ES2322306T3 - Proteinas de streptpcpccus pneumoniae y fragmentos inmunogenicos para vacunas. - Google Patents
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Abstract
Vacuna que comprende un polipéptido idéntico en al menos un 95% a los aminoácidos 1-819 de la SEQ ID NO: 4 en un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para proteger frente a la infección neumocócica cuando se administra a un mamífero, en la que dicho polipéptido comprende dos regiones de superhélice.
Description
Proteínas de Streptococcus pneumoniae y
fragmentos inmunogénicos para vacunas.
Esta invención se refiere generalmente al campo
de los antígenos bacterianos y a su uso, por ejemplo, como agentes
inmunogénicos en seres humanos y animales para estimular una
respuesta inmunitaria. Más específicamente, se refiere a la
vacunación de especies de mamífero con un polipéptido que comprende
al menos un residuo de tríada de histidina conservado (HxxHxH) y al
menos un polipéptido que forma una hélice obtenidos de
Streptococcus pneumoniae como un mecanismo para estimular la
producción de anticuerpos que protegen al receptor de la vacuna
frente a la infección producida por una amplia variedad de serotipos
de S. pneumoniae patogénico. Además, la invención se refiere
a anticuerpos frente a tales polipéptidos útiles en el diagnóstico
y el tratamiento inmunitario pasivo con respecto al diagnóstico y el
tratamiento de tales infecciones neumocócicas.
En un aspecto particular, la presente invención
se refiere a la prevención y el tratamiento de infecciones
neumocócicas tales como infecciones del oído medio, nasofaringe,
pulmón y zonas bronquiales, sangre, LCR y similares, que se
producen por bacterias neumocócicas.
Streptococcus pneumoniae es una bacteria
Gram positiva que es un agente causal principal en infecciones
invasivas en animales y seres humanos, tales como septicemia,
meningitis, otitis media y neumonía lobular (Tuomanen et al.
New Engl. J. Med. 322:1280-1284 (1995)). Como parte
del proceso infeccioso, los neumococos se unen fácilmente a células
epiteliales humanas no inflamadas de las vías respiratorias
superiores e inferiores mediante la unión a hidratos de carbono de
eucariotas en una manera similar a la lectina (Cundell et
al., Micro. Path. 17:361-374 (1994)). La
conversión en infecciones neumocócicas invasivas para las bacterias
unidas puede implicar la generación local de factores inflamatorios
que pueden activar las células epiteliales para que cambien el
número y el tipo de receptores en su superficie (Cundell et
al., Nature, 377:435-438 (1995)). Aparentemente,
uno de tales receptores, el factor activador de plaquetas (PAF) se
capta por las bacterias neumocócicas y en el plazo de un periodo de
tiempo muy corto (minutos) desde la aparición de PAF, los neumococos
muestran adherencia e invasión de tejido fuertemente
intensificadas. Se ha demostrado que ciertos análogos de receptor
solubles previenen la progresión de infecciones neumocócicas
(Idanpaan-Heikkila et al., J. Inf. Dis.,
176:704-712 (1997)). Se ha sugerido que otras
proteínas diversas están implicadas en la patogenicidad de S.
pneumoniae. Sigue habiendo una necesidad de identificar
polipéptidos que tienen epítopos en común de diversas cepas de
S. pneumoniae con el fin de utilizar tales polipéptidos como
vacunas para proporcionar protección frente a una amplia variedad de
S. pneumoniae.
Según la presente invención, se proporcionan
vacunas y composiciones de vacuna que incluyen polipéptidos
obtenidos de S. pneumoniae y/o variantes de dichos
polipéptidos y/o fragmentos activos de tales polipéptidos.
Los fragmentos activos, tal como se definen más
adelante en el presente documento, incluyen un/unos
residuo(s) de tríada de histidina y/o regiones de superhélice
de tales polipéptidos.
La expresión "porcentaje de identidad" o
"idéntico en porcentaje", cuando se refiere a una secuencia,
significa que se compara una secuencia con una secuencia
reivindicada o descrita a partir de una alineación de la secuencia
que va a compararse (la "secuencia comparada") con la
secuencia descrita o reivindicada (la "secuencia de
referencia"). El porcentaje de identidad se determina tal como
sigue:
Porcentaje de
identidad =
[1-(C/R)]100
en la que C es el número de
diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia
comparada a lo largo de la longitud de la alineación entre la
secuencia comparada y la secuencia de referencia, en la que (i)
cada base o aminoácido en la secuencia de referencia que no tiene
una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada y (ii)
cada hueco en la secuencia de referencia y (iii) cada base o
aminoácido alineados en la secuencia de referencia que es diferente
de una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada, es
cada uno una diferencia; y R es el número de bases o aminoácidos en
la secuencia de referencia a lo largo de la longitud de la
alineación con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en
la secuencia de referencia que también se cuenta como una base o
aminoácido.
Si existe una alineación entre la secuencia
comparada y la secuencia de referencia en la que el porcentaje de
identidad tal como se calculó anteriormente es aproximadamente igual
o mayor que un porcentaje de identidad mínimo especificado,
entonces la secuencia comparada tiene el porcentaje de identidad
mínimo especificado con respecto a la secuencia de referencia aun
cuando puedan existir alineaciones en las que el porcentaje de
identidad calculado anteriormente en el presente documento sea
menor que el porcentaje de identidad especificado.
"Aislado" en el contexto de la presente
invención con respecto a polipéptidos y/o polinucleótidos significa
que el material se extrae de su entorno original (por ejemplo, el
entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, un
polinucleótido o polipéptido que se produce de manera natural
presente en un microorganismo vivo no está aislado, pero el mismo
polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los
materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales
polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o tales
polinucleótidos o polipéptidos podrían formar parte de una
composición, y esta rían todavía aislados porque tal vector o
composición no forma parte de su entorno natural. Los polipéptidos y
polinucleótidos de la presente invención se proporcionan
preferiblemente en una forma aislada y preferiblemente se purifican
hasta la homogeneidad.
Las figuras 1A-1C,
respectivamente, informan de los resultados de tres experimentos
usando diferentes preparaciones de SP36. Los resultados demuestran
que la inmunización activa con SP36 recombinante derivado del
serotipo 4 de la cepa neumocócica noruega puede proteger a ratones
de la muerte en un modelo de septicemia neumocócica usando una cepa
heteróloga, SJ2 (serotipo 6B). En cada uno de los tres experimentos
mostrados, el cien por cien de los ratones inmunizados con SP36
sobrevivió durante el periodo de observación de 14 días tras la
exposición a aproximadamente 500 ufc de neumococos, mientras que
del ochenta al cien por cien de los ratones inmunizados de manera
simulada (a los que se inyectó PBS y adyuvante) murió durante el
mismo periodo.
Las figuras 2A-2B muestran que
la administración pasiva de antisuero de conejo obtenido frente a
Sp36 derivado del tipo 4 noruego podía proteger a los ratones en el
modelo de septicemia neumocócica usando dos cepas heterólogas. La
figura 2A muestra que el cien por cien de los ratones inmunizados
con el antisuero de SP36 sobrevivió durante el periodo de
observación de 21 días tras la exposición a 172 UFC de la cepa SJ2
(serotipo 6B). El ochenta por ciento de los ratones inmunizados con
un suero control (anti-FimC de conejo) murió hacia
el día 8 y el noventa por ciento murió hacia el día 12. La figura
2B muestra que el 90 por ciento de los ratones inmunizados con el
antisuero de Sp36 sobrevivió durante la observación de 8 días tras
la exposición a 862 UFC de la cepa EF6796 (serotipo 6A). El noventa
por ciento de los ratones inmunizados con un suero control
(recogido antes de la inmunización) murió hacia el día 5.
La figura 3 es una inmunotransferencia de tipo
Western que demuestra la capacidad de los antisueros obtenidos
frente a Sp36 recombinante derivado del tipo 4 de la cepa noruega
para reaccionar con Sp36 de cepas heterólogas. Los lisados
celulares totales se sometieron a inmunotransferencia con
antisueros de ratón frente a Sp36. Se detectó una banda que
representa la proteína Sp36 en las 23 cepas de S. pneumoniae
sometidas a prueba, que incluyó aislados de cada uno de los 23
serotipos neumocócicos representados en la vacuna de polisacárido
actual.
La figura 4 es una transferencia de tipo
Southern que muestra que el gen de Sp36 del tipo 4 noruego hibrida
con el ADN genómico de otras 24 cepas neumocócicas, lo que indica la
presencia de secuencias similares en todas estas cepas.
La figura 5 es una inmunotransferencia de tipo
Western que muestra la reactividad de los sueros de los pacientes
con Sp36. Sp36 (o bien de longitud completa, panel A; o bien la
mitad N-terminal, panel B; o bien la mitad
C-terminal, panel C) se sometió a electroforesis
mediante SDS-PAGE y se transfirió a nitrocelulosa.
Los sueros de los pacientes recogidos poco después del comienzo de
la enfermedad (suero agudo, carriles A) o de ocho a 30 días después
(suero convaleciente, carriles C) se usaron para estudiar mediante
sonda las transferencias. Para los pacientes 2, 3 y 5, el suero
convaleciente reaccionó más fuertemente con Sp36 de lo que lo hizo
el suero agudo correspondiente.
La figura 6 es una comparación de alineación de
aminoácidos de cuatro proteínas neumocócicas relacionadas,
concretamente Sp36A (PhtA; SEQ ID NO: 8), Sp36B (PhtB; SEQ ID NO:
10), Sp36D (PhtD; SEQ ID NO: 4), Sp36E (PhtE; SEQ ID NO: 6),
respectivamente. Los guiones en una secuencia indican huecos
introducidos para maximizar la similitud de la secuencia. Los
residuos de aminoácidos que se aparean están recuadrados.
La figura 7 es una comparación de alineación de
nucleótidos de cuatro genes neumocócicos relacionados,
concretamente de Sp36A (PhtA; SEQ ID NO: 9), Sp36B (PhtB; SEQ ID
NO: 11), Sp36D (PhtD; SEQ ID NO: 5), Sp36E (PhtE; SEQ ID NO: 7),
respectivamente. Los guiones en una secuencia indican huecos
introducidos para maximizar la similitud de la secuencia.
La figura 8 muestra los resultados de la
inmunización de ratones con la proteína recombinante PhtD, lo que
conduce a la protección de la septicemia letal. Se inmunizaron
ratones C3H/HeJ (panel A y B) o Balb/cByJ (panel C) por vía
subcutánea con la proteína PhtD (15 \mug en 50 \mul de PBS
emulsionada en 50 pi de adyuvante completo de Freund (CFA)). La
proteína recombinante PhtD usada en los experimentos de protección
consistió en 819 residuos de aminoácidos, comenzando con la
cisteína (residuo 20). Un grupo de 10 ratones inmunizados de manera
simulada recibió PBS con adyuvante. Se administró una segunda
inmunización de 15 \mug de proteína con adyuvante incompleto de
Freund (IFA) 3 semanas más tarde; el grupo simulado recibió PBS con
IFA. Se extrajo sangre (sangrado retroorbital) en la semana 7; y se
reunieron sueros de cada grupo para realizar un análisis de
anticuerpos anti-PhtD mediante ELISA. En la semana
8 se expusieron los ratones mediante una inyección intraperitoneal
(i.p.) de aproximadamente 550 UFC de la cepa SJ2 de S.
pneumoniae, serotipo 6B (panel A), 850 UFC de la cepa EF6796,
serotipo 6A (panel B) o 450 UFC de la cepa EF5668, serotipo 4 (panel
C). En experimentos preliminares, se determinó que la DL50 para las
cepas SJ2 y EF6796 era de aproximadamente 10 UFC para ambas cepas.
Se determinó que la DL50 para la cepa EF5668 era < 5 UFC. Se
determinó la supervivencia en todos los grupos durante el transcurso
de 15 días tras la exposición. Los datos se presentan como el
porcentaje de supervivencia para un total de 10 ratones por grupo
experimental. Se usó la prueba de rango logarítmico de dos muestras
para el análisis estadístico comparando ratones inmunizados con Pht
recombinante con ratones inmunizados de manera simulada.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una vacuna, generalmente en forma de una composición,
que incluye al menos un polipéptido que es idéntico en al menos un
95% a (i) una secuencia de polipéptido que comprende los aminoácidos
1-819 de la SEQ ID NO: 4 o (ii) una secuencia de
polipéptido que comprende los aminoácidos 1-460 de
la SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo de los anteriores.
La expresión "fragmento activo" significa
un fragmento que incluye uno o más residuos de tríada de histidina
y/o una o más regiones de superhélice. Un "residuo de tríada de
histidina" es la parte del polipéptido que tiene la secuencia
HxxHxH en la que H es histidina y x es un aminoácido distinto de
histidina.
Una región de superhélice es la región
pronosticada por el algoritmo "Hélices": Lupas, A., Van Dyke,
M., y Stock, J. (1991) Predicting Coiled Coils from Protein
Sequences, Science 252:1 162-1164.
Según una realización, el fragmento activo
incluye tanto uno o más residuos de tríada de histidina como al
menos una región de superhélice de la secuencia de polipéptido
aplicable. Según otra realización, el fragmento activo incluye al
menos dos residuos de tríada de histidina.
En otra realización, el fragmento activo que
incluye al menos un residuo de tríada de histidina o al menos una
región de superhélice del polipéptido aplicable incluye al menos
aproximadamente el diez por ciento del polipéptido aplicable y no
más de aproximadamente el 85% del polipéptido aplicable. El
polipéptido de la SEQ ID NO: 4 incluye cinco residuos de triada de
histidina, tal como sigue:
Aminoácidos 64-69;
188-193; 296-301;
541-546 y 625-630.
El polipéptido de la SEQ ID NO: 6 incluye cinco
residuos de tríada de histidina, tal como sigue:
Aminoácidos 63-68;
185-190; 289-294,
376-381 y 441-446.
Además, el polipéptido de la SEQ ID NO: 4
incluye dos regiones de superhélice (aminoácidos
120-140 y aminoácidos 750-772) y el
polipéptido de la SEQ ID NO: 6 incluye una región de superhélice
(aminoácidos 119-152).
El polipéptido de la SEQ ID NO: 8 incluye las
regiones siguientes:
HxxHxH: aminoácidos 63-68,
189-194, 309-314,
550-555, 634-639.
Superhélices: aminoácidos
118-145, 406-434,
462-493, 724-751.
Según un aspecto adicional de la invención, se
administra una vacuna del tipo descrito anteriormente en el
presente documento con el fin de prevenir o tratar la infección
producida por S. pneumoniae.
Una vacuna, o composición de vacuna, según la
presente invención puede incluir uno o más de los polipéptidos o
fragmentos activos de los mismos descritos anteriormente en el
presente documento. Cuando se emplea más de un polipéptido o
fragmento activo, pueden usarse tales dos o más polipéptidos y/o
fragmentos activos como una mezcla física o como una fusión de dos
o más polipéptidos o fragmentos activos. El fragmento de fusión o el
polipéptido de fusión puede producirse, por ejemplo, mediante
técnicas recombinantes o mediante el uso de ligadores apropiados
para fusionar los polipéptidos o fragmentos activos preparados
anteriormente.
En una realización de la invención, se
proporciona (a) un polipéptido que es idéntico en al menos un 95% o
idéntico en al menos un 97% o idéntico en un 100% a (i) una
secuencia de polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 819 de
la SEQ ID NO: 4 o (ii) una secuencia de polipéptido que comprende
los aminoácidos 1-460 de la SEQ ID NO: 6; o (b) un
fragmento activo del polipéptido de (a).
En el caso en el que el polipéptido es una
variante del polipéptido que comprende el polipéptido maduro de la
SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6, o cualquiera de los fragmentos
activos de la invención, la variación en el polipéptido o fragmento
es generalmente en una parte del mismo distinta de los residuos de
tríada de histidina y de la región de superhélice, aunque pueden
realizarse variaciones en una o más de estas regiones.
En muchos casos, la variación en el polipéptido
o fragmento activo es una sustitución de aminoácido conservativa,
aunque otras sustituciones están dentro del alcance de la
invención.
Según la presente invención, una variante de
polipéptido incluye variantes en las que se sustituyen y/o
delecionan y/o insertan uno o más aminoácidos.
En otro aspecto, la invención se refiere a
vacunas de inmunidad pasiva formuladas a partir de anticuerpos
frente a un polipéptido o fragmento activo de un polipéptido de la
presente invención. Tales vacunas de inmunidad pasiva pueden
utilizarse para prevenir y/o tratar infecciones neumocócicas en
pacientes. De esta manera, según un aspecto adicional de la
invención, puede producirse una vacuna a partir de un polipéptido
sintético o recombinante de la presente invención o a partir de un
anticuerpo frente a tal polipéptido.
Todavía en otro aspecto, la presente invención
se refiere a un método de uso de uno o más anticuerpos
(monoclonales, policlonales o sueros) frente a los polipéptidos de
la invención tal como se describió anteriormente para la profilaxis
y/o el tratamiento de enfermedades que se producen por bacterias
neumocócicas. En particular, la invención se refiere a un método
para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas
que se producen por S. pneumoniae. Todavía en un aspecto
adicional preferido, la invención se refiere a un método para la
profilaxis y/o el tratamiento de otitis media, infecciones
nasofaríngeas, bronquiales y similares en seres humanos mediante la
utilización de una vacuna de la presente invención.
Generalmente, las vacunas se preparan como
inyectables, en forma de suspensiones o disoluciones acuosas.
También se conocen bien las vacunas en una base oleosa tal como para
inhalación. También pueden formularse formas sólidas que se
disuelven o se suspenden antes de su uso. Generalmente se añaden
vehículos farmacéuticos que son compatibles con los principios
activos y aceptables para su uso farmacéutico. Ejemplos de tales
vehículos incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas,
dextrosa o glicerol. También pueden usarse combinaciones de
vehículos.
Las composiciones de vacuna pueden incorporar
además sustancias adicionales para estabilizar el pH, o para
funcionar como adyuvantes, agentes humectantes o agentes
emulsionantes, que pueden servir para mejorar la eficacia de la
vacuna.
Las vacunas se formulan generalmente para su
administración parenteral y se inyectan o bien por vía subcutánea o
bien por vía intramuscular. Tales vacunas también pueden formularse
como supositorios o para su administración oral, usando métodos
conocidos en la técnica.
La cantidad de vacuna suficiente para conferir
inmunidad frente a bacterias patogénicas se determina mediante
métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Esta cantidad
se determinará basándose en las características del receptor de la
vacuna y en el nivel de inmunidad requerida. Normalmente, la
cantidad de vacuna que va a administrarse se determinará basándose
en el criterio de una persona experta. Cuando las vacunas se
administran mediante inyección subcutánea o intramuscular, puede
administrarse un intervalo de 50 a 500 \mug de proteína
purificada.
La presente invención también se refiere a una
vacuna en la que se suministra o administra un polipéptido o
fragmento activo de la presente invención en forma de un
polinucleótido que codifica para el polipéptido o fragmento activo,
por lo que el polipéptido o el fragmento activo se producen in
vivo. El polinucleótido puede incluirse en cualquier vector de
expresión adecuado y combinarse con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Además, los polipéptidos de la presente
invención pueden usarse como inmunógenos para estimular la
producción de anticuerpos para su uso en inmunoterapia pasiva, para
su uso como reactivos de diagnóstico y para su uso como reactivos
en otros procedimientos tales como cromatografía de afinidad.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona polinucleótidos que codifican para los polipéptidos y
fragmentos activos de la invención descritos anteriormente en el
presente documento. El polinucleótido de la presente invención
puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, ADN que incluye
ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o
monocatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificante
o la hebra no codificante (antisentido).
La solicitud proporciona
1. (A) un polinucleótido aislado que es idéntico
en al menos un 90% a una secuencia de polinucleótido que codifica
para (i) un polipéptido que comprende los aminoácidos
1-819 de la SEQ ID NO: 4 o (ii) un polipéptido que
comprende los aminoácidos 1-460 de la SEQ ID NO: 6,
o
2. (B) un fragmento del polinucleótido de (A)
que codifica para un fragmento de polipéptido activo.
En realizaciones específicas, el polinucleótido
es idéntico en al menos un 95%, preferiblemente idéntico en al
menos un 97% e incluso idéntico en un 100% a tal secuencia de
polinucleótido.
La expresión "polinucleótido que codifica para
un polipéptido" engloba un polinucleótido que incluye sólo la
secuencia codificante para el polipéptido así como un
polinucleótido que incluye secuencia codificante y/o no codificante
adicionales.
La presente invención se refiere además a
variantes de polinucleótidos. Las variantes de los polinucleótidos
pueden ser una variante alélica de los polinucleótidos que se
produce de manera natural o una variante de los polinucleótidos que
no se produce de manera natural. Las variantes incluyen variantes
en las que se sustituyen, delecionan o insertan una o más bases.
Pueden utilizarse complementos a tales polinucleótidos codificantes
para aislar polinucleótidos que codifican para los mismos
polipéptidos o similares. En particular, tales procedimientos son
útiles para obtener partes inmunogénicas naturales de polipéptidos
de diferentes serotipos de S. pneumoniae, que son
especialmente útiles en la producción de vacunas de polipéptido
"de cadena" que contienen múltiples segmentos
inmunogénicos.
La SEQ ID NO: 5 es un ejemplo representativo de
un polinucleótido que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO:
4 y la SEQ ID NO: 7 es un ejemplo representativo de un
polinucleótido que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 6.
La SEQ ID NO: 9 es un ejemplo representativo de un polinucleótido
que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 8, y la SEQ ID
NO: 11 es un ejemplo representativo de un polinucleótido que
codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 10. Como resultado de
la degeneración conocida del código genético, otros polinucleótidos
que codifican para los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 deben resultar evidentes para los
expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en el presente
documento.
Los polinucleótidos que codifican para los
polipéptidos inmunogénicos descritos anteriormente también pueden
tener la secuencia codificante fusionada en marco a una secuencia
marcadora, lo que permite la purificación de los polipéptidos de la
presente invención. La 1 secuencia marcadora puede ser, por ejemplo,
una cola de hexa-histidina suministrada por un
vector pQE-9 para proporcionar la purificación de
los polipéptidos maduros fusionados al marcador en el caso de un
huésped bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser
un marcador de hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped
mamífero, por ejemplo las células COS-7. El
marcador de HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína
hemaglutinina del virus Influenza (Wilson, I., et
al., Cell, 37:767 (1984)).
La presente invención también se refiere a los
vectores que incluyen polinucleótidos que codifican para uno o más
de los polipéptidos de la invención, a las células huésped que se
modifican mediante ingeniería genética con los vectores de la
invención y a la producción de tales polipéptidos inmunogénicos
mediante técnicas recombinantes en una forma aislada e
inmunogénicamente pura de manera sustancial.
Las células huésped se modifican mediante
ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfectadas)
con los vectores que comprenden un polinucleótido que codifica para
un polipéptido de la invención. El vector puede estar, por ejemplo,
en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las
células huésped modificadas mediante ingeniería genética pueden
cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea
apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los polinucleótidos que codifican para tales
polipéptidos. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH
y similares, son las usadas anteriormente con la célula huésped
seleccionada para la expresión y resultarán evidentes para el
experto habitual.
Los vectores incluyen secuencias de ADN
cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados
de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos
de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN
de fago, ADN viral tal como de Vaccinia, adenovirus, virus
de la viruela aviar y de la seudo-
rrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que pueda replicarse y que sea viable en el huésped.
rrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que pueda replicarse y que sea viable en el huésped.
La secuencia de ADN apropiada puede insertarse
en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general,
la secuencia de ADN se inserta en un/unos sitio(s) de
endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante
procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales
procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en
la técnica.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se
une operativamente a una/unas secuencia(s) de control de la
expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la síntesis
del ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores pueden
mencionarse: promotor de SV40 o LTR, el lac o trp de E.
coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores que
se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas
o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene
un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción y un
terminador de la transcripción. El vector también puede incluir
secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
Además, los vectores de expresión contienen
preferiblemente uno o más genes marcadores de selección para
proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células
huésped transformadas tales como resistencia a neomicina o
dihidrofolato reductasa para el cultivo de células eucariotas, o
tales como resistencia a ampicilina o tetraciclina en E.
coli.
El vector que contiene la secuencia de ADN
apropiada tal como se describió anteriormente en el presente
documento, así como un promotor o secuencia control apropiados,
puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir
que el huésped exprese las proteínas.
Como ejemplos representativos de huéspedes
apropiados pueden mencionarse: células bacterianas, tales como
E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células
fúngicas, tales como levadura; células de insecto tales como S2 de
Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales
tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células
vegetales, etc. Se considera que la selección de un huésped
apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a
partir de las enseñanzas en el presente documento.
Más particularmente, la presente invención
también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más
de las secuencias tal como se describió anteriormente de manera
amplia. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o
vector viral, en el que se ha insertado una secuencia de la
invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto
preferido de esta realización, el constructo comprende además
secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido
operativamente a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen
grandes números de vectores y promotores adecuados, y están
comercialmente disponibles. Se proporcionan los vectores siguientes
a modo de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9
(Qiagen, Inc.), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK,
pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5
(Pharmacia). Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG
(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo,
puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que puedan
replicarse y que sean viables en el huésped.
Pueden seleccionarse regiones promotoras a
partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol
transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Dos
vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores
bacterianos nombrados particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7,
gpt, lambda P_{R}, P_{L} y TRP. Promotores eucariotas incluyen
promotor inmediato temprano de CMV, timidina cinasa de VHS,
promotor temprano y tardío de SV40, LTR de retrovirus y
metalotioneína I de ratón. La selección del vector y del promotor
apropiados está completamente dentro del nivel del experto habitual
en la técnica.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a células huésped que contienen los
constructos descritos anteriormente. La célula huésped puede ser una
célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una
célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la
célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula
bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped
puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio,
transfección mediada por DEAE-dextrano o
electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods
in Molecular Biology, (1986)).
Los constructos en las células huésped pueden
usarse de una manera convencional para producir el producto génico
codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los
polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente
mediante sintetizadores de péptidos convencionales.
Las proteínas maduras pueden expresarse en
células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el
control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas
de traducción libres de células para producir tales proteínas
usando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente
invención. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) describen
vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con
huéspedes procariotas y eucariotas.
La transcripción del ADN que codifica para los
polipéptidos de la presente invención realizada por eucariotas
superiores se aumenta mediante la inserción de una secuencia
potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN
que actúan en cis, por lo general de aproximadamente desde 10 hasta
300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción.
Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del
origen de replicación, pb 100 a 270, un potenciador del promotor
temprano de citomegalovirus, el potenciador de poliomavirus en el
lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de
adenovirus.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores de
selección que permiten la transformación de la célula huésped, por
ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el
gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen
altamente sumamente expresado para la transcripción directa de una
secuencia estructural hacia el sentido de 3'. Tales promotores
pueden derivarse de operones que codifican para enzimas
glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa
(PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque
térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se
ensambla en la fase apropiada con las secuencias de inicio de la
traducción y de terminación. Opcionalmente, la secuencia heteróloga
puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido
de identificación N-terminal que confiere las
características deseadas, por ejemplo, estabilización o
purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Los vectores de expresión útiles para el uso
bacteriano se construyen mediante la inserción de una secuencia de
ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con
señales adecuadas de inicio y terminación de la traducción en fase
de lectura operativa con un promotor funcional. El vector
comprenderá uno o más marcadores de selección fenotípicos y un
origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y
para, si es deseable, proporcionar amplificación dentro del huésped.
Huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluyen
E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas
especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y
Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otras según
elección.
Como ejemplo representativo pero no limitativo,
los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano pueden
comprender un marcador de selección y un origen de replicación
bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles que
comprenden elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC
37017) bien conocido. Tales vectores comerciales incluyen, por
ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).
Estas secciones de "estructura principal" de pBR322 se
combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que va
a expresarse.
Tras la transformación de una cepa huésped
adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad
celular apropiada, se induce el promotor seleccionado mediante
medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción
química) y se cultivan las células durante un periodo
adicional.
Normalmente, las células se recogen mediante
centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos y se
conserva el extracto bruto resultante para la purificación
adicional.
Las células microbianas empleadas en la
expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método
conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, una prensa
francesa, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular,
conociéndose bien tales métodos por los expertos en la técnica. Sin
embargo, se prefieren las células huésped que segregan el
polipéptido de la invención y que permiten la recuperación del
polipéptido de los medios de cultivo.
También pueden emplearse diversos sistemas de
cultivo de células de mamífero para expresar la proteína
recombinante. Ejemplos de sistema de expresión de mamíferos incluyen
las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono,
descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas
celulares que pueden expresar un vector compatible, por ejemplo, las
líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de
expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un
promotor adecuado y un potenciador, y también cualquier sitio de
unión a ribosomas, sitio de poliadenilación, sitio de aceptor y
donante de corte y empalme, secuencia de terminación de la
transcripción y secuencia no transcrita flanqueante en 5'
necesarios. Las secuencias de ADN derivadas del corte y empalme de
SV40 y los sitios de poliadenilación pueden usarse para
proporcionar los elementos genéticos no transcritos
requeridos.
requeridos.
Los polipéptidos pueden recuperarse y/o
purificarse de cultivos celulares recombinantes mediante métodos de
recuperación y purificación de proteínas bien conocidos. Tal
metodología puede incluir precipitación con sulfato de amonio o
etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio iónico o
catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en
hidroxilapatita y cromatografía en lectina. Pueden usarse etapas de
replegamiento de proteínas, según sea necesario, para completar la
configuración de la proteína madura. En cuanto a esto, pueden usarse
chaperonas en un procedimiento de replegamiento de este tipo.
Finalmente, puede emplearse cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales.
Los polipéptidos que son útiles como inmunógenos
en la presente invención pueden ser un producto purificado
naturalmente, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o
producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped
procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de
levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos en
cultivo). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de
producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención
pueden estar glicosilados o pueden estar no
glicosilados.
glicosilados.
Los procedimientos para el aislamiento de los
polipéptidos expresados individualmente pueden aislarse mediante
métodos de expresión recombinante/aislamiento que se conocen bien en
la técnica. Ejemplos típicos para tal aislamiento pueden utilizar
un anticuerpo frente a una zona conservada de la proteína o frente
a un marcador de His o cola o secuencia líder que puede escindirse
que se expresa como parte de la estructura de la proteína.
Los polipéptidos, sus fragmentos u otros
derivados o análogos de los mismos, o células que los expresan
pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos frente a
ellos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos
policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye
anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como
fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab.
Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para
la producción de tales anticuerpos y fragmentos.
Los anticuerpos generados frente a los
polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente
invención pueden obtenerse mediante inyección directa de los
polipéptidos en un animal.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales,
puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos
producidos mediante cultivos de líneas celulares continuos. Ejemplos
incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature,
256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de
hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983,
Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma por el VEB para
producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al.,
1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., págs.
77-96).
77-96).
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense 4.946.778)
pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla frente
a los productos de polipéptido inmunogénicos de esta invención.
Además, pueden usarse ratones transgénicos para expresar
anticuerpos humanizados frente a los productos de polipéptido
inmunogénicos de esta invención.
La invención se describirá adicionalmente con
respecto a los ejemplos siguientes; sin embargo el alcance de la
invención no está limitado por los mismos:
\global\parskip0.910000\baselineskip
Se aisló el ADN genómico usado como diana para
la amplificación de la cepa noruega de S. pneumoniae
(serotipo 4), se usó la misma cepa para la secuenciación genómica.
En la lista de secuencias adjunta en el presente documento se
facilitan la secuencia completa del gen de Sp36 (SEQ ID NO: 9) y su
secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) pronosticada. Se observó que
la secuencia de aminoácidos pronosticada incluyó una secuencia
líder hidrófoba seguida por una secuencia (LSVC) similar a la
secuencia consenso para la peptidasa señal tipo II (LxxC, en la que
las dos x normalmente representan aminoácidos pequeños). Se
diseñaron cebadores (enumerados como SEQ ID NOS:
1-3) que amplificarían el gen de Sp36 y permitirían
su donación en pQE10 y su expresión como una proteína con cola de
histidina que carecía de la secuencia señal para su purificación
mediante cromatografía de afinidad a níquel. La donación del
fragmento amplificado mediante las SEQ ID NOS 1 y 3 dio como
resultado una proteína que contenía los aminoácidos de 2 a 800 de
Sp36; la donación del fragmento amplificado mediante las SEQ ID NOS
2 y 3 dio como resultado una proteína que contenía los aminoácidos
de 7 a 800 de Sp36 (los números de aminoácido se refieren a la SEQ
ID NO: 8).
En cada uno de los tres experimentos mostrados
en las figuras 1A-1C, se inmunizaron por vía
intraperitoneal (i.p.) ratones C3H/HeJ (10/grupo) con proteína Sp36
(15 \mug en 50 \mul de PBS emulsionada en 50 \mul de
adyuvante completo de Freund (CFA)). Un grupo de 10 ratones
inmunizados de manera simulada recibió PBS con adyuvante. Se
administró una segunda inmunización de 15 \mug de proteína con
adyuvante incompleto de Freund (IFA) 4 semanas más tarde; el grupo
simulado recibió PBS con IFA. Se extrajo sangre (sangrado
retroorbital) en las semanas 3, 6 y 9; y se reunieron sueros de
cada grupo para realizar un análisis de anticuerpos
anti-Sp36 mediante ELISA. En la semana 10 se
expusieron los ratones mediante una inyección i.p. de
aproximadamente 500 UFC de la cepa SJ2 de S. pneumoniae
(serotipo 6B; proporcionado por P. Flynn, St. Jude Children's
Research Hospital, Memphis, TN). En experimentos preliminares, se
determinó que la DL50 de esta cepa era de aproximadamente 10 UFC. Se
monitorizaron los ratones durante 14 días para determinar la
supervivencia.
Los tres experimentos mostrados en las figuras
1A-1C usaron preparaciones ligeramente diferentes
de Sp36 recombinante. Los experimentos mostrados en la figura 1A y
1B usaron ambos Sp36 que contenía los aminoácidos
20-815, pero se usaron diferentes lotes de proteína en los dos experimentos. El experimento mostrado en la figura 1C usó Sp36 que contenía los aminoácidos 25-815.
20-815, pero se usaron diferentes lotes de proteína en los dos experimentos. El experimento mostrado en la figura 1C usó Sp36 que contenía los aminoácidos 25-815.
En el experimento mostrado en la figura 1A, los
sueros de 9 semanas recogidos de los diez ratones inmunizados con
Sp36 (primer lote) tuvieron un título de ELISA en el punto final de
1:4.096.000. No se detectaron anticuerpos anti-Sp36
en los sueros de los ratones inmunizados de manera simulada. El
cien por cien de los ratones inmunizados con la proteína Sp36
sobrevivió a la exposición (520 UFC de neumococos) durante 14 días.
El ochenta por ciento de los ratones inmunizados de manera simulada
murió hacia el día 4, y el resto sobrevivió.
En el experimento mostrado en la figura 1B, los
sueros de 9 semanas recogidos de los diez ratones inmunizados con
Sp36 (segundo lote) tuvieron un título de ELISA en el punto final
> 1:4.096.000 No se detectaron anticuerpos
anti-Sp36 en los sueros de los ratones inmunizados
de manera simulada. El cien por cien de los ratones inmunizados con
la proteína Sp36 sobrevivió a la exposición (510 UFC de neumococos)
durante 14 días. De los ratones inmunizados de manera simulada, el
ochenta por ciento murió hacia el día 4, y todos murieron hacia el
día 9.
En el experimento mostrado en la figura 1C, los
sueros de 9 semanas recogidos de los diez ratones inmunizados con
Sp36 (que contenían los aminoácidos 25-815) tuvieron
un título de ELISA en el punto final de 1:4.096.000. No se
detectaron anticuerpos anti-Sp36 en los sueros de
los ratones inmunizados de manera simulada. El cien por cien de los
ratones inmunizados con la proteína Sp36 sobrevivió a la exposición
(510 UFC de neumococos) durante 14 días. De los ratones inmunizados
de manera simulada, el noventa por ciento murió hacia el día 4, y
todos murieron hacia el día 12. Estos datos demuestran que la
inmunización de ratones con proteínas Sp36 recombinantes provoca
una respuesta que puede proteger frente a la infección neumocócica
sistémica y muerte. Esta protección no fue específica de cepa: se
clonó la proteína neumocócica recombinante a partir de una cepa de
serotipo 4, mientras que la exposición fue a una cepa heteróloga,
SJ2 (serotipo 6B).
Ejemplo
2
Tras la recogida de suero preinmunitario, se
inmunizó un conejo blanco de Nueva Zelanda con 250 \mug de Sp36
(que contenía los aminoácidos 20-815) en CFA. Se
administraron al conejo dos inmunizaciones de refuerzo de 125
\mug de Sp36 en IFA en los días 29 y 50 y se le extrajo sangre en
los días 39 y 60. Se inmunizó un segundo conejo con un antígeno
control, FimC de E. coli.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron pasivamente ratones C3H/HeJ (10
ratones/grupo) mediante dos inyecciones i.p. de 100 \mul de suero
de conejo. Se administró la primera inyección veinticuatro horas
antes de la exposición a 172 UFC de cepa SJ2 de S.
pneumoniae, y se administró la segunda inyección cuatro horas
tras la exposición. La figura 2 muestra la supervivencia de los
ratones tras la infección con dos cepas de neumococos
diferentes.
La figura 2A muestra que de los ratones a los
que se inyectaron 172 UFC de la cepa SJ2 (figura 2A), el cien por
cien de los ratones inmunizados con suero inmunitario de conejo
obtenido frente a la proteína Sp36 sobrevivió durante el periodo de
observación de 21 días. De los ratones inmunizados con el suero
control (anti-FimC), el ochenta por ciento murió
hacia el día 8 y el noventa por ciento murió hacia el día 12. La
figura 2B muestra que de los ratones a los que se inyectaron 862
UFC de la cepa EF6796, el noventa por ciento de los ratones
inmunizados con suero inmunitario de conejo obtenido frente a la
proteína Sp36 sobrevivió durante el periodo de observación de 8
días. De aquellos a los que se administró un suero control (recogido
de un conejo antes de la inmunización), el noventa por ciento murió
hacia el día 8.
Estos datos indican que la protección frente a
la infección neumocócica que resulta de la inmunización con Sp36
está mediada por anticuerpos, puesto que los ratones pueden
protegerse mediante la transferencia pasiva de suero de un conejo
hiperinmunizado. Tal como se observó en los experimentos de
exposición activa de ratón descritos anteriormente, el suero
dirigido frente a la proteína recombinante Sp36 clonada de una cepa
de serotipo 4 fue protector frente a la exposición a cepas
heterólogas.
Ejemplo
3
Las 23 cepas neumocócicas usadas en este
experimento se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos
Tipo (Rockville, MD) e incluyen un aislado de cada uno de los 23
serotipos en la vacuna neumocócica multivalente. Para los usados
celulares totales, se hicieron crecer los neumococos hasta la fase
semilogarítmica (densidad óptica a 620 nm, de 0,4 a 0,6) en 2 ml de
caldo Todd-Hewitt con extracto de levadura al 0,5%
(Difco, Detroit, ME) a 37ºC. Se recogieron las bacterias mediante
centrifugación y se lavaron dos veces con agua. Se resuspendieron
los sedimentos en 200 \mul de tampón de lisis (dodecilsulfato de
sodio al 0,01%, citrato de sodio 0,15 M y desoxicolato de sodio
0,1%) y se incubaron a 37ºC durante 30 min., entonces se diluyó en
un volumen igual de 2x SSC (cloruro de sodio 0,3 M, citrato de sodio
0,03 M). Se separaron los lisados mediante
SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y
se estudiaron mediante sonda con anticuerpos en un procedimiento de
inmunotransferencia de tipo Western convencional. Se reunieron los
sueros de diez ratones C3H/HeJ inmunizados con Sp36 (tal como se
describió en el ejemplo 1) y se usaron a una dilución de 1:3000. Se
detectó el anticuerpo unido con IgG de oveja
anti-ratón conjugado con peroxidasa usando el kit
de quimioluminiscencia de Amersham, Inc. (Cambridge, MA).
Los sueros anti-Sp36 de ratón
detectaron dos bandas principales con pesos moleculares aparentes
de 97 y 100 kDa en los 23 lisados neumocócicos sometidos a prueba
(mostrados en la figura 3). Las señales de Sp36 obtenidas de los
serotipos 1, 5, 17F y 22F de S. pneumoniae fueron menores,
lo que indica que o bien se reduce el nivel de expresión de Sp36 en
estas cepas, o bien que Sp36 en estas cepas es antigénicamente
diferente.
Estos datos muestran que Sp36 se conserva
antigénicamente entre las cepas de los 23 serotipos neumocócicos
representados en la vacuna de polisacárido actual.
Se preparó el ADN genómico de cada una de las 23
cepas neumocócicas enumeradas en la sección anterior y también de
la cepa SJ2. Se digirió el ADN con PvuII y BamHI, se
sometió a electroforesis en un gel de agarosa y se transfirió a una
membrana de nailon. Se preparó una sonda amplificando el gen de
Sp36 del ADN tipo 4 noruego (tal como en el ejemplo 1) y marcando
el fragmento amplificado con fluoresceína mediante el método de
cebado al azar, usando un kit de Amersham. Se llevaron a cabo la
hibridación, el lavado y la exposición de la película según el
protocolo suministrado por Amersham. La figura 4 muestra que la
sonda de Sp36 hibridó con ADN de cada una de las 24 cepas
estudiadas. El carril marcado con "M" contenía ADN del fago
lambda, digerido con HindIII y marcado con fluoresceína, como
marcadores de peso molecular.
Ejemplo
4
Con el fin de determinar si Sp36 es inmunogénico
durante la infección neumocócica humana, se usaron sueros de
pacientes con bacteriemia neumocócica probada mediante cultivo en
inmunotransferencias de tipo Western que contenían proteína Sp36
recombinante. En el experimento mostrado en la figura 5, se
diluyeron los sueros de cinco pacientes (indicados como de 1 a 5)
1:3000 y se usaron para estudiar mediante sonda las transferencias
que contenían Sp36 de longitud completa, la mitad
N-terminal de Sp36 (que precede a la región rica en
prolina), o la mitad C-terminal de Sp36 (tras la
región rica en prolina). Se estudiaron mediante sonda los carriles
marcados A (agudo) con suero recogido poco después del diagnóstico
de infección neumocócica; se estudiaron mediante sonda los carriles
C (convaleciente) con suero recogido o bien un mes después
(pacientes 1, 2, y 3) o bien ocho días después de la primera
recogida de suero (pacientes 4 y 5). Para los pacientes 2, 3 y 5,
la reactividad del suero convaleciente con Sp36 fue más fuerte que
la del suero agudo correspondiente. La diferencia entre los sueros
agudos y convalecientes fue particularmente evidente con la mitad
C-terminal de la proteína.
En experimentos adicionales (no mostrados), se
sometieron a prueba individualmente sueros convalecientes de 23
pacientes con infección neumocócica para determinar la reactividad
con Sp36 de longitud completa: Se encontró que 20 de los 23 sueros
se unían a Sp36 en una inmunotransferencia de tipo Western.
Estos experimentos indican que se reconoce Sp36
mediante el sistema inmunitario humano y sugieren que pueden
producirse anticuerpos que pueden unirse a la proteína Sp36 durante
la infección por S. pneumoniae natural en seres humanos.
Puesto que los pacientes estaban infectados con una variedad de
cepas neumocócicas, estos datos también apoyan la idea de que Sp36
está conservada antigénicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La tabla 1 proporciona el porcentaje de
identidad entre las diversas secuencias.
La alineación de las secuencias de aminoácidos
pronosticadas de PhtA, PhtB, PhtD y PhtE usando el programa MEGAUGN
de Lasergene mostró fuerte homología en el extremo
N-terminal con divergencia sustancial de los
extremos C-terminal (figura 6). Se muestra la
alineación de las secuencias de nucleótidos de los mismos genes en
la figura 7. Se compararon las secuencias de aminoácidos y de
nucleótidos usando la obtención del valor de identidad en una
alineación por emparejamiento de Lipman-Pearson, en
la que se divide el número de residuos de apareamiento entre el
total de residuos de apareamiento más el número de residuos no
apareados más el número de residuos en los huecos. En la tabla más
adelante, se muestra el porcentaje de identidad entre cada par de
las secuencias en la intersección de la fila y columna
correspondientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los ratones inmunizados con PhtD recombinantes
derivados de la cepa N4 generaron títulos de anticuerpos potentes
(títulos en el punto final recíprocos que oscilan desde 2.048.00
hasta 4.096.000). Se protegieron los ratones inmunizados con PhtD
frente a muerte tras la inyección intraperitoneal con cualquiera de
tres cepas heterólogas, SJ2 (serotipo 6B; proporcionado por P.
Flynn, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN), EF6796
(serotipo 6A) o EF5668 (serotipo 4; ambas cepas proporcionadas por
D. Briles, Universidad de Alabama, Birmingham). En el experimento
mostrado en la figura 8 (panel A), los diez ratones inmunizados de
manera simulada murieron en el plazo de 10 días tras la exposición a
los neumococos virulentos (cepa SJ2), mientras que el ochenta por
ciento de los ratones inmunizados con PhtD sobrevivió durante el
periodo de observación de 15 días. La inmunización con PhtD también
protegió frente a una cepa de serotipo 6A, EF6796 (panel B) y una
cepa de serotipo 4, EF5668 (panel C). En el experimento mostrado en
la figura 8 (panel B), los diez ratones inmunizados de manera
simulada murieron en el plazo de 7 días tras la exposición a los
neumococos virulentos (cepa EF6796), mientras que el noventa por
ciento de los ratones inmunizados con PhtD sobrevivió durante el
periodo de observación de 15 días. En el experimento mostrado en la
figura 8 (panel C), los diez ratones inmunizados de manera simulada
murieron en el plazo de 6 días tras la exposición a los neumococos
virulentos (cepa EF5668), mientras que ocho de nueve ratones
inmunizados con PhtD sobrevivió durante el periodo de observación
de 15 días.
<110> Johnson, Leslie S.
\hskip1cmKoenig, Scott
\hskip1cmAdamou, John E.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas de Streptococcus
pneumoniae y fragmentos inmunogénicos para vacunas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 469201-444
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<140>
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<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/113.048
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador directo usado en la amplificación de la secuencia del gen
de Sp36.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcggatcct tcttacgagt tgggactgta tcaagc
\hfill36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador directo usado en la amplificación de la secuencia del gen
de Sp36.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcggatcca ctgtatcaag ctagaacggt taagg
\hfill35
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<210> 3
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<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador inverso usado en la amplificación de la secuencia del gen
de Sp36.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipagtcaagctt gtttattttt tccttactta cagatgaagg
\hfill40
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<210> 4
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<211> 838
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<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 4
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1455
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<212> ADN
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 819
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<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 8
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2451
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<212> ADN
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<210> 10
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<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<210> 11
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<211> 2531
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<212> ADN
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<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
Claims (25)
1. Vacuna que comprende un polipéptido idéntico
en al menos un 95% a los aminoácidos 1-819 de la
SEQ ID NO: 4 en un vehículo farmacéuticamente aceptable en una
cantidad eficaz para proteger frente a la infección neumocócica
cuando se administra a un mamífero, en la que dicho polipéptido
comprende dos regiones de superhélice.
2. Vacuna según la reivindicación 1, en la que
dicho porcentaje de identidad es de al menos el 97%.
3. Vacuna que comprende un polipéptido que tiene
la secuencia de aminoácidos de PhtD de la figura 6 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para proteger
frente a la infección neumocócica cuando se administra a un
mamífero.
4. Vacuna según la reivindicación 1, en la que
dicho polipéptido comprende cinco regiones de tríada de
histidina.
5. Vacuna que comprende un fragmento activo de
los aminoácidos 1-819 de la SEQ ID NO: 4 en un
vehículo farmacéuticamente aceptable y en una cantidad suficiente
para proteger frente a la infección neumocócica cuando se
administra a un mamífero y en la que dicho fragmento comprende uno
o más residuos de tríada de histidina y/o una o más regiones de
superhélice.
6. Vacuna según la reivindicación 5, en la que
dicho fragmento activo es un segmento contiguo de los aminoácidos
1-819 de la SEQ ID NO: 4 que incluye al menos un
residuo de tríada de histidina o al menos una región de superhélice
y tiene una longitud de al menos aproximadamente el 10% y no más de
aproximadamente el 85% de la
SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 4.
7. Vacuna según la reivindicación 5, en la que
dicho fragmento activo comprende al menos una región de
superhélice.
8. Vacuna según la reivindicación 5, en la que
dicho fragmento activo comprende al menos una región de tríada de
histidina.
9. Composición que comprende al menos un
anticuerpo específico para un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 95% a los
aminoácidos 1-819 de la SEQ ID NO: 4 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, para provocar inmunidad pasiva frente
a S. pneumoniae.
10. Composición que comprende al menos un
anticuerpo específico para un fragmento activo de un polipéptido
que comprende los aminoácidos 1-819 de la SEQ ID NO:
4, en la que dicho fragmento activo comprende al menos
aproximadamente el 10% y no más de aproximadamente el 85% de dicho
polipéptido, en la que dicho fragmento activo comprende al menos
una tríada de histidina y al menos una región de superhélice en un
vehículo farmacéuticamente aceptable, para provocar inmunidad pasiva
frente a S. pneumoniae.
11. Uso del anticuerpo específico para un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en
al menos un 95% a los aminoácidos 1-819 de la SEQ ID
NO: 4 para la preparación de una composición para tratar o prevenir
la infección producida por S. pneumoniae.
12. Uso del anticuerpo específico para un
fragmento activo de un polipéptido que comprende los aminoácidos
1-819 de la SEQ ID NO: 4, en el que dicho fragmento
activo comprende al menos el 10% y no más del 85% de dicho
polipéptido, en el que dicho fragmento activo comprende al menos
una tríada de histidina y al menos una región de superhélice, para
la preparación de una composición para tratar o prevenir la
infección producida por S. pneumoniae.
13. Vacuna que comprende un polipéptido idéntico
en al menos un 95% a los aminoácidos 1-460 de la
SEQ ID NO: 6 en un vehículo farmacéuticamente aceptable en una
cantidad eficaz para proteger frente a la infección neumocócica
cuando se administra a un mamífero, en la que dicho polipéptido
comprende una región de superhélice.
14. Vacuna según la reivindicación 13, en la que
dicho porcentaje de identidad es de al menos el 97%.
15. Vacuna según la reivindicación 13, en la que
dicho polipéptido comprende 5 regiones de tríada de histidina.
16. Vacuna que comprende un fragmento activo de
un polipéptido idéntico en al menos un 95% a los aminoácidos
1-460 de la SEQ ID NO: 6, en la que dicho fragmento
activo comprende una región de superhélice y está en un vehículo
farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para proteger
frente a la infección neumocócica cuando se administra a un
mamífero.
17. Vacuna según la reivindicación 16, en la que
dicho porcentaje de identidad es de al menos el 97%.
18. Vacuna según la reivindicación 16, en la que
dicho polipéptido tiene la secuencia de residuos de aminoácidos
1-460 de la SEQ ID NO: 6.
19. Vacuna según la reivindicación 18, en la que
dicho fragmento activo es un segmento contiguo de los aminoácidos
1-450 de la SEQ ID NO: 6 que incluye al menos una
tríada de histidina o una región de superhélice y tiene una
longitud de al menos el 10% y no más del 85% de la SEQ ID NO:
6.
20. Vacuna según la reivindicación 16, en la que
dicho fragmento activo comprende una región de superhélice.
21. Vacuna según la reivindicación 16, en la que
dicho fragmento activo comprende al menos una región de tríada de
histidina.
22. Composición que comprende al menos un
anticuerpo específico para un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 95% a los
aminoácidos 1-460 de la SEQ ID NO: 6 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, para provocar inmunidad pasiva frente
a S. pneumoniae.
23. Composición que comprende al menos un
anticuerpo específico para un fragmento activo de un polipéptido
que comprende los aminoácidos 1-460 de la SEQ ID NO:
6, en la que dicho fragmento activo comprende al menos el 10% y no
más del 85% de dicho polipéptido, en la que dicho fragmento activo
comprende al menos una tríada de histidina y una región de
superhélice en un vehículo farmacéuticamente aceptable, para
provocar inmunidad pasiva frente a S. pneumoniae.
24. Uso del anticuerpo específico para un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en
al menos un 95% a los aminoácidos 1-460 de la SEQ ID
NO: 6 para la preparación de una composición para tratar o prevenir
la infección producida por S. pneumoniae.
25. Uso del anticuerpo específico para un
fragmento activo de un polipéptido que comprende los aminoácidos
1-460 de la SEQ ID NO: 6, en el que dicho fragmento
activo comprende al menos el 10% y no más del 85% de dicho
polipéptido, en el que dicho fragmento activo comprende al menos
una tríada de histidina y una región de superhélice para la
preparación de una composición para tratar o prevenir la infección
producida por S. pneumoniae.
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