CN105131139B - 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的领域涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法，其具体为，超滤并浓缩肺炎链球菌溶解产物，加入脱氧胆酸钠，调节pH至4‑5，离心处理取上清液，得到酸化溶解产物；超滤酸化溶解产物，加入核酸酶反应3‑8小时，加入脱氧胆酸钠，酸化后离心处理取上清液；超滤浓缩获得纯化多糖溶液，干燥后得到纯化的肺炎链球菌荚膜多糖。该方法未使用苯酚及乙醇，只使用一次核酸酶处理细胞溶解产物，产品更安全环保，工艺时间短，生产成本低，可实现大规模生产。
Description
技术领域
本发明的领域涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法，尤其涉及一种简化的纯化方法。
背景技术
肺炎链球菌是呼吸道感染的首要致病菌，既是引起儿童社区获得性肺炎最常见的病原菌，也是致使老年人致命性肺炎感染的主要病原菌。目前发现90余个血清型，其中约30个血清型的菌株对人类有致病性。荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子，研究结果表明肺炎链球菌荚膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。
制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗一般过程为：细菌在发酵罐中生长，在发酵结束时通过加入脱氧胆酸钠或者另外的裂解剂诱导裂解。然后收获裂解物以进行下游的纯化并回收围绕细菌细胞的荚膜多糖。所述多糖包含于最终的疫苗产物中，并赋予疫苗靶向群体对于选定的肺炎链球菌血清型的免疫力。
在发酵培养过程中，除了产生荚膜多糖之外，还产生大量的蛋白质、核酸等成分，当疫苗中含有这些成分且含量超过一定标准时，接种后可能导致较严重的副反应。《欧洲药典》肺炎链球菌荚膜多糖疫苗规程对荚膜多糖中的蛋白质含量、核酸含量和特异多糖含量有严格的要求。
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法已有诸多报道和研究，但仍存在一些不足。例如，EP8026320中描述了一种经典的肺炎链球菌荚膜多糖纯化方法，即肺炎链球菌发酵培养液经脱氧胆酸钠裂解后，离心超滤浓缩，用乙醇进行两步分级沉淀，再用苯酚抽提法去除蛋白质，用活性炭吸附法去除核酸。该方法步骤繁琐，耗时较多，所用试剂中含有有毒的苯酚，对人体及环境均有危害。另外，乙醇的使用在操作和试剂保存方面均存在重大安全隐患。
US 4242501、US 4686102将此方法进行了改进，用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)替代了苯酚，但仍然没有避免乙醇的使用。US 20100129881和Norma Suarez等人(NORMA SUA′REZ,LAURA FRANCO,et al.,FRAGUASAPPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2001,p.969–971Vol.67,No.2)，在肺炎链球菌荚膜多糖纯化工艺中引入了柱层析的方法，但该方法对操作人员的要求较高，样品处理时间较长，且设备的运行及维护费用高昂，很难满足大规模生产的需求。CA1206905提出了酶解法纯化肺炎链球菌荚膜多糖，Viviane Maimoni(Viviane Maimoni et al.,Simple and efficient method ofbacterial polysaccharides purification for vaccines production usinghydrolytic enzymes and tangential flow ultrafiltration,Communicating CurrentResearch and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology,2007,1(13):450–457；Viviane Maimoni et al.,Purification of Capsularpolysaccharides form streptococcus pneumoniae serotype 23F by a proceduresuitable for scale‐up,Biotechnol.Appl.Biochem.,2003,37(3):283‐287)等人，又做了一些改进，但这些方法均需使用多种核酸酶、蛋白酶，步骤较多，成本较高，而且仍需乙醇分级沉淀处理，存在安全隐患。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一种更为简单，成本更低的纯化方法。
本发明的在于提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法，其含有以下步骤：
(a)细胞裂解
提供包含可产生选定肺炎链球菌血清型的细菌细胞的发酵培养液；
加入脱氧胆酸钠溶解所述步骤中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的细胞溶解产物；使用离心处理细胞溶解产物，取上清；
对上清液进行超滤浓缩，以去除低分子量杂质并浓缩，由此产生第一澄清细胞溶解产物；
(b)脱氧胆酸钠处理
在步骤(a)第一澄清细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4-5以使蛋白质和/或核酸沉淀，离心处理取上清液，得到酸化溶解产物；
重复1-2次,获得进一步纯化的酸化溶解产物；
对进一步纯化的的酸化溶解产物进行超滤浓缩，以去除低分子量杂质并浓缩，以获得第二澄清细胞溶解产物；
(c)核酸酶处理
使用核酸酶处理所述步骤(b)中的第二澄清细胞溶解产物；
在核酸酶处理的细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4-5以使蛋白质和/或核酸沉淀，离心处理取上清液；
对上清液进行超滤浓缩，以去除低分子量杂质并浓缩，从而获得纯化多糖溶液。
其中，前述纯化多糖溶液可通过干燥步骤进行干燥，所述的干燥步骤可为包括喷雾干燥、流化床(fluidized bed)干燥、转鼓式干燥、真空冷冻干燥在内的常见干燥方式，但是出于便捷、以及纯化多糖溶液的稳定性考虑，优选地采取真空冷冻干燥。
其中，前述步骤(a),(b),(c)中的超滤浓缩是指用截留分子量为100Kd-300Kd的超滤膜超滤浓缩。
其中，前述步骤(a)中的脱氧胆酸钠为终浓度为0.05-0.2％的脱氧胆酸钠，前述步骤(b),(c)中的脱氧胆酸钠为终浓度为0.2-3％的脱氧胆酸钠。需要说明的是，由于在步骤(b)中，脱氧胆酸钠的添加量可能分多次重复加入，而此处说明的终浓度含量，是在多次重复添加后的最终浓度含量，且该浓度百分比为质量百分比。
其中，前述步骤(a)中的脱氧胆酸钠的处理时间为12-15小时，温度为18～22℃；所述步骤(b),(c)中的脱氧胆酸钠处理时间为8-15分钟，温度为18～22℃。
其中，前述步骤(a),(b),(c)中的离心过程中的离心力为6000g，离心时间为15～35分钟。
其中，步骤(c)中的核酸酶为脱氧核糖核酸酶I(Sigma公司，货号：DN25，批号：SLBC4924V)。
其中，步骤(c)中的核酸酶处理还混合有CaCl2,MgCl2。
其中，步骤(c)中的核酸酶处理时间为3-8小时，温度为35-37℃。
本方法的优势为：1.避免苯酚的使用，产品更安全环保；2.无乙醇的纯化工艺，消除了安全隐患；3.只使用一次核酸酶，缩短了工艺时间，降低了生产成本；4.工艺操作简便，可实现大规模放大。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料或生物制剂，如无特殊说明，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
具体实施方式
实施例1：1型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
1型肺炎球菌发酵培养液5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.15％，置于室温下裂解12小时。随后将裂解液离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.4，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.4，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过300Kd膜包超滤透析。具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶50mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，并离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过300Kd膜包超滤浓缩至950ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表1所示：
表1 1型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果(其中，表1第一列中的参数为《欧洲药典》中的含量限定值，下同)
实施例2：3型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
3型肺炎链球菌发酵培养液1L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.05％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至4.0,室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入1％脱氧胆酸钠，调pH至4.0，室温静置10分钟，离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。再加入1％脱氧胆酸钠，调pH至4.0，室温静置10分钟，离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过300Kd膜包超滤透析。具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶20mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入1％脱氧胆酸钠，调pH至4.0，室温静置10分钟，并离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至800ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表2所示：
表2 3型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例3：5型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
5型肺炎链球菌发酵培养液6L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶100mg，35-37℃酶解6小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至800ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表3所示：
表3 5型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例4：6B型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
6B型肺炎链球菌发酵培养液7.5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.05％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.1％，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶60mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至900ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表4所示：
表4 6B型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例5：8型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
8型肺炎链球菌发酵培养液3.5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.2％，置于室温下裂解14小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入1％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过300Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶60mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入1％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过300Kd膜包超滤浓缩至850ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表5所示：
表5 8型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例6：9N型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
9N型肺炎链球菌发酵培养液7L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶30mg，35-37℃酶解5小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表6所示：
表6 9N型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例7：10A型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
10A型肺炎链球菌发酵培养液9L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.2％，置于室温下裂解12小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为1％，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入1％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶80mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入1％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1200ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表7所示：
表7 10A型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例8：11A型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
11A型肺炎链球菌发酵培养液7.5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1500ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶75mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至800ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表8所示：
表8 11A型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例9：14型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
14型肺炎链球菌发酵培养液7L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.05％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0 Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶300mg，35-37℃酶解5小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1100ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表9所示：
表9 14型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例10：15B型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
15B型肺炎链球菌发酵培养液7L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12％，置于室温下裂解14小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶140mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表10所示：
表10 15B型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例11：17F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
17F型肺炎链球菌发酵培养液5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.1％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.1％，调pH至4.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.1％脱氧胆酸钠，调pH至4.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶40mg，35-37℃酶解3小时。随后，加入0.1％脱氧胆酸钠，调pH至4.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表11所示：
表11 17F型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例12：18C型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
18C型肺炎链球菌发酵培养液5.5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶140mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至750ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表12所示：
表12 18C型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例13：19A型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
19A型肺炎链球菌发酵培养液6L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.05％，置于室温下裂解12小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.2％，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.2％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶200mg，35-37℃酶解3小时。随后，加入0.2％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1200ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表13所示：
表13 19A型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例14：19F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
19F型肺炎链球菌发酵培养液5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.05％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.2％，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.2％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶60mg，35-37℃酶解3小时。随后，加入0.2％脱氧胆酸钠，调pH至5.0，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表14所示：
表14 19F型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例15：20型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
20型肺炎链球菌发酵培养液7.5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.1％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.8，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.8，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶70mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.8，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表15所示：
表15 20型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例16：22F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
22F型肺炎链球菌发酵培养液4L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12％，置于室温下裂解12小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液1000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶120mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.3，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表16所示：
表16 22F型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例17：23F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
23F型肺炎链球菌发酵培养液30L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.1％，置于室温下裂解15小时。对裂解液并进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至3000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0 Tris-HCl缓冲液，收透析液3500ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶150mg，35-37℃酶解3小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至2400ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表17所示：
表17 23F型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
实施例18：33F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
33F型肺炎链球菌发酵培养液7L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.1％，置于室温下裂解15小时。随后对裂解液进行离心(离心力：6000g，离心时间：35分钟)，收取上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5％，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后重复前述步骤，再加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。随后将该上清液通过100Kd膜包超滤透析，具体透析液为0.05mol/L pH7.0Tris-HCl缓冲液，收透析液2000ml。随后将透析过的处理液通过核酸酶进行处理，具体方式为：加入CaCl2(终浓度1mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)，混匀后加入核酸酶10mg，35-37℃酶解8小时。随后，加入0.5％脱氧胆酸钠，调pH至4.5，室温静置10分钟，进行离心(离心力：6000g，离心时间：15分钟)，收集上清液。最后将获得上清液通过100Kd膜包超滤浓缩至600ml，并最后将该浓缩产物冷冻干燥。纯化后的肺炎链球菌荚膜多糖具体标准效果如表18所示：
表18 33F型肺炎链球菌纯化荚膜多糖各项检测结果
应当注意的是，本发明的实施例有较佳的实施性，且并非对本发明作任何形式的限制，任何熟悉该领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容变更或修饰为等同的有效实施例，但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改或等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)细胞裂解
提供包含可产生选定肺炎链球菌血清型的细菌细胞的发酵培养液；
加入脱氧胆酸钠溶解所述步骤(a)中的细菌细胞；使用离心处理细胞溶解产物，取上清液；
对上清液进行超滤浓缩，由此产生第一澄清细胞溶解产物；
(b)脱氧胆酸钠处理
在步骤(a)第一澄清细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4-5，离心处理取上清液，得到酸化溶解产物；
重复1-2次,获得进一步纯化的酸化溶解产物；
对进一步纯化的酸化溶解产物进行超滤浓缩，以获得第二澄清细胞溶解产物；
(c)核酸酶处理
使用核酸酶处理所述步骤(b)中的第二澄清细胞溶解产物；
在核酸酶处理的细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4-5，离心处理取上清液；
对上清液进行超滤浓缩，获得纯化多糖溶液，
其中，所述步骤(a)中的脱氧胆酸钠终浓度为0.05-0.2％，所述步骤(b),(c)中的脱氧胆酸钠终浓度为0.2-3％。
2.如权利要求1所述的自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，其特征在于，还包括干燥步骤，干燥所述的纯化多糖溶液。
3.如权利要求2所述的自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，其特征在于，所述干燥步骤为真空冷冻干燥。
4.如权利要求1所述的自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，其特征在于，所述步骤(a),(b),(c)中的超滤浓缩是指用截留分子量为100kD-300kD的超滤膜超滤浓缩。
5.如权利要求1所述的自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的脱氧胆酸钠处理时间为12-15小时，温度为18～22℃；所述步骤(b),(c)中的脱氧胆酸钠处理时间为8-15分钟，温度为18～22℃。
6.如权利要求1所述的自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，其特征在于，所述步骤(a),(b),(c)中的离心过程中的离心力为6000g，离心时间为15～35分钟。
7.如权利要求1所述的自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的核酸酶处理为35-37℃酶解3-8小时。
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