NO323870B1 - Fremgangsmate for a konjugere et peptid til et polysakkarid. - Google Patents
Fremgangsmate for a konjugere et peptid til et polysakkarid. Download PDFInfo
- Publication number
- NO323870B1 NO323870B1 NO19984341A NO984341A NO323870B1 NO 323870 B1 NO323870 B1 NO 323870B1 NO 19984341 A NO19984341 A NO 19984341A NO 984341 A NO984341 A NO 984341A NO 323870 B1 NO323870 B1 NO 323870B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polysaccharide
- peptide
- conjugate
- group
- amino
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 181
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 157
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 157
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 123
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 title claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 3
- -1 amino, hydroxyl Chemical group 0.000 claims abstract description 36
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 28
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 26
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 16
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 7
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 abstract description 49
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 abstract description 26
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 9
- 229920001231 Polysaccharide peptide Polymers 0.000 abstract description 8
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 abstract description 7
- 108010022457 polysaccharide peptide Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 3
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 241000947238 Neisseria meningitidis serogroup C Species 0.000 description 3
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000921898 Neisseria meningitidis serogroup A Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical group [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- AQRLNPVMDITEJU-UHFFFAOYSA-N triethylsilane Chemical compound CC[SiH](CC)CC AQRLNPVMDITEJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKUZQMZWTZAPSN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-bromoacetate Chemical compound BrCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NKUZQMZWTZAPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000004400 (C1-C12) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 1-[(1r,6r)-9-azabicyclo[4.2.1]non-4-en-5-yl]ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CCC[C@@H]2CC[C@H]1N2 SGNXVBOIDPPRJJ-PSASIEDQSA-N 0.000 description 1
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- AIHDUTVBOYDXOW-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)pyridin-1-ium-1-carbonitrile Chemical compound CN(C)C1=CC=[N+](C#N)C=C1 AIHDUTVBOYDXOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical group O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011785 NMRI mouse Methods 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241001467018 Typhis Species 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Chemical group 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003948 anatoxin Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004989 dicarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde Chemical group OCC(O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- RTWNYYOXLSILQN-UHFFFAOYSA-N methanediamine Chemical compound NCN RTWNYYOXLSILQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007248 oxidative elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000000843 phenylene group Chemical group C1(=C(C=CC=C1)*)* 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- ZNZJJSYHZBXQSM-UHFFFAOYSA-N propane-2,2-diamine Chemical compound CC(C)(N)N ZNZJJSYHZBXQSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide Chemical compound NNC(N)=O DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Abstract
Det er beskrevet et polysakkarid-peptid-konjugat hvori polysakkaridet er fordelaktig. immunogent, omfattende en polysakkarid kjede bestående av gjentatte enheter og en mengde av peptid deler, i det hver del inneholder et cystein residie og er kovalentlig koblet tilfeldig langs polysakkaridkjeden, gjennom en indirekte binding som innbefatter tiolgruppen til cysteinresidiet og en amino, hydroksyl eller karboksylgruppe av polysakkaridet, i det nevnte indirekte binding blir oppnådd gjennom enten en linker eller en spacer-linker del forutsatt at spacerdelen av spacer-linker delen er koblet til amino, hydroksyl eller karboksylgruppen til polysakkaridet. En nyttig linker kan for eksempel være N-(y-maleimidobutyryloksy)sukksinimid ester. Et slikt konjugat kan vanligvis utvise en "Rake" konfigurasjon.Konjugasjonsprosesser er også beskrevet. Konjugatene ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige innenfor vaksineområdet for å utløse en beskyttende langtids immunrespons overfor en patogen mikroorganisme hvorfra det immunogene polysakkaridet er avledet.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et polysakkaridpeptid konjugat. I en spesiell utførelsesform ifølge oppfinnelsen er konjugatet bakterielle eller sopp polysakkarider og kan følgelig være nyttige for vaksineformål.
Polysakkarider utgjør en stor familie av polymere molekyler som er nyttige innfor forskjellige tekniske områder. I noen tilfeller må de bli koblet til et polypeptid, for eksempel protein eller peptid. For eksempel blir polysakkaridene anvendt innen diagnostikk eller rensing som et matrisemedium for peptidreagenser. Ikke-immunogene polysakkarider så som dekstran, er også nyttige for å presentere små peptider for immunsystemet, som beskrevet i EP 326 111. Peptider må bli koblet til proteinbærere eller må bli administrert med en adjuvans og den mest vanlige anvendte adjuvansen er aluminiumforbindelser. Små peptider blandet, adsorbert eller presipitert med disse adjuvansene kan bli hindret av aluminiumgel og ér derfor ikke tilgjengelige for immunsystemet. For å løse dette problemet beskriver EP 326 111 at peptider kan bli konjugert til ikke-immunogene polysakkarider. Slike konjugater kan i nærvær av duminiumforbindelser utløse en immunrespons mot peptiddelen.
Innen vaksineområdet er det også meget interessant å konjugere polypeptider, for eksempel, peptid eller protein, til immunogene polysakkarider, som kan utløse en immunrespons mot polysakkaridene. Kapselen og celleveggen til bakterier (og også celleveggen til sopp) består av polysakkarider bestående av meget spesifikke gjentatte enheter som bærer epitope motiver som vanligvis ikke finnes hos pattedyr og som kan utløse immunogenisitet. Derfor er polysakkarider, for eksempel kapsulære polysakkarider allerede blitt anvendt som vaksiner mot bakterielle sykdommer så som meningitt, lungebetennelse og typtoid feber.
Dette er derimot er vesentlig problem ved anvendelse av polysakkarider som vaksiner. Til tross for at de er vist å være immunogene, dvs. at de med andre ord utløser en immunrespons når administrert som de er til et pattedyr, selv om denne responsen kan være svak, er de spesifikke ved at de tilhører det lille antallet av antigener som har evne til å indusere B-celleproduksjon uten hjelp av T-celler. De blir derfor betegnet T-uavhengige.
Immunresponsen indusert av T-uavhengige antigener er kjennetegnet ved et antall trekk, hvoriblant:
(i) primær responsen er svakere og tidligere enn responsen overfor T-avhengige antigener; (ii) antistoffresponsen modnes ikke til høy IgG produksjon, med affinitetsøkning, som observert med T-avhengige antigener; (iii) immunhukommelsen som følger T-uavhengige antigener er dårlig og følgelig fordi immunhukommelsen er nøkkelen til sekundær immunrespons som utgjør grunnlaget for vaksineringsprinsippet, er et T-uavhengig antigen et dårlig antigen for indusering av en langtidsbeskyttende immunrespons; og
(iv) nyfødte kan ikke reagere overfor polysakkarider før et eller to års alderen.
For å indusere en sekundær immunrespons må T-uavhengige antigener bli kovalent koblet til et baererprotein så som difteri- eller tetanustoksin som gir antigenet den T-avhengige karakteren. Konjugatet kan deretter bli komplementert med en adjuvans så som aluminiumforbindelse eller fullstendig eller ufullstendig Freunds adjuvans (disse to sistnevnte, er utelukkende for anvendelse i pattedyr forskjellige fra mennesker), slik at immunresponsen blir forsterket (adjuvans effekt).
Med betegnelsen "bærer" menes et molekyl som når kovalent koblet til et antigen for eksempel et polysakkarid, har evne til å fremme en T-avhengig respons mot antigenet. En slik respons vises ved et vaksineringsskjema omfattende minst to injeksjoner av antigen-bærer konjugat, i dager, uker eller måneder fra hverandre (priming og booster). Ved første injeksjon (priming), vises en svak antistoff respons, mens med booster-injeksjonen, blir antistofrfesponsen utløst i et høyt nivå. En slik forøket respons ses ikke når den negative kontrollen utgjort av ukonjugert antigen.
Forskjellige konjugeringsmetoder er allerede tilgjengelige innenfor fagområdet. Funksjonelle polysakkaridgrupper som vanligvis er involvert kan være amino, karboksyl eller hydroksylgrupper beliggende langs kjeden eller aldehydgruppene enten terminalt eller langs kjeden. Funksjonelle polypeptidgrupper som vanligvis er involvert kan være amino eller karboksylgrupper, terminale eller tilstede på aminosyre sidekj edene eller til og med tiolgruppene.
På en generell måte kan polysakkaridkonjugater utvise tre strukturtyper avhengig av beliggenheten til de funksjonelle gruppene til både polysakkarid (enten langs kjeden eller i enden) og bæreren, som er involvert i bindingen. Disse typer av strukturer blir for å lette beskrivelsen betegnet "Sun"- eller "Ear"-, "Rake-" og "Lattice"-typer. De er illustrert i figur 1, hvori (A), (B) og (C) henholdsvis står for "Sun" (neoglykokonjugat), "Rake"- og "Lattice"-typer.
I "Sun"-typen er et polysakkarid koblet til et protein eller peptid gjennom en reaktiv gruppe som eksklusivt er beliggende på en ekstremitet av polysakkaridkjeden. Vanligvis involverer dette en karbonylgruppe beliggende ved den reduktive enden av polysakkairdkjeden. Flere polysakkairdkjeder kan bli koblet på proteinet, i det koblingen vanligvis involverer en aminogruppe båret av for eksempel et lysinresidie. Slike konjugater er også definert som neoglykokonjugater. Som et eksempel blir et konjugat av denne typen oppnådd i Alonso de Velasco et al, Infect. Immun. (1995) 63: 961, Paradiso et al, Vaccine Research (1993) 2 (4): 239, and Jennings US-PS 4.356.170.
I "Rake"-typen, er peptidene koblet langs polysakkairdkjeden. Et eksempel på denne typen er angitt i Lett et al, Infect. Immun. (1994) 62: 785, og mer hensiktsmessig Lett et al. Infect. Immun. (1995) 63: 2645 and Konen-Waisman et al, J. Immunol. (1995):5977. kobling innbefatter aminogruppen båret av det enkelte lysinresidiet i det indre av peptidsekvensen og/eller den terminale aminogruppen.
I "Lattice"-typen blir proteinet og polysakkaridet kryss-bundet. Dette blir muliggjort på grunn av det faktumet at et protein i stedenfor et peptid blir anvendt (vanligvis amino-eller syregruppe beliggende langs proteinet) og reaktive grupper beliggende langs polysakkairdkjeden er involvert. Et konjugat av denne typen er beskrevet i Anderson US-PS 4.673.574, Schneerson et al, J. Exp. Med. (1980) 152: 361 beskriver også en konjugasjonsmetode som fører til en "Lattice"-type. Den anvender CNBr som en linker, adipinsyredihydrazid (ADH). Hydroksylgrupper tilstede langs hele polysakkairdkjeden og sidekjedeaminogrupper av proteinet er involvert.
Hver av disse strukturene kan bli oppnådd ifølge forskjellige konjugeringsprosesser. Bindingen kan være en direkte binding som i Anderson US-PS 4.673.574, Jennings US-PS 4.356.170, Lett et al eller Konen-Waisman et al. Bindingen kan også være en indirekte binding ved at et linkermolekyl blir anvendt som illustrert av Schneerson et al. I tillegg til en linker kan en spacer også bli anvendt som beskrevet i Alonso de Valesco et al eller Paradiso et al (for pneumokokkalt polysakkarid). Forskjellige funksjonelle grupper tilstede på polysakkarid, protein, linker og eventuelt spacer kan være involvert. Noen av de tidligere referansene sitert ovenfor blir presentert med ytterligere detaljer som følger: I Alonso de Velasco et al, er bæreren et peptid med omtrent 20 aminosyreresidier som omfatter et enkelt cysteinresidie ved en hvilken som helst ende. Streptococcus pneumoniae 17F polysakkaridet blir først derivatisert ved den reduktive enden ved reduktiv aminering med diaminopropan i nærvær av NaCNBH.3. Deretter blir det derivatiserte polysakkaridet bromacetylert med N-succinimidyl bromacetat som en linker og polysakkaridet aktivert på denne måten blir koblet til tiolgruppen av det enkelte N- eller C-terminale cysteinresidiet til peptidet. Et enkelt endekonjugat blir følgelig oppnådd.
I Lett et al (1994), blir S. mutans eller Saccaromyces cerevisiae polysakkaridet først oksydert med periodat for å danne aldehydgrupper som alle befinner seg langs polysakkairdkjeden. Deretter blir det oksiderte polysakkaridet direkte koblet ved reduktiv aminering til et peptid, i nærvær av NaCNBH3.
I Paradiso et al blir to polysakkarider anvendt: et pneumococcalpolysakkarid og polyribitol fosfat (PRP) til Haemiphilus influenzae. Ved sur hydrolyse av pneumococcpolysakkaridetS blir en aldosegruppe først dannet i enden av polysakkairdkjeden. Aminogrupper blir deretter tilsatt på enden av kjeden ved reduktiv aminering med diaminometan i nærvær av pyridinboran. Det derivatiserte polysakkaridet blir aktivert med succinimidyl diester av adipinsyre og koblet til aminogrupper av proteinet eller peptidet: når det gjelder PRP blir dette først utsatt for oksidativ spaltning ved anvendelse av periodat. Aldehydgruppene blir følgelig dannet i begge ender. Oksidert PRP blir deretter koblet til aminogruppene av proteinet og peptidet. I begge tilfeller blir en "Sun"-struktur dannet.
I Konen-Waisman et al, er Vi-polysakkaridet og peptidene (hvor ingen inneholder et cysteinresidie) eller proteiner direkte koblet sammen i nærvær av (3-dimerylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid hydroklorid (EDAC): karboksylgrupper i polysakkaridet og aminogrupper i proteinet eller peptidene er involvert i konjugeringen. Som et resultat blir en "Lattice"-struktur dannet når proteinet blir anvendt. Når peptider blir anvendt avhenger strukturen av antall aminosyreresidier som bærer aminogrupper. Det kan enten være en enkel "Lattice"-struktur eller en "Rake"-struktur. Som kjent når konjugering innbefatter funksjonelle grupper tilstede langs hele polysakkairdkjeden fører dette til et kryss-bundet konjugat dersom bæreren er et protein (flere amino eller karboksylgrupper på proteinet er tilgjengelig for kobling). Dersom polypeptidbæreren inneholder et enkelt koblingssete (denne situasjonen skjer ofte når det er lite nok), utviser konjugatet derav en "Rake"-struktur (som også kan bli oppnådd dersom polypeptidet inneholder noen få koblingsseter og konjugering blir utført under nær, usikker kontroll slik at en enkelt funksjonell gruppe på polypeptidet reagerer). Når konjugeringsmetoden anvender karboksyl- eller aminogrupper til et naturlig forekommende polypeptid (eller et fragment derav), er denne meget liten for å fa en "Rake"-struktur, på grunn av at karboksyl- eller aminogruppene ofte fremkommer på polypeptidene.
Det er nå blitt oppdaget en ny konjugeringsmetode som med letthet kan produsere en "Rake"-struktur, ved anvendelse av tiolgruppen til et cysteinresidie. På grunn av at cysteinresidier er sjeldnere enn lysin og asparaginsyre er denne fremgangsmåten derfor egnet for konjugering av større peptider.
Som bærere har peptidene noen fordeler i forhold til proteiner fordi de lett kan bli renset når de produseres biologisk, eller syntetisert og er derfor renere og mer definerte. I forhold til bærerproteiner som også kan ha skadelige egenskaper (toksisitet) kan peptidene bli avledet fra de proteinene for å utvisere kun bæreregenskapen.
Polysakkarid-peptidkonjugater kjent innenfor fagområdet er derimot mindre immunogene enn deres polysakkairdprotein motparter og krever definitivt bruk av adjuvans. Det er overraskende at polysakkarid-peptidkonjugatet dannet ifølge den nye fremgangsmåten har god immunogenisitet. En av grunnene for dette skyldes det faktumet at peptiddelen er stor nok.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for å konjugere (i) et peptid inneholdende minst seks aminosyrerester, der minst en er en cysteinresidie til (ii) et polysakkarid omfattende minst 4 gjentagelses-enheter; der fremgangsmåten omfatter: A (i) aktivering av polysakkaridet med en bifunksjonell linker med formel Rl-A-R2, der RI er en maleimidylgruppe, A er en aromatisk eller alifatisk karbonkjede substituert eller ikke, og R2 er en succinimidylgruppe, slik at R2 reagerer med aminogruppene i polysakkaridet og et aktivert polysakkarid oppnås; og (ii) konjugering av det aktiverte polysakkarid med peptidet, slik at RI reagerer med tiolgruppen i cysteinresidiet og et konjugat oppnås, der flere av peptidenhetene introduseres tilfeldig langs polysakkaridkjeden ved kovalent binding; eller B (i) derivatisering av polysakkaridet med en spacer med formelen (H) R3-B-R4,
der R3 er en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med amino-, karboksyl- eller hydroksylgrupper, B er en aromatisk eller alifatisk karbonkjede og R4 er en aminogruppe, slik at R3 reagerer med amino-, karboksyl- eller hydroksylgruppene i polysakkaridet og et derivatisert polysakkarid oppnås, der flere spacerenheter introduseres tilfeldig langs polysakkairdkjeden; (ii) aktivering av det derivatiserte polysakkarid med en bifunksjonell linker med formelen R1-A-R2, der RI er en maleimidylgruppe, A er en aromatisk eller alifatisk karbonkjede substituert eller ikke, og R2 er en succinimidylgruppe, slik at R2 reagerer med R4 og et aktivert polysakkarid oppnås; og (iii) konjugering av det aktiverte polysakkarid med peptidet slik at RI reagerer med tiolgruppen i cysteinresidiet i peptidet og et konjugat oppnås, der flere av peptidenhetene introduseres tilfeldig langs polypeptidkjeden ved kovalent binding.
På grunn av at nativ amino-, hydroksyl- eller karboksylgrupper finnes i gjentagelsesenhetene og derfor er tilstede langs hele polysakkairdkjeden, utviser et konjugat ifølge oppfinnelsen vanligvis en "Rake"-srruktur som beskrevet ovenfor. En alternativ og ekvivalent definisjon for konjugatet ifølge oppfinnelsen kan følgelig bli tilveiebrakt som følger.
Sagt på en annen måte omfatter et konjugat ifølge oppfinnelsen en polysakkaridkjede bestående av gjentatte enheter og en mengde peptiddeler, i det hver del inneholder et cysteinresidie og er kovalentlig koblet tilfeldig langs polysakkairdkjeden, gjennom en indirekte binding som involverer tiolgruppen til cysteinresidiet og en amino-, hydroksyl-eller karboksylgruppe til polysakkaridet, i det nevnte indirekte binding blir oppnådd gjennom enten en linker eller en spacer-linker del forutsatt at spacerdelen av spacer-linker delen er koblet til amino, hydroksyl eller karboksylgruppen til polysakkaridet.
Med "peptid" menes en arninosyrekjede som har minst 6 og fortrinnsvis ikke mer enn omtrent 200 aminosyreresidier. Peptidet inneholder fortrinnsvis minst 10, fortrinnsvis minst omtrent 15, mer foretrukket minst omtrent 20 aminosyreresidier. Det inneholder fortrinnsvis for det meste omtrent 150, fortrinnsvis for det meste omtrent 100, eller for det meste omtrent 50 aminosyreresidier. Et foretrukket peptid inneholder fra omtrent 50 til 150 aminosyreresidier.
For anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan peptidet inneholde en eller flere cysteinresidier. Cysteinresidiene tilveiebringer kobling av linkeren til peptidet. Anvendelse av et cysteinresidie for koblingen forsterker selektiviteten til koblingen i det mengden av cysteinresidier i et peptid vanligvis er lavt. Cysteinresidiet (ene) kan bli beliggende ved en hvilke som helst ende av peptidet eller være inne i peptidkjeden, forutsatt at koblingen ved dette setet ikke interfererer med strukturen og egenskapene til peptidet. Uansett cysteinmengde er det foretrukket at et cysteinresidie er beliggende ved den N- eller C-terminale enden.
Det er mer foretrukket at peptidet inneholder to cysteinresidier hvor hver er beliggende i en ende, eller et enkelt cysteinresidie beliggende ved en hvilke som helst ende; i det sistnevnte alternativt er mest foretrukket.
Den hele aminosyresekvensen til peptidet kan naturlig forekomme som den er eller som en del av et større polypeptid. Den kan også utgjøre en naturlig forekommende sekvens som er utvidet ved N- eller C-tenninal ende eller begge endene ved et ytterligere cysteinresidie.
For anvendelse som en bærer i vaksinekonjugat inneholder peptidet fortrinnsvis minst en T-celle avhengig epitope og vil derfor muliggjøre utvikling av en beskyttende immunrespons overfor polysakkaridet som er et T-avhengig antigen, ved administrering av konjugatet til for eksempel et pattedyr.
Peptidet anvendt i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli syntetisert kjemisk eller produsert ifølge rekombinante metoder. Hvilke som helst fremgangsmåte kan bli oppnådd konvensjonelt.
Et konjugat anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte et enkelt peptid. I dette tilfellet er peptiddelen som er tilstede langs hele polysakkaridkjeden identiske med hverandre. Den kan også omfatte flere peptider, for eksempel bærende forskjellige epitoper. Et begrenset antall peptider er derimot foretrukket: ikke mer enn 6 og mer foretrukket er 2 eller 3.1 det et første peptid bærer en T-avhengig epitope kan et andre peptid bære en B-epitope.
Polysakkarider anvendt i konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være av en hvilke som helst type. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir konjugatene dannet for vaksineformål og derfor innbefatter de hensiktsmessige polysakkaridene kapsulære polysakkarider, polysakkarider avledet fra lipopolysakkarider (LPS eller LOS) fra gram-negative bakteriecellevegg, så som O-spesifikk sidekjede, og også soppcelle-vegg polysakkarider. For eksempel kan polysakkarider bli oppnådd fra bakterier inkludert pseudomonas, så som P aeruginosa, Staphylococci, Streptococci, spesielt S. pneumoniae, Klebsiellae, for eksempel K. pneumoniea, Salmonellae, for eksempel typhi og paratyphi, Escherichia coli Ki, Kioo, 0157:H7, Neisseriae, for eksempel N. meningitidis, Shigellae, for eksempel S. dysenteriae, somnei og flexneri, Haemophilus, for eksempel H. influenzae type b og fra sopp så som Candida, Cryptococcus neoformans og Hansenula.
Polysakkarider består av gjentatte enheter. For anvendelse i konjugater ifølge oppfinnelsen omfatter et polysakkarid minst fire gjentagelsesenheter med fortrinnsvis opptil 3.000. Spesielt for anvendelse som en vaksineingrediens består polysakkaridet fortrinnsvis av 4 til 1000 gjentagelsesenheter, mer foretrukket 7 til 700 gjentagelsesenheter med fortrinnsvis 50 til 200 gjentagelsesenheter.
En gjentagelsesenhet er karakteristisk for et gitt polysakkarid og sammensetningen og molekylvekten til gjentagelsesenheten varierer derfor meget fra et polysakkarid til et annet. For eksempel i det gjentagelsesenheten til de fleste kapsulære polysakkaridene omfatter hydroksyl- og karboksylgrupper inneholder noen av disse aminogrupper (for eksempel Streptococcus pneumoniae serotype 1), andre inneholder ikke slike grupper (for eksempel Streptococcus pneumoniae serotype 14); noen av dem inneholder N-acetyler (for eksempel Streptococcus pneumoniae serotype 14), andre ikke (for eksempel Streptococcus pneumoniae serotype 6B). Også som eksempel er molekylvekten til kapsulære polysakkarider av Streptococcus pneumoniae typene 3 og 4 henholdsvis 360 og 847. Det er derfor ingen generell sammenheng mellom mengden av gjentagelsesenheter og molekylvekten til polysakkaridet, som kan bli anvendt globalt, uansett polysakkarid sammensetning. Man kan derimot uavhengig indikere at et polysakkarid for anvendelse i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har en foretrukket molekylvekt i det gjennomsnittlige området 10.000 til 500.000. Molekylvekten til et polysakkarid blir alltid uttrykt som en gjennomsnittlig verdi på grunn av at et polysakkarid utgjøres av en populasjon av molekyler med heterogen størrelse.
Polysakkarider kan enten bli syntetisert kjemisk eller renset fra en naturlig kilde, hvis den eksisterer, ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. For eksempel når det gjelder bakterielle eller sopp polysakkarider kan disse bli ekstrahert fra mikroorganismer og behandlet for å fjerne toksiske deler, om nødvendig. En spesielt nyttig fremgangsmåte er beskrevet av Gotschlich et al, J. Exp. Med (1969) 129: 1349.
Polysakkarider kan bli anvendt som syntetisert eller renset. De kan også bli depolymerisert før anvendelsen. Native kapsulære polysakkarider har vanligvis en molekylvekt som er større enn 500.000. Når det er foretrukket å anvende kapsulære polysakkarider med lavere molekylvekt, for eksempel 10.000 til 20.000 i gjennomsnitt, kan polysakkaridene som renset bli utsatt for fragmentering. Frem til nå er konvensjonelle fremgangsmåter tilgjengelige, for eksempel WO 93/7178 beskriver en fragmenteringsmetode ved reduktiv oksidasjon.
Hydroksyl-, karboksyl- eller aminogrupper av polysakkaridet som er involvert i bindingen kan være native funksjonelle grupper. Alternativt kan de ha blitt innført kunstig ved spesifikk behandling.
Aminogruppene kan ha blitt dannet ved kontrollert sur eller basisk hydrolyse av native N-acyl grupper for eksempel N-acetyl grupper.
Funksjonelle grupper inkludert hydroksyl-, karboksyl-, aminogrupper og andre (til tross for at aminogrupper er foretrukket), kan også bli innført ved derivatisering med en spacerdel bundet til native amino-, hydroksyl- eller karboksylgrupper, i det disse to sistnevnte for tiden er foretrukket. Det er vanlig at spaceren er et bifunksjonelt molekyl som har evne til å reagere i en ende med native hydroksyl-, karboksyl- eller aminogrupper av polysakkaridet og i den andre enden med linkeren. Spaceren tilveiebringer følgelig en funksjonell gruppe, men ikke begrenset til, hydroksyl-, karboksyl- og aminogrupper. En annen nyttig funksjonell gruppe som også kan bli innført av spaceren er en tiolgruppe, som videre angitt nedenfor.
Funksjonelle grupper forskjellige fra de som allerede er sitert kan også ha blitt innført med den spesifikke behandlingen. For eksempel kan aldehydgrupper bli introdusert langs hele polysakkairdkjeden ved periodatbehandling som spalter en karbon-karbon-kobling mellom to nabokarbonatomer som bærer hydroksylgrupper. En periodatbehandling blir fortrinnsvis utført på et polysakkarid, hvor kjeden ikke er mottagelig for spaltning ved en slik behandling for eksempel fra S. mutans.
Når aldehydgrupper blir introdusert langs hele kjeden for konjugeringsformål utviser linkeren som blir anvendt en aminogruppe.
Forbindelser som skal bli anvendt som spacere eller linkere er videre definert nedenfor. Det blir derimot indikert at linkeren er et bifunksjonelt molekyl som har en hensiktsmessig lengde slik at peptidet og polysakkriddelen ikke interfererer med hverandre for eksempel når de presentert for immunsystemet. Linkerdelen blir fortrinnsvis koblet til cysteinresidiet av peptidet bundet gjennom en disulfidbro eller en tioeter og til hydroksylgrupper av polysakkaridet bundet gjennom en eter eller ester, til aminogrupper bundet gjennom et amid eller karbamat, til karboksylgrupper bundet gjennom en ester, amid eller karbamat, eller til aldehydgrupper bundet gjennom et redusert imin.
Egenskapen og intensiteten til immunresponsen som kan bli utløst av et vaksinekonjugat ifølge oppfinnelsen, kan bli sterkt påvirket av forholdet peptid : polysakkarid. Det er vesentlig at B-epitopene tilstede i polysakkaridet og T-avhengige epitoper båret av peptidet er tilgjengelig og blir korrekt presentert for immunsystemet. Dermed skal begge epitoptyper være tilstede i tilstrekkelig og balansert mengde for å unngå for eksempel sterisk hindring av polysakkairdepitopene til peptiddelene. For å optimalisere immunresponsen er det indikert at et forhold 1 mol peptid pr 1 til 50 mol gjentagelsesenhet er egnet. Fortrinnsvis er dette forholdet 1 mol peptid pr 3 til 30 mol gjentagelsesenheter; mer foretrukket er forholdet 1 mol peptid pr 5 til 20 mol gj entagelsesenheter.
Kjede A skal hverken være for kort (for å unngå sterisk hindring) eller for lang (for å unngå interferens med immunogene deler). Kjede A omfatter følgelig fra 1 til 12, fortrinnsvis fra 3 til 8 karbonatomer og blir fortrinnsvis valgt fra C2-C8 alkylen, fenylen, C7-C12 aralkylen, C2-C8 alkyl, fenyl, C7-C12 aralkyl, C6 alkanoyloksy og benzylkarbonyloksy, hvori alkyl, fenyl, alkylen og fenyl kan bli substituert eller ikke.
Forbindelsene som er nyttige som linkere innbefatter succinimidyl-4-(N-maleiimidometyl)cykloheksan-1 -karboksylat, N-succimmidyl-4-(4-maleiimido)butyrat, N-succinimidyl-4-maleiimido-butyrat, N-succinimidyl-3-maleiimido-benzoat og N-(y-maleimidobutyryloksy) succinimidester (GMBS).
Som angitt ovenfor kan polysakkaridet bli derivatisert med en spacer før konjugasjon. Polysakkaridet kan følgelig bli omsatt først med en spacer med formel (H) R3 - B- R4, hvori R3 er en funksjonell gruppe som har evne til å reagere med amino, karboksyl eller hydroksylgrupper, B er en aromatisk eller alifatisk kjede, og R4 er en funksjonell gruppe som har evne til å reagere med R2 gruppen til linkeren anvendt i ytterligere konjugeringstrinn.
Kjeden B kan være en aromatisk eller alifatisk karbonkjede, fortrinnsvis karbonyl, Cl-C12 alkyl eller alkylen eller dikarbonyl.
Forbindelser nyttige som spacere i foreliggende oppfinnelse innbefatter cysteamin, cystein, diaminer, for eksempel diaminoheksan, adipinsyredihydrazid (ADH), urea, semikarbazid og cystamin.
Når cysteamin eller cystein blir anvendt som en spacer blir tiolgruppene innført på polysakkaridet. I dette tilfellet innbefatter nyttige linkere som kan bli anvendt i kombinasjon for eksempel bis-maleimidylforbindelser så som bis-maleimidoheksan.
For å oppnå et konjugat som utviser et hensiktsmessig peptid: polysakkairdforhold som beskrevet ovenfor hører inn under kunnskapen til fagfolk innenfor dette området å teste og justere reaksjonsbetingelsene for eksempel, konsentrasjonen av reagensene som er involvert i derivaterisering og/eller aktiveringstrinnene. Ytterligere rettledning er som følger: Når aminogruppene til polysakkaridet blir omsatt blir reaksjonen fortrinnsvis utført i nærvær av en karbodiimidforbindelse for eksempel (3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid hydroklorid (EDAC) ved en pH på 4 til 7, forutsatt at den funksjonelle gruppen til linkeren eller spaceren som var involvert i reaksjonen er karboksyl.
Karboksylgruppene til polysakkaridet blir omsatt og reaksjonen blir fortrinnsvis oppnådd i nærvær av en karbodiimidforbindelse som ovenfor, forutsatt at den funksjonelle gruppen til linkeren eller spaceren som var involvert i reaksjonen er en aminogruppe.
Det molare forholdet mellom polysakkarid gjentagelsesenheter: karbodiimid er fortrinnsvis i området 0,1 til 2, fortrinnsvis i området 0,1 til 1, mer foretrukket er i området 0,2 til 0,6. Som det fremgår kan ved justering av dette forholdet mengden av peptiddeler pr gjentagelsesenheter bli kontrollert.
Når aminogruppene til polysakkaridet blir omsatt med succinimidyl eller sulfosuccinimidyl blir reaksjonen fortrinnsvis oppnådd ved pH fra 6 til 9, fortrinnsvis omtrent 7,5. Succinimidyl grupper reagerer bare med aminogrupper. Når hensiktsmessige eksperimentelle betingelser blir anvendt (for eksempel overskudd av linker) er reaksjonen nesten øyeblikkelig dvs. foregår i løpet av omtrent 5 min. Dersom polysakkaridet anvendt i reaksjonen er et nativt polysakkarid som bærer aminogrupper er den eneste muligheten for å kontrollere mengden av substitusjon med succinimidyl grupper å anvende motsatte eksperimentelle betingelser (ellers så oppstår reaksjonen øyeblikkelig og alle aminogruppene blir substituert), slik som en øket fortynning av reaksjonsmediet eller en lav linkermengde. Dette muliggjør at man kan justere forholdet mellom peptid og gjentagelsesenhet i et hensiktsmessig område. Dersom hydrolyse eller derivatisering blir anvendt for å innføre aminogrupper på polysakkaridet kan dette forholdet lett bli kontrollert ved å kontrollere tilsynekomst av aminogrupper på polysakkaridet.
Når hydroksylgruppene til polysakkaridet blir omsatt blir reaksjonen fortrinnsvis oppnådd i nærvær av en cyanogenforbindelse; ved pH fra 8 til 12, dersom denne forbindelsen er cyanogenbromid; eller ved pH fra 6 til 10, fortrinnsvis fra 6 til 8, dersom forbindelsen er l-cyano-4-dimetyl aminopyridinium tetrafluorborat. Det molare forholdet mellom polysaldcaridgjenta<g>elsesenheterxyanogenforbindelse er fortrinnsvis i området 0,1 til 3, fortrinnsvis i området 0,1 til 2.
Når aldehydgrupper tilstede langs polysakkaridkjeden blir omsatt blir reaksjonen fortrinnsvis utført i nærvær av cyanoborhydrid for eksempel NaCNBEb ved pH fra 6,5 til 8.
Ved å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir et konjugat oppnådd hvori polysakkaridet og peptiddelene blir bundet via en Iinkerdel eller en kombinasjon av både spacer og linker, hvori linkeren eller linker/spacerdelen har en optimal lengde og hvori polysakkarid-peptidbindingen er stabil. Videre blir et konjugat oppnådd hvor forholdet mellom peptid og gjentagelsesenheter til polysakkaridet er optimal for immuniseringsformål.
Konjugater ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige innenfor vaksineområdet for å utløse en beskyttende langtidsimmunrespons mot en patogen mikroorganisme hvorfra det immunogene polysakkaridet er avledet.
Konjugatet kan benyttes i en farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et konjugat ifølge oppfinnelsen, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer. En slik sammensetning kan bli fremstilt konvensjonelt. Sammensetningen kan også inneholde andre ingredienser så som en adjuvans, for eksempel en aluminiumforbindelse. Egnede aluminiumforbindelser innbefatter aluminiumhydroksid eller aluminiumfosfat. Det er ikke nødvendig å anvende en adjuvans for å forsterke immunogenisiteten i et konjugat ifølge oppfinnelsen. En sammensetning kan bli administrert ifølge en hvilken som helst konvensjonell vei som anvendes innen vaksineområdet. Valg av administrasjonsvei avhenger av et antall parametre så som anvendt adjuvans.
Oppfinnelsen blir ytterligere illustrert som følger:
EKSEMPEL 1: Fremstilling av et syntetisk 105mer peptid som har følgende
sekvens:
Peptidet ble syntetisert ved anvendelse av FastMoc kjemi med en automatisert peptid syntetisator (modell 43IA, Applied Biosystem). Den faste fasen var en Rink harpiks
(0,13 mM TentaGel S RAM Spezial, 0,15 mM g"\ Rapp Polymere, Tubingen Germany)
som tilveiebringer et C-terminalt amid kapped peptid. Syntesen anvender Fmoc (9-fluorebykmetyloksykarbonyl) beskyttede aminosyrer med O-t-butyl- (for asparagjnsyre, glutaminsyre, serin, threonin og tyrosinkarboksyl eller hydroksylgruppe); trityl- (for histidin, asparagin og glutaminamino eller iminogruppe); t-butyloksykarbonyl- (for lysinaminogruppe); eller PMC (pentametylkroman-6-sulfonyl) (for arginin iminogruppe) sidebeskyttelse.
Aktivering og kobling ble oppnådd i nærvær av 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-3,3,3-tetrametyluronium heksafluorfosfat (HBYU)/diisopropyletylamin. Ved syklusene 1-2,4, 10-13,17, 27,32,49, 59,66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 og 104-105, ble dobbelt kobling utført og frie aminogrupper ble blokkert ved acetylering med eddiksyreanhydrid. Etter den siste syklusen ble peptidet avspaltet med piperidin og det endelige produktet ble N-terminalt acetylert ved anvendelse av eddiksyreanhydrid.
Sidekjede avspaltning og spaltning fra harpiksbæreren ble utført med 2,1% (v/v) 1,2-etanditiol, 4,2% (v/v) tioanisol, 4,2% (v/v) vann, 6,2% fenol (v/v) og 83% (v/v) trifluoreddiksyre (TFA) i 3 timer ved romtemperatur. Harpiksen ble fjernet ved filtrering og trietylsilan ble dråpevis tilsatt helt til oppløsningen var farveløs. Oppløsningen ble deretter inkubert 3 timer ved romtemperatur. 360 mg urenset peptid ble isolert etter presipitering med t-butylmetyleter etterfulgt av sentrifugering og lyofilisering. 130 mg råpeptid ble oppløst i 40 ml 50 mM etylmorfolin, pH 8,3 inneholdende 50 mM ditiotreitol og inkubert over natt ved romtemperatur. pH ble justert til 3,5 med 10% TFA og peptidet ble renset ved revers fase HPLC (Prep-S, C2/C18,100 Å porestørrelse, 12 um 22,5 mm x 25 cm, Pharmacia) ved anvendelse av en gradient (25 til 45% (v/v) acetonitril, 0,1% TFA (10 ml min"<1>, gradient 0,33% min"<1>. Peptidet eluerte som en topp ved omtrent 25% acetonitril, og toppen ble lyofilisert (73 mg) før ytterligere anvendelser. En analyse ved HPLC og massespektrometri viste at over 65% av sluttproduktet tilsvarte den ønskede sekvensen. Den N-terminale sekvensen ble bekreftet ved N-terminal Edman sekvensering av prøven fjernet før N-terminal acetylering.
EKSEMPEL 2: N. meningitidis serogruppe C polysakkarid-peptidkonjugat
Et tørt pulver av kapsulært polysakkarid fra Neisseria meningitidis serogruppe C, nedenfor referert til som polysakkarid C, ble oppnådd ved en ekstraheringsprosess som beskrevet av Gotschlich et al, J. Exp. Med. (1969) 129:1349.100 mg polysakkarid C ble oppløst i 0,2 M NaCl til en sluttkonsentrasjon på 11,1 mg/ml (oppløsning A). Parallelt ble en oppløsning av 0,2 M adipinsyre dihydrazid (ADH) 0,2 M NaCl preparert (oppløsning B). En 0,5 M oppløsning av etyldimetylaminopropylkarbodiimid (EDAC) i 0,2 M NaCl ble også preparert (oppløsning C). 9 ml oppløsning A, 10 ml oppløsning B og 1 ml oppløsning C blir blandet sammen for å tilveiebringe et preparat inneholdende 5 mg/ml polysakkarid C, 0,125 M ADH og 0,025 M EDAC. 0,1 M HC1 ble tilsatt for å justere pH til 6,5; denne pH ble opprettholdt i løpet av hele reaksjonsperioden på 45 minutter. Temperaturen var omtrent 20°C.
Reaksjonen ble stoppet av 40 ul 0,1 N NaOH som økte pH til 7,1. Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 0,5 M NaCl, 10 mM fosfat og deretter vann og deretter lyofilisert.
Størrelsen til derivatisert polysakkarid C ble kontroller som en HPLC eksklusjonskolonne TSK 4000 (manufacturer Tosohaas). Resultatene demonstrerte at ingen depolymerisasjon var oppstått i løpet av derivatiseringen.
I løpet av derivatiseringen ble omtrent 3,4% gjentagelsesenheter derivatisert med en NH2 gruppe.
Lyofilisert produkt ble oppløst i 0,02 M fosfatbuffer, pH 7, til en konsentrasjon på 6,25 mg/ml og avgasset N-(y-maleimidobutyryloksy) succinimidester (GBMS) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) under nitrogen i en konsentrasjon på 25 mg/ml og deretter tilsatt for å derivatisere polysakkarid C i lik mengde. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 90 minutter ved romtemperatur under nitrogen. Aktivert polysakkarid C ble renset ved Sephadex G50 eksklusjonskolonnekromatografi. Den ekskluderte fraksjonen ble isolert og konsentrert til omtrent 7,5 mg/ml ultrafiltrering (30K Amicon membran). Den konsentrerte oppløsningen ble avgasset. 20 mg peptid oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i vann ved en konsentrasjon på 10 mg/ml under nitrogen. En og halv ml peptidoppløsning ble tilsatt til 1,2 ml preparat inneholdende aktivert polysakkarid C, slik at forholdet (maleimidoresidier)/(tiolresidier) utgjør 2. Reaksjonsblandingen ble opprettholdt over natt under omrøring ved romtemperatur. Deretter ble ureagerte maleimidresidier inaktivert ved tilsetning av 0,010 ml merkaptoetanol.
Det konjugerte produktet ble renset på en 4BCL Sepharose kolonne. Eluerte fraksjoner ble analysert for tilstedeværelse av sakkarider (sialinsyre) og peptider. Fraksjoner som reagerer positivt i begge analysene ble slått sammen.
Mengden av sialinsyre residier ble bestemt ifølge doseringsmetoden beskrevet i Svnnerholm L., Biochem. Biophys. Acta (1957) 24:604, og mengden peptid ble bestemt ifølge fremgangsmåten til Lowry et al. J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. Det ble vist at forholdet (peptid/gjentagelsesenheter til polysakkarid C) mol/mol var 1:18 (som tilsvarer et forhold vekt/vekt på 1,8:1).
EKSEMPEL 3: S. pneumoniae polysakkaird-peptid konjugat
Et tørt pulver av kapsulært polysakkarid fra Streptococcus pneumoniae type 4, nedenfor referert til som Pneumo 4 polysakkarid, blir oppnådd ifølge en ekstraheringsprosess som beskrevet i patentsøknad WO 82/1995 "Procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins å base polysides ainsi purifies". 100 mg Pneumo 4 polysakkarid ble oppløst i 0,2 M NaCl til en sluttkonsentrasjon på 11,1 mg/ml (oppløsning A). Parallelt ble en oppløsning av adipinsyredihydrazid (ADH) i 0,2 M NaCl preparert i en konsentrasjon på 0,25 M (oppløsning B). En oppløsning av etyldimetylaminopropylkarbodiimid (EDAC) i 0,2 M NaCl ble også preparert ved en konsentrasjon på 0,5 M (oppløsning C). 9 ml oppløsning A, 10 ml oppløsning B og 1 ml oppløsning C blir blandet sammen for å tilveiebringe et preparat inneholdende 5 mg/ml Pneumo 4 polysakkarid, 0,125 M ADH og 0,025 M EDAC. 1 N HC1 ble tilsatt til pH 4,9; denne pH ble opprettholdt i løpet av hele reaksjonsperioden på 30 minutter. Temperaturen var omtrent 25°C.
Reaksjonen ble stoppet med 0,28 ml 1 N NaOH. pH ble øket til 7,5. Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 0,5 M NaCl og deretter vann og deretter lyofilisert.
Størrelsen på derivatisert Pneumo 4 polysakkarid ble kontrollert på en HPLC eksklusjonskolonne TSK 4000 (forhandler Tosohaas). Ingen depolymerisasjon oppsto i løpet av derivatiseringen.
I løpet av derivatiseringen ble omtrent 8,2% gjentagelsesenheter av Pneumo 4 polysakkarid derivatisert med en -NH2 gruppe.
Lyofilisert produkt ble oppløst i 0,05 M NaCl ble oppløst i en konsentrasjon på 2,76 mg/ml og avgasset. N-(Y-maleimidobutyryloksy) succinimidester (GMBS) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) under nitrogen i en konsentrasjon på 25 mg/ml. 1,75 ml av GMBS oppløsning ble tilsatt til 16 ml polysakkarid oppløsning under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble latt stå under omrøring i 5 timer ved romtemperatur under nitrogen. Aktivert Pneumo 4 polysakkarid ble renset på en eksklusjonskolonne Sephadex G50. Ekskludert fraksjon ble isolert og konsentrert til omtrent 7 mg/ml på en 30K membran (Amicon). Konsentrert oppløsning ble avgasset. 20 mg peptidet oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i 0,1 M NaCl, 0,01 M fosfatbuffer pH 7,5, ved en konsentrasjon på 4,6 mg/ml under nitrogen. Derimot ble 2,2 ml peptidoppløsning tilsatt til 1,25 ml preparat inneholdende aktivert Pneumo 4 polysakkarid slik at forholdet (maleiimidyl rester)/(tiol grupper) var lik 1 (Pneumo 4-peptid-l-konjugat). Reaksjonsblandingen ble opprettholdt i 6 timer under omrøring ved romtemperatur under nitrogen og deretter over natt ved +4°C. Deretter ble ureagerte maleiimidylresidier inaktivert ved tilsetning av 0,005 ml merkaptoetanol til hver reaksj onsblanding.
Konjugatene ble renset på en Sepharose 4BCL kolonne. Eluerte fraksjoner ble analysert for tilstedeværelse av sukkere og peptider. Fraksjoner som reagerer positivt i begge analysene ble slått sammen.
Mengden sukker ble bestemt ifølge doseringsmetoden beskrevet i Dubois et al, Anal. Chem. (1956) 3:350, og mengden av peptid ble bestemt ifølge fremgangsmåten til Lowry et al, J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. Forholdet (gjentagelsesenheter til (peptid/polysakkarid) mol/mol er 1:30 for Pn 4-peptid-l-konjugat (tilsvarende et forhold w/w på 0,4:1).
EKSEMPEL 4: N. meningitidis serogruppe A polysakkaird-peptid konjugat
Et tørt pulver av kapsulært polysakkarid fra Neisseria meningitidis serogruppe A, referert til som polysakkarid A i det følgende, blir oppnådd ifølge en ekstraheringsprosess som beskrevet av Gottschlich et al, J. Exp. Med. (1969) 129:1349. 100 mg polysakkarid A ble oppløst i vann til en sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml (oppløsning A). Parallelt ble en oppløsning av cyanogenbromid (CNBr) i vann preparert i en konsentrasjon på 67 mg/ml (oppløsning B). En oppløsning av adipinsyredihydrazid (ADH) i 0,5 M NaHC03 ble også preparert i en konsentrasjon på 150 mg/ml (oppløsning C). 20 oppløsning A og 0,75 ml oppløsning C ble blandet sammen for å tilveiebringe et preparat med et forhold polysakkarid/CNBr vekt/vekt som utgjør 1. 0,1 N NaOH ble tilsatt til en pH på 10,8; og denne pH ble opprettholdt i løpet av hele reaksjonsperioden på 60 minutter. Temperaturen var omtrent 20°C.
Deretter ble pH redusert til 8,5 ved tilsetning av 0,15 ml 0,1 N HC1.1 17 ml oppløsning C ble tilsatt slik at forholdet ADH/polysakkarid vekt/vekt utgjør 3,5. pH ble opprettholdt i løpet av 15 minutter. Deretter ble reaksjonsblandingen latt stå over natt under omrøring ved +4°C. 0,1 ml 1 N HC1 ble tilsatt for å redusere pH til 7. Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 0,5 M NaCl og deretter vann og deretter lyofilisert.
Størrelsen på derivatisert polysakkarid A ble kontrollert på en HLPC eksklusjonskolonne TSK 4000 (fremstiller Tosohaas). Ingen depolymerisasjon oppsto i løpet av derivatiseringen.
I løpet av derivatiseringen ble omtrent 2,5% gjentagelsesenheter polysakkarid A derivatisert med en -NH2-gruppe.
Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 2 anvendt for å aktivere derivatisert polysakkarid A og å konjugere aktivert polysakkarid A til peptidet som oppnådd i eksempel 1.
EKSEMPEL 5: Immunogenisitetsstudier med N. meningitidis serogruppe C
konjugat som oppnådd i eksempel 2
Anvendelse av peptidet ifølge eksempel 1 som bærer i et polysakkairdkonjugat er demonstrert som følger. 6 uker gamle NMRI-mus mottok via subkutan vei en av følgende sammensetninger i et volum på 0,5 ml (hver injeksjon) og via intraperitoneal vei, dersom en adjuvans ble anvendt: a) 5 ug polysakkarid C (uten peptid) på dagene 1,15 og 29, i fravær av adjuvans; b) 5 ug polysakkarid C (uten peptid) sammen med Freunds fullstendige adjuvans på dag 1, og på dagene 15 og 29 sammen med ufullstendig Freunds adjuvans; c) 5 ug polysakkarid C og 9 ug peptid sammen med Freunds fullstendige adjuvans på dag 1, og på dagene 15 og 29 sammen med ufullstendig Freunds adjuvans; d) konjugat oppnådd i eksempel 2 inneholdende 1 ug polysakkarid C og 1,8 ug peptid på dagene 1,15 og 29 i fravær av adjuvans; e) konjugat oppnådd i eksempel 2 inneholdende 5 ug polysakkarid C og 9 ug peptid på dagene 1,15 og 29 i fravær av adjuvans; f) konjugat oppnådd i eksempel 2 inneholdende 5 ug polysakkarid C og 9 ug peptid sammen med Freunds fullstendige adjuvans på dag 1 og på dagene 15 og
29 konjugatet oppnådd i eksempel 2 sammen med ufullstendig Freunds adjuvans; og
g) et konjugat av 5 ug polysakkarid C sammen med diphtheria anatoksin (DT).
På dagene 15, 29 og 43 (beregnet fra dag en med immunisering) ble en blodprøve tatt og
antipolysakkarid C antistoffer titrert ved ELISA. Resultatene er oppsummert i følgende tabell.
Antistoffrespons til ikke-konjugert polysakkarid C er meget svak i hvert tilfelle og øker ikke over tid, mens responsen til polysakkarid konjugert til enten DT eller peptid er tilfredsstillende. Med konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse blir det oppnådd en booster effekt etter andre injeksjon og dette indikerer en vedvarende immunrespons. Responsen til konjugatpolysakkarid C-peptid tilsvarer responsen oppnådd med konjugatet av polysakkarid C - DT.
EKSEMPEL 6: Irnmunogenisitetsstudier med S. pneumoniae konjugat som
oppnådd i eksempel 3
Konjugatet preparert i eksempel 3 ble et forhold (w/w) av peptid og polysakkarid på 0,4:1 (som tilsvarer et forhold mellom peptid pr gjentagelsesenhet på 1 : 30 (mol/mol)) ble testet i mus ved anvendelse av protokollen i eksempel S. Den var immunogen i mus i nærvær av adjuvans og resulterte i en booster effekt etter andre injeksjon. Resultatene er angitt i tabell 2 nedenfor.
Claims (17)
1.
Fremgangsmåte for å konjugere (i) et peptid inneholdende minst seks aminosyrerester,
der minst en er en cysteinresidie til (ii) et polysakkarid omfattende minst 4 gjentagelses-enheter; der fremgangsmåten omfatter: A (i) aktivering av polysakkaridet med en bifunksjonell linker med formel Rl-A-
R2, der RI er en maleimidylgruppe, A er en aromatisk eller alifatisk karbonkjede substituert eller ikke, og R2 er en succinimidylgruppe, slik at R2 reagerer med aminogruppene i polysakkaridet og et aktivert polysakkarid oppnås; og (ii) konjugering av det aktiverte polysakkarid med peptidet, slik at RI reagerer med tiolgruppen i cysteinresidiet og et konjugat oppnås, der flere av peptidenhetene introduseres tilfeldig langs polysakkairdkjeden ved kovalent binding; eller B (i) derivatisering av polysakkaridet med en spacer med formelen (II) R3-B-R4,
der R3 er en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med amino-, karboksyl- eller hydroksylgrupper, B er en aromatisk eller alifatisk karbonkjede og R4 er en aminogruppe, slik at R3 reagerer med amino-, karboksyl- eller hydroksylgruppene i polysakkaridet og et derivatisert polysakkarid oppnås, der flere spacerenheter introduseres tilfeldig langs polysakkaridkj eden; (iv) aktivering av det derivatiserte polysakkarid med en bifunksjonell linker med formelen R1-A-R2, der RI er en maleimidylgruppe, A er en aromatisk eller alifatisk karbonkjede substituert eller ikke, og R2 er en succinimidylgruppe,
slik at R2 reagerer med R4 og et aktivert polysakkarid oppnås; og (v) konjugering av det aktiverte polysakkarid med peptidet slik at RI reagerer med tiolgruppen i cysteinresidiet i peptidet og et konjugat oppnås, der flere av peptidenhetene introduseres tilfeldig langs polypeptidkjeden ved kovalent binding.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet inneholder fra 6 til 200 aminosyreresidier, inkludert cysteinresidie.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at peptidet inneholder fra IS til 100 aminosyreresidier, inkludert cysteinresidie.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at peptidet inneholder fra 20 til 50 aminosyreresidier, inkludert cysteinresidie.
5.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at cysteinresidiet er beliggende i N- eller C-terminal ende av peptidet.
6.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at peptidet inneholder en T-avhengig epitope.
7.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at polysakkaridet er et nativt polysakkarid valgt fra O-spesifikk kjede av bakterielle lipopolysakkarider, detoksifiserte bakterielle lipopolysakkarider og kapsulære polysakkarider.
8.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at polysakkaridet er avledet fra et nativt polysakkarid omfattende N-acetylgrupper ved kontrollert sur eller basisk hydrolyse.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at polysakkaridet er avledet fra en nativ valgt fra et kapsulært polysakkarid.
10.
Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 9, karakterisert v e d at polysakkaridet består av 4 til 3000 gjentagelsesenheter.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at polysakkaridet består av 4 til 1000 gjentagelsesenheter.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at polysakkaridet består av 7 til 700 gjentagelsesenheter.
13.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at linkeren med formel (I) er utvalgt fra gruppen bestående av succinimidyl-4-(N-maleiimidometyl) cykloheksan-l-karboksylat, N-succinimidyl-4-(4-maleiimidofenyl) butyrat, N-succinimidyl-4-maleiimido-butyrat, N-succinimidyl-3-maleiimido-benzoat og N-(y-maleimidobutyryloksy) succinimidester (GMBS).
14.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert ved at linkeren med formel (H) er adipinsyredihydrazid (ADH).
15.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, karakterisert ved at konjugering foregår slik at konjugatet som oppnås inneholder fra et peptid mol for femti mol gjentagelsesenheter (1:50) til et peptid mol for et mol gjentagelsesenheter (1:1).
16.
Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at som i krav 15 inneholder fra et peptid mol for 30 mol gjentagelsesenheter (1:30) til et peptid mol for tre mol gjentagelsesenheter (1:3).
17.
Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at som i krav 16 inneholder fra et peptid mol for 20 mol gjentagelsesenheter (1:20) til et
peptid mol for 5 mol gjentagelsesenheter (1:5).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP97100884 | 1997-01-21 | ||
PCT/EP1998/000654 WO1998031393A2 (en) | 1997-01-21 | 1998-01-21 | Polysaccharide-peptide-conjugates |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO984341D0 NO984341D0 (no) | 1998-09-18 |
NO984341L NO984341L (no) | 1998-11-11 |
NO323870B1 true NO323870B1 (no) | 2007-07-16 |
Family
ID=8226387
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19984341A NO323870B1 (no) | 1997-01-21 | 1998-09-18 | Fremgangsmate for a konjugere et peptid til et polysakkarid. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6472506B1 (no) |
EP (1) | EP0959905B1 (no) |
JP (1) | JP4290766B2 (no) |
KR (1) | KR100593466B1 (no) |
AT (1) | ATE451124T1 (no) |
AU (1) | AU722315B2 (no) |
CA (1) | CA2246760C (no) |
DE (1) | DE69841362D1 (no) |
DK (1) | DK0959905T3 (no) |
ES (1) | ES2335557T3 (no) |
NO (1) | NO323870B1 (no) |
NZ (1) | NZ331578A (no) |
PT (1) | PT959905E (no) |
WO (1) | WO1998031393A2 (no) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040001842A1 (en) * | 1997-05-12 | 2004-01-01 | Dov Michaeli | Immunogenic compositions to the CCK-B/gastrin receptor and methods for the treatment of tumors |
DE19821859A1 (de) * | 1998-05-15 | 1999-12-09 | M Alexander Schmidt | Darstellung immunogener (Kapsel-)Polysaccharid-Konjugate durch orientierte Kupplung synthetischer T-Zell-Epitope zur Erzeugung von Vakzinen gegen N.meningitidis |
US7223845B2 (en) | 1998-06-16 | 2007-05-29 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Synthetic glycosulfopeptides and methods of synthesis thereof |
DE69934890D1 (de) * | 1998-06-16 | 2007-03-08 | Univ Oklahoma | Glykosulfopeptide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
US6858211B1 (en) * | 1998-07-20 | 2005-02-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccines against Escherichia coli O157 infection |
US7723296B2 (en) | 2001-01-18 | 2010-05-25 | Genzyme Corporation | Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof |
ES2544979T3 (es) | 2001-01-23 | 2015-09-07 | Sanofi Pasteur Inc. | Vacuna de conjugado de polisacárido-CRM197 meningocócica tri- o tetravalente |
WO2002076499A2 (en) | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Aphton Corporation | Combination treatment of pancreatic cancer |
US20090191232A1 (en) | 2001-05-04 | 2009-07-30 | Gevas Philip C | Combination therapy for the treatment of tumors |
US20030035806A1 (en) * | 2001-05-11 | 2003-02-20 | D'ambra Anello J. | Novel meningitis conjugate vaccine |
GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
GB0220198D0 (en) * | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture |
US6695447B1 (en) | 2002-09-30 | 2004-02-24 | Eastman Kodak Company | Ink jet recording element |
US20050118199A1 (en) * | 2003-10-07 | 2005-06-02 | Esser Mark T. | Process for covalently conjugating polysaccharides to microspheres or biomolecules |
ES2400058T3 (es) | 2004-09-22 | 2013-04-05 | Cancer Advances, Inc. | Anticuerpos monoclonales para progastrina |
TWI264608B (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-21 | Delta Electronics Inc | Light tunnel module |
JP5155170B2 (ja) * | 2005-10-06 | 2013-02-27 | ネステク ソシエテ アノニム | 免疫を改善するためのプロバイオティックエンテロコッカス |
TW200745163A (en) * | 2006-02-17 | 2007-12-16 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Peptides that block the binding of IgG to FcRn |
FR2899110A1 (fr) * | 2006-03-31 | 2007-10-05 | Sanofi Pasteur Sa | Polysaccharides capsulaires de type 5 et de type 8 des souches surproductrices de staphylococcus aureus |
CN102978185B (zh) | 2007-01-18 | 2015-02-11 | 建新公司 | 包含氨基氧基基团的寡糖及其轭合物 |
KR20100040951A (ko) * | 2007-08-09 | 2010-04-21 | 신토닉스 파마수티칼스, 인코포레이티드 | 면역조절성 펩티드 |
JP2009242372A (ja) * | 2008-03-11 | 2009-10-22 | Yokohama City Univ | 均一な糖鎖構造を有するエリスロポエチン誘導体 |
US20100048488A1 (en) * | 2008-08-01 | 2010-02-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunomodulatory peptides |
SI2465542T1 (sl) | 2008-12-16 | 2015-05-29 | Genzyme Corporation | Konjugati oligosaharid-protein |
DK2430151T3 (da) | 2009-05-14 | 2014-09-15 | Sanofi Pasteur | Meningokokvaccine på basis af lipooligosaccharid (los) fra modificerede stammer af neisseria meningitidis med immuntype l6 |
WO2010130896A2 (fr) | 2009-05-14 | 2010-11-18 | Sanofi Pasteur | Procédé pour adjuver le lipopolysaccharide (lps) des bactéries à gram-négatif |
GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
US10226536B2 (en) | 2011-11-28 | 2019-03-12 | Case Western Reserve University | Polysaccharide therapeutic conjugates |
US10471118B2 (en) | 2014-05-30 | 2019-11-12 | Case Western Reserve University | Retinylamine derivitives for treatment of ocular disorders |
US11129845B2 (en) | 2014-06-18 | 2021-09-28 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
US10925980B2 (en) | 2014-08-04 | 2021-02-23 | Case Western Reserve University | Molecular probes and methods of use |
US11407786B2 (en) | 2015-06-18 | 2022-08-09 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
CA3066756A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-20 | Cancer Advances Inc. | Compositions and methods for inducing humoral and cellular immunities against tumors and cancer |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4695624A (en) * | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
NZ214503A (en) * | 1984-12-20 | 1990-02-26 | Merck & Co Inc | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates |
EP0326111A3 (en) * | 1988-01-29 | 1989-12-27 | New York Blood Center, Inc. | Peptide derivatives rendered immunogenic when administered with alum as an adjuvant |
CA2047033A1 (en) | 1990-07-19 | 1992-01-20 | Elizabeth E. Sugg | Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides |
-
1998
- 1998-01-21 NZ NZ331578A patent/NZ331578A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-01-21 JP JP53376898A patent/JP4290766B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-21 AU AU62957/98A patent/AU722315B2/en not_active Ceased
- 1998-01-21 KR KR1019980707414A patent/KR100593466B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-01-21 CA CA2246760A patent/CA2246760C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-21 AT AT98906928T patent/ATE451124T1/de active
- 1998-01-21 PT PT98906928T patent/PT959905E/pt unknown
- 1998-01-21 EP EP98906928A patent/EP0959905B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-21 WO PCT/EP1998/000654 patent/WO1998031393A2/en active IP Right Grant
- 1998-01-21 US US09/155,077 patent/US6472506B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-21 DK DK98906928.1T patent/DK0959905T3/da active
- 1998-01-21 ES ES98906928T patent/ES2335557T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-21 DE DE69841362T patent/DE69841362D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-18 NO NO19984341A patent/NO323870B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2246760C (en) | 2012-01-10 |
DK0959905T3 (da) | 2010-04-06 |
KR100593466B1 (ko) | 2007-04-25 |
NO984341L (no) | 1998-11-11 |
JP4290766B2 (ja) | 2009-07-08 |
DE69841362D1 (de) | 2010-01-21 |
EP0959905B1 (en) | 2009-12-09 |
NZ331578A (en) | 2000-05-26 |
US6472506B1 (en) | 2002-10-29 |
EP0959905A2 (en) | 1999-12-01 |
AU6295798A (en) | 1998-08-07 |
NO984341D0 (no) | 1998-09-18 |
ATE451124T1 (de) | 2009-12-15 |
CA2246760A1 (en) | 1998-07-23 |
ES2335557T3 (es) | 2010-03-29 |
WO1998031393A3 (en) | 1998-09-11 |
PT959905E (pt) | 2010-02-05 |
KR20000064696A (ko) | 2000-11-06 |
JP2000507974A (ja) | 2000-06-27 |
WO1998031393A2 (en) | 1998-07-23 |
AU722315B2 (en) | 2000-07-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2246760C (en) | Polysaccharide-peptide-conjugates | |
AU771330B2 (en) | Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an N-acryloylated polysaccharide | |
CA1340958C (en) | Synthetic peptides representing a t-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines | |
Pozsgay | Oligosaccharide-protein conjugates as vaccine candidates against bacteria | |
HUT64237A (en) | Improved vaccina preparatives | |
NO321705B1 (no) | Vaksiner med modifiserte meningokokk/polysakkarid-konjugater | |
Reichel et al. | Synthetic carbohydrate-based vaccines: synthesis of an L-glycero-D-manno-heptose antigen–T-epitope–lipopeptide conjugate | |
CA2249409C (en) | Iga1 protease fragment as carrier peptide | |
MXPA98007617A (es) | Conjugados de polisacaridos peptidos | |
RU2249463C2 (ru) | Иммуногенный конъюгат бета-пропионамид-связанного полисахарида с белком, использующийся в качестве вакцины | |
WO1998031791A9 (en) | Iga1 protease fragment as carrier peptide | |
AU779038B2 (en) | IGA1 protease fragment as carrier peptide | |
MXPA98007634A (en) | Iga1 protease fragment as carrier peptide |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |