ES2911490T3 - Composiciones inmunogénicas para su uso en vacunas antineumocócicas - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende al menos un glucoconjugado del polisacárido capsular del serotipo 18C de S. pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora y que comprende además glucoconjugados de polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae unidos covalentemente a una proteína portadora, en la que dichos glucoconjugados se conjugan individualmente con CRM197, para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, en la que dicha composición no comprende un sacárido capsular de los serotipos 18A, 18B y 18F de S. pneumoniae.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones inmunogénicas para su uso en vacunas antineumocócicas
Campo de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar composiciones inmunogénicas para la protección contra el serogrupo 18 de S. pneumoniae. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención comprenderán típicamente antígenos de sacáridos capsulares conjugados (glucoconjugados), en los que los sacáridos se derivan de serotipos de Streptococcus pneumoniae. La presente invención se refiere a nuevas composiciones inmunogénicas para su uso en vacunas antineumocócicas.
Antecedentes de la invención
Las infecciones causadas por neumococos son una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La neumonía, la bacteriemia febril y la meningitis son las manifestaciones más comunes de la enfermedad neumocócica invasiva, mientras que la propagación bacteriana dentro del aparato respiratorio puede dar lugar a una infección del oído medio, una sinusitis o una bronquitis recurrente. En comparación con la enfermedad invasiva, las manifestaciones no invasivas suelen ser menos graves, pero considerablemente más comunes.
El agente etiológico de las enfermedades neumocócicas, Streptococcus pneumoniae (neumococo), es un coco encapsulado Gram-positivo, rodeado por una cápsula de polisacáridos. Las diferencias en la composición de esta cápsula permiten la diferenciación serológica entre unos 91 tipos capsulares, algunos de los cuales se asocian con frecuencia a la enfermedad neumocócica, mientras que otros raramente. Las infecciones neumocócicas invasivas incluyen la neumonía, la meningitis y la bacteriemia febril; entre las manifestaciones no invasivas comunes están la otitis media, la sinusitis y la bronquitis. Las vacunas antineumocócicas conjugadas ("pneumococcal conjugate vaccines", PCV) son vacunas antineumocócicas que se utilizan para proteger contra la enfermedad causada por S. pneumoniae (neumococo). Actualmente hay tres vacunas PCV disponibles en el mercado mundial: PREVNAR® (llamada Prevenar en algunos países) (vacuna heptavalente), SYNFLORIX® (vacuna decavalente) y PREVNAR 13® (vacuna tridecavalente).
Los serotipos específicos que causan la enfermedad más allá del 13 de PREVNAR 13® varían según la región, la población y pueden cambiar con el tiempo debido a la adquisición de resistencia a los antibióticos, la introducción de la vacuna antineumocócica y las tendencias seculares de origen desconocido.
El documento WO 2006/110381 divulga una composición inmunogénica multivalente, que comprende: 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína, en los que cada uno de los conjugados comprende un polisacárido capsular de un serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado con una proteína portadora, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 180, 19A, 19F y 23F.
El documento CN 102 068 690 divulga una vacuna polivalente de polisacáridos capsulares de neumococo que comprende conjugados de polisacáridos capsulares de 23 serotipos de neumococos y una proteína portadora, y los serotipos de los 23 serotipos de neumococos son 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F y 33F.
El documento WO 2007/071707 divulga una composición inmunogénica multivalente de S. pneumoniae con diversos sacáridos capsulares conjugados de diferentes serotipos de S. pneumoniae conjugados con 2 o más proteínas portadoras diferentes, en la que la composición comprende el sacárido capsular del serotipo 19F conjugado con el toxoide diftérico (DT) o CRM197, opcionalmente en la que el 19F es el único sacárido en la composición conjugado con el toxoide diftérico (DT) o CRM197.
El documento 2016/113644 divulga composiciones inmunogénicas para la protección contra S. pneumoniae, en particular contra el serogrupo 9 de S. pneumoniae, limitando el número de conjugados.
El documento WO 2007/116028 divulga una composición inmunogénica multivalente de S. pneumoniae con 9 o más sacáridos capsulares conjugados de diferentes serotipos de S. pneumoniae, en la que la composición comprende el sacárido capsular conjugado 18C que está menos del 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 o 10 % O-acetilado.
La adición de conjugados a una composición inmunogénica no es un proceso sencillo, ya que la combinación de conjugados en una única inyección multivalente puede dar lugar a una competencia entre los diferentes componentes y puede afectar negativamente a la inmunogenicidad de cualquier conjugado individual.
Este fenómeno de interferencia puede limitar el número de conjugados que pueden incluirse en una vacuna multivalente. Por lo tanto, la protección contra un número elevado de serotipos, aunque limita el número de conjugados en la composición, puede ser muy difícil de obtener a pesar del valor significativo.
Un objeto de la presente invención es proporcionar composiciones inmunogénicas para una protección adecuada contra S. pneumoniae, en particular contra S. pneumoniae del serogrupo 18, limitando al mismo tiempo el número de conjugados.
El serogrupo 18 de Streptococcus pneumoniae consta de cuatro serotipos diferentes, 18F, 18A, 18B y 18C, cada uno de los cuales produce su propio polisacárido capsular específico del tipo.
Es un objeto de la presente invención proporcionar composiciones inmunogénicas para una protección adecuada contra los serotipos 18F, 18A, 18B y 18C de S. pneumoniae, con un número limitado de conjugados.
Sumario de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia (o para diagnóstico).
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende al menos un glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora y que comprende además glucoconjugados de polisacáridos capsulares de S. pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F y 23F unidos covalentemente a una proteína portadora, en la que dichos glucoconjugados se conjugan individualmente con CRM197, para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y/o 18F, en la que dicha composición no comprende un sacárido capsular de S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y 18F.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas anteriores comprenden además al menos un glucoconjugado de los serotipos 15B, 22F, 33F, 12F, 10A, 11A y/o 8 de S. pneumoniae.
En otro aspecto, las composiciones inmunogénicas anteriores comprenden además al menos un glucoconjugado de los serotipos 2, 15C, 17F y/o 20 de S. pneumoniae.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas anteriores comprenden además al menos un glucoconjugado del serotipo 9N de S. pneumoniae.
En otro aspecto, la composición inmunogénica es una composición de conjugado neumocócico 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25-valente.
En otro aspecto, los glucoconjugados de las composiciones inmunogénicas se conjugan individualmente con CRM197.
En un aspecto, los glucoconjugados se preparan utilizando la química CDAP o mediante la química de aminación reductora.
La composición inmunogénica puede comprender además antígenos de otros patógenos y/o al menos un adyuvante, tal como fosfato de aluminio, sulfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas son capaces de suscitar anticuerpos IgG en seres humanos que son capaces de unirse a un polisacárido de los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae a una concentración de al menos 0,35 pg/ml, tal como se determina mediante un ensayo ELISA. En un aspecto, las composiciones inmunogénicas son capaces de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en al menos el 50 % de los sujetos, tal como se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA).
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas son capaces de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra el serotipo 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas son capaces de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra el serotipo 18A, 18B y/o 18Fde S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas son para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y/o 18F.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto, para su uso para prevenir la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto o para su uso en un método para proteger o tratar a un ser humano susceptible a la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, mediante la administración de dichas composiciones inmunogénicas por vía sistémica o mucosa.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y/o 18F en un sujeto, para su uso para prevenir la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto o para su uso en un método para proteger o tratar a un ser humano susceptible a la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, mediante la administración de dichas composiciones inmunogénicas por vía sistémica o mucosa.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección asociada con los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica de la invención.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para prevenir una infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica de la invención.
La divulgación se refiere además a un kit que comprende una composición inmunogénica divulgada en el presente documento y un prospecto informativo, en el que dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos funcionales contra los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae y el proceso para producir dicho kit.
Se ha descubierto sorprendentemente que el conjugado de un polisacárido del serotipo 18C, además de suscitar anticuerpos reactivos funcionales contra el serogrupo 18C, puede suscitar también anticuerpos funcionales de reacción cruzada contra los demás serotipos del serogrupo 18: 18A, 18B y/o 18F.
Figuras
Figura 1. Respuestas de funcionalidad cruzada en OPA. Un subconjunto de 59 sueros de adultos vacunados con una vacuna antineumocócica conjugada 13 valente (estudio estadounidense 6115A1-004; identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00427895) se evaluó en OPA para la presencia de anticuerpos funcionales contra los serotipos 18C, 18F, 18A, 18B. Sobre cada grupo se indica el porcentaje de muestras con título positivo en OPA (es decir, >1:8). La media geométrica de los títulos (GMT) aparece en el eje de abscisas debajo de cada grupo.
Figura 2. Respuestas de funcionalidad cruzada en OPA de 66 sueros emparejados antes y después de la vacunacion. Un subconjunto de 66 paneles de suero emparejados antes y después de la vacunación de adultos con una vacuna conjugada antineumocócica 13 valente (estudio 6115A1-3005; identificación de ClinicalTrials.gov: NCT00546572) fueron evaluados en OPA para la presencia de anticuerpos funcionales contra los serotipos 18C, 18F, 18A y 18B. Sobre cada grupo se indica el porcentaje de muestras con título positivo en OPA (es decir, >1:8). La media geométrica de los títulos (GMT) aparece en el eje de abscisas debajo de cada grupo.
Figura 3. Curvas de distribución acumulada inversa (RCDC) antes y después de la inmunización - serotipo neumocócico 18C. Curvas de distribución acumulada inversa de los títulos en OPA para el serotipo 18C de un panel de suero emparejado antes y después de la vacunación (N = 66) vacunado con una vacuna antineumocócica conjugada 13 valente (estudio 6115A1-3005; identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00546572). Los gráficos representan el porcentaje de sueros con título positivo en OPA (es decir, >1:8).
Figura 4. Curvas de distribución acumulada inversa (RCDC) antes y después de la inmunización - serotipo neumocócico 18A. Curvas de distribución acumulada inversa de los títulos en OPA para el serotipo 18A de un panel de suero emparejado antes y después de la vacunación (N = 66) vacunado con una vacuna antineumocócica conjugada 13 valente (estudio 6115A1-3005; identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00546572). Los gráficos representan el porcentaje de sueros con título positivo en OPA (es decir, >1:8).
Figura 5. Curvas de distribución acumulada inversa (RCDC) antes y después de la inmunización - serotipo neumocócico 18B. Curvas de distribución acumulada inversa de los títulos en OPA para el serotipo 18B de un panel de suero emparejado antes y después de la vacunación (N = 66) vacunado con una vacuna antineumocócica conjugada 13 valente (estudio 6115A1-3005; identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00546572). Los gráficos representan el porcentaje de sueros con título positivo en OPA (es decir, >1:8).
Figura 6. Curvas de distribución acumulada inversa (RCDC) antes y después de la inmunización - serotipo neumocócico 18F. Curvas de distribución acumulada inversa de los títulos en OPA para el serotipo 18F de un panel de suero emparejado antes y después de la vacunación (N = 66) vacunado con una vacuna antineumocócica conjugada 13 valente (estudio 6115A1-3005; identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00546572). Los gráficos representan el porcentaje de sueros con título positivo en OPA (es decir, >1:8).
1. Composiciones inmunogénicas de la invención
Las composiciones inmunogénicas de la presente invención comprenderán típicamente antígenos de sacáridos capsulares conjugados (también denominados glucoconjugados), en los que los sacáridos se derivan de serotipos de S. pneumoniae.
Preferiblemente, el número de sacáridos capsulares de S. pneumoniae puede oscilar entre 13 serotipos (o "v", valencias) y 25 serotipos diferentes (25v). En una realización hay 13 serotipos diferentes. En una realización hay 14 serotipos diferentes. En una realización hay 15 serotipos diferentes. En una realización hay 16 serotipos diferentes. En una realización hay 17 serotipos diferentes. En una realización hay 18 serotipos diferentes. En una realización hay 19 serotipos diferentes. En una realización hay 20 serotipos diferentes. En una realización hay 21 serotipos diferentes. En una realización hay 22 serotipos diferentes. En una realización hay 23 serotipos diferentes. En una realización hay 24 serotipos diferentes. En una realización hay 25 serotipos diferentes. Los sacáridos capsulares se conjugan con una proteína portadora para formar glucoconjugados como se describe a continuación.
Si el portador de proteína es el mismo para 2 o más sacáridos en la composición, los sacáridos podrían conjugarse a la misma molécula de portador de proteína (moléculas portadoras que tienen 2 o más sacáridos diferentes conjugados a ellas) [véase, por ejemplo, el documento WO 2004/083251].
Sin embargo, en una realización preferida, los sacáridos se conjugan individualmente a diferentes moléculas de portador de proteína (cada molécula de portador de proteína solo tiene un tipo de sacárido conjugado a ella). En dicha realización, se dice que los sacáridos capsulares se conjugan individualmente con la proteína portadora.
Para los fines de la invención, el término "glucoconjugado" indica un sacárido capsular unido covalentemente a una proteína portadora. En una realización, un sacárido capsular está unido directamente a una proteína portadora. En una segunda realización, un sacárido bacteriano se une a una proteína a través de un espaciador/conector.
1.1 Proteína portadora de la invención
Un componente del glucoconjugado de la invención es una proteína portadora a la que se conjuga el sacárido. Las expresiones "portador de proteína" o "proteína portadora" o el término "portador" pueden utilizarse indistintamente en el presente documento. Las proteínas portadoras deben poder someterse a procedimientos de conjugación convencionales.
En una realización preferida, la proteína portadora de los glucoconjugados se selecciona en el grupo que consiste en: DT (toxina diftérica), TT (toxina tetánica) o fragmento C de TT, CRM197 (una variante no tóxica, pero antigénicamente idéntica de la toxina diftérica), la cadena A de la toxina diftérica mutante CRM197 (documento CN103495161), otros mutantes de DT (tales como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. (1973), J. Biol. Chem. 218:3838-3844, 1973); CRM9, CRM102, CRM 103 o CRM107; y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, ed. Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992); deleción o mutación de Glu-148 a Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones divulgadas en la patente de EE.UU. n.° 4.709.017 y 4.950.740; la mutación de al menos uno o más restos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones divulgadas en las patentes de EE. UU. n.os 5.917.017 y 6.455.673o un fragmento divulgado en la patente de EE. UU. n.° 5.843.711, neumolisina neumocócica (ply) (Kuo et al. (1995), Infect. Immun., 63:2706-2713) que incluye ply desintoxicada de alguna manera, por ejemplo dPLY-GMBS (documentos WO 2004/081515 y WO 2006/032499) o dPLY-formol, PhtX, que incluyen PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (las secuencias de PhtA, PhtB, PhtD o PhtE se divulgan en los documentos WO 00/37105 y WO 00/39299) y fusiones de proteínas Pht, por ejemplo, fusiones PhtDE, fusiones PhtBE, Pht A-E (documento WO 01/98334, documento WO 03/054007, documento WO 2009/000826), OMPC (proteína de la membrana externa meningocócica - generalmente extraída de Neisseria meningitidis del serogrupo B (documento EP0372501), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenzae; véase, por ejemplo el documento EP0594610 B), o sus equivalentes inmunológicamente funcionales, péptidos sintéticos (documento EP0378881, documento EP0427347), proteínas de choque térmico (documento W o 93/17712, documento WO 94/03208), proteínas de la tos ferina (documento WO 98/58668, documento EP0471177), citoquinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (documento WO 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógenos (Falugi et al. (2001), Eur. J. Immunol., 31:3816-3824), tal como la proteína N19 (Baraldoi et al. (2004), Infect. Immun., 72:4884-4887), proteína de la superficie neumocócica PspA (documento WO 02/091998), proteínas de captación de hierro (documento WO 01/72337), toxina A o B de Clostridium difficile (documento WO 00/61761), proteínas de unión a la transferrina, proteína de adhesión neumocócica (PsaA), exotoxina A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (en particular, mutantes no tóxicos de la misma (como la exotoxina A con una sustitución en el ácido glutámico 553 (Douglas et al. (1987), J. Bacteriol., 169(11):4967-4971)). Otras proteínas, como la ovoalbúmina, la hemocianina de lapa (KLH), la albúmina de suero bovino (BSA) o el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), también pueden utilizarse como proteínas portadoras. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivadas, tales como el toxoide del cólera (por ejemplo, como se describe en el documento WO 2004/083251), Escherichia coli LT, E. coli ST y la exotoxina A de P. aeruginosa.
En una realización preferida, la proteína portadora de los glucoconjugados se selecciona independientemente del grupo que consiste en TT, DT, mutantes de DT (como CRM197), la proteína D de H. influenzae , PhtX, PhtD, fusiones de PhtDE (en particular las descritas en los documentos WO 01/98334 y WO 03/054007), neumolisina desintoxicada, PorB, proteína N19, PspA, OMPC, toxina A o B de C. difficile y PsaA.
En una realización, la proteína portadora de los glucoconjugados de la invención es DT (toxoide diftérico). En otra realización, la proteína portadora de los glucoconjugados de la invención es TT (toxoide tetánico).
En otra realización, la proteína portadora de los glucoconjugados de la invención es PD (proteína D de H. influenzae; véase, por ejemplo, el documento EP0594610 B).
La proteína CRM197 es una forma no tóxica de la toxina diftérica, pero es inmunológicamente indistinguible de la toxina diftérica. El CRM197 es producido por Corynebacterium diphtheriae infectado por el fago no toxigénico p197tox-creado por mutagénesis con nitrosoguanidina del corinefago beta toxigénico (Uchida et al. (1971), Nature New Biology 233:8-11). La proteína CRM 197 tiene el mismo peso molecular que la toxina diftérica, pero difiere de ella por un único cambio de base (guanina a adenina) en el gen estructural. Este único cambio de base provoca una sustitución de aminoácidos (ácido glutámico por glicina) en la proteína madura y elimina las propiedades tóxicas de la toxina diftérica. La proteína CRM197 es un portador seguro y eficaz de sacáridos dependiente de las células T. Se pueden encontrar más detalles sobre el CRM197 y su producción, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.614.382. En una realización, los sacáridos capsulares de la invención se conjugan con la proteína CRM197 o la cadena A de CRM197 (véase el documento CN103495161). En una realización, los sacáridos capsulares de la invención se conjugan con la cadena A de CRM 197 obtenida mediante la expresión por E. coli genéticamente recombinante (véase el documento CN103495161). En una realización, los sacáridos capsulares de la invención están todos conjugados con CRM 197. En una realización, los sacáridos capsulares de la invención están todos conjugados a la cadena A del CRM197.
En consecuencia, en realizaciones frecuentes, los glucoconjugados de la invención comprenden CRM197 como la proteína portadora, en la que el polisacárido capsular está unido covalentemente a CRM197.
1.2 Sacárido capsular de la invención
El término "sacárido" a lo largo de esta memoria descriptiva puede indicar un polisacárido o un oligosacárido e incluye ambos. En realizaciones frecuentes, el sacárido es un polisacárido, en particular un polisacárido capsular de S. pneumoniae.
Los polisacáridos capsulares se preparan mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.
En la presente invención, pueden prepararse polisacáridos capsulares, por ejemplo, de los serotipos 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae. Normalmente, los polisacáridos capsulares se producen cultivando cada serotipo de S. pneumoniae en un medio (por ejemplo, en un medio a base de soja), y los polisacáridos se preparan a partir del cultivo de la bacteria. Las cepas bacterianas de S. pneumoniae utilizadas para hacer los respectivos polisacáridos que se utilizan en los glucoconjugados de la invención pueden obtenerse de colecciones de cultivos establecidos o de muestras clínicas.
La población del organismo (cada serotipo de S. pneumoniae ) a menudo se amplía desde un vial de siembra a botellas de siembra se hace pasar por uno o más fermentadores de siembra de volumen creciente hasta que se alcanzan los volúmenes de fermentación a escala de producción. Al final del ciclo de crecimiento, las células se lisan y el caldo lisado se recoge para su procesamiento posterior (purificación) (véase, por ejemplo, el documento WO 2006/110381, el documento WO 2008/118752y las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas n.os 2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 y 2008/0286838).
Los polisacáridos individuales se purifican típicamente mediante centrifugación, precipitación, ultrafiltración y/o cromatografía en columna (véanse, por ejemplo los documentos WO 2006/110352 y W o 2008/118752).
Los polisacáridos purificados pueden activarse (por ejemplo, químicamente) para hacerlos capaces de reaccionar (por ejemplo, directamente con la proteína portadora o a través de un conector, tal como un espaciador eTEC) y luego incorporarse a los glucoconjugados de la invención, como se describe más adelante.
Los polisacáridos capsulares de S. pneumoniae comprenden unidades de oligosacáridos repetidas que pueden contener hasta 8 restos azúcar.
En una realización, el sacárido capsular de la invención puede ser una unidad de oligosacárido, o una cadena de sacáridos de longitud más corta que la nativa de unidades de oligosacáridos repetidas. En una realización, el sacárido capsular de la invención es una unidad de oligosacárido repetitiva del serotipo correspondiente.
En una realización, los sacáridos capsulares de la invención pueden ser oligosacáridos. Los oligosacáridos tienen un bajo número de unidades de repetición (normalmente entre 5 y 15 unidades de repetición) y suelen obtenerse de modo sintético o mediante hidrólisis de polisacáridos.
En una realización, todos los sacáridos capsulares de la presente invención y en las composiciones inmunogénicas de la presente invención son polisacáridos. Los polisacáridos capsulares de alto peso molecular son capaces de inducir determinadas respuestas inmunitarias de anticuerpos debido a los epítopos presentes en la superficie antigénica. El aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular se contempla preferiblemente para su uso en los conjugados, las composiciones y los métodos de la presente invención.
En algunas realizaciones, los polisacáridos purificados antes de la conjugación tienen un peso molecular de entre 5 kDa y 4.000 kDa. En otras realizaciones de este tipo, el polisacárido tiene un peso molecular de entre 10 kDa y 4.000 kDa; entre 50 kDa y 4.000 kDa; entre 50 kDa y 3.000 kDa; entre 50 kDa y 2.000 kDa; entre 50 kDa y 1.500 kDa; entre 50 kDa y 1.000 kDa; entre 50 kDa y 750 kDa; entre 50 kDa y 500 kDa; entre 100 kDa y 4.000 kDa; entre 100 kDa y 3.000 kDa; entre 100 kDa y 2.000 kDa; entre 100 kDa y 1.500 kDa; entre 100 kDa y 1.000 kDa; entre 100 kDa y 750 kDa; entre 100 kDa y 500 kDa; entre 100 y 400 kDa; entre 200 kDa y 4.000 kDa; entre 200 kDa y 3.000 kDa; entre 200 kDa y 2.000 kDa; entre 200 kDa y 1.500 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; o entre 200 kDa y 500 kDa.
En otras realizaciones, el polisacárido capsular tiene un peso molecular de entre 70 kDa y 150 kDa; entre 80 kDa y 160 kDa; entre 90 kDa y 250 kDa; entre 100 kDa y 1.000; entre 100 kDa y 500 kDa; entre 100 kDa y 400 kDa; entre 100 kDa y 160 kDa; entre 150 kDa y 600 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; entre 200 kDa y 600 kDa; entre 200 kDa y 400 kDa; entre 300 kDa y 1.000 kDa; entre 300 kDa y 600 kDa; entre 300 kDa y 500 kDa; o entre 500 kDa y 600 kDa.
En otras realizaciones, el polisacárido capsular tiene un peso molecular de entre 5 kDa y 100 kDa; entre 7 kDa y 100 kDa; entre 10 kDa y 100 kDa; entre 20 kDa y 100 kDa; entre 30 kDa y 100 kDa; entre 40 kDa y 100 kDa; entre 50 kDa y 100 kDa; entre 60 kDa y 100 kDa; entre 70 kDa y 100 kDa; entre 80 kDa y 100 kDa; entre 90 kDa y 100 kDa; entre 5 kDa y 90 kDa; entre 5 kDa y 80 kDa; entre 5 kDa y 70 kDa; entre 5 kDa y 60 kDa; entre 5 kDa y 50 kDa; entre 5 kDa y 40 kDa; entre 5 kDa y 30 kDa; entre 5 kDa y 20 kDa; o entre 5 kDa y 10 kDa. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
Un polisacárido se puede reducir ligeramente en tamaño durante los procedimientos normales de purificación. Además, como se describe en el presente documento, el polisacárido puede someterse a técnicas de dimensionamiento antes de la conjugación. Se puede emplear un dimensionamiento mecánico o químico. La hidrólisis química puede realizarse con ácido acético. Por ejemplo, los sacáridos del serotipo 18C pueden ser dimensionados (y des-O-acetilados) mediante un tratamiento con ácido acético (véase, por ejemplo, el documento WO2006/110381, p. 37, líneas 1-4). El dimensionamiento mecánico puede realizarse mediante cizallamiento por homogeneización a alta presión. Los intervalos de peso molecular mencionados anteriormente se refieren a polisacáridos purificados antes de la conjugación (por ejemplo, antes de la activación).
En una realización preferida, los polisacáridos purificados son polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F de S. pneumoniae, en los que el polisacárido capsular tiene un peso molecular incluido dentro de uno de los intervalos de peso molecular descritos anteriormente.
Tal y como se utiliza en este documento, la expresión "peso molecular" del polisacárido o del conjugado proteína portadora-polisacárido se refiere al peso molecular calculado mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) combinada con un detector de dispersión de luz láser multiángulo (MALLS).
En algunas realizaciones, los sacáridos neumocócicos de los serotipos 9V, 18C, 11A, 15B, 22F y/o 33F de la invención están O-acetilados. En algunas realizaciones, los sacáridos neumocócicos de los serotipos 9V, 11A, 15B, 22F y/o 33F de la invención están O-acetilados. En una realización preferida, el sacárido neumocócico del serotipo 18C de la invención está des-O-acetilado. Por ejemplo, los sacáridos del serotipo 18C pueden ser des-O-acetilados mediante un tratamiento ácido (véase, por ejemplo, el documento Wo2006/110381p.p. 37, líneas 1-4).
El grado de O-acetilación del polisacárido puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por RMN de protones (véase, por ejemplo Lemercinier et al. (1996), Carbohydrate Research, 296:83-96; Jones et al. (2002), J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30:1233-1247; documentos WO 2005/033148 y WO 00/56357). Otro método comúnmente utilizado se describe en Hestrin (1949), J. Biol. Chem.
180:249-261. Preferiblemente, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante un análisis de HPLC iónico.
Los polisacáridos purificados descritos en el presente documento se activan químicamente para que los sacáridos sean capaces de reaccionar con la proteína portadora. Estos conjugados antineumocócicos se preparan mediante procesos separados y se formulan en una única fórmula de dosificación como se describe a continuación.
1.3 Glucoconjugados de la invención
Los sacáridos purificados se activan químicamente para que los sacáridos (es decir, los sacáridos activados) sean capaces de reaccionar con la proteína portadora, ya sea directamente o a través de un conector. Una vez activado, cada sacárido capsular se conjuga por separado con una proteína portadora para formar un glucoconjugado. En otra realización, cada sacárido capsular se conjuga con la misma proteína portadora. La activación química de los sacáridos y la posterior conjugación con la proteína portadora pueden lograrse mediante los métodos de activación y conjugación divulgados en el presente documento.
1.3.1 Glucoconjugados de la invención
Los polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y/o 33F de S. pneumoniae se preparan como se ha descrito anteriormente.
En una realización, los polisacáridos se activan con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El sacárido activado se puede acoplar directamente o a través de un grupo espaciador (conector) a un grupo amino de la proteína portadora (preferiblemente, CRM197). Por ejemplo, el espaciador puede ser cistamina o cisteamina para dar un polisacárido tiolado que se puede acoplar al portador a través de un enlace tioéter obtenido tras la reacción con una proteína portadora activada por maleimida (por ejemplo, mediante el uso del éster de N-[Y-maleimidobutirloxi]succinimida (GMBS)) o una proteína portadora holoacetilada (por ejemplo, mediante el uso de yodoacetimida, bromoacetato de N-succinimidilo (SBA; SIB), N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB), sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SlAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), o 3-[bromoacetamido]proprionato de succinimidilo (SBAP)). Opcionalmente, el éster de cianato (opcionalmente preparado por la química CDAP) se acopla con hexanodiamina o hidrazida del ácido adípico (ADH) y el sacárido derivatizado con amino se conjuga con la proteína portadora (por ejemplo, CRM197) usando mediante el uso de la química de carbodiimida (por ejemplo, EDAc o EDC) a través de un grupo carboxilo en la proteína portadora. Tales conjugados se describen, por ejemplo, en los documentos WO 93/15760, WO 95/08348 y W o 96/129094.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y/o 33F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1,4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7f , 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP.
Otras técnicas adecuadas para la conjugación utilizan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido pnitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muchas de estas se describen en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 98/42721. La conjugación puede implicar un conector carbonilo que se puede formar por reacción de un grupo hidroxilo libre del sacárido con CDI (Bethell et al. (1979), J. Biol. Chem., 254:2572-2574; Hearn et al. (1981), J. Chromatogr., 218:509-518), seguido de una reacción con una proteína para formar un enlace carbamato. Esto puede implicar la reducción del terminal anomérico a un grupo hidroxilo primario, la protección/desprotección opcional del grupo hidroxilo primario, la reacción del grupo hidroxilo primario con CDI para formar un intermedio de carbamato de CDI y el acoplamiento del intermedio de carbamato de CDI con un grupo amino en una proteína.
En una realización preferida, al menos uno de los polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae se conjuga con la proteína portadora mediante aminación reductora (como se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas n.os 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 y 2007/0184071, y documentos WO 2006/110381, WO 2008/079653y WO 2008/143709).
En una realización de la presente invención, el glucoconjugado de S. pneumoniae de serotipo 18C se prepara por aminación reductora. En una realización de la presente invención, el glucoconjugado de S. pneumoniae de serotipo 6A se prepara por aminación reductora. En una realización de la presente invención, el glucoconjugado de S. pneumoniae de serotipo 19A se prepara por aminación reductora. En una realización de la presente invención, el glucoconjugado de S. pneumoniae de serotipo 3 se prepara por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 6A y 19a de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 3, 6A y 19A de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En una realización preferida de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1,4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1,4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora. En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23f y 33F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
En otra realización preferida, los glucoconjugados de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15C, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae se preparan por aminación reductora.
La aminación reductora implica dos etapas, (1) la oxidación del polisacárido, (2) la reducción del polisacárido activado y una proteína portadora para formar un conjugado. Antes de la oxidación, el polisacárido se hidroliza opcionalmente. Puede emplearse la hidrólisis mecánica o química. La hidrólisis química puede realizarse con ácido acético. La etapa de oxidación puede implicar la reacción con peryodato. Para el objetivo de la presente invención, el término "peryodato" incluye tanto el peryodato como el ácido peryódico; el término también incluye tanto el metaperyodato (IO4-) como el ortoperyodato (IO65-) e incluye las diversas sales de peryodato (por ejemplo, peryodato de sodio y peryodato de potasio). En una realización, el polisacárido capsular se oxida en presencia de metaperyodato, preferiblemente en presencia de peryodato de sodio (NaIO4). En otra realización, el polisacárido capsular se oxida en presencia de ortoperyodato, preferiblemente en presencia de ácido periódico.
En una realización, el agente oxidante es un compuesto de radical nitroxilo o nitróxido estable, tales como los compuestos piperidin-N-oxi o pirrolidin-N-oxi, en presencia de un oxidante para oxidar selectivamente los hidroxilos primarios (como se describe en el documento w O 2014/097099). En dicha reacción, el oxidante real es la sal de N-oxoamonio, en un ciclo catalítico. En un aspecto, dicho compuesto de radical nitroxilo o nitróxido estable son compuestos de piperidin-N-oxi o pirrolidin-N-oxi. En un aspecto, dicho compuesto de radical nitroxilo o nitróxido estable porta un resto TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinilox) o PROXYL (2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi). En un aspecto, dicho compuesto de radical nitroxilo estable es TEMPO o un derivado del mismo. En un aspecto, dicho oxidante es una molécula que porta un resto N-halo. En un aspecto, dicho oxidante se selecciona del grupo que consiste en N-clorosuccinimida, N-bromosuccinimida, N-yodosuccinimida, ácido dicloroisocianúrico, 1,3,5-tricloro-1,3,5-triazinan-2,4,6-triona, ácido dibromoisocianúrico, 1,3,5-tribromo-1,3,5-triazinan-2,4,6-triona, ácido diyodoisocianúrico y 1,3,5-triyodo-1,3,5-triazinan-2,4,6-triona. Preferiblemente, dicho oxidante es la N-clorosuccinimida.
En una realización preferida, los polisacáridos capsulares de los serotipos 12F de S. pneumoniae se conjugan con la proteína portadora mediante aminación reductora, en la que el agente oxidante es el radical libre 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) y la N-clorosuccinimida (NCS) como cooxidante (como se describe en el documento WO 2014/097099). Por lo tanto, en un aspecto, los glucoconjugados de S. pneumoniae del serotipo 12F se obtienen mediante un método que comprende las etapas de: a) hacer reaccionar un sacárido 12F con 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) y N-clorosuccinimida (NCS) en un disolvente acuoso para producir un sacárido activado; y b) hacer reaccionar el sacárido activado con una proteína portadora que comprende uno o más grupos amina (dicho método se denomina en adelante como la "aminación reductora TEMPO/NCS").
Opcionalmente, la reacción de oxidación se extingue mediante la adición de un agente de extinción. El agente de extinción puede seleccionarse entre dioles vecinales, 1,2-aminoalcoholes, aminoácidos, glutatión, sulfito, bisulfato, ditionito, metabisulfito, tiosulfato, fosfitos, hipofosfitos o ácido fosforoso (tales como glicerol, etilenglicol, propan-1,2-diol, butan-1,2-diol o butan-2,3-diol, ácido ascórbico).
Después de la etapa de oxidación del polisacárido, se dice que el polisacárido está activado y se denomina en el presente documento "polisacárido activado". El polisacárido activado y la proteína portadora pueden ser liofilizados, ya sea de forma independiente (liofilización discreta) o juntos (coliofilizados). En una realización, el polisacárido activado y la proteína portadora están coliofilizados. En otra realización, el polisacárido activado y la proteína portadora se liofilizan de forma independiente.
En una realización, la liofilización tiene lugar en presencia de un azúcar no reductor, y los posibles azúcares no reductores incluyen la sacarosa, la trehalosa, la rafinosa, la estaquiosa, la melezitosa, el dextrano, el manitol, el lactitol y el palatinit.
La segunda etapa del proceso de conjugación es la reducción del polisacárido activado y una proteína portadora para formar un conjugado (la llamada aminación reductora), utilizando un agente reductor. Los agentes reductores adecuados son los cianoborohidruros (tales como el cianoborohidruro de sodio, el triacetoxiborohidruro de sodio o el borohidruro de sodio o de zinc en presencia de ácidos de Bronsted o de Lewis), amino-boranos, tales como piridinaborano, 2-picolina-borano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMeiPrN-BH3, bencilamina-borano o 5-etil-2-metilpiridina-borano (PEMB) o la resina de intercambio de borohidruros. En una realización, el agente reductor es cianoborohidruro de sodio.
En una realización, la reacción de reducción se lleva a cabo en un disolvente acuoso (por ejemplo, seleccionado de PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicina o HEPB, a un pH entre 6,0 y 8,5, 7,0 y 8,0, o 7,0 y 7,5) y, en otra realización, la reacción se lleva a cabo en un disolvente aprótico. En una realización, la reacción de reducción se lleva a cabo en el disolvente DMSO (dimetilsulfóxido) o DMF (dimetilformamida). El disolvente DMSO o DMF puede utilizarse para reconstituir el polisacárido activado y la proteína portadora que ha sido liofilizada.
Al final de la reacción de reducción, pueden quedar grupos aldehídos sin reaccionar en los conjugados, los cuales pueden ser bloqueados utilizando un agente de bloqueo adecuado. En una realización, este agente de bloqueo es borohidruro de sodio (NaBH4). Tras la conjugación (la reacción de reducción y, opcionalmente, el bloque), los glucoconjugados pueden purificarse (enriquecerse con respecto a la cantidad de conjugado de polisacárido-proteína) mediante una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen la diálisis, la ejecución de una concentración/diafiltración, la elución/precipitación por filtración de flujo tangencial, la cromatografía en columna (DEAE o cromatografía de interacción hidrofóbica) y la filtración en profundidad. En una realización, los glucoconjugados se purifican por diafilitración o cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de exclusión por tamaño.
En una realización, los glucoconjugados se esterilizan por filtración.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan mediante química CDAp y el glucoconjugado del serotipo 6A de S. pneumoniae se prepara mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan mediante química CDAP y el glucoconjugado del serotipo 19A de S. pneumoniae se prepara mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan mediante química CDAP y los glucoconjugados de los serotipos 6A y 19A de S. pneumoniae se preparan mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae se preparan mediante química CDAP y los glucoconjugados de los serotipos 3, 6A y 19A de S. pneumoniae se preparan mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP y el glucoconjugado del serotipo 6A de S. pneumoniae se prepara mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan utilizando la química CDAP y el glucoconjugado del serotipo 19A de S. pneumoniae se prepara mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan mediante química CDAP y los glucoconjugados de los serotipos 6A y 19A de S. pneumoniae se preparan mediante aminación reductora.
En una realización de la presente invención, los glucoconjugados de los serotipos 1,4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 14, 18C, 19F, 22F y 23F de S. pneumoniae se preparan mediante química CDAP y los glucoconjugados de los serotipos 3, 6A y 19A de S. pneumoniae se preparan mediante aminación reductora.
En una realización, los glucoconjugados de la invención se preparan utilizando la conjugación eTEC, tal como se describe en el documento WO 2014/027302. Dichos glucoconjugados comprenden un sacárido conjugado covalentemente a una proteína portadora a través de uno o más espaciadores eTEC, en los que el sacárido está conjugado covalentemente al espaciador eTEC a través de un enlace carbamato, y en los que la proteína portadora está conjugada covalentemente al espaciador eTEC a través de un enlace amida. Los glucoconjugados unidos con eTEC de la invención pueden estar representados por la fórmula general (I):
Figure imgf000011_0001
en la que los átomos que componen el espaciador eTEC están contenidos en la caja central.
El espaciador eTEC incluye siete átomos lineales (es decir, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-) y proporciona enlaces estables de tioéter y amida entre el sacárido y la proteína portadora. La síntesis del glucoconjugado único con eTEC implica la reacción de un grupo hidroxilo activado del sacárido con el grupo amino de un reactivo de tioalquilamina, por ejemplo, cistamina o cisteinamina o una sal de los mismos, formando un enlace de carbamato con el sacárido para proporcionar un sacárido tiolado. La generación de uno o más grupos sulfhidrilo libres se realiza por reacción con un agente reductor para proporcionar un sacárido tiolado activado. La reacción de los grupos sulfhidrilo libres del sacárido tiolado activado con una proteína portadora activada que tiene uno o más grupos a-haloacetamida en restos que contienen amina genera un enlace tioéter para formar el conjugado, en el que la proteína portadora está unida al espaciador eTEC mediante un enlace amida.
En dichos glucoconjugados de la invención, el sacárido puede ser un polisacárido o un oligosacárido. La proteína portadora puede seleccionarse de entre cualquier portador adecuado como se describe en el presente documento o conocido por los expertos en la técnica. En realizaciones frecuentes, el sacárido es un polisacárido. En algunas de estas realizaciones, la proteína portadora es CRM197. En algunas de estas realizaciones, el glucoconjugado unido con eTEC comprende un polisacárido capsular del serotipo 33F de S. pneumoniae.
En realizaciones particularmente preferidas, el glucoconjugado unido con eTEC comprende un polisacárido capsular del serotipo 33F (Pn33F) neumocócico, que se conjuga covalentemente con CRM197 a través de un espaciador eTEC (glucoconjugados unidos con eTEC del serotipo 33F).
En algunas realizaciones, los glucoconjugados de los serotipos 1, 7F, 9V y/o 18C de S. pneumoniae de la invención están O-acetilados. En algunas realizaciones, el glucoconjugado de los serotipos 1, 7F y 9V de S. pneumoniae está O-acetilado y el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae está des-O-acetilado.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 1 de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre el 10 y el 100 %, entre el 20 y el 100 %, entre el 30 y el 100 %, entre el 40 y el 100 %, entre el 50 y el 100 %, entre el 60 y el 100 %, entre el 70 y el 100 %, entre el 75 y el 100 %, el 80 y el 100 %, el 90 y el 100 %, el 50 y el 90 %, el 60 y el 90 %, el 70 y el 90 % o el 80 y el 90 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es > 10 %, > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 %, o aproximadamente 100 %.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 7F de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre el 10 y el 100 %, entre el 20 y el 100 %, entre el 30 y el 100 %, entre el 40 y el 100 %, entre el 50 y el 100 %, entre el 60 y el 100 %, entre el 70 y el 100 %, entre el 75 y el 100 %, el 80 y el 100 %, el 90 y el 100 %, el 50 y el 90 %, el 60 y el 90 %, el 70 y el 90 % o el 80 y el 90 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es > 10 %, > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 %, o aproximadamente 100 %.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 9V de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre el 10 y el 100 %, entre el 20 y el 100 %, entre el 30 y el 100 %, entre el 40 y el 100 %, entre el 50 y el 100 %, entre el 60 y el 100 %, entre el 70 y el 100 %, entre el 75 y el 100 %, el 80 y el 100 %, el 90 y el 100 %, el 50 y el 90 %, el 60 y el 90 %, el 70 y el 90 % o el 80 y el 90 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es > 10 %, > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 %, o aproximadamente 100 %.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre el 10 y el 100 %, entre el 20 y el 100 %, entre el 30 y el 100 %, entre el 40 y el 100 %, entre el 50 y el 100 %, entre el 60 y el 100 %, entre el 70 y el 100 %, entre el 75 y el 100 %, el 80 y el 100 %, el 90 y el 100 %, el 50 y el 90 %, el 60 y el 90 %, el 70 y el 90 % o el 80 y el 90 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es > 10 %, > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 %, o aproximadamente 100 %. Sin embargo, es preferible que el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae esté desacetilado. En algunas de dichas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre 0 y 50 %, entre 0 y 40 %, entre 0 y 30 %, entre 0 y 20 %, entre 0 y 10 %, entre 0 y 5 %, o entre 0 y 2 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es < 50 %, < 40 %, < 30 %, < 20 %, < 10 %, < 5 %, < 2 %, o < 1 %.
El porcentaje de O-acetilación es el porcentaje de un sacárido dado en relación con el 100 % (en el que cada unidad de repetición está totalmente acetilada en relación con su estructura acetilada).
En algunas realizaciones, los glucoconjugados de la presente invención comprenden un sacárido que tiene un peso molecular de entre 5 kDa y 2.000 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 50 kDa y 1.000 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 70 kDa y 900 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 800 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 200 kDa y 600 kDa. En otras realizaciones de este tipo, el sacárido tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 1000 kDa; entre 100 kDa y 900 kDa; entre 100 kDa y 800 kDa; entre 100 kDa y 700 kDa; entre 100 kDa y 600 kDa; entre 100 kDa y 500 kDa; entre 100 kDa y 400 kDa; entre 100 kDa y 300 kDa; entre 150 kDa y 1.000 kDa; entre 150 kDa y 900 kDa; entre 150 kDa y 800 kDa; entre 150 kDa y 700 kDa; entre 150 kDa y 600 kDa; entre 150 kDa y 500 kDa; entre 150 kDa y 400 kDa; entre 150 kDa y 300 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; entre 200 kDa y 900 kDa; entre 200 kDa y 800 kDa; entre 200 kDa y 700 kDa; entre 200 kDa y 600 kDa; entre 200 kDa y 500 kDa; entre 200 kDa y 400 kDa; entre 200 kDa y 300; entre 250 kDa y 1.000 kDa; entre 250 kDa y 900 kDa; entre 250 kDa y 800 kDa; entre 250 kDa y 700 kDa; entre 250 kDa y 600 kDa; entre 250 kDa y 500 kDa; entre 250 kDa y 400 kDa; entre 250 kDa y 350 kDa; entre 300 kDa y 1.000 kDa; entre 300 kDa y 900 kDa; entre 300 kDa y 800 kDa; entre 300 kDa y 700 kDa; entre 300 kDa y 600 kDa; entre 300 kDa y 500 kDa; entre 300 kDa y 400 kDa; entre 400 kDa y 1.000 kDa; entre 400 kDa y 900 kDa; entre 400 kDa y 800 kDa; entre 400 kDa y 700 kDa; entre 400 kDa y 600 kDa; entre 500 kDa y 600 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 5 kDa y 100 kDa; entre 7 kDa y 100 kDa; entre 10 kDa y 100 kDa; entre 20 kDa y 100 kDa; entre 30 kDa y 100 kDa; entre 40 kDa y 100 kDa; entre 50 kDa y 100 kDa; entre 60 kDa y 100 kDa; entre 70 kDa y 100 kDa; entre 80 kDa y 100 kDa; entre 90 kDa y 100 kDa; entre 5 kDa y 90 kDa; entre 5 kDa y 80 kDa; entre 5 kDa y 70 kDa; entre 5 kDa y 60 kDa; entre 5 kDa y 50 kDa; entre 5 kDa y 40 kDa; entre 5 kDa y 30 kDa; entre 5 kDa y 20 kDa; o entre 5 kDa y 10 kDa. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación. En algunas de estas realizaciones, el glucoconjugado se prepara mediante aminación reductora.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado de la invención tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 15.000 kDa; entre 500 kDa y 10.000 kDa; entre 2.000 kDa y 10.000 kDa; entre 3.000 kDa y 8.000 kDa; o entre 3.000 kDa y 5.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado tiene un peso molecular de entre 500 kDa y 10.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado tiene un peso molecular de entre 1.000 kDa y 8.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado tiene un peso molecular de entre 2.000 kDa y 8.000 kDa o entre 3.000 kDa y 7.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado de la invención tiene un peso molecular de entre 200 kDa y 20.000 kDa; entre 200 kDa y 15.000 kDa; entre 200 kDa y 10.000 kDa; entre 200 kDa y 7.500 kDa; entre 200 kDa y 5.000 kDa; entre 200 kDa y 3.000 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; entre 500 kDa y 20.000 kDa; entre 500 kDa y 15.000 kDa; entre 500 kDa y 12.500 kDa; entre 500 kDa y 10.000 kDa; entre 500 kDa y 7.500 kDa; entre 500 kDa y 6.000 kDa; entre 500 kDa y 5.000 kDa; entre 500 kDa y 4.000 kDa; entre 500 kDa y 3.000 kDa; entre 500 kDa y 2.000 kDa; entre 500 kDa y 1.500 kDa; entre 500 kDa y 1.000 kDa; entre 750 kDa y 20.000 kDa; entre 750 kDa y 15.000 kDa; entre 750kDa y 12.500 kDa; entre 750 kDa y 10.000 kDa; entre 750 kDa y 7.500 kDa; entre 750 kDa y 6.000 kDa; entre 750 kDa y 5.000 kDa; entre 750 kDa y 4.000 kDa; entre 750 kDa y 3.000 kDa; entre 750 kDa y 2.000 kDa; entre 750 kDa y 1.500 kDa; entre 1.000 kDa y 15.000 kDa; entre 1.000 kDa y 12.500 kDa; entre 1.000 kDa y 10.000 kDa; entre 1.000 kDa y 7.500 kDa; entre 1.000 kDa y 6.000 kDa; entre 1.000 kDa y 5.000 kDa; entre 1.000 kDa y 4.000 kDa; entre 1.000 kDa y 2.500 kDa; entre 2.000 kDa y 15.000 kDa; entre 2.000 kDa y 12.500 kDa; entre 2.000 kDa y 10.000 kDa; entre 2.000 kDa y 7.500 kDa; entre 2.000 kDa y 6.000 kDa; entre 2.000 kDa y 5.000 kDa; entre 2.000 kDa y 4.000 kDa; o entre 2.000 kDa y 3.000 kDa.
En otras realizaciones, el glucoconjugado de la invención tiene un peso molecular de entre 3.000 kDa y 20.000 kDa; entre 3.000 kDa y 15.000 kDa; entre 3.000 kDa y 10.000 kDa; entre 3.000 kDa y 7.500 kDa; entre 3.000 kDa y 5.000 kDa; entre 4.000 kDa y 20.000 kDa; entre 4.000 kDa y 15.000 kDa; entre 4.000 kDa y 12.500 kDa; entre 4.000 kDa y 10.000 kDa; entre 4.000 kDa y 7.500 kDa; entre 4.000 kDa y 6.000 kDa; o entre 4.000 kDa y 5.000 kDa.
En otras realizaciones, el glucoconjugado de la invención tiene un peso molecular de entre 5.000 kDa y 20.000 kDa; entre 5.000 kDa y 15.000 kDa; entre 5.000 kDa y 10.000 kDa; entre 5.000 kDa y 7.500 kDa; entre 6.000 kDa y 20.000 kDa; entre 6.000 kDa y 15.000 kDa; entre 6.000 kDa y 12.500 kDa; entre 6.000 kDa y 10.000 kDa o entre 6.000 kDa y 7.500 kDa.
En otras realizaciones, el glucoconjugado de la invención tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 250 kDa; entre 100 kDa y 500 kDa; entre 100 kDa y 750 kDa; entre 100 kDa y 1000 kDa; entre 100 kDa y 1500 kDa; entre 100 kDa y 2000 kDa; entre 100 kDa y 2500 kDa; entre 100 kDa y 3000 kDa; entre 250 kDa y 500 kDa; entre 250 kDa y 1000 kDa; entre 250 kDa y 1500 kDa; entre 250 kDa y 2000 kDa o entre 250 kDa y 2500 kDa.
El peso molecular del glucoconjugado se mide por SEC-MALLS. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 22F de la invención comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 o aproximadamente 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 33F de la invención comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 33F. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 33F. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 33F. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 33F. En una realización preferida, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante un análisis de HPLC iónico.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 15B de la invención comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante un análisis de HPLC iónico.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 15B de la invención comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 15B de la invención comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 15B de la invención comprende al menos 0,6 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 15B de la invención comprende al menos 0,7 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,3, 0,5, 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3,0, 3,4, 3,8, 4,2, 4,6 o aproximadamente 5,0 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A comprende al menos 1,8, 2,2 o 2,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización, el glucoconjugado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3,0, 3,4, 3,8, 4,2 o aproximadamente 4,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A y menos de aproximadamente 5,0 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, o aproximadamente 3,0 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A y menos de aproximadamente 3,4 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, o aproximadamente 3,0 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A y menos de aproximadamente 3,3 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 11A. Cualquiera de los números anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o aproximadamente 1,0 mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A comprende al menos 0,2, 0,3 o 0,4 mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o aproximadamente 0,9 mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 11A y menos de aproximadamente 1,0 mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 11A. En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 11A de la invención comprende al menos 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, o aproximadamente 0,7 mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 11A y menos de aproximadamente 0,8 mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 11A. Cualquiera de los números anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
Otra forma de caracterizar los glucoconjugados de la invención es por el número de restos lisina en la proteína portadora (por ejemplo, CRM197) que se conjugan con el sacárido, que puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas (grado de conjugación). La evidencia de la modificación de las lisinas de la proteína portadora, debido a los enlaces covalentes con los polisacáridos, puede obtenerse mediante el análisis de los aminoácidos utilizando métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica. La conjugación da lugar a una reducción del número de restos lisina recuperados, en comparación con el material de partida de la proteína portadora utilizado para generar los materiales conjugados. En una realización preferida, el grado de conjugación del glucoconjugado de la invención está entre 2 y 15, entre 2 y 13, entre 2 y 10, entre 2 y 8, entre 2 y 6, entre 2 y 5, entre 2 y 4, entre 3 y 15, entre 3 y 13, entre 3 y 10, entre 3 y 8, entre 3 y 6, entre 3 y 5, entre 3 y 4, entre 5 y 15, entre 5 y 10, entre 8 y 15, entre 8 y 12, entre 10 y 15 o entre 10 y 12. En una realización, el grado de conjugación del glucoconjugado de la invención es aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14 o aproximadamente 15. En una realización preferida, el grado de conjugación del glucoconjugado de la invención está entre 4 y 7. En algunas de estas realizaciones, la proteína portadora es CRM197.
Los glucoconjugados de la invención también pueden caracterizarse por la proporción (en peso/peso) entre el sacárido y la proteína portadora. En algunas realizaciones, la proporción entre el polisacárido y la proteína portadora en el glucoconjugado (en p/p) está entre 0,5 y 3 (por ejemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 17, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9 o aproximadamente 3,0). En otras realizaciones, la proporción entre sacárido y proteína portadora (en p/p) está entre 0,5 y 2,0, entre 0,5 y 1,5, entre 0,8 y 1,2, entre 0,5 y 1,0, entre 1,0 y 1,5 o entre 1,0 y 2,0. En otras realizaciones, la proporción entre sacárido y proteína portadora (en p/p) está entre 0,8 y 1,2. En una realización preferida, la proporción entre el polisacárido capsular y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,9 y 1,1. En algunas de estas realizaciones, la proteína portadora es CRM197.
Los glucoconjugados y las composiciones inmunogénicas de la invención pueden contener un sacárido libre que no está conjugado covalentemente con la proteína portadora, pero que sin embargo está presente en la composición del glucoconjugado. El sacárido libre puede estar asociado de forma no covalente el glucoconjugado (es decir, unido de forma no covalente a él, adsorbido sobre él, o atrapado dentro de él o con él).
En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % o 15 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 25 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 20 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 15 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido.
Los glucoconjugados también pueden caracterizarse por su distribución de tamaño molecular (Kd). Puede usarse un medio de cromatografía de exclusión por tamaño (CL-4B) para determinar la distribución del tamaño molecular relativo del conjugado. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza en columnas cargadas por gravedad para realizar el perfil de la distribución del tamaño molecular de los conjugados. Las moléculas grandes excluidas de los poros del medio eluyen más rápidamente que las moléculas pequeñas. Se usan recolectores de fracciones para recoger el eluido de la columna. Las fracciones se analizan colorimétricamente mediante un ensayo de sacáridos. Para la determinación de Kd, las columnas se calibran para establecer la fracción en la que las moléculas están totalmente excluidas (V0), (Kd = 0), y la fracción que representa la máxima retención (Vi), (Kd = 1). La fracción a la que se alcanza un determinado atributo de la muestra (Ve), se relaciona con la Kd mediante la expresión Kd = (Ve - V0)/ (Vi -V0).
En una realización preferida, al menos el 30 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 40 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 45%, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 % o el 85 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 60 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 50 % y el 80 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 65 % y el 80 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. La frecuencia de unión de la cadena de sacáridos a una lisina de la proteína portadora es otro parámetro para caracterizar los glucoconjugados de la invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se produce al menos un enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido por cada 4 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En otra realización, el enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido se produce al menos una vez por cada 10 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En otra realización, el enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido se produce al menos una vez por cada 15 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En otra realización, el enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido se produce al menos una vez por cada 25 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido.
En realizaciones frecuentes, la proteína portadora es CRM197, y el enlace covalente a través de un espaciador eTEC entre el CRM197 y el polisacárido se produce al menos una vez en por 4, 10, 15 o 25 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido.
En otras realizaciones, el conjugado comprende al menos un enlace covalente entre la proteína portadora y el sacárido por cada 5 a 10 unidades de repetición de sacáridos; cada 2 a 7 unidades de repetición de sacáridos; cada 3 a 8 unidades de repetición de sacáridos; cada 4 a 9 unidades de repetición de sacáridos; cada 6 a 11 unidades de repetición de sacáridos; cada 7 a 12 unidades de repetición de sacáridos; cada 8 a 13 unidades de repetición de sacáridos; cada 9 a 14 unidades de repetición de sacáridos; cada 10 a 15 unidades de repetición de sacáridos; cada 2 a 6 unidades de repetición de sacáridos, cada 3 a 7 unidades de repetición de sacáridos; cada 4 a 8 unidades de repetición de sacáridos; cada 6 a 10 unidades de repetición de sacáridos; cada 7 a 11 unidades de repetición de sacáridos; cada 8 a 12 unidades de repetición de sacáridos; cada 9 a 13 unidades de repetición de sacáridos; cada 10 a 14 unidades de repetición de sacáridos; cada 10 a 20 unidades de repetición de sacáridos; cada 4 a 25 unidades de repetición de sacáridos o cada 2 a 25 unidades de repetición de sacáridos. En realizaciones frecuentes, la proteína portadora es CRM197.
En otra realización, se produce al menos un enlace entre la proteína portadora y el sacárido por cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En una realización, la proteína portadora es CRM197. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
1.3.2 Glucoconjugados del serotipo 18C de la invención
En una realización, los glucoconjugados de 18C de la invención son como se definen en la presente sección.
Los polisacáridos capsulares del serotipo 18C de S. pneumoniae se preparan como se ha descrito anteriormente.
En una realización, los polisacáridos se activan con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El sacárido activado después se acopla directamente o a través de un grupo espaciador (conector) a un grupo amino de la proteína portadora (preferiblemente, CRM197). Por ejemplo, el espaciador puede ser cistamina o cisteamina para dar un polisacárido tiolado que se puede acoplar al portador a través de un enlace tioéter obtenido tras la reacción con una proteína portadora activada por maleimida (por ejemplo, utilizando el éster de N-[ymaleimidobutirloxi]succinimida (GMBS)) o una proteína portadora haloacetilada (por ejemplo, utilizando yodoacetimida, bromoacetato de N-succinimidilo (SBA; SIB), N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB), sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), o 3-[bromoacetamido]proprionato de succinimidilo (SBAP)). Preferiblemente, el éster de cianato (opcionalmente preparado por la química CDAP) se acopla con hexanodiamina o hidrazida del ácido adípico (ADH) y el sacárido derivatizado con amino se conjuga con la proteína portadora (por ejemplo, CRM197) mediante el uso de la química de carbodiimida (por ejemplo, EDAc o EDC) a través de un grupo carboxilo en la proteína portadora. Tales conjugados se describen, por ejemplo, en los documentos WO 93/15760, WO 95/08348 y WO 96/129094.
En una realización de la presente invención, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae se prepara utilizando la química CDAP.
Otras técnicas adecuadas para la conjugación utilizan carbodiimidas, hidrazidas, esteres activos, norborano, ácido pnitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muchas de estas se describen en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 98/42721. La conjugación puede implicar un conector carbonilo que se puede formar por reacción de un grupo hidroxilo libre del sacárido con CDI (Bethell et al. (1979), J. Biol. Chem., 254:2572-2574; Hearn et al. (1981), J. Chromatogr., 218:509-518), seguido de una reacción con una proteína para formar un enlace carbamato. Esto puede implicar la reducción del terminal anomérico a un grupo hidroxilo primario, la protección/desprotección opcional del grupo hidroxilo primario, la reacción del grupo hidroxilo primario con CDI para formar un intermedio de carbamato de CDI y el acoplamiento del intermedio de carbamato de CDl con un grupo amino en una proteína.
En una realización preferida, el polisacárido capsular del serotipo 18C de S. pneumoniae se conjuga con la proteína portadora mediante aminación reductora (tal como se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas n.os 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 y 2007/0184071, WO 2006/110381, WO 2008/079653y WO 2008/143709).
La aminación reductora implica dos etapas, como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención está O-acetilado. En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención está des-O-acetilado.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre el 10 y el 100 %, entre el 20 y el 100 %, entre el 30 y el 100 %, entre el 40 y el 100 %, entre el 50 y el 100 %, entre el 60 y el 100 %, entre el 70 y el 100 %, entre el 75 y el 100 %, el 80 y el 100 %, el 90 y el 100 %, el 50 y el 90 %, el 60 y el 90 %, el 70 y el 90 % o el 80 y el 90 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es > 10 %, > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 %, o aproximadamente 100 %. Sin embargo, es preferible que el glucoconjugado de S. pneumoniae del serotipo 18C esté des-O-acetilado. En algunas de dichas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación de entre 0 y 50 %, entre 0 y 40 %, entre 0 y 30 %, entre 0 y 20 %, entre 0 y 10 %, entre 0 y 5 %, o entre 0 y 2 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación es < 50 %, < 40 %, < 30 %, < 20 %, < 10 %, < 5 %, < 2 %, o < 1 %.
El porcentaje de O-acetilación es el porcentaje de un sacárido dado en relación con el 100 % (en el que cada unidad de repetición está totalmente acetilada en relación con su estructura acetilada).
En algunas realizaciones, el glucoconjugado de S. pneumoniae del serotipo 18C de la presente invención comprende un sacárido que tiene un peso molecular de entre 5 kDa y 2.000 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 10 kDa y 1.000 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 15 kDa y 900 kDa. En otras realizaciones, el sacárido tiene un peso molecular de entre 20 kDa y 800 kDa. En otras realizaciones de este tipo, el sacárido tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 1000 kDa; entre 100 kDa y 900 kDa; entre 100 kDa y 800 kDa; entre 100 kDa y 700 kDa; entre 100 kDa y 600 kDa; entre 100 kDa y 500 kDa; entre 100 kDa y 400 kDa; entre 100 kDa y 300 kDa; entre 150 kDa y 1.000 kDa; entre 150 kDa y 900 kDa; entre 150 kDa y 800 kDa; entre 150 kDa y 700 kDa; entre 150 kDa y 600 kDa; entre 150 kDa y 500 kDa; entre 150 kDa y 400 kDa; entre 150 kDa y 300 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; entre 200 kDa y 900 kDa; entre 200 kDa y 800 kDa; entre 200 kDa y 700 kDa; entre 200 kDa y 600 kDa; entre 200 kDa y 500 kDa; entre 200 kDa y 400 kDa; entre 200 kDa y 300; entre 250 kDa y 1.000 kDa; entre 250 kDa y 900 kDa; entre 250 kDa y 800 kDa; entre 250 kDa y 700 kDa; entre 250 kDa y 600 kDa; entre 250 kDa y 500 kDa; entre 250 kDa y 400 kDa; entre 250 kDa y 350 kDa; entre 300 kDa y 1.000 kDa; entre 300 kDa y 900 kDa; entre 300 kDa y 800 kDa; entre 300 kDa y 700 kDa; entre 300 kDa y 600 kDa; entre 300 kDa y 500 kDa; entre 300 kDa y 400 kDa; entre 400 kDa y 1.000 kDa; entre 400 kDa y 900 kDa; entre 400 kDa y 800 kDa; entre 400 kDa y 700 kDa; entre 400 kDa y 600 kDa; entre 500 kDa y 600 kDa. En otras realizaciones preferidas, el sacárido tiene un peso molecular de entre 5 kDa y 100 kDa; entre 7 kDa y 100 kDa; entre 10 kDa y 100 kDa; entre 20 kDa y 100 kDa; entre 30 kDa y 100 kDa; entre 40 kDa y 100 kDa; entre 50 kDa y 100 kDa; entre 60 kDa y 100 kDa; entre 70 kDa y 100 kDa; entre 80 kDa y 100 kDa; o entre 90 kDa y 100 kDa. En otras realizaciones preferidas, el sacárido tiene un peso molecular de entre 5 kDa y 90 kDa; entre 5 kDa y 80 kDa; entre 5 kDa y 70 kDa; entre 5 kDa y 60 kDa; entre 5 kDa y 50 kDa; entre 5 kDa y 40 kDa; entre 5 kDa y 30 kDa; entre 5 kDa y 20 kDa; entre 5 kDa y 10 kDa; entre 10 kDa y 90 kDa; entre 10 kDa y 80 kDa; entre 10 kDa y 70 kDa; entre 10 kDa y 60 kDa; entre 10 kDa y 50 kDa; entre 10 kDa y 40 kDa; entre 10 kDa y 30 kDa; entre 10 kDa y 20 kDa, 20 kDa y 90 kDa; entre 20 kDa y 80 kDa; entre 20 kDa y 70 kDa; entre 20 kDa y 60 kDa; entre 20 kDa y 50 kDa; entre 20 kDa y 40 kDa; o entre 20 kDa y 30 kDa. En otras realizaciones preferidas, el sacárido tiene un peso molecular de entre 30 kDa y 90 kDa; entre 30 kDa y 80 kDa; entre 30 kDa y 70 kDa; entre 30 kDa y 60 kDa; entre 30 kDa y 50 kDa; entre 30 kDa y 40 kDa; entre 40 kDa y 90 kDa; entre 40 kDa y 80 kDa; entre 40 kDa y 70 kDa; entre 40 kDa y 60 kDa; entre 40 kDa y 50 kDa; entre 50 kDa y 90 kDa; entre 50 kDa y 80 kDa; entre 50 kDa y 70 kDa; o entre 50 kDa y 60 kDa. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación. En algunas de estas realizaciones, el glucoconjugado se prepara mediante aminación reductora.
En algunas realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 20.000 kDa; entre 200 kDa y 10.000 kDa; o entre 300 kDa y 5.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 5.000 kDa; entre 150 kDa y 4.000 kDa; entre 200 kDa y 3.000 kDa; o entre 250 kDa y 2.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 100 kDa y 2.000 kDa; entre 150 kDa y 2.000 kDa; entre 200 kDa y 2.000 kDa; entre 250 kDa y 2.000 kDa; entre 300 kDa y 2.000 kDa; entre 350 kDa y 2.000 kDa; entre 400 kDa y 2.000 kDa; entre 450 kDa y 2.000 kDa; entre 500 kDa y 2.000 kDa; entre 550 kDa y 2.000 kDa; entre 600 kDa y 2.000 kDa; entre 700 kDa y 2.000 kDa; entre 800 kDa y 2.000 kDa; entre 900 kDa y 2.000 kDa; entre 1.000 kDa y 2.000 kDa; entre 1.250 kDa y 2.000 kDa; entre 1.500 kDa y 2.000 kDa o entre 1.750 kDa y 2.000 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 150 kDa y 2.000 kDa; entre 150 kDa y 1.900 kDa; entre 150 kDa y 1.800 kDa; entre 150 kDa y 1.700 kDa; entre 150 kDa y 1.600 kDa; entre 150 kDa y 1.500 kDa; entre 150 kDa y 1.400 kDa; entre 150 kDa y 1.300 kDa; entre 150 kDa y 1.200 kDa; entre 150 kDa y 1.100 kDa; entre 150 kDa y 1.000 kDa; entre 150 kDa y 900 kDa; entre 150 kDa y 800 kDa; entre 150 kDa y 700 kDa; entre 150 kDa y 600 kDa; entre 150 kDa y 500 kDa; entre 150 kDa y 400 kDa; entre 150 kDa y 300 kDa; o entre 150 kDa y 200 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 200 kDa y 2.000 kDa; entre 200 kDa y 1.900 kDa; entre 200 kDa y 1.800 kDa; entre 200 kDa y 1.700 kDa; entre 200 kDa y 1.600 kDa; entre 200 kDa y 1.500 kDa; entre 200 kDa y 1.400 kDa; entre 200 kDa y 1.300 kDa; entre 200 kDa y 1.200 kDa; entre 200 kDa y 1.100 kDa; entre 200 kDa y 1.000 kDa; entre 200 kDa y 900 kDa; entre 200 kDa y 800 kDa; entre 200 kDa y 700 kDa; entre 200 kDa y 600 kDa; entre 200 kDa y 500 kDa; entre 200 kDa y 400 kDa; o entre 200 kDa y 300 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 250 kDa y 2.000 kDa; entre 250 kDa y 1.900 kDa; entre 250 kDa y 1.800 kDa; entre 250 kDa y 1.700 kDa; entre 250 kDa y 1.600 kDa; entre 250 kDa y 1.500 kDa; entre 250 kDa y 1.400 kDa; entre 250 kDa y 1.300 kDa; entre 250 kDa y 1.200 kDa; entre 250 kDa y 1.100 kDa; entre 250 kDa y 1.000 kDa; entre 250 kDa y 900 kDa; entre 250 kDa y 800 kDa; entre 250 kDa y 700 kDa; entre 250 kDa y 600 kDa; entre 250 kDa y 500 kDa; entre 250 kDa y 400 kDa; o entre 250 kDa y 300 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 300 kDa y 2.000 kDa; entre 300 kDa y 1.900 kDa; entre 300 kDa y 1.800 kDa; entre 300 kDa y 1.700 kDa; entre 300 kDa y 1.600 kDa; entre 300 kDa y 1.500 kDa; entre 300 kDa y 1.400 kDa; entre 300 kDa y 1.300 kDa; entre 300 kDa y 1.200 kDa; entre 300 kDa y 1.100 kDa; entre 300 kDa y 1.000 kDa; entre 300 kDa y 900 kDa; entre 300 kDa y 800 kDa; entre 300 kDa y 700 kDa; entre 300 kDa y 600 kDa; entre 300 kDa y 500 kDa; o entre 300 kDa y 400 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 400 kDa y 2.000 kDa; entre 400 kDa y 1.900 kDa; entre 400 kDa y 1.800 kDa; entre 400 kDa y 1.700 kDa; entre 400 kDa y 1.600 kDa; entre 400 kDa y 1.500 kDa; entre 400 kDa y 1.400 kDa; entre 400 kDa y 1.300 kDa; entre 400 kDa y 1.200 kDa; entre 400 kDa y 1.100 kDa; entre 400 kDa y 1.000 kDa; entre 400 kDa y 900 kDa; entre 400 kDa y 800 kDa; entre 400 kDa y 700 kDa; entre 400 kDa y 600 kDa; o entre 400 kDa y 500 kDa. En otras realizaciones, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la presente invención tiene un peso molecular de entre 500 kDa y 2.000 kDa; entre 500 kDa y 1.900 kDa; entre 500 kDa y 1.800 kDa; entre 500 kDa y 1.700 kDa; entre 500 kDa y 1.600 kDa; entre 500 kDa y 1.500 kDa; entre 500 kDa y 1.400 kDa; entre 500 kDa y 1.300 kDa; entre 500 kDa y 1.200 kDa; entre 500 kDa y 1.100 kDa; entre 500 kDa y 1.000 kDa; entre 500 kDa y 900 kDa; entre 500 kDa y 800 kDa; entre 500 kDa y 700 kDa; o entre 500 kDa y 600 kDa.
El peso molecular del glucoconjugado se mide por SEC-MALLS. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
Otra forma de caracterizar los glucoconjugados de la invención es por el número de restos lisina en la proteína portadora (por ejemplo, CRM197) que se conjugan con el sacárido, que puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas (grado de conjugación). La evidencia de la modificación de las lisinas de la proteína portadora, debido a los enlaces covalentes con los polisacáridos, puede obtenerse mediante el análisis de los aminoácidos utilizando métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica. La conjugación da lugar a una reducción del número de restos lisina recuperados, en comparación con el material de partida de la proteína portadora utilizado para generar los materiales conjugados. En una realización preferida, el grado de conjugación del glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención está entre 2 y 15, entre 2 y 13, entre 2 y 10, entre 2 y 8, entre 2 y 6, entre 2 y 5, entre 2 y 4, entre 3 y 15, entre 3 y 13, entre 3 y 10, entre 3 y 8, entre 3 y 6, entre 3 y 5, entre 3 y 4, entre 5 y 15, entre 5 y 10, entre 8 y 15, entre 8 y 12, entre 10 y 15 o entre 10 y 12. En una realización, el grado de conjugación del glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención es aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14 o aproximadamente 15. En una realización preferida, el grado de conjugación del glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención está entre 4 y 7. En algunas de estas realizaciones, la proteína portadora es CRM197.
El glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención también puede caracterizarse por la proporción (en peso/peso) entre el sacárido y la proteína portadora. En algunas realizaciones, la relación entre el polisacárido y la proteína portadora en el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención (en p/p) está entre 0,5 y 3 (por ejemplo, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 17, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9 o aproximadamente 3,0). En otras realizaciones, la proporción entre sacárido y proteína portadora (en p/p) está entre 0,5 y 2,0, entre 0,5 y 1,5, entre 0,8 y 1,2, entre 0,5 y 1,0, entre 1,0 y 1,5 o entre 1,0 y 2,0. En otras realizaciones, la proporción entre sacárido y proteína portadora (en p/p) está entre 0,8 y 1,2. En una realización preferida, la proporción entre el polisacárido capsular y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,9 y 1,1. En algunas de estas realizaciones, la proteína portadora es CRM197.
En una realización preferida, el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención comprende menos de aproximadamente el 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % o 15 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 25 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 20 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido. En una realización preferida, el glucoconjugado comprende menos de aproximadamente 15 % de polisacárido libre en comparación con la cantidad total de polisacárido.
Los glucoconjugados también pueden caracterizarse por su distribución de tamaño molecular (Kd). Puede usarse un medio de cromatografía de exclusión por tamaño (CL-4B) para determinar la distribución del tamaño molecular relativo del conjugado. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza en columnas cargadas por gravedad para realizar el perfil de la distribución del tamaño molecular de los conjugados. Las moléculas grandes excluidas de los poros del medio eluyen más rápidamente que las moléculas pequeñas. Se usan recolectores de fracciones para recoger el eluido de la columna. Las fracciones se analizan colorimétricamente mediante un ensayo de sacáridos. Para la determinación de Kd, las columnas se calibran para establecer la fracción en la que las moléculas están totalmente excluidas (V0), (Kd = 0), y la fracción que representa la máxima retención (Vi), (Kd = 1). La fracción a la que se alcanza un determinado atributo de la muestra (Ve), se relaciona con la Kd mediante la expresión Kd = (Ve - V0)/ (Vi -V0).
En una realización preferida, al menos el 30 % del glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae de la invención tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4b . En una realización preferida, al menos el 40 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 45%, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 % o el 85 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 60 % del glucoconjugado tiene una K inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 50 % y el 80 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 65 % y el 80 % del glucoconjugado tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B.
La frecuencia de unión de la cadena de sacáridos a una lisina en la proteína portadora es otro parámetro para caracterizar el glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se produce al menos un enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido por cada 4 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En otra realización, el enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido se produce al menos una vez por cada 10 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En otra realización, el enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido se produce al menos una vez por cada 15 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En otra realización, el enlace covalente entre la proteína portadora y el polisacárido se produce al menos una vez por cada 25 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido.
En otras realizaciones, el conjugado comprende al menos un enlace covalente entre la proteína portadora y el sacárido por cada 5 a 10 unidades de repetición de sacáridos; cada 2 a 7 unidades de repetición de sacáridos; cada 3 a 8 unidades de repetición de sacáridos; cada 4 a 9 unidades de repetición de sacáridos; cada 6 a 11 unidades de repetición de sacáridos; cada 7 a 12 unidades de repetición de sacáridos; cada 8 a 13 unidades de repetición de sacáridos; cada 9 a 14 unidades de repetición de sacáridos; cada 10 a 15 unidades de repetición de sacáridos; cada 2 a 6 unidades de repetición de sacáridos, cada 3 a 7 unidades de repetición de sacáridos; cada 4 a 8 unidades de repetición de sacáridos; cada 6 a 10 unidades de repetición de sacáridos; cada 7 a 11 unidades de repetición de sacáridos; cada 8 a 12 unidades de repetición de sacáridos; cada 9 a 13 unidades de repetición de sacáridos; cada 10 a 14 unidades de repetición de sacáridos; cada 10 a 20 unidades de repetición de sacáridos; cada 4 a 25 unidades de repetición de sacáridos; o cada 2 a 25 unidades de repetición de sacáridos. En realizaciones frecuentes, la proteína portadora es CRM197.
En otra realización, se produce al menos un enlace entre la proteína portadora y el sacárido por cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 unidades de repetición de sacáridos del polisacárido. En una realización, la proteína portadora es CRM197. Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
1.4 Combinación de glucoconjugados de la invención
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende cualquiera de los glucoconjugados divulgados en el presente documento.
1.4.1 Combinaciones de glucoconjugados
La composición inmunogénica de la invención comprende al menos un glucoconjugado de cada uno de los trece serotipos de S. pneumoniae siguientes: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.
1.4.2 Otras combinaciones de glucoconjugados
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 15B de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 22F de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 33F de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 8 de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 10A de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 11A de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado del serotipo 12F de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado de cada uno de los dos serotipos de S. pneumoniae siguientes:
15B y 22F,
15B y 33F,
15B y 12F,
15B y 10A,
15B y 11A,
15B y 8,
22F y 33F,
22F y 12F,
22F y 10A,
22F y 11A,
22F y 8,
33F y 12F,
33F y 10A,
33F y 11A,
33F y 8,
12F y 10A,
12F y 11A,
12F y 8,
10A y 11A,
10A y 8, o
11A y 8.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado de cada uno de los tres serotipos de S. pneumoniae siguientes:
15B y 22F y 33F,
15B y 22F y 12F,
15B y 22F y 10A,
15B y 22F y 11A,
15B y 22F y 8,
15B y 33F y 12F,
15B y 33F y 10A,
15B y 33F y 11A,
15B y 33F y 8,
15B y 12F y 10A,
15B y 12F y 11A,
15B y 12F y 8,
15B y 10A y 11A,
15B y 10A y 8,
15B y 11A y 8,
22F y 33F y 12F,
22F y 33F y 10A,
22F y 33F y 11A,
22F y 33F y 8,
22F y 12F y 10A,
22F y 12F y 11A,
22F y 12F y 8,
22F y 10A y 11A,
22F y 10A y 8,
22F y 11A y 8,
33F y 12F y 10A,
33F y 12F y 11A,
33F y 12F y 8,
33F y 10A y 11A,
33F y 10A y 8,
33F y 11A y 8,
12F y 10A y 11A,
12F y 10A y 8,
12F y 11A y 8, o
10A y 11A y 8.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado de cada uno de los cuatro serotipos de S. pneumoniae siguientes:
15B y 22F y 33F y 12F,
15B y 22F y 33F y 10A,
15B y 22F y 33F y 11A,
15B y 22F y 33F y 8,
15B y 22F y 12F y 10A,
15B y 22F y 12F y 11A,
15B y 22F y 12F y 8,
15B y 22F y 10A y 11A,
15B y 22F y 10A y 8,
15B y 22F y 11A y 8,
15B y 33F y 12F y 10A,
15B y 33F y 12F y 11A,
15B y 33F y 12F y 8,
15B y 33F y 10A y 11A,
15B y 33F y 10A y 8,
15B y 33F y 11A y 8,
15B y 12F y 10A y 11A,
15B y 12F y 10A y 8,
15B y 12F y 11A y 8,
15B y 10A y 11A y 8,
22F y 33F y 12F y 10A,
22F y 33F y 12F y 11A,
22F y 33F y 12F y 8,
22F y 33F y 10A y 11A,
22F y 33F y 10A y 8,
22F y 33F y 11A y 8,
22F y 12F y 10A y 11A,
22F y 12F y 10A y 8,
22F y 12F y 11A y 8,
22F y 10A y 11A y 8,
33F y 12F y 10A y 11A,
33F y 12F y 10A y 8,
33F y 12F y 11A y 8,
33F y 10A y 11A y 8 o
12F y 10A y 11A y 8.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado de cada uno de los cinco serotipos de S. pneumoniae siguientes:
15B y 22F y 33F y 12F y 10A,
15B y 22F y 33F y 12F y 11A,
15B y 22F y 33F y 12F y 8,
15B y 22F y 33F y 10A y 11A,
15B y 22F y 33F y 10A y 8,
15B y 22F y 33F y 11A y 8,
15B y 22F y 12F y 10A y 11A,
15B y 22F y 12F y 10A y 8,
15B y 22F y 12F y 11A y 8,
15B y 22F y 10A y 11A y 8,
15B y 33F y 12F y 10A y 11A,
15B y 33F y 12F y 10A y 8,
15B y 33F y 12F y 11A y 8,
15B y 33F y 10A y 11A y 8,
15B y 12F y 10A y 11A y 8,
22F y 33F y 12F y 10A y 11A,
22F y 33F y 12F y 10A y 8,
22F y 33F y 12F y 11A y 8,
22F y 33F y 10A y 11A y 8,
22F y 12F y 10A y 11A y 8 o
33F y 12F y 10A y 11A y 8.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado de cada uno de los seis serotipos de S. pneumoniae siguientes:
15B y 22F y 33F y 12F y 10A y 11A,
15B y 22F y 33F y 12F y 10A y 8,
15B y 22F y 33F y 12F y 11A y 8,
15B y 22F y 33F y 10A y 11A y 8,
15B y 22F y 12F y 10A y 11A y 8,
15B y 33F y 12F y 10A y 11A y 8 o
22F y 33F y 12F y 10A y 11A y 8.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el punto 1.4.1 anterior comprende además al menos un glucoconjugado de cada uno de los siete serotipos de S. pneumoniae siguientes: 15B y 22F y 33F y 12F y 10A y 11A y 8.
En una realización, cualquiera de las anteriores composiciones inmunogénicas comprende además glucoconjugados del serotipo 2 de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las anteriores composiciones inmunogénicas comprende además glucoconjugados del serotipo 17F de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las anteriores composiciones inmunogénicas comprende además glucoconjugados del serotipo 20 de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las anteriores composiciones inmunogénicas comprende además glucoconjugados del serotipo 15C de S. pneumoniae.
Preferiblemente, todos los glucoconjugados de las anteriores composiciones inmunogénicas se conjugan individualmente con la proteína portadora.
En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 18C de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 22F de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 33F de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 15B de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 33F de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 10A de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 10A de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 8 de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 19F y 23F de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados de los serotipos 1, 5 y 7F de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados de los serotipos 6A y 19A de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 3 de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En una realización de cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 2 de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 17F de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En una realización de cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 20 de S. pneumoniae se conjugan con CRM197. En cualquiera de las composiciones inmunogénicas anteriores, los glucoconjugados del serotipo 15C de S. pneumoniae se conjugan con CRM197.
En una realización, los glucoconjugados de las composiciones inmunogénicas anteriores están todos conjugados individualmente con CRM197.
En una realización, la composición inmunogénica anterior comprende glucoconjugados de 16 o 20 serotipos diferentes.
En una realización, la composición inmunogénica anterior es una composición de conjugado neumocócico 14, 15, 16, 17, 18 o 19 valente. En una realización, la composición inmunogénica anterior es una composición de conjugado neumocócico 16-valente. En una realización, la composición inmunogénica anterior es una composición de conjugado neumocócico 19-valente. En una realización, la composición inmunogénica anterior es una composición de conjugado neumocócico 20-valente.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende sacáridos conjugados de S. pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende sacáridos conjugados de S. pneumoniae de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F.
En una realización, los glucoconjugados de la composición inmunogénica de la invención consisten en glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F de S. pneumoniae. En una realización, los glucoconjugados de la composición inmunogénica de la invención consisten en glucoconjugados de los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F. En una realización, los glucoconjugados de la composición inmunogénica de la invención consisten en glucoconjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F. En una realización, los glucoconjugados de la composición inmunogénica de la invención consisten en glucoconjugados de 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F.
Preferiblemente, todos los glucoconjugados de la composición inmunogénica de la invención se conjugan individualmente con la proteína portadora. En una realización, los glucoconjugados de la composición inmunogénica anterior se conjugan individualmente con CRM197.
1.4.3 Otras combinaciones de glucoconjugados
Cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en los apartados 1.4.1 o 1.4.2 anteriores no comprende un sacárido capsular de los serotipos 18F, 18A y 18B de S. pneumoniae.
2 Dosificación de las composiciones inmunogénicas
2.1 Cantidad de polisacáridos
La cantidad de glucoconjugados en cada dosis se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios significativos y adversos en los vacunados típicos. Dicha cantidad variará en función del inmunógeno específico que se emplee y de la forma en que se presente.
La cantidad de un glucoconjugado particular en una composición inmunogénica puede calcularse en base al total de polisacáridos para ese conjugado (conjugados y no conjugados). Por ejemplo, un glucoconjugado con un 20 % de polisacárido libre contendrá aproximadamente 80 |jg de polisacárido conjugado y aproximadamente 20 |jg de polisacárido no conjugado en una dosis de 100 jg de polisacárido. La cantidad de glucoconjugado puede variar dependiendo del serotipo estreptocócico. La concentración de sacáridos puede determinarse mediante el ensayo de ácido urónico.
La "cantidad inmunogénica" de los diferentes componentes de polisacáridos en la composición inmunogénica puede divergir y cada uno puede comprender aproximadamente 1,0 jg , aproximadamente 2,0 jg , aproximadamente 3,0 jg , aproximadamente 4,0 jg , aproximadamente 5,0 jg , aproximadamente 6,0 jg , aproximadamente 7,0 jg , aproximadamente 8,0 jg , aproximadamente 9,0 jg , aproximadamente 10,0 jg , aproximadamente 15,0 jg , aproximadamente 20,0 jg , aproximadamente 30,0 jg , aproximadamente 40,0 jg , aproximadamente 50,0 jg , aproximadamente 60,0 jg , aproximadamente 70,0 jg , aproximadamente 80,0 jg , aproximadamente 90,0 jg , o aproximadamente 100,0 jg de cualquier antígeno polisacárido particular.
Generalmente, cada dosis comprenderá de 0,1 |jg a 100 |jg de polisacárido para un serotipo dado, en particular de 0,5 jg a 20 jg , más en particular de 1 jg a 10 jg , y aún más en particular de 2 jg a 5 jg . Cualquier número entero dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una realización de la divulgación.
En una realización, cada dosis comprenderá 1 jg , 2 jg , 3 jg , 4 jg , 5 jg , 6 jg , 7 jg , 8 jg , 9 jg , 10 jg , 15 jg o 20 jg de polisacárido para un serotipo dado.
2.2 Cantidad de portador
Generalmente, cada dosis comprenderá de 5 jg a 150 jg de proteína portadora, en particular de 10 jg a 100 jg de proteína portadora, más en particular de 15 jg a 100 jg de proteína portadora, más en particular de 25 a 75 jg de proteína portadora, más en particular de 30 jg a 70 jg de proteína portadora, más en particular de 30 a 60 jg de proteína portadora, más en particular de 30 jg a 50 jg de proteína portadora y aún más en particular de 40 a 60 jg de proteína portadora. En una realización, dicha proteína portadora es CRM197.
En una realización, cada dosis comprenderá aproximadamente 25 jg , aproximadamente 26 jg , aproximadamente 27 jg , aproximadamente 28 jg , aproximadamente 29 j g, aproximadamente 30 jg , aproximadamente 31 jg, aproximadamente 32 jg , aproximadamente 33 jg , aproximadamente 34 jg , aproximadamente 35 jg , aproximadamente 36 jg , aproximadamente 37 jg , aproximadamente 38 jg , aproximadamente 39 jg , aproximadamente 40 jg , aproximadamente 41 jg , aproximadamente 42 jg , aproximadamente 43 jg , aproximadamente 44 jg , aproximadamente 45 jg , aproximadamente 46 jg , aproximadamente 47 jg , aproximadamente 48 jg aproximadamente 49 jg , aproximadamente 50 jg , aproximadamente 51 jg , aproximadamente 52 jg , aproximadamente 53 jg , aproximadamente 54 jg , aproximadamente 55 jg , aproximadamente 56 jg , aproximadamente 57 jg , aproximadamente 58 jg , aproximadamente 59 jg , aproximadamente 60 jg , aproximadamente 61 jg , aproximadamente 62 jg , aproximadamente 63 jg , aproximadamente 64 jg, aproximadamente 65 jg, aproximadamente 66 jg , aproximadamente 67 jg , 68 jg , aproximadamente 69 jg , aproximadamente 70 jg , aproximadamente 71 jg , aproximadamente 72 jg , aproximadamente 73 jg , aproximadamente 74■ jg o aproximadamente 75 jg de proteína portadora. En una realización, dicha proteína portadora es CRM197.
3 Otros antígenos
Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden antígenos sacáridos conjugados de S. pneumoniae (glucoconjugados). También pueden incluir antígenos de otros patógenos, en particular de bacterias y/o virus. Los antígenos adicionales preferidos se seleccionan de: un toxoide diftérico (D), un toxoide tetánico (T), un antígeno de tos ferina (P), que suele ser acelular (Pa), un antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B (VHB) (HBsAg), un antígeno del virus de la hepatitis A (VHA), un sacárido capsular de tipo b de Haemophilus influenzae conjugado (Hib), una vacuna de poliovirus inactivado (IPV).
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden D-T-Pa. En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden D-T-Pa-Hib, D-T-Pa-IPV o D-T-Pa-HBsAg. En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden D-T-Pa-HBsAg-IPV o D-T-Pa-HBsAg-Hib. En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib. Antígenos de la tos ferina: Bordetella pertussis causa la tos ferina. Los antígenos de la tos ferina en las vacunas son celulares (células enteras, en forma de células inactivadas de B. pertussis) o acelulares. La preparación de los antígenos celulares de la tos ferina está bien documentada (por ejemplo, pueden obtenerse por inactivación térmica de un cultivo de fase I de B. pertussis). Sin embargo, la invención utiliza preferiblemente antígenos acelulares. Cuando se utilizan antígenos acelulares, se prefiere utilizar uno, dos o (preferiblemente) tres de los siguientes antígenos: (1) la toxina de la tos ferina desintoxicada (toxoide de la tos ferina, o PT); (2) la hemaglutinina filamentosa (FHA); (3) la pertactina (también conocida como la proteína de la membrana externa de 69 kiloDalton). La FHA y la pertactina pueden ser tratadas con formaldehído antes de su uso según la invención. El PT se desintoxica preferiblemente mediante un tratamiento con formaldehído y/o glutaraldehído. Los antígenos de la tos ferina acelulares se adsorben preferiblemente sobre uno o más adyuvantes de sal de aluminio. Como alternativa, pueden añadirse en estado no adsorbido. Si se añade pertactina, es preferible que ya esté adsorbida sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio. El PT y el FHA pueden ser adsorbidos sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio o de fosfato de aluminio. La adsorción de todos los PT, FHA y pertactina al hidróxido de aluminio es la más preferida.
Vacuna de poliovirus inactivado: El poliovirus causa la poliomielitis. En lugar de utilizar la vacuna oral contra el poliovirus, las realizaciones preferidas de la invención utilizan la IPV. Antes de su administración a los pacientes, los poliovirus deben ser inactivados, lo que puede lograrse mediante el tratamiento con formaldehído. La poliomielitis puede ser causada por uno de los tres tipos de poliovirus. Los tres tipos son similares y causan síntomas idénticos, pero son antigénicamente diferentes y la infección por un tipo no protege contra la infección por otros. Por lo tanto, se prefiere utilizar tres antígenos de poliovirus en la invención: poliovirus de tipo 1 (por ejemplo, la cepa Mahoney), poliovirus de tipo 2 (por ejemplo, la cepa MEF-1) y poliovirus de tipo 3 (por ejemplo, la cepa Saukett). Los virus se cultivan, purifican e inactivan preferiblemente de forma individual, y luego se combinan para obtener una mezcla trivalente a granel para su uso con la invención.
Toxoide diftérico: La Corynebacterium diphtheriae causa la difteria. La toxina diftérica puede ser tratada (por ejemplo, con formol o formaldehído) para eliminar su toxicidad, pero conservando la capacidad de inducir anticuerpos específicos contra la toxina tras la inyección. Estos toxoides diftéricos se utilizan en las vacunas contra la difteria. Los toxoides diftéricos preferidos son los que se preparan mediante un tratamiento con formaldehído. El toxoide diftérico puede obtenerse cultivando C. diphtheriae en un medio de crecimiento, seguido de un tratamiento con formaldehído, una ultrafiltración y una precipitación. A continuación, el material toxoide puede tratarse mediante un proceso que comprenda la filtración estéril y/o la diálisis. El toxoide diftérico se adsorbe preferiblemente sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio.
Toxoide tetánico: El Clostridium tetani causa el tétanos. La toxina tetánica puede ser tratada para dar un toxoide protector. Los toxoides se utilizan en las vacunas antitetánicas. Los toxoides tetánicos preferidos son los que se preparan mediante un tratamiento con formaldehído. El toxoide tetánico puede obtenerse cultivando C. tetani en un medio de crecimiento, seguido de un tratamiento con formaldehído, una ultrafiltración y una precipitación. A continuación, el material puede ser tratado mediante un proceso que comprende la filtración estéril y/o la diálisis.
Antígenos del virus de la hepatitis A: El virus de la hepatitis A (VHA) es uno de los agentes conocidos que causa la hepatitis viral. Un componente preferido del VHA se basa en un virus inactivado, y la inactivación puede lograrse mediante un tratamiento con formol.
El virus de la hepatitis B (VHB) es uno de los agentes conocidos que causa la hepatitis viral. El principal componente de la cápside es una proteína conocida como antígeno de la superficie del VHB o, más comúnmente, HBsAg, que suele ser un polipéptido de 226 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 24 kDa. Todas las vacunas existentes contra la hepatitis B contienen HBsAg, y cuando este antígeno se administra a un vacunado normal, estimula la producción de anticuerpos anti-HBsAg que protegen contra la infección por el VHB.
Para la fabricación de vacunas, el HBsAg se ha fabricado de dos maneras: purificación del antígeno en forma de partículas a partir del plasma de portadores de hepatitis B crónica o expresión de la proteína por métodos de ADN recombinante (por ejemplo, expresión recombinante en células de levadura). A diferencia de1HBsAg nativo (es decir, como en el producto purificado a partir de plasma), el HBsAg expresado por levaduras generalmente no está glicosilado, y esta es la forma más preferida de HBsAg para su uso con la invención.
Antígenos conjugados de Haemophilus influenzae de tipo b: El Haemophilus influenzae de tipo b (Hib) provoca meningitis bacteriana. Las vacunas contra el Hib suelen basarse en el antígeno sacárido capsular, cuya preparación está bien documentada. El sacárido de Hib puede conjugarse con una proteína portadora para mejorar su inmunogenicidad, especialmente en los niños. Las proteínas portadoras típicas son el toxoide tetánico, el toxoide diftérico, el CRM197, la proteína D de H. influenzae y un complejo de proteínas de la membrana externa del meningococo del serogrupo B. La fracción de sacárido del conjugado puede comprender polirribosilribitol fosfato (PRP) de longitud completa, tal como se prepara a partir de la bacteria Hib y/o fragmentos de PRP de longitud completa. Los conjugados de Hib pueden o no adsorberse sobre un adyuvante de sal de aluminio.
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención incluyen además un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo Y (MenY) y/o un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo C (MenC).
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención incluyen además un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo A (MenA), un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo W135 (MenW135), un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo Y (MenY) y/o un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo C (MenC).
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención incluyen además un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo W135 (MenW135), un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo Y (MenY) y/o un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo C (MenC).
4 Adyuvantes
En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento pueden comprender además al menos un adyuvante (por ejemplo, uno, dos o tres adyuvantes). El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que aumenta la respuesta inmunitaria contra un antígeno. Los antígenos pueden actuar principalmente como un sistema de transporte, principalmente como un modulador inmunitario o tener fuertes características de ambos. Entre los adyuvantes adecuados se encuentran los que pueden utilizarse en mamíferos, incluidos los seres humanos.
Entre los ejemplos de adyuvantes adecuados conocidos del tipo de sistema de transporte que pueden utilizarse en los seres humanos se incluyen, entre otros, el alumbre (por ejemplo, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio o hidróxido de aluminio), fosfato de calcio, liposomas, emulsiones de aceite en agua, tales como MF59 (escualeno al 4,3 % en p/v, polisorbato 80 (Tween 80) al 0,5 % en p/v, trioleato de sorbitán (Span 85) al 0,5 % en p/v), emulsiones de agua en aceite, tales como Montanide, y micropartículas o nanopartículas de poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG).
En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprenden sales de aluminio (alumbre) como adyuvante (por ejemplo, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio o hidróxido de aluminio). En una realización preferida, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprenden fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio como adyuvante. En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprenden de 0,1 mg/mL a 1 mg/mL o de 0,2 mg/mL a 0,3 mg/ml de aluminio elemental en forma de fosfato de aluminio. En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprenden aproximadamente 0,25 mg/mL de aluminio elemental en forma de fosfato de aluminio. Los ejemplos de adyuvantes de tipo inmunomodulador conocidos que pueden utilizarse en seres humanos incluyen, pero no se limitan a extractos de saponina de la corteza del árbol de Aquilla (QS21, Quil A), agonistas de TLR4, tales como MPL (monofosforil lípido A), 3DMPL (MPL 3-O-desacilado) o GLA-a Q, mutantes lT/CT, citoquinas, tales como las diversas interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-12) o GM-CSF, y similares.
Entre los ejemplos de adyuvantes adecuados conocidos de tipo inmunomodulador con características tanto de transporte como de modulación inmunitaria que pueden utilizarse en seres humanos se incluyen, entre otros, los ISCOMS (véase, por ejemplo, Sjolander et al. (1998), J. Leukocyte Biol., 64:713; documentos WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 y WO 2007/026190) o GLA-EM, que es una combinación de un agonista de TLR4 y una emulsión de aceite en agua.
Para aplicaciones veterinarias, incluyendo, pero sin limitarse a la experimentación animal, se puede utilizar el adyuvante completo de Freund (CFA), el adyuvante incompleto de Freund (IFA), Emulsigen, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominada nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominada MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+t Dm CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80.
Otros ejemplos de adyuvantes para mejorar la eficacia de las vacunas antineumocócicas divulgadas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, tales como péptidos de muramilo (véase más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), como, por ejemplo (a) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polímero plurónico bloqueado L121 al 5 %, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitado en vórtice para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula, y (b) el sistema adyuvante RIBI™ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 %, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana, tales como monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL CWS (DEToX™); (2) pueden utilizarse adyuvantes de saponina, tales como QS21, STlMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), Abisco® (Isconova, Suecia), o Iscomatrix® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), o partículas generadas a partir de ellos, como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), y dichos ISCOM pueden estar exentos de detergente adicional (por ejemplo, documento WO 00/07621); (3) adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA); (4) citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, iL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento WO 99/44636)), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (5) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) (véanse, por ejemplo, los documentos GB-2220221, EP0689454), opcionalmente en ausencia sustancial de alumbre cuando se utiliza con sacáridos neumocócicos (véase, por ejemplo, el documento WO 00/56358); (6) combinaciones de 3dMPL, por ejemplo, con QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (véanse, por ejemplo, los documentos EP0835318, EP0735898, EP0761231); (7) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno (véase, por ejemplo, el documento WO99/52549); (8) un tensioactivo de éster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol (documento WO 01/21207) o un tensioactivo de éster o éter de polioxietilenalquilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional, tal como un octoxinol (documento WO 01/21152); (9) una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) (documento WO 00/62800); (10) un inmunoestimulante y una partícula de sal metálica (véase, por ejemplo, el documento WO00/23105); (11) una saponina y una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, documento WO 99/11241(12) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IM2 (opcionalmente un esterol), por ejemplo, e documento WO 98/57659(13) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la eficacia de la composición. Los péptidos de muramilo incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-25 acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutarninil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE), etc.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG como adyuvante. Un oligonucleótido CpG, tal y como se utiliza en este documento, se refiere a un oligodesoxinucleótido CpG inmunoestimulador (ODN CpG), por lo que estos términos se utilizan indistintamente a menos que se indique lo contrario. Los oligodesoxinucleótidos CpG inmunoestimuladores contienen uno o más motivos CpG inmunoestimuladores que son dinucleótidos de citosina-guanina no metilados, opcionalmente dentro de ciertos contextos de bases preferidos. El estado de metilación del motivo inmunoestimulador CpG se refiere generalmente al resto citosina en el dinucleótido. Un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es un oligonucleótido que contiene una citosina 5' no metilada unida por un enlace fosfato a una guanina 3', y que activa el sistema inmunitario mediante la unión al receptor de tipo Toll 9 (TLR-9). En otra realización, el oligonucleótido inmunoestimulador puede contener uno o más dinucleótidos CpG metilados, que activarán el sistema inmunitario a través de TLR9, pero no con tanta fuerza como si el motivo o motivos CpG no estuvieran metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG pueden comprender uno o más palíndromos que a su vez pueden englobar el dinucleótido CpG. Los oligonucleótidos CpG se han descrito en una serie de patentes expedidas, solicitudes de patentes publicadas y otras publicaciones, incluyendo las patentes de EE. UU. n.os 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116 y 6.339.068.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas tal como se divulgan en el presente documento comprenden cualquiera de los oligonucleótidos CpG descritos en la página 3, línea 22, a la página 12, línea 36, del documento WO 2010/125480.
Se han identificado diferentes clases de oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG. Se denominan clase A, B, C y P, y se describen con mayor detalle en la página 3, línea 22, a la página 12, línea 36, del documento WO 2010/125480. Los métodos de la invención incluyen el uso de estas diferentes clases de oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG. En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase A. En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase B.
Las secuencias de oligonucleótidos CpG de clase B de la invención son las descritas anteriormente en términos generales, así como las divulgadas en los documento publicados WO 96/02555, WO 98/18810y en las patente des EE.UU. n.os 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116y 6.339.068. Los ejemplos de secuencias incluyen, pero no se limitan a las divulgadas en estas últimas solicitudes y patentes.
En una realización, el oligonucleótido CpG de "clase B" de la invención tiene la siguiente secuencia de ácido nucleico:
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO:1), o
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO:2), o
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO:3), o
5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO:4), o
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO:5).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser enlaces fosforotioato. En otra realización, en cualquiera de estas secuencias, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferiblemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG, que forma un oligonucleótido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la T 5'; los ejemplos de sustituciones de halógenos incluyen, pero no se limitan a sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de clase B incluyen:
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO:6), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO:7), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO:8), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO:9), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO:10).
en los "*" se refiere a un enlace fosforotioato.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase C.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase P.
En una realización, el oligonucleótido incluye al menos un enlace fosforotioato. En otra realización, todos los enlaces internucleotídicos del oligonucleótido son enlaces fosforotioato. En otra realización, el oligonucleótido incluye al menos un enlace de tipo fosfodiéster. En otra realización, el enlace de tipo fosfodiéster es un enlace fosfodiéster. En otra realización se conjuga un grupo lipofílico con el oligonucleótido. En una realización el grupo lipofílico es el colesterol. En una realización, todos los enlaces internucleotídicos de los oligonucleótidos CpG divulgados en el presente documento son enlaces fosfodiéster (oligonucleótidos "blandos", como se describe en el documento WO 2007/026190). En otra realización, los oligonucleótidos CpG de la invención se hacen resistentes a la degradación (por ejemplo, se estabilizan). Un "oligonucleótido estabilizado" se refiere a un oligonucleótido que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, a través de una exo- o endonucleasa). La estabilización del ácido nucleico puede lograrse mediante modificaciones del esqueleto. Los oligonucleótidos con enlaces fosforotioato proporcionan la máxima actividad y protegen al oligonucleótido de la degradación por exo- y endonucleasas intracelulares.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden tener un esqueleto quimérico, que tiene combinaciones de enlaces fosfodiéster y fosforotioato. Para los propósitos de la presente invención, un esqueleto quimérico se refiere a un esqueleto parcialmente estabilizado, en el que al menos un enlace internucleotídico es fosfodiéster o de tipo fosfodiéster, y en el que al menos otro enlace internucleotídico es un enlace internucleotídico estabilizado, en el que dicho al menos un enlace fosfodiéster o de tipo fosfodiéster y dicho al menos un enlace estabilizado son diferentes. Cuando el enlace fosfodiéster se localiza preferentemente dentro del motivo CpG, tales moléculas se denominan "semiblandas", como se describe en el documento WO 2007/026190.
Otros oligonucleótidos modificados incluyen combinaciones de enlaces fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato y/o p-etoxi.
Los ODN modificados de esqueleto mixto pueden sintetizarse como se describe en el documento WO 2007/026190. El tamaño del oligonucleótido CpG (es decir, el número de restos nucleótidos a lo largo del oligonucleótido) también puede contribuir a la actividad estimulante del oligonucleótido. Para facilitar la captación en las células, el oligonucleótido CpG de la invención tiene preferiblemente una longitud mínima de 6 restos nucleótidos. Los oligonucleótidos de cualquier tamaño superior a 6 nucleótidos (incluso de muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmunitaria si hay suficientes motivos inmunoestimuladores, porque los oligonucleótidos más grandes se degradan dentro de las células. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos CpG tienen una longitud de 6 a 100 nucleótidos, preferiblemente de 8 a 30 nucleótidos. En realizaciones importantes, los ácidos nucleicos y oligonucleótidos de la invención no son plásmidos ni vectores de expresión.
En una realización, el oligonucleótido CpG divulgado en el presente documento comprende sustituciones o modificaciones, tales como en las bases y/o azúcares como se describe en los párrafos 134 a 147 del documento WO 2007/026190.
En una realización, el oligonucleótido CpG de la presente invención se modifica químicamente. Los ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por los experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Uhlmann et al. (1990), Chem. Rev., 90:543; S. Agrawal, ed., Humana Press, Totowa, E e . UU., 1993; Crooke et al. (1996), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 36:107-129;y Hunziker et al. (1995), Mod. Synth. Methods, 7:331-417. Un oligonucleótido según la invención puede tener una o más modificaciones, en las que cada modificación se localiza en un puente internucleósido fosfodiéster particular y/o en una unidad de p-D-ribosa particular y/o en una posición de base nucleósida natural particular en comparación con un oligonucleótido con la misma secuencia que esté compuesto por ADN o ARN natural.
En algunas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos que contienen CpG pueden mezclarse simplemente con portadores inmunogénicos de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 03/024480).
En una realización particular de la presente invención, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprende de 2 |jg a 100 mg de oligonucleótido CpG, preferiblemente de 0,1 mg a 50 mg de oligonucleótido CpG, preferiblemente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleótido CpG, preferiblemente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleótido CpG, preferiblemente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleótido CpG, más preferiblemente de 0,5 mg a 2 mg de oligonucleótido CpG, más preferiblemente de 0,75 mg a 1,5 mg de oligonucleótido CpG. En una realización preferida, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprende aproximadamente 1 mg de oligonucleótido CpG.
5 Formulación
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden formularse en forma líquida (es decir, disoluciones o suspensiones) o en forma liofilizada. Las formulaciones líquidas pueden administrarse de modo ventajoso directamente desde su forma envasada y, por tanto, son ideales para la inyección sin necesidad de reconstituirlas en un medio acuoso, como se requiere en el caso de las composiciones liofilizadas de la invención.
La formulación de la composición inmunogénica de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando métodos reconocidos en la técnica. Por ejemplo, los conjugados neumocócicos individuales pueden formularse con un vehículo fisiológicamente aceptable para preparar la composición. Los ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se limitan a agua, disolución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y disoluciones de dextrosa.
La presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende cualquiera de las combinaciones de glucoconjugados divulgadas en el presente documento y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención está en forma líquida, preferiblemente en forma líquida acuosa.
Las composiciones inmunogénicas de la divulgación pueden comprender uno o más de un tampón, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un crioprotector, tal como un azúcar, y un antioxidante, tal como un captador de radicales libres o un agente quelante, o cualquier combinación múltiple de los mismos.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende un tampón. En una realización, dicho tampón tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, el tampón es fosfato, succinato, histidina o citrato. En ciertas realizaciones, el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM. En una realización particular, la concentración final del tampón de succinato es de aproximadamente 5 mM.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende una sal. En algunas realizaciones, la sal se selecciona entre los grupos que consisten en cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio y una combinación de los mismos. En una realización particular, la sal es cloruro de sodio. En una realización particular, la composición inmunogénica de la invención comprende cloruro de sodio a 150 mM.
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden un tensioactivo. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo formado por polisorbato 20 (TWEEN™20), polisorbato 40 (TWEEN™40), polisorbato 60 (TWEEN™60), polisorbato 65 (TWEEN™65), polisorbato 80 (TWEEN™80), polisorbato 85 (TWEEN™85), TRITON™ N-1 01, TRITON™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinol-9, trietanolamina, oleato de polipéptido de trietanolamina, hidroxiestearato de polioxietileno-660 (PEG-15, Solutol H 15), polioxietileno-35-ricinoleato (CREMOPHOR® EL), lecitina de soja y un poloxámero. En una realización particular, el tensioactivo es polisorbato 80. En alguna de dichas realizaciones, la concentración final de polisorbato 80 en la formulación es de al menos un 0,0001 % a un 10 % de polisorbato 80 en peso (en p/p). En alguna de dichas realizaciones, la concentración final de polisorbato 80 en la formulación es de al menos un 0,001 % a un 1 % de polisorbato 80 en peso (en p/p). En alguna de dichas realizaciones, la concentración final de polisorbato 80 en la formulación es de al menos un 0,01 % a un 1 % de polisorbato 80 en peso (en p/p). En otras realizaciones, la concentración final de polisorbato 80 en la formulación es del 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 % o 0,1 % de polisorbato 80 (en p/p). En otra realización, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 1 % de polisorbato 80 (en p/p).
En ciertas realizaciones, la composición inmunogénica de la invención tiene un pH de 5,5 a 7,5, más preferiblemente un pH de 5,6 a 7,0, incluso más preferiblemente un pH de 5,8 a 6,0.
En una realización, la invención proporciona un recipiente que contiene cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento. En una realización, el recipiente se selecciona del grupo que consiste en un vial, una jeringa, un matraz, un fermentador, un biorreactor, una bolsa, un frasco, una ampolla, un cartucho y una pluma desechable. En ciertas realizaciones, el recipiente está siliconizado.
En una realización, el recipiente de la presente invención está fabricado de vidrio, metales (por ejemplo, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y/o polímeros (por ejemplo, termoplásticos, elastómeros, termoplásticos-elastómeros). En una realización, el recipiente de la presente invención está fabricado de vidrio.
En una realización, la invención proporciona una jeringa que contiene cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la jeringa está siliconizada y/o es de vidrio.
Una dosis típica de la composición inmunogénica de la invención para inyección tiene un volumen de 0,1 mL a 2 mL, más preferiblemente de 0,2 mL a 1 mL, incluso más preferiblemente un volumen de aproximadamente 0,5 mL.
Por lo tanto, el recipiente o jeringa como se define anteriormente se rellena con un volumen de 0,1 mL a 2 mL, más preferiblemente de 0,2 mL a 1 mL, incluso más preferiblemente un volumen de aproximadamente 0,5 mL de cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el presente documento.
6 Capacidad de las composiciones inmunogénicas de la invención para suscitar anticuerpos de reacción cruzada
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos IgG en el ser humano que son capaces de unirse a polisacárido de los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae , tal como se determina mediante un ensayo ELISA.
En el método ELISA ("Enzyme-linked Immunosorbent Assay", ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas), los anticuerpos del suero de sujetos vacunados se incuban con polisacáridos que han sido adsorbidos sobre un soporte sólido. Los anticuerpos unidos se detectan usando anticuerpos de detección secundarios conjugados con enzimas.
En una realización, dicho ensayo ELISA es el ensayo ELISA convencional definido por la OMS en el "Training Manual For Enzyme Linked Immunosorbent Assay For The Quantitation Of Streptococcus Pneumoniae Serotype Specific IgG (Pn PS ELISA)" (disponible en http://www.vaccine.uab.edu/ELISA protocol.pdf, consultado el 31 de marzo de 2014).
El ELISA mide los anticuerpos específicos del tipo de IgG contra el polisacárido capsular (PS) de S. pneumoniae presentes en el suero humano. Cuando se añaden diluciones de sueros humanos a placas de microtitulación recubiertas de PS capsular específico de tipo, los anticuerpos específicos para ese PS capsular se unen a las placas de microtitulación. Los anticuerpos unidos a las placas se detectan utilizando un anticuerpo anti-IgG humana de cabra marcado con fosfatasa alcalina, seguido de un sustrato de p-nitrofenil fosfato. La densidad óptica del producto final coloreado es proporcional a la cantidad de anticuerpo anti-PS capsular presente en el suero.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos IgG en seres humanos que son capaces de unirse al polisacárido del serotipo 18A de S. pneumoniae a una concentración de al menos 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,3 pg/ml, 0,35 pg/ml, 0,4 pg/ml o 0,5 pg/ml, según se determina mediante un ensayo ELISA.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos IgG en seres humanos que son capaces de unirse al polisacárido del serotipo 18B de S. pneumoniae a una concentración de al menos 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,3 pg/ml, 0,35 pg/ml, 0,4 pg/ml o 0,5 pg/ml, según se determina mediante un ensayo ELISA.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos IgG en seres humanos que son capaces de unirse al polisacárido del serotipo 18F de S. pneumoniae a una concentración de al menos 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,3 pg/ml, 0,35 pg/ml, 0,4 pg/ml o 0,5 pg/ml, según se determina mediante un ensayo ELISA.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y/o 18F, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA) (véase el ejemplo 1). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniae del serotipo 18A, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniae del serotipo 18B, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniaedel serotipo 18F, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniaedel serotipo 18A y 18B, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniaedel serotipo 18A y 18F, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de matar a S. pneumoniaedel serotipo 18B y 18F, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA).
El ensayo opsonofagocítico neumocócico (OPA), que mide la destrucción de las células de S. pneumoniae por parte de las células efectoras fagocíticas en presencia de anticuerpos funcionales y complemento, se considera un importante sustituto para evaluar la eficacia de las vacunas antineumocócicas.
El ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA) puede llevarse a cabo incubando juntos una mezcla de células de Streptococcus pneumoniae, un suero humano inactivado por calor que se va a probar, células HL-60 diferenciadas (fagocitos) y una fuente de complemento exógena (por ejemplo, complemento de cría de conejo). La opsonofagocitosis se produce durante la incubación, y las células bacterianas que están recubiertas con anticuerpos y complemento mueren al producirse la opsonofagocitosis. Las unidades formadoras de colonias (cfu) de bacterias supervivientes que escapan a la opsonofagocitosis se determinan mediante el cultivo en placa de la mezcla del ensayo. El título de OPA se define como la dilución recíproca que da lugar a una reducción del 50 % del recuento bacteriano con respecto a los pocillos de control sin suero de prueba. El título de OPA se interpola a partir de las dos diluciones que abarcan este valor de corte de destrucción del 50 %.
Un título de criterio de valoración de 1:8 o mayor se considera un resultado positivo en estos OPA de tipo destructivo.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18A de S. pneumoniae en al menos el 50 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18A de S. pneumoniae en al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o al menos el 99 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA).
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18B de S. pneumoniae en al menos el 50 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18B de S. pneumoniae en al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o al menos el 99 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA).
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18F de S. pneumoniae en al menos el 50 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA). En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra el serotipo 18F de S. pneumoniae en al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o al menos el 99 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA).
En alguna realización, los sujetos pueden tener unos títulos de OPA específicos del serotipo antes de la vacunación antineumocócica debido, por ejemplo, a exposiciones naturales a S. pneumoniae (por ejemplo, en el caso de sujetos adultos).
Por lo tanto, puede realizarse una comparación de la actividad OPA del suero antes y después de la inmunización con la composición inmunogénica de la invención y compararse para su respuesta a los serotipos 18A, 18B y 18F para evaluar el aumento potencial de respondedores (véase el ejemplo 1).
En una realización, la composición inmunogénica de la invención aumenta significativamente la proporción de respondedores (es decir, el individuo con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
Por lo tanto, en una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra el serotipo 18A de S. pneumoniae (es decir, el individuo con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra el serotipo 18B de S. pneumoniae (es decir, el individuo con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra el serotipo 18F de S. pneumoniae (es decir, el individuo con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra los serotipos 18A y 18B de S. pneumoniae (es decir, individuos con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra los serotipos 18A y 18F de S. pneumoniae (es decir, individuos con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra los serotipos 18B y 18F de S. pneumoniae (es decir, individuos con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra los serotipos 18A, 18B y 18F de S. pneumoniae (es decir, individuos con un suero que tiene un título de al menos 1:8 según se determina mediante una OPA in vitro) en comparación con la población preinmunizada.
La comparación de la actividad de OPA del suero antes y después de la inmunización con la composición inmunogénica de la invención también puede hacerse comparando el aumento potencial de los títulos de OPA.
Por lo tanto, puede realizarse una comparación de la actividad de OPA del suero antes y después de la inmunización con la composición inmunogénica de la invención y compararse para su respuesta a los serotipos 18A, 18B y 18F para evaluar el potencial de aumento de los títulos de OPA (véase el ejemplo 1).
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la invención son capaces de aumentar significativamente el título de OPA de sujetos humanos en comparación con la población preinmunizada.
Por lo tanto, en una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra el serotipo 18A de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0 u 8,4.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra el el serotipo 18B de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 15,5 o 16,0.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra S. pneumoniae del serotipo 18F en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 5,7 o 5,9.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra los serotipos 18A y 18B de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0 u 8,4 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 15,5 o 16,0. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 8,4 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 16,0.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra los serotipos 18A y 18F de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 7,5, 8,0 u 8,4 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 5,7 o 5,9. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 8,4 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 5,9.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra los serotipos 18B y 18F de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 15,5 o 16,0 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 5,7 o 5,9. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 16,0 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 5,9.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra los serotipos 18A, 18B y 18F de S. pneumoniae en comparación con la población preinmunizada. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0 u 8,4, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 15,5 o 16,0 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 5,7 o 5,9. En una realización, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae es de al menos 8,4, el aumento del título de OPA contra el serotipo 18B de S. pneumoniae es de al menos 16,0 y el aumento del título de OPA contra el serotipo 18F de S. pneumoniae es de al menos 5,9.
7 Usos de las composiciones inmunogénicas de la invención
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por el serotipo 18A de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por el serotipo 18B de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por el serotipo 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A y 18B de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A y 18F de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18B y 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por el serotipo 18A de S. pneumoniae. En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por el serotipo 18B de S. pneumoniae. En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por el serotipo 18F de S. pneumoniae.
En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por los serotipos 18A y 18B de S. pneumoniae. En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por los serotipos 18a y 18F de S. pneumoniae. En una realización, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento es para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por los serotipos 18B y 18F de S. pneumoniae.
En un aspecto, la presente divulgación se dirige al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
En un aspecto, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A y 18B de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, la presente divulgación se dirige al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A y 18F de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, la presente divulgación se dirige al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18B y 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae.
En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por el serotipo 18A de S. pneumoniae. En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por el serotipo 18B de S. pneumoniae. En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por el serotipo 18F de S. pneumoniae.
En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por los serotipos 18A y 18B de S. pneumoniae. En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por los serotipos 18A y 18F de S. pneumoniae. En una realización, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para inmunizar a un sujeto contra la infección por los serotipos 18B y 18F de S. pneumoniae.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria a los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria al serotipo 18A de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria al serotipo 18B de S. pneumoniae en un sujeto. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria al serotipo 18F de S. pneumoniae en un sujeto. En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento son para su uso como vacuna. Más concretamente, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden utilizarse para prevenir las infecciones por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto. Así, en un aspecto, la divulgación proporciona un método para prevenir una infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición inmunogénica de la invención. En algunas de estas realizaciones, la infección se selecciona del grupo que consiste en neumonía, sinusitis, otitis media, otitis media aguda, meningitis, bacteriemia, sepsis, empiema pleural, conjuntivitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, mastoiditis, celulitis, infección de tejidos blandos y absceso cerebral. En un aspecto, el sujeto a vacunar es un mamífero, tal como un ser humano, un gato, una oveja, un cerdo, un caballo, un bovino o un perro.
En un aspecto, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento son para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección asociada a S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y/o 18F en un sujeto. En algunas de estas realizaciones, la infección, la enfermedad o la afección se selecciona del grupo que consiste en neumonía, sinusitis, otitis media, otitis media aguda, meningitis, bacteriemia, sepsis, empiema pleural, conjuntivitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, mastoiditis, celulitis, infección de tejidos blandos y absceso cerebral.
En un aspecto, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento es para su uso en un método para prevenir de una infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto. En algunas de estas realizaciones, la infección se selecciona del grupo que consiste en neumonía, sinusitis, otitis media, otitis media aguda, meningitis, bacteriemia, sepsis, empiema pleural, conjuntivitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, mastoiditis, celulitis, infección de tejidos blandos y absceso cerebral. En un aspecto, el sujeto a vacunar es un mamífero, tal como un ser humano, un gato, una oveja, un cerdo, un caballo, un bovino o un perro.
En un aspecto, la presente divulgación se dirige al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección asociada a S. pneumoniae de los serotipos 18A, 18B y/o 18F en un sujeto. En algunas de estas realizaciones, la infección, la enfermedad o la afección se selecciona del grupo que consiste en neumonía, sinusitis, otitis media, otitis media aguda, meningitis, bacteriemia, sepsis, empiema pleural, conjuntivitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, mastoiditis, celulitis, infección de tejidos blandos y absceso cerebral.
En un aspecto, la presente divulgación está dirigida al uso de la composición inmunogénica divulgada en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir una infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto. En algunas de estas realizaciones, la infección se selecciona del grupo que consiste en neumonía, sinusitis, otitis media, otitis media aguda, meningitis, bacteriemia, sepsis, empiema pleural, conjuntivitis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, mastoiditis, celulitis, infección de tejidos blandos y absceso cerebral. En un aspecto, el sujeto a vacunar es un mamífero, tal como un ser humano, un gato, una oveja, un cerdo, un caballo, un bovino o un perro.
Las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación pueden utilizarse para proteger o tratar a un ser humano susceptible a la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, mediante la administración de las composiciones inmunogénicas por vía sistémica o mucosa. En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento se administran por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento se administran por inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento se administran por inyección intramuscular o subcutánea.
En una realización, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación comprenden al menos un glucoconjugado de S. pneumoniae 9V (tales como los glucoconjugados del párrafo 1.3 anterior).
8 Sujeto a tratar con las composiciones inmunogénicas de la invención
Ta como se describe en el presente documento, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden utilizarse en diversos métodos terapéuticos o profilácticos para prevenir, tratar o mejorar una infección bacteriana, una enfermedad o una afección en un sujeto.
En una realización preferida, dicho sujeto es un ser humano. En una realización más preferida, dicho sujeto es un recién nacido (es decir, menos de tres meses), un bebé (es decir, de 3 meses a un año) o un niño pequeño (es decir, de un año a cuatro años).
En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento son para su uso como vacuna.
En dicha realización, el sujeto a vacunar puede ser menor de 1 año. Por ejemplo, el sujeto a vacunar puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. En una realización, el sujeto a vacunar tiene unos 2, 4 o 6 meses. En otra realización, el sujeto a vacunar es menor de 2 años. Por ejemplo, el sujeto a vacunar puede tener entre 12 y 15 meses. En algunos casos, solo se necesita una dosis de la composición inmunogénica según la invención, pero en algunas circunstancias, se puede administrar una segunda, tercera o cuarta dosis (véase la sección 9 más adelante).
En una realización de la presente invención, el sujeto a vacunar es un adulto humano de 50 años o más, más preferiblemente un adulto humano de 55 años o más. En una realización, el sujeto a vacunar es un adulto humano de 65 años o más, de 70 años o más, de 75 años o más o de 80 años o más.
En una realización, el sujeto a vacunar es un individuo inmunocomprometido, en particular un ser humano. Un individuo inmunocomprometido se define generalmente como una persona que muestra una capacidad atenuada o reducida para montar una defensa humoral o celular normal ante la exposición a agentes infecciosos.
En una realización de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de una enfermedad o una afección que deteriora el sistema inmunitario y provoca una respuesta de anticuerpos que es insuficiente para la protección contra la enfermedad neumocócica o para tratarla.
En una realización, dicha enfermedad es un trastorno de inmunodeficiencia primaria. Preferiblemente, dicho trastorno de inmunodeficiencia primaria se selecciona del grupo que consiste en: inmunodeficiencias combinadas de células T y B, deficiencias de anticuerpos, síndromes bien definidos, enfermedades de desregulación inmunitaria, trastornos de fagocitos, deficiencias de inmunidad innata, trastornos autoinflamatorios y deficiencias del complemento. En una realización, dicho trastorno de inmunodeficiencia primaria se selecciona entre el divulgado en la página 24, línea 11, a la página 25, línea 19, del documento WO 2010/125480.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que se va a vacunar padece una enfermedad seleccionada de los grupos que consisten en: infección por VIH, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, trastornos cardíacos o pulmonares crónicos, insuficiencia cardíaca congestiva, diabetes mellitus, enfermedad hepática crónica, alcoholismo, cirrosis, fugas de líquido cefalorraquídeo, cardiomiopatía, bronquitis crónica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), disfunción del bazo (tal como la anemia de células falciformes), falta de actividad del bazo (asplenia), neoplasia sanguínea, leucemia, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma, insuficiencia renal, síndrome nefrótico y asma.
En una realización de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de desnutrición.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado está tomando un fármaco o se está sometiendo a un tratamiento que disminuye la resistencia del cuerpo a las infecciones. En una realización, dicho fármaco se selecciona del divulgado en la página 26, línea 33, a la página 26, línea 4, del documento WO 2010/125480.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado es un fumador.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que se va a vacunar tiene un recuento de glóbulos blancos (recuento de leucocitos) inferior a 5 x 109 células por litro, o inferior a 4 x 109 células por litro, o inferior a 3 x 109 células por litro, o inferior a 2 x 109 células por litro, o inferior a 1 x 109 células por litro, o inferior a 0,5 x 109 células por litro, o inferior a 0,3 x 109 células por litro, o inferior a 0,1 x 109 células por litro.
Recuento de glóbulos blancos (recuento de leucocitos): El número de glóbulos blancos (WBC) en la sangre. Los glóbulos blancos suelen medirse como parte del hemograma (recuento sanguíneo completo, CBC). Los glóbulos blancos son las células que combaten las infecciones en la sangre y son distintos de los glóbulos rojos (que transportan oxígeno), conocidos como eritrocitos. Existen diferentes tipos de glóbulos blancos, como los neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN), las células en banda (neutrófilos ligeramente inmaduros), los linfocitos de tipo T (células T), los linfocitos de tipo B (células B), los monocitos, los eosinófilos y los basófilos. Todos los tipos de glóbulos blancos se reflejan en el recuento de glóbulos blancos. El intervalo normal del recuento de glóbulos blancos suele estar entre 4.300 y 10.800 células por milímetro cúbico de sangre. También puede denominarse recuento de leucocitos y puede expresarse en unidades internacionales como 4,3- 0,8 x 109 células por litro.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de neutropenia. En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de neutrófilos inferior a 2 x 109 células por litro, o inferior a 1 x 109 células por litro, o inferior a 0,5 x 109 células por litro, o inferior a 0,1 x 109 células por litro, o inferior a 0,05 x 109 células por litro.
Un recuento bajo de glóbulos blancos o "neutropenia" es una afección caracterizada por niveles anormalmente bajos de neutrófilos en la sangre circulante. Los neutrófilos son un tipo específico de glóbulos blancos que ayudan a prevenir y combatir las infecciones. La razón más común por la que los pacientes con cáncer sufren neutropenia es como un efecto secundario de la quimioterapia. La neutropenia inducida por la quimioterapia aumenta el riesgo de infección del paciente y altera el tratamiento del cáncer.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que se va a vacunar tiene un recuento de células CD4+ inferior a 500/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 300/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 200/mm3, un recuento de células CD4+ inferior a 100/mm3, un recuento de células CD4+ inferior a 75/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 50/mm3.
Las pruebas de células CD4 se indican normalmente como el número de células en mm3. Los recuentos normales de CD4 están entre 500 y 1600, y los de CD8 entre 375 y 1100. Los recuentos de CD4 disminuyen drásticamente en las personas con VIH.
En una realización de la invención, cualquiera de los sujetos inmunocomprometidos divulgados en el presente documento es un hombre o una mujer humanos.
9 Régimen
En algunos casos, se necesita tan solo una dosis de la composición inmunogénica según la invención, pero en algunas circunstancias, como en condiciones de mayor inmunodeficiencia, se puede administrar una segunda, tercera o cuarta dosis. Tras la vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias vacunas de refuerzo separadas por un intervalo de tiempo adecuado.
En una realización, el esquema de vacunación de la composición inmunogénica según la invención es una dosis única. En una realización particular, dicho esquema de dosis única es para personas sanas de al menos 2 años de edad.
En una realización, el programa de vacunación de la composición inmunogénica según la invención es un programa de dosis múltiples. En una realización particular, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 2 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses. En una realización particular, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 2 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes, o una serie de 2 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 2 meses.
En otra realización, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses. En otra realización, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes, o una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 2 meses.
En otra realización, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses, seguido de una cuarta dosis de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 13 meses después de la primera dosis. En otra realización, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes, seguidas por una cuarta dosis de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 13 meses después de la primera dosis, o una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 2 meses, seguidas por una cuarta dosis de aproximadamente 10 meses a aproximadamente 13 meses después de la primera dosis.
En una realización, el programa de dosis múltiples consiste en al menos una dosis (por ejemplo, 1, 2 o 3 dosis) en el primer año de edad, seguida de al menos una dosis para niños pequeños.
En una realización, el esquema de dosis múltiples consiste en una serie de 2 o 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses (por ejemplo 28-56 días entre las dosis), comenzando a los 2 meses de edad, y seguido por una dosis para niños pequeños a los 12-18 meses de edad. En una realización, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 3 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 1 a 2 meses (por ejemplo, 28-56 días entre las dosis), comenzando a los 2 meses de edad, y seguido por una dosis para niños pequeños a los 12-15 meses de edad. En otra realización, dicho programa de dosis múltiples consiste en una serie de 2 dosis separadas por un intervalo de aproximadamente 2 meses, comenzando a los 2 meses de edad, y seguido por una dosis para niños pequeños a los 12-18 meses de edad.
En una realización, el esquema de dosis múltiples consiste en una serie de 4 dosis de vacuna a los 2, 4, 6 y 12-15 meses de edad.
En una realización, se administra una dosis inicial en el día 0 y después uno o más refuerzos en intervalos que varían desde aproximadamente 2 a aproximadamente 24 semanas, preferiblemente con un intervalo de dosificación de 4 a 8 semanas.
En una realización, se administra una dosis de cebado en el día 0 y se administra un refuerzo aproximadamente 3 meses después.
10 Kit y proceso
En una realización, la divulgación se dirige a un kit que comprende una composición inmunogénica divulgada en el presente documento y un prospecto informativo.
En una realización, dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos funcionales contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae.
En una realización, dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos funcionales contra el serotipo 18A de S. pneumoniae.
En una realización, dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos anticapsulares contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae a una concentración > 0,35 pg/mL en una población humana.
En una realización, dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos anticapsulares contra el serotipo 18A de S. pneumoniae a una concentración > 0,35 pg/mL en una población humana. En una realización, dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar títulos de OPA contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae en una población humana.
En una realización, dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar títulos de OPA contra el serotipo 18A de S. pneumoniae en una población humana.
En una realización, la divulgación se dirige a un proceso para producir un kit que comprende una composición inmunogénica y un prospecto informativo, y dicho proceso comprende la etapa de:
• producir una composición inmunogénica de la presente divulgación, y
• combinar en el mismo kit dicha composición inmunogénica y el prospecto informativo, en el que dicho prospecto informativo menciona la capacidad de dicha composición para suscitar anticuerpos funcionales contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae.
En una realización, la divulgación se dirige a un proceso para producir un kit que comprende una composición inmunogénica y un prospecto informativo, y dicho proceso comprende la etapa de:
• producir una composición inmunogénica de la presente divulgación, y
• combinar en el mismo kit dicha composición inmunogénica y el prospecto informativo, en el que dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos anticapsulares contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae a una concentración > 0,35 pg/mL en una población humana.
En una realización, la divulgación se dirige a un proceso para producir un kit que comprende una composición inmunogénica y un prospecto informativo, y dicho proceso comprende la etapa de:
• producir una composición inmunogénica de la presente divulgación, y
• combinar en el mismo kit dicha composición inmunogénica y el prospecto informativo, en el que dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar de OPA contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae en una población humana.
En una realización, la divulgación se dirige a un proceso para producir un kit que comprende una composición inmunogénica y un prospecto informativo, y dicho proceso comprende la etapa de:
• producir una composición inmunogénica de la presente divulgación;
• imprimir un prospecto informativo en el que se menciona la capacidad de dicha composición para suscitar anticuerpos funcionales contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae;
• combinar en el mismo kit dicha composición inmunogénica y dicho prospecto informativo.
En una realización, la divulgación se dirige a un proceso para producir un kit que comprende una composición inmunogénica y un prospecto informativo, y dicho proceso comprende la etapa de:
• producir una composición inmunogénica de la presente divulgación;
• imprimir un prospecto informativo en el que dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar anticuerpos anticapsulares contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae a una concentración > 0,35 pg/mL en una población humana;
• combinar en el mismo kit dicha composición inmunogénica y dicho prospecto.
En una realización, la divulgación se dirige a un proceso para producir un kit que comprende una composición inmunogénica y un prospecto informativo, y dicho proceso comprende la etapa de:
• producir una composición inmunogénica de la presente divulgación;
• imprimir un prospecto informativo en el que dicho prospecto informativo menciona la capacidad de la composición para suscitar títulos de OPA contra los serotipos 18B, 18F y/o 18A de S. pneumoniae en una población humana;
• combinar en el mismo kit dicha composición inmunogénica y dicho prospecto informativo.
11 Métodos
En una realización, la divulgación se dirige a un método que comprende la etapa de:
• inyectar a un sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el presente documento;
• recoger una muestra de suero de dicho sujeto;
• analizar la actividad de destrucción opsonofagocítica de dicha muestra de suero contra el serotipo 18A de S.
pneumoniae mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPA) in vitro .
En una realización, la divulgación se dirige a un método que comprende la etapa de:
• inyectar a un sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el presente documento;
• recoger una muestra de suero de dicho sujeto;
• analizar la actividad de destrucción opsonofagocítica de dicha muestra de suero contra el serotipo 18B de S.
pneumoniae mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPA) in vitro .
En una realización, la divulgación se dirige a un método que comprende la etapa de:
• inyectar a un sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el presente documento;
• recoger una muestra de suero de dicho sujeto;
• analizar la actividad de destrucción opsonofagocítica de dicha muestra de suero contra el serotipo 18F de S.
pneumoniae mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPA) in vitro .
En una realización, la divulgación se dirige a un método que comprende la etapa de:
• inyectar a un sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogénicas definidas en el presente documento;
• recoger una muestra de suero de dicho sujeto;
• analizar la actividad de destrucción opsonofagocítica de dicha muestra de suero contra los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPA) in vitro .
Tal y como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" significa dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor, tal como un intervalo de concentración establecido, un marco temporal, un peso molecular, una temperatura o un pH. Dicho intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, típicamente dentro del 20 %, más típicamente dentro del 10 %, y aún más típicamente dentro del 5 % o dentro del 1 % de un valor o intervalo dado. A veces, dicho intervalo puede estar dentro del error experimental típico de los métodos convencionales utilizados para la medición y/o la determinación de un valor o intervalo determinado. La variación admisible que abarca el término "aproximadamente" dependerá del sistema particular que se estudie, y puede ser fácilmente apreciada por los expertos en la técnica. Siempre que se indique un intervalo dentro de esta solicitud, cada número entero dentro del intervalo también se contempla como una realización de la divulgación.
Los inventores pretenden que la expresión y los términos "que comprende", "comprenden" y "comprende" sean opcionalmente sustituibles por las expresiones "que consiste en", "consisten en" y "consiste en", respectivamente, en todos los casos.
La invención se ilustra en los ejemplos adjuntos. Los ejemplos que se presentan a continuación se llevan a cabo por medio de técnicas estándar, que son muy conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, salvo que se describa en detalle lo contrario. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Evaluación de las respuestas inmunitarias opsonofagocíticas cruzadas dentro del serogrupo 18 de Streptococcus pneumoniae
La protección del huésped frente a S. pneumoniae está mediada principalmente por la opsonofagocitosis dependiente de anticuerpos anticapsulares. El ensayo opsonofagocítico neumocócico (OPA), que mide la destrucción de células de S. pneumoniae por parte de células efectoras fagocíticas en presencia de anticuerpos funcionales y complemento, se considera un importante sustituto para evaluar la eficacia de las vacunas antineumocócicas.
Materiales y métodos
Sueros
Dos subconjuntos seleccionados al azar de inmunosueros de adultos vacunados con una vacuna antineumocócica conjugada 13-valente (13vPnC) fueron probados en ensayos OPA para los serotipos 18F, 18A, 18B y 18C. Los sueros se recogieron en los ensayos clínicos estadounidenses 6115A1-004 (N = 59, después de la vacunación) y 6115A1-3005 (N = 66, emparejados antes y después de la vacunación), respectivamente.
El estudio 6115A1-3005 (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00546572) fue un ensayo de fase 3, aleatorizado, controlado activamente y doble ciego modificado que evaluó la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de PREVNAR 13® en comparación con una vacuna de polisacáridos neumocócicos 23-valente (23vPS) en ancianos ambulatorios de 70 años o más que recibieron 1 dosis de 23vPS al menos 5 años antes de la inscripción en el estudio (véase http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572, consultado el 4 de octubre de 2016).
El estudio 6115A1-004 (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00427895) fue un ensayo de fase 3, aleatorizado, controlado activamente y doble ciego modificado que evaluó la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de una vacuna antineumocócica conjugada 13 (13vPnC) en comparación con una vacuna de polisacáridos neumocócicos 23 (23vPS) en adultos de 60 a 64 años que no habían recibido la 23vPS, y la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de la 13vPnC en adultos de 18 a 59 años que no habían recibido la 23vPS (véase: http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895, consultado el 4 de octubre de 2016).
La vacuna antineumocócica conjugada 13-valente (13vPnC) probada en estos estudios contenía conjugados de los serotipos neumocócicos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, conjugados individualmente con la proteína portadora del material de reacción cruzada 197 de la difteria (CRM197) (Prevenar 13 ®).
Procedimiento del ensayo opsonofagocítico de microcolonias (mcOPA)
Los ensayos opsonofagocíticos (OPA) se utilizan para medir los anticuerpos funcionales en sueros humanos contra los serotipos 18F, 18A, 18B y/o 18C de S. pneumoniae. El suero de prueba se prepara en reacciones de ensayo que miden la capacidad de la inmunoglobulina específica del polisacárido capsular para opsonizar las bacterias, desencadenar el depósito del complemento, facilitando así la fagocitosis y la destrucción de las bacterias por los fagocitos. El título de OPA se define como la dilución recíproca que da lugar a una reducción del 50 % del recuento bacteriano con respecto a los pocillos de control sin suero de prueba. El título de OPA se interpola a partir de las dos diluciones que abarcan este valor de corte de destrucción del 50 %.
Los procedimientos de OPA se basaron en los métodos descritos en Hu et al. (2005), Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:287-295.
El ensayo opsonofagocítico de microcolonias evalúa cuantitativamente los anticuerpos funcionales anti­ S. pneumoniae midiendo la supervivencia bacteriana en reacciones de OPA de microcolonias (mcOPA) que contienen el suero de prueba. Se añadieron diluciones en serie (en 2,5 veces) de suero inactivado por calor a las bacterias diana en placas de ensayo y se incubaron durante 30 minutos con agitación. A continuación, se añadieron a cada pocillo complemento de cría de conejo (de 3-4 semanas de edad, con una concentración final del 12,5 %) y células HL-60 diferenciadas, en una proporción aproximada de efector a diana de 200:1, y se incubaron a 37 °C con agitación. Para terminar la reacción, se añadieron 80 pl de NaCl al 0,9 % a todos los pocillos, se mezcló la disolución de reacción y se transfirió una parte alícuota de 10 pl a los pocillos de las placas de filtración Millipore, MultiScreenHTS HV que contenían 200 pl de agua. El líquido se filtró a través de las placas al vacío, y se añadieron 150 pl de medio HySoy a cada pocillo y se filtraron.
Después de la filtración, las placas de filtración se incubaron durante la noche en una incubadora con 5 % de CO2 a 37 °C y luego se fijaron con la Destain Solution (Bio-Rad). A continuación, las placas se tiñeron con azul de Coomassie y se destiñeron una vez. Las colonias se visualizaron y contaron en un Cellular Technology Limited (CTL) ImmunoSpot Analyzer®. El título de anticuerpos de OPA se determinó como el recíproco de la dilución de suero más baja que

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. - Una composición inmunogénica que comprende al menos un glucoconjugado del polisacárido capsular del serotipo 18C de S. pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora y que comprende además glucoconjugados de polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae unidos covalentemente a una proteína portadora, en la que dichos glucoconjugados se conjugan individualmente con CRM197, para su uso en un método de inmunización de un sujeto contra la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, en la que dicha composición no comprende un sacárido capsular de los serotipos 18A, 18B y 18F de S. pneumoniae.
2. - La composición inmunogénica para su uso según la reivindicación 1, que comprende además glucoconjugados de los serotipos 22F y 33F de S. pneumoniae.
3. - La composición inmunogénica para su uso según la reivindicación 1, que comprende además glucoconjugados de los serotipos 15B, 22F y 33F de S. pneumoniae.
4. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además glucoconjugados de los serotipos 12F, 10A, 11A y 8 de S. pneumoniae.
5. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es una composición de conjugado neumocócico 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25-valente.
6. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicho glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae se prepara por aminación reductora.
7. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho glucoconjugado del serotipo 18C de S. pneumoniae comprende un sacárido que tiene un grado de O-acetilación < 10 %.
8. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha composición inmunogénica comprende además al menos un adyuvante.
9. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es capaz de suscitar anticuerpos IgG en seres humanos que son capaces de unirse al polisacárido de los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae a una concentración de al menos 0,35 pg/ml, según se determina mediante un ensayo ELISA.
10. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que es capaz de suscitar anticuerpos funcionales en seres humanos que son capaces de destruir los serotipos 18A, 18b y/o 18F de S. pneumoniae, según se determina mediante un ensayo opsonofagocítico in vitro (OPA).
11. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que es capaz de suscitar un título de al menos 1:8 contra los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en al menos el 50 % de los sujetos, según se determina mediante un ensayo de destrucción opsonofagocítica in vitro (OPA).
12. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que es capaz de aumentar significativamente la proporción de respondedores contra los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, en comparación con la población preinmunizada.
13. - La composición inmunogénica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que es capaz de aumentar significativamente los títulos de OPA de sujetos humanos contra los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae, en comparación con la población preinmunizada.
14. - La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una infección, una enfermedad o una afección provocada por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
15. - La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en la prevención de la infección por los serotipos 18A, 18B y/o 18F de S. pneumoniae en un sujeto.
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