KR20130122810A - 백신 제조 방법 - Google Patents

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KR20130122810A
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랄프 레온 비만스
피에르 두비비어
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본원 발명은 카르보디이미드 축합 화학을 이용한 당류-단백질 컨주게이션 반응을 수행하기 위한 개선된 방법을 개시한다. 관련된 당류 또는 담백질 담체의 특성에 따라 달라질 수 있지만, 상기 컨주게이트의 품질은 반응 혼합물에 천천히 반응 성분들 중 어느 한 성분을 첨가함으로써 개선될 수 있다. 본원 발명에 의해 개시된 방법들로 제조된 당류-단백질 컨주게이트를 포함하는 면역원성 조성물이 추가로 제공된다.

Description

백신 제조 방법{PROCESS FOR MANUFACTURING VACCINES}
본원 발명은 카르보디이미드(carbodiimide) 축합 반응을 일으키기 위한 개선된 방법과 관련이 있다. 특히, 본원 발명은 카르보디이미드 축합을 이용한 당류(saccharide) 및 단백질의 컨주게이션과 관련이 있다. 본원 발명은 또한 본원 발명의 상기 당류-단백질 컨주게이트(conjugate)를 포함하도록 제조되는 면역원성 조성물과 관련이 있다.
박테리아 캡슐 다당류의 용도가 세균성 질병의 예방을 위하여 면역학에서 수년 동안 폭넓게 이용되어 왔다. 그러나, 이러한 용도에 수반된 문제는 면역 반응의 T-비의존성 특성에 존재한다. 그러므로 이러한 항원들은 나이가 어린 아동에게서 면역원성이 빈약하게 나타난다. 이러한 문제점은 상기 다당류 항원들을 단백질 담체(T-헬퍼 에피토프의 근원)에 컨주게이션시킴으로써 극복되었는데, 한 예로 심지어 생애 첫해에, T-의존성 면역 반응을 일으키는데 이용될 수 있다.
다양한 컨주게이션 기술이 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다. 컨주게이트는 미국 특허 4365170호(Jennings) 및 4673574호(Anderson)에 소개된 것과 같은 직접 환원 아미노화 방법에 의해 제조될 수 있다. 그 외 방법들은 다음 특허문헌들에 소개되어 있다: EP-0-161-188호, EP-208375호 및 EP-0-477508호. 대안적으로 컨쥬게이션 방법은 시아네이트 에스테르를 형성하기 위해 당류와 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)의 활성화에 의존할 수 있다. 따라서, 활성화된 당류는 담체 단백질 상의 아미노기에 직접적으로 또는 스페이서(링커) 기를 통해 커플링될 수 있다. 예를 들어, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드(ADH 또는 AH)와 커플링되고, 아미노-유도체화(amino-derivatised) 당류는 단백질 담체 상의 카르복시기를 통해 카르보디이미드(예를 들어, EDAC 또는 EDC) 화학(chemistry)을 이용하여 담체 단백질에 컨주게이션된다. 이러한 컨주게이트는 PCT 특허출원 국제 공개공보 WO 93/15760호(Uniformed Service University) 및 WO 95/08348호 및 WO 96/29094호에 소개되어 있다. 또한 추 씨 등의 논문(Chu C. et al., Infect. Immunity, 1983 245 256)을 참조하라.
일반적으로 단백질 담체 상에 존재하는 하기 유형의 화학 기들을 커플링/컨주게이션에 이용할 수 있다:
A) 카르보디이미드 화학적 성질을 이용하여 당류 모이어티(moieties) 상의 천연 또는 유도체화된 아미노기에 컨주게이션될 수 있는, 카르복시기(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산을 통해);
B) 카르보디이미드 화학을 이용하여 당류 모이어티 상의 천연 또는 유도체화된 카르복시기에 컨주게이션될 수 있는, 아미노기(예를 들어, 리신을 통해);
C) 설프히드릴 기(예를 들어, 시스테인을 통해);
D) 히드록시 기(예를 들어, 티로신을 통해);
E) 이미다졸일 기(예를 들어, 히스티딘을 통해);
F) 구아니딜 기(예를 들어, 아르기닌을 통해); 및
G) 인돌일 기(예를 들어, 트립토판을 통해).
당류에서, 일반적으로 다음 기들을 커플링에 이용할 수 있다: OH, COOH 또는 NH2. 알데히드기는 다음과 같은 본원 발명이 속하는 기술분야에 공지된 상이한 처리 후 생성될 수 있다: 과요드산 염, 산 가수분해, 과산화수소 처리 등.
직접 커플링 방법:
당류-OH +CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 +NH2-단백질 ----> 컨주게이트
당류-알데히드 +NH2-단백질 ----> 시프(Schiff) 염기 +NaCNBH3 ----> 컨주게이트
당류-COOH +NH2-단백질 +EDAC ----> 컨주게이트
당류-NH2 +COOH-단백질 +EDAC ----> 컨주게이트
스페이서 (링커)를 통한 간접 커플링 방법:
당류-OH +CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 +NH2----NH2 ----> 당류----NH2 +COOH-단백질 +EDAC -----> 컨주게이트
당류-OH +CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 +NH2-----SH -----> 당류----SH +SH-단백질(노출된 시스테인을 지닌 천연 단백질 또는 예를 들어, SPDP에 의한 단백질의 아미노기의 변형 후에 수득된 단백질) -----> 당류-S-S-단백질
당류-OH +CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 +NH2----SH -------> 당류----SH +말레이미드-단백질(아미노기의 변형) ----> 컨주게이트
당류-COOH +EDAC +NH2-----NH2 ---> 당류------NH2 +EDAC +COOH-단백질 ----> 컨주게이트
당류-COOH +EDAC+NH2----SH -----> 당류----SH +SH-단백질 (노출된 시스테인을 지니는 천연 단백질 또는, 예를들어 SPDP에 의한 단백질의 아미노기의 변형 후에 수득된 단백질) -----> 당류-S-S-단백질
당류-COOH +EDAC+NH2----SH -----> 당류----SH +말레이미드-단백질 (아미노기의 변형) ----> 컨주게이트
당류-알데히드 +NH2-----NH2 ----> 당류---NH2 +EDAC +COOH-단백질 ----> 컨주게이트
관찰할 수 있는 바와 같이, 카르보디이미드 화학(예를 들어, EDAC를 이용)은 천연적으로 존재하거나 유도체화에 의해 용이하게 삽입될 수 있는 당류 및/또는 단백질 상의 기들을 이용하기 때문에 컨주게이션 반응에 매우 편리하다. 또한 상기 카르보디이미드가 펩티드 결합을 통해 용이하게 모이어티들과 연결된다.
카르보디이미드(RN=C=NR')는 알렌 구조를 지닌 불포화 화합물이다(Nakajima 및 Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6:123-130; Hoare 및 Koshland 1967 JBC 242:2447-2453). 상기 화합물은 이의 반응 pH(4.5-6.5)에서 비교적 불안정하고, 그러므로 당류/단백질/카르보디이미드 컨주게이션 반응의 모든 성분들은 본원 발명이 속하는 기술분야에서 다 함께 첨가되는 경향이 있다.
본원 발명의 발명자들은 컨주게이션되는 당류 및 단백질의 특성에 따라 달라지기는 하지만, 상기 반응의 특정 성분을 혼합물(mix)에 천천히 첨가함으로써 백신용 최종 컨주게이트의 더 나은 특성이 획득될 수 있다는 것을 발견하였다.
이러한 작업 중, 다음과 같은 하나 이상의 이점/개선점이 얻어질 수 있다는 것을 깨달을 수 있다: 컨주게이트로 당류 수득율, 컨주게이트의 멸균 여과도, 컨주게이션의 개선된 조절, 더 용이한 재현성(reproducibility), 및/또는 모이어티내(intra-moiety) 교차-결합의 방지.
따라서, 일 구체예에서 카르보디이미드의 축합 화학을 이용하여 당류를 단백질 담체에 컨주게이션시키는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 당류는 아미노 및/또는 카르복시기를 포함하거나(예를 들어, 이의 반복 단위의 일부로서), 아미노 및/또는 카르복시기를 포함하도록 유도체화되며, 여기서 상기 단백질 담체는 아미노 및/또는 카르복시기를 포함하거나, 아미노 및/또는 카르복시기를 포함하도록 유도체화 되는 것을 특징으로 하며, 상기 방법은:
I) - 상기 단백질 담체가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하고, 상기 당류가 아미노기 또는 카르복시기 중 어느 하나를 포함하는 경우:
a) 컨주게이션을 실행하는데 필요한 상기 당류 및 카르보디이미드의 분취액(aliquot)을 혼합하는 단계, 및
b) 필요한 상기 단백질 담체의 분취액을 35초 내지 6시간에 걸쳐 첨가하는 단계를 포함하며;
II) - 상기 당류가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하고, 상기 단백질 담체가 아미노기 또는 카르복시기 중 어느 하나를 포함하는 경우:
a) 컨주게이션을 실행하는데 필요한 상기 당류 및 카르보디이미드의 분취액을 혼합하는 단계, 및
b) 필요한 상기 당류의 분취액을 35초 내지 6시간에 걸쳐 첨가하는 단계를 포함하며;
III) - 상기 당류가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하고, 상기 단백질 담체가 아미노기 또는 카르복시기 둘 모두를 포함하는 경우:
a) 상기 단백질 담체 및 당류를 혼합하는 단계, 및
b) 컨주게이션을 실행하는데 필요한 상기 카르보디이미드의 분취액을 35초 내지 6시간에 걸쳐 첨가하는 단계를 포함한다.
발명의 상세한 설명
수성 매질 중에서 당류 및 단백질을 컨주게이션시킬 수 있는한, 임의의 적당한 카르보디이미드가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 카르보디이미드는 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카르보디이미드)[EDC로도 알려져 있음] 또는 EDAC 이외의 카르보디이미드일 수 있다.
본 명세서 전반에 사용된 용어 "당류"는 다당류 또는 올리고당류를 의미할 수 있고, 둘 모두를 포함할 수 있다. 상기 당류는 리포다당류(LPS) 또는 리포올리고당류(LOS)를 의미할 수 있다. 사용 전에 다당류(예를 들어, 박테리아 다당류)는 (예를 들어, 세균 중의) 공급원 종으로부터 동정되거나 상기 공급원 종으로부터 동정되고 공지된 방법, 예를 들어, 미세유동화(microfluidisation)에 의해 어느 정도 일정 크기로 만들어 질 수 있다(참조예: EP497524 및 EP497525; Shousun Chen Szu 등 - Carbohydrate Research VoI 152 p7-20 (1986)). 다당류는 다당류 샘플에서 점성을 감소시키고/시키거나 컨주게이션된 생성물에 대한 여과도를 개선시키기 위하여 일정 크기를 갖출 수 있다. 올리고당류는 적은 수의 반복 단위(통상적으로, 5-30개의 반복 단위)를 지니고, 통상적으로 가수분해된 다당류이다.
용어 "단백질 담체"는 소형 펩티드 및 거대 폴리펩티드(>10 kDa) 모두를 포괄하기 위한 의도로 사용된다. 분명히 거대 폴리펩티드가 임의의 변형 없이 반응성 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함할 가능성이 더 높다.
본 발명의 목적상, "천연 다당류"는 당류의 크기를 감소시키려는 목적으로 가공되지 않은 당류를 의미한다. 다당류는 일반적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소될 수 있다. 이러한 당류는 여전히 천연 당류이다. 다당류들이 크기 조절 기술을 적용받은 경우에만, 천연 다당류로 간주되지 않는다.
본 발명의 목적상, "2배 이하로 크기가 조절됨"은 상기 당류가 당류의 크기를 감소시키나, 천연 다당류 크기의 반 이상의 크기를 보유하도록 의도된 공정을 거친다는 것을 의미한다. 3배, 4배 등은 동일한 방식, 즉 당류가 다당류의 크기를 감소시키나, 천연 다당류 크기의 1/3 이상, 1/4 이상 등의 크기를 보유하도록 의도된 공정을 거친다는 것으로 해석되어야 한다.
최종 성분의 전체 분취액을 첨가하기 위한 상기 방법의 단계 b)의 시간 35초 내지 6시간은 50초 내지 5시간, 1분 내지 4시간, 2분 내지 3시간, 3분 내지 2시간, 4 내지 60분, 5 내지 50분, 6 내지 40분, 7 내지 30분 또는 8 내지 20분이 될 수 있다. 상기 시간은 1분 내지 5시간, 10분 내지 4시간, 20분 내지 3시간, 30분 내지 2시간, 40 내지 90분, 또는 50 내지 70분일 수 있다. 이러한 시간은 컨주게이션되는 해당 당류 및 단백질에 따라 조정될 수 있다.
일 구체예에서 최종 성분(예를 들어, 카르보디이미드, 당류 또는 단백질)의 분취액이 상기 시간 동안 일정한 속도로 반응 혼합물에 첨가된다(이것은 일정 속도로 작동하는 펌프를 이용하여 간편하게 달성된다). 대안적으로, 상기 시간 전반에 걸쳐 여러 단계로 첨가될 수 있다. 상기 첨가는 다양한 방식으로 행해질 수 있지만, 일반적으로 상기 분취액 중 일부는 상기 시간 내내 첨가되어야 한다. 예를 들어, 상기 분취액의 1/4 이상은 상기 시간 중 첫 번째 절반에 해당하는 시간에 걸쳐 첨가되고, 상기 분취액의 1/4 이상은 상기 시간 중 두 번째 절반에 해당하는 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다. ㎖ 또는 ㎎ 단위로 측정된 상기 분취액의 총량('a')은 상기 시간 전반에 걸쳐 4-100 단계('s')로 첨가될 수 있다. 일 구체예에서 상기 단계들은 균등한 분량(a/s)이 상기 모든 단계들에 첨가되는 방식으로 조정된다. 일 구체예에서 상기 단계들은 시간 'p'(초 단위) 전반에 걸쳐 균등한 시간 간격을 두게 된다. 따라서, 한 단계가 시간 'p'의 0시에 개시되면, 이후 각각의 후속 단계는 p/(s-1)인 시간에 진행될 수 있다. 상기 단계 b)에 첨가되는 최종 성분의 분취액 부피는 상기 요망되는 시간 내에 반응물에 대한 상기 분취액의 첨가의 용이성 측면에서 조정될 수 있다. 카르보디이미드는 수성 용액(일반적으로 반응물에 첨가되기 전에 pH 7.5로 완충됨) 또는 고체 분말(예를 들어, EDAC는 수성 매질에서 용해도가 매우 높음)로 첨가될 수 있다. 물론, 카르보디이미드가 반응물에 첨가되는 마지막 성분이라면(상황 III 단계 b)), 천천히 용해되는 카르보디이미드는 분말의 전체 분취액이 한꺼번에 반응물에 첨가되나 상기 분취액이 반응물로 이용될 수 있게 하기 위해 필요한 시간과 부합되는 속도로 용해되는 방식으로 이용될 수 있다.
단백질 및/또는 당류가 아미노 또는 카르복시기를 지니지 않는 경우 (또는 상기 둘 중 어느 하나만을 갖는 경우), 상기 단백질 및/또는 당류가 상기 아미노기 또는 카르복시기 중 어느 하나를 갖추도록 하기 위하여 (또는 이미 지니고 있는 기 이외의 다른 나머지 기를 갖추도록 하기 위하여) 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 반응성 히드록시기 만을 포함하는 당류의 경우(예를 들어, 수막구균 혈청형 A 캡슐 당류), 이러한 기는 EDAC 축합이 일어날 수 있게 아미노기 또는 카르복시기에 대한 유도체화를 위해 이용되어야 한다. 이것은 반복 소단위체에서 일어날 수 있거나 당류 분자의 말단에 존재하는 기에만 일어날 수 있다.
유도체화가 일어나는 경우, 모이어티을 부분적으로만 유도체화하는 것이 이로울 수 있다는 것을 유념하여야 한다. 반복되는 소단위체를 갖는 당류의 경우, 표적 에피토프는 각각의 반복체에 존재할 수 있다. 그러므로, 부분적인 유도체화가 일어나면(이 경우 사실상 표적화된 반응 기의 0.5-20, 1-15, 3-12, 또는 5-10%가 유도체화된다는 것을 의미함), 이는 대다수의 에피토프를 보존시키며, 너무 과도한 교차-반응성을 방지하는 이점을 가질 수 있다.
당류 또는 단백질이 이미 아미노기 또는 카르복시기 중 어느 한 기만을 지니고 있는 경우라면(예를 들어, 살모넬라 티피(Salmonella typhi)로부터 유래한 Vi 당류는 천연적으로 카르복시기가 지니지만 아미노기는 지니지 않음), 유도체화는 나머지 한 유형의 기를 갖추도록 하기 위해서 일어날 수 있다(즉, Vi의 경우 아미노기). 그러나 유도체화가 부분적일 수 있기 때문에, 이러한 작용은 유형 I로부터 유형 III까지의 본원 발명의 바람직한 반응을 변화시킬 수 있다는 것을 주목해야 한다. 예를 들어, Vi 당류가 아미노 시 및 카르복시기 둘 모두를 포함하는 단백질 담체에 컨주게이션되는 경우, 상황 I은 단계 b)에서 상기 단백질의 분취액을 천천히 첨가하게 된다. 상기 Vi 당류 카르복시가 아미노기와 부분적으로 유도체화되는 경우, 상기 당류는 카르복시기와 아미노기 둘 모두를 지니게 될 것이고, 따라서 상황 III은 단계 b)에서 카르보디이미드의 분취액을 천천히 첨가하는 것이 가장 적절하다.
유도체화는 이종(hetero)- 또는 동종-이작용성(homo-bifunctional) 링커의 부가를 통해 이루어질 수 있다. 유도체화는 당류-단백질 컨주게이션 단계와 관련하여 상기에 기재한 바와 같이 유사한 화학을 이용하여 일어날 수 있다(예를 들어, CDAP 또는 카르보디이미드 화학). 링커는 4개 내지 20개, 4개 내지 12개, 또는 5개 내지 10개의 탄소 원자를 지닐 수 있다. 링커는 또한 2개의 반응성 아미노기, 2개의 반응성 카르복시기, 또는 상기 두 기들 중 어느 하나를 지닐 수 있다(예를 들어, 헥산 디아민, 6-아미노카프로산, 또는 아디프산 디히드라지드). 전형적으로 유도체화는 과량의 링커를 유도체화되어야 하는 당류 및/또는 단백질 담체와 반응시킴으로써 일어나게 된다. 이것은 유도체화가 최소 모이어티내 교차-결합(달리, 예를 들어, 당류 상의 카르복시기가 카르보디이미드 축합을 이용하여 아미노기와 함께 유도체화되는 경우에 가능할 수 있음)과 함께 일어나게 한다. 과량의 링커는 투석여과(diafiltration)와 같은 기술을 이용하여 손쉽게 제거된다.
일 구체예에서 당류는 이의 반복 단위의 일부로 반응성 히드록시기를 포함하는데, 상기 기는 링커 상의 아미노기를 통해 부분적으로 유도체화된다(예를 들어, CDAP 화학을 이용함). 또 다른 구체예에서, 당류는 이의 반복 단위의 일부로 반응성 아미노기를 포함하는데, 상기 기는 링커 상의 카르복시기를 통해 부분적으로 유도체화된다(예를 들어, 카르보디이미드 화학을 이용함). 추가 구체예에서, 당류는 이의 반복단위의 일부로 반응성 카르복시기를 포함하는데, 상기 기는 링커 상의 아미노기를 통해 부분적으로 유도체화된다(예를 들어, 카르보디이미드 화학을 이용함).
컨주게이션을 실행하는데 필요한 카르보디이미드의 분취액이(본원 발명의 반응 단계 a)에 존재하든 단계 b)에 존재하든지 간에) 0.01 내지 3, 0.05 내지 2, 또는 0.09 내지 1(㎎ 카르보디이미드/mg 당류)이다. 이러한 수치들은 EDAC가 카르보디이미드인 경우를 고려하여 계산된 것이지만, 임의의 다른 카르보디이미드가 사용되는 경우, 상기 수치들은 하기 식에 의한 범위 내에서 상기 수치들을 증가시킴으로써 조정될 수 있다: (다른 카르보디이미드의 분자량)/(EDAC의 분자량).
일반적으로, 당류는 본원 발명의 방법의 단계 b)에서 0.5-50mg/ml의 최종 농도로 존재할 수 있다. 상기 농도는 당류의 크기 및 특성, 그리고 유도체화의 정도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 올리고당류의 경우 더 높은 농도가 요구될 것이나, 거대 다당류의 경우 훨씬 더 적은 농도가 보다 적절할 것이다. 부분적으로 유도체화된 아미노기 또는 카르복시기를 지닌 고급 최종산물(high end)이 지향되는 경우라면, 임의의 교차-반응을 줄이기 위해 적은 농도가 적절할 수 있다. 단백질 담체는 단계 b)에서 최종 농도 1-50mg/㎖로 존재할 수 있다.
본원 발명의 방법에서 단백질 담체 대 당류의 최초 비는 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 1:1, 또는 3:1 내지 2:1(w/w)일 수 있다. 게다가 상기 비는 당류의 크기 및 특성, 그리고 유도체화의 정도에 따라 달라질 것이다.
염 조건(예를 들어, NaCl)은 또한 당류/단백질의 특성에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 본원 발명의 방법의 단계 b)에서 약 0.2M NaCl이 존재할 수 있으나, 0-2, 0.1-1 또는 0.2-0.5M일 수 있다.
본원 발명의 방법의 단계 b)의 pH와 관련하여, 반응 pH가 카르보디이미드가 활성화되는 임의의 pH일 수 있다 - 예를 들어, pH 4.5-6.5, 4.7-6.0, 또는 5-5.5. 상기 pH는 일반적으로 필요에 따라 산/염기의 첨가로 반응 전반에 걸쳐 유지된다. 컨주게이션이 더 높은 pH에서 행해질 필요가 있다면, 반응 중간체를 안정하게 유지시키는 것으로 알려진 화합물(예를 들어, N-히드록시숙신이미드)이 반응의 단계 b)에 존재할 수 있으며, 이러한 경우 단계 b)에서의 반응 pH가 pH 4.5-7.5에서 유지될 수 있을지라도, EDAC는 일반적으로 pH 7.5에서 안정적이다.
본원 발명의 방법의 단계 b)가 진행되는 동안의 반응 온도가 4-37, 10- 32, 17-30, 또는 22-27℃일 수 있으며, 일반적으로 반응 전반에 걸쳐 유지된다.
본원 발명의 방법에서, 단계 b)에서 일단 전체 분취액이 첨가되고 나면, 반응은 일반적으로 추가로 10분 내지 72시간, 20분 내지 48시간, 30분 내지 24시간, 40분 내지 12시간, 50분 내지 6시간, 또는 1-3시간 동안 유지된다. 일단 반응이 완료되고 나면, pH는 카르보디이미드의 안정한 pH 범위로의 복귀를 위하여 pH 7.5-9로 조정된다(N-히드록시숙신이미드가 존재하는 경우, 상기 pH가 최고로 좋은 결과를 초래함).
일단 컨주게이션되면, 당류-단백질 컨주게이트는 다음으로부터 정제될 수 있다: 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, Sephacryl S400HR, Pharmacia)에 상기 컨주게이트를 주입함으로써 반응하지 않은 성분들, 유리 당류, 등. 상기 정제는 일반적으로 2-8℃에서 수행된다. 컨주게이트는 멸균 여과되고 난 후 저장될 수 있다. 궁극적으로 당류-단백질 컨주게이트의 유효한 용량(예를 들어, 1-20, 2-15, 또는 3-10㎍ 당류/용량)은 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하기 위하여 약제학적으로 허용되는 부형제(예를 들어, 염 또는 애주번트)와 함께 제형화될 수 있다.
본원 발명의 당류와 관련하여, 바이러스, 곰팡이, 박테리아 또는 진핵생물 기원의 임의의 당류가 본원 발명의 방법을 이용하여 컨주게이션될 수 있다. 상기 당류는 살모넬라 티피(Salmonella typhi)유래의 Vi 당류 또는 Vi 이외의 당류일 수 있다. 상기 당류는 헤모필루스 인플루엔자(H. influenza) b형으로부터의 캡슐 당류 Hib, 또는 Hib 이외의 당류일 수 있다. 일 구체예에서 당류는 예를 들어, 나이세리아 메닌지티디스(N. meningitidis) 혈청형 A(MenA), B(MenB), C(MenC), W135(MenW) 또는 Y(MenY), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococus pneumoniae) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 또는 33F, 그룹 B 스트렙토코커스 군 Ia, Ib, II, III, IV, V, Vl, 또는 VII, 스태필로코커스 아우레우스(Stapylococus aureus) 제5형, 스태필로코커스 아우레우스 제8형, 살모넬라 티피(Vi 당류), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 또는 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae) b형으로 구성된 목록으로부터 선택된 박테리아로부터 유래된, 박테리아 캡슐 당류이다.
당류의 중량-평균 분자량(weight-average molecular weight)은 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000, 또는 100000-200000일 수 있다. 본원의 당류의 분자량 또는 평균 분자량은 컨주게이션 이전에 측정된 당류의 중량-평균 분자량(Mw)이고 MALLS에 의해 측정된다. MALLS 기술은 본원 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지되어 있고 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행된다. 당류의 MALLS 분석에 있어서, 2개의 컬럼(TSKG6000 및 5000PWxI)을 병용하여 사용할 수 있으며 당류는 물로 용출된다. 당류는 광 산란 검출기(예를 들어, 488nm에서 1OmW 아르곤 레이저를 장착한 Wyatt Dawn DSP) 및 인페로메터(inferometric) 굴절계(예를 들어, 498nm에서 P100 셀 및 적색 필터를 장착한 Wyatt Otilab DSP)를 이용하여 검출된다. 일 구체에에서, 당류의 다분산성(polydispersity)은 1-1.5, 1-1.3, 1-1.2, 1-1.1 또는 1-1.05이고, 담체 단백질에 컨주게이션 후, 컨주게이트의 다분산성은 1.0-2.5, 1.0-2.0. 1.0-1.5, 1.0-1.2, 1.5-2.5, 1.7-2.2 또는 1.5-2.0이 된다. 모든 다분산 측정은 MALLS에 의해 행해진다.
당류는 천연 다당류이거나 단지 2, 4, 6, 8, 10 또는 20배의 인자로(예를 들어, 미세유동화[예: 이멀시플렉스(Emulsiflex) C-50 기기에 의해] 또는 그 외 다른 공지된 기술[예를 들어, 열, 화학, 산화, 초음파 처리 방법]에 의해) 크기 조절될 수 있다. 올리고당류는 실질적으로 더 일정한 크기로 만들어질 수 있다[예를 들어, 공지된 열, 화학, 또는 산화 방법에 의해].
이러한 당류들 대부분의 구조는 공지되어 있고 그러므로 이러한 당류가 카르보디이미드 화학을 위한 임의의 아미노기 또는 카르복시기를 천연적으로 지니거나, 아미노기 또는 카르복시기로 유도체화될 수 있는 임의의 다른 반응성 기를 지닌다(하기 표를 참조하라).
Figure pat00001
당류는 예를 들어, N. 메닌지티디스, H. 인플루엔자, 대장균(E. coli), 살모넬라 또는 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)로 구성된 목록으로부터 선택된 박테리아에서 유래한 박테리아 지질다당류, 또는 지질다당류(상기 표를 참조바람)일 수 있다. LOS는 수막구균 면역형 L2, L3 또는 L10일 수 있다. 상기 LOS는 이의 지질 A 모이어티에 대한 알칼리 처리로 무독화될 수 있다.
일 구체예에서, MenA 캡슐 당류는 적어도 부분적으로 O-아세틸화되는데, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위가 하나 이상의 위치에서 O-아세틸화된다. O-아세틸화는, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위의 O-3 위치에 존재한다. 일 구체예에서, MenC 캡슐 당류는 적어도 부분적으로 O-아세틸화되는데, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 (α2→9)-연결된 NeuNAc 반복 단위가 하나 또는 두개 이상의 위치에서 O-아세틸화된다. O-아세틸화는, 예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위의 O-7 및/또는 O-8 위치에 존재한다. 일 구체예에서, MenW 캡슐 당류는 적어도 부분적으로 O-아세틸화되는데, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위가 하나 또는 두개 이상의 위치에서 O-아세틸화된다. O-아세틸화는, 예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위의 O-7 및/또는 O-9 위치에 존재한다. 일 구체예에서, MenY 캡슐 당류는 적어도 부분적으로 O-아세틸화되는데, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위가 하나 또는 두개 이상의 위치에서 O-아세틸화된다. O-아세틸화는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 반복 단위의 7 및/또는 9 위치에 존재한다. O-아세틸화의 비율은 O-아세틸화를 함유하는 반복 단위의 비율을 의미한다. 이는 컨주게이션 이전 및/또는 컨주게이션 이후에 당류에서 측정될 수 있다.
단백질 담체는 임의의 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 상기 담체는 하나 이상의 T-헬퍼 에피토프를 포함할 수 있다. 본원 발명의 일 구체예에서, 상기 단백질 담체는 TT, DT, CRM197, TT의 단편 C, H. 인플루엔자의 단백질 D, 폐렴구균 PhtD, 및 폐렴구균 뉴모리신(Pneumolysin)으로 구성된 군에서 선택된다. 담체 단백질은 파상풍 독소(TT), 파상풍 독소 단편 C, 파상풍 독소의 비독성 돌연변이체[이러한 TT의 모든 변이체들은 본원 발명의 목적상 동일한 유형의 담체 단백질로 간주됨], 디프테리아 독소(DT), CRM197, 디프테리아 독소의 그 외 비독성 돌연변이체[예를 들어, CRM176, CRM197, CRM228, CRM45(Uchida et al ., J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 니콜(Nicholls) 및 율(Youle)의 논문[Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기술된 그 외 돌연변이; Glu-148의 결실 또는 이의 Asp, Gln 또는 Ser으로의 돌연변이 및/또는 Ala 158의 결실 또는 이의 Gly로의 돌연변이 및 US 4709017호 또는 US 4950740호에 기술된 그 외 돌연변이; Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534 중 하나 이상의 잔기의 돌연변이 및 US 5917017호 또는 US 6455673호에 기술된 그 외 돌연변이; 또는 US 5843711에 기술된 단편](이러한 DT의 모든 변이체는 본원 발명의 목적상 동일한 유형의 담체 단백질로 간주됨), 폐렴구균 뉴몰리신(Kuo et al. (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC(수막구균 외막 단백질 - 보통 N. 메닌지티디스 혈청군 B로부터 추출됨 - EP0372501), 합성 펩티드(EP0378881, EP0427347), 열충격 단백질(WO 93/17712, WO 94/03208), 백일해 단백질(WO 98/58668, EP0471177), 사이토카인, 림포카인, 성장인자 또는 호르몬(WO 91/01146), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다수의 인간 CD4+T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질(Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), 예를 들어, N19 단백질(Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7), 폐렴구균 표면 단백질 PspA(WO 02/091998), 철 흡수 단백질(WO 01/72337), 클로스트리듐 디피실레(C. difficile)의 독소 A 또는 B(WO 00/61761), H. 인플루엔자 단백질 D(EP594610 및 WO 00/56360), 폐렴구균 PhtA(WO 98/18930, Sp36으로도 알려져 있음), 폐렴구균 PhtD (WO 00/37105에 소개되어 있고, SpO36D로도 알려져 있음), 폐렴구균 PhtB(WO 00/37105에 소개되어 있고, SpO36B로도 알려져 있음), 또는 PhtE(WO00/30299에 개시되어 있고 BVH-3로 알려져 있음)일 수 있다.
본원 발명의 추가 양상에서, 본원 발명의 방법으로 획득될 수 있거나 획득되는 당류-단백질 담체 컨주게이트(또는 면역원성 조성물 또는 백신)가 제공된다.
질병의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에서 본원 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도 및 이것이 요구되는 환자에게 본원 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 유효한 용량으로 투여하는 단계를 포함하는 질병의 예방 또는 치료 방법이 추가로 제공된다. 상기 용도 또는 방법은 N. 메닌지티디스, 스트렙토코커스 뉴모니애, M. 카타르할리스, 그룹 B 스트렙토코커스, 스태필로코커스 아우레우스, 살모넬라 티피, 비브리오 콜레라, 대장균(E. coli), 및 H. 인플루엔자로 이루어진 목록에서 선택된 박테리아에 의해 유발된 질병에 관한 것일 수 있다.
본원 발명의 면역원성 조성물은 또한 DTPa 또는 DTPw 백신(예를 들어, DT 및 TT를 함유하는 백신, 및 전체 세포 백일해(Pw) 백신 또는 무세포 백일해(Pa) 백신(예를 들어, 백일해 독소, FHA, 퍼탁틴 및 선택적으로 어글루티노긴 2 및 3을 포함하는 백신))을 포함할 수 있다. 이러한 조합물은 또한 B형 간염에 대한 백신을 포함할 수 있다(예를 들어, 상기 백신은 선택적으로 알루미늄 포스페이트 상에 흡착된 B형 간염 표면 항원[HepB]을 포함할 수 있다). 일 구체예에서, 본원 발명의 면역원성 조성물은 Hib, MenA 및 MenC 당류 컨주게이트, 또는 Hib 및 MenC 당류 컨주게이트, 또는 Hib, MenC 및 MenY 당류 컨주게이트, 또는 MenA, MenC, MenW 및 MenY 당류 컨주게이트를 포함하는데, 적어도 하나, 둘 또는 모든 당류 컨주게이트들이 본원 발명의 방법에 따라 제조된다.
본원 발명의 면역원성 조성물은 선택적으로 홍역 및/또는 유행성 이하선염(mump) 및/또는 풍진 및/또는 수두에 의해 유발된 질병에 대한 보호를 부여하는 추가 바이러스 항원들을 포함한다. 예를 들어, 본원 발명의 면역원성 조성물은 홍역, 유행성 이하선염 및 풍진(MMR) 또는 홍역, 유행성 이하선염, 풍진 및 수두(MMRV)로부터의 항원들을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 바이러스 항원들은 선택적으로 조성물내에 존재하는 수막구균 및/또는 Hib 당류 컨주게이트(들)로서 동일 용기내에 존재한다. 일 구체예에서, 이러한 바이러스 항원들은 동결건조된다.
일 구체예에서, 본원 발명의 면역원성 조성물은 N. 메닌지티디스 혈청형 B로부터의 항원을 추가로 포함한다. 항원은 선택적으로 EP301992호, WO 01/09350호, WO 04/14417호, WO 04/14418호 및 WO 04/14419호에 기술된 것과 같은 N. 메닌지티디스 혈청형 B로부터의 외막 소포 제조물이다.
일반적으로, 본원 발명의 면역원성 조성물은 각각의 당류 컨주게이트 용량 중에 0.1 내지 20㎍, 2 내지 10㎍, 2 내지 6㎍ 또는 4 내지 7㎍의 당류를 포함할 수 있다.
"대략" 및 "약"은 본원 발명의 목적상 해당 수치의 10% 이상 또는 이하로 정의된다.
일 구체예에서, 본원 발명의 면역원성 조성물은 pH 7.0 내지 8.0, pH 7.2 내지 7.6 또는 대략 또는 정확히 pH 7.4로 조정되거나, 완충된다.
본원 발명의 면역원성 조성물 또는 백신은 안정제, 예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스와 같은 폴리올의 존재하에서 선택적으로 동결건조된다.
선택적으로, 본원 발명의 면역원성 조성물 또는 백신은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키는데 충분한 양의 애쥬번트를 함유한다. 적절한 애쥬번트는 타카하시 등의 논문[Takahashi et al., (1990) Nature 344:873-875]에 기재된 것과 같이 알루미늄염(알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 무라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 미코박테리아 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 소단위체, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 면역자극 복합체 (ISCOMs)를 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
N. 메닌지티디스 또는 HibMen 조합물에 대해서는, 임의의 알루미늄염 애쥬번트 또는 임의의 애쥬번트를 사용하지 않는 것이 이로울 수 있다.
모든 면역원성 조성물 또는 백신과 마찬가지로, 면역학적으로 유효한 양의 면역원은 경험적으로 결정되어야 한다. 고려되어야 할 요소들은, 면역원이 애쥬번트 또는 담체 단백질 또는 기타 담체와 복합체를 형성하게 되거나 이에 공유적으로 부착되든지 그렇지 않든지 간에, 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 회수를 포함한다.
활성제는 본원 발명의 약제 조성물 또는 백신 내에 다양한 농도로 존재할 수 있다. 통상적으로, 상기 물질의 최소 농도는 이의 의도된 용도를 달성하기 위해 필요한 양인 반면, 최대 농도는 용액 내에 잔류하게 되거나 최초 혼합물 내에 균질하게 현탁될 최대량이다. 예를 들어, 치료제의 최소량은 임의로 치료학적으로 유효한 단일 용량을 제공하게 될 양이다. 생활성(Bioactive) 물질에 대해서는, 최소 농도는 재구성후 생활성에 필요한 양이고, 최대 농도는 균질한 현탁액이 유지될 수 없는 시점에서의 농도이다. 단일 투여 단위에 있어서, 상기 량은 단일 치료 적용을 위한 양이다. 일반적으로, 각각의 용량은 1-100㎍, 임의로 5-50㎍ 또는 5-25㎍의 단백질 항원을 포함할 것으로 예상된다. 예를 들어, 박테리아 당류의 용량은 컨주게이트 내에서 10-20㎍, 5-10㎍, 2.5-5㎍ 또는 1-2.5㎍의 당류이다.
본원 발명의 백신 제조물은 전신 또는 점막 경로를 통해 상기 백신을 투여함으로써, 감염에 민감한 포유동물(예를 들어, 인간 환자)을 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 인간 환자는 선택적으로 영아(12개월 미만), 유아(12-24, 12-16 또는 12-14 개월), 아동(2-10, 3-8 또는 3-5세), 청년(12-20, 14-20 또는 15-19세) 또는 성인이다. 이러한 투여는 근내, 복막내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 경구/식사, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있다. 폐렴 또는 중이염의 치료를 위한 백신의 비내 투여가 바람직하다(폐렴구균의 비강인두 이동은 보다 효과적으로 예방될 수 있으며, 따라서 감염의 가장 초기 단계에서 상기 감염을 약화시킬 수 있음). 본원 발명의 백신은 단일 용량으로 투여될 수 있으나, 이의 성분들은 또한 동시에 또는 상이한 시간에 모두 함께 동시투여(co-administration)될 수 있다(예를 들어, 당류가 백신에 존재하는 경우, 서로에 대한 면역 반응의 최적 협동을 위해 동시에 또는 세균 단백질 백신의 투여 후 1-2주 경과시 따로따로 투여될 수 있음). 단일 경로의 투여 외에, 2개의 상이한 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 항원은 ID(피내) 투여될 수 있는 반면, 세균 단백질은 IM(근내) 또는 IN(비내) 투여될 수 있다. 당류가 존재하는 경우, 이들은 IM(또는 ID) 투여될 수 있고, 세균 단백질은 IN(또는 ID) 투여될 수 있다. 또한, 본원 발명의 백신은 프라이밍 용량에 대해 IM 투여 및 부스터 용량에 대해 IN 투여될 수 있다.
백신 제조는 일반적으로 백신 디자인[Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기술되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화는 미국 특허문헌[Fullerton, US Patent 4,235,877]에 기술되어 있다.
본원 발명의 추가 양상은 본원 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하기 위한 공정과 관련이 있는데, 상기 공정은 본원 발명의 방법으로 제조된 MenA 및 MenC 당류를 본원 발명에 따라 제조되지 아니한 MenW 및 MenY, 및 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하는 단계를 포함한다.
본원의 용어 "포함하는", "~를 포함하다" 및 "~들을 포함하다"는 선택적으로 모든 경우에서 각각 용어 "구성되는", "~로 구성되다" 및 "~들로 구성되다"로 대용될 수 있다.
본 특허 명세서에 인용된 모든 참고문헌 또는 특허 출원은 참조로서 본원에 포함된다.
본원 발명은 하기 실시예로 예시된다. 하기 실시예들은 달리 상세하게 기술되는 경우를 제외하고는 본원 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있거나 통상적인 표준 기술을 이용하여 수행된다. 실시예는 단지 예시이며, 본원 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 - 다당류 컨주게이트의 제조
실시예 1a - 본원 발명에 따른 수막구균성 MenA 및 MenC 캡슐 다당류 컨주게이트의 제조
천연 다당류(MALLS로 측정시 150kDa 이상)를 이용하여 MenC-TT 컨쥬게이트를 생산하거나, 상기 컨주게이트를 약간 미세유동화시켰다. 천연 다당류 또는 실시예 2의 MALLS 방법으로 측정시 60kDa을 초과하는 약간 미세유동화된 다당류를 이용하여 MenA-TT 컨쥬게이트를 생산하였다. 균질화기인 이멀시플렉스 C-50 기기를 이용한 미세유동화로 크기 조절을 수행하였다. 이후, 다당류를 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
스페이서를 통해 MenA 캡슐 다당류를 파상풍 독소에 컨쥬게이팅시키기 위해, 하기 방법을 이용하였다. 다당류와 스페이서(ADH)의 공유 결합을 다당류가 조절된 조건하에서 시아닐화 작용제인 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화되는 커플링 화학작용에 의해 수행하였다. 스페이서를 이의 히드라지노기를 통해 시아닐화된 PS와 반응시켜, 스페이서와 다당류 사이에 안정한 이소우레아 연결을 형성시켰다.
10mg/㎖의 MenA 용액(pH 6.0)[3.5g]을 사용 직전에 제조한 아세토니트릴/물(50/50(v/v)) 중의 100mg/㎖의 CDAP 용액으로 처리하여, CDAP/MenA 비가 0.75(w/w)인 용액을 제조하였다. 1.5분 후, pH를 pH 10.0으로 상승시켰다. 3분 후, ADH를 첨가하여 ADH/MenA 비가 8.9에 도달되게 하였다. 용액의 pH를 8.75로 감소시키고, 상기 pH를 유지시키면서 2시간 동안 상기 반응을 진행시켰다(온도를 25℃로 유지함).
PSAAH 용액을 초기 부피의 1/4로 농축하고 그런 다음 1OkDa의 컷-오프를 지니는 필트론 오메가 멤브레인(Filtron Omega membrane)을 이용하여 30부피의 0.2M NaCl과 함께 투석여과하고, 농축물(retentate)을 여과하였다.
컨주게이션(카르보디이미드 축합) 반응 전에, 정제된 TT 용액 및 PSAAH 용액을 희석시켜, 농도가 PSAAH의 경우 10mg/㎖ 및 TT의 경우 10mg/㎖에 도달되게 하였다.
EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카르보디이미드)를 PSAH 용액(2g의 당류)에 첨가하여, 최종비 0.9(mg EDAC/mg PSAAH)인 용액을 제조하였다. pH를 5.0으로 조정하였다. 액체이송펌프(peristalitic pump)를 사용하여 정제된 파상풍 독소를 첨가하여(60분 이내) 비가 2(mg TT/mg PSAAH)에 도달되게 하였다. 120분의 최종 커플링 시간을 얻기 위하여 생성된 용액을 교반하에서 +25℃에서 60분 동안 방치하였다. 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 첨가하여(최종 부피의 1/10) 상기 용액을 중화시키고 +25℃에서 30분간 방치한 다음 +2℃ 내지 +8℃에서 밤새 방치하였다.
10㎛ 필터를 이용하여 컨쥬게이트를 여과시키고, 세파크릴 S400HR 컬럼 (Pharmacia, Sweden)을 이용하여 정제하였다. 컬럼을 10mM Tris-HCl(pH 7.0) 중에서 평형화시키고, 0.075M NaCl 및 컨쥬게이트(약 660mL)를 컬럼에 로딩시켰다(+2℃ 내지 +8℃). 용출물(Elution pool)을 280nm의 광학 밀도 함수에 따라 선별하였다. 흡광도가 0.05까지 증가하였을 때, 수집을 시작하였다. Kd가 0.30에 도달할 때까지 수집을 지속하였다. 컨쥬게이트를 +20℃에서 여과 멸균시킨 후, +2℃ 내지 +8℃에서 보관하였다. 획득된 컨쥬게이트는 1:2-1:4(w/w)의 다당류:단백질 비를 지녔다.
MenC 캡슐 다당류를 스페이서를 통해 파상풍 독소로 컨쥬게이팅시키기 위해, 하기 방법을 이용하였다. 다당류와 스페이서(ADH)의 공유 결합을 조절되는 조건하에서 다당류가 시아닐화 작용제인 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화되는 커플링 화학에 의해 수행하였다. 스페이서는 이의 히드라지노기를 통해 시아닐화된 PS와 반응하여, 스페이서와 다당류 사이에 안정한 이소우레아 결합을 형성시킨다.
20mg/㎖의 MenC 용액(pH 6.0)(3.5 g)을 사용 직전에 제조한 아세토니트릴/물(50/50(v/v)) 중의 100mg/㎖의 CDAP 용액으로 처리하여 CDAP/MenC 비가 1.5(w/w)인 용액을 제조하였다. 1.5분 후, pH를 pH 10.0으로 상승시켰다. 활성화 pH에서 2M NaCl의 최종 농도에 도달시키기 위해 5M NaCl을 첨가하였다. 3분 후, ADH를 첨가하여 ADH/MenC 비가 8.9에 도달되게 하였다. 용액의 pH를 8.75로 감소시키고, 2시간 동안 반응을 진행시켰다(25℃에서 유지).
PSCAH 용액을 최소 150㎖로 농축시킨 후, 10kDa의 컷오프를 지니는 필트론 오메가 멤브레인을 이용하여 30부피의 0.2M NaCl과 함께 투석여과시키고, 농축물을 여과시켰다.
컨쥬게이션 반응 전, 정제된 TT 용액 및 PSCAH 용액(2g 규모)을 0.2M NaCl 중에 희석시켜, 농도가 PSCAH의 경우 15mg/㎖ 및 TT의 경우 20mg/㎖에 도달되게 하였다.
정제된 파상풍 독소를 PSCAH 용액에 첨가하여 비가 2(mg TT/mg PSCAH)에 도달되게 하였다. pH를 5.0으로 조정하였다. 액체이송펌프를 이용하여 EDAC(Tris 0.1M(pH 7.5) 중 16.7mg/ml)를 첨가하여(10분 이내) 최종비 0.5(mg EDAC/mg PSCAH)인 용액을 제조하였다. 120분의 최종 커플링 시간을 얻기 위해 상기 용액을 교반 및 pH 조절하에서 +25℃에서 110분 동안 방치하였다. 이후, 1M Tris-HCl(pH 9.0)(최종 부피의 1/10)을 첨가하여 용액을 중화시키고, +25℃에서 30분, 이후 +2℃ 내지 +8℃에서 밤새 방치시켰다.
10㎛ 필터를 이용하여 컨쥬게이트를 여과시키고, 세파크릴 S400HR 컬럼(Pharmacia, Sweden)을 이용하여 정제하였다. 컬럼을 10mM Tris-HCl(pH 7.0) 중에서 평형화시키고, 0.075M NaCl 및 컨쥬게이트(약 460㎖)를 컬럼에 로딩시켰다(+2℃ 내지 +8℃). 280nm에서의 광학 밀도 함수에 따라 용출물을 선별하였다. 흡광도가 0.05로 상승하였을 때, 수집을 시작하였다. Kd가 0.20에 도달할 때까지 수집을 지속하였다. 컨쥬게이트를 +20℃에서 여과 멸균시킨 후, +2℃ 내지 +8℃에서 보관하였다. 생성된 컨쥬게이트는 1:2-1:4(w/w)의 다당류:단백질 비를 지녔다.
10-45분에 걸쳐 EDAC를 부가하는 다양한 실험들이 진행되었다 - 각각의 실험에서 우수한 품질의 MenC 컨주게이트가 획득되었다. 그러나, MenC-ADH +EDAC 혼합물에 TT 담체를 제일 나중에 천천히 첨가시키면, 이것은 정제불가능한 겔-컨주게이트의 생성을 초래하였다.
한꺼번에 EDAC를 반응에 첨가하는 실험들이 또한 진행되었으나 컨주게이트의 최종 TT/PS 비(2.771)(w/w)는 EDAC가 10분에 걸쳐 첨가되는 반응을 통해 획득된 컨주게이트보다 낮았다(3.3/1); 더욱이 αTT 및 αPS 항원성 둘 모두는 EDAC가 10분에 걸쳐 첨가되는 반응에 의해 제조된 컨주게이트에 대해 측정된 것보다 낮았다.
다당류 MenCAH의 대략적인 유도체화율(%)에 주목하라: CDAP를 ADH로 처리한후 약 3.47%의 히드록시기가 ADH로 유도체화되었다(반복 소단위체 당 가용한 히드록시 기가 2개인 것으로 평가됨). MenA의 경우: 약 11.5%의 히드록시기가 ADH로 유도체화되었다(반복 소단위체 당 가용한 히드록시 기가 단지 1개 존재하는 것으로 생각됨).
실시예 1b - 폐렴구균 캡슐 PS 3 다당류 컨주게이트의 제조
1) PS03 - TT AH 공정: PS03 - TT AH 208
이멀시플렉스에 의한 크기조절
이론적인 수분 함량 10%에 근거하여 PS의 무게를 쟀다. 천연 PS를 초기 농도 3㎎/㎖로 2M NaCl 중에서 밤새 용해시켰다. 크기조절 전에, 천연 PS 용액을 5㎛ 컷-오프 필터로 정제하였다.
균질화기 이멀시플렉스 C-50 기기를 사용하여 활성화 단계 전에 다당류의 분자량 및 점도를 감소시켰다. 크기조절의 효율은 주위(circuit) 압력, 플런저 부양 압력(plunger alimentation pressure) 및 총 순환주기(cycles) 횟수에 따라 좌우된다. 크기조절 효율을 개선하기 위하여(그리고 결과적으로 총 순환주기 수를 감소시기기 위하여), 이멀시플렉스의 균질화 셀을 고정형 지오메트리(Microfluidics F20Y-0.75㎛ 상호작용 챔버)로 교체하였다. 크기조절의 목적은 PS 항원성의 중대한 감소없이 이의 분자량 및 점도를 감소시키는 것이었다.
크기 감소는 6000 ± 500프사이(psi)에서 실행되었고 이어서 점도 측정에 의하여 인-프로세스(in - process)로 실행되었다. 크기조절은 목표값 2.0 ± 0.2cp에 도달되었을 때 중단되었다.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 크기조절된 PS 의 여과
크기조절된 PS를 10㎖/분의 유속으로 밀리팩(Millipak) 40멤브레인(컷-오프 0.22㎜) 상에서 여과하였다.
TT 유도체화
유도체화 단계를 T°조절 수조(waterbath) 내에서 연속 스터링 하에 25℃에서 진행하였다. TT를 NaCl 0.2M로 희석하여 최종 TT 농도 25㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 고체 형태의 ADH를 상기 TT 용액에 첨가하여 최종 농도 0.2M의 용액을 수득하였다. ADH 용해가 완료된 후, 용액의 pH를 HCl로 pH 6.2+/- 0.1로 조정하였다. 그런 다음 EDAC를 TT/ADH 용액에 첨가하여 최종 농도 0.02M의 용액을 수득하였다. pH를 HCl로 pH 6.2+/-0.1로 조정하고 1시간 동안 pH 조절하에서 유지하였다. 유도체화 단계 후, pH를 NaOH로 pH 9.5까지 상승시키고 반응을 멈추었다. 투석여과 단계 전에 용액을 pH 조절하에서 2시간 동안 두었다.
투석여과
반응하지 않은 ADH 및 EDAC 부산물을 제거하기 위하여 TTAH 유도체를 투석여과시켰다. 투석여과를 센트라메이트(centramate) 멤브레인(0.09㎡, 10kDa 컷오프)을 통해 실시하였다. 용액을 20부피의 0.2M NaCl에 대하여 투석시켰다. 투석여과 단계의 후속 단계로서 5, 10, 15 및 20 부피의 투석여과 후 여과액(permeate) 중에 ADH(TNBS 검정)에 대한 정량을 실시하였다.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 여과
TTAH를 최종적으로 10㎖/분의 유속으로 0.22㎛ 컷-오프 멤브레인(Millipack 40)을 통해 여과시켰다. 그런 다음 여과된 TTAH를 -70℃에서 보관하였다.
PS3 - TT AH 컨주게이트
제조공정의 조건들은 다음과 같다:
2M NaCl 중에셔 2㎎/㎖의 초기 PS3 농도, 1.5/1(w/w)의 초기 TTAH/PS3 비, 0.5㎎/㎎ PS의 EDAC 농도, 및 0.15M NaCl 중에서 10㎎/㎖의 TT 농도.
PS3 50㎎을 2M NaCl 중에서 용해시켜 최종 PS 농도 2㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 정제된 TTAH 용액을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 농도 10㎎/㎖의 용액을 수득하였다.
PS3 용액의 pH를 HCl로 pH 5로 조정하였다.
고체 형태의 EDAC를 상기 PS3 용액에 첨가하여 최종 농도 0.5㎎ EDAC/㎎ PS의 용액을 수득하였다. HCl로 pH를 pH 5.0 ± 0.05로 조정하고, 수작업으로 TTAH를 11분(분취액/분) 내에 첨가하였다. 그 결과 획득된 용액을 스터링 및 pH 조절과 함께 +25℃에서 109분 동안 인큐베이션하여 최종 커플링 시간 120분을 획득하였다. 그런 다음 1M Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 상기 용액을 중화시키고 +25℃에서 30분간 두었다.
컨주게이트를 최종적으로 5㎛ 멤브레인을 통해 정제하고 세파크릴(Sephacryl) S400HR 컬럼에 주입하였다.
2) PS03 - TT AH 제조공정 : PS03 AH - TT215
이멀시플렉스에 의한 크기조절
상기와 동일.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 크기조절된 PS 의 여과
상기와 동일.
PS3 유도체화
유도체화 단계를 T°조절 수조(waterbath) 내에서 연속 스터링 하에 25℃에서 진행하였다. PS3를 NaCl 0.2M 중에서 희석하여 최종 PS3 농도 3㎎/㎖의 용액을 수득하였다. CDAP(0.25㎎ CDAP/㎎ PS, 아세토니트릴/ WFI 혼합물 중에서 100㎎/㎖로 용해시킴)의 첨가 전에 상기 PS 용액의 pH를 pH 6.0으로 조정하였다. ADH(8.9㎎ ADH/㎎ PS, 0.2M NaCl 중에서 100㎎/㎖로 용해시킴)의 첨가 전에 NaOH로 상기 pH를 pH 9.5로 상승시켰다. 상기 pH를 9.5로 유지하고 60분간 조절하였다. 유도체화의 비율은 2.4%(2.4㎎ ADH/100㎎ PS)에 상당하였다. 공지된 기술을 이용하여 상기 비율을 측정할 수 있다: ADH 측정에 관한 TNBS; 및 PS 정량에 관한 DMAB 또는 레조르시놀(resorcinol)(Monsigny et al., (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530).
본원 발명의 경우에, TNBS 1회용량(dosage)은 228㎍/㎖이었고 PS 1회용량은 5250㎍/㎖이었다. ADH의 Mw를 174.2, 및 PS3의 반복 단위의 Mw를 338.27(1개의 COOH 및 4개 OH기를 지님)로 가정하면, 1.3μmoles의 ADH/15.52μmole의 반복단위, 또는 1.3μmoles의 ADH/62.08μmoles의 반응성 히드록시기가 존재한다. 2.09%의 PS3 히드록시기가 ADH 변형 히드록시 기에 해당하였다.
투석여과
반응하지 않은 ADH 및 CDAP 부산물을 제거하기 위하여 PS3AH 유도체를 투석여과하였다. 투석여과를 UFP-30-C-H24LA 멤브레인(42㎠, 30kDa 컷오프)을 통해 실시하였다. 용액을 20부피의 0.2M NaCl에 대하여 투석시켰다. 투석여과 단계의 후속 단계로서 5, 10, 15 및 20 부피의 투석여과 후 여과액 중에 ADH(TNBS 검정)에 대한 정량을 실시하였다.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 여과
PSAH를 최종적으로 10㎖/분의 유속으로 0.22㎛ 컷-오프 멤브레인(Millipack 40)을 통해 여과시켰다. 그런 다음 여과된 PS3AH를 4℃에서 보관하였다.
PS3 AH - TT 컨주게이트
제조공정의 조건들은 다음과 같다:
2M NaCl 중에서 2㎎/㎖의 초기 PS3 농도, 1.5/1(w/w)의 초기 TTAH/PS3AH 비, 0.5㎎/㎎ PS의 EDAC 농도, 및 0.15M NaCl 중에서 10㎎/㎖의 TT 농도.
PS3AH 50㎎을 2M NaCl 중에서 용해시켜 최종 PS 농도 2㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 정제된 TT 용액을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 농도 10㎎/㎖의 용액을 수득하였다.
PS3AH 용액의 pH를 HCl로 pH 5로 조정하였다.
고체 형태의 EDAC를 상기 PS3 용액에 첨가하여 최종 농도 0.5㎎ EDAC/㎎ PS의 용액을 수득하였다. pH를 HCl로 pH 5.0 ± 0.05로 조정하고, TT를 액체이송펌프를 이용하여 10분내에 첨가하였다. 그 결과 획득된 용액을 스터링 및 pH 조절과 함께 +25℃에서 110분 동안 인큐베이션하여 최종 커플링 시간 120분을 획득하였다. 그런 다음 1M Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 상기 용액을 중화시키고 +25℃에서 30분간 두었다. 컨주게이트를 최종적으로 5㎛ 멤브레인을 통해 정제하고 세파크릴 S400HR 컬럼에 주입하였다.
3) PS03 AH - TT 제조공정 : PS3 AH - TT217
이멀시플렉스에 의한 크기조절
상기와 동일.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 크기조절된 PS 의 여과
상기와 동일.
PS3 유도체화
215 컨주게이트의 경우 적용됨.
투석여과
215 컨주게이트의 경우 적용됨.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 여과
215 컨주게이트의 경우 적용됨.
PS3 AH - TT 컨주게이트
제조공정의 조건들은 다음과 같다:
2M NaCl 중에서 2㎎/㎖의 초기 PS3 농도, 1.5/1(w/w)의 초기 TT/PS3AH 비, 0.5㎎/㎎ PS의 EDAC 농도, 및 0.15M NaCl 중에서 10㎎/㎖의 TT 농도.
PS3AH 50㎎을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 최종 PS 농도 2㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 정제된 TT 용액을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 농도 10㎎/㎖의 용액을 수득하였다.
PS3AH 용액 및 TT 용액을 섞고 pH를 HCl로 pH 5로 조정하였다.
EDAC를 1M Tris(pH7.5) 완충용액 중에서 용해시켰다. 40㎕의 EDAC를 매분마다 첨가하였다(EDAC/PS 비(0.5㎎ EDAC/㎎ PS)에 도달하는데 10분). 그 결과 획득된 용액을 스터링 및 pH 조절과 함께 +25℃에서 110분 동안 인큐베이션하여 최종 커플링 시간 120분을 획득하였다. 그런 다음 1M Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 상기 용액을 중화시키고 +25℃에서 30분간 방치하였다. 컨주게이트를 최종적으로 5㎛ 멤브레인을 통해 정제하고 세파크릴 S400HR 컬럼에 주입하였다.
4) PS03 AH - TT 제조공정 : PS3 AH - TT218
이멀시플렉스에 의한 크기조절
상기와 동일.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 크기조절된 PS 의 여과
상기와 동일.
PS3 유도체화
유도체화 단계를 T°조절 수조 내에서 연속 스터링과 더불어 25℃에서 진행하였다. PS3를 NaCl 2M 중에서 희석하여 최종 PS 농도 3㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 고체 형태의 EDAC를 첨가하여 EDAC/PS 비가 0.1(㎎ EDAC/㎎ PS)인 용액을 수득하였다. 용해가 완료된 후, 용액의 pH를 pH 5로 조정하였다. 그런 다음 ADH(8.9㎎ ADH/㎎ PS, 0.2M NaCl 중에서 100㎎/㎖로 용해시킴)를 액체이송펌프를 이용하여 44분내에 첨가하였다(이와 같이 ADH가 과도한 양으로 존재하는 경우라 할지라도, 직접적인 첨가도 괜찮을 수도 있다). pH를 pH 5.0+/-0.1로 유지하고 120분(44' +76') 동안 조절하였다. 수산화나트륨을 이용하여 pH를 pH 7.5로 증가시킴으로써 반응을 멈추었다. 유도체화의 비율은 3.7%(㎎ ADH/㎎ PS)에 상당하였다. TNBS 1회용량은 220㎍/㎖이었고 PS 1회용량은 5902㎍/㎖이었기 때문에, 1.26μmoles의 ADH/17.44μmoles의 반복 단위(=반응성 COOH 기의 μmoles)이다. 따라서, 7.22%의 PS3 카르복시기가 ADH 변형된 COOH 기에 해당하였다.
투석여과
반응하지 않은 ADH 및 EDAC 부산물을 제거하기 위하여 PS3AH 유도체를 투석여과하였다. 투석여과를 UFP-30-C-H24LA 멤브레인(42㎠, 30kDa 컷오프)을 통해 실시하였다. 용액을 23부피의 0.2M NaCl에 대하여 투석시켰다. 투석여과 단계의 후속 단계로서 5, 10, 15 및 20 부피의 투석여과 후 여과액 중에 ADH(TNBS 검정)에 대한 정량을 실시하였다.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 여과
PSAH를 최종적으로 10㎖/분의 유속으로 0.22㎛ 컷-오프 멤브레인(Millipack 40)을 통해 여과시켰다. 그런 다음 여과된 PS3AH를 4℃에서 보관하였다.
PS3 AH - TT 컨주게이트
제조공정의 조건들은 다음과 같다:
2M NaCl 중에서 2㎎/㎖의 초기 PS3AH 농도, 1.5/1(w/w)의 초기 TT/PS3AH 비, 0.5㎎/㎎ PS의 EDAC 농도, 및 0.15M NaCl 중에서 10㎎/㎖의 TT 농도.
PS3AH 50㎎을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 최종 PS 농도 2㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 정제된 TT 용액을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 농도 10㎎/㎖의 용액을 수득하였다.
PS3AH 용액 및 TT 용액을 함께 섞었다.
pH를 HCl로 pH 5.0 ± 0.05로 조정하고, 수작업으로 EDAC를 10분내에 첨가하였다(매분마다 동일한 분량의 부분-분취액(part-aliquotes)을 첨가하였음). 그 결과 획득된 용액을 스터링 및 pH 조절과 더불어 +25℃에서 110분 동안 인큐베이션하여 최종 커플링 시간 120분을 획득하였다. 그런 다음 1M Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 상기 용액을 중화시키고 +25℃에서 30분간 두었다. 컨주게이트를 최종적으로 5㎛ 멤브레인을 통해 정제시키고 세파크릴 S400HR 컬럼에 주입하였다.
결론:
컨주게이션 단계에서 카르보디이미드 화학을 이용하여 상이한 컨주게이트를 제조하였다. 단백질 또는 EDAC 시약 중 어느 한 성분이 반응 용액에 첨가되는 마지막 성분이 될 수 있다. 첨가 시간은 그 결과 획득된 컨주게이트에 영향을 미칠 수 있다.
PS3 AH TT215 & 217 컨주게이트:
동일한 성분들 및 조건들이 상기 두 컨주게이트를 제조하는데 이용되었다. 마지막 성분을 첨가하는 방법은 서로 달랐다. PS3AHTT217 컨주게이트는 시험관내 조건 기준을 충족시키는 생성물을 생성시켰다. 이러한 생성물 중 하나는 10분이내의 EDAC 첨가로 만들어졌다.
그러나 PS3AHTT215 컨주게이트는 정제 멤브레인을 통해 여과될 수 없었다. 이러한 컨주게이트의 경우, 반응 매체에 첨가된 마지막 성분은 TT이었다(10분 이내). 최종 TT/PS 비는 두 컨주게이트에서 매우 상이하였다(0.98/1 대 0.50/1). EDAC가 먼저 PSAH(반응성 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 지님)에 첨가되면, 이것은 히드라진과 다당류 상에 존재하는 카르복시기의 교차-결합을 야기할 수 있으며, 따라서 10분 이내의 TT 첨가 후 더 낮은 최종 비를 지닌 보다 더 교차-결합된 컨주게이트의 생성을 초래할 수 있다.
이러한 효과는 PS3AHTT217 컨주게이트에서 관찰되지 아니한다. TT 통합은 10분내의 EDAC 첨가에 의해 더 잘 이루어지는데, 이는 아마도 더 적은 내부(intra) 교차-결합, 및 PS3AH의 히드라진 기 및 단백질의 카르복시기 사이의 더 나은 상호(inter) 교차-결합에 기인할 것이다.
218 컨주게이트의 경우에, PS3 EDAC 유도체화가 유일하게 부분적으로 다당류를 유도체화함에 따라(대다수의 다당류 에피토프를 온전하게 보존하기 위하여), 다시 반응성 아미노기 및 카르복시기 둘 모두가 존재하게 되고, 이러한 이유로, 최종 컨주게이션 단계에서 EDAC의 느린 첨가가 또한 이롭다.
최종 컨주게이션 단계에서 느린 TT 첨가가 208 컨주게이트에서 이로운데 (그러나), 상기 컨주게이트의 경우, TT가 ADH 유도체화 되었으며(그리고 아미노기 및 카르복시기를 포함함), 반면 PS3는 이의 반복 소단위체의 모이어티으로서 이의 천연 반응성 -OH 및 -COOH 기들을 그대로 보유하였다. PS3에 대한 EDAC의 첨가는 상기 교차-결합 효과를 지니지 아니하였고, 유도체화된 TT의 느린 첨가는 우수한 시험관애 특성을 지닌 컨주게이트를 생성시켰다 - 하기 표 참조.
시험관내 특성결정:
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
* 208 컨주게이트와 대비한 값
실시예 1c - 본원 발명의 S. 티피 Vi 다당류 컨주게이트의 제조
이멀시플렉스에 의한 크기 조절
이론적인 수분 함량 10%에 근거하여 PS의 무게를 쟀다. 천연 PS를 초기 농도 7㎎/㎖로 WFI 중에서 밤새 용해시켰다. 크기조절 전에, 천연 PS 용액을 50㎖/분의 유속으로 10㎛ 컷-오프 필터를 통해 정제하였다.
균질화기 이멀시플렉스 C-50 기기를 사용하여 활성화 단계 전에 다당류의 분자량 및 점도를 감소시켰다. 크기 조절의 효율은 주위 압력, 플런저 부양 압력 및 총 순환주기 횟수에 좌우된다. 크기 조절 효율을 개선하기 위하여(그리고 결과적으로 총 순환주기 횟수를 감소시키기 위하여), 이멀시플렉스의 균질화 셀을 고정형 지오메트리(Microfluidics F20Y-0.75㎛ 상호작용 챔버)로 교체하였다. 크기조절의 목적은 PS 항원성의 중대한 감소없이 이의 분자량 및 점도를 감소시키는 것이었다.
크기 감소는 15000 ± 500프사이(psi)에서 실행되었고 이어서 점도 측정에 의한 인-프로세스(in - process)로 실행되었다. 크기 조절은 목표값 5.0 ± 0.3cp에 도달될 때 중단되었다.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 크기조절된 PS 의 여과
크기조절된 PS를 10㎖/분의 유속으로 밀리팩 40 멤브레인(컷-오프 0.22㎜)을 통해 여과하였다. 여과된 크기 조절된 PS를 -20℃에 보관하였다.
다당류 Vi 의 유도체화
1.5g의 크기 조절된 Vi PS를 교반하면서 25℃에서 EPI 중에 용해시켰다(5㎎/㎖). 13.35g의 ADH(8.9mg ADH/mg PS)를 상기 PS 용액에 첨가하였다. 용해 완료 후 1N HCl로 pH를 pH 5.0 ± 0.05로 조정하였다. 고체 형태의 EDAC(0.1mg/mg PS)를 첨가하였다. 용액을 25℃에서 60분간 두었다. 이후 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 첨가하여 용액을 중화시키고 25℃에서 30분 이상(최대 2시간) 방치하였다. 유도체화 수준을 TNBS 1회용량(mg ADH/100mg PS)을 이용하여 4.55%로 평가하였다. TNBS 1회용량은 200㎍/㎖이었고 PS 1회용량은 4034㎍/㎖이었다; 따라서 0.0697μmoles의 ADH/16.46μmoles의 반복 단위(Mw 245)이다. 1.3μmoles의 ADH/16.46μmoles의 Vi 상의 반응성 COOH기이므로, 7%의 Vi COOH기가 ADH 변형된 COOH기에 해당하였다.
투석여과
반응하지 않은 DH 및 EDAC 부산물을 제거하기 위하여 PSViAH 유도체를 투석여과하였다. 센트라메이트 멤브레인(0.09㎡, 10kDa 컷오프)을 통해 투석여과를 실시하였다. 용액을 20부피의 0.2M NaCl에 대하여 투석시켰다. 투석여과 단계의 후속 단계로서 3, 5, 10 및 20 부피의 투석여과 후 여과액 중에 ADH(TNBS 검정)에 대한 정량을 실시하였다.
0.22㎛ 컷- 오프 멤브레인을 통한 여과
PSViAH를 최종적으로 10㎖/분의 유속으로 0.22㎛ 컷-오프 멤브레인(Millipack 40)을 통해 여과시켰다. 여과된 PSViAH를 +2/+8℃에서 최대 4일간 보관하였다.
PSVi AH - TT 컨주게이트
제조공정의 조건들은 다음과 같다:
0.2M NaCl 중에서 2㎎/㎖의 초기 PSViAH 농도, 2.5/1(w/w)의 초기 TT/PSViAH 비, 0.25㎎/㎎ PS의 EDAC 농도, 및 0.2M NaCl 중에서 10㎎/㎖의 TT 농도.
PSViAH 1g을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 최종 PS 농도 2㎎/㎖의 용액을 수득하였다. 정제된 TT 용액을 0.2M NaCl 중에서 용해시켜 농도가 10㎎/㎖인 용액을 제조하였다.
TT를 상기 PSViAH 용액에 첨가하여 최종 비 2.5(mg TT/mg PS)인 용액을 제조하였다(우론산 1회용량). 1N HCl로 pH를 pH 5.0 ± 0.05로 조정하였다. EDAC 용액(0.1M Tris(pH 7.5) 중에서 7.5㎎/㎖)을 첨가하여(액체이송펌프로 10분이내) 비가 0.25(㎎ EDAC/㎎ PSViAH)인 용액을 제조하였다. 그 결과 획득된 용액을 스터링 및 pH 조절과 더불어 +25℃에서 50분간 인큐베이션하여 최종 커플링 시간 60분을 획득하였다. 그런 다음 1M Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 상기 용액을 중화시키고 +25℃에서 30분간 방치하였다. 컨주게이트를 4℃로 옮기고 크로마토그래피 단계 전에 느린 속도로 지속적인 스터링하에 밤새 방치하였다.
정제
세파크릴 S400HR을 통한 용리 전에, 10㎛ 클린팩(Kleenpak) 필터를 이용하여 컨주게이트를 정제하였다. 유속은 100㎖/분으로 고정시켰다. 이후 컨주게이트를 세파크릴 S400HR에 주입하고 용출물(pool) 수집을 Kd 값에 근거하여 실행하였다. 용출물 수집에 다음 기준을 적용하였다: 280nm에서 OD = 0.05 일때, 수집을 개시하고, Kd = 0.22 일때 종료하였다.
멸균 여과
여과 전에, 상기 용출물을 실온으로 가져왔다. 이후 컨주게이트를 옵티캡(Opticap) 4" 멸균 멤브레인을 통해 여과시켰다. 유속은 30㎖/분으로 고정시켰다.
분석 결과
그 결과 획득된 컨주게이트는 2.44/1의 최종 TT/PS 비(w/w), 3.7%의 유리(free) PS 함량 및 58%의 αPS/αPS 항원성을 지녔다.
실시예 1d - 다른 다당류 컨주게이트의 제조
헤모필루스 인플루엔자(Hib) PRP 다당류의 TT로의 공유 결합을 추(Chu) 등에 의해 개발된 커플링 화학(Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256)에 의해 실행하였다. CNBr을 첨가하고 6분 동안 pH 10.5에서 인큐베이팅시킴으로써 Hib PRP 다당류를 활성화시켰다. pH를 pH 8.5로 낮추고, 아디프산 디히드라지드(ADH)를 첨가하고, 추가로 90분 동안 인큐베이션을 지속하였다. 활성화된 PRP를 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카르보디이미드(EDAC)를 이용한 카르보디이미드 축합을 통해 정제된 파상풍 독소에 커플링시켰다. EDAC를 활성화된 PRP에 첨가하여 최종 비가 0.6(EDAC mg/활성화된 PRP mg)인 용액을 수득하였다. pH를 5.0으로 조정하고, 정제된 파상풍 독소를 첨가하여 TT/PRP 비가 2(mg TT/mg 활성화된 PRP)인 용액을 제조하였다. 수득한 용액을 유순한 교반하에서 3일 동안 방치하였다. 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과시킨 후, 컨쥬게이트를 0.2M NaCl로 평형화된 세파크릴 S500HR(Pharmacia, Sweden) 컬럼을 통해 정제하였다.
천연 다당류(MALLS로 측정시 150kDa 이상)를 이용하여 MenC-TT 컨쥬게이트를 생성시키거나, 상기 컨주게이트를 약간 미세유동화시켰다. 천연 다당류 또는 실시예 2의 MALLS 방법으로 측정시 60kDa을 초과하는 약간 미세유동화된 다당류를 이용하여 MenA-TT 컨쥬게이트를 생성시켰다. MALLS로 측정시 약 100-200kDa으로 크기 조절된 다당류를 이용하여 MenW 및 MenY-TT 컨쥬게이트를 생성시켰다(실시예 2 참조). 크기 조절은 균질화기인 이멀시플렉스 C-50 기기를 이용하는 미세유동화에 의해 실행되었다. 이후, 다당류를 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
PCT 국제공개공보 WO96/29094호 및 WO 00/56360호에 기술된 바와 같이 활성화 및 직접 커플링을 수행하였다. 간략히 요약하면, 2M NaCl(pH 5.5-6.0) 중에서 10-20㎎/㎖ 농도의 다당류를 CDAP 용액(아세토니트릴/WFI(50/50) 중에서 사용전에 곧바로 제조된 100㎎/㎖)과 함께 섞어 CDAP/다당류 비가 0.75/1 또는 1.5/1인 용액을 제조하였다. 1.5분 후, 수산화나트륨을 이용하여 pH를 pH 10.0으로 상승시켰다. 3분 후, 파상풍 독소를 첨가하여 MenW의 경우 1.5/1, MenY의 경우 1.2/1, MenA의 경우 1.5/1 또는 MenC의 경우 1.5/1의 단백질/다당류 비를 갖는 용액을 제조하였다. 상기 반응을 1 내지 2시간 동안 지속시켰다.
커플링 단계 후, 글리신/PS(w/w)의 최종 비가 7.5/1에 도달되게 글리신을 첨가하였으며, pH를 pH 9.0으로 조정하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 방치시켰다. 컨쥬게이트를 10㎛ 클린팩 필터를 이용하여 정제한 후, 150mM NaCl, 10mM 또는 5mM Tris(pH 7.5)의 용리 완충용액을 이용하는 세파크릴 S400HR 컬럼에 로딩시켰다. 임상 로트(lot)를 옵티캡 4 멸균 멤브레인을 통해 여과시켰다. 그 결과 획득된 컨쥬게이트는 1:1-1:5(w/w)의 평균 다당류:단백질 비를 가졌다.
실시예 2 - MALLS 를 이용한 분자량의 결정
검출기를 샘플이 용리되는 HPLC 크기 배제 컬럼에 커플링시켰다. 한편으로, 레이저 광 분산 검출기는 거대분자 용액에 의해 16°로 분산된 광 강도를 측정하였고, 다른 한편으로 작동중인 간섭 굴절계는 용리되는 샘플에 대한 정량을 가능케 하였다. 이러한 강도로부터, 용액 내의 거대분자의 크기 및 형태가 결정될 수 있다.
중량 내의 평균 분자량(Mw)은 모든 종의 중량의 합계를 이들의 각각의 분자량으로 곱하고, 이를 모든 종의 중량의 합계로 나눈 것으로 정의된다.
a) 중량-평균 분자량: -Mw-
Figure pat00006
b) 수-평균 분자량: -Mn-
Figure pat00007
c) 제곱평균제곱근 반지름: -Rw-, R2w는 하기와 같이 정의되는 반지름의 제곱이다:
Figure pat00008
(-mi-는 산란중심(scattering centre) i의 질량이고, -ri-는 산란 중심 i와 거대분자의 무게중심(center of gravity) 사이의 거리이다)
d) 다분산성은 -Mw / Mn- 비로 정의된다.
수막구균 다당류를 조합되어 사용되는 두개의 HPLC 컬럼(TSKG6000 및 5000PWxl)에 로딩하여 MALLS로 분석하였다. 25㎕의 다당류를 컬럼에 로딩시키고, 0.75㎖의 여과된 물로 용리시켰다. 광 분산 검출기(488nm의 10mW 아르곤 레이저가 장착된 Wyatt Dawn DSP) 및 간섭 굴절계(P100 셀 및 498nm의 적색 필터가 장착된 Wyatt Otilab DSP)를 이용하여 다당류를 검출하였다.
분자량 다분산성 및 모든 샘플의 회수를 아스트라(Astra) 4.72 소프트웨어에서 1의 다항 컨주게이션 차수(polynominal fit order)를 이용한 디바이 방법 (Debye method)으로 계산하였다.
실시예 3 - MenACWY 컨쥬게이트 백신에서 MenA 내의 링커의 효과를 평가하는 임상 시험
MenACWY 백신의 상이한 제형의 단일 용량을 1:1:1:1:1의 무작위화 시험으로 15-19세의 10대 25명으로 구성된 피검체 5개 군에 투여하였다. 시험된 제형은 다음과 같다:
F1 - AH(ADH) 스페이서를 함유하는 MenA 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 5/5/5/5㎍
F2 - AH 스페이서(실시예 1에 따라 제조됨)를 함유하는 MenA 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 2.5/5/2.5/2.5㎍
F3 - AH 스페이서(실시예 1에 따라 제조됨)를 함유하는 MenA 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 5/5/2.5/2.5㎍
F4 - 임의의 컨쥬게이트에 스페이서를 지니지 않는 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 5/5/5/5㎍
대조군 - 멘세백스(MencevaxTM) ACWY
접종 30일 후에, 환자로부터 혈액 샘플을 채취하였다.
혈액 샘플을 백신 투여 1개월 후에 SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW135 및 SBA-MenY 반응자의 비율을 평가하는데 사용하였다. 백신 반응을, 1) 최초에 혈청음성반응인 피검체의 경우 - 예방접종 1개월 후 항체 역가가 1/32 이상(≥1/32)의 항체 역가, 또는 2) 최초에 혈청양성반응인 피검의 경우 - 예방접종전 항체 역가의 4배 이상(≥4)의 항체 역가로 정의하였다.
결과
하기 표에 나타난 바와 같이, MenA 컨쥬게이트에서의 스페이서의 이용은 MenA에 대한 면역 반응을 증가시켰다. AH 스페이서가 부가되는 경우 반응자의 비율이 66%에서 90-95%로 상승하였다. 이는 SBA GMT에서 4335로부터 10000으로의 증가 및 GMC에서 5로부터 20-40으로의 증가로 반영되었다. 놀랍게도, AH 스페이서의 사용은 또한 반응자의 비율의 증가 및 SBA GMT에서의 증가에 의해 알 수 있듯이 MenC에 대한 면역 반응을 증가시켰다. 증가는 또한 스페이서가 도입되는 경우 MenY(6742-7122) 및 MenW(4621-5418)에 대해, SBA-GMT에서도 관찰할 수 있었다.
Figure pat00009
실시예 4 - MenACWY 컨쥬게이트 백신에서의 MenA 및 MenC 컨쥬게이트 내의 링커의 효과를 평가하는 임상 시험
MenACWY 백신의 상이한 제형의 단일 용량을 1:1:1:1:1 무작위화 시험으로 15-19세의 10대로 구성된 25명의 피검체 5개 군에 투여하였다. 시험된 제형은 다음과 같다:
F1 - AH 스페이서(실시예 1에 따라 제조됨)를 함유하는 MenA 및 MenC 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 2.5/2.5/2.5/2.5㎍
F2 - AH 스페이서(실시예 1에 따라 제조됨)를 함유하는 MenA 및 MenC 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 5/5/2.5/2.5㎍
F3 - AH 스페이서(실시예 1에 따라 제조됨)를 함유하는 MenA 및 MenC 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 5/5/5/5㎍
F4 - AH 스페이서(실시예 1에 따라 제조됨)를 함유하는 MenA 컨쥬게이트와 함께 파상풍 독소에 컨쥬게이팅된 MenACWY - 5/5/5/5㎍
대조군 - 멘세백스 ACWY
접종 30일 후에, 환자로부터 혈액 샘플을 채취하였다.
혈액 샘플을 백신 투여 1개월 후에 SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW135 및 SBA-MenY 반응자의 비율을 평가하는데 사용하였다. 백신 반응자를, 1) 최초에 혈청음성반응인 피검체의 경우 - 예방접종 1개월 후 항체 역가가 1/32 이상(≥1/32)의 항체 역가, 또는 2) 최초에 혈청양성반응인 피검체 경우 - 예방접종전 항체 역가의 4배 이상(≥4)의 항체 역가로 정의하였다.
결과
MenC 컨쥬게이트로의 AH 스페이서의 도입은 하기 표에 나타난 바와 같이 MenC에 대한 면역 반응을 증가시켰다. 이는 SBA GMT에서 1943으로부터 4329로의 증가 및 항-PSC GMC에서 7.65로부터 13.13으로의 증가에 의해 입증된다. MenA, MenW 및 MenY에 대한 우수한 면역 반응이 유지되었다.
Figure pat00010

Claims (48)

  1. 카르보디이미드의 축합 화학을 이용하여 당류를 단백질 담체에 컨주게이션시키는 방법으로서,
    여기서 상기 당류는 아미노기 및/또는 카르복시기를 포함하거나(예를 들어, 이의 반복 단위의 일부로서), 아미노기 및/또는 카르복시기를 포함하도록 유도체화되며,
    상기 단백질 담체는 아미노기 및/또는 카르복시기를 포함하거나, 아미노 및/또는 카르복시기를 포함하도록 유도체화되며,
    I) - 상기 단백질 담체가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하고, 상기 당류가 아미노기 또는 카르복시기 중 어느 하나를 포함하는 경우:
    a) 컨주게이션을 일으키는데 필요한 상기 당류 및 카르보디이미드의 분취액(aliquot)을 혼합하는 단계, 및
    b) 필요한 상기 단백질 담체의 분취액을 35초 내지 6시간에 걸쳐 첨가하는 단계를 포함하며;
    II) - 상기 당류가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하고, 상기 단백질 담체가 아미노기 또는 카르복시기 중 어느 하나를 포함하는 경우:
    a) 컨주게이션을 일으키는데 필요한 상기 당류 및 카르보디이미드의 분취액을 혼합하는 단계, 및
    b) 필요한 상기 당류의 분취액을 35초 내지 6시간에 걸쳐 첨가하는 단계를 포함하며;
    III) - 상기 당류가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하고, 상기 단백질 담체가 아미노기 및 카르복시기 둘 모두를 포함하는 경우:
    a) 상기 단백질 담체 및 당류를 혼합하는 단계, 및
    b) 컨주게이션을 일으키는데 필요한 상기 카르보디이미드의 분취액을 35초 내지 6시간에 걸쳐 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서 상기 첨가 시간이 50초 내지 5시간, 1분 내지 4시간, 2분 내지 3시간, 3분 내지 2시간, 4분 내지 60분, 5분 내지 50분, 6분 내지 40분, 7분 내지 30분 또는 8분 내지 20분임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서 상기 첨가 시간이 1분 내지 5시간, 10분 내지 4시간, 20분 내지 3시간, 30분 내지 2시간, 40분 내지 90분, 또는 50분 내지 70분임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카르보디이미드가 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카르보디이미드) 또는 EDAC 이외의 카르보디이미드임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨주게이션을 일으키는데 필요한 카르보디이미드의 분취액이 0.01 내지 3(㎎ 카르보디이미드/㎎ 당류), 0.05 내지 2(㎎ 카르보디이미드/㎎ 당류) 또는 0.09 내지 1(㎎ 카르보디이미드/㎎ 당류)임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류 및/또는 단백질 담체가 아미노기 또는 카르복시기를 포함하도록 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유도체화는 이종이작용성(hetero-bifunctional 또는 동종이작용성(homo-bifunctional) 링커를 통해 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 링커가 4개 내지 12개의 탄소원자를 지님을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 링커가 2개의 반응성 아미노기를 지님을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 상기 링커가 ADH임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  11. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 링커가 2개의 반응성 카르복시산 기를 지님을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 링커가 한쪽 말단에 반응성 아미노기를 지니고 다른 쪽 말단에 반응성 카르복시산 기를 지님을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도체화가 과량의 링커와 유도체화되어야 할 당류 및/또는 단백질 담체를 반응시킴으로써 일어남을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 이의 반복 단위의 일부로서 반응성 히드록시기를 포함하는 방법으로서, 상기 히드록시기가 링커 상의 아미노기를 통해 부분적으로 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 당류가 CDAP 화학을 이용하여 부분적으로 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 이의 반복 단위의 일부로 반응성 아미노기를 포함하는 방법으로서, 상기 아미노기가 링커 상의 카르복시기를 통해 부분적으로 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 당류가 카르보디이미드 축합 화학을 이용하여 부분적으로 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 이의 반복 단위의 일부로서 반응성 카르복시기를 포함하는 방법으로서, 상기 카르복시기가 링커 상의 아미노기를 통해 부분적으로 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 당류가 카르보디이미드 화학을 이용하여 부분적으로 유도체화됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 카르보디이미드, 당류 또는 단백질 담체의 분취액이 펌프를 이용하여 일정한 속도로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 카르보디이미드, 당류 또는 단백질 담체의 분취액이 상기 첨가 시간 내내 복수의 단계로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 분취액의 1/4 이상은 상기 첨가 시간 중 첫 번째 절반에 해당하는 시간 내내 첨가되고, 상기 분취액의 1/2 이상은 상기 첨가 시간 중 두 번째 절반에 해당하는 시간 내내 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 분취액('a')은 4 내지 100 단계('s')로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, a/s의 분취액이 각각의 단계에 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 한 단계가 시간('p')의 0시에 개시되면, 각각의 후속 단계는 p/(s-1)의 시간에 실행됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 상기 단계 b)에서 최종 농도 0.5-50㎎/㎖로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체 대 당류의 초기 비가 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 1:1, 또는 3:1 내지 2:1(w/w)임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에 존재하는 염, 예를 들어, NaCl의 농도가 0 내지 2, 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5M임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체가 상기 단계 b)에서 최종 농도 1 내지 50㎎/㎖로 존재함을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 반응 pH가 pH 4.5-6.5, 4.7-6.0, 또는 5-5.5로 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, N-히드록시숙신이미드가 또한 상기 단계 b)에서의 반응에 존재하며, 상기 단계 b)에서 반응 pH가 pH 4.5 내지 7.5로 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 반응 온도가 4 내지 37, 10 내지 32, 17 내지 30, 또는 22 내지 27℃로 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분취액 모두가 단계 b)에서 첨가되고 난 후, 반응이 추가로 10분 내지 72시간, 20분 내지 48시간, 30분 내지 24시간, 40분 내지 12시간, 50분 내지 6시간, 또는 1 내지 3시간 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 완료되면, pH가 pH 7.5 내지 9로 조정됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류-단백질 컨주게이트가 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 통해 정제되는, 후속 단계 c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류-단백질 컨주게이트가 멸균 여과되는 후속 단계 d)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 유효한 용량의 상기 당류-단백질 컨주게이트가 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하기 위하여 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화되는, 후속 단계 e)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 박테리아 캡슐 당류, 예를 들어, 나이세리아 메닌지티디스(N. meningitidis) 혈청형 A, B, C, W 135 또는 Y, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 혈청형 1 , 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 또는 33F, 그룹 B 스트렙토코커스 군 Ia, Ib, II, III, IV, V, Vl, 또는 VII, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 제5형, 스태필로코커스 아우레우스 제8형, 살모넬라 티피(Salmonella typhi)(Vi 당류), 비브리오 콜레라(Vbrio cholerae), 또는 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae) 제b형으로 구성된 목록에서 선택된 박테리아로부터 유래된, 당류임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류의 중량-평균 분자량(weight-average molecular weight)이 1000 내지 2000000, 5000 내지 1000000, 10000 내지 500000, 50000 내지 400000, 75000 내지 300000, 또는 100000 내지 200000임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 천연 다당류이거나 단지 10배(x10)의 인자로(예를 들어, 미세유동화(microfluidization)에 의해) 크기조절됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류가 박테리아 지질다당류 또는 지질다당류, 예를 들어, 나이세리아 메닌지티디스(N. meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae), 대장균(E. coli), 살모넬라 또는 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhalis)로 구성된 목록에서 선택된 박테리아에서 유래한, 다당류임을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체가 하나 이상의 T-헬퍼 에피토프를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체가 TT, DT, CRM197, TT의 단편 C, 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae)의 단백질 D, 폐렴구균 PhtD, 및 폐렴구균 뉴모리신(Pneumolysin)으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항의 방법으로 획득되는 당류-단백질 담체 컨주게이트.
  45. 제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항의 방법으로 획득되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  46. 질병의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조시 제 45항의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도.
  47. 투여가 요구되는 환자에게 제 45항의 면역원성 조성물 또는 백신을 유효한 용량으로 투여하는 단계를 포함하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  48. 제 46항 또는 제 47항의 용도 또는 방법에 있어서, 상기 질병이 나이세리아 메닌지티디스(N. meningitidis), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 모락셀라 카타르할리스(M. catarrhalis), 그룹 B 스트렙토코커스, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 대장균(E. coli), 및 헤모필루스 인플루엔자균(Hemophillus influenzae)로 구성된 목록에서 선택된 박테리아에 의해 유발됨을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
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