencia. Los
recuentos inferiores a 1,0E+05 ufc/ml se consideraron demasiado
bajos.
Para cada cepa se inocularon 200 ml de caldo MRS
al 3% con un subcultivo fresco. Los cultivos se cultivaron durante
16 h a 37ºC. Se asumió que las condiciones sin aire (contenedores
cerrados) eran esencialmente anaeróbicas. Se enumeraron las células
viables mediante el método de vertido en placa descrito
anteriormente.
Los cultivos se centrifugaron a 3.500 x
g/+7ºC/20 minutos (RC3C Sorvall Instrument centrifuge) y se
resuspendieron en 10 ml de dos medios crioprotectores diferentes.
Cada cepa fue resuspendida en dos crioprotectores diferentes. Las
suspensiones bacterianas concentradas se enumeraron (método de
vertido en placa) y distribuidas en viales (0,5 ml por ampolla). Las
muestras se congelaron a -196ºC en nitrógeno líquido y se secaron al
vacío durante 18 horas. Después de la liofilización, se introdujo
nitrógeno a través de la válvula de entrada de aire del
liofilizador y se sellaron todas las ampollas. Todos los viales se
conservaron a +4ºC y +20ºC durante seis meses. EL número de células
viables por ampolla (para cada bacteria y cada medio de suspensión)
se determinó mensualmente.
En el marco de la selección de probióticos
potenciales para gatos y perros, los resultados de este cribado
in vitro de 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias basado en
sus potenciales de crecimiento, resistencia a la liofilización y
posterior conservación, resistencia al pH y concentraciones biliares
gástricas del tubo gastrointestinal de gatos y perros se presentan
en la Tabla 5.
Los 20 lactobacilos se clasificaron según los
criterios que éstos cumplían en el estudio actual. Cuatro de las
cepas mostradas presentaban buenos resultados en cuanto a sus
características de crecimiento, resistencia al pH gástrico,
resistencia a la bilis y supervivencia durante la conservación tras
la liofilización: L. reuteri NCC2581 (CNCM
I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM
I-2450), L. reuteri NCC2603 (CNCM
I-2451), L. reuteri NCC2613 (CNCM
I-2452). Se cumplían las siguientes
características:
\bullet el tiempo de generación era inferior a
una hora cuando se cultivaban en MRS
\bullet la fase de latencia era corta
(inferior a dos horas)
\bullet los recuentos bacterianos eran
elevados (mayores a 1,0E+08 ufc/ml) durante la fase estacionaria del
ciclo de crecimiento y estables a las 8 y 24 horas
post-inoculación
\bullet las cepas estaban estables a lo largo
de la liofilización y posterior conservación de seis meses a 4 y
20ºC
\bullet las cepas eran resistentes a las
concentraciones biliares extremas que con probabilidad se pueden
encontrar en el tubo gastrointestinal de gatos y perros (2%)
\bullet no se observó inhibición significativa
en presencia de hasta un 4% de bilis en el medio
\bullet se evidenció que las cepas toleraban
un pH de 2,6 durante al menos 10 min y podían mantenerse a niveles
superiores a 1,0E+08 ufc/ml
\bullet las cepas eran resistentes a un pH
gástrico medio durante por lo menos dos horas.
Por todas estas razones, dos lactobacilos
aislados a partir de gatos (L. reuteri NCC2581 y L.
reuteri NCC2592) y dos aislados a partir de perros (L.
reuteri NCC2603 y L. reuteri NCC2613) fueron
seleccionadas para el estudio de su actividad probiótica potencial.
Se identificó las cepas NCC2581, NCC2592, NCC2603 y NCC2613 como
L. reuteri mediante identificación API 50CH. Sin embargo, la
ribotipificación mostró que, tanto NCC2581 y NCC2592 como NCC2603 y
NCC2613, tenían patrones muy similares lo cual indica la existencia
de una relación estrecha probable. La cepa NCC2581 presentaba unas
características de crecimiento muy buenas y la NCC2603 presentaba
una resistencia a la bilis mejor que la NCC2613.
Los resultados referentes a las ocho
bifidobacterias aisladas a partir de heces felinas permitieron hacer
una selección en función de sus características de crecimiento,
resistencia al pH gástrico y sensibilidad a la bilis. La cepa
NCC2623 no presentaba ninguna de las características deseadas y, por
tanto, no se recomienda para estudios posteriores. Por otro lado, la
cepa NCC2627 cumplía todos los criterios:
\bullet el tiempo de generación era inferior a
una hora al ser cultivada en MRS-C
\bullet la fase de latencia era igual de corta
que en los lactobacilos
\bullet los recuentos eran elevados y estables
durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento
\bullet la cepa era resistente a las
concentraciones biliares extremas que con probabilidad se pueden
encontrar en el tubo gastrointestinal de gatos y perros (2%)
\bullet no se observó inhibición significativa
en presencia de hasta un 4% de bilis en el medio
\bullet se evidenció que las cepas toleraban
un pH de 2,6 durante al menos 10 min y podían mantenerse a niveles
superiores a 1,0E+06 ufc/ml
\bullet las cepas eran resistentes a un pH
gástrico medio durante por lo menos dos horas.
La cepa NCC2627 era mucho más resistente que la
NCC2623 y la NCC2635, mientras que estas tres cepas presentaban un
patrón muy similar obtenido por ribotipificación lo cual indica una
relación estrecha probable (digestión con dos enzimas de
restricción: EcoRI y EcoRV).
Las diez bifidobacterias aisladas a partir de
perros solamente mostraron dos patrones diferentes al ser
caracterizadas por ribotipificación. Por tanto, solo se llevaron a
cabo ensayos de resistencia a la bilis con cuatro cepas (dos de
cada grupo): NCC2657, NCC2660, NCC2671 y NCC2677. Estas cuatro cepas
eran resistentes a la concentración biliar máxima que se puede
encontrar in vivo (2% de bilis) y las cepas NCC2660 y NCC2657
no presentaron ningún descenso en el recuento de viables al ser
sometidos a un valor máximo de un 4% de bilis. En consecuencia,
todas las bifidobacterias aisladas a partir de heces caninas son
considerablemente resistentes a concentraciones biliares
elevadas.
Según las características de crecimiento, estas
diez bacterias se pueden dividir en dos grupos:
\bullet cepas resistentes a la bilis y con
características de crecimiento buenas: NCC2657, NCC2651, NCC2663 y
NCC2667
\bullet cepas resistentes a la bilis pero con
características de crecimiento que deben optimizarse para su
producción industrial: NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647,NCC2654 y
NCC2674.
Los resultados completos acerca de la
resistencia al pH gástrico extremo durante la digestión de gatos y
perros permitirán una determinación mejor de las cepas a
seleccionar para estudios posteriores. Solamente la cepa NCC2651 no
cumplió los criterios de selección en cuanto a la resistencia a
pH.
\vskip1.000000\baselineskip
| Código NCC | Código | Criterios de | Resistencia a los | Resistencia | Estabilidad tras |
| crecimiento | jugos gástricos | a la bilis | liofilización | ||
| 2578 | LB1-1 | + | + | - | - |
| 2581 | LB1-2 | + | + | + | + |
| 2583 | LK-1 | + | + | + | - |
| 2586 | LK1-2 | - | + | - | - |
| 2590 | LH2-1 | + | + | + | - |
| 2592 | LR1-1 | + | + | + | + |
| 2594 | LS1-1 | - | + | - | - |
| 2597 | LA2-5 | - | + | + | + |
| 2600 | LC2-5 | - | - | + | - |
| 2603 | LE2-5 | + | + | + | + |
| 2606 | LF2-6 | - | + | + | - |
| 2609 | LH2-6 | + | + | + | - |
| Código NCC | Código | Criterios de | Resistencia a los | Resistencia | Estabilidad tras |
| crecimiento | jugos gástricos | a la bilis | liofilización | ||
| 2613 | LHH2-7 | + | + | + | + |
| 2616 | L1-1-1 | - | + | + | - |
| 2619 | L1-1-2 | - | + | + | - |
| 2621 | L3-1-2 | + | + | - | + |
| 2625 | L7-1-3 | + | + | - | + |
| 2628 | LA1-5 | + | + | + | - |
| 2632 | LA1-6 | - | + | + | - |
| 2636 | LB1-5 | - | + | + | + |
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con los resultados actuales se puede
seleccionar una cepa bifidobacteriana aislada a partir de gatos y
tres bifidobacterias aisladas a partir de perros; NCC2627, NCC2657,
NCC2663 y NCC2667, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Sustrato | Composición | pH | |
| Tampón fosfato | K2PO4 | 72 g/l | 7,0 |
| KH2PO4 | 48 g/l | ||
| Agua destilada | 1,000 ml | ||
| Solución Ringer | NaCl | 9 g/l | 7,0 |
| Agua destilada | 1.000 ml | ||
| TS (Triptón salino) | NaCl | 8,5 g/l | 7,0 |
| Triptón | 1 g/l | ||
| Agua destilada | 1,000 ml |
\vskip1.000000\baselineskip
Se dispusieron porciones de 9 ml en tubos y se
introdujeron en autoclave a 121ºC durante 15 min.
Finalmente, 8 de las 38 cepas fueron
seleccionadas para estudios posteriores (véase el Ejemplo 3): tres
lactobacilos aislados a partir de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583),
tres lactobacilos a partir de perros (NCC2603, NCC2613, NCC2628),
una bifidobacteria a partir de gatos (NCC2627) y una bifidobacteria
a partir de perros (NCC2657).
Estas cepas se caracterizan por tiempos de
generación cortos, recuentos elevados (superiores a 1,0E+08 ufc/ml)
durante la fase estacionaria y estabilidad a altas cantidades a 8 y
24 h post-incubación, estabilidad frente a la
liofilización seguida de cualesquiera condiciones de conservación,
resistencia a las concentraciones biliares extremas del duodeno (2%
bilis) y baja inhibición al ser cultivadas en presencia de hasta un
4% de bilis. Además, se tuvieron en cuenta resultados de análisis
de DNA para seleccionar bacterias representativas de la diversidad
investigada.
\newpage
L. reuteri NCC2581, L. reuteri
NCC2592, L. rhamnosus NCC2583 y Bifidobacterium sp.
NCC2627 fueron sometidas a ensayo en varios experimentos
alimentarios para poder evaluar su capacidad de supervivencia al
tránsito por el tubo gastrointestinal felino.
Se sometió a 16 gatos, machos y hembras lo más
iguales posibles, a tres días de adaptación con Friskies Grand Menu
de buey. El protocolo de alimentación consistió en siete días con
"Friskies Grand Menu" y siete días de ensayo con "Friskies
Grand Menu" al que se le había añadido una de las cepas antes
mencionadas: L. reuteri NCC2581 (dieta A), L. reuteri
NCC2592 (dieta B), L. rhamnosus NCC2583 (dieta C) y
Bifidobacterium sp. NCC2627 (dieta D). La asignación de
dietas fue la siguiente:
| Núm. gato | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Periodo 1 | A | D | C | B | D | A | A | C | B | A |
| Periodo 2 | B | A | D | A | C | C | D | A | C | B |
\vskip1.000000\baselineskip
| Núm. gato | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| Periodo 1 | B | C | B | D | C | D |
| Periodo 2 | C | D | D | A | B | B |
Estas cepas se prepararon en una cantidad
suficiente y en una forma liofilizada estable para aplicar estas
ocho bacterias diferentes según la supervivencia de la cepa en el
tubo gastrointestinal de los animales ensayados. Todas las cepas se
mezclaron con 4 g de trealosa para así añadir un volumen suficiente
de portador para la mezcla de las cepas preparadas con la matriz
alimentaria para los animales. Las cepas bacterianas se preparan en
tubos de plástico individuales (1,0E+09 ufc/día) y se añaden
diariamente en una parte del alimento para garantizar la ingestión
del total de las bacterias.
Se obtienen muestras fecales frescas para el
análisis de las cifras de la población bacteriana y se comparan con
la línea de base (sin bacterias añadidas). Las heces se recogen los
días
7 y 8 (línea de base),
14 y 15,
21 y 22 (línea de base).
28 y 29.
Se utiliza una sonda rectal estéril para obtener
una muestra fecal de por lo menos 0,1 g. Esta muestra es pesada con
precisión y se mezclan 0,1 g con 10 ml de solución fisiológica
(Ringer) que contiene un 10% de glicerol. Luego se transfiere esta
solución a criotubos de 1 ml y se congela en nitrógeno líquido.
Entonces todas las muestras se conservan a -80ºC hasta el
análisis.
Se hizo el recuento de las poblaciones endógenas
de lactobacilos, Bacteroides, enterobacteriáceas,
enterococos, bifidobacterias y Clostridium perfringens. Se
detectaron bacterias en medios selectivos o semiselectivos. A
partir de las diluciones que estaban en el intervalo entre -2 y -8,
Se realizaron cien diluciones seriadas en solución Ringer con un
0,5% de cisteína. Se inocularon e incubaron placas de petri de
diversos medios selectivos (véase la siguiente Tabla).
\newpage
| Bacterias | Medios | T (ºC) | Tiempo (h) | Atmósfera |
| Enterobacteriaceae | Drigalski (Sanofi Diagnostics | 37 | 24 | Aeróbica |
| Pasteur, Francia) | ||||
| Bifidobacteria | Eugon Tomato * | 37 | 48 | Anaeróbica |
| lactobacilos | MRS (Difco, MI. USA) | 37 | 48 | Anaeróbica |
| + antibióticos ** | ||||
| C. perfringens | Agar NN *** | 37 | 48 | Anaeróbica |
| Bacteroides | Schaedler Neo-Vanco (BioMérieux, | 37 | 48 | Anaeróbica |
| Marcy-l'Etoile, Francia) | ||||
| *: \; \; Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D. Citron y S. Finegold; Third ed. | ||||
| **: \; Fosfomicina (79,5 mg/l) + Sulfametoxazol (0,93 mg/l) + Trimetoprima (5 mg/l) | ||||
| ***: Agar NN de Lowbury and Lilly, 1995 |
Resultados: los recuentos bacterianos que
se presentan en la Tabla 7 están expresados en log en base 10.
| NCC 2581 | NCC 2592 | NCC 2583 | NCC 2627 | |||||
| antes | Durante | Antes | Durante | Antes | Durante | Antes | Durante | |
| Lactobacilos | 6,38 | 7,63 | 6,12 | 7,62 | 5,31 | 7,47 | 6,69 | 7,65 |
| \pm 2,25 | \pm 1,23 | \pm 2,45 | \pm 1,58 | \pm 2,04 | \pm 1,23 | \pm 1,44 | \pm 1,45 | |
| Bifidobacterias | 7,17 | 7,64 | 7,57 | 6,31 | 6,43 | 6,80 | 8,04 | 6,07 |
| \pm 1,82 | \pm 0,42 | \pm 1,68 | \pm 2,26 | \pm 2,25 | \pm 2,19 | \pm 1,03 | \pm 2,32 | |
| Enterobacteriaceae | 4,25 | 4,27 | 4,37 | 4,58 | 5,09 | 4,40 | 4,59 | 3,64 |
| \pm 1,71 | \pm 1,20 | \pm 1,35 | \pm 1,45 | \pm 1,50 | \pm 0,63 | \pm 1,42 | \pm 0,64 | |
| Bacteroides | 6,05 | 5,54 | 5,94 | 6,15 | 6,19 | 5,52 | 6,00 | 5,48 |
| \pm 1,38 | \pm 0,49 | \pm 0,99 | \pm 1,43 | \pm 0,97 | \pm 0,46 | \pm 1,11 | \pm 0,50 | |
| C. perfr. | 4,09 | 3,84 | 3,61 | 3,30 | 4,16 | 3,34 | 3,84 | 3,57 |
| \pm 1,22 | \pm 1,00 | \pm 0,57 | \pm 0,00 | \pm 1,64 | \pm 0,11 | \pm 0,89 | \pm 0,56 |
Durante el tratamiento se observa un incremento
de los recuentos fecales de lactobacilos debido a la ingestión de
las bacterias probióticas citadas. No se observa ningún incremento
drástico en el recuento de Enterobacteriaceae lo cual refleja
que no existen daños en el ecosistema intestinal relacionados con el
uso de los probióticos seleccionados.
L. reuteri NCC2603, L. reuteri
NCC2613, L. acidophilus NCC2628 y Bifidobacterium sp.
NCC2657 fueron sometidas a ensayo en varios experimentos
alimentarios para poder evaluar su capacidad de supervivencia al
tránsito por el tubo gastrointestinal del perro.
Se sometió a 10 perros, 5 machos y 5 hembras de
4 a 7 años de edad, a este experimento específico. El protocolo
alimentario consistió en 5 días de adaptación con "Friskies
Vitality" sin achicoria, 5 días de ensayo con "Friskies
Vitality" sin achicoria, 3 días de adaptación y 5 días de ensayo
con "Friskies Vitality" sin achicoria más bacterias: L.
reuteri NCC2603 (dieta E), L. reuteri NCC2613 (dieta F),
L. acidophilus NCC2628 (dieta G) y Bifidobacterium sp.
NCC2657 (dieta H). La asignación de dietas fue la siguiente:
\newpage
| núm. perro | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| periodo 1 | E | E | E | E | E | F | F | F | F | F |
| periodo 2 | G | G | G | G | G | H | H | H | H | H |
Las cepas mencionadas se prepararon en una
cantidad suficiente y en una forma liofilizada estable para aplicar
estas ocho bacterias diferentes según la supervivencia de la cepa en
el tubo gastrointestinal de los animales ensayados. Todas las cepas
se mezclaron con 4 g de trealosa para así añadir un volumen
suficiente de portador para la mezcla de las cepas preparadas con la
matriz alimentaria para los animales. Las cepas bacterianas se
preparan en tubos de plástico individuales (5,0E+09 ufc/día) y se
añaden diariamente en una parte del alimento para garantizar la
ingestión del total de las bacterias.
Se obtienen muestras fecales frescas para el
análisis de las cifras de la población bacteriana y se comparan con
la línea de base (sin bacterias añadidas). Las heces se recogen los
días
7 y 8 (línea de base),
14 y 15,
21 y 22 (línea de base).
28 y 29.
Se utiliza una sonda rectal estéril para obtener
una muestra fecal de por lo menos 0,1 g. Esta muestra es pesada con
precisión y se mezclan 0,1 g con 10 ml de solución fisiológica
(Ringer) que contiene un 10% de glicerol. Luego se transfiere esta
solución a criotubos de 1 ml y se congela en nitrógeno líquido.
Entonces todas las muestras se conservan a -80ºC hasta el análisis.
El recuento de todas las bacterias se llevó a cabo en los mismos
medios que se describen en el ejemplo 3.
Resultados: Los recuentos bacterianos que
se presentan en la Tabla 8 están expresados en log en base 10.
| NCC 2603 | NCC 2613 | NCC 2628 | NCC 2657 | |||||
| antes | Durante | Antes | Durante | Antes | Durante | Antes | Durante | |
| Lactobacilos | 5,25 | 3,92 | 4,00 | 3,40 | 7,93 | 8,30 | 6,47 | 7,00 |
| \pm 1,34 | \pm 1,05 | \pm 1,56 | \pm 0,21 | \pm 1,75 | \pm 0,99 | \pm 1,27 | \pm 1,35 | |
| Bifidobact. | 7,32 | 4,48 | 6,09 | 4,55 | 7,70 | 7,20 | 5,72 | 6,78 |
| \pm 2,06 | \pm 2,64 | \pm 2,10 | \pm 2,79 | \pm 1,88 | \pm 1,88 | \pm 2,51 | \pm 2,39 | |
| Enterobact. | 4,10 | 4,62 | 3,62 | 4,39 | 4,58 | 4,04 | 4,51 | 4,85 |
| \pm 0,89 | \pm 0,61 | \pm 0,72 | \pm 0,94 | \pm 1,54 | \pm 0,76 | \pm 1,51 | \pm 1,45 | |
| Bacteroides | 7,82 | 6,70 | 6,92 | 6,69 | 7,88 | 7,53 | 7,92 | 7,66 |
| \pm 0,53 | \pm 1,25 | \pm 1,37 | \pm 1,19 | \pm 1,13 | \pm 0,61 | \pm 0,63 | \pm 0,86 | |
| C. perfr. | 3,70 | 3,84 | 3,50 | 3,30 | 3,70 | 3,30 | 3,93 | 3,70 |
| \pm 0,89 | \pm 0,87 | \pm 0,45 | \pm 0,00 | \pm 0,62 | \pm 0,00 | \pm 1,25 | \pm 0,89 |
Durante el tratamiento no se observa ningún
cambio importante en los recuentos fecales de lactobacilos debido a
la ingestión de las bacterias probióticas seleccionadas excepto en
el caso de la cepa de L. acidophilus NCC2628. El efecto
inhibidor sobre C. perfringens bajo las condiciones ensayadas
no fue significativo ya que los niveles basales de C.
perfringens eran muy bajos. No se observa ningún incremento
drástico en el recuento de Enterobacteriaceae lo cual
refleja que no existe ninguna perturbación del ecosistema intestinal
relacionada con el uso de los probióticos seleccionados.
Se estudió el efecto de sobrenadantes de
filtrado de cultivo de cepas de lactobacilos aislados a partir de
gatos y perros.
Cepas y cultivos bacterianos: los
microorganismos pertenecientes al género Lactobacillus
formaban parte de la Colección de Cultivos Nestlé. Las bacterias se
cultivaron en medio MTYI. Los sobrenadantes que contenían
metabolitos de lactobacilos fueron neutralizados a pH 6 y
esterilizados por filtración.
Se llevaron a cabo controles en los que se
acidificó el medio MTYI con ácido láctico al mismo pH que el de los
cultivos bacterianos. Después se ajustó a pH 6 con NaOH 0,1 N. El
origen de la cepa estudiada y el pH de los sobrenadantes y
controles se muestran en la Tabla 9.
| Cepa | Origen | pH sobrenadante | pH control |
| L. reuteri NCC2581 | Gato | 6,63 | 6,63 |
| L. rhamnosus NCC2583 | Gato | 6,50 | 5,97 |
| L. reuteri NCC2592 | Gato | 6,04 | 5,98 |
| L. reuteri NCC2603 | Perro | 6,04 | 5,99 |
| L. reuteri NCC2613 | Perro | 6,07 | 5,95 |
| L. acidophilus NCC2628 | Perro | 6,01 | 5,93 |
Parásitos: La cepa de Giardia
intestinalis WB (ATCC 30957) fue comprada a la American Type
Culture Collection (Rockville, EEUU). Los trofozoitos se cultivaron
en medio de cultivo TYI-S-33
modificado de Keister y contenía por litro: 20 g de producto de la
digestión de la caseína (Difco), 10 g de extracto de levadura (BBL),
10 g de dextrosa (Merck), 0,75 g de bilis bovina (Difco), 2 g de
NaCl (Merck), 2 g de HCl L-cisteína (Sigma), 0,2 g
de sal sódica de ácido ascórbico (Fluka), 0,6 g de K_{2}HPO_{4}
(Merck), 22,8 mg de citrato amónico férrico (Sigma), 100 ml de
suero bovino adulto (Sigma), 15 ml de penicilina/estreptomicina
(Gibco, 1000 IU/ml, 1000 \mug/ml). El pH se ajustó a 6,9 con NaOH
5 N previamente a la esterilización por filtración (tamaño del
poro:0,22 \mum).
Los parásitos se cultivaron en frascos de
cultivo de poliestireno (LUX, Miles Laboratories, Inc. Naperville IL
60540) en los que había 40 ml de medio de cultivo. Se realizaron
subcultivos descartando el sobrenadante carente de parásitos,
añadiendo 5 ml de medio de cultivo frío, incubando en un baño de
hielo durante 10 min para separar los trofozoitos adheridos e
inoculando 0,2 ml de la suspensión resultante en medio fresco. Las
incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC en la oscuridad.
Ensayos de proliferación: Se mezclaron 200
\mul de suspensiones de trofozoitos (1,4 x 10^{5} parásitos/ml)
con 100 \mul de sobrenadantes o controles, y se añadió 1 \muCi
de timidina H3. Se incubaron muestras a 37ºC durante 24 h en placas
de cultivo de 96 pocillos (Nunc Brand Products). Entonces se
recogieron los parásitos y se evaluó la incorporación de
timidina.
La incorporación de Timidina se muestra en la
Tabla 10. La cepa NCC 2628 aislada a partir de un perro produjo una
fuerte inhibición de la proliferación de la cepa WB (91%). Otras
cepas estudiadas no inhibieron el crecimiento de trofozoitos.
| Cepa | Proliferación Giardia intestinalis en CPM |
| L. reuteri NCC 2581 | 1720 |
| Control | 2000 |
| L. rhamnosus NCC 2583 | 2500 |
| Control | 1720 |
| L. reuteri NCC 2592 | 1800 |
| Control | 1970 |
| L. reuteri NCC 2603 | 2100 |
| Control | 1900 |
| L. reuteri NCC 2613 | 2510 |
| Control | 1950 |
| L. acidophilus NCC 2628 | 150 |
| Control | 1610 |
| MTYI | 1870 |
En este experimento se puede demostrar que los
metabolitos funcionales producidos durante el crecimiento de L.
acidophilus NCC 2628 tienen un fuerte efecto inhibidor sobre el
crecimiento de Giardia intestinalis.
Ejemplos del 6 al
8
Para identificar cepas con propiedades
antagonistas fuertes respecto a patógenos intestinales pequeños se
realizaron experimentos de cocultivo siguiendo un sistema modelo de
simulación de las condiciones intestinales caninas (pH, composición
y concentración biliar, mucina, pancreatina). El jugo de intestino
delgado canino simulado contenía bilis canina reconstituida (0,345
g/l tauroquenodesoxicolato, Sigma, Alemania; 3,04 g/l taurocolato,
Sigma, Alemania; 0,006 g/l colato, Fluka, Suiza), mucina porcina
(1,9 g/l, Sigma, Alemania), pancreatina porcina (2,42 g/l, Sigma,
Alemania) y solución electrolítica (5 g/l NaCl, 0,6 g/l KCl, 0,25
g/l CaCl_{2}, todos de Merck, Alemania). El pH del jugo se ajustó
a 6,5 \pm 0,5 con NaOH 0,1 N.
Se seleccionaron cuatro cepas potencialmente
patógenas: S. typhimurium SL1344, E. coli ETEC O8:H9 y
E. coli O149:K88 (aislados caninos patógenos) y un aislado
clínico de Sh. dysenteriae (origen humano, amablemente
proporcionada por el Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise -
CHUV Laussane, Suiza). Con la excepción de S. typhimurium
SL1344 propagado en caldo Luria Bertani (Difco, EEUU), todas las
Enterobacteriaceae se cultivaron en caldo Infusión Cerebro Corazón
(Difco, EEUU) a 37ºC en agitación (240 rpm).
Un amplio espectro de lactobacilos de origen
canino y felino que incluye L. acidophilus NCC2628 (CNCM
I-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM
I-2449), L. reuteri NCC2581 (CNCM
I-2448) y L. reuteri NCC2592 (CNCM
I-2450) fueron seleccionadas a partir de la
Colección de Cultivos Nestlé (NCC, Nestec, Suiza) y se analizó en el
intestino delgado canino su supervivencia, actividad fisiológica y
efectos inhibidores sobre los patógenos del intestino delgado
arriba mencionados. Los lactobacilos se cultivaron anaeróbicamente
(anaerocult, Oxoid, Inglaterra) en caldo de cultivo Man Rogosa Sharp
(Difco, EEUU) a 37ºC.
Se diluyeron muestras en tampón fosfato estéril
(NaH_{2}PO_{4}, pH 7, 0,2 M) y se realizaron diez diluciones
seriadas que fueron dispuestas en la superficie de placas de agar:
agar MRS (Difco, EEUU) para lactobacilos, agar
Salmonella-Shigella (Oxoid, Inglaterra) para S.
typhimurium y Sh. dysenteriae y agar Sorbitol Mac Conkey
(Oxoi, Inglaterra) para E. coli. Las placas se incubaron
anaeróbicamente durante 48 h a 37ºC, en el caso de los lactobacilos,
y durante 24 h a 37ºC en el caso de las Enterobacteriaceae.
En los experimentos de cocultivo, el crecimiento de
Enterobacteriaceae sobre agar MRS se inhibió mediante la
adición de polimixina (Oxoid, Inglaterra).
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con
BAL probióticas potenciales y cepas patógenas a 37ºC en 20 ml (tubos
Falcon) de jugo de intestino delgado canino simulado enriquecido con
diferentes fuentes de carbono (azúcar, alimento para mascotas) para
favorecer la actividad metabólica de los cultivos. Las BAL fueron
inoculadas a 10E+08 ufc/ml y los patógenos a 10E+02 ufc/ml, 10E+04
ufc/ml y 10E+06 ufc/ml. Se tomaron muestras en diferentes tiempos
hasta las 8 horas y se determinaron recuentos de células viables
mediante la disposición de diez diluciones seriadas sobre la
superficie de placas con los medios respectivos.
Los experimentos de cocultivo se realizaron bajo
diferentes condiciones como el enriquecimiento con dextrosa del jugo
de intestino delgado canino simulado (5 g/l) y diferentes
concentraciones de alimento seco extruido para mascotas
comercialmente disponible (5, 25 ó 100 g/l; Friskies ALPO Complete,
EEUU). Estas últimas fueron homogeneizadas (Stomacher Lab Blender)
y suspendidas en solución electrolítica. Todos los experimentos se
realizaron por duplicado.
Ejemplo
6
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con
cuatro lactobacilos y las cuatro cepas potencialmente patógenas
E. coli ETEC O8:H9, E. coli O149:K88, S.
typhimurium SL1344 y Sh. dysenteriae en jugo duodenal
canino simulado enriquecido con 5 g/l de dextrosa (Difco). Se
inocularon los lactobacilos a 10E+08 ufc/ml y las cepas indicadoras
Gram negativas a 10E+02 ufc/ml. Los resultados se recogen en la
Tabla 11.
| Patógeno | E. coli ETEC O8:H9 | E. coli O149:K 88 | S. typhimurium SL1344 | Sh. dysenteriae |
| Probiótico | ||||
| L. acidophilus NCC | +++ | +++ | +++ | +++ |
| 2628 (CNCM I-2453) | ||||
| L. rhamnosus NCC | +++ | +++ | +++ | +++ |
| 2583 (CNCM I-2449) | ||||
| L. reuteri NCC2581 | Inhibición | ++ | Inhibición | +++ |
| (CNCM I-2448) | nula | nula | ||
| L. reuteri NCC2592 | Inhibición | ++ | Inhibición | + |
| (CNCM I-2450) | nula | nula | ||
| + \; \; Inhibición del crecimiento | ||||
| ++ \; Inhibición del crecimiento e inactivación parcial | ||||
| +++ Inhibición del crecimiento inactivación completa |
Los cuatro lactobacilos investigados mostraron
actividad antimicrobiana, pero solamente L. acidophilus
NCC2628 (CNCM I-2453) y L. rhamnosus NCC2583
(CNCM I-2449) mostraron una actividad elevada frente
a todos los patógenos ensayados. Ambas cepas eran capaces tanto de
inhibir el crecimiento como de inactivar completamente los patógenos
que contenía el sistema de ensayo (no quedaba ninguna célula
viable).
Ejemplo
7
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con
los lactobacilos L. acidophilus NCC2628 (CNCM
I-2453) y L. rhamnosus NCC2583 (CNCM
I-2449) y S. typhimurium SL1344 en jugo
duodenal canino simulado enriquecido con alimento seco extruido para
mascotas comercialmente disponible (5, 25 ó 100 g/l; Friskies ALPO
Complete, EEUU). Se inocularon los lactobacilos a 10E+08 ufc/ml y
las cepas indicadoras Gram negativas a 10E+02 ufc/ml. Los resultados
se recogen en la Tabla 12.
| Patógeno | Enriquecimiento con alimento para mascotas | S. typhimurium SL1344 |
| Probiótico | ||
| L. acidophilus NCC2628 | 5 g/l | +++ |
| (CNCM I-2453) | 25 g/l | +++ |
| 100 g/l | +++ | |
| L. rhamnosus NCC2583 | 5 g/l | No inhibición |
| (CNCM I-2449) | 25 g/l | + |
| 100 g/l | ++ | |
| + \; \; Inhibición del crecimiento | ||
| ++ \; Inhibición del crecimiento e inactivación parcial | ||
| +++ Inhibición del crecimiento inactivación completa |
Los resultados demuestran en especial el alto
potencial de L. acidophilus NCC2628 (CNCM
I-2453) para inhibir el crecimiento e incluso
inactivar completamente los patógenos del intestino delgado bajo
condiciones muy prácticas como son una mezcla de jugo de intestino
delgado simulado y alimento para mascotas. La actividad
antimicrobiana de L. acidophilus NCC2628 era muy elevada
incluso a niveles bajos de enriquecimiento con alimento para
mascotas comercial que servía de fuente de azúcares fermentables
para el organismo. Por el contrario, la efectividad de L.
rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) dependía del
nivel de enriquecimiento con alimento para mascotas de manera que
se observaba un aumento en la actividad antimicrobiana a medida que
aumentaba la cantidad de alimento para mascotas añadido al sistema
de ensayo.
Ejemplo
8
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con
L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y
diferentes niveles de inoculación de S. typhimurium SL1433 en
jugo duodenal canino simulado enriquecido con dextrosa (5 g/l,
Difco). L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453)
fue inoculado a 10E+08 ufc/ml y S. typhimurium SL1433 a
10E+02 ufc/ml, 10E+04 ufc/ml y 10E+06 ufc/ml. Los resultados se
recogen en la Tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
| Patógeno | Nivel de inoculación del patógeno | S. typhimurium SL1344 |
| Probiótico | ||
| L. acidophilus | 10E+02 ufc/ml | +++ |
| NCC2628 (CNCM I-2453) | 10E+04 ufc/ml | +++ |
| 10E+06 ufc/ml | +++ | |
| + \; \; Inhibición del crecimiento | ||
| ++ \; Inhibición del crecimiento e inactivación parcial | ||
| +++ Inhibición del crecimiento inactivación completa |
La actividad antimicrobiana de L.
acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) era lo
suficientemente alta como para inactivar completamente incluso
concentraciones iniciales elevadas de S. typhimurium
SL1344.
\newpage
Se analizó el potencial de estimulación
inmunitaria de cepas de probióticos aisladas de mascotas en un
ensayo clínico con la cepa L. acidophilus NCC2628.
Para realizar este experimento se utilizaron 20
perros de 4 a 7 años de edad. El protocolo alimentario consistió en
una semana de adaptación con "Friskies Vitality" sin achicoria
y 4 semanas de ensayo con "Friskies Vitality" sin achicoria más
bacterias de L. acidophilus NCC2628.
La cepa L. acidophilus NCC2628 se preparó
en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada estable de
acuerdo con la supervivencia de la cepa en el tubo gastrointestinal
de los animales ensayados. Se mezclaron bacterias con 4 g de
trealosa con el fin de añadir un volumen de portador suficiente para
mezclar la bacteria preparada con la matriz alimentaria para los
animales. Las bacterias se prepararon en tubos de plástico
individuales (5,0E+09 ufc/día) y se añadieron diariamente en una
parte del alimento para asegurar la ingestión del total de
bacterias.
Se tomaron muestras de sangre de los perros
después de las cuatro semanas de administración del probiótico. La
sangre se fraccionó en una columna Vaccutaniner^{TM} (Becton
Dickinson, Mountain View, CA). Las PMBC fueron recubiertas
siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Las células se estimularon con diferentes
mitógenos o ésteres de forbol que inducen una fuerte proliferación
de células T (concanavalina A (conA), fitohemaglutinina (PHA)), de
células B (mitógeno de filotaca o "pokeweed" (PWM)) y de todas
las células
(Forbol-Miristato-Acetato/Ionomicina
(PMA/Iono)). Se incubaron 10^{5} células por pocillo con mitógenos
o los ésteres de forbol (las dosis respectivas se indican en la
figura 1) en un volumen final de 200 \mul de medio de cultivo
RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero fetal
bovino y antibióticos en placas de cultivo de fondo plano de 96
pocillos (Nunc).
Las células se mantuvieron en atmósfera de
CO_{2} al 5% humidificada a 37ºC durante 48 h. Las células se
marcaron por pulsos con 1 \muCi de timidina H3 (Amersham Pharmacia
Biotech, Suiza) durante otras 18 h. Luego se transfirieron las
células sobre filtros de nitrocelulosa (Packard) y la timidina H3
unida se midió mediante recuento de centelleos (TopCount; Packard,
Suiza). La proliferación celular se calculó como las cuentas por
minuto (cpm) medias(\pmSD) a partir de triplicados.
Figura 1: tuvo lugar un incremento claro de la
proliferación celular en respuesta todos los mitógenos del grupo
del perro alimentado con L. acidophilus NCC2628 si se compara
con el grupo control. Este incremento fue significativo en los
cultivos estimulados con los ésteres de forbol PMA + ionomicina.
Estos datos muestran que las células linfoides de perros
alimentados con probióticos eran más reactivas tras una activación
in vitro y sugieren que el sistema inmunitario de los perros
alimentados con probióticos ha sido estimulado.
Se estableció un cribado in vitro de las
diferentes cepas de lactobacilos aisladas de mascotas antes
descritas para determinar su potencial de modulación inmunitaria.
Con esta finalidad, se midió su capacidad para inducir citocinas
proinflamatorias (IL-12, IFN\gamma) y/o citocinas
antiinflamatorias (IL-10,
TGF-\beta) (Anand A.C., Adaya C.M. 1999, Trop.
Gastroenterol.; 20(3):97-106; Spellber
B., Edwards J.E.Jr 2001, Clin. Infect. Dis.;
32(1):76-102). Con esto se pretendía
seleccionar cepas candidatas potenciales para funciones inmunitarias
antipatógenas o anticancerosas fuertes además de funciones
antagonistas respecto a patologías intestinales caninas como
alergias e inflamación (enfermedades inflamatorias intestinales). Se
realizaron cultivos adicionales solo con medio de cultivo (control
negativo), con la cepa Enterococcus faecium SF68 (NCIMB
10415, Cerbios-Pharma, Suiza) y con un aislado de
Lactobacillus humano ST11 (NCC 2461, CNCM
I-2116) (control positivo).
Se trató sangre de perros adultos normales
durante 5 min a temperatura ambiente con tampón de lisis ACK (150 mM
de NH_{4}Cl, 1 mM de KHCO_{3} y 0,1 mM de Na_{2}EDTA en
H_{2}O, pH = 7,4). Los leucocitos se lavaron dos veces con medio
RPMI (sin antibióticos) y se sembraron a 2,10^{6} células/ml en
placas de cultivo de 24 pocillos. Se añadió a cada pocillo 1 ml de
una suspensión bacteriana (descrita más adelante) que contenía
10^{6} ufc.
Para el tratamiento control, se añadió solamente
medio a los leucocitos. Las muestras se incubaron 18 h a 37ºC y
CO_{2} al 5%. Posteriormente, los leucocitos se recogieron, se
lavaron en PBS y se centrifugaron. El sedimento celular fue lisado
con 500 \mul de reactivo Trizol (Gibco BRL). Se extrajo RNA de los
lisados celulares mediante el equipo Nucleospin RNA
(Macherey-Nagel). Se realizaron
RT-PCR para amplificación de citocinas caninas
mediante el equipo AB gene (Merck). Las referencias de los cebadores
(todos producidos por Microsynth) se indican más adelante. El
análisis densitométrico de las bandas de PCR reveladas en los geles
de agarosa teñidos con bromuro de etidio se llevó a cabo utilizando
el software NIH Image. Todas las bandas se normalizaron con la banda
del producto de PCR correspondiente a \beta-actina
respectiva obtenida con cada muestra (control interno), y los
resultados están expresados en unidades arbitrarias que reflejan las
densidades en píxeles de cada banda del producto de PCR
correspondiente a citocina (figura 2).
- -
- Preparación de las bacterias: las diferentes cepas de lactobacilos se cultivaron en medio MRS durante aproximadamente 8 h hasta alcanzar una densidad idéntica. Las bacterias se diluyeron en medio RPMI sin antibióticos hasta unas concentraciones finales de 10^{6} ufc/ml.
- -
- Cebadores utilizados para las RT-PCR de citocinas:
| Citocinas | Referencias |
| IL-12p40 | Büttner M., et al., 1998. Cytokine; 10(4):241-248. |
| IFN\gamma | Büttner M., et al., 1998. Cytokine; 10(4):241-248. |
| TGF\beta1 | Gröne A., et al., 1998. Vet. Immunol. Immunopathol.; 65:11-27. |
| IL-10 | Pinelli E., et al., 1999, Vet. Immunol. Immunopathol.; 69:121-126. |
Figura 2: Los datos mostrados muestran que los
perfiles de citocinas inducidos por lactobacilos dependen del tipo
de cepa. Por ejemplo, la cepa NCC2628 indujo altos niveles de
IL-10 y TGF\beta, lo cual resalta el potencial de
esta cepa en particular para la modulación inmunitaria de trastornos
inflamatorios como alergias y enfermedades inflamatorias
intestinales. Por el contrario, la cepa NCC2583 indujo elevados
niveles de IFN\gamma y IL-12, lo que implica que
esta cepa es una buena candidata para la actividad antipatógena o
anticancerosa.
En el estudio se utilizan tres tipos de alimento
seco para mascotas: "A","B" y "C". El alimento para
mascotas "A" es un alimento seco nutricionalmente completo,
disponible con el nombre de ALPO (ALPO es una marca registrada de
SOCIÉTÉ DES PRODUITS NESTLÉ S.A. de Suiza).
El alimento para mascotas "B" es el mismo
alimento seco nutricionalmente completo que "A", pero está
suplementado con una mezcla en polvo de microorganismos probióticos
seleccionados añadidos de una bolsita. La mezcla comprende
cantidades sustancialmente iguales de L. acidophilus NCC2628
y Bifidobacterium sp. NCC2657. Se espolvorea sobre el
alimento en cada ración en una dosis de unas 1.0E+08 ufc/día.
El alimento para mascotas "C" es un
alimento seco nutricionalmente completo sustancialmente idéntico al
alimento "A" pero que contiene un 1,2% en peso de un
sobrenadante seco de un cultivo de Enterococcus faecium SF68
(NCIMB 10415).
En el estudio se emplearon 30 perros. Primero
son prealimentados durante 8 semanas con el alimento "A". Luego
se les divide en tres grupos de 10 perros cada uno, se les designa
como grupo A, B y C y se les alimenta durante 8 semanas con las
dietas que les corresponde por nombre:
Los perros tienen acceso libre a agua y son
alimentados una vez al día. La prevalencia de caspa en el pelo se
determina mediante un panel de evaluación de 30 miembros al inicio y
a las 7 semanas.
Los perros se cepillan antes de ser evaluados
por el panel y los miembros del mismo no comparan notas durante la
evaluación.
En esta evaluación los perros son presentados a
cada uno de los miembros del panel en 20 parejas diferentes. Se pide
a los miembros que indiquen en sus hojas de puntuación qué perro de
la pareja presentada muestra (1) menos caspa (2) mayor brillo del
pelo y (3) menos olor a pelo.
El estado general del pelo de todos los perros
es bueno a la vista y al tacto, tal como se espera de perros
normales y sanos. Sin embargo, se observa que los perros alimentados
con la dieta C presentan bastante menos caspa que aquellos
alimentados con la dieta control A. Los alimentados con la dieta B
presentan un pelo mucho más brillante y desprenden menos olor a
pelo que los alimentados con A. Estas características no parecen
diferir estadísticamente de forma significativa si se comparan con
los perros en el grupo B.
Una mezcla alimenticia está compuesta de cerca
de un 58% en peso de maíz, un 6% en peso de gluten de maíz, un 23%
en peso de carne y el resto lo componen harina, sales, vitaminas y
minerales.
La mezcla alimenticia se introduce en un
precondicionador y se humedece. A esta mezcla se le añade un polvo
que contiene una mezcla de las siguientes cepas de
Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM
I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628
(CNCM I-2453) y Enterococcus faecium SF68
(NCIMB 10415). El polvo se dispersa bastante homogéneamente por
toda la mezcla. Esta combinación alimenticia humedecida se
introduce en una extrusora-esterilizadora y es
gelatinizada. La matriz de gelatina que sale de la extrusora se
obliga a pasar por un molde y se extruye. La mezcla extruida se
corta en porciones adecuadas para alimentar a los perros, se seca a
unos 110ºC durante 20 min y se enfría para formar pellets. Se
analiza la actividad bacteriana de las cepas añadidas en las
porciones de mezcla extruida y no se detecta ninguna.
En este estudio se utilizan 24 perros, jóvenes y
mayores, estos últimos de entre 8 y 12 años. Los perros mayores
seleccionados muestran signos externos de inflamación articular
habituales de su edad y parecen padecer alguna dificultad de
movimiento ocasional. Ciertos movimientos parecen resultarles
dolorosos. Estos síntomas se observan con frecuencia en perros
mayores y se cree que están relacionados con una enfermedad
artrítica.
En el estudio se utilizan tres alimentos secos
para mascotas que se designan como A, B y C. El alimento A es un
alimento seco nutricionalmente completo (ALPO Beefy Dinner) y es el
alimento control.
Todos los 24 miembros de la selección son
alimentados durante 8 semanas con el alimento A. Entonces los perros
son divididos en tres grupos, A, B y C, cada uno de ellos con 8
perros y con la misma proporción de jóvenes y mayores. Cada grupo
es alimentado siguiendo las dietas respectivas durante 8
semanas:
| Grupo | Alimento para mascotas |
| A | A |
| B | B |
| C | C |
El alimento B es un alimento seco
nutricionalmente completo sustancialmente idéntico al alimento A,
pero contiene un recubrimiento que representa el 2% de su peso y
que contiene los microorganismos de Enterococcus faecium
SF68 (NCIMB 10415). La cantidad de alimento administrado diariamente
a cada perro se calcula según la masa corporal individual, por
tanto la dosis de microorganismos es de 1,0E+09 ufc/día.
La dieta C está formada por las porciones
extruidas producidas en el ejemplo 12 anterior. La cantidad de
alimento administrado diariamente a cada perro se calcula según la
masa corporal individual, por tanto la dosis es de 1,0E+11
ufc/día.
Los perros tienen libre acceso a agua y son
alimentados una vez al día. A cada perro se le coloca en el collar
un medidor de actividad y se realizan mediciones cada día. La
actividad de los perros también es evaluada visualmente por personal
experto.
El estado general de todos los perros es bueno a
la vista y al tacto, tal como se espera de perros normales y sanos.
Sin embargo, se observa que los perros alimentados con las dietas B
y C son más activos que sus equivalentes de la dieta A. Las
lecturas del medidor apoyan estas observaciones.
Además, los perros mayores de los grupos B y C,
después de ser alimentados con las dietas B y C durante el periodo
del ensayo, parecen mostrar menos signos externos de inflamación
articular local. Los perros también parecen experimentar niveles
más bajos de dolor con el movimiento físico y se mueven más
libremente que antes. Se puede concluir que las dietas B y C
parecen proporcionar alivio respecto a determinados signos de
envejecimiento y mejoran la movilidad de las mascotas mayores.
Una mezcla alimenticia está compuesta de cerca
de un 58% en peso de maíz, un 6% en peso de gluten de maíz, un 23%
en peso de harina de pollo y el resto lo componen sales, vitaminas y
minerales.
La mezcla alimenticia se introduce en un
precondicionador y se humedece. La composición alimenticia
humedecida se introduce en una
extrusora-esterilizadora y es gelatinizada. La
matriz de gelatina que sale de la extrusora se obliga a pasar por un
molde y se extruye. La mezcla extruida se corta en porciones
adecuadas para alimentar a los perros, se seca a unos 110ºC durante
20 min y se enfría para formar pellets. En este punto se proporciona
un polvo liofilizado de una cepa o más de las siguientes especies
de Lactobacillus para aplicar a los pellets:
Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM
I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628
(CNCM I-2453) y Enterococcus faecium SF68
(NCIMB 10415). Así, se proporciona suficiente polvo para que la
ingesta alimenticia correspondiente para el gato sea de
aproximadamente entre 1,0E+07 y 1,0E+09 ufc/día. Parte del polvo se
mezcla en una primera masa de pellets y se embolsa. Una segunda
cantidad del polvo es medida y mezclada con un portador lipídico que
entonces es rociado sobre una segunda masa de pellets. Los pellets
se embolsan una vez el recubrimiento esté suficientemente seco a
entre 50 y 60ºC durante algunos minutos.
Se prepara una mezcla alimenticia a partir de un
73% de carcasa de pollo, pulmones porcinos y hígado de ternera
(molido), un 16% de harina de maíz, un 2% de colorantes, vitaminas y
sales inorgánicas. Esta mezcla es emulsionada a 12ºC y extruida en
forma de "pudding" que luego se cuece a una temperatura de
90ºC. Se deja enfriar hasta 30ºC y se corta en pedazos. El 45% de
estos pedazos se mezcla con un 55% de una salsa preparada con un
98% de agua, 1% de colorante y un 1% de goma guar. Se llenan latas
de hojalata y se esterilizan a 125ºC durante 40 min. Se proporciona
un empaquetado adicional en bolsitas como un suplemento probiótico
que se debe mezclar con el alimento para mascotas antes de
servirlo. Su contenido son cepas de las siguientes especies de
Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM
I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628
(CNCM I-2453) o Enterococcus faecium SF68
(NCIMB 10415). La cantidad correspondiente para la mascota es de
aproximadamente entre 10^{6} y 10^{12} ufc/día, dependiendo de
si es un perro o un gato y de factores físicos como la masa
corporal. Se suministra como un suplemento adjunto a la lata y con
indicaciones alimentarias.
Claims (10)
1. Cepa probiótica que es Lactobacillus
reuteri NCC2581 (NCMC I-2448), Lactobacillus
reuteri NCC2592
(NCMC I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (NCMC I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (NCMC I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (NCMC I-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (NCMC I-2453).
(NCMC I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (NCMC I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (NCMC I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (NCMC I-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (NCMC I-2453).
2. Un método de obtención de cepas probióticas
para gatos y/o perros que comprende los siguientes pasos:
- a.
- Aislamiento de bacterias ácido lácticas a partir de heces de gatos y perros,
- b.
- Selección de cepas con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares, y con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml tras 2 horas en un intervalo de pH de entre 3,4 y 4,2.
3. Un método de preparación de una composición
de alimento para perros o gatos que comprende los siguientes
pasos:
- a.
- Aislamiento de bacterias ácido lácticas a partir de heces de gatos o perros,
- b.
- Selección de cepas con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares, y con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml tras 2 horas en un intervalo de pH de entre 3,4 y 4,2.
- c.
- Incorporación de la(s) cepa seleccionada en una composición de alimento para perros o gatos.
4. El método de acuerdo con la reivindicación
3, en el que la cepa es Lactobacillus o
Bifidobacterium y donde la cepa está asociada a un vehículo
ingerible o una matriz farmacéutica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que la composición está destinada a la salud del tubo
gastrointestinal de gatos y/o perros.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que la composición está destinada a la salud de la piel y/o
el pelo de gatos y/o perros.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que la composición está destinada a la mejora o reducción de
los efectos del envejecimiento en gatos y/o perros.
8. El método de acuerdo con las reivindicaciones
de la 3 a la 7, en el que la cepa se encuentra en la composición en
una cantidad de entre 1,0E+04 y 1,0e+11 ufc/g.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 3 a la 8, que también contiene el paso de
adición de un prebiótico.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 3 y la 9, en el que la composición está en
forma de
- a.
- Un alimento para mascotas nutricionalmente completo en una forma seca en polvo o húmeda refrigerada o de conservación sin refrigerar, o
- b.
- En forma de un complemento alimenticio.
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