KR20150021127A - 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 제조하기 위한 단축 정제 방법 - Google Patents

스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 제조하기 위한 단축 정제 방법 Download PDF

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KR20150021127A
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Abstract

본 발명은 세포 스트렙토코커스 뉴모니아 용해물 배양액으로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 포함하는 용액을 제조하는 단축된 방법을 기술하고 있다. 청징화된 S. 뉴모니아 용해물을 한외여과 및 정용여과시킨 후, 4.5 미만, 바람직하게는 약 3.5로 pH를 조정하고, 다당류 수율에 심각한 영향을 미치지 않으면서 용액 내 단백질 98% 이상을 침전시켰다. 또한, 이어서 한외여과와 정용여과를 하고, pH 4.5 미만으로 산성화시키고, 활성탄을 사용하여 여과하고 다당류 수율에 심각한 영향을 미치지 않으면서 잔여 단백질 90% 이상을 침전시킨다. 본 발명의 단축된 공정을 사용하여 정제시킬 수 있는 비제한적 예시의 S. 뉴모니아 혈청형은 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 19F형, 및 23F형이다. 일 구체예에서, 데옥시콜린산나트륨(DOC)을 사용하여 스트렙토코커스 뉴모니아 세포를 용해시키고, 반면에 또다른 구체예에서는 용해제가 비동물 유래 용해제, 예컨대 N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS)이다.

Description

스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 제조하기 위한 단축 정제 방법{SHORTENED PURIFICATION PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CAPSULAR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLYSACCHARIDES}
본 발명은 정제된 폐렴구균성 다당류의 제조에 사용된 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae ; S. pneumoniae) 혈청형의 세포 용해물로부터 과잉 가용성 단백질 및 기타 불순물의 제거 방법에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니아는 통상 쌍으로(쌍구균), 또한 단쇄로 또는 단일 세포로서 나타내는 그람 양성의 란셋형 구균이다. 이들은 반짝이는(glistening) 콜로니를 형성하면서 혈액 한천배지 상에서 쉽게 성장하며 베타 용혈반응을 보이는 혐기성 환경(anaerobically)에서 성장시키지 않는 한 알파 용혈반응을 나타낸다. 이들은 세포의 자가 효소인 자가용해소의 존재 하에 세포벽을 분해시킬 수 있는 담즙 염에 감수성이 있다. 상기 유기체는 내기성 혐기성생물이고 복합적인 영양소 요구 조건을 갖는다는 점에서 까다롭다.
대부분의 폐렴구균의 혈청형 세포는 각 세포의 주변을 감싸는 다당류 코팅인 협막을 갖는다. 이 협막은 항체가 박테리아 세포에 결합하는 것을 막음으로써 식균작용을 방해하기 때문에 인간 내에서 병독성의 결정자이다. 최근 약 90%의 침윤성 질병의 원인이 되는 23개의 혈청형을 비롯해 90개의 협막 혈청형이 동정되었다. 백신으로서, 다당류는 발달하거나 비손상된 면역계를 갖는 개인에서 S. 뉴모니아에 대한 적당한 면역 정도를 부여할 수 있다. 하지만, 다당류가 CRM197과 같은 고분자량 단백질과 접합되고 다중 혈청형의 접합체를 포함하는 백신으로 조제하는 경우, 그러한 접합체 백신은 또한 폐렴구균 감염에 대해 가장 높은 위험에 있는 유아 및 중장년층에서 면역 반응을 일으킬 수 있다.
백신 생성물에 사용되는 각 S. 뉴모니아 혈청형에 대한 협막 다당류는 액체 배지에서 유기체를 성장시킴으로써 생성된다. 유기체의 군집은 종종 시드 바이알에서 시드 병으로 규모가 확대되고 생성 규모 발효 부피에 도달할 때까지 증가한 부피의 하나 이상의 시드 발효기를 통해 통과된다. 성장 주기의 완료는, 세포가 고정상에 도달하는 경우 세포 용해를 유발하는 자가용해소의 방출 및 세포벽 파괴를 돕는 기타 시약 또는 세제의 첨가를 통해 세포가 용해되는 시점에 여러 수단 중 하나에 의해 측정될 수 있다. 이후 하류(정제) 처리를 위해 배양액을 수확한다. 주요 오염물질은 세포 단백질, 핵산, C-다당류 및 배지 성분이다.
최근 시판된 7가 폐렴구균 접합체(7vPnC) 백신(Prevnar®)을 위한 대부분의 혈청형의 경우, 새롭게 개발된 13가 폐렴구균 접합체(13vPnC) 백신과 마찬가지로, 기존의 정제 공정은 고비용의 노동 집약적이고 기술이 요구되는 다수의 작업, 예컨대 크로마토그래피 및 다중 막 분리를 비롯한 16개 단계를 필요로 한다. S. 뉴모니아 다당류의 정제 공정을 개선하려는 선행 시도들은, 예를 들어 발효 및 회수 동안 pH 조작(미국 특허 출원 공개 번호 제2006/0228381호 참조) 및 용매와 세제의 침전을 포함하였다. 하지만, 이 공정에서 불순물 제거는 여전히 상당히 노동 집약적이고 고비용의 단계를 전개시킨다. 단백질 농도는 가용성 단백질의 물리적 및 화학적 성질로 인해 가장 문제성 사양이다.
따라서, 폐렴구균 접합체 백신에 도입시키기에 적당한 실질적으로 정제된 협막 다당류를 생성하기 위해 S. 뉴모니아 용해물 내 가용성 단백질 농도를 감소시키고 기존의 정제 공정의 비효율성을 감소시킨 간소화된 정제 공정이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 공정은
(a) 선택된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
(b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
(c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
(d) 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 보유물을 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)의 보유물의 pH를 4.5 미만으로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
(f) 침전물이 가라앉기에 충분한 시간 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지한 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(g) 활성탄 필터를 통해 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
(h) 단계 (g)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
(i) 멸균 필터를 사용하여 단계 (h)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
를 포함하고; 이에 따라 용액 형태의 실질적으로 정제된 협막 다당류가 생성된다. 본 발명의 상기 구체예에 선택된 비제한적으로 예시적인 S. 뉴모니아 혈청형은 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 19F형, 및 23F형이다. 특정 구체예에서, 단계 (e)의 pH를 약 3.5로 낮춘다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 5.5∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 7.0∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 7.4로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 보유물로부터 단백질 98% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (g)는 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액으로부터 단백질 90% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (g)의 활성탄 필터는 목재계 인산-활성탄을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (f)는 2시간 이상 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지하는 것을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 데옥시콜린산나트륨(DOC)이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 비동물 유래 용해제이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 비동물 유래 용해제 N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS)이다.
스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 본 발명의 방법에 의해 생성된 실질적으로 정제된 협막 다당류는 폐렴구균 백신, 바람직하게는 단백질 담체와 접합된 다당류를 포함하는 폐렴구균 백신의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 생성하는 방법에 관한 것이다. 이 공정은
(a) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
(b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
(c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
(d) 중성 pH, 실온에서 염 무함유 배지 중의 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 염 무함유 보유물을 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)의 염 무함유 보유물의 pH를 4.5 미만으로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
(f) 실온에서 침전물이 가라앉을 수 있는 2시간 이상 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지한 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(g) 활성탄 필터를 통해 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
(h) 단계 (g)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
(i) 멸균 필터를 사용하여 단계 (h)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
를 포함하고; 이에 따라 용액 형태의 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 포함하는 실질적으로 정제된 협막 다당류가 생성된다. 특정 구체예에서, 단계 (e)의 pH를 약 3.5로 낮춘다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 5.5∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 7.0∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 7.4로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 염 무함유 보유물로부터 단백질 98% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (g)는 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액으로부터 단백질 90% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (g)의 활성탄 필터는 목재계 인산-활성탄을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 데옥시콜린산나트륨(DOC)이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 비동물 유래 용해제이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 비동물 유래 용해제 N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS)이다.
본 발명은 또한 혈청형 19A형을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 생성하는 방법에 관한 것이다. 이 공정은
(a) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
(b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
(c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
(d) 약 6의 pH, 약 4℃에서 인산나트륨 완충액 중의 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 보유물을 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)의 보유물의 pH를 4.5 미만으로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
(f) 약 4℃에서 침전물이 가라앉을 수 있는 2시간 이상 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지한 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(g) 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액의 pH를 약 6으로 조정하여 pH 조정된 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(h) 활성탄 필터를 통해 단계 (g)의 pH 조정된 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
(i) 단계 (h)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
(j) 멸균 필터를 사용하여 단계 (i)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
를 포함하고; 이에 따라 용액 형태의 혈청형 19A형을 포함하는 실질적으로 정제된 협막 다당류가 생성된다. 특정 구체예에서, 단계 (e)의 pH를 약 3.5로 낮춘다. 또다른 구체예에서, 단계 (i)의 정용여과는 약 5.5∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (i)의 정용여과는 약 7.0∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (i)의 정용여과는 약 7.4로의 pH 조정을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 보유물로부터 단백질 98% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)는 단계 (g)의 pH 조정된 청징화된 다당류 용액으로부터 단백질 90% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 활성탄 필터는 목재계 인산-활성탄을 포함한다. 또다른 구체예에서, 단계 (d)의 인산나트륨 완충액은 25 mM 인산나트륨이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 데옥시콜린산나트륨(DOC)이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 비동물 유래 용해제이다. 또다른 구체예에서, 단계 (b)의 용해제는 비동물 유래 용해제 N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS)이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 세포 스트렙토코커스 뉴모니아 용해물 내에서 가용성 단백질 수준을 감소시켜 폐렴구균 접합체 백신에 도입시키는데 적당한 실질적으로 정제된 협막 다당류를 생성하는 단축된 정제 방법에 관한 것이다. 최근 시판된 7가 폐렴구균 접합체(7vPnC) 백신(Prevnar®)을 위한 대부분의 혈청형의 경우, 새롭게 개발된 13가 폐렴구균 접합체(13vPnC) 백신과 마찬가지로, 기존의 다당류 정제 공정은 최대 16개의 단계가 필요하다. 상기 단계는 고비용의 노동 집약적이고 기술이 요구되는 다수의 작업, 예컨대 크로마토그래피 및 다중 막 분리를 수반한다. 본 발명의 공정은 동일한 정제를 성취하는 동안 상기 공정 중 최대 8단계를 제거하고 크로마토그래피에 대한 필요를 제거한다. 따라서, 본 발명은 덜 비싸고, 시간이 덜 들며, 더 적은 단계를 수반하는 더욱 효율적인 정제 공정에 관한 것이다.
본 발명의 단축된 정제 공정은 청징화된 세포 S. 뉴모니아 용해물 배양액을 한외여과 및 정용여과시킨 후, 농축된 용해물 배양액의 pH를 4.5, 바람직하게는 약 3.5 미만으로 산성화시키면, 다당류 수율에 심각하게 영향을 미치지 않으면서 용액 중 단백질 98% 이상을 침전시킨다는 발견에 관한 것이다. 4.5 미만, 바람직하게는 대략 3.5로 pH를 산성화시키기 전, 용해되고 청징화된 발효 배양액의 한외여과 및 정용여과에 의해, 단백질의 "염해" 효과는 제거되고 "염석"되는 단백질 분획은 증가된다. "염해"란 단백질의 증가된 용해도를 지칭하는 반면 "염석"이란 등전점에 도달하였을 때 용액 중 단백질의 침전을 지칭한다. 한외여과 및 정용여과 단계는 또한 탄산나트륨 처리된 배양액이 심지어 5.0의 pH로 산성화되는 경우 관찰되는 발포성을 방지한다(미국 특허 출원 공개 번호 제2006/0228381호 참조). 따라서, 청징화된 용해물 배양액의 한외여과 및 정용여과는 S. 뉴모니아 혈청형의 발효 동안 탄산나트륨과 같은 임의의 저분자량 pH 적정제를 사용할 수 있고 4.5 미만의 pH로 산성화된 경우 청징화된 용해물 배양액의 발포성을 방지한다.
"청징화된 용해물 배양액"이란 원심분리시키거나 또는 여과시켜 세포 잔사물을 제거하는 용해물 배양액을 지칭한다.
"정용여과하는," "정용여과," "DF," 등의 용어는, 예를 들어 용액으로부터 소분자를 제거하기 위해 적당한 물리적 및 화학적 성질을 갖는 반투과성 막을 사용하는 것을 말한다.
"한외여과하는," "한외여과," "UF," 등의 용어는, 예를 들어 용액 중 분자들을 식별하고 더 적은 용액 부피로 분자를 농축시키기 위해 적당한 물리적 및 화학적 성질을 갖는 반투과성 막을 사용하는 것을 말한다.
본 발명의 방법 내에서, 한외여과 및 정용여과는 통상 필터 막이 막히는 것을 피하기 위해 "횡단류" 또는 "접선류" 여과를 포함한다. "횡단류" 여과에서, 여과시키고자 하는 용액은 막의 표면을 가로질러 통과시킨다. 막을 통해 통과한 재료들은 투과물로 지칭된다. 막을 통해 통과하지 않은 재료들은 보유물로 지칭된다. 보유물은 재여과시키게 되는 공급물 저장소로 재순환된다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 산은 pH가 4.5 미만, 특히 약 3.5이 실현되도록 한외여과 및 정용여과된 용해물 배양액의 pH를 더 낮추는데 사용할 수 있다. 따라서, 유기산과 무기산은 둘다 본 발명의 방법 내에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "무기산"이란 유기산의 반대어로서 화학 반응에 의해 무기 광물질로부터 유도된 산을 지칭한다. 본 발명의 방법 내에 사용될 수 있는 무기산의 예시적인 비제한적 예는 염산, 질산, 인산, 및 황산을 포함한다. 특정 구체예에서, 농축된 용해물 배양액의 pH는 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 또는 3.0 미만으로 낮춰진다. 다른 구체예에서, 농축된 용해물 배양액의 pH는 약 4.4, 약 4.3, 약 4.2, 약 4.1, 약 4.0, 약 3.9, 약 3.8, 약 3.7, 약 3.6, 약 3.5, 약 3.4, 약 3.3, 약 3.2, 약 3.1, 약 3.0, 약 2.9, 약 2.8, 약 2.7, 약 2.6, 약 2.5, 약 2.4, 약 2.3, 약 2.2, 약 2.1, 또는 약 2.0으로 낮춰진다.
본 발명의 단축된 정제 공정은 또한 상기 기술된 농축 및 낮은 pH 단계와 함께 활성탄을 이용한 여과가 다당류 수율에 심각하게 영향을 미치지 않으면서 잔여 단백질 90% 이상을 침전시킨다는 발견에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 톱밥 또는 기타 목재 생성물에서 유래되고 인산으로 활성탄을 이용하는 탄소 여과는 기존의 탄소 여과 방법 내에서 사용된 탄소보다 단백질 불순물의 감소 또는 제거에 있어 더욱 효율적인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 제조하는 방법으로서,
(a) 선택된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
(b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
(c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
(d) 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 보유물을 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)의 보유물의 pH를 4.5 미만, 특히 약 3.5로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
(f) 교반하거나 하지 않으면서 침전물이 가라앉기에 충분한 시간, 특히 2시간 이상 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지한 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(g) 활성탄 필터, 특히 목재계 인산 활성탄을 포함하는 활성탄 필터를 통해 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
(h) 단계 (g)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
(i) 멸균 필터를 사용하여 단계 (h)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
를 포함하며; 이에 따라 용액 형태의 실질적으로 정제된 협막 다당류가 생성되는 방법에 관한 것이다. 단계 (i)의 멸균 여과는 농축 정제된 다당류 용액으로부터의 박테리아 및 입자들을 제거하는데 유용하다. 본 발명의 구체예에서 선택된 비제한적 예시적인 S. 뉴모니아 혈청형은 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 19F형, 및 23F형이다. 특정 구체예에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 보유물로부터 단백질 98% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (g)는 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액으로부터 단백질 90% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 5.5∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 하지만, 장기간의 보관 동안 실질적으로 정제된 협막 다당류의 개선된 안정성의 경우, 단계 (h)의 정용여과는 약 7.0∼약 7.5, 더욱 구체적으로는 약 7.4로의 pH 조정을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된 협막 다당류 함유 용해물" 또는 "실질적으로 정제된 협막 다당류를 포함하는 용액"이란 세포 스트렙토코커스 뉴모니아 용해물 또는 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 백분율 비가 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만이고 핵산 대 다당류(NA/PS)의 백분율 비가 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만이도록 단백질이 제거된 용액을 지칭한다. 특정 구체예에서, 실질적으로 정제된 협막 다당류 함유 용해물 또는 특정 혈청형을 포함하는 용액에 대한 단백질/PS 및 NA/PS의 백분율 비는 다음과 같다: 혈청형 1형의 경우, 단백질/PS의 비는 2% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 4형의 경우, 단백질/PS의 비는 3% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 5형의 경우, 단백질/PS의 비는 7.5% 이하이고 NA/PS의 비는 2% 이하이며, 혈청형 6A형의 경우, 단백질/PS의 비는 2% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 6B형의 경우, 단백질/PS의 비는 4% 미만이고 NA/PS의 비는 1% 미만이며, 혈청형 7F형의 경우, 단백질/PS의 비는 5% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 9V형의 경우, 단백질/PS의 비는 2% 미만이고 NA/PS의 비는 1% 미만이며, 혈청형 14형의 경우, 단백질/PS의 비는 3% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 18C형의 경우, 단백질/PS의 비는 2% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 19A형의 경우, 단백질/PS의 비는 2% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 19F형의 경우, 단백질/PS의 비는 3% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이며, 혈청형 23F형의 경우, 단백질/PS의 비는 2% 미만이고 NA/PS의 비는 2% 미만이다. 세포 용해물 또는 용액 중 단백질, 다당류, 및 핵산 농도의 정량 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 예를 들어 SDS-PAGE(도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 및 SEC(크기별 배제 크로마토그래피), 변형된 로우리 검정, 분광광도법, SEC-MALLS(크기별 배제 크로마토그래피/다중각 레이저광 산란), 및 NMR(핵자기공명)을 포함한다.
본 발명의 방법 내에서, 박테리아 세포는 임의의 용해제를 사용하여 용해시킬 수 있다. "용해제"는 세포벽 분해 및 예를 들어 세제를 비롯한 세포 용해를 유발하는 자가용해소의 방출을 돕는 임의의 제제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세제"란 박테리아 세포의 용해를 유도할 수 있는 임의의 음이온성 또는 양이온성 세제를 지칭한다. 본 발명의 방법 내에서 사용하기 위한 상기 세제의 대표예는 데옥시콜린산나트륨(DOC), N-라우릴 사르코신(NLS), 케노데옥시콜산 나트륨, 및 사포닌을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 박테리아 세포를 용해시키는데 사용된 용해제는 DOC이다. DOC 암소 또는 황소와 같은 생물학적 원천에서 통상 유도되는 담즙산 데옥시콜산의 나트륨 염이다. DOC는 LytA 단백질을 활성화시키고, 이는 스트렙토코커스 뉴모니아 내에서 세포벽 성장 및 분열에 수반되는 자가용해소이다. LytA 단백질은 이의 C 말단 부위에 콜린 결합 도메인을 갖고, lytA 유전자의 돌연변이는 DOC에 내용해성인 LytA 돌연변이체를 생성하는 것으로 공지되어 있다.
스트렙토코커스 뉴모니아 다당류 정제 동안 DOC의 사용이 건강에 위협적이라는 것에는 증거가 없음에도 불구하고, 상기 생물학적으로 유도된 시약의 사용은 잠재적 규제 관심을 부상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 박테리아 세포를 용해시키는데 사용된 용해제는 비동물 유래 용해제이다. 본 발명의 방법 내에 사용하기 위한 비동물 유래 용해제는 DOC의 것(즉, LytA 기능에 영향을 주고 스트렙토코커스 뉴모니아 세포의 용해를 초래하는 것)과 유사한 작용 방식인 비동물 원천 유래의 제제를 포함한다. 상기 비동물 유래 용해제는, 비제한적 예로서 DOC의 유사체, 계면활성제, 세제, 및 콜린의 구조적 유사체를 포함하고, 하기 실시예 부분에 기술된 바와 같은 절차를 사용하여 측정될 수 있다. 일 구체예에서, 비동물 유래 용해제는 데칸설폰산, tert-옥틸페녹시 폴리(옥시에틸렌)에탄올(예, Igepal® CA-630, CAS #: 9002-93-1; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Aldrich에서 구입 가능), 옥틸페놀 산화에틸렌 축합물(예, Triton® X-1OO; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Aldrich에서 구입 가능), N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS), 라우릴 이미노디프로피오네이트, 도데실 황산나트륨, 케노데옥시콜린산염, 히오데옥시콜린산염, 글리코데옥시콜린산염, 타우로데옥시콜린산염, 타우로케노데옥시콜린산염, 및 콜린산염으로 이루어진 군에서 선택된다. 또다른 구체예에서, 비동물 유래 용해제는 NLS이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 방법으로 혈청형 특이적 변형시키는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 혈청형 19A형의 다당류가 불안정하고 정제 동안 이의 분자량이 변하기 때문에, 기술된 방법으로 변형시키는 것은 19A 다당류를 안정화시키는데 유용하였음을 발견하였다. 이러한 변형은 pH 약 6의 인산나트륨 완충액 중에서 약 4℃에서 산성화시키기 전에 한외여과 및 정용여과 단계를 수행하고, 약 4℃에서 2시간 이상 동안 산성화된 보유물 용액을 유지시켜 침전물을 가라앉히고, 활성탄 여과 단계 전에 청징화된 다당류 용액의 pH를 6으로 조정하는 것이 포함된다. 반대로, 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 및 23F형의 경우, 산성화 전에 물과 같은 염 무함유 배지에서 한외여과 및 정용여과 단계를 수행하고, 이 단계는 중성 pH, 실온에서 수행할 수 있는 경우, 다당류 손실은 덜하고 단백질 제거는 더 되었다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 또한 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 제조하는 방법으로서,
(a) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
(b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
(c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
(d) 중성 pH, 실온에서 염 무함유 배지 중의 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 염 무함유 보유물을 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)의 염 무함유 보유물의 pH를 4.5 미만, 바람직하게는 3.5로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
(f) 교반하거나 하지 않으면서 실온에서 2시간 이상 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지하여 침전물을 가라앉힌 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(g) 활성탄 필터, 바람직하게는 목재계 인산 활성탄을 포함하는 활성탄 필터를 통해 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
(h) 단계 (g)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
(i) 멸균 필터를 사용하여 단계 (h)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
를 포함하며; 이에 따라 용액 형태의 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 포함하는 실질적으로 정제된 협막 다당류가 생성되는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 염 무함유 보유물로부터 단백질 98% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (g)는 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액으로부터 단백질 90% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)의 정용여과는 약 5.5∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 하지만, 장기간의 보관 동안 실질적으로 정제된 협막 다당류의 향상된 안정성의 경우, 단계 (h)의 정용여과는 약 7.0∼약 7.5, 더욱 구체적으로는 약 7.4로의 pH 조정을 포함한다.
본 발명은 또한 혈청형 19A형을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니아 세포 용해물로부터 실질적으로 정제된 협막 다당류를 제조하는 방법으로서,
(a) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
(b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
(c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
(d) 약 6의 pH, 약 4℃에서 인산나트륨 완충액인 25 mM 인산나트륨 중 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 보유물을 생성하는 단계;
(e) 단계 (d)의 보유물의 pH를 4.5 미만, 특히 약 3.5로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
(f) 교반하거나 하지 않으면서 약 4℃에서 2시간 이상 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지하여 침전물을 가라앉힌 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(g) 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액의 pH를 약 6으로 조정하여 pH 조정된 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
(h) 활성탄 필터, 목재계 인산 활성탄을 포함하는 활성탄 필터를 통해 단계 (g)의 pH 조정된 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
(i) 단계 (h)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
(j) 멸균 필터를 사용하여 단계 (i)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
를 포함하며; 이에 따라 용액 형태의 혈청형 19A형을 포함하는 실질적으로 정제된 협막 다당류가 생성되는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 단계 (e)는 단계 (d)의 보유물로부터 단백질 98% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (h)는 단계 (g)의 pH 조정된 청징화된 다당류 용액으로부터 단백질 90% 이상을 제거한다. 또다른 구체예에서, 단계 (i)의 정용여과는 약 5.5∼약 7.5 사이로의 pH 조정을 포함한다. 하지만, 장기간의 보관 동안 실질적으로 정제된 19A 다당류의 향상된 안정성의 경우, 단계 (i)의 정용여과는 약 7.0∼약 7.5, 더욱 구체적으로는 약 7.4로의 pH의 조정을 포함한다.
하기 실시예는 예시로 제공되며 한정하는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 5형에 대한 평균 공정중 다당류(PS) 수율, 단백질/PS 비, 및 핵산(NA)/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 2는 단축된 정제 공정(B)으로부터의 혈청형 4형의 PS와 비교하였을 때 기존의 정제 공정(A)으로부터의 혈청형 4형의 PS에 대한 NMR 스펙트럼을 도시하고 있다. 2개의 스펙트럼 사이에는 유의할 만한 차이가 관찰되지 않았다. 양 스펙트럼에서 우측에서 두번째 피크가 피루베이트였으며, 피루베이트 군 피크 높이가 양 스펙트럼에서 비교되었다.
도 3은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 4형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 4는 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 19A형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 5는 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 7F형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 6은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 6B형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 7은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 6A형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 8은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 1형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 9는 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 14형에 대한 평균 공정중 PS 수율, 단백질/PS 비, 및 NA/PS 비를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 도시된다.
도 10은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 정제된 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형에 대한 PS 공정중 수율의 비교를 도시하고 있다.
도 11은 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 정제된 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형에 대한 단백질/PS 비의 비교를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 대해 비교된다.
도 12는 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 정제된 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형에 대한 NA/PS 비의 비교를 도시하고 있다. 결과는 각 정제 단계에 대해 비교된다.
도 13은 본 발명의 단축된 정제 공정의 산성화 단계로 인한 단백질 제거 효율을 도시하고 있다. 산성화 전 및 후에 단백질 농도의 차(SDS-PAGE)는 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형의 뱃치의 경우 산성화 전에 초기 단백질 농도에 대하여 플롯팅된다. 초기 단백질 농도에 의해 나뉜 단백질 농도 차는 산성화 단계에 의한 단백질 제거율이 반영되었다.
도 14는 본 발명의 단축된 정제 공정의 탄소 흡착 단계로 인한 단백질 제거 효율을 도시하고 있다. 제거된(탄소 상에 흡착된) 단백질 양은 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형의 뱃치의 초기 단백질 로딩 양에 대하여 플롯팅되었다. 초기 단백질 로딩 양으로 나뉜 제거된 단백질의 양은 탄소 흡착 단계에 의한 단백질 제거율이 반영되었다.
[ 실시예 ]
다음의 실시예는 본 발명의 향상된 방법을 사용하여 1O L 규모에서 정제된 S. 뉴모니아 다당류 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형에 대한 결과를 제시하고, 이 결과들을 기존의 정제 방법의 것과 비교한다.
실시예 1. S. 뉴모니아 다당류 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 14형, 및 19A형을 위한 단축된 정제 방법.
데옥시콜린산나트륨(DOC)으로 용해시킨 S. 뉴모니아 발효 배양액을 수확 후 2일 내에 얻거나, 또는 4℃에서 보관하여 그 다음 주 중에 처리하였다. 하기 기술된 바와 같이, 본 발명의 정제 방법은 기존의 정제 방법과 비교하였을 때 하기 변경 사항을 포함하였다:
1) 산성화 단계는 시작 시점에서 첫번째 한외여과/정용여과 (UF/DF) 단계 이후로 이동시켰고, pH를 5 대신에 3.5로 조정하였음;
2) 정용여과 완충액을 0.025 M 포스페이트에서 탈이온화된(DI) 물로 변경하였음;
3) 목재계 인산 활성탄을 사용하여 탄소 흡착을 2 CUNO R32SP 탄소 디스크(CUNO Inc.; 미국 뉴저지주 웨인 소재)로 변경하고, 흡착 시간을 4에서 12 턴오버로 연장함(각 턴오버는 22분임); 및
4) 약 5회 정용여과시키는 경우 마지막 30K 정용여과 단계 동안 pH를 7.4로 조정함. 동일한 정제 절차를 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 또는 7F형에 적용하였다. 혈청형 19A형의 경우, 단계를 추가로 변형시키고 하기 기술된 바와 같이 냉각실에서 정제를 실시하였다.
정제 단계
모든 단계는 19A형만 제외하고 실온에서 실시하였으며, 19A의 경우, 냉각실 내에서 4℃에서 공정을 실시하였다.
용해물의 청징화: 이 단계의 목적은 세포 잔사물을 제거하고 배양액을 청징화시키는 것이었다. 이는 원심분리 또는 여과에 의해 실현하였다. 30분 동안 또는 배양액이 20℃(19A형의 경우, 4℃)에서 투명해질 때까지 10,000 g에서 배양액을 원심분리하거나, Celpure® 필터 보조물(Advanced Minerals; 미국 캘리포니아주 산타바바라 소재)을 첨가하여 Millipore Prefilter(Millipore Corp.; 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)로 여과시켰다. 추가 처리 동안 청징화된 용해물을 수집하고 펠렛을 버렸다.
첫번째 UF / DF ( 한외여과 / 정용여과 ): 이 단계는 부피 감소 및 완충액 교환이 제공되고 또한 저분자량 불순물을 제거하였다. 청징화된 용해물을 원래 부피의 약 1/8로 농축시켰다. 약 10 부피의 DI수(19A의 경우, pH 6의 25 mM 포스페이트)를 사용하여 정용여과를 수행하였다.
산성화: 이 단계에서 단백질 98% 이상을 제거하였다. 교반하면서, 신중하게 농축된 인산을 보유물에 첨가하였다. 보유물의 pH를 pH 3.5의 표적값으로 조정하였다. 산성화된 보유물을 30분 동안 교반하고 실온에서 밤새 숙성(19A의 경우, 4℃에서 2시간)시켜 단백질 및 핵산을 침전시켰다.
산성화된 보유물의 청징화: 이는 산성화 후 침전물을 제거하기 위한 청징화 단계였다. 산성화된 용액의 슬러리를 20℃에서 1시간 동안(6B의 경우만 제외, 이 경우 원심분리는 37℃에서 6시간이었음) 10,000 rpm (17,000 상대원심력 또는 RCF)으로 회전기 내에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 펠렛을 버렸다. 또한 Celpure® 필터 보조물(Advanced Minerals; 미국 캘리포니아주 산타바바라 소재)을 첨가하여 Millipore Prefilter(Millipore Corp.; 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 통한 심층 여과를 이 단계에 사용할 수도 있다.
탄소 흡착: 대부분의 경우, 산성화된 100K 보유물을 원심분리한 후에는 연황색이었다. 목재계 인산-활성탄을 사용하여 탄소 흡착에 의해 색조 제거를 실현하였다. 이 단계는 또한 산성화 후 잔류하는 잔류 단백질을 제거하였다. 5∼6시간 동안 또는 밤새 탄소 필터를 통해 청징화된 다당류 용액을 재순환시켰다(19A의 경우, pH를 탄소 흡착 전에 6으로 조정하였음).
최종 3 OK UF / DF: 이것은 최종 다당류(PS) 농도 >2 g/L로 용액을 농축시키는 또다른 농축 및 완충액 교환 단계이고, 이는 탈이온(DI)수로 정용여과시켰다. 탄소-여과된 PS 용액을 농축시켰다. 이후 농축물을 DI수로 10X 정용여과시켰다. pH는 정용 여과 동안 7.4로 조정하였다.
최종 0.2 ㎛ 멸균 여과: 최종 PS 용액을 0.22 ㎛ 필터 또는 멸균 일회용 필터 유닛으로 멸균 여과시키고 4℃ 냉각 장치에 보관하였다.
분석 방법
SDS-PAGE(도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 및 SEC(크기별 배제 크로마토그래피), 변형된 로우리 검정, 분광광도법, SEC-MALLS(크기별 배제 크로마토그래피/다중각 레이저광 산란), 및 NMR(핵자기공명)을 비롯한 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 단백질, PS, 및 핵산 농도의 정량을 수행하였다.
결론 및 논의
5형의 단축된 정제 뱃치: 5형을 위한 단축된 공정을 사용한 3개의 정제 뱃치와 기존의 공정을 사용한 것의 최종 PS 수율, PS 분자량 및 주요 불순물 농도를 하기 표 1에 나타내었다. 출발 배양액 모두가 DOC 용해된 고 세포 밀도 발효 뱃치였고, 이는 표준 SOP 발효 배양액(∼0.3 g/L)보다 더 높은 다당류 농도(∼0.5 g/L)를 갖는다. 첫번째 UF/DF 단계에 30K 또는 50K 막을 사용하였다. 불순물/PS 비를 계산하여 불순물 농도를 계산하였다. 본원에 기술된 모든 다른 혈청형에 대해 동일한 접근법을 사용하였다.
Figure pat00001
표 1의 데이타에서 나타난 것과 같이, 단축된 정제 공정을 사용한 3개의 모든 뱃치의 단백질 비는 ≤ 7.5%의 사양이었고, 또한 기존의 공정의 것과 유사하였다. 핵산(NA)의 비와 C-다당류(C-PS)의 비는 또한 각각 ≤ 2.0% 및 ≤ 35%의 사양 미만으로 적당하였고, 기존의 공정의 것과 유사하였다. 표 1에 제시된 3개의 뱃치의 최종 PS 수율 및 불순물 농도의 결과는 단축된 공정의 재현성과 견고성을 입증하고 있다.
다당류가 3.5의 더 낮은 pH에서 가수분해될 수 있는지 여부에 관하여 일부 문제가 있었다. 따라서 정제 공정 동안 PS 체류 시간의 변화가 모니터링되었고, 최종 정제된 PS의 분자량을 측정하였다. HPLC 크로마토그램으로부터 혈청형 5형의 PS 체류 시간의 유의할 만한 변화가 관찰되지 않았다. 또한 MALLS 측정을 기초로 단축된 공정에 의한 정제된 PS에 대한 분자량과 기존 공정의 것(284kg/몰)에서의 유의적인 차이점은 없었다. 따라서, 정제된 PS의 분자량은 단축된 정제 공정에 의해 악영향을 받지 않는다는 것으로 결론지어졌다.
3개의 단축된 공정 뱃치를 위한 처리 단계 각각에서 공정중 다당류 수율, 단백질/다당류 비 및 핵산/다당류 비를 하기 표 2에 요약하였다.
Figure pat00002
Figure pat00003
임의의 정제 공정의 각 단계 동안 생성물의 손실은 항상 일어난다. 이러한 3개의 단축된 공정 뱃치의 경우, PS 손실은 대부분 첫번째 UF/DF 단계 및 산성화 단계에서 일어났다. 첫번째 UF/DF 단계의 PS 손실은 막의 표면으로 PS 또는 PS-단백질 복합체의 흡착으로 인한 것이었다. 이러한 손실은 정용여과 후 DI수로 막의 보유물 쪽을 씻어내고 원래의 보유물과 씻어낸 것을 합함으로써 최소화시켰다. 산성화 단계에서 PS의 손실은 2개의 이유, 즉 침전 고체로의 PS의 물리적 흡착, 및 산성화 동안 공침전으로 단백질로의 다당류의 결합으로 인한 것일 수 있다. 상기 두번째 가능성은 추가로 조사되었으며 결론은 PS/단백질 결합의 증거를 제시하였다.
도 1은 각 정제 단계에서 단백질/PS 비의 감소를 도시하고 있다. 원심분리 단계가 적은 백분율의 단백질을 제거하였지만, 대부분의 단백질은 산성화 단계에서 제거되었다. 가장 높은 단백질 효과 뱃치의 경우에서조차 미량의 단백질만이 pH 3.5 처리 후에 검출되었다.
단백질/PS 비와 유사하게, 핵산/PS 비는 뱃치 중에서 불순물 농도의 다양성을 보여주었다. 30/50K UF/DF 단계는 동일한 처리 단계에서 단백질 제거와 비교하였을 때 핵산의 유의적 양을 제거하였다. 이론과 결부시키지 않고, 이것은 핵산의 분자 크기가 단백질 크기보다 더 작아서 30/50K UF/DF 단계를 통해 비교적 더 쉽게 제거되기 때문일 수 있다. 첫번째 원심분리 및 산성화 단계는 또한 유의적인 양의 핵산을 제거하였다.
하기 표 2에서는 또한 활성탄 흡착 단계가 단백질/PS 및 NA/PS 농도를 감소시킨다는 것을 보여주었다. 감소율은 첫번째 두 단계만큼 유의적이지 않았지만, 이 단계는 용액의 색조를 제거하는데 중요했으며 불순물 농도를 규격화시켰다.
4형 단축된 정제 뱃치: 4형을 위한 3개의 단축된 정제 뱃치의 요약을 하기 표 3에 제시하였다. 3개의 모든 뱃치를 위한 공급물 배양액은 용해된 DOC였다.
Figure pat00004
4형의 PS 수율은 또한 50∼60%였다. 단백질/PS 비 및 핵산/PS 비는 그 사양 이내였다. C-PS 비는 또한 그 사양 이내에 있었다. 3개의 뱃치 모두의 분자량은 ∼300 kg/몰에 가까웠다. 유사한 발효 배양액을 사용한 기존의 정제 공정에 의해 정제된 혈청형 4형 PS는 또한 더 낮은 분자량인 285 kg/몰을 얻었다. 발효 배양액과 최종 정제된 용액으로부터의 PS의 HPLC 크로마토그래프의 비교는 PS 체류 시간에서 차이가 없었음을 보여주었다. 이는 분자량 차에서의 차이가 공정 변화에 의해 유발되는 것이 아니고, 오히려 발효 공정의 내인성 성질로 인한 것임을 시사한다.
4형 PS는 정제된 분자 내에 피루베이트 기를 포함하고, 이 피루베이트는 폐렴구균 접합체 백신으로 사용하기 위한 접합에 중요하였다. 피루베이트 양이 산 처리에 의해 악영향을 받지 않는다는 것을 입증하기 위해, NMR 분석을 실시하였다. 도 2는 표준 4형 PS와 뱃치 L29276-47의 NMR 스펙트럼을 도시하고 있다. 2개의 스펙트럼 사이에는 유의할 만한 차이점이 관찰되지 않았다. 스펙트럼 둘다 오른쪽에서 두번째 피크는 피루베이트였고, 피루베이트 기 피크 높이는 스펙트럼 둘다 유사하였다. 3개의 모든 단축된 공정 뱃치의 피루베이트 비는 0.8 몰/몰이었고, >0.7 몰/몰의 사양이었다.
3개의 4형 뱃치의 공정중 PS 수율, 단백질/PS 및 NA/PS 비를 하기 표 4에 요약하였다. PS 손실은 대부분 첫번째 원심분리, 산성화 및 활성탄 흡착 단계에서 각각 평균 10%, 8% 및 20%로 일어났다. 전체적인 PS 수율은 5형과 가깝게 55% 정도였다.
Figure pat00005
Figure pat00006
도 3은 표 4에서의 3개의 뱃치를 위한 정제 단계의 각각에서의 평균 PS 수율, 단백질/PS 및 NA/PS 비의 변화를 도시하고 있다. 단백질 제거는 예상한 바와 같이 산성화 단계에서 대부분 일어났다. 또한 첫번째 원심분리 및 UF/DF 단계에서는 일정량의 단백질이 선택적으로 제거되지만, 단백질 감소는 산성화 단계보다 덜하였다.
5형과 유사하게, 대부분의 핵산/PS 비 감소는 50/100K UF/DF, 첫번째 원심분리, 및 산성화 단계에서 일어났고, 첫번째 UF/DF 단계에서 NA 감소는 단백질보다 더 유의적이었다. 또한, 도 3에 도시된 바와 같이, 활성탄 단계는 일정량의 단백질과 NA를 제거하고 사양 이하의 불순물 농도를 가져왔다. 또한 용액의 색조도 제거하였다.
19A형 단축된 정제 뱃치: 19A형 다당류는 정제 동안 불안정하고 분자량이 변화한다. 단축된 정제 공정을 약간 변형시켜 19A 다당류를 안정화시켰다. 이러한 변형은 다음과 같이 요약된다: 1) 냉각실에서 4℃로 정제 단계를 대부분 실시하였음; 2) 첫번째 100K 정용여과를 실온의 물을 사용하는 대신에 pH 6의 25 mM 포스페이트 완충액(4℃)을 사용하여 냉각시켰음; 3) 밤샘에서 2시간으로 산성화 유지 시간을 단축시킴; 그리고 4) 산성화된 100K 보유물을 청징화시킨 후, pH를 6으로 조정하고 활성탄 흡착을 3.5 대신에 pH 6에서 실시함.
단축된 정제 공정에 의해 정제된 2개의 19A 뱃치의 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00007
2개의 단축된 정제 뱃치의 PS 수율은 각각 62% 및 76%였다. 최종 단백질/PS 비, 핵산 비, 및 C-PS 비는 모두 이의 각 사양을 만족시켰다. 2개의 뱃치로부터의 다당류의 최종 분자량은 각각 525 kg/몰 및 488 kg/몰이고, III상 임상 실험(486 kg/몰)에 사용된 19A의 PS에 가까웠다.
2개의 뱃치 모두의 단백질/PS 비는 < 2%의 사양을 만족시켰다. 2개의 뱃치의 NA 및 C-PS 비 모두는 이의 사양 내에 있었다.
각 정제 단계의 PS 수율, 단백질 및 NA 감소는 하기 표 6 및 도 4에 제시하였다. 결론적으로, 첫번째 원심분리 단계를 제외하고 각 정제 단계에서 PS가 손실되었음이 나타났다. 혈청형 5형 및 4형과 같이, 단백질 및 NA 제거는 대부분 첫번째 세 단계에서 일어났으며, 검출가능한 단백질 및 NA가 산성화 후에는 거의 남아있지 않았다. 활성탄 흡착 단계가 유의적인 양의 단백질과 NA를 제거하지는 않았지만, 아마 산성화 후 매우 낮은 단백질과 NA의 농도로 인해 이 단계에서는 색조 제거가 여전히 필요하였다.
Figure pat00008
7F형 단축된 정제 뱃치: 7F형은 비이온성 다당류이며, 통상 상기 기술된 혈청형과 비교하였을 때 기존의 공정을 사용하여 정제하는 동안 단계 중 변화가 필요하다. 하지만, 본 발명의 단축된 정제 공정은 공정 편차의 필요없이 혈청형 7F형에 성공적으로 적용되었다. 단축된 공정을 사용하여 7F형 배양액의 2개의 뱃치를 정제시켰다. 하나는 표준 발효 배양액(L29276-107)이고 하나는 높은 세포 밀도 배양액(L29276-157)이었다. 2개의 뱃치 결과를 하기 표 7에 요약하였다.
Figure pat00009
7F형의 PS 수율은 아마 하전된 단백질 분자에 비이온성 중합체가 덜 결합하는 것으로 인해 사실상 다른 혈청형보다 더 높았다. 최종 단백질, NA 및 C-PS 비는 이의 사양 내에 있었다. 7F형의 분자량은 표준 뱃치와 유사하였고 비록 7F형 분자량은 꽤 높았지만, PS 용액은 비이온성 중합체의 더 적은 배제된 부피로 인해 매우 점성은 아니었다.
정제 단계 각각에서 7F형의 PS 수율, 단백질 및 NA 비는 하기 표 8에 제시되고, 2개의 뱃치 평균은 도 5에서 플로팅되었다.
Figure pat00010
각 정제 단계에서 일부의 7F형 PS가 손실되었다. 전체적으로, PS 손실은 혈청형 5형 및 4형보다 덜하였다. 단백질 및 NA 비 감소는 대부분 첫번째 원심분리, 100K UF/DF, 및 산성화 단계에 의해 일어났다. 다른 혈청형과 유사하게, 100K UF/DF는 단백질보다 NA를 제거하는데 더 효율적이었다. 활성탄 흡착 단계가 산성화 후 매우 낮은 불순물 농도로 인해 유의적인 양의 단백질 및 NA를 제거하지 못했지만, 이 단계에서는 여전히 색조 제거가 필요하였다.
6B형 단축된 정제 뱃치: 단축된 정제 공정을 사용하여 6B형의 2개의 뱃치를 정제하였다. 산성화된 100K 보유물의 청징화는 다른 혈청형(1시간 대신에 6시간)보다 더 긴 시간이 소요되는 것을 발견하였다. 이러한 차이를 제외하고, 정제 공정은 상기 혈청형과 유사하였다. 2개의 뱃치 결과를 하기 표 9에 요약하였다.
Figure pat00011
모든 불순물 농도(단백질, NA, 및 C-PS)는 이의 사양 내에 있었다. PS 수율은 비교적 높았고, 다른 혈청형과 단백질 및 NA 비를 비교하였을 때도 마찬가지였다.
각 정제 단계에서 공정중 PS 수율, 단백질 및 NA 비는 하기 표 10 및 도 6에 제시하였다.
Figure pat00012
19A형과 유사하게, PS 손실은 첫번째 원심분리 단계를 제외한 각 정제 단계에서 발생하였고, 이 경우 PS가 약간 증가하였다. 첫번째 원심분리, 첫번째 100K UF/DF, 및 산성화 단계에 의해 대부분의 단백질과 NA를 제거하였다. 하지만, 또한 활성탄 흡착 단계에서 단백질 및 NA 비가 다소 감소하였다.
6A형 단축된 정제 뱃치: 단축된 정제 공정을 사용하여 6A형의 2개의 뱃치를 정제하였다. 최종 용액의 PS 수율, 불순물 농도 및 분자량을 하기 표 11에 요약하였다.
Figure pat00013
2개의 6A 뱃치의 최종 PS 수율은 단축된 공정을 사용하여 처리된 혈청형 중에서 가장높은 것이 둘다 > 70%였다. 단백질, NA, 및 C-PS 비는 모두 사양 내에 있었다.
하기 표 12 및 도 7은 각 정제 단계에서 공정중 PS 수율, 단백질 및 NA 비의 변화를 나타내었다. 첫번째 원심분리 및 100K UF/DF 단계에서 PS의 손실은 거의 일어나지 않았다. 산성화 및 활성탄 흡착 단계에서 약 10∼15% PS 손실이 일어났고, 이는 다른 혈청형에 가까웠다. 대부분의 단백질 및 NA 비의 감소는 첫번째 원심분리, 100K UF/DF, 및 산성화에 의해 일어났다. 산성화 후, 단백질과 NA의 비는 둘다 이미 이의 사양 이하였다. 단백질의 경우, 산성화가 가장 효율적인 단계였지만, NA의 경우, 100K UF/DF가 대부분의 NA/PS 비를 감소시켰다. 활성탄 흡착 단계가 산성화 후 매우 낮은 불순물 농도로 인해 유의적인 양의 단백질과 NA를 제거하지 못하지만, 이 단계는 여전히 색조 제거가 필요하였다.
Figure pat00014
1형 단축된 정제 뱃치: 단축된 공정에 의해 정제된 1형의 2개의 뱃치를 하기 표 13에 요약하였다. 고 세포 밀도 발효 배양액으로부터 뱃치 L29276-170을 정제시키고 표준 발효 배양액으로부터 L29276-173을 정제시켰다.
Figure pat00015
양 뱃치의 PS 수율은 약 50%이고, 단백질, NA 및 C-PS의 불순물 농도는 모두 이의 사양 내에 있었다.
각 정제 단계 후의 공정중 PS 수율, 단백질 및 NA 비는 하기 표 14 및 도 8에 나타내었다. 이의 경향은 다른 정제된 혈청형과 유사하였다. PS 손실은 산성화 및 활성탄 흡착 단계에서 대부분 일어났고, 대부분의 단백질 및 NA 제거는 첫번째 세 단계에서 일어났다. 100K UF/DF 단계에서 단백질보다 더 많은 NA가 제거되었다. 활성탄 흡착 단계에서 산성화 후 매우 낮은 불순물 농도로 인해 유의적인 양의 단백질 및 NA를 제거하지 못하지만, 이 단계에서는 여전히 색조 제거가 필요하였다.
Figure pat00016
14형 단축된 정제 뱃치: 공정 편차 없이 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 14형의 2개의 뱃치를 정제하였다. 최종 PS 수율, 및 불순물 농도를 하기 표 15에 요약하였다.
Figure pat00017
혈청형 7F형과 유사하게, 혈청형 14형은 비이온성 다당류이고, 이의 기존의 정제 공정은 다른 혈청형과 약간 다르다. 하지만, 본 발명의 단축된 정제 공정은 추가 공정의 필요없이 혈청형 14형에 성공적으로 적용되었다. 2개의 단축된 정제 공정 뱃치의 PS 수율은 50∼60%이고, 단백질 및 NA 비는 이의 사양 내에 있었다. 정제된 PS의 분자량은 또한 사양을 만족하였다.
공정중 PS 수율, 단백질 및 NA 비는 하기 표 16 및 도 9에 요약하였다. 상기 기술된 다른 테스트된 혈청형에서와 같은 PS 손실, 단백질 및 NA의 제거의 유사한 경향이 관찰되었다.
Figure pat00018
Figure pat00019
실시예 2. 상이한 혈청형의 비교(혈청형 L 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14. 18C. 19A. 및 19F).
본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 상이한 혈청형의 정제를 비교하기 위해, 실시예 1에 기술된 모든 혈청형 및 혈청형 9V형, 18C형, 및 19F형의 PS 제거를 하기 도 10에서 하나의 그래프로 플롯팅하였다. 대부분의 혈청형은 정제 단계의 각각에서 PS가 손실되는 유사한 경향을 따랐다. 첫번째 원심분리 단계에서 6B형의 경우와 산성화 단계에서 14형의 경우 PS 수율이 증가하였다. PS 백분율의 손실은 혈청형마다 달랐다. 5형은 산성화 단계에서 대부분의 PS를 잃는 것처럼 보이며 4형은 활성탄 흡착 단계에서 대부분의 PS를 잃는 것처럼 보인다.
혈청형 각각에 대한 각 정제 단계의 단백질/PS 비는 도 11에 도시되어 있다. 도면은 상이한 혈청형의 초기 단백질/PS 비와, 초기 단백질/PS 비가 가장 높은 1형, 4형, 5형, 9V형, 19F형, 및 18C형의 차이에 대하여 도시하고 있다. 단백질/PS 비가 첫번째 UF/DF 단계 후에도 나머지 혈청형과 비교하였을 때 1형, 4형, 5형, 9V형, 19F형, 및 18C형이 더 높을지라도, 산성화 단계는 단백질/PS 비를 상당히 감소시키고 이 단계 후에는 많지 않은 단백질이 남아있었다.
도 12에 도시된 바와 같이, NA/PS 비는 또한 혈청형마다 다르다. 1형 및 5형은 가장 높은 NA/PS 비를 가졌고, 그 다음으로 높은 것은 18C형 및 4형이었다. 첫번째 원심분리 및 UF/DF 단계는 상기 혈청형의 유의적인 양의 NA를 제거하였고 1형이 가장 효율적인 것으로 보였다. 산성화 단계 후 NA는 매우 적게 남아있었다.
실시예 3. 산성화 및 활성탄 흡착 단계의 효율성 분석(혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F).
PnC 다당류의 정제 경우, 가장 심각하고 제거가 어려운 불순물은 단백질이다. 단축된 공정의 불순물 제거 효율성을 더 탁월하게 이해하기 위해, 단백질 제거에 대한 2개의 주요 정제 단계, 산성화 및 활성탄 흡착을 분석하였다. 산성화 단계의 경우, 본 발명의 단축된 정제 공정을 사용하여 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 및 19F형에 대한 산성화 전에 초기 단백질 농도에 대하여 산성화 전후의 단백질 농도 차(SDS-PAGE)를 플롯팅하였다(도 13).
산성화 단계 전, 후에서 용액 부피의 상대적으로 적은 변화로 인해, 초기 단백질 농도로 나눈 단백질 농도차는 산성화 단계에 의한 단백질 제거율을 반영하였다. 도 13은 (SDS-PAGE 검정에 의한) 초기 단백질 농도와 관련된 단백질 농도차의 선형 피트의 기울기를 도시하고 있다. 단백질 농도 변화와 초기 농도 사이에서 매우 탁월한 선형 관계가 관찰되었고, R은 1에 가까웠다. 기울기는 0.9876이었고, 이는 98.76%의 단백질 제거(경미한 용액 부피 변화로 간주됨)와 상응한다. 따라서, 연구된 모든 혈청형의 경우, 산성화 단계는 매우 효율적이며 평균적으로 98% 이상의 단백질이 제거되었다.
산성화 단계와 유사하게, 초기 단백질 로딩과 관련하여 제거(탄소 상 흡착)된 단백질 양을 플롯팅함으로써 활성탄 흡착 단계의 효율성 또한 평가되었다(도 14). R2(0.9723)는 산성화 단계만큼 높지 않았지만, 제거된 단백질과 초기 단백질 로딩 사이의 탁월한 선형 관계가 관찰되었다. 상기 선형 피트의 기울기가 단백질 제거율과 상응하기 때문에, 활성탄 흡착 단계는 93.87%의 단백질 제거율을 나타내었다.
산성화 및 활성탄 흡착 단계의 분석을 기준으로, 2개의 단계 후에는 약 0.1%의 단백질만이 용액 중에 남겨졌다.
실시예 1∼3에 대한 결론
단축된 정제 공정은 S. 뉴모니아의 협막 다당류에 대한 기존의 정제 공정을 대체하기 위해 개발되었다. 단축된 정제 공정은 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 및 19F형에 직접적으로 적용되며, 19A형에는 약간의 편차와 함께 적용되었다. 상기 공정은 용해된 DOC 발효 배양액을 사용하여 1O L 규모에서 실시하였다. 단백질/PS, NA/PS 및 C-PS/PS 비를 비롯한 불순물 농도는 모두 이의 각 사양을 만족하였다. PS 수율은 50% 이상이고 기존의 정제 공정과 유사하였다. 공정중 PS 수율, 단백질/PS 및 NA/PS 비를 플롯팅하여 상이한 혈청형의 양상을 비교하였다. 혈청형 1형, 5형, 9V형, 19F형, 및 18C형은 100K UF/DF 단계 전, 후의 단백질/PS 비를 기초로 정제시키기 가장 어려운 것으로 밝혀졌다.
단계 분석은 산성화 및 활성탄 흡착 단계가 각각 98% 및 90% 이상의 단백질을 제거하는 것을 보여주었다(SDS-PAGE로 측정함).
실시예 4. 다당류의 생성시 데옥시콜린산나트륨을 위한 비동물 유래 용해제의 대체
본 실시예는 실질적으로 정제된 협막 스트렙토코커스 뉴모니아 다당류의 생성을 위해 상기 기술된 공정 중에서 비동물 유래 용해제를 데옥시콜린산나트륨(DOC)의 대체물로 사용할 수 있는지 여부를 조사하였다. 상기 기술된 바와 같이, DOC는 세포벽 성장 및 스트렙토코커스 뉴모니아 내 분할과 연관된 자가용해소인 LytA 단백질을 활성화시킨다. LytA 단백질은 이의 C-말단 부위 내에 콜린 결합 도메인을 가지며, lytA 유전자의 돌연변이는 DOC에 내용해성인 LytA 돌연변이체를 생성하는 것으로 공지되어 있다.
신속한 마이크로역가판 검정을 개발하여 DOC와 유사한 기전으로 세포 용해를 유발하는 화합물을 동정하였다. 스트렙토코커스 뉴모니아 세포사 및 다당류 방출에서 DOC와 동일하게 효과적인 DOC에 대한 여러 비동물 유래의 대안체를 동정하였다. 표준 조건을 사용하여 처리 후, 비동물 유래 화합물로 생성된 다당류의 크기 및 순도는 DOC로 생성된 다당류와 동일하였다.
방법
세포 용해: 0.1∼0.01%(v/v)의 최종 농도에서 테스트하고자 하는 화합물을 발효 배양액에 첨가하고 이 용액을 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이후 상기 용액을 밤새 2∼8℃에서 보관하였다. 다음날 아침에, 용액을 원심분리하여 모든 세포 잔사물을 제거하였다. 세포 무함유 배양액을 SEC-HPLC로 분석하여 방출된 다당류의 농도를 측정하였다. 2∼37℃ 사이의 온도, 바람직하게는 6.0∼7.5의 pH 범위에서 용해를 수행하였다. 세제의 농도는 특정 세제에 따라 통상 0.05∼0.2%였다.
마이크로역가 검정: 상이한 세제 또는 계면활성제에 의한 폐렴구균의 lytA-의존성 용해를 조사하기 위해 신속한 마이크로역가판 검정을 고안하였다. S. 뉴모니아의 2쌍의 동질유전자 균주를 상기 검정에 사용하였다; 각 쌍의 한 구성원은 lytA 유전자의 야생형인 반면 나머지 균주는 lytA 유전자 내 결실이 수행되었다. 따라서, 용해가 활성 lytA 기능에 의존성인 경우, 세제는 돌여변이체 균주를 용해시키지 못할 것이다. 4개의 균주인 R6X, R6X ΔlytA, D39 및 D39 ΔlytA를 HySoy 배지 내에서 대략 중간 대수기(OD600 ~0.2∼0.8; OD600 = 600 nm에서의 광학 밀도)로 배양시켰다. 이후 세포를 원심분리하여 세포 펠렛을 HySoy 배지 내에 재현탁시켰다. 마이크로역가판의 각 웰에, 대조군으로서 세제 스톡 또는 물 10 ㎕와 함께 100 ㎕의 세포 현탁액을 첨가하였다. 36℃에서 약 15분 후, 샘플의 OD600을 Spectramax® 분광광도계(Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)로 측정하였다. 새롭게 제조된 세포 또는 동결 및 해동 세포에 대하여 다음의 결과가 관찰되었다: DOC, 도데실 황산나트륨, Triton® X-100 및 N-라우릴사르코신에 노출된 야생형 세포 모두는 OD값이 블랭크 배지와 유사하였고, 이것은 용해가 일어났음을 나타내었다. 다른 한편으로, ΔlytA 세포는 상기 세제의 존재 하에서 용해되지 않았고, 이는 상기 세제에 세포를 용해시키는 LytA 기능이 필요하다는 것을 나타내었다.
비교 분석 연구에 사용된 PS 단리: 10 L 생물반응장치에서 Hy-Soy 배지 내에서 배양물을 성장시켰다. NaOH 또는 Na2CO3을 사용하여 대략 7.0에서 pH를 조절하였다. 성장 종료시(광학 밀도에서 추가 증가가 없는 것에 의해 제시됨), 배양물을 0.12% DOC 또는 0.1% NLS로 처리하였다. 12∼16시간 동안 배양물을 항온처리하였다. TSA-혈액 한천배지판 위에서 처리된 배양액 샘플을 평판배양함으로써 세포사의 유효성을 확인하였다. (상기 기술된 바와 같은) 표준 절차를 사용하여 다당류를 청징화된 용해물로부터 정제시켰다. 재료의 동정 및 순도를 측정하는데 적당한 표준 분석 기법을 사용하여 정제된 다당류를 조사하였다.
굴절률(RI) 검출기와 연결된 SEC-HPLC를 사용하여 용해물의 PS 함량을 측정하였다.
혈청형 1형 및 6B형을 사용한 비동물 유래 용해제의 스크리닝
Hy-Soy계 배지 내에서 S. 뉴모니아 혈청형 1형 및 6B형을 분리하여 성장시켰다. 배양물을 분리하여 수확하고 튜브로 분리하여 분배하였다. DOC와 유사한 용해 활성에 대하여 스크리닝하고자 하는 비동물 유래 화합물을 (적당한 용매 중에서) 스톡 용액으로 제조하고 배양물에 첨가하였다. 밤새 항온처리한 후, 튜브를 원심분리하고 각 혈청형에 대한 용해물의 PS 함량을 SEC-HPLC로 측정하고 DOC와 비교하였다.
lytA 돌연변이체를 사용한 비동물 유래 용해제의 스크리닝
lytA 돌연변이를 포함하는 균주의 동질유전자 쌍을 Hy-Soy계 배지에서 성장시켰다. 그 세포를 수확하고 마이크로역가판 내 웰로 분배하였다. 테스트 화합물을 첨가하고 배양물을 항온처리하였다. 36℃에서 15분 후, SpectraMax® 판 판독기(Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD600)를 측정하였다(예시 화합물에 대한 2개의 개별 테스트로부터의 결과를 요약한 하기 표 17 및 18 참조).
Figure pat00020
Figure pat00021
상기 기술된 스크리닝 연구를 기초로, DOC에 대한 다음의 비동물 유래 용해제 대체물을 확인하였다: 데칸설폰산, Igepal® CA-630(tert-옥틸페녹시 폴리(옥시에틸렌)에탄올; CAS #: 9002-93-1; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Aldrich에서 구입 가능), N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS), 라우릴 이미노디프로피오네이트, 도데실 황산나트륨, Triton® X-100, 케노데옥시콜린산염, 히오데옥시콜린산염, 글리코데옥시콜린산염, 타우로데옥시콜린산염, 타우로케노데옥시콜린산염, 및 콜린산염.
용해된 DOC PS 대 용해된 NLS PS 의 비교
본 발명의 향상된 공정을 사용하여 상기 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 10 L 규모에서 S. 뉴모니아 다당류 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 및 7F형을 정제하였다. 하지만, 한 군 내에서, NLS(0.1%)를 용해제로 사용한 반면 다른 군 내에서는 DOC(0.12%)를 용해제로 사용하였다.
PS 수율, 단백질/PS 비, NA/PS 비, 및 PS 분자량을 상기 기술된 바와 같이 측정하였고, 하기 표 19에 결과를 요약하였다. 상기 결과는 본 발명의 정제 방법 내에서 용해제로 NLS의 사용은 상대적으로 높은 PS 수율과 상대적으로 낮은 단백질 및 핵산 농도를 나타내는 것을 보여주었다. 사실상, 대부분의 테스트된 혈청형의 경우, 용해제로서 NLS의 사용은 DOC 사용과 비교하였을 때 더 높은 PS 수율을 나타내었다.
Figure pat00022
본 명세서에 언급된 모든 공개 및 특허 출원은 본 발명이 보유하는 당업자의 수준을 나타내는 것이다. 본원에서 모든 공개 및 특허 출원은, 각 개별 공개 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 제시되어 참고인용된 것과 같이 동일한 내용으로 본원에 참고인용된다.
상기 본 발명이 이해의 청징화 목적을 위해 예시 및 실시예의 방식으로 다소 상세하게 기술한 바 있지만, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에서 특정 변화 및 변형을 실시할 수 있음이 명백할 것이다.

Claims (28)

  1. 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 백분율 비가 10% 미만인 실질적으로 정제된 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류를 포함하는 용액.
  2. 제1항에 있어서, 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만인 용액.
  3. 핵산 대 다당류(NA/PS)의 백분율 비가 5% 미만인 실질적으로 정제된 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  4. 제3항에 있어서, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 용액.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, NA/PS의 백분율 비가 5% 미만인 용액.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 용액.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류가 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19A형, 19F형 또는 23F형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류인 용액.
  8. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 1형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  9. 단백질/PS의 백분율 비가 3% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 4형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  10. 단백질/PS의 백분율 비가 7.5% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 5형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  11. 640,000 달톤~670,000 달톤의 분자량을 갖는 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 6A형 협막 다당류.
  12. 제11항에 따른 실질적으로 정제된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 6A형 협막 다당류를 포함하는 용액.
  13. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 6A형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  14. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만이며 640,000 달톤~670,000 달톤의 분자량을 갖는 실질적으로 정제된 혈청형 6A형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  15. 단백질/PS의 백분율 비가 4% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 1% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 6B형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  16. 단백질/PS의 백분율 비가 5% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 7F형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  17. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 1% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 9V형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  18. 단백질/PS의 백분율 비가 3% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 14형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  19. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 18C형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  20. 488,000 달톤~525,000 달톤의 분자량을 갖는 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A형 협막 다당류.
  21. 제20항에 따른 실질적으로 정제된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A형 협막 다당류를 포함하는 용액.
  22. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 19A형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  23. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만이며 488,000 달톤~525,000 달톤의 분자량을 갖는 실질적으로 정제된 혈청형 19A형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  24. 단백질/PS의 백분율 비가 3% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 19F형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  25. 단백질/PS의 백분율 비가 2% 미만이고, NA/PS의 백분율 비가 2% 미만인 실질적으로 정제된 혈청형 23F형 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당류를 포함하는 용액.
  26. 제1항 내지 제4항, 제8항 내지 제10항, 제12항 내지 제19항, 및 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이
    (a) 선택된 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
    (b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
    (c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
    (d) 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 보유물을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 보유물의 pH를 4.5 미만으로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
    (f) 침전물이 가라앉기에 충분한 시간 동안 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 유지한 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
    (g) 활성탄 필터를 통해 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
    (h) 단계 (g)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
    (i) 멸균 필터를 사용하여 단계 (h)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 용액.
  27. 제8항 내지 제10항, 제12항 내지 제19항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이
    (a) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 1형, 4형, 5형, 6A형, 6B형, 7F형, 9V형, 14형, 18C형, 19F형, 또는 23F형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
    (b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
    (c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
    (d) 중성 pH, 실온에서 염 무함유 배지 중에서 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 염 무함유 보유물을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 염 무함유 보유물의 pH를 4.5 미만으로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
    (f) 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 실온에서 2시간 이상 동안 유지하여 침전물을 가라앉힌 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
    (g) 활성탄 필터를 통해 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
    (h) 단계 (g)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
    (i) 멸균 필터를 사용하여 단계 (h)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 용액.
  28. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이
    (a) 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A형을 생성하는 박테리아 세포를 포함하는 발효 배양액을 제공하는 단계;
    (b) 용해제로 단계 (a)의 박테리아 세포를 용해시켜서, 세포 잔사물, 가용성 단백질, 핵산, 및 다당류를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 단계;
    (c) 원심분리 또는 여과를 이용하여 단계 (b)의 세포 용해물을 청징화시켜 세포 잔사물을 제거함으로써 청징화된 세포 용해물을 생성하는 단계;
    (d) 6의 pH, 4℃에서 인산나트륨 완충액 중의 단계 (c)의 청징화된 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과시켜 저분자량 불순물을 제거하고 다당류 농도를 증가시킴으로써 보유물을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 보유물의 pH를 4.5 미만으로 낮춰서 단백질과 핵산을 침전시킴으로써 산성화된 보유물 용액을 형성하는 단계;
    (f) 단계 (e)에서 형성된 산성화된 보유물 용액을 4℃에서 2시간 이상 동안 유지하여 침전물을 가라앉힌 후, 산성화된 보유물 용액을 여과 또는 원심분리시켜서 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
    (g) 단계 (f)의 청징화된 다당류 용액의 pH를 6으로 조정하여 pH 조정된 청징화된 다당류 용액을 생성하는 단계;
    (h) 활성탄 필터를 통해 단계 (g)의 pH 조정된 청징화된 다당류 용액을 여과시키는 단계;
    (i) 단계 (h)에 의해 생성된 여과된 용액을 한외여과 및 정용여과시켜 농축 정제된 다당류 용액을 생성하는 단계; 및
    (j) 멸균 필터를 사용하여 단계 (i)에 의해 생성된 농축 정제된 다당류 용액을 여과시키는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 용액.
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