CN104602705A - 血清组b脑膜炎球菌和d/t/p的联合疫苗 - Google Patents
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Abstract
血清组B脑膜炎球菌抗原能够成功地与白喉、破伤风和百日咳类毒素("DTP")联合,以提供用于保护抵抗多种病原体的有效联合疫苗。这些联合疫苗在佐以一定范围的不同佐剂时均有效,并且在用小儿型和加强型DTP比例时都有效。所述佐剂能够改善所述组合物引发的免疫应答;或者,通过包括佐剂,所述组合物能够具有相对较低量的抗原但仍具有与未加佐剂的联合疫苗相当的免疫原性。
Description
本申请要求2012年9月6日提交的美国临时申请61/697,756的权益,其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明属于联合疫苗,即含有来自多于一种病原体的混合免疫原的疫苗的领域,从而给予该疫苗可使对象同时获得针对多于一种病原体的免疫力。
背景技术
单一剂量中含有来自多于一种病原性生物体的抗原的疫苗被称为“多价”疫苗或“联合”疫苗。已有多种联合疫苗被许可用于人类,包括用于保护抵抗白喉、破伤风和百日咳的三价疫苗或保护抵抗麻疹、腮腺炎和风疹的三价疫苗。这些疫苗为患者提供的益处在于减少了注射次数,这可导致顺应性提高的临床益处(例如参见参考文献1的第29章),对小儿患者尤其如此。
提供新型联合疫苗的一个难处是,混合组分之间存在疫苗-疫苗负面相互作用的可能,这可归因于物理因素或化学因素。例如,参考文献2讨论了抗原联用时免疫原性的可能变化,而参考文献3报告了联合疫苗的开发涉及的问题远多于现有抗原的简单混合。类似地,参考文献4综述了多种临床相关相互作用(也参见参考文献5),而参考文献6综述了制造联合疫苗时所面临的技术挑战。
本发明的目的在于,提供新型且改进的联合疫苗,而具体是能够保护抵抗血清组B脑膜炎球菌和其它病原体的那些。
发明内容
发明人已显示,血清组B脑膜炎球菌抗原能够成功地与白喉、破伤风和百日咳类毒素("DTP")联合,以提供用于保护抵抗多种病原体的有效联合疫苗。这些联合疫苗在佐以一定范围的不同佐剂时均有效,并且在采用小儿型和加强型DTP比例时均有效。所述佐剂能够改善所述组合物引发的免疫应答;或者,通过包括佐剂,所述组合物能够具有相对较低量的抗原但仍具有与未加佐剂的联合疫苗相当的免疫原性。
因此,一般而言,本发明提供一种免疫原性组合物,其包含(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原,和(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和/或百日咳类毒素中的至少一种。所述组合物通常还包含佐剂,例如铝盐或水包油乳剂。优选组分(b)包含白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素的全部三种。在一些实施方式中,组分(b)包含的白喉类毒素多于破伤风类毒素(以Lf单位测量),但在其它实施方式中,其包含的破伤风类毒素多于白喉类毒素。
第一方面中,本发明提供一种免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含:(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原;(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素;和(c)佐剂。所述佐剂可包含一种或多种铝盐佐剂、TLR激动剂或水包油乳剂。
第二方面中,本发明提供一种免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含:(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原;和(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,其中存在的白喉类毒素相对过量于破伤风类毒素(以Lf单位计)。该组合物还可包含佐剂,并且其可包含一种或多种铝盐佐剂、TLR激动剂或水包油乳剂。
第三方面中,本发明提供一种免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含:(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原;和(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,其中存在的破伤风类毒素相对过量于白喉类毒素(以Lf单位计)。该组合物还可包含佐剂,并且其可包含一种或多种铝盐佐剂、TLR激动剂或水包油乳剂。
本发明的组合物可包含除白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素以外的抗原,例如,其可包含Hib荚膜糖(理想上是偶联的)、HBsAg、IPV、脑膜炎球菌荚膜糖(理想上是偶联的)等。
脑膜炎球菌血清组B免疫原
本发明的免疫原性组合物包含血清组B脑膜炎球菌免疫原。当给予人(或给予合适的动物模型)时,所述免疫原可引发杀菌性免疫应答。这些免疫原可以是蛋白质、脂糖或囊泡。
本领域已知的不同血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原包括但不限于:NHBA、fHbp和NadA,如BEXSEROTM产品中所见[7,8]。可包含在本发明组合物中的其它蛋白质免疫原有:HmbR、NspA、NhhA、App、Omp85、TbpA、TbpB、Cu,Zn-过氧化歧化酶和ZnuD。这些免疫原的其它细节描述于下文。
疫苗可包含这些不同免疫原中的一种或多种,例如,其可包含各NHBA、fHbp和NadA。其还可包含单一免疫原的多个变体形式,例如,其可包含脑膜炎球菌fHbp的多于一种变体(即,序列不同的两种fHbp蛋白[191,9])。
所述血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原可以融合蛋白的形式存在。例如,所述BEXSEROTM产品包含两种融合蛋白:SEQ ID NO:4是NMB2091和fHbp的融合形式;而SEQ ID NO:5是NHBA和NMB1030的融合形式。一种有用的融合蛋白是SEQ ID NO:19,其包含NMB2091和两拷贝fHbp。
血清组B免疫原的两种有用的组合包括:NHBA,例如SEQ ID NO:5;fHbp例如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19;和NadA,例如SEQ ID NO:6。其它有用的组合包括如下蛋白质:其与SEQ ID NO:5、4、19和6各有至多5个氨基酸的差异,但保留引发识别SEQ ID NO:5、4、19和6的抗体的能力。
优选包含至少一种fHbp免疫原的组合物,例如,包含两种不同fHbp序列的那些。合适的fHbp组合物在下文详细讨论。
因此,本发明的组合物可有利地包含(a)在参考文献8中公开为‘5CVMB’的三种血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原的混合物,或(b)在参考文献10中公开为‘rLP2086’的血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原的混合物。
所述血清组B脑膜炎球菌免疫原通常是纯化的可溶性重组蛋白。然而,在一些实施方式中,其可存在于脑膜炎球菌囊泡中。因此,所述组合物可包含脑膜炎球菌囊泡,即,通过脑膜炎球菌外膜的破坏或出泡以由此形成的保留有源自所述外膜的抗原的囊泡而获得的任何蛋白脂质体囊泡。因此该术语包括,例如OMV(有时称为“小泡”)、微囊泡(MV)和“原初OMV”(“NOMV)。”本领域已知多种此类囊泡(例如,参见参考文献11-25),并且其中任何囊泡均可包含在本发明的组合物中。关于这些囊泡,在下文中有更详细的说明。然而,在一些实施方式中,所述组合物不含囊泡。
本发明的组合物可优选地在给予后引发血清杀菌性试验。这些应答可以在小鼠中方便地测得,并且是疫苗效力的标准指标。血清杀菌活性(SBA)衡量由补体介导的细菌杀伤力,并且可以采用人或幼兔补体进行试验。例如,组合物可在超过90%的受者中诱导至少4倍的SBA上升。
优选地,本发明的组合物可在人类中引发保护性抵抗血清组B脑膜炎球菌的免疫应答。例如,所述疫苗可引发至少保护性抵抗原型血清组B菌株(例如,MC58)的免疫应答,MC58可通过广泛途径获得(例如,ATCC BAA-335)并且是参考文献26中测序的菌株。还可采用其它菌株,但抵抗MC58的应答容易测试。
白喉类毒素
白喉是由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae),一种或多革兰氏阳性无孢子需氧菌产生的。该生物体表达原噬菌体编码的ADP-核糖基化外毒素(“白喉毒素”),(例如用甲醛)处理后得到无毒但保留抗原性的类毒素,能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。参考文献1的第13章更详细地揭示了白喉类毒素。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。采用可补充牛提取物的生长培养基(如Fenton培养基,或Linggoud和Fenton培养基)培养白喉棒杆菌(C.diphtheriae),接着进行甲醛处理、超滤和沉淀,可获得白喉类毒素。该类毒素物质随后可通过包括无菌过滤和/或透析的方法来处理。
组合物可包含足够的白喉类毒素以引发至少0.01IU/ml的循环白喉抗毒素水平。白喉类毒素的量一般以"Lf"单位("絮凝单位"或"边界絮凝剂量"或"絮凝限值")度量,其定义为:当与一个国际单位的抗毒素混合时,产生最优絮凝混合物的毒素/类毒素的量[27,28]。例如,NIBSC提供了'普通白喉类毒素(DiphtheriaToxoid,Plain)'[29],其含有300Lf/安瓿,也提供了'用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参比试剂'[30],其含有900Lf/安瓿。组合物中白喉类毒素的浓度可以采用絮凝试验,通过按所述参比试剂校准的参比物质相比较来容易地确定。
组合物中的白喉类毒素的免疫效力一般以国际单位(IU)表示。所述效力可通过将组合物在实验室动物(通常是豚鼠)中提供的保护与已经校准到IU的参比疫苗做比较来评估。NIBSC提供‘白喉类毒素吸附第三国际标准1999(DiphtheriaToxoid Adsorbed Third International Standard 1999)’[31,32],其包含160IU/安瓿,并且适用于校准此类试验。
IU与Lf系统间的转换取决于具体的类毒素制剂。
本发明的组合物通常包含1~40Lf白喉类毒素/单位剂量。在白喉类毒素相对过量于破伤风类毒素(以Lf单位计)存在的小儿型组合物中,所述组合物将一般包含10~35Lf的白喉类毒素/单位剂量,例如,15~30Lf,例如15、25或30Lf。在破伤风类毒素相对过量于白喉类毒素过量(以Lf单位计)存在的加强型组合物中,所述组合物将一般包含1~4Lf的白喉类毒素/单位剂量,例如,1.5~3Lf,例如2或2.5Lf。若组合物包含偶联至白喉类毒素的糖抗原,则前述量排除那些偶联物中的载体蛋白的量。
按IU衡量,小儿型组合物将一般包含>25IU的白喉类毒素/单位剂量,而加强型组合物将一般包含1~3IU/单位剂量。
如果组合物包含铝盐佐剂,则所述组合物中的白喉类毒素优选被吸附至(更优选被完全吸附至)所述佐剂,并且优选被吸附在氢氧化铝佐剂上。
破伤风类毒素
破伤风是由破伤风梭菌(Clostridium tetani),一种革兰氏阳性有芽孢杆菌产生的。该生物体表达内肽酶(“破伤风毒素”),经处理后得到无毒但保留抗原性的类毒素,能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。参考文献1的第27章更详细地揭示了破伤风类毒素。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制得的那些。采用生长培养基(如衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)培养破伤风梭菌(C.tetani),然后进行甲醛处理、超滤和沉淀,能够获得破伤风类毒素。此物质随后可通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理。
组合物可包含足够的破伤风类毒素以引发至少0.01IU/ml的循环破伤风抗毒素水平。破伤风类毒素的量一般以"Lf"单位(参见上文)表示,其定义为当与一个国际单位的抗毒素混合时产生最优絮凝混合物的类毒素的量[27]。NIBSC提供“用于絮凝试验的破伤风类毒素的第一国际参比试剂”[33],其包含1000LF/安瓿,通过该试剂可对检测校准。
破伤风类毒素的免疫效力以国际单位(IU)衡量,通过将组合物在实验室动物(通常是豚鼠)中提供的保护与参比疫苗(例如,采用NIBSC的‘破伤风类毒素吸附第三国际标准2000(Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard2000)’[34,35],其包含469IU/安瓿)做比较来评估。
IU与Lf系统间的转换取决于具体的类毒素制剂。
本发明的组合物通常包含2.5~25Lf的破伤风类毒素/单位剂量。在白喉类毒素相对过量于破伤风类毒素(以Lf单位计)存在的小儿型组合物中,所述组合物将一般包含4~15Lf的破伤风类毒素/单位剂量,例如,5~10Lf,例如5或10Lf。在破伤风类毒素相对过量于白喉类毒素(以Lf单位计)存在的加强型组合物中,所述组合物将一般包含4~6Lf的破伤风类毒素/单位剂量,例如,5Lf。若组合物包含偶联至破伤风类毒素的糖抗原,则前述量排除那些偶联物中的载体蛋白的量。
按IU衡量,小儿型组合物将一般包含>40IU的破伤风类毒素/单位剂量,而加强型组合物将一般包含15~25IU/单位剂量。
若本发明组合物包含铝盐佐剂,则所述组合物中的破伤风类毒素优选地被吸附(有时被完全吸附)在铝盐上,优选地被吸附在氢氧化铝佐剂上。
百日咳类毒素
百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起百日咳。本发明的组合物包含百日咳类毒素("PT"),即,百日咳毒素的解毒形式。本发明可采用含PT的全细胞百日咳抗原("wP"),但组合物优选不含wP而是包含非细胞("aP")的含PT抗原,即,纯化的百日咳抗原的确定的混合物。当采用aP抗原时,本发明组合物通常在PT以外将包含丝状血凝素(FHA)和/或百日咳杆菌粘附素(也称为"69千道尔顿外膜蛋白")。可以能任选地包含2型和3型菌毛。这些不同Pa抗原的制备是本领域中熟知的。
可通过用甲醛和/或戊二醛处理来使PT脱毒,而FHA和百日咳杆菌粘附素也可以相同方式处理。作为PT的化学脱毒化的替代,本发明可采用突变型PT,其中野生型的酶促活性已通过诱变[36](例如,9K/129G双突变[37])而降低。优选采用此类遗传学脱毒的PT。
非细胞百日咳抗原的量通常以微克表示。本发明组合物通常包含2~30μgPT/单位剂量。在小儿型组合物中,PT可以5~30μg/单位剂量(例如,5、7.5、20或25μg)存在,而在加强型组合物中,所述组合物将一般包含2~10μg PT/单位剂量(例如,2.5μg或8μg)。当组合物包含FHA时,其通常以2~30μg/单位剂量存在。在小儿型组合物中,FHA可以2.5~25μg/单位剂量(例如,2.5、5、10、20或25μg)存在,而在加强型组合物中,FHA可以4~10μg/单位剂量(例如,5μg或8μg)存在。当组合物包含百日咳杆菌粘附素时,其通常以2~10μg/单位剂量存在。在小儿型组合物中,百日咳杆菌粘附素可以2.5~10μg/单位剂量(例如,2.5、3、8或10μg)存在,而在加强型组合物中,百日咳杆菌粘附素可以2~3μg/单位剂量(例如,2.5μg或3μg)存在。
组合物通常包含<80μg/单位剂量的总体非细胞百日咳抗原。各个体抗原将通常以<30μg/单位剂量存在。
通常,PT、FHA和百日咳杆菌粘附素各自存在于本发明的组合物中。这些可以以不同比例(以重量计)存在,例如PT:FHA:p69比例为20:20:3、25:25:8、16:16:5、5:10:6或10:5:3。当FHA和百日咳杆菌粘附素两者均存在时,通常FHA的质量大于百日咳杆菌粘附素。
若本发明组合物包含铝盐佐剂,则所述组合物中的PT优选地被吸附(有时被完全吸附)在铝盐上,优选地被吸附在氢氧化铝佐剂上。也可使任何FHA吸附在所述铝盐上。可使任何百日咳杆菌粘附素吸附至所述铝盐佐剂,但百日咳杆菌粘附素的存在通常意味着所述组合物需要氢氧化铝存在以确保稳定吸附[38]。
Hib偶联物
B型流感嗜血杆菌(“Hib”)引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常是基于荚膜糖抗原(例如参考文献1的第14章),对于其制备方法已有详尽记载(例如参考文献39-48)。Hib糖与载体蛋白偶联而增加其免疫原性,特别是就儿童而言。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的CRM197衍生物,或来自血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。破伤风类毒素是有用的载体,产品中所使用的破伤风类毒素通常称为“PRP-T”。PRP-T可如下制备:采用溴化氰激活Hib荚膜糖,将活化的糖偶联于己二酸接头(如(1-乙基1-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺),一般是盐酸盐),然后将该接头-糖实体与破伤风类毒素载体蛋白反应。CRM197是用于本发明组合物中的Hib偶联物的另一种有用的载体。
所述偶联物的糖部分可包含由Hib细菌制备的全长聚核糖基核醣醇磷酸(PRP),和/或全长PRP的片段。可使用糖:蛋白质比例(w/w)在1:5(即蛋白质过量)和5:1(即糖过量)之间的偶联物,例如比例在1:2到5:1之间,在1:1.25到1:2.5之间。在优选的疫苗中,糖与载体蛋白的重量比为1:2.5-1:3.5。在破伤风类毒素以抗原和载体蛋白形式存在的疫苗中,偶联物中糖与载体蛋白的重量比可以是在1:0.3-1:2之间[49]。Hib偶联物的给予优选导致抗PRP抗体浓度≥0.15μg/ml,更优选≥1μg/ml,而这些是标准应答阈值。
Hib抗原的量通常用微克糖表示。若本发明的组合物包含Hib抗原,则通常的量/单位剂量是5-15μg,例如10μg或12μg。
如果组合物包含铝盐佐剂,则可使Hib抗原吸附或不吸附至该佐剂。
乙型肝炎病毒表面抗原
乙型肝炎病毒(HBV)是一种引起病毒性肝炎的已知物质。HBV病毒颗粒是由被外部蛋白质外壳或衣壳包裹的内部核心组成,病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要组分是一种称为HBV表面抗原,或者更通常称为‘HBsAg’的蛋白质,这通常是一种分子量约为24kDa的226个氨基酸的多肽。所有现有的乙型肝炎疫苗均含有HBsAg,当把这种抗原给予正常接种者时刺激抗-HbsAg抗体的产生从而防止HBV感染。
在疫苗生产中,可以用两种方式制备HBsAg。第一种方法涉及从慢性乙肝携带者血浆中纯化特定形式的抗原,因为在HBV感染期间在肝脏中合成出大量的HBsAg并释放到血流中。第二种方法涉及通过重组DNA法表达蛋白质。用于本发明方法的HBsAg是重组表达的,例如,在酵母或CHO细胞中。合适的酵母菌包括酿酒酵母属(Saccharomyces)(如酿酒酵母(S.cerevisiae))或者汉森酵母属(Hanensula)(如多形汉森酵母(H.polymorpha))宿主。
与天然HBsAg(即,质粒纯化产品中的HBsAg)不同,酵母菌所表达的HBsAg通常是非糖基化的,这是用于本发明的最优选形式的HBsAg。酵母菌所表达的HbsAg具有高度的免疫原性,并且制造时没有血液产品污染的风险。
HBsAg通常采用基本呈球形的颗粒形式(平均直径约为20nm),包括含有磷脂的脂质基质。酵母菌所表达的HBsAg颗粒可含有在天然HBV病毒颗粒中未发现的磷脂酰肌醇。这些颗粒也可含有非毒性量的LPS以便刺激免疫系统[50]。如果在酵母菌的破碎中使用这些颗粒,这些颗粒可保留非离子型表面活性剂(例如,聚山梨酯20)[51]。
细胞破碎后纯化HBsAg的优选方法包括:超滤;尺寸排阻层析法;阴离子交换层析法;超速离心;脱盐;无菌过滤。可在细胞破碎后使裂解物沉淀(例如采用聚乙二醇),从而使HBsAg留在溶液中准备进行超滤。
纯化后,HBsAg可进行透析处理(例如用半胱氨酸),透析可用于去除任何含汞防腐剂,例如在HBsAg制备期间可能使用的硫柳汞[52]。优选不含硫柳汞的制剂。
HBsAg优选地是来源于HBV亚型adw2。
HBsAg的量一般用微克表示。若本发明的组合物包含HbsAg,则通常的量/单位剂量是5-25μg,例如10μg或20μg。
若组合物包含铝盐佐剂,则HBsAg可被吸附至该佐剂上(优选吸附至磷酸铝佐剂上)。
灭活的脊髓灰质炎病毒抗原(IPV)
脊髓灰质炎可由三种类型的脊髓灰质炎病毒中的一种引起。这三种类型是相似的并且引起相同的症状,但它们的抗原性差异很大,被一种类型病毒感染后不能防止免受其它类型病毒的感染。因此,如参考文献1第24章所述,本发明方法优选采用三种脊髓灰质炎病毒抗原:1型脊髓灰质炎病毒(如Mahoney菌株)、2型脊髓灰质炎病毒(如MEF-1菌株),和3型脊髓灰质炎病毒(如Saukett菌株)。作为这些菌株(“Salk”菌株)的替代,如参考文献53和54所述可以使用1型-3型的Sabin菌株。这些菌株可比普通Salk菌株更有效。
脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长。优选的培养物是Vero细胞系,它是从猴肾中得到的连续细胞系。可方便地将Vero细胞培养成为微载体。病毒感染之前和感染期间的Vero细胞的培养可涉及使用来自牛的材料,例如小牛血清,使用乳球蛋白水解产物,例如由乳球蛋白酶降解得到的产物。这些来源于牛的材料应从不患有BSE或其它TSE的来源获取。
生长后可用诸如超滤、渗滤和层析等技术来纯化病毒颗粒。在给予患者之前,必须将脊髓灰质炎病毒灭活,这可以通过在把病毒用于本发明方法之前用甲醛处理而实现。
优选地对病毒单独地进行培养、纯化和灭活,然后合并而得到用于本发明的大量混合物。
IPV的量一般用“DU”单位(“D-抗原单位”[55])表示。在所有三种1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒存在的情况下,这三种抗原可以分别以5:1:4的DU比率或其它任意合适比率而存在,例如当使用Sabin菌株时的比率为15:32:45[53]。典型的Salk IPV菌株/单位剂量的量是40DU 1型、8DU 2型和32DU 3型,但也可采用更低的剂量。低量的源自Sabin菌株的抗原是特别有用的,每单位剂量中含有≤15DU 1型,≤5DU 2型,和≤25DU 3型。
如果组合物包含铝盐佐剂,那么通常在配制之前不使IPV抗原预先吸附至任何佐剂,但在配制之后使其吸附至所述铝盐上。
其它抗原
本发明的组合物包含D、T和P抗原。如上所述,其还可包含Hib、HBsAg和/或脊髓灰质炎病毒抗原。本发明的免疫原性组合物可包含来自其它病原体的抗原。例如,这些抗原可来源于脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)(血清组A、B、C、W135和/或Y中的一种或多种)或肺炎链球菌(S.pneumoniae)。
脑膜炎球菌糖
在组合物包含脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖偶联物的情况下,可以存在一种或多于一种的此类偶联物。包括血清组A、C、W135和Y中的2、3或4种,通常例如是A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y等。如同在MENACTRATM和MENVEOTM产品中,包含来源于所有四种血清组A、C、W135和Y的糖的组分是有用的。在包括来源于一种以上血清组的偶联物的情况下,它们可以基本上以相等的质量而存在,例如各血清组的糖质量相互间是在±10%内。每个血清组的通常量在1μg和20μg之间,例如每个血清组2-10μg,或约4μg或约5μg或约10μg。作为大致相等比率的替代,可使用双倍质量的血清组A糖。
给予偶联物优选导致对相关血清组的血清杀菌试验(SBA)效价增加至少4倍、优选至少8倍。可用幼兔补体或人补体来测定SBA效价[56]。
血清组A脑膜炎球菌的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸酯的均聚物,C3和C4位的有部分O-乙酰基化。C-3位的乙酰化可以是70-95%。用于纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如在碱性条件下),但在该C-3位保留OAc是有用的。在一些实施方式中,血清组A糖中至少50%(例如,至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺残基的C-3位上被O-乙酰基化。乙酰基可被封闭基团取代以防止水解[57],这种改性糖仍然是在本发明含义内的血清组A糖。
血清组C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸,或“NeuNAc”)的均聚物。糖结构为→9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→。大多数血清组C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8位具有O-乙酰基团,但约15%的临床分离物缺乏这些O-乙酰基[58,59]。OAc基的存在或不存在产生独特的表位,抗体与糖结合的特异性可影响其对O-乙酰化(OAc-)和去-O-乙酰化(OAc+)菌株的杀菌活性[60-62]。本发明中使用的血清组C糖可以从OAc+或OAc-菌株获得。获得许可的MenC偶联物疫苗包含OAc-(NEISVAC-CTM)和OAc+(MENJUGATETM和MENINGITECTM)糖。在一些实施方式中,用于制备血清组C偶联物的菌株是OAc+菌株,例如血清型16,血清亚型P1.7a,1等。因此,可使用C:16:P1.7a,1OAc+菌株。也可使用血清亚型P1.1的OAc+菌株,例如C11菌株。优选的MenC糖是来源于OAc+菌株,如菌株C11。
血清组W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。类似于血清组C糖,其具有可变的O-乙酰化,但是在唾液酸的7和9位[63]。结构如下:→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(l→。
血清组Y糖类似于血清组W135糖,不同之处在于二糖重复单元包含葡萄糖而非半乳糖。类似于血清组W135,在唾液酸的7和9位具有可变的O-乙酰化[63]。血清组Y的结构如下:→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(l→。
根据本发明所使用的糖可以如上述被O-乙酰化(例如,在天然荚膜糖中所见的相同的O-乙酰化模式),或者它们能可以在糖环的一个或多个位置被部分或完全去-O-乙酰化,或者它们可以相对于天然荚膜糖被超-O-乙酰化。例如,参考文献64报道了血清组Y糖的使用,其超过80%被去-O-乙酰化。
脑膜炎球菌偶联物中的糖部分可包含由脑膜炎球菌所制备的全长糖,并且/或者可包括全长糖的片段,即比细菌中存在的天然荚膜糖短的糖。因此,糖可以解聚,解聚发生在糖纯化期间或者之后,但在偶联之前。解聚可降低糖链的长度。一种解聚方法涉及使用过氧化氢[65]。将过氧化氢加入糖中(例如,H2O2终浓度为1%),然后孵育混合物(例如在约55℃)直到实现所需的链长降低。另一种解聚方法涉及酸水解[66]。其它解聚方法则是本领域已知的。用于制备本发明中所用偶联物的糖,可以通过这些解聚方法中的任一方法而获得。可利用解聚获得对于免疫原性为最佳的链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。在一些实施方式中,糖具有以下的平均聚合度(Dp):A=10-20;C=12-22;W135=15-25;Y=15-25。就分子量而非Dp而言,对于所有血清组,有用范围是:<100kDa;5kDa-75kDa;7kDa-50kDa;8k Da-35kDa;12kDa-25kDa;15kDa-22kDa。在其它实施方式中,来自各脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的糖的平均分子量可超过50kDa,例如≥75kDa,≥100kDa,≥110kDa,≥120kDa,≥130kDa,等[67],甚至最高达1500kDa,具体由MALLS测定。例如,MenA糖可以是50-500kDa,如60-80kDa;MenC糖可以是100-210kDa;MenW135糖可以是60-190kDa,如120-140kDa;和/或MenY糖可以是60-190kDa,如150-160kDa。
如果一种组分或组合物包含Hib和脑膜炎球菌偶联物,那么在一些实施方式中Hib糖的质量可以与特定脑膜炎球菌血清组糖的质量大致相同。在一些实施方式中,Hib糖的质量大于特定脑膜炎球菌血清组糖的质量(例如至少1.5倍)。在一些实施方式中,Hib糖的质量小于特定脑膜炎球菌血清组糖的质量(例如至少小1.5倍)。
如果组合物包含来源于一种以上脑膜炎球菌血清组的糖,则存在每种血清组的平均糖质量。如果使用基本相等质量的各血清组,那么平均质量与各个血清组的质量相同;如果使用非等质量的血清组,那么平均质量不同,对于10:5:5:5μg量的MenACWY混合物而言,平均质量为6.25μg/血清组。在一些实施方式中,Hib糖的质量与各血清组的脑膜炎球菌糖的质量基本相同。在一些实施方式中,Hib糖的质量大于各血清组中脑膜炎球菌糖的平均质量(例如,至少1.5倍)。在一些实施方式中,Hib糖的质量小于每个血清组中脑膜炎球菌糖的平均质量(例如,至少1.5倍)[68]。
肺炎球菌糖
肺炎链球菌引起细菌性脑膜炎并且现有的疫苗是基于荚膜糖。因此,本发明的组合物可包含至少一种偶联至载体蛋白的肺炎球菌荚膜糖。
本发明可包括来自一种或多种不同肺炎球菌血清型的荚膜糖。组合物包含来源于超过一种血清型的糖抗原的情况下,这些抗原优选地单独制备,单独结合,然后合并。本领域中已知纯化肺炎球菌荚膜糖的方法(例如参见参考文献69),并且早已知道以来自23种不同血清型的纯化糖为基础的疫苗。这些方法的改进也有描述,例如参考文献70描述了对血清型3的改进,或者参考文献71描述了对血清型1、4、5、6A、6B、7F和19A的改进。
肺炎球菌荚膜糖通常选自以下血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。因此,组合物总共可包含来源于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或更多种不同血清型的荚膜糖。包含至少血清型6B糖的组合物是有用的。
有用的血清型组合是7价组合,例如包括来自4、6B、9V、14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。另一种有用的组合是9价组合,例如包括来自1、4、5、6B、9V、14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。另一种有用的组合是10价组合,例如包括来自1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。11价组合还可包含来自血清型3的糖。12价组合可以是向10价混合物添加:血清型6A和19A;6A和22F;19A和22F;6A和15B;19A和15B;或22F和15B。13价组合可以是向11价混合物添加:血清型19A和22F;8和12F;8和15B;8和19A;8和22F;12F和15B;12F和19A;12F和22F;15B和19A;15B和22F;6A和19A等。
因此,有用的13价组合物包括来源于血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19(或19A)、19F和23F的荚膜糖,例如以参考文献72-75所述方式制备。一种这类组合物包括约8μg/ml的6B型糖和浓度各约4μg/ml的其它12种糖。另一种这类组合物包括各约8μg/ml的6A和6B型糖以及各约4μg/ml的其它11种糖。
结合物的适当载体蛋白包括细菌毒素,如白喉或破伤风毒素、或者其类毒素或变体。这些常用于偶联疫苗。例如,可用CRM197白喉毒素突变体[76]。其它合适的载体蛋白包括合成肽[77,78]、热激蛋白[79,80]、百日咳蛋白[81,82],细胞因子[83],淋巴因子[83],激素[83],生长因子[83],含来自不同病原衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[84]如N19[85],来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[86-88],肺炎球菌溶血素[89]或其无毒衍生物[90],肺炎球菌表面蛋白PspA[91],摄铁蛋白[92],来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[93],重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外蛋白A(rEPA)[94]等。
特别有用的肺炎球菌结合疫苗载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D。CRM197用于PREVNARTM。13价混合物可使用CRM197作为13种结合物中每一种的载体蛋白,且CRM197可以约55-60μg/ml存在。
组合物包含来源于超过1种肺炎球菌血清型的结合物时,各单独结合物可使用同一载体蛋白或采用不同载体蛋白。尽管在这两种情况下,制备不同结合物的混合物常通过单独制备各血清型结合物,然后将其混合以形成单独结合物的混合物。参考文献95描述了在多价肺炎球菌结合疫苗中使用不同载体蛋白的潜在优势,但PREVNARTM产品成功地对7种不同血清型中的每一种使用了同一载体。
载体蛋白可直接或经接头共价结合于肺炎球菌糖。已知多种接头。例如可经羰基连接,这可通过修饰糖的游离羟基与CDI反应[96,97],然后与蛋白质反应以形成氨基甲酸酯连接来形成。也可采用碳二亚胺缩合[98]。可使用己二酸接头,所述接头可通过使游离-NH2基(例如通过胺化来引入糖)与己二酸(使用例如二酰亚胺活化)偶联,然后使蛋白质偶联至所得糖-己二酸中间体来形成[99,100]。其它接头包括β-丙酰胺基[101]、硝基苯基-乙胺[102]、卤代酰卤[103]、糖苷键[104]、6-氨基己酸[105]、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)[106]、己二酸二酰肼ADH[107]、C4-C12部分[108]等。
可使用经还原性胺化的结合。糖可首先用过碘酸盐氧化以引入醛基,随后可通过还原性胺化使其形成连接至载体蛋白的直接共价连接,例如,连接至赖氨酸的ε-氨基基团。若每个糖分子包括多个醛基,则此连接技术可产生交联产物,其中多个醛与多个载体氨基反应。此交联结合技术对于至少4、6B、9V、14、18C、19F和23F型肺炎球菌特别有用。
肺炎球菌糖可包括制备自肺炎球菌的全长完整糖,和/或可包括全长糖的片段,即所述糖可比细菌中所见天然荚膜糖短。因此,糖可以解聚,解聚发生在糖纯化期间或者之后,但在偶联之前。解聚可降低糖链的长度。可利用解聚获得对于免疫原性为最佳的链长和/或出于糖的物理可操作性而降低链长。使用超过1种的肺炎球菌血清型时,可采用各血清型的完整多糖、各血清型的片段,或采用一些血清型的完整多糖和其它血清型的片段。
组合物包含来源于任何4、6B、9V、14、19F和23F血清型的糖时,这些糖优选是完整的。相反,组合物包含来源于血清型18C的糖时,该糖优选是解聚的。
血清型3糖也可以是解聚的,例如,血清型3糖可以经过酸水解(例如,使用乙酸)以解聚[72]。然后使所得片段氧化(例如,可在二价阳离子存在下(如MgCl2)的高碘酸盐氧化)以活化,在还原性条件下(例如,使用氰基硼氢化钠)与载体结合(例如CRM197),然后(任选地)可对糖中任何未反应的醛加帽(例如,使用硼氢化钠)[72]。偶联可以够在冻干物质上进行,例如在活化的糖和载体共冷冻干燥之后。
血清型1糖可以至少部分脱-O-乙酰化,例如通过碱性pH缓冲液(如通过使用碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液)处理实现[73]。这种(部分地)脱-O-乙酰化的糖可以被氧化(例如高碘酸盐氧化)以活化,在还原条件下(例如,采用氰基硼氢化钠)偶联至载体(例如,CRM197),然后(任选地)可对糖中任何未反应的醛加帽(例如,使用硼氢化钠)[73]。偶联可以在冻干物质上进行,例如在活化的糖和载体共冷冻干燥之后。
血清型19A糖可被氧化以活化(例如,高碘酸盐氧化),在还原性条件下在DMSO中与载体(例如CRM197)偶联,然后(任选地)对糖中任何未反应的醛加帽(例如,使用硼氢化钠)[109]。偶联可以在冻干物质上进行,例如在活化的糖和载体共冷冻干燥之后。
一种或多种肺炎球菌荚膜多糖偶联物可以冻干形式存在。
肺炎球菌偶联物可以够理想地引起与相应糖结合的抗荚膜抗体,例如,引起抗-糖抗体水平>0.20μg/mL[110]。可以通过酶免疫分析(EIA)和/或对调理素吞噬活性(OPA)的检测来评价抗体。EIA方法已被广泛采用并且抗体浓度和疫苗效果之间存在关联。
佐剂
本发明的组合物可包含佐剂,例如(i)水包油乳剂,(ii)至少一种铝盐,或(iii)至少一种TLR激动剂。
在一些实施方式中,组合物包含铝盐和TLR激动剂的混合物,并且所述TLR激动剂可吸附至所述铝盐以促进佐剂效应[142]。这能导致更好(更强,或更快起效)的免疫应答和/或能允许在组合物中铝的量的减少同时保持等同的佐剂效应。
若组合物包含铝盐佐剂,则所述组合物中的一种到全部免疫原可被吸附至所述盐。此外,若所述组合物包含TLR佐剂,则其也可吸附至所述盐,如下所述。
在组合物包含铝盐佐剂的情况下,优选其不同时含有水包油乳剂佐剂。反之,在组合物包含水包油乳剂佐剂的情况下,优选其不同时含有铝盐佐剂。
水包油乳剂佐剂
根据本发明的第二方面,疫苗佐以水包油乳剂。多种这类乳剂是已知的,例如MF59和AS03均在欧洲被批准。
有用的乳剂佐剂通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂,其中所述油和表面活性剂是生物可降解的(可代谢)且生物相容的。乳剂中的油滴通常具有亚微米级直径,使用微流化床或通过替代性方法(如相转化)可容易地获得这类小尺寸以提供稳定的乳剂。优选乳剂中至少80%(以数量计)液滴的直径小于220nm,因为可对其进行过滤灭菌。
所述乳剂可以包含来自动物(如鱼)和/或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中,最常见的是玉米油,但也可以使用其它谷类的油,如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中,但可从坚果和种籽油开始,通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的,因此可以用于本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。
大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如,可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油,其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物,2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯,其在本发明中特别优选使用(参见下文)。鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是有用的油。包括鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得,或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。
佐剂乳剂中优选的总油量(体积百分比)为1至20%,例如2-10%。5%(以体积计)的鲨烯含量特别有用。
表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB至少为10,例如约15。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于:聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温),特别是聚山梨酯20或聚山梨酯80;以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物,如直链EP/PO嵌段共聚物;重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇,特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通X-100,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇);(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂,如磷脂酰胆碱(卵磷脂);壬酚乙醇酯,如TergitolTM NP系列;衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂),如三甘醇单月桂基醚(苄泽30);以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(Span)),如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
本发明使用的乳剂优选包括非离子型表面活性剂。乳剂中所包含的优选表面活性剂有:聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯;吐温80)、司盘85(山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂或曲通X-100。可采用表面活性剂的混合物,例如,聚山梨酯80和山梨糖醇三油酸酯的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚山梨酯80(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也是有用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。在使用了表面活性剂的混合物时,可根据其相对权重(以体积计算)计算该混合物的HLB,例如优选的体积比为1:1的聚山梨酯80和山梨糖醇三油酸酯的混合物的HLB是8.4。
佐剂乳剂中总表面活性剂的优选的量(体积百分比)为0.1~2%,例如0.25~2%。体积百分比为1%的总含量特别有用,例如体积百分比为0.5%的聚山梨酯80和体积百分比为0.5%的山梨糖醇三油酸酯。
可采用已知技术(例如,参见参考文献132和111-117)来制备有用的乳剂。
本发明所用的具体水包油乳剂佐剂包括但不限于:
·鲨烯、聚山梨酯80和山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳剂。该乳剂的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%山梨糖醇三油酸酯。以重量计,这些比率变为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂称为‘MF59’[118-120],在参考文献131的第10章和参考文献132的第12章有更详细地描述。MF59乳剂优选包含柠檬酸根离子,例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·鲨烯、生育酚和聚山梨酯80的乳剂。所述乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。这些乳剂可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%聚山梨酯80,且鲨烯:生育酚的重量比优选<1(例如0.90),因为这能提供更稳定的乳剂。鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2,或者重量比约为11:5。因此这三种组分(鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。这种佐剂称为“AS03”。此种类型的另一有用乳剂可包含(每人剂量)0.5-10mg鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[121],例如,采用上述比例。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳剂[122]。
·含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳剂。如参考文献123所述,优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯,如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳剂。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)尺寸小于200nm[124]。所述乳剂也可含有一种或多种以下物质:醛醇;低温保护剂(例如,糖,如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖);和/或烷基聚糖苷。也可包含TLR4激动剂,如化学结构不含糖环的TLR4激动剂[125]。可将这类乳剂冻干。"AF03"产品是一种这类乳剂。
本发明中使用的优选的水包油乳剂包含鲨烯和聚山梨酯80。
可以在疫苗生产期间将该乳剂与TdaP抗原混合,或其可在递送时即时混合。因此,在一些实施方式中,可使所述佐剂和抗原分开保持在包装的或分布的疫苗中,待在使用时配制成最终制剂。混合时(大批量生产期间或使用时),抗原一般是水性形式,从而最终疫苗通过混合两种液体来制备。待混合的两种液体的体积比可变(例如5:1-1:5),但一般是约1:1。若将乳剂和抗原在试剂盒中分开贮存,则该产品可以是含有乳剂的小瓶和含有水性抗原的小瓶的形式,待混合以获得带佐剂的液体疫苗(单剂量或多剂量)。
本发明的乳剂优选包含鲨烯油。其通常由鲨鱼油制备,但替代性来源也是已知的,例如参见参考文献126(酵母)和127(橄榄油)。本发明优选采用其中包含低于661皮克PCB/克鲨烯(TEQ)的鲨烯,如参考文献128所公开。乳剂优选由高纯度鲨烯制备,例如通过参考文献129所公开的双蒸馏法制备。
当组合物包含生育酚时,可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何生育酚,但优选α-生育酚。生育酚可取多种形式,例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐,例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。生育酚具有抗氧化性质,这有助于稳定乳剂[130]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚,而所述生育酚的优选的盐是琥珀酸盐。
铝盐佐剂
本发明的组合物可包含铝盐佐剂。目前使用的铝盐佐剂通常指“氢氧化铝”或“磷酸铝”佐剂。这些是便名,但它们均不是对存在的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献131的第9章,和参考文献132的第4章]。本发明可采用用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”。如果希望TLR激动剂的吸附,则优选包含氢氧根离子的铝盐,因为这些氢氧根离子能易于进行配体交换以供TLR激动剂的吸附。因此,供于TLR激动剂吸附的优选的盐是氢氧化铝和/或羟基磷酸铝。这些盐具有表面羟基部分,所述表面羟基部分能易于与含磷基团(例如磷酸盐/酯、膦酸盐/酯)进行配体交换,以提供稳定吸附。因此,最优选氢氧化铝佐剂。
称为“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱来区分式AlO(OH)表示的羟基氧化铝和其它铝化合物如氢氧化铝Al(OH)3,具体差异在于1070cm-1处存在吸收条带和3090-3100cm-1处存在强烈的肩峰(参考文献131的第9章)。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度,结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加,WHH值较大的佐剂显示较强的吸附抗原能力。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形貌(如电子透射显微照片所见的),例如直径为约2nm的针状颗粒。氢氧化铝佐剂的PZC通常为约11,即在生理学pH下佐剂本身具有正表面电荷。据报道,pH=7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al+++。
称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝,这些佐剂也常含有少量硫酸根。其可通过沉淀获得,沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中的PO4/Al摩尔比通常在0.3-0.99之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如,3164cm-1的IR谱带(例如,当加热至200℃时)表明存在结构性羟基[参考文献131的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3~1.2,优选为0.8~1.2,更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的,羟基磷酸盐尤其如此。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝,包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒。抗原吸附后的典型颗粒直径范围是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道,pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5mg蛋白质/mg Al+++。
磷酸铝的PZC与磷酸对羟基的取代程度逆相关,这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0至7.0,更优选为5.0至6.5,例如约为5.7。
在溶液中,磷酸铝佐剂和氢氧化铝佐剂都易于形成直径为1~10μm的稳定多孔聚集体[133]。
组合物可以包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物,以及被吸附于这些盐中的一种或两种的组分。
用于制备本发明组合物的磷酸铝溶液可以含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液),但不一定如此。磷酸铝溶液优选为无菌且无热原。磷酸铝溶液可含有游离的水性磷酸根离子,如浓度为1.0-20mM,优选5-15mM,更优选约10mM的磷酸根离子。磷酸铝溶液中也可含有氯化钠。氯化钠的浓度优选为0.1-100mg/ml(例如0.5-50mg/ml,1-20mg/ml,2-10mg/ml)并且更优选约3±1mg/ml。NaCl的存在有助于在抗原吸附之前正确地测定pH值。
本发明的组合物理想上包含少于0.85mg Al+++/单位剂量。在本发明的一些实施方式中,组合物包含少于0.5mg Al+++每单位剂量。Al+++的量可低于此,例如<250μg、<200μg、<150μg、<100μg、<75μg、<50μg、<25μg、<10μg等。
当本发明组合物包含铝基佐剂时,在贮存过程中组分可能会发生沉淀。因此,在给予患者之前应振荡该混合物。振荡过的组合物是混浊的白色悬液。
如果同时存在TLR激动剂和铝盐,一般而言,TLR激动剂和Al+++的重量比将小于5:1,例如,小于4:1、小于3:1、小于2:1,或小于1:1。因此,例如,对于Al3+浓度为0.5mg/ml的组合物,TLR激动剂的最大浓度将是2.5mg/ml。但是可采用更高或更低的水平。TLR激动剂的质量低于Al+++可能是最典型的,例如,每剂量100μg的TLR激动剂和0.2mg Al+++,等。例如,FENDRIXTM产品每剂量包含50μg的3d-MPL和0.5mg的Al+++。
TLR激动剂
在一些实施方式中,本发明的组合物包含TLR激动剂,即,可使Toll样受体促效的化合物。最优选地,TLR激动剂是人TLR的激动剂。所述TLR激动剂能够激活TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11中的任何一种;优选其能够激活人TLR4或人TLR7。
化合物针对任何特定Toll样受体的激动剂活性可通过标准试验来测定。诸如茵姆基因公司(Imgenex)和英韦沃基公司(Invivogen)的公司供应稳定共转染了人TLR基因和NFκB的细胞系,以及合适的报告基因以供检测TLR激活通路。其为灵敏的、宽工作范围动力学而设计,并且能够用于高通量筛选。此类细胞系中通常存在一种或两种特异性TLR的组成型表达。也可见参考文献134。本领域已知多种TLR激动剂,例如,参考文献135描述了某些脂肽分子是TLR2激动剂,参考文献136-139各自描述了TLR7的小分子激动剂种类,而参考文献140和141描述了用于治疗疾病的TLR7和TLR8激动剂。
本发明所用的TLR激动剂理想上包括至少一个吸附部分。TLR激动剂中所包括此类部分使其能够吸附至不溶性铝盐(例如,通过配体交换或其它合适的机制)并改善其免疫原性性质[142]。含磷的吸附部分是尤其有用的,所以吸附部分可包含磷酸盐(酯)、膦酸盐(酯)、次磷酸盐(酯)、亚磷酸盐(酯)、次亚磷酸盐(酯)(phosphinite)等。
优选地,所述TLR激动剂包括至少一个膦酸基团。
因此,在优选的实施方式中,本发明的组合物包含含有膦酸基团的TLR激动剂(例如TLR7激动剂)。膦酸基团可使所述激动剂吸附至不溶性铝盐[142]。
本发明可用的TLR激动剂可包括单一吸附部分,或可包括多于一个(例如,2~15个)吸附部分。化合物通常会包含1、2或3个吸附部分。
本发明可用的含磷TLR激动剂可由式(A1)表示:
其中:
RX和RY独立地选自H和C1-C6烷基;
X选自共价键、O和NH;
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH;
L是接头,例如,选自C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地取代有1~4个取代基,所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2;
各p独立地选自1、2、3、4、5和6;
q选自1、2、3和4;
n选自1、2和3;并且
A是TLR激动剂部分。
在一个实施方式中,式(A1)的TLR激动剂如下:RX和RY是H;X是O;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地取代有1~2个卤素原子;p选自1、2和3;q选自1和2;且n是1。因此,在这些实施方式中,所述吸附部分包含磷酸基团。
在其它实施方式中,式(A1)的TLR激动剂如下:RX和RY是H;X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地取代有1~2个卤素原子;p选自1、2或3;q选自1或2;且n是1。因此,在这些实施方式中,所述吸附部分包含膦酸基团。
式(A1)的有用的“A”部分包括但不限于:任一下述化合物的基团,如本文中定义或如参考文献136、137、139、140、142和177中公开:
在一些实施方式中,所述TLR激动剂部分“A”的分子量低于1000Da。在一些实施方式中,式(A1)的TLR激动剂的分子量低于1000Da。
优选的TLR激动剂是水溶性的。因此,其在pH7,25℃,1个大气压下与水在水性缓冲剂中混合时能够形成均匀溶液,以获得浓度为至少50μg/ml的溶液。因此,术语“水溶性的”排除在这些条件下仅微溶的物质。
可用的TLR激动剂包括如下文中更详细描述的具有式(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)、(I)、(II)、(J)或(K)的那些。其它有用的TLR激动剂是如参考文献142中定义的化合物1~102。优选的TLR7激动剂具有式(K),例如下文中鉴定的化合物K2。这些可以盐的形式使用,例如,K2的精氨酸盐。
优选的TLR4激动剂是单磷酰脂质A(MPL)的类似物,如下文中详述。例如,有用的TLR4激动剂是3d-MPL。
本发明的组合物可包含多于一种TLR激动剂。这两种激动剂彼此不同,并且其能够靶向相同的TLR或不同的TLR。这两种激动剂都可吸附至铝盐。
优选地,组合物中任何TLR激动剂的至少50%(以质量计)(例如≥60%、≥70%、≥80%、≥85%、≥90%、≥92%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%或甚至100%)吸附至铝盐(若存在)。
在本发明组合物包含吸附于金属盐的TLR激动剂并且还包含缓冲液的情况下,优选缓冲液中的磷酸根离子的浓度低于50mM(例如在1-15mM之间),因为高浓度的磷酸根离子会引起解吸附。优选采用组氨酸缓冲液。
式(C)、(D)、(E)和(H)–TLR7激动剂
所述TLR激动剂可以是任何式(C)、(D)、(E)和(H)的化合物:
其中:
(a)P3选自H、C1-C6烷基、CF3,和-((CH2)pO)q(CH2)pOs-与-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);且P4选自H、C1-C6烷基、-C1-C6烷芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);前提是P3和P4中至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY),
(b)P5选自H、C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);P6选自H、C1-C6烷基(其各自任选地被选自C1-C4烷基和OH的1至3个取代基取代)以及-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);P7选自H、C1-C6烷基、-((CH2)pO)q(CH2)pOs-、-NHC1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);前提是P5、P6和P7中至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
(c)P8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基,其各自任选地被OH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代;P9和P10各自独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NHC1-C6烷基(其各自任选地被OH和C1-C6烷基取代)以及-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);前提是P8、P9或P10中至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
(d)P16和各P18各自独立地选自H、C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);P17选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C1-C6烷基芳基、C1-C6烷基杂芳基、C1-C6烷基芳基-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY),其各自任选地被选自C1-C6烷基或杂环基的1至2个取代基取代,前提是P16、P17或P18中至少一个包含-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)部分;
RX和RY独立地选自H和C1-C6烷基;
RC、RD和RH各自独立地选自H和C1-C6烷基;
XC选自CH和N;
RE选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C(O)C1-C6烷基、卤素和-((CH2)pO)q(CH2)p-;
XE选自共价键、CRE2RE3和NRE4;
RE2、RE3和RE4独立地选自H和C1-C6烷基;
XH1-XH2选自-CRH2RH3-、-CRH2RH3-CRH2RH3-、-C(O)CRH2RH3-、-C(O)CRH2RH3-、-CRH2RH3C(O)-、-NRH4C(O)-、C(O)NRH4-、CRH2RH3S(O)2和–CRH2=CRH2-;
RH2、RH3和RH4各自独立地选自H、C1-C6烷基和P18;
XH3选自N和CN;
X选自共价键、O和NH;
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH;
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被1至4个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2;
m选自0或1;
各p独立地选自1、2、3、4、5和6;
q选自1、2、3和4;且
s选自0和1。
式(G)–TLR8激动剂
所述TLR激动剂可以是式(G)化合物:
其中:
P11选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、NRVRW和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
P12选自H、C1-C6烷基、任选被–C(O)NRVRW取代的芳基、和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
P13、P14和P15独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
前提是P11、P12、P13、P14或P15中至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
RV和RW独立地选自H、C1-C6烷基或与其所连接的氮原子一同形成4至7元杂环;
XG选自C、CH和N;
代表任选的双键,其中若是双键则XG是C;且
RG选自H和C1-C6烷基;
X选自共价键、O和NH;
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH;
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被1至4个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2;
各p独立地选自1、2、3、4、5和6,且
q选自1、2、3和4。
式(I)和(II)–TLR7激动剂[137]
所述TLR激动剂可以是式(I)或式(II)化合物:
其中:
Z是-NH2或-OH;
X1是亚烷基、经取代的亚烷基、亚烯基、经取代的亚烯基、亚炔基、经取代的亚炔基、亚碳环基、经取代的亚碳环基、杂亚碳环基、或经取代的杂亚碳环基;
L1是共价键、亚芳基、经取代的亚芳基、杂亚碳环基、经取代的杂亚碳环基、亚碳环基、经取代的亚碳环基、-S-、-S(O)-、S(O)2、-NR5-或-O-
X2是共价键、亚烷基或经取代的亚烷基;
L2是NR5-、—N(R5)C(O)—、-O-、-S-、-S(O)-、S(O)2或共价键;
R3是H、烷基、经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、烯基、经取代的烯基、芳基、经取代的芳基、芳基烷基、经取代的芳基烷基、杂环基、经取代的杂环基、杂环基烷基或经取代的杂环基烷基;
Y1和Y2各自独立地是共价键、-O-或-NR5-;或-Y1—R1和-Y2-R2各自独立地是—O-N=C(R6R7);
R1和R2各自独立地是H、烷基、经取代的烷基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基、经取代的杂环基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基烷基、经取代的芳基烷基、杂环烷基、经取代的杂环烷基、-亚烷基-C(O)-O-R5、—(经取代的亚烷基)-C(O)-O-R5、-亚烷基-O-C(O)-R5、-(经取代的亚烷基)-O-C(O)-R5、-亚烷基-O-C(O)-O-R5或-(经取代的亚烷基)-O-C(O)-O-R5
R4是H、卤素、-OH、-O-烷基、-O-亚烷基-O-C(O)-O-R5、-O-C(O)-O-R5、-SH或-NH(R5);
R5、R6和R7各自独立地是H、烷基、经取代的烷基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基、经取代的杂环基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基烷基、经取代的芳基烷基、杂环基烷基或经取代的杂环基烷基。
式(J)–TLR2激动剂[143]
所述TLR激动剂可以是式(J)化合物:
其中:
R1是H、-C(O)-C7-C18烷基或–C(O)-C1-C6烷基;
R2是C7-C18烷基;
R3是C7-C18烷基;
L1是-CH2OC(O)-、-CH2O-、-CH2NR7C(O)-或-CH2OC(O)NR7-;
L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-;
R4是-L3R5或-L4R5;
R5是–N(R7)2、-OR7、-P(O)(OR7)2、-C(O)OR7、-NR7C(O)L3R8、-NR7C(O)L4R8、-OL3R6、-C(O)NR7L3R8、-C(O)NR7L4R8、-S(O)2OR7、-OS(O)2OR7、C1-C6烷基、C6芳基、C10芳基、C14芳基、包含选自O、S和N的1至3个杂原子的5至14元环杂芳基,包含选自O、S和N的1至3个杂原子的5至6元环杂环烷基或C3-C8环烷基,其中R5的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基各自未经取代,或者R5的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基各自被独立地选自-OR9、-OL3R6、-OL4R6、-OR7和-C(O)OR7的1至3个取代基取代;
L3是C1-C10亚烷基,其中L3的C1-C10亚烷基未经取代,或者L3的C1-C10亚烷基被1至4个R6基团取代,或者L3的C1-C10亚烷基在相同碳原子上被两个C1-C6烷基基团取代,这两个C1-C6烷基基团和其连接的碳原子一同形成C3-C8环烷基;
L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-或-(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-,其中各R11是C1-C6烷基基团,所述C1-C6烷基基团与其相连的碳原子一同形成C3-C8环烷基;
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、被1~2个羟基基团取代的C1-C6烷基、-OR7、-N(R7)2、-C(O)OH、-C(O)N(R7)2、-P(O)(OR7)2、C6芳基、C10芳基和C14芳基;
各R7独立地选自H和C1-C6烷基;
R8选自–SR7、-C(O)OH、-P(O)(OR7)2和包含选自O和N的1至3个杂原子的5至6元杂环烷基;
R9是苯基;
各R10独立地选自H和卤素;
各p独立地选自1、2、3、4、5和6,以及
q是1、2、3或4。
优选地,R5是P(O)(OR7)2、-NR7C(O)L3-P(O)(OR7)2、-NR7C(O)L4-P(O)(OR7)2、-OL3-P(O)(OR7)2、-C(O)NR7L3-P(O)(OR7)2或-C(O)NR7L4-P(O)(OR7)2。
在(J)的一些实施方式中,R1是H。在(J)的其它实施方式中,R1是-C(O)-C15烷基;
在(J)的一些实施方式中:(i)L1是-CH2OC(O)-且L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-;或者(ii)或L1是-CH2O-且L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-;或者(iii)L1是-CH2NR7C(O)-且L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-;或者(iv)L1是-CH2OC(O)NR7-且L2是-OC(O)-、-O-、NR7C(O)-或-OC(O)NR7-。
在(J)的一些实施方式中:(i)L1是-CH2OC(O)-且L2是-OC(O)-;或者(ii)L1是-CH2O-且L2是-O-;或者(iii)L1是-CH2O-且L2是-NHC(O)-;或者(iv)L1是-CH2OC(O)NH-且L2是-OC(O)NH-。
在(J)的一些实施方式中,(i)R2是-C11烷基且R3是-C11烷基;或者(ii)R2是-C16烷基且R3是-C16烷基;或者(iii)R2是-C16烷基且R3是-C11烷基;或者(iv)R2是-C12烷基且R3是-C12烷基;或者(v)R2是-C7烷基且R3是-C7烷基;或者(vi)R2是-C9烷基且R3是-C9烷基;或者(vii)R2是-C8烷基且R3是-C8烷基;或者(viii)R2是-C13烷基且R3是-C13烷基;或者(ix)R2是-C12烷基且R3是-C11烷基;或者(x)R2是-C12烷基且R3是-C12烷基;或者(xi)R2是-C10烷基且R3是-C10烷基;或者(xii)R2是--C15烷基且R3是-C15烷基。
在(J)的一些实施方式中,R2是-C11烷基且R3是-C11烷基。
在(J)的一些实施方式中,L3是C1-C10亚烷基,其中L3的C1-C10亚烷基未经取代或被1至4个R6基团取代。
在(J)的一些实施方式中:L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-;各R10独立地选自H和F;且p各自独立地选自2、3和4。
在(J)的一些实施方式中,各R6独立地选自甲基、乙基、异丙基、异丁基、-CH2OH、-OH、-F、-NH2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-P(O)(OH)2和苯基。
在(J)的一些实施方式中,各R7独立地选自H、甲基和乙基。
TLR4激动剂
本发明的组合物可包括TLR4激动剂,且最优选是人TLR4的激动剂。TLR4由先天性免疫系统的细胞表达,所述细胞包括常规的树突细胞和巨噬细胞[144]。通过TLR4的触发诱导利用MyD88-和TRIF-依赖通路的信号级联反应,分别导致NF-κB和IRF3/7激活。TLR4的激活通常诱导大量IL-12p70生成并显著增强Th1型细胞和体液免疫应答。
多种有用的TLR4激动剂是本领域已知的,其中许多是内毒素或脂多糖(LPS)的类似物。例如,所述TLR4激动剂可以是:
(i)3d-MPL(即3-O-去酰化的单磷酰基脂质A;也称为3-去氧-酰化单磷酰基脂质A或3-O-去酰化-4'-单磷酰基脂质A)。该内毒素的单磷酰基脂质A部分的衍生物含有葡糖胺还原性末端的3位脱酰化位点。其已由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备,并且在化学上类似于脂质A但缺少酸不稳定性的磷酰基基团和碱不稳定性的酰基基团。3d-MPL的制备最初在参考文献145中有描述,并且该产品已被科雷莎公司(Corixa Corporation)生产并出售。其存在于GSK公司的“AS04”佐剂中。更多详细情况请见参考文献146~149。
(ii)吡喃葡糖基脂A(GLA)[150]或其铵盐:
(iii)氨烷基氨基葡糖苷磷酸,如RC-529或CRX-524[151-153]。RC-529和CRX-524具有如下结构,区别在于其R2基团:
(iv)包含脂质的化合物,其脂质与含磷酸无环主链连接,如TLR4拮抗剂E5564[154,155]:
(v)如参考文献156中定义的式I、II或III的化合物或其盐,如化合物‘ER803058’、‘ER 803732’、‘ER 804053’、‘ER 804058’、‘ER 804059’、‘ER 804442’、‘ER 804680’、‘ER 803022’、‘ER 804764’或‘ER 804057’。ER 804057也被称为E6020,其具有如下结构:
而ER 803022具有如下结构:
(vi)参考文献157所公开的多肽配体中的一种。
本发明可采用任何这些TLR4激动剂。
本发明的组合物可包含所述TLR4激动剂得以吸附的铝盐。具有吸附性质的TLR4激动剂通常包含含磷部分,该部分可以与铝盐上的表面基团进行配体交换,尤其是与具有表面羟基基团的盐进行配体交换。因此,有用的TLR4激动剂可包括磷酸盐/酯、膦酸盐/酯、次膦酸盐/酯、亚膦酸盐/酯、次亚膦酸盐/酯(phosphinite)、磷酸盐/酯等。优选的TLR4激动剂包括至少一个磷酸基团[142],例如上文所列的激动剂(i)-(v)。
用于本发明的优选TLR4激动剂是3d-MPL。其可吸附至磷酸铝佐剂、氢氧化铝佐剂或两者的混合物[158]。
3d-MPL可以是酰基化不同(如具有3、4、5或6个酰基链,它们的长度可以不同)的相关分子的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-酰基化,3'位上也有O-酰基化。连接至C2的基团具有下式:-NH-CO-CH2-CR1R1'。连接于C2'的基团具有下式:-NH-CO-CH2-CR2R2'。连接至C3'的基团具有下式:-O-CO-CH2-CR3R3'。代表性结构为:
基团R1、R2和R3各自独立地是-(CH2)n-CH3。n值优选为8至16,更优选为9至12,最优选为10。
基团R1'、R2'和R3'各自独立地是:(a)-H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4,其中R4是-H或-(CH2)m-CH3,其中m值优选为8至16,更优选为10、12或14。在2位上,m优选为14。在2'位上,m优选为10。在3'位上,m优选为12。因此基团R1'、R2'和R3'优选为来自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的-O-酰基。
当R1'、R2'和R3'均为-H时,3d-MPL仅含有3条酰基链(2、2'和3'位上各有一条)。当R1'、R2'和R3'中仅有两个是–H时,3D–MPL可含有4条酰基链。当R1'、R2'和R3'中仅有一个是–H时,3d–MPL可含有5条酰基链。当R1'、R2'和R3'中无一是–H时,3d–MPL可含有6条酰基链。本发明所用的3d-MPL可以是含有3至6条酰基链的这些形式的混合物,但混合物中优选包含具有6条酰基链的3d-MPL,具体而言,以保证所述6条酰基链的形式占3d-MPL总重的至少10%,例如,>20%、>30%、>40%、>50%或更多。已发现具有6条酰基链的3d-MPL是佐剂活性最高的形式。
因此,可用于本发明的3d-MPL的最优选形式是:
以混合物的形式使用3d-MPL时,3d-MPL在本发明组合物中的含量或浓度指混合物中所包含的总3d-MPL物质。
典型的组合物包括浓度为25μg/ml至200μg/ml的3d-MPL,例如浓度为50-150μg/ml、75-125μg/ml、90-110μg/ml或约100μg/ml的组合物。通常采用25-75μg的3d-MPL/剂量,例如45-55μg,或约50μg 3d-MPL/剂量。
在水性条件下,3d-MPL可形成不同大小的胶束聚集体或颗粒,如直径<150nm或>500nm的胶束聚集体或颗粒。胶束聚集体或颗粒中的一种或两种可用于本发明,可通过常规试验选择较好的颗粒。本发明优选采用较小颗粒(例如小到足以产生澄清的3d-MPL水性悬液),因为其具有优良的活性[159]。优选的颗粒的平均直径小于150nm,更优选地小于120nm,甚至可以小于100nm。然而,在大多数情况下,所述平均直径不小于50nm。当3d-MPL吸附至铝盐时,可能无法直接测定3d-MPL的粒度,但可以在发生吸附之前测定粒度。可通过动态光散射的常规技术来评估粒径,该技术揭示平均粒径。当颗粒的直径据称为x nm时,粒径通常分布在此平均值附近,但数量上至少50%(例如>60%、>70%、>80%、>90%或更多)颗粒的直径在x±25%的范围内。
式(K)[160]
所述TLR激动剂可以是式(K)化合物:
其中:
R1是H、C1-C6烷基、-C(R5)2OH、-L1R5、-L1R6、-L2R5、-L2R6、-OL2R5或-OL2R6;
L1是–C(O)-或–O-;
L2是C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR4R4)pO)q(CH2)p-,且L2的C1-C6亚烷基和C2-C6亚烯基可任选被1至4个氟基团取代;
各L3独立地选自C1-C6亚烷基和-((CR4R4)pO)q(CH2)p-,其中L3的C1-C6亚烷基任选被1至4个氟基团取代;
L4是亚芳基或杂亚芳基;
R2是H或C1-C6烷基;
R3选自C1-C4烷基、–L3R5、-L1R5、-L3R7、-L3L4L3R7、-L3L4R5、-L3L4L3R5、-OL3R5、-OL3R7、-OL3L4R7、-OL3L4L3R7、-OR8、-OL3L4R5、-OL3L4L3R5和-C(R5)2OH;
各R4独立地选自H和氟;
R5是-P(O)(OR9)2,
R6是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10;
R7是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10;
R8是H或C1-C4烷基;
各R9独立地选自H和C1-C6烷基;
R10是H或C1-C4烷基;
各p独立地选自1、2、3、4、5和6,以及
q是1、2、3或4。
式(K)的化合物优选是式(K'):
其中:
P1选自H、任选地被COOH取代的C1-C6烷基,和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
P2选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
前提是P1和P2中至少一个是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);
RB选自H和C1-C6烷基;
RX和RY独立地选自H和C1-C6烷基;
X选自共价键、O和NH;
Y选自共价键、O、C(O)、S和NH;
L选自共价键C1-C6亚烷基、C1-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C1-C6亚烷基氧基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被1至4个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和-P(O)(OH)2;
各p独立地选自1、2、3、4、5和6;以及
q选自1、2、3和4。
在式(K')的一些实施方式中:P1选自C1-C6烷基,其任选地被COOH和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代;P2选自C1-C6烷氧基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);RB是C1-C6烷基;X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被1至4个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2;各p独立地选自1、2和3;q选自1和2。
优选的式K的TLR7激动剂是3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-磷酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f]-[1,7]萘啶-8-基)丙酸,本文中称为化合物“K2”:
K2化合物还可以精氨酸盐单水合物的形式使用。
式(F)—TLR7激动剂[138]
所述TLR激动剂可以是式(F)化合物:
其中:
X3是N;
X4是N或CR3
X5是-CR4=CR5-;
R1和R2是H;
R3是H;
R4和R5各自独立地选自H、卤素、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)N(R11R12)、-N(R11R12)、-N(R9)2、-NHN(R9)2、-SR7、-(CH2)nOR7、-(CH2)nR7、-LR8、-LR10、-OLR8、-OLR10、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基,其中R4和R5的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基各自可选取代有1-3个取代基,所述取代基独立地选自卤素、-CN、-NO2、-R7、-OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、-OP(O)(OR10)2、-C(O)N(R9)2、-S(O)2R8、-S(O)R8、-S(O)2N(R9)2和-NR9S(O)2R8;
或者,当存在于毗邻环原子上时,R3和R4,或R4和R5,或R5和R6可任选地彼此连接一同形成5~6元环,其中所述5~6元环任选地被R7取代;
各L独立地选自键、-(O(CH2)m)t-、C1-C6烷基、C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基,其中L的C1-C6烷基、C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基各自任选地被1至4个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、-R8、-OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2和-OP(O)(OR10)2;
R7选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基和C3-C8杂环烷基,其中R7的C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基和C3-C8杂环烷基各自任选地被1至3个R13基团取代,各R13独立地选自卤素、-CN、-LR9、-LOR9、-OLR9、-LR10、-LOR10、-OLR10、-LR8、-LOR8、-OLR8、-LSR8、-LSR10、-LC(O)R8、-OLC(O)R8、-LC(O)OR8、-LC(O)R10、-LOC(O)OR8、-LC(O)NR9R11、-LC(O)NR9R8、-LN(R9)2、-LNR9R8、-LNR9R10、-LC(O)N(R9)2、-LS(O)2R8、-LS(O)R8、-LC(O)NR8OH、-LNR9C(O)R8、-LNR9C(O)OR8、-LS(O)2N(R9)2、-OLS(O)2N(R9)2、-LNR9S(O)2R8、-LC(O)NR9LN(R9)2、-LP(O)(OR8)2、-LOP(O)(OR8)2、-LP(O)(OR10)2和-OLP(O)(OR10)2;
各R8独立地选自H、-CH(R10)2、C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基,其中R8的C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基各自任选地被1至3个取代基取代,所述取代基独立地选自-CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)N(R9)2、-C(O)OR11、-NR9C(O)R11、-NR9R10、-NR11R12、-N(R9)2、-OR9、-OR10、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、-S(O)2R11、-S(O)R11、-S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2;
各R9独立地选自H、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)R10、-C(O)OR10、-S(O)2R10、-C1-C6烷基、C1-C6杂烷基和C3-C6环烷基,或各R9独立为与所连的N共同形成C3-C8杂环烷基的C1-C6烷基,其中所述C3-C8杂环烷基环可任选含有选自N、O和S的额外杂原子,且其中R9的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C3-C6环烷基或C3-C8杂环烷基任选地被1至3个取代基取代,所述取代基独立地选自-CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)OR11、-NR11R12、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、-S(O)2R11、-S(O)R11、-S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2;
各R10独立地选自芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基,其中所述芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基可任选由1-3个取代基取代,所述取代基选自卤素、-R8、-OR8、-LR9、-LOR9、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9CO2R8、-CO2R8、-C(O)R8和-C(O)N(R9)2;
R11和R12独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基,其中R11和R12的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基各自可任选地被1至3个取代基取代,所述取代基独立地选自卤素、-CN、R8、-OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-NR8C(O)R8、-NR8C(O)OR8、-C(O)N(R9)2、C3-C8杂环烷基、–S(O)2R8、-S(O)2N(R9)2、-NR9S(O)2R8、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基;
或者R11和R12各自独立为C1-C6烷基,并与所连接的N原子共同形成可任选取代的C3-C8杂环烷基环,该环可任选含有选自N、O和S的额外杂原子;
环A是芳基或杂芳基,其中环A的芳基和杂芳基基团任选地被1至3个RA基团取代,各RA基团独立地选自-R8、-R7、-OR7、-OR8、-R10、-OR10、-SR8、-NO2、-CN、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9C(S)R8、-NR9C(O)N(R9)2、-NR9C(S)N(R9)2、-NR9CO2R8、-NR9NR9C(O)R8、-NR9NR9C(O)N(R9)2、-NR9NR9CO2R8、-C(O)C(O)R8、-C(O)CH2C(O)R8、-CO2R8、-(CH2)nCO2R8、-C(O)R8、-C(S)R8、-C(O)N(R9)2、-C(S)N(R9)2、-OC(O)N(R9)2、-OC(O)R8、-C(O)N(OR8)R8、-C(NOR8)R8、-S(O)2R8、-S(O)3R8、-SO2N(R9)2、-S(O)R8、-NR9SO2N(R9)2、-NR9SO2R8、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、-OP(O)(OR10)2、-N(0R8)R8、-CH=CHCO2R8、-C(=NH)-N(R9)2和-(CH2)nNHC(O)R8,或者环A上的两个毗邻RA取代基形成包含至多两个杂原子作为环成员的5-6元环;
每次出现的n均独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8;
各m独立地选自1、2、3、4、5和6,以及
t为1、2、3、4、5、6、7或8。
式(C)、(D)、(E)、(G)和(H)
如上所述,所述TLR激动剂可以是式(C)、(D)、(E)、(G)或(H)。
式(C)、(D)、(E)和(H)的"母体"化合物是有用的TLR7激动剂(参见参考文献136~139和161~177),但在本文中优选通过连接含磷部分来修饰。
在式(C)、(D)和(E)的一些实施方式中,所述化合物具有式(C`)、(D`)和(E`)的结构,如下所示:
本发明的式(C)、(D)、(E)和(H)的实施方式也适用式(C`)、(D`)、(E`)和(H`)。
在式(C)、(D)、(E)和(H)的一些实施方式中:X是O;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(C)的其它实施方式中:P3选自C1-C6烷基、CF3和-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);P4选自-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);XC是CH;X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;q是1或2。
在式(C)、(D)、(E)和(H)的其它实施方式中:X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(C)的其它实施方式中:P3选自C1-C6烷基、CF3和-((CH2)pO)q(CH2)pOs-和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);P4选自-C1-C6烷基芳基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY);XC是N;X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;q选自1和2。
在式(D)的其它实施方式中:P5选自C1-C6烷基和-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
在式(D)的其它实施方式中:X是O;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(D)的其它实施方式中:X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(E)的其它实施方式中:X是O;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(E)的其它实施方式中:X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(E)的其它实施方式中:XE是CH2,P8是C1-C6烷氧基,其任选地被-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)取代。
在式(E)的其它实施方式中:P9是任选地被OH和C1-C6烷基取代的-NHC1-C6烷基,以及-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
在一些实施方式中,式(C)的化合物中P4不是-Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)。
在一些实施方式中,式(C)的化合物中,P4选自H、C1-C6烷基、-C1-C6烷基芳基。
在式(H)的一些实施方式中:XH1-XH2是CRH2RH3,RH2和RH3是H,XH3是N,X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;q选自1和2。
在式(H)的一些实施方式中:XH1-XH2是CRH2RH3,RH2和RH3是H,XH3是N,X是O;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
式(G)的“母体”化合物是有用的TLR8激动剂(参见参考文献140和141),但在本文中优选通过连接含磷部分来修饰以允许吸附。在式(G)的一些实施方式中,所述化合物具有式(G`)的结构;
在式(G)或(G`)的一些实施方式中:XG是C且代表双键。
在式(G)或(G`)的一些实施方式中:X是共价键;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
在式(G)或(G`)的一些实施方式中:X是O;L选自C1-C6亚烷基和-((CH2)pO)q(CH2)p-,其各自任选地被独立地选自卤素、OH、C1-C4烷基、-OP(O)(OH)2和–P(O)(OH)2的1至4个取代基取代;各p独立地选自1、2和3;且q选自1和2。
免疫原性组合物
在上述抗原和佐剂组分以外,本发明的组合物还可包含其它非抗原性组分。这些可包括载体、赋形剂、缓冲剂等。这些非抗原组分可来自各种来源。例如,它们可存在于生产过程中所用的抗原或佐剂物质之一之中,或与那些组分分开添加。
优选的本发明组合物包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。
为了控制张力,优选包含生理盐(如钠盐)。优选氯化钠(NaCl),其可以1-20mg/ml存在。
组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg,优选为240-360mOsm/kg,更优选为280-320mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[178],但仍优选地将渗透压保持在此范围内。
本发明组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括:磷酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般为5至20mM的范围。
本发明组合物的pH值通常是在6.0和7.5之间。因此,制备方法可包括在包装前调整组合物pH值的步骤。给予患者的水性组合物能具有5.0-7.5的pH,更通常为5.0-6.0以最优化稳定性;在白喉类毒素和/或破伤风类毒素存在的情况下,pH值理想地在6.0和7.0之间。
本发明组合物优选为无菌组合物。
本发明组合物优选是无热原的,例如每剂量含有<1EU(内毒素单位,标准度量,1EU等于0.2ng FDA参比标准内毒素EC-2‘RSE’),优选每剂量<0.1EU。
本发明组合物优选地不含谷蛋白。
如果组合物包含吸附的组分,则其可以是具有浑浊外观的悬浮液。这种外观意味着不容易观察微生物污染,因此该疫苗优选含有抗微生物剂。当疫苗包装在多剂量容器中时,这点尤其重要。所包含的抗微生物剂优选地是2-苯氧基乙醇和硫柳汞。然而,在本发明方法中优选地不使用含汞防腐剂(如硫柳汞)。因此,在方法中混合的一种和所有组分之间可基本不含含汞防腐剂。然而,如果在用于本发明之前某组分经这种防腐剂处理则无法避免存在痕量的这种防腐剂。但是,出于安全性考虑,优选地最终组合物所含有的汞少于约25ng/ml。更优选地,无法检测到最终疫苗产品中含有硫柳汞。通常通过在加入本发明方法之前去除抗原制剂中的含汞防腐剂或在制备组合物的组分的制备过程中避免采用硫柳汞来实现此目的。不含汞的组合物是优选的。
本发明的组合物通常是水性溶液的形式。
在制备过程中,通常用WFI(注射用水)或用缓冲剂稀释组分,以得到所需的终浓度。
本发明可提供适合包装到单个剂量中的混合物质,随后可分配给予患者。上述浓度一般是最终包装剂量中的浓度,因此批量疫苗中的浓度可更高(如待通过稀释降低至最终浓度)。
给予患者单位剂量的本发明的组合物,单位剂量即单次给予中给予单一患者的组合物的量(例如,单次注射是单位剂量)。若组合物以液体形式给予,则单位剂量通常具有0.5mL的体积。应理解,该体积包括常态变异量,例如,0.5ml±0.05ml。对于多剂量的情况,多个剂量的量被共同提取和包装在单个容器中,例如在10剂量的多剂量容器中采用5ml(或5.5ml,带10%溢出)。
来源于单独抗原组分的残留物质也可在本发明的方法生产的最终疫苗中以痕量存在。例如,如果用甲醛制备白喉、破伤风和百日咳的类毒素,那么最终疫苗可含有痕量的甲醛(如低于10μg/ml,优选<5μg/ml)。在脊髓灰质炎病毒制备中可能已经使用培养基或稳定剂(例如培养基199),这些可延续至最终疫苗。相似地,游离的氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或羟基脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸)、维生素(例如胆碱、抗坏血酸盐等)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钙、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、酚红、乙酸钠、氯化钾等,可在最终疫苗中各自保留≤100μg/ml,优选<10μg/ml。来自抗原制剂的其它组分,如新霉素(例如硫酸新霉素,特别是来自脊髓灰质炎病毒组分)、多粘菌素B(例如硫酸多粘菌素B,特别是来自脊髓灰质炎病毒组分)等也可以在每剂量中存在亚纳克的量。来源于抗原制备的最终疫苗的另一可能组分产生于抗原的不完全纯化(less-than-total purification)。因此,可能存在少量的百日咳博德特氏菌、白喉棒杆菌、破伤风梭菌和酿酒酵母蛋白和/或基因组DNA。为了使这些残留组分的量最小化,在抗原与本发明一起使用之前优选处理抗原制品以去除这些残留组分。
在使用脊髓灰质炎病毒组分的情况下,脊髓灰质炎病毒通常在Vero细胞上培养。最终疫苗优选含有低于10ng/ml,优选≤1ng/ml,例如≤500pg/ml或≤50pg/ml的Vero细胞DNA,例如低于10ng/ml的≥50碱基对长度的Vero细胞DNA。
本发明组合物适于存在于容器中。合适的容器包括药瓶和一次性注射器(优选无菌注射器)。本发明方法可包括将疫苗包装到容器中待用的步骤。合适的容器包括药瓶和一次性注射器(优选无菌注射器)。
本发明还提供含有本发明药物组合物(例如包含单位剂量)的递送装置(例如注射器、喷洒器(nebuliser)、喷雾器(sprayer)、吸入器、皮肤贴片等)。该装置可用于向脊椎动物对象给予所述组合物。
本发明还提供含本发明免疫原性药物组合物(如含单位剂量)的无菌容器(如药瓶)。
本发明还提供本发明药物组合物的单位剂量。
本发明还提供包含本发明药物组合物的密封容器。合适的容器包括例如药瓶。
将本发明组合物在药瓶中时,药瓶优选地是由玻璃或塑料制成。在加入组合物之前,摇瓶优选已灭菌。为了避免胶乳敏感型患者的问题,可以用无胶乳的塞子密封药瓶,所述药瓶可包含单一剂量的疫苗,或者可以包含一个以上剂量(‘多剂量’药瓶),如10个剂量。当采用多剂量药瓶时,应用无菌针头和注射器在严格无菌的条件下取出各剂量,注意避免污染药瓶的内容物。优选地,药瓶由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如鲁尔(Luer)锁),从而预填装注射器可插入该帽,可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中复溶冻干物质),并可以将药瓶的内容物移回注射器中。从药瓶移出注射器后,可连上针头,将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧,以便在封口或盖子移除后才能接触到该帽。
将组合物包装到注射器中时,注射器通常不会连接有针头,但可提供单独的针头与注射器组装和使用。优选安全针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。注射器可具有剥离式标签,该标签上可打印上批号和过期日期,以帮助记录保存。注射器中的活塞优选带有防脱装置,以防止活塞在吸出时意外脱出。注射器可以具有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽,用以在连接针头之前密封顶端,顶帽优选是由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装,则针头优选地装有丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。优选的注射器是以商品名“Tip-Lok”TM销售的注射器。
采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时,优选采用由硼硅酸盐玻璃,而非钠钙玻璃制成的容器。
将组合物包装到容器中之后,可将容器密封到用于分销的箱子(如纸板箱)中,该箱子标记有该疫苗的详细情况,例如其商品名、疫苗所含抗原的列表(如“乙型肝炎重组物”等)、提供的容器(如“一次性预填充Tip-Lok注射器”或“10x0.5ml单剂量药瓶”)、其剂量(如“各含一剂0.5ml剂量”)、警示(如“仅用于成年人”或“仅用于儿童”)、失效日期、说明、专利号等。各箱可含有一个以上的包装疫苗,例如5或10个包装的疫苗(特别是药瓶)。
可将疫苗与宣传页包装在一起(在同一个箱子中),所述宣传页包括疫苗的详细情况如给药说明、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警示,例如准备好肾上腺素溶液以防疫苗接种后发生过敏反应等。
包装疫苗优选保存于2℃~8℃。不应被冷冻。
制备后的疫苗能以全液体的形式提供(如在所有抗原组分都在水溶液或悬浮液中的情况下),或疫苗能以在使用时/使用点通过混合两种组分临时制备的形式下制备。这种双组分实施方式包括液体/液体混合和液体/固体混合,例如通过混合水性物质和冻干物质。例如,在一个实施方式中,疫苗可以通过混合以下组成而制备:(a)含有水性抗原和/或佐剂的第一组分;以及(b)含有冻干抗原的第二组分。在另一个实施方式中,疫苗能通过混合以下组分而制备:(a)含有水性抗原和/或佐剂的第一组分;以及(b)含有水性抗原的第二组分。在另一个实施方式中,疫苗能通过混合以下组分而制备:(a)含有水性抗原的第一组分;以及(b)含有水性佐剂的第二组分。这两种组分优选装在不同的容器(如小瓶和/或注射器)中,本发明提供了包含组分(a)和(b)的药盒。
另一种有用的液体/冻干形式包含(a)铝盐佐剂和TLR激动剂的水性复合物以及(b)一种或多种抗原的冻干组分。通过混合组分(a)和(b)得到适于患者给药的疫苗组合物。在一些实施方式中,组分(a)不含抗原,从而在最终疫苗中的所有抗原组分都来自组分(b);在其它实施方式中,组分(a)包含一种或多种抗原,从而在最终疫苗中的抗原组分同时来自组分(a)和(b)。
因此,本发明提供制备包含上述组分(a)和(b)的联合疫苗的药盒。药盒组分通常是瓶子或注射器,并且单个药盒可以同时含有瓶子和注射器。本发明也提供了一种制备这样的药盒的方法,所述方法包括以下步骤:(i)制备如上述的水性组分疫苗;(ii)将所述水性联合疫苗包装到第一个容器(如注射器)中;(iii)制备冻干形式的含抗原组分;(iv)将所述冻干抗原包装到第二个容器(如瓶子)中;以及(v)将第一个容器和第二个容器一起包装到药盒中。然后可将该药盒分配给医生。
液体/冻干形式特别可用于包含偶联物组分,特别是Hib和/或脑膜炎球菌和/或肺炎球菌偶联物的疫苗,因为它们可能在冻干形式中更稳定。因此,可在用于本发明之前将偶联物冻干。
在对组分进行冻干的情况下,通常包含非活性组分,这些组分(例如作为稳定剂)在冻干之前加入。所包含的稳定剂优选地是乳糖、蔗糖和甘露醇及其混合物,如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此,通过冻干物质的水性重建得到的最终疫苗可能含有乳糖和/或蔗糖。当制备冻干疫苗时,优选使用无定形赋形剂和/或无定形缓冲液[179]。
本发明的大多数组合物包含白喉、破伤风和百日咳类毒素。在小儿型组合物中,所述组合物包含相对于破伤风类毒素过量的白喉类毒素(以Lf单位计)。理想上,所述过量是至少1.5:1,例如5Lf的白喉类毒素对于每2Lf破伤风类毒素(即,比例为2.5:1)。这些实施方式最有利于婴儿和儿童。在加强型组合物中,其最有利于青少年和成人(作为加强物),所述组合物包含的破伤风类毒素相对于白喉类毒素过量(以Lf为单位计)。理想上,所述过量是至少1.5:1,例如2Lf的破伤风类毒素对于每1Lf的白喉类毒素(即,比例为2:1)。在其它实施方式中,采用等量的白喉和破伤风类毒素(以Lf单位计)。当白喉或破伤风之一以过量存在时,所述过量理想上是至少1.5倍,例如,2倍或2.5倍,但所述过量通常不超过5倍。
本发明的组合物包含血清组B脑膜炎球菌抗原和白喉类毒素、破伤风类毒素和/或百日咳类毒素中的至少一种。理想上,组合物包括血清组B脑膜炎球菌免疫原、白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素中的全部四种。在一些实施方式中,本发明的组合物不包含该清单以外的免疫原;在其它实施方式中,本发明的组合物包含该清单以外的免疫原。因此,例如,一些组合物包含白喉、破伤风和百日咳类毒素,灭活的1、2和3型脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒表面抗原和Hib偶联物。这些组合物的抗原性部分可由该清单中的抗原组成,或还可包含来自其它病原体(例如,脑膜炎球菌)的抗原。因此这些组合物本身可作为疫苗使用,或作为其它联合疫苗的组分使用。
本发明的特定实施方式包括由如下免疫原组成的组合物:(a)D-T-aP-MenB;(b)D-T-aP-MenB-IPV;(c)D-T-aP-MenB-HBsAg;(d)D-T-aP-MenB-Hib;(e)D-T-aP-MenB-HBsAg-Hib;(f)D-T-aP-MenB-HBsAg-IPV;(g)D-T-aP-MenB-IPV-Hib;(h)D-T-aP-MenB-IPV-Hib-HBsAg;(i)D-T-MenB;其中“D”是白喉类毒素,“T”是破伤风类毒素,“aP”是非细胞百日咳抗原或混合物,MenB是血清组B脑膜炎球菌抗原或混合物,“IPV”是灭活的脊髓灰质炎病毒抗原或混合物,“HBsAg”是乙型肝炎病毒表面抗原,而“Hib”是偶联的B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)荚膜糖。
治疗方法和疫苗的给予
本发明组合物适于给予人类患者,本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法,该方法包括将本发明组合物给予患者的步骤。
本发明还提供了用于医药的本发明组合物。所述组合物可按本文中的不同描述给予,例如,在一些实施方式中通过给予婴儿不超过两个剂量的联合疫苗。
本发明还提供血清组B脑膜炎球菌、白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素(以及任选地,佐剂)在制备在患者中引起免疫应答的药物中的应用。所述药物理想上是本文各处不同描述的组合物,并且其可按照本文中的不同描述给予。
由这些方法、应用和组合物引起的免疫应答理想上是保护性的,并且本发明的免疫原性组合物优选是疫苗,所述疫苗用于防御至少白喉、破伤风和百日咳。基于其抗原组分,所述疫苗也可以保护抵抗细菌性脑膜炎、脊髓灰质炎、肝炎等。
为充分发挥功效,典型的初次免疫方案(特别对于儿童)可包括给予一次以上的剂量。例如,可在以下时间给予:0和6个月(时间0是第一次剂量);在0、1、2和6个月;在0天、21天然后第三次剂量在6和12个月之间;在2、4和6个月;在3、4和5个月;在6、10和14周;在2、3和4个月;或者在0、1、2、6和12个月。
组合物还可用作加强剂,例如用于两岁时的儿童,用于青少年或用于成人。
可通过肌肉内注射例如注射进入手臂或腿中来给予本发明的组合物。
任选的要求和排除部分[180]
在一些实施方式中,本发明不涵盖包含下述物质的单位剂量形式的组合物:(i)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,和(ii)铝盐佐剂,其中该单位剂量中的Al+++的量小于0.2mg。在其它实施方式中,若组合物为单位剂量形式并且包含(i)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,和(ii)铝盐佐剂,但该单位剂量中Al+++的量少于0.2mg,则:(a)所述组合物包含的白喉类毒素至少1.5倍于破伤风类毒素(以Lf单位计);或(b)所述组合物包含的破伤风类毒素至少1.5倍于白喉类毒素(以Lf单位计);或(c)所述组合物包含非细胞型含PT抗原的百日咳抗原,而非全细胞百日咳抗原。
在一些实施方式中,本发明不涵盖包含如下物质的组合物:(i)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,和(ii)铝盐佐剂,其中Al+++的浓度低于0.4mg/ml。在其它实施方式中,若组合物包含(i)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,和(ii)铝盐佐剂,但单位剂量中的Al+++浓度低于0.4mg/ml,那么:(a)所述组合物包含的白喉类毒素至少1.5倍于破伤风类毒素(以Lf单位计);或(b)所述组合物包含的破伤风类毒素至少1.5倍于白喉类毒素(以Lf单位计);或(c)所述组合物包含非细胞型含PT抗原的百日咳抗原,而非全细胞百日咳抗原。
在一些实施方式中,本发明不涵盖包含如下物质的组合物:(i)铝盐佐剂和(ii)<8Lf/ml的白喉类毒素、<3.5Lf/ml的破伤风类毒素和<5μg/ml的百日咳类毒素。在其它实施方式中,若组合物包含(i)铝盐佐剂,和(ii)<8Lf/ml的白喉类毒素、<3.5Lf/ml的破伤风类毒素,和<5μg/ml的百日咳类毒素,则:(a)所述组合物包含的白喉类毒素相对于破伤风类毒素而言过量至少1.5倍(以Lf单位计);或(b)所述组合物包含的破伤风类毒素至少1.5倍于白喉类毒素(以Lf单位计);或(c)所述组合物包含非细胞型含PT抗原的百日咳抗原,而非全细胞百日咳抗原。
在一些实施方式中,本发明不涵盖包含如下物质的组合物:(i)水包油乳剂佐剂(ii)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素和Hib偶联物,和(iii)乙型肝炎病毒表面抗原和/或灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。在其它实施方式中,若组合物包含(i)水包油乳剂佐剂,(ii)白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素和Hib偶联物,则:(a)所述组合物不含乙型肝炎病毒表面抗原;或(b)所述组合物不含灭活的脊髓灰质炎病毒抗原;或(c)所述组合物即不含灭活的脊髓灰质炎病毒抗原,由不含乙型肝炎病毒表面抗原;或(d)所述组合物包含的白喉类毒素至少1.5倍于破伤风类毒素(以Lf单位计);或(e)所述组合物包含的破伤风类毒素至少1.5倍于白喉类毒素(以Lf单位计);或(f)所述组合物包含非细胞型含PT抗原的百日咳抗原,而非全细胞百日咳抗原。
在一些实施方式中,本发明不涵盖包含如下物质的组合物:来自血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物和b型流感嗜血杆菌荚膜糖抗原的偶联物。在其它实施方式中,若本发明的组合物包含来自血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物和b型流感嗜血杆菌荚膜糖抗原的偶联物,则其必须还包括来自血清组B脑膜炎球菌的其它免疫原。
在一些实施方式中,本发明不涵盖包含铝盐佐剂和TLR4激动剂的组合物。
概述
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”,例如,“包括”X的组合物可以仅由X组成或可包含其它物质,例如X+Y。
术语“基本上”不排除“完全”,如基本上不含Y的组合物可能完全不含Y。如有需要,基本上一词可从本发明的定义中省略。
与数值x相关的术语“约”表示例如,x±10%。
除非另有明确说明,包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此,组分可以任何顺序混合。在有三种组分时,可将两种组分相互合并,然后可将组合与第三种组分混合等。
将描述抗原“吸附”至佐剂时,优选该抗原至少吸附50%(以重量计),例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多。优选的是,白喉类毒素和破伤风类毒素均完全吸附,即上清液中检测不到。可采用HBsAg完全吸附。
偶联物的含量通常是以糖质量的形式表示(即,偶联物(载体+糖)作为整体的剂量高于所述剂量),以免载体选择引起的变化。
在本发明中使用的含磷基团可以多种质子化和去质子化形式存在,取决于周围环境的pH值,例如溶解它们的溶剂的pH值。因此,虽然本文可能表示特定的形式,但应当认识到,除非另外指出,这些说明仅仅是代表性的并且不限制特定的质子化或去质子化形式。例如,在磷酸基的情况下,磷酸基被表示为-OP(O)(OH)2,但是该定义包含可能在酸性条件下存在的质子化形式-[OP(O)(OH2)(OH)]+和-[OP(O)(OH2)2]2+以及可能在碱性条件下存在的去质子化形式-[OP(O)(OH)(O)]-和[OP(O)(O)2]2-。本发明包括所有这些形式。
TLR激动剂能以药学上可接受的盐的形式存在。因此,这些化合物可以它们药学上可接受的盐(例如生理上或毒理上可耐受的盐)的形式使用,(所述盐在合适的时候包括药学上可接受的碱加成盐和药学上可接受的酸加成盐)。
在本文所示的可能以互变异构体形式存在的TLR激动剂的情况中,所述化合物能以所有这些互变异构体的形式使用。
将化合物作为组合物的一部分给予机体时,该化合物或可由合适的前药替代。
将动物(且特别是牛)材料用于培养细胞时,其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE),特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。
脑膜炎球菌蛋白免疫原
NHBA(奈瑟菌属肝素结合抗原)
NHBA[181]作为基因NMB2132(GenBank登录号GI:7227388;本文的SEQ IDNO:9)包括在奈瑟球菌血清组B菌株MC58[26]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的NHBA序列。例如,NHBA(称为蛋白质“287”)的等位基因形式可见参考文献182的图5和15,以及例如文献183的实施例13和图21所示(其中的SEQ ID 3179~3184)。已报道了各种NHBA的免疫原性片段。
本发明所用的优选NHBA抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:9具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:9的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:9的表位。
最有用的NHBA抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:9组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选NHBA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
一种有用的NHBA抗原包含SEQ ID NO:4,其为NHBA和NMB1030的融合物,如BEXSEROTM产品中存在的那样。
NadA(奈瑟菌粘附素A)
NadA抗原作为基因NMB1994包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7227256;本文的SEQ ID NO:10)。迄今已公布了许多菌株的NadA抗原序列,并详细记载了作为奈瑟菌粘附素的蛋白活性。已报道了许多NadA的免疫原性片段。
本发明所用的优选NadA抗原包含以下的氨基酸序列:(a)与SEQ ID NO:10具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:10的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:10的表位。
NadA通常以寡聚如三聚体形式存在于的组合物中[184]。
最有用的NadA抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQID NO:10组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选NadA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO:6是一种此类片段,如BEXSEROTM产品中存在的那样。
fHbp(H因子结合蛋白)
已详细确定了fHbp抗原的特征。其也被称为蛋白‘741’[参考文献183中的SEQ ID 2535和2536]、‘NMB1870’、‘GNA1870’[185,186,207]、‘P2086’、‘LP2086’或‘ORF2086’[187-189]。它是一种天然脂蛋白,在所有脑膜炎球菌血清组中有表达。已经通过NMR确定了fHbp的C-端免疫决定结构域(“fHbpC”)的结构[190]。所述蛋白质的这个部分形成了8-链的β-桶,其链通过不同长度的环相连。桶之前是短α-螺旋和柔性的N-端尾部。
fHbp抗原分为三种不同变体[191]且已发现对给定家族产生的血清对同一家族产生杀细菌活性,但对表达另两个家族之一的菌株无活性,即存在家族内、而非家族间交叉保护。本发明可以使用单个fHbp变体,但是可以有益地包括来自两种或三种变体的fHbp。
当组合物含有一种fHBP变体时,其可包含以下之一:
(a)包含第一氨基酸序列的第一多肽,其中所述第一氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:1有至少a%的序列相同性,和/或(ii)由来自SEQ IDNO:1的至少x个连续氨基酸的片段组成;
(b)包含第二氨基酸序列的第二多肽,其中所述第二氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:2有至少b%的序列相同性,和/或(ii)由来自SEQ IDNO:2的至少y个连续氨基酸的片段组成;
(c)包含第三氨基酸序列的第三多肽,其中所述第三氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:3有至少c%的序列相同性,和/或(ii)由来自SEQ IDNO:3的至少z个连续氨基酸的片段组成。
a的值是至少80,例如,82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。b的值是至少80,例如,82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。c的值是至少80,例如,82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。a、b和c的值可以相同或不同。在一些实施方式中,a、b和c是相同的。
x值为至少7,例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值为至少7,例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z值为至少7,例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z的值可以相同或不同。在一些实施方式中,x、y和z是相同的。
片段优选包含来自相应SEQ ID NO:序列的表位。其他有用片段缺失各SEQ ID NO:的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或各SEQ ID NO:的N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个),而保留其至少一个表位。
在一些实施方式中,来自SEQ ID NO:1的至少x个连续氨基酸的片段不同样存在于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中。类似地,来自SEQ ID NO:2的至少y个连续氨基酸的片段也不同样存在于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中。类似地,来自SEQ ID NO:3的至少z个连续氨基酸的片段也不同样存在于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中。在一些实施方式中,当来自SEQ ID NO:1-3之一的所述片段以连续序列针对其它两条SEQ ID NO对准时,所述片段和各其它两条SEQ IDNO之间的相同性少于75%,例如少于70%,少于65%,少于60%等。
当组合物包含两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原时,其可包含如下组合:(i)如上定义的第一和第二多肽;(ii)如上定义的第一和第三多肽;或(iii)如上定义的第二和第三多肽。优选第一和第三多肽的组合。当一种组合物含有两种不同的脑膜炎球菌fHBP抗原时,虽然它们彼此可以有一些共有序列,但第一、第二和第三多肽具有不同的fHBP氨基酸序列。
包含第一氨基酸序列的多肽在给予对象时,能引起抗体反应,该反应包含的抗体能结合具有原初氨基酸序列SEQ ID NO:20(MC58)的野生型脑膜炎球菌蛋白。在一些实施方式中,这些抗体中的一些或全部不结合至具有原初氨基酸序列SEQ ID NO:21的野生型脑膜炎球菌蛋白或具有原初氨基酸序列SEQ IDNO:22的野生型脑膜炎球菌蛋白。
包含第二氨基酸序列的多肽在给予对象时,能引起抗体反应,该反应包含的抗体能结合具有原初氨基酸序列SEQ ID NO:21(2996)的野生型脑膜炎球菌蛋白。在一些实施方式中,这些抗体中的一些或全部不结合至具有原初氨基酸序列SEQ ID NO:20的野生型脑膜炎球菌蛋白或具有原初氨基酸序列SEQ IDNO:22的野生型脑膜炎球菌蛋白。
包含第三氨基酸序列的多肽在给予对象时,能引起抗体反应,该反应包含的抗体能结合具有原初氨基酸序列SEQ ID NO:22(M1239)的野生型脑膜炎球菌蛋白。在一些实施方式中,这些抗体中的一些或全部不结合至具有原初氨基酸序列SEQ ID NO:20的野生型脑膜炎球菌蛋白或具有原初氨基酸序列SEQ IDNO:21的野生型脑膜炎球菌蛋白。
有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO:1(菌株MC58)具有至少85%的相同性(例如,>95%或100%)。另一个有用的第一氨基酸序列与SEQ ID NO:23(菌株CDC1573)具有至少95%的相同性(例如,>98%或100%)。
有用的第三氨基酸序列与SEQ ID NO:3(菌株M1239)具有至少85%的相同性(例如,>95%或100%)。另一个有用的第三氨基酸序列与SEQ ID NO:25(菌株M98-250771)具有至少95%的相同性(例如,>98%或100%)。
包含基于SEQ ID NO:23和25(或其相近变体)的第一和第三序列的混合物的组合是特别有用的。因此,组合物可包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的多肽。
若组合物包含两种脑膜炎球菌fHBP抗原,则其可以是二价fHBP组合物形式,或可以有多于两种不同的fHBP抗原,即,三价或四价fHBP组合物。
另一种可按照本发明使用的fHbp是在例如参考文献192中公开的经修饰形式中的一种,例如,包含其中的SEQ ID NO:20或23。这些经修饰的形式可以引发抗体应答,其通过识别多重fHbp变体而对脑膜炎球菌具有广泛的杀菌作用。一种所述修饰形式是本文中的SEQ ID NO:28(参考文献192中的SEQ ID NO:23),其可如参考文献193所述融合至非-fHbp序列,例如,以获得SEQ ID NO:19(其包含NMB2091和SEQ ID NO:28的两个拷贝),其被用于下文实施例。
参考文献192的SEQ ID NO:77是另一种有用的fHbp序列,其可用于提供显著的菌株内反应性。
在一些实施方式中,fHBP多肽被脂化,例如在N-末端半胱氨酸处。然而,在其它实施方案中,fHBP多肽不发生脂化。对于脂化fHBP,与半胱氨酸结合的脂类通常包含棕榈酰基,例如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)、N-乙酰基(二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸)等。成熟的脂化的fHBP序列的示例有:SEQ ID NO:24(包括SEQ ID NO:23)和SEQID NO:26(包括SEQ ID NO:25)。若fHbp蛋白位于囊泡中,则其通常会被脂化的。
fHBP的给予优选引发能够结合脑膜炎球菌多肽的抗体,所述脑膜炎球菌多肽由氨基酸序列SEQ ID NO:1、2或3组成。用于本发明的有利fHBP抗原可在施给对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
fHBP多肽的总量通常会在1~500μg/单位剂量,例如,60~200μg/单位。就各fHBP多肽而言,10、20、40、50、60、80、100或200μg/单位剂量的量在人疫苗剂量中是典型的。
当组合物包含不同脑膜炎球菌fHBP抗原时,这些可如上所述以分开的多肽存在(例如,第一和第二多肽),或其可以单一融合多肽的部分存在,即,至少两种(例如,2、3、4、5或更多种)fHBP抗原作为单一多肽链表达,如参考文献194关于脑膜炎球菌抗原公开的那样。最有用地,所述融合多肽可包含上述各第一、第二和第三序列(例如,SEQ ID NO:27)。
HmbR
全长HmbR序列作为基因NMB1668(本文的SEQ ID NO:7)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的公开基因组序列中。参考文献195报道了来自不同菌株的HmbR序列(本文的SEQ ID NO:8),而参考文献196报道了其他的序列(本文的SEQ ID NO:15)。SEQ ID NO:7和8长度差1个氨基酸并且具有94.2%相同性。SEQ ID NO:15比SEQ ID NO:7短一个氨基酸并且它们具有99%相同性(1处插入,7处差异)。本发明可使用任何这种HmbR多肽。
本发明可使用包含HmbR全长序列的多肽,但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些实施方式中,按照本发明使用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO:7具有至少i%序列相同性的氨基酸序列,其中i值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中,按照本发明使用的HmbR序列可包含SEQ ID NO:7的至少j个连续氨基酸的片段,其中j值为7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方式中,按照本发明使用的HmbR序列可包含以下的氨基酸序列:(i)与SEQ IDNO:7具有至少i%序列相同性,和/或(ii)包含SEQ ID NO:7中至少j个连续氨基酸的片段。
j个氨基酸的优选片段包含来自SEQ ID NO:7的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR与血凝素结合的氨基酸,因为与这些表位结合的抗体能够阻断细菌与宿主血凝素结合的能力。HmbR的拓扑学及其关键功能性残基在文献197中有研究。保留跨膜序列的片段是特别有用的,因为它们能够呈现在细菌表面上,例如囊泡中。然而,如果使用可溶性HmbR,则可以使用省略跨膜序列但是通常保留来自胞外部分的表位的序列。
本发明最有用的HmbR抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选HmbR抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
NspA(奈瑟菌表面蛋白A)
NspA抗原作为基因NMB0663包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7225888;本文中的SEQ ID NO:11)。先前文献198和199提到该抗原。之后已公布了来自许多菌株的NspA抗原序列。还报道了许多NspA的免疫原性片段。
本发明所用的优选NspA抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:11具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:11的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:11的表位。
本发明最有用的NspA抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选NspA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
NhhA(奈瑟菌hia同源物)
NhhA抗原作为基因NMB0992包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7226232;本文的SEQ ID NO:12)。自从例如文献182和200已出版了来自许多菌株的NhhA抗原序列,也已报导了许多NhhA的免疫原性片段。它也被称为Hsf。
本发明所用的优选NhhA抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:12具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:12的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:12的表位。
本发明最有用的NhhA抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选NhhA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
App(粘附和渗透蛋白)
App抗原作为基因NMB1985包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7227246;本文的SEQ ID NO:13)。之后已公布了来自许多菌株的App抗原序列。它也被称为“ORF1”和“Hap”。还报道了许多App的免疫原性片段。
本发明所用的优选App多肽包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ ID NO:13具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:13的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:13的表位。
本发明最有用的App抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选App抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
Omp85(85kDa外膜蛋白)
Omp85抗原作为基因NMB0182包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的已公布基因组序列中(GenBank登录号GI:7225401;本文的SEQ ID NO:14)。之后已公布了来自许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可见文献201和202。还报道了许多Omp85的免疫原性片段。
本发明所用的优选Omp抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:14具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:14的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:14的表位。
本发明最有用的Omp85抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选Omp85抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
TbpA
TbpA抗原作为基因NMB0461(GenBank登录号GI:7225687;本文中的SEQID NO:23)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的TbpA序列。还报道了多种TbpA的免疫原性片段。
本发明所用的优选TbpA抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:23具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:23的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:23的表位。
本发明最有用的TbpA抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:23组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选TbpA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
TbpB
TbpB抗原作为基因NMB0460(GenBank登录号GI:7225686;本文中的SEQID NO:24)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的TbpB序列。还报道了多种TbpB的免疫原性片段。
本发明所用的优选TbpB抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:24具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:24的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:24的表位。
本发明最有用的TbpB抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:24组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选TbpB抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
Cu,Zn-超氧化物歧化酶
Cu,Zn-超氧化物歧化酶抗原作为基因NMB1398(GenBank登录号GI:7226637;本文的SEQ ID NO:25)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的Cu,Zn-超氧化物歧化酶序列。还报道了多种Cu,Zn-超氧化物歧化酶的免疫原性片段。
本发明所用的优选Cu,Zn-超氧化物歧化酶抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ ID NO:25具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:25的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:25的表位。
本发明最有用的Cu,Zn-超氧化物歧化酶抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选Cu,Zn-超氧化物歧化酶抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
ZnuD
ZnuD抗原作为基因NMB0964(GenBank登录号GI:15676857;本文中的SEQID NO:29)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[26]的公开基因组序列中。来自多种菌株的ZnuD的序列已在这之后公开,例如,参见参考文献203和204。
本发明所用的优选ZnuD抗原包含某一氨基酸序列,该序列:(a)与SEQ IDNO:29具有50%或更高的相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高);和/或(b)包括SEQ ID NO:29的至少‘n’个连续氨基酸的片段,其中‘n’是7或更多(例如,8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:29的表位。
本发明最有用的ZnuD抗原可引发抗体,其在给予对象后能结合由氨基酸序列SEQ ID NO:29组成的脑膜炎球菌多肽。用于本发明的优选ZnuD抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
脑膜炎球菌囊泡
本发明可采用已知关于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的不同类型的囊泡。
参考文献22公开了来自经修饰以表达六种不同PorA亚型的脑膜炎球菌菌株的囊泡的构建。参考文献205-207报道了对其中fHbp(也称为GN1870)过表达(并且该过表达可与LpxL1的敲除相结合[208])的OMV的临床前研究。参考文献209于近期报道了5种配方的OMV疫苗的临床研究,其中敲除了PorA和FrpB并且过表达Hsf和TbpA。参考文献210报道了从具有灭活的synX、lpxL1和lgtA基因的细菌制备的原初(native)外膜囊泡疫苗。本发明可采用所有此类囊泡。
可从因遗传修饰而过表达所需抗原的脑膜炎球菌制备OMV。除导致感兴趣的抗原过表达的遗传修饰以外,所述细菌可包含一种或多种其它修饰。例如,所述细菌可具有如下一种或多种基因的敲除:lpxL1、lgtB、porA、frpB、synX、lgtA、mltA和/或lst。
通过敲除参与LPS生物合成的酶,可使细菌具有低内毒素水平[211,212]。
细菌可以是任何血清型(例如,1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如,L1;L2;L3;L3,3,7;L10;等)。可以从具有以下亚型之一的菌株有效地制备囊泡:P1.2;P1.2,5;P1.4;P1.5;P1.5,2;P1.5,c;P1.5c,10;P1.7,16;P1.7,16b;P1.7h,4;P1.9;P1.15;P1.9,15;P1.12,13;P1.13;P1.14;P1.21,16;P1.22,14。
细菌可以来自任何合适的谱系,包括高侵袭性和超毒力谱系,例如下列7个超毒力谱系中的任何一个:亚组I、亚组III、亚组IV-1、ET-5复合系、ET-37复合系、A4簇、谱系3。这些谱系通过多位点酶电泳(MLEE)确定,但也使用多位点序列分型(MLST)也已用于对脑膜炎球菌分类[参考文献213],例如ET-37复合系为由MLST所分的ST-11复合系,ET-5复合系为ST-32(ET-5),谱系3为ST-41/44等。
在一些实施方式中,细菌可包含参考文献226和214-216中所述的敲除和/或高表达突变中的一种或多种。适于修饰的基因包括:(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[214];(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB;(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB;和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC。
细菌可具有下述特性中的一种或多种或全部:(i)下调或敲除LgtB和/或GalE,以截短脑膜炎球菌LOS;(ii)TbpA上调;(iii)NhhA上调;(iv)Omp85上调;(v)LbpA上调;(vi)NspA上调;(vii)PorA敲除;(viii)FrpB下调或敲除;(ix)Opa下调或敲除;(x)Opc下调或敲除;(xi)cps基因复合物缺失;(xi)NHBA下调;(xii)NadA上调;(xiii)NHBA和NadA上调;(xiv)fHbp上调;(xv)LpxL1下调。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位,例如,其可以为半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。
如果脂寡糖(LOS)存在于囊泡中,可以对囊泡进行处理,以将其LOS与蛋白质组分连接起来(“内泡”偶联[216])。
囊泡可完全缺少LOS,或它们可能缺少六酰化LOS,例如,囊泡中LOS的每LOS分子二级酰基链数目可有减少[217]。例如,囊泡可以来自具有lpxL1缺失或突变的菌株,其导致产生五酰化的LOS[206,210]。菌株中的LOS可能缺少乳糖-N-新四糖表位,例如,其可以是lst和/或lgtB敲除的菌株[209]。LOS可以缺少至少一种野生型一级O-连接的脂肪酸[218]。LOS具有。所述LOS可以没有α链。LOS可以包含GlcNAc-Hep2磷脂酰乙醇胺-KDO2-脂质A[219]。
作为上述上调的结果,由经修饰的脑膜炎球菌制备的囊泡就包含较高水平的上调的抗原。囊泡中表达的增加(相对于对应的野生型菌株度量)在至少10%时是有益的,以相关抗原的质量/单位质量囊泡计,并且在至少20%、30%、40%、50%、75%、100%或更多时更加有益。
可用于引起抗原上调的合适的重组修饰包括但不限于:(i)启动子替换;(ii)基因添加;(iii)基因替换;或(iv)抑制物敲除。在启动子替换中,控制抗原基因在细菌中的表达的启动子用提供更高表达水平的启动子替换。例如,可用来自管家代谢基因的启动子控制所述基因。在其它实施方式中,所述抗原基因用组成型或诱导型启动子控制。类似地,所述基因可被修饰以确保其表达不经历相变异。参考文献220描述了减少或消除脑膜炎球菌中基因表达相变异性的方法。这些方法包括启动子替换,或可导致基因相变异性的DNA基序的移除或替换。在基因添加中,已经表达抗原的细菌接受相关基因的第二拷贝。第二拷贝可以整合进细菌染色体中或可以在诸如质粒的附加元件上。第二拷贝可具有比原有拷贝更强的启动子。所述基因可用组成型或诱导型启动子控制。基因添加的效果是增加抗原的表达量。在基因替换中,发生基因添加但是伴随着所述基因原有拷贝的缺失。例如,在参考文献207中使用这种方法,其中使细菌的内源染色体fHbp基因缺失并且用质粒编码的拷贝替换(也参见参考文献221)。替换拷贝的表达高于原有拷贝,因此导致上调。在抑制物敲除中,抑制感兴趣的抗原表达的蛋白质被敲除。因此,不会发生所述抑制,并且感兴趣的抗原可以更高水平表达。用于上调基因的启动子可有利地包含CREN[222]。
修饰的菌株一般与其亲本菌株等基因,除了遗传修饰以外。作为修饰的结果,(在相同条件下)感兴趣的抗原在经修饰的菌株中的表达高于在亲本菌株中的表达。典型的修饰将是,用天然中不存在的启动子控制该基因和/或敲除编码抑制物的基因。
在NHBA上调的实施方式中,可采用不同的方法。方便起见,可采用已经报道于参考文献181的方法,即,将NHBA基因引入到IPTG-可诱导型启动子的控制下。通过该方法,NHBA的表达水平可与添加至培养物的IPTG的浓度成比例。所述启动子可包括CREN。
在NadA上调的实施方式中,可采用不同的方法。一种有用的方法涉及使编码NadR的基因(NMB1843)缺失,NadR是转录抑制物蛋白[223],其在所有测试的菌株中下调或抑制编码NadA的基因。NadR的敲除导致NadA的高水平组成型表达。实现NadA上调的替代性的方法是向培养基添加4-羟基苯基乙酸。另一种方法是将NadA基因导入IPTG-诱导型启动子的控制下。
NhhA的上调已经在参考文献209和224中有所报道。TbpA的上调已经在参考文献209、224和225中有所报道。HmbR的上调已在参考文献196中有所报道。TbpB的上调已在参考文献225中有所报道。NspA的上调已在参考文献226中有所报道,其联合porA和cps的敲除。Cu,Zn-超氧化物歧化酶的上调已在参考文献225中有所报道。fHbp的上调已在参考文献205-207和221中有所报道,参考文献227和228则利用不同方法(表达组成型活性突变体FNR)。
在一些实施方式中,使NHBA、NadA和fHbp各自上调。这三种抗原是在参考文献40中公开的“通用疫苗”或“4CMenB”[229,230]的组分。在一个实施方式中,通过强启动子控制NHBA的表达,敲除NadR,并且该菌株表达组成型活性突变体FNR。在另一个实施方式中,通过强启动子控制NHBA的表达,通过强启动子控制fHbp的表达,并且敲除NadR。所述细菌还可以是不表达活性MltA的细菌(GNA33),从而其自发释放包含NHBA、NadA和fHbp的囊泡。理想地,所述细菌并不表达天然LPS,例如,其具有LpxL1的突变或敲除。
囊泡可以包含一个、多与一个或(优选)零个PorA血清亚型。对脑膜炎球菌修饰以提供多-PorA OMV是已知的,例如,参见参考文献22和23。相反,也从例如参考文献209中获知用以去除PorA的修饰。
囊泡可不含PorA和FrpB两者中的一种或两种。优选囊泡不含PorA。
本发明可与不同菌株的囊泡的混合物一起使用。例如,参考文献24公开了含多价脑膜炎球菌囊泡组合物的疫苗,含有第一囊泡和第二囊泡,其中衍生第一囊泡的脑膜炎球菌菌株具有在使用国中有普遍性的血清亚型,衍生第二囊泡的菌株无需具有在使用国中有普遍性的血清亚型。参考文献25也公开了不同囊泡的有用组合。在一些实施方式中,可使用各来自L2和L3免疫型菌株的囊泡组合。
囊泡的其它有用组合公开于参考文献231和232。该类型的三价混合物可包括由如下各物质制备的囊泡:(a)过表达NadA的第一菌株;(b)过表达来自变体1的fHbp序列(即,如上定义的第一fHbp多肽序列)的第二菌株;和(c)过表达来自变体2的fHbp序列(即,如上定义的第二fHbp多肽序列)的第三菌株。这些菌株也可具有其它修饰,例如,敲除synX和LpxL1,如参考文献231中所公开。
附图说明
图1~8显示响应如下物质的血清总IgG:(1)破伤风类毒素;(2)白喉类毒素;(3)百日咳类毒素;(4)百日咳杆菌粘附素;(5)FHA;(6)NadA;(7)NHBA;和(8)fHbp。若图包含图(A)和(B),则(A)中的数据为第35天时,而(B)中的数据为第49天时。所有情况中的y轴刻度是0.01~10,000。
具体实施方式
制备了免疫原组合,包含如下组分:
免疫原 | 量(每0.5ml) | |
T | 破伤风类毒素 | 5Lf |
D | 白喉类毒素 | 2Lf |
aP | 百日咳类毒素,PT-9K/129G | 4μg |
FHA | 4μg | |
百日咳杆菌粘附素 | 8μg | |
MenB | NHBA(SEQ ID NO:4) | 50μg |
NadA(SEQ ID NO:6) | 50μg | |
fHbp(SEQ ID NO:19) | 50μg |
出于比较目的,制备等同组合但不含MenB蛋白。这两种免疫原组合被称为“TdaP-MenB”和“TdaP”。
这两种组合佐以:
(a)氢氧化铝,1mg/剂量(“Al-H”)
(b)氢氧化铝,1mg/剂量,有100μg吸附的‘K2’TLR7激动剂
(c)氢氧化铝,1mg/剂量,有100μg吸附的合成的MPL TLR4激动剂
(d)MF59含鲨烯的水包油乳剂。
就TdaP和TdaP-MenB而言,在组合物(a)~(c)中,所有抗原均吸附至Al-H,尽管在包含MenB免疫原的组合物中百日咳杆菌粘附素不完全吸附。
在这四对组合物有佐剂以外,另有无佐剂的一对。由此共获得10种组合物,(C1)~(C10):
无佐剂 | Al-H | Al-H/K2 | Al-H/MPL | MF59 | |
TdaP | C1 | C2 | C3 | C4 | C5 |
TdaP-MenB | C6 | C7 | C8 | C9 | C10 |
此外,出于比较目的,还测试了BOOSTRIXTM产品(“C11”),其包含(每0.5ml)2.5Lf的白喉类毒素、5Lf破伤风类毒素和18.5μg非细胞百日咳抗原(纯化的PT、FHA和p69百日咳杆菌粘附素的混合物),佐以磷酸铝和氢氧化铝盐的混合物。最后,还制备了不含免疫原的单独缓冲液阴性对照(“C12”)。
在第0、21和35天对雌性Balb/C小鼠(6周龄)以100μl肌肉内剂量(2x50μl)给予这12种组合物。在各剂量之后2周测试血清,并评估针对各8种免疫原的特异性IgG应答(除了仅对C6-C10和C12测试针对3种MenB免疫原的应答)。这些效价如图1-8所示。
图1~5显示第35天(1A~5A)和第49天(1B~5B)的数据,而图6~8仅显示第35天的数据。数据显示,在2或3剂量之后,MenB抗原对于针对白喉、破伤风和非细胞百日咳抗原的IgG应答没有负面影响。此外,包含TLR激动剂和Al-H佐剂促进针对所有抗原的IgG应答。乳剂佐剂还给出优于单独Al-H的结果。然而,在所有情况中,所述佐剂对抗-PT应答没有大的影响。
第二剂量的疫苗(第21天)导致针对所有抗原的IgG应答增加,但第三剂量(第35天)不提供进一步显著的增加。因此,所研究的佐剂提供对于再注射的抗原的更快速应答,其可能在加强时非常有用。
因此,D、T、aP和MenB抗原的混合物提供新型且有效的联合疫苗。
应理解,仅以举例的方式描述了本发明,可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
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Claims (12)
1.一种免疫原性组合物,其包含(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和/或百日咳类毒素中的至少一种,和(c)选自下组的佐剂:(i)铝盐和TLR激动剂的组合,或(ii)水包油乳剂。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,组分(b)包含白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素中的全部三种。
3.如权利要求2所述的组合物,其特征在于,组分(b)包含的白喉类毒素多于破伤风类毒素,以Lf单位计。
4.如权利要求2所述的组合物,其特征在于,组分(b)包含的白喉类毒素少于破伤风类毒素,以Lf单位计。
5.一种免疫原性组合物,其包含:(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原;和(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,其中存在的白喉类毒素相对于破伤风类毒素过量,以Lf单位计。
6.如权利要求5所述的组合物,其包含佐剂。
7.一种免疫原性组合物,其包含:(a)血清组B脑膜炎球菌免疫原;和(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素,其中存在的破伤风类毒素相对于白喉类毒素过量,以Lf单位计。
8.如权利要求7所述的组合物,其包含佐剂。
9.如权利要求6或权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述佐剂包含(i)一种或多种铝盐(ii)TLR激动剂,或(iii)水包油乳剂。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物,其特征在于,所述组合物在组分(a)中包含脑膜炎球菌fHbp蛋白。
11.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述组合物在组分(a)中包含脑膜炎球菌fHbp、NHBA和NadA蛋白。
12.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述fHbp位于脑膜炎球菌囊泡中。
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