BRPI0809212B1 - Processo para produção de polissacarídeos capsulares purificados de um lisado celular de streptococcus pneumoniae e processo para a fabricação de uma vacina pneumocócica - Google Patents
Processo para produção de polissacarídeos capsulares purificados de um lisado celular de streptococcus pneumoniae e processo para a fabricação de uma vacina pneumocócica Download PDFInfo
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Abstract
"processo para produção de polissacarídeos capsulares purificados de um lisado celular de streptococcus pneumoniae e processo para a fabricação de uma vacina pneumocócica". é descrito um processo abreviado para produção de uma solução contendo polissacarídeos capsulares substancialmente purificados de um caldo de lisado celular de streptococcus pneumoniae. ultrafiltração e diafiltração do lisado de s. pneumoniae clarificado seguido por ajuste do ph para menos de 4,5, preferivelmente cerca de 3,5, precipitando pelo menos 98% da proteína na solução sem afetar seriamente o rendimento do polissacarídeo. adicionalmente, seguindose a ultrafiltração, diafiltração e acidificação a um ph de menos de 4,5, a filtração empregando carbono ativado precipita pelo menos 90% do restante da proteína, sem afetar seriamente o rendimento do polissacarídeo. de modo exemplar, os sorotipos de s. pneumoniae não limitantes que podem ser purificados empregando o processo abreviado da invenção são 1, 4, 5, 6a, 6b, 7f, 9v, 14, 18c, 19a, 19f e 23f. em uma modalidade, as células do streptococcus pneumoniae são lisadas empregando desoxicolato de sódio (doc), enquanto em outra modalidade o agente lítico é um agente lítico não derivado de animal, tal como, n-lauril sarcosina de sódio (nls).
Description
POLISSACARÍDEOS CAPSULARES PURIFICADOS DE UM LISADO CELULAR DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E PROCESSO PARA A FABRICAÇÃO DE UMA VACINA PNEUMOCÓCICA. CAMPO DA INVENÇÃO [001] Esta invenção se refere aos métodos para remoção de excesso de proteína solúvel e outras impurezas dos lisados celulares dos sorotipos de Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) empregados na produção de polissacarídeos pneumocócicos purificados. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Streptococcus pneumoniae são cocos conformados em lanceta, gram-positivos, que são geralmente vistos em pares (diplococos), porém também em cadeias curtas ou como células simples. Eles crescem prontamente em placas de ágar-sangue com colônias de cintilação e revelam hemólise alfa a menos que se desenvolvam anaerobicamente onde mostram hemólise beta. Eles são sensíveis aos sais biliares que podem romper a parede da célula com a presença de enzima própria da célula, a autolisina. O organismo é um anaeróbio aerotolerante e é fastidioso pelo que possui requisitos nutricionais complexos.
[003] As células dos sorotipos mais pneumocócicos possuem uma cápsula que é um revestimento polissacarídeo ao redor de cada célula. Esta cápsula é um determinante da virulência nos seres humanos, uma vez que interfere com a fagocitose por prevenir os anticorpos do ataque às células bacterianas. Existem correntemente 90 sorotipos capsulares identificados, com 23 sorotipos responsáveis por cerca de 90% das doenças invasivas. Como uma vacina o polissacarídeo pode conferir um grau razoável de imunidade contra S. pneumoniae nos indivíduos com sistemas imunes desenvolvidos ou não lesionados. Contudo, quando o polissacarídeo é conjugado com uma proteína de peso
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2/47 molecular alto, tal como, CRMÍ97 e formulado em uma vacina contendo conjugados de múltiplos sorotipos, tais vacinas permitem uma resposta imune em bebes e nos mais velhos que também são os que estão mais em risco de sofrer infecções pneumocócicas.
[004] O polissacarídeo capsular para cada sorotipo de pneumoniae utilizado para produtos de vacina é produzido por desenvolvimento do organismo no meio líquido. A população do organismo é frequentemente transferida de um frasco com sementes para garrafas com sementes e passada através de um ou mais fermentadores de semente para aumentar o volume até os volumes de fermentação em escala de produção serem alcançados. O término do ciclo de crescimento pode ser determinado por um de vários meios, no qual ponto as células são lisadas através da adição de um detergente ou outro reagente que ajuda no rompimento da parede da célula e libera a autolisina que causa lise celular quando as células alcançam a fase estacionária. O caldo é então colhido para processamento a jusante (purificação). Os principais contaminantes são proteínas celulares, ácidos nucléicos, polissacarídeo C e componentes do meio.
[005] Para a maior parte dos sorotipos da vacina de conjugado pneumocócico 7 valente (7vPnC) comercializada correntemente (Prevnar(R)), bem como a vacina de conjugado pneumocócico de 13 valentes (13vPnC) desenvolvida recentemente, o processo de purificação corrente requer dezesseis etapas envolvendo trabalho intenso e operações tecnológicas, tais como, cromatografia e múltiplas separações de membrana. Tentativas anteriores para aperfeiçoar os processos de purificação dos polissacarídeos de S. Pneumoniae incluíram, por exemplo, manipulação de pH durante fermentação e recuperação (vide, Pedido de Patente US publicado número 2006/0228381) e precipitação de solvente e detergente. Contudo, a remoção das impurezas nestes processos ainda é realizada em muitas etapas laboratoriais in
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3/47 tensivas e caras. O nível da proteína é a especificação mais problemática a ser satisfeita em razão das propriedades físicas e químicas das proteínas solúveis.
[006] Assim existe a necessidade de um processo de purificação simplificado para reduzir os níveis das proteínas solúveis nos lisados de S. pneumoniae e eliminação das ineficiências do processo de purificação atual para produção de polissacarídeos capsulares substancialmente purificados apropriados à incorporação em vacinas de conjugado pneumocócico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] A presente invenção se refere ao processo para produção de polissacarídeo capsular substancialmente purificado de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae. Este processo compreende as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo células bacterianas que produzem um sorotipo selecionado de Streptococcus pneumoniae-, (b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular compreendendo fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato;
(e) diminuição do pH do retentato da etapa (d) para menos de 4,5 de modo a precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo
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4/47 formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
(g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) através de um filtro de carbono ativado;
(h) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (g), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (i) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (h) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares substancialmente purificados na forma de uma solução. De modo exemplar, sorotipos de S. pneumoniae não limitantes selecionados para esta modalidade da invenção são 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Em uma modalidade específica, o pH da etapa (e) é diminuído para cerca de 3,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de
7,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para cerca de 7.4. Ainda em outra modalidade, a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato da etapa (d). Em outra modalidade, a etapa (g) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f). Em outra modalidade, o filtro de carbono ativado da etapa (g) compreende ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira. Em outra modalidade, a etapa (f) compreende manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa
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5/47 (e) por pelo menos 2 horas. Ainda em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é desoxicolato de sódio (DOC). Em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é um agente lítico não derivado de animal. Ainda em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é o agente lítico não derivado de animal N-lauril sarcosina de sódio (NLS).
[008] O polissacarídeo capsular substancialmente purificado produzido por um processo da invenção de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae pode ser empregado na fabricação de uma vacina pneumocócica, preferivelmente uma vacina pneumocócica contendo polissacarídeo conjugado com um veículo de proteína. A presente invenção também se refere ao processo para produção de polissacarídeo capsular substancialmente purificado de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae compreendendo sorotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F. Este processo compreende as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo células bacterianas que produzem sorotipo de Streptococcus pneumoniae 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F;
(b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular compreendendo fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) a temperatura ambiente em pH neutro em meios isentos de sal para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato isento de sal;
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6/47 (e) diminuição do pH do retentato isento de sal da etapa (d) para menos de 4,5 de modo a precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas a temperatura ambiente de modo a permitir o assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada; (g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) através de um filtro de carbono ativado;
(h) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (g), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (i) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (h) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares substancialmente purificados compreendendo sorotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F na forma de uma solução. Em uma modalidade específica, o pH da etapa (e) é diminuído para cerca de 3,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para cerca de 7.4. Ainda em outra modalidade, a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato isento de sal da etapa (d). Em outra modalidade, a etapa (g) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f). Em outra modalidade, o filtro de carbono ativado da etapa (g) compreende ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira. Ainda em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é desoxicolato
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7/47 de sódio (DOC). Em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é um agente lítico não derivado de animal. Ainda em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é o agente lítico não derivado de animal Nlauril sarcosina de sódio (NLS).
[009] A presente invenção também se refere ao processo para produção de polissacarídeo capsular substancialmente purificado de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae compreendendo sorotipo 19A. Este processo compreende as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo células bacterianas que produzem sorotipo de Streptococcus pneumoniae 19A;
(b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular compreendendo fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) a cerca de 4 0°C a um pH de cerca de 6 em tampão de fosfato de sódio para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato;
(e) diminuição do pH do retentato da etapa (d) para menos de 4,5 de modo a precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas a cerca de 4°C de modo a permitir o assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma
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8/47 solução de polissacarídeo clarificada; (g) ajuste do pH da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) para cerca de 6, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado;
(g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado da etapa (g) através de um filtro de carbono ativado;
(i) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (h), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (j) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (i) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares substancialmente purificados compreendendo sorotipo 19A na forma de uma solução. Em uma modalidade específica, o pH da etapa (e) é diminuído para cerca de 3,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de
7,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para cerca de 7.4. Ainda em outra modalidade, a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato da etapa (d). Em outra modalidade, a etapa (h) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado da etapa (g). Em outra modalidade, o filtro de carbono ativado da etapa (h) compreende ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira. Em outra modalidade, o tampão fosfato de sódio da etapa (d) is 25 mM fosfato de sódio. Ainda em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é desoxicolato de sódio (DOC). Em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é um agente lítico não derivado de animal. Ainda em outra modalidade, o agente lítico da etapa (b) é o agente lítico não derivado de animal N-lauril sarcosina de sódio (NLS).
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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0010] A figura 1 ilustra o rendimento médio do polissacarídeo (PS) no processo, taxa de proteína/PS e taxa de ácido nucléico (NA)/PS para sorotipo 5 empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0011] A figura 2 ilustra os espectros de NMR para sorotipo 4 PS do processo de purificação atual (A) em comparação com o sorotipo 4 PS do processo de purificação abreviado (B). Não foram observadas diferenças significativas entre os dois espectros. A segunda máxima a partir da direita em ambos os espectros era piruvato e a altura da máxima do grupo piruvato era comparável em ambos os espectros.
[0012] A figura 3 ilustra o rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/OS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 4 empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0013] A figura 4 ilustra rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/PS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 19A empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0014] A figura 5 ilustra rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/PS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 7F empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0015] A figura 6 ilustra rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/PS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 6B empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0016] A figura 7 ilustra rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/PS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 6A empregando o proces
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10/47 so de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0017] A figura 8 ilustra rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/PS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 1 empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0018] A figura 9 ilustra rendimento médio do PS no processo, taxa de proteína/PS e taxa ΝΑ/PS para sorotipo 14 empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são mostrados para cada etapa de purificação.
[0019] A figura 10 ilustra uma comparação dos rendimentos do PS no processo para sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19 A e 19F purificados empregando o processo de purificação abreviado da invenção.
[0020] A figura 11 ilustra uma comparação das taxas de proteína/PS para sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F purificados empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são comparados para cada etapa de purificação.
[0021] A figura 12 ilustra uma comparação das taxas ΝΑ/PS para sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F purificados empregando o processo de purificação abreviado da invenção. Os resultados são comparados para cada etapa de purificação.
[0022] A figura 13 ilustra eficiência de remoção de proteína atribuída etapa de acidificação do processo de purificação abreviado da invenção. A diferença na concentração da proteína (SDS-PAGE) antes e após acidificação é colocada em gráfico contra concentração de proteína inicial antes da acidificação para bateladas de sorotipos 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F. A diferença da concentração de proteína dividida pela concentração de proteína inicial refletiu a taxa de remoção de proteína pela etapa de acidificação.
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11/47 [0023] A figura 14 ilustra eficiência de remoção de proteína atribuível a etapa de absorção de carbono do processo de purificação abreviado da invenção. A quantidade de proteína removida (absorvida sobre carbono) foi colocada em gráfico contra quantidades de carga de proteínas iniciais para bateladas de sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F. A quantidade de proteína removida dividida pelas quantidades de carga de proteínas iniciais refletiu a taxa de remoção de proteína pela etapa de absorção de carbono.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0024] A presente invenção se refere ao a processo de purificação abreviado para reduzir os níveis de proteína solúvel nos lisados celulares de Streptococcus pneumoniae para produzir polissacarídeos capsulares substancialmente purificados apropriados para incorporação às vacinas conjugadas pneumocócicas. Para a maior parte dos sorotipos empregados na vacina conjugada pneumocócica 7-valente (7vPnC) comercializada atualmente (Prevnar(R)), bem como, a vacina conjugada pneumocócica 13-valente (13vPnC) desenvolvida recentemente, o processo de purificação de polissacarídeo atual requer até dezesseis etapas. Estas etapas envolvem muitas operações caras, muito trabalhosas e que demandam tecnologia, tais como, cromatografia e múltiplas separações de membrana. O processo da presente invenção elimina até oito destas etapas enquanto realizando a mesma purificação e eliminando a necessidade de cromatografia. Assim, a presente invenção se refere a um processo de purificação mais eficiente que seja mais barato, mais rápido e envolva menos etapas.
[0025] O processo de purificação abreviado da presente invenção se refere à descoberta de que ultrafiltração e diafiltração do um caldo de lisado de S. pneumoniae celular clarificado, seguido por acidificação do caldo de lisado concentrado a um pH de menos de 4,5, preferivelmente cerca de 3,5, precipita pelo menos 98% da proteína na solu
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12/47 ção sem afetar seriamente o rendimento do polissacarídeo. Por ultrafiltração e diafiltração do caldo de fermentação lisado e clarificado antes da acidificação a um pH de menos de a 4,5, preferivelmente ao redor de 3,5, os efeitos de salinização das proteínas são eliminados e a fração da proteína que é dessalinizada é aumentada. Salinização se refere à solubilidade aumentada das proteínas, enquanto dessalinização se refere à precipitação das proteínas na solução conforme elas alcançam seus pontos isoelétricos. A etapa de ultrafiltração e diafiltração também impede o espumamento observado quando o caldo tratado com carbonato de sódio sofre acidificação, mesmo a um pH de 5,0 (vide Pedido de Patente US Publicado Número 2006/0228381). Assim, a ultrafiltração e diafiltração do caldo de lisado clarificado tornam possível o uso de qualquer titulador de pH de peso molecular baixo, tal como, carbonato de sódio durante fermentação do sorotipo de
S. pneumoniae e impedem o espumamento do caldo de lisado clarificado quando acidificado a um pH de menos de 4,5.
[0026] Caldo de lisado clarificado se refere a um caldo de lisado que sofreu centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células.
[0027] Diafiltração, DF e termos semelhantes se referem, por exemplo, ao uso de membranas semipermeáveis com propriedades físicas e químicas para remoção de moléculas pequenas de uma solução.
[0028] Ultrafiltração, UF e termos semelhantes se referem, por exemplo, ao uso de membranas semipermeáveis com propriedades físicas e químicas apropriadas para discriminar entre moléculas em uma solução e moléculas semelhantes a concentrado em um volume menor da solução.
[0029] Dentro dos métodos da presente invenção, ultrafiltração e diafiltração compreendem, tipicamente, filtração de fluxo transversal
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13/47 ou fluxo tangencial, a fim de evitar entupimento das membranas do filtro. Na filtração de fluxo transversal, a solução a ser filtrada é passada através da superfície da membrana. Os materiais que passam através da membrana são referidos como permeato. Os materiais que não passam através da membrana são referidos como retentato. O retentato é reciclado para um reservatório de alimentação de modo a ser refiltrado.
[0030] Conforme usado aqui, qualquer ácido pode ser usado para abaixar o pH do caldo de lisado ultrafiltrada e diafiltrado, à medida que um pH inferior a 4,5, especificamente cerca de 3,5 seja obtido. Consequentemente, ambos os ácidos orgânicos e minerais podem ser usados nos métodos da invenção. Conforme usado no presente documento, o termo ácido mineral se refere a um ácido derivado de mineral inorgânico por reação química de modo oposto aos ácidos orgânicos. De modo exemplar, exemplos não limitantes de ácidos minerais que podem ser usados dentro dos métodos da presente invenção incluem ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. Nas modalidades preferidas, o pH do caldo de lisado concentrado é diminuído para menos de 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 ou 3,0. Em outras modalidades, o pH do caldo de lisado concentrado é diminuído para cerca de 4,4, cerca de 4,3, cerca de 4,2, cerca de 4,1, cerca de 4,0, cerca de 3,9, cerca de 3,8, cerca de 3,7, cerca de 3,6, cerca de 3,5, cerca de 3,4, cerca de 3,3, cerca de3,2, cerca de 3,1, cerca de 3,0, cerca de 2,9, cerca de 2,8, cerca de2,7, cerca de 2,6, cerca de 2,5, cerca de 2,4, cerca de 2,3, cerca de2,2, cerca de 2,1 ou cerca de 2,0 [0031] O processo de purificação abreviado da presente invenção também se refere à descoberta de que, em combinação com as etapas de concentração e pH baixo descritas acima, a filtração empregando carbono ativado precipitada pelo menos 90% da proteína res
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14/47 tante, sem afetar seriamente o rendimento do polissacarídeo. Nas modalidades preferidas, foi verificado que a filtração de carbono empregando carbono derivado de serragem ou outros produtos de madeira e ativado com ácido fosfórico é mais eficaz na redução ou remoção das impurezas da proteína que os carbonos usados nos métodos de filtração de carbono usados atualmente.
[0032] Consequentemente, a presente invenção se refere ao processo para produção de polissacarídeo capsular substancialmente purificado de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae compreendendo as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo células bacterianas que produzem um sorotipo selecionado de Streptococcus pneumoniae-, (b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular compreendendo fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato;
(e) diminuição do pH do retentato da etapa (d) para menos de 4,5, especificamente cerca de 3,5, para precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado, especificamente por pelo menos 2 horas com ou sem agi
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15/47 tação, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
(g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) através de um filtro de carbono ativado, especificamente um filtro de carbono ativado compreendendo ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira;
(h) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (g), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (i) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (h) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares substancialmente purificados na forma de uma solução. A filtração estéril da etapa (i) é útil para remover bactérias e partículas da solução de polissacarídeo concentrada e purificada. De modo exemplar, sorotipos de S. pneumoniae não limitantes selecionados para esta modalidade da invenção são 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Em uma modalidade específica, a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato da etapa (d). Em outra modalidade, a etapa (g) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f). Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5. Contudo, de modo a aperfeiçoar a estabilidade do polissacarídeo capsular substancialmente purificado durante armazenamento de longo prazo, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5 e mais especificamente para cerca de 7,4. [0033] Conforme empregado no presente documento, o termo lisado contendo polissacarídeo capsular substancialmente purificado ou solução contendo polissacarídeos capsulares substancialmente
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16/47 purificados se refere a um lisado ou solução de Streptococcus pneumoniae a proteína da qual foi removida, tal que, a taxa porcentual da proteína para polissacarídeo (proteína/PS) é inferior a 10%, inferior a 9%, inferior a 8%, inferior a 7%, inferior a 6%, inferior a 5%, inferior a 4%, inferior a 3%, inferior a 2%, ou inferior a 1% e a taxa porcentual de ácido nucléico para polissacarídeo (ΝΑ/PS) é inferior a 5%, inferior a 4%, inferior a 3%, inferior a 2%, ou inferior a 1%. Nas modalidades preferidas, as taxas porcentuais da proteína/PS e ΝΑ/PS para lisados contendo polissacarídeo capsular substancialmente purificado ou soluções compreendendo sorotipos específicos são como se segue: para sorotipo 1 a taxa da proteína/PS é inferior a 2% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 4 a taxa da proteína/PS é inferior a 3% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 5 a taxa da proteína/PS é inferior a ou igual a 7,5% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a ou igual a 2%, para sorotipo 6A a taxa da proteína/PS é inferior a 2% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 6B a taxa da proteína/PS é inferior a 4% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 1%, para sorotipo 7F a taxa da proteína/PS é inferior a 5% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 9V a taxa da proteína/PS é inferior a 2% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 1%, para sorotipo 14 a taxa da proteína/PS é inferior a 3% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 18C a taxa da proteína/PS é inferior a 2% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 19A a taxa da proteína/PS é inferior a 2% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%, para sorotipo 19F a taxa da proteína/PS é inferior a 3% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2% e para sorotipo 23F a taxa da proteína/PS é inferior a 2% e a taxa de ΝΑ/PS é inferior a 2%. Métodos para a quantificação da proteína, polissacarídeo e concentrações de ácido nucléico em um lisado celular ou soluções são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise SDS-PAGE (Eleroforese de Gel Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Sódio), HPLC (Cromatografia de Líquido de
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Alto Desempenho) e SEC (Cromatografía por Exclusão de Tamanho), ensaios de Lowry modificados, espectrofotometria, SEC-MALLS (Cromatografia de Exclusão por Tamanho/Difusão de Luz de Laser em Múltiplos Ângulos) e NMR (Ressonância Magnética Nuclear).
[0034] Dentro dos métodos da presente invenção, as células bacterianas podem ser lisadas usando qualquer agente lítico. Um agente lítico é qualquer agente que ajuda no rompimento da parede celular e liberação da autolisina que causa a lise celular incluindo, por exemplo, detergentes. Conforme usado aqui, o termo detergente se refere a qualquer detergente aniônico ou catiônico capaz de induzir lise das células bacterianas. Exemplos representativos de tais detergentes para uso nos métodos da presente invenção incluem desoxicolato de sódio (DOC), N-lauril sarcosina (NLS), acido quenodesoxicólico de sódio e saponinas.
[0035] Em uma modalidade da presente invenção, o agente lítico empregado para lise das células bacterianas é o DOC. DOC é o sal de sódio do ácido desoxicólico do ácido biliar, que é geralmente derivado de fontes biológicas, tais como, vacas e bois. O DOC ativa a proteína LytA, que é uma autolisina que está envolvida no crescimento da parede celular e divisão no Streptococcus pneumoniae. A proteína LytA possui domínios de ligação de colina em sua porção de término C e mutações do gene lytA são conhecidas por produzirem mutantes LytA que são resistentes à lise com DOC.
[0036] Embora não exista evidência de que o uso de DOC durante a purificação do polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae apresente risco à saúde, o emprego de tais reagentes biologicamente derivados elevaria potencialmente as questões reguladoras. Consequentemente, em uma modalidade da presente invenção, o agente lítico empregado para lise das células bacterianas é um agente lítico não derivado de animal. O agente lítico não derivado de animais para em
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18/47 prego nos métodos da presente invenção inclui agentes de fontes não animais com modos de ação semelhantes aos do DOC (isto é, que afetam a função de LytA e resultam na lise das células de Streptococcus pneumoniae). Tais agentes líticos não derivados de animais incluem, porém não estão limitadas aos análogos de DOC, agentes tensoativos, detergentes e análogos estruturais de colina e podem ser determinados empregando procedimentos conforme descritos na seção Experimentos a seguir neste documento. Em uma modalidade, o agente lítico não derivado de animal é selecionado do grupo consistindo em ácido decanossulfônico, f-octilfenóxi poli(oxietileno)etanóis (por exemplo, Igepal® CA-630, CAS #: 9002-93-1, disponível na Sigma Aldrich, St. Louis, MO), condensados de óxido octilfenol etileno (por exemplo, Triton® X-100, disponível na Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauril sarcosina de sódio (NLS), lauril iminodipropionato, dodecil sulfato de sódio, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato e colato. Em outra modalidade, o agente lítico não derivado de animal é NLS.
[0037] A presente invenção também se refere às modificações específicas de sorotipo relacionadas ao processo descrito acima. Por exemplo, uma vez que o polissacarídeo do sorotipo 19A é instável e seu peso molecular varia durante a purificação, foi descoberto que as modificações em relação ao processo descrito acima foram úteis na estabilização do polissacarídeo 19A. Estas modificações incluíram realização da etapa de ultrafiltração e diafiltração antes da acidificação a cerca de 4Ό em um pH de cerca de 6 em tampão fosfato de sódio, manutenção da solução de retentato acidificada por pelo menos 2 horas a cerca de 4Ό de modo a permitir o assentamento do precipitado e ajuste do pH da solução de polissacarídeo clarificada para 6 antes da etapa de filtração de carbono ativado. Em contraste, foi descoberto que para os sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, fo
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19/47 ram obtidas menos perda de polissacarídeo e mais remoção de proteína quando a etapa de ultrafiltração e diafiltração antes da acidificação foi realizada nos meios isentos de sal, tais como, água, e esta etapa seria realizada a temperatura ambiente em pH neutro.
[0038] Consequentemente, a presente invenção também se refere ao processo para produção de polissacarídeo capsular substancialmente purificado de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae compreendendo sorotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F compreendendo as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo células bacterianas que produzem sorotipo de Streptococcus pneumoniae 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F;
(b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um detergente, desta forma, produzindo um lisado celular compreendendo fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) a temperatura ambiente em pH neutro em meios isentos de sal para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato isento de sal;
(e) diminuição do pH do retentato isento de sal da etapa (d) para menos de 4,5, especificamente cerca de 3,5, para precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas a temperatura ambiente com ou
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20/47 sem agitação de modo a permitir o assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
(g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) através de um filtro de carbono ativado, especificamente um filtro de carbono ativado compreendendo ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira;
(h) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (g), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (i) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (h) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares substancialmente purificados compreendendo sorotipo 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F na forma de uma solução. Em uma modalidade específica, a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato isento de sal da etapa (d). Em outra modalidade, a etapa (g) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f). Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5. Contudo, de modo a aperfeiçoar a estabilidade do polissacarídeo capsular substancialmente purificado durante armazenamento por longo prazo, a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5 e mais especificamente para cerca de 7,4.
[0039] A presente invenção também se refere ao processo para produção de polissacarídeo capsular substancialmente purificado de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae compreendendo sorotipo 19A compreendendo as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo
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21/47 células bacterianas que produzem sorotipo de Streptococcus pneumoniae 19A;
(b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um detergente, desta forma, produzindo um lisado celular compreendendo fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) a cerca de 4Ό a um pH de cerca de 6 em t ampão de fosfato de sódio, 25 mM fosfato de sódio, para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato;
(e) diminuição do pH do retentato da etapa (d) para menos de 4,5, especificamente cerca de 3,5, para precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas a cerca de 4Ό com ou sem agitação, de modo a permitir o assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
(g) ajuste do pH da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) para cerca de 6, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado;
(h) filtração da solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado da etapa (g) através de um filtro de carbono ativado, especificamente um filtro de carbono ativado compreendendo ácido fosfóricocarbono ativado à base de madeira;
(i) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida
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22/47 pela etapa (h), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (j) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (i) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares substancialmente purificados compreendendo sorotipo 19A na forma de uma solução. Em uma modalidade específica, a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato da etapa (d). Em outra modalidade, a etapa (h) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado da etapa (g). Em outra modalidade, a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5. Contudo, de modo a aperfeiçoar a estabilidade do polissacarídeo 19A substancialmente purificado durante armazenamento por longo prazo, a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5 e mais especificamente para cerca de 7,4.
[0040] Os exemplos que se seguem são providos apenas como ilustração e não como uma limitação.
EXPERIMENTOS [0041] Os exemplos que se seguem apresentam os resultados dos sorotipos de polissacarídeos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F purificados em escala de 10L usando o processo aperfeiçoado da presente invenção e os resultados são comparados aos do processo de purificação atual.
Exemplo 1. Processo de Purificação Abreviado para Sorotipos de Polissacarídeos S. pneumoniae 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 14 e 19A [0042] Caldos de fermentação de S. pneumoniae lisados com desoxicolato de sódio (DOC) foram obtidos tanto dentro de dois dias seguindo-se sua colheita quanto armazenados a 4Ό e p rocessados dentro da semana seguinte. Conforme descrito a seguir, o presente proPetição 870180149001, de 07/11/2018, pág. 29/67
23/47 cesso de purificação incluiu as alterações em comparação ao processo de purificação existente:
1) a etapa de acidificação foi movida do começo para após a primeira etapa de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) e o pH foi ajustado para 3,5 ao invés de 5;
2) o tampão de diafiltração foi alterado de 0,025 M fosfato para água deionizada (Dl);
3) adsorção de carbono foi alterada para discos de carbono 2 CUNO R32SP (CUNO Inc., Wayne, NJ) empregando ácido fosfóricocarbono ativado à base de madeira e o tempo de adsorção foi estendido de 4 para 12 voltas (cada volta levou 22 minutos); e
4) pH foi ajustado para 7,4 durante a última etapa de diafiltração de 30K, quando diafiltrado cerca de 5 vezes. O mesmo procedimento de purificação foi aplicado aos sorotipos 1,4, 5, 6A, 6B ou 7F. Para o sorotipo 19A, as etapas foram adicionalmente modificadas e a purificação foi conduzida em um ambiente resfriado, conforme descrito a seguir.
Etapas de Purificação [0043] Todas etapas foram conduzidas a temperatura ambiente, exceto para o tipo 19A, caso em que o processo foi conduzido a 4Ό em ambiente resfriado.
[0044] Clarificação do lisado: A finalidade desta etapa foi a de remover fragmentos de células e clarificar o caldo. Isto foi realizado tanto por centrifugação quanto por filtração. O caldo foi centrifugado a 10.000 g por 30 minutos ou até o caldo estar claro a 20Ό (4Ό para o tipo 19A) ou filtrado com um Pré-filtro Millipore (Millipore Corp., Billerica, MA) com a adição de coadjuvantes de filtro Celpure® (Advanced Minerais, Santa Barbara, CA). O lisado clarificado foi coletado para processamento adicional e as microesferas foram descartadas.
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24/47 [0045] Primeira UF/DF (Ultrafiltração/Diafiltração): Esta etapa forneceu redução de volume e troca de tampão e também removeu impurezas de peso molecular baixo. O lisado clarificado foi concentrado para cerca de 1/8° do volume original. A diafiltração foi realizada usando cerca de 10 volume de água Dl (pH 6, 25 mM fosfato para 19A).
[0046] Acidificação: Mais de 98% das proteínas foram removidas nesta etapa. Enquanto agitando, o ácido fosfórico concentrado foi adicionado cuidadosamente ao retentato. O pH do retentato foi ajustado para um valor alvo de pH 3,5. O retentato acidificado foi agitado por meia hora e envelhecido a temperatura ambiente por toda noite (2 horas a 4Ό para 19A), resultando na precipitação da proteína e ácidos nucléicos.
[0047] Clarificação do Retentato Acidificado: Esta foi a etapa de clarificação para remover os precipitados após acidificação. A pasta de solução acidificada foi centrifugada em um rotor a 10.000 rpm (Força Centrífuga Relativa de 17.000 ou RCF) por uma hora a 20Ό (exceto para 6B, quando a centrifugação foi de 6 horas a 37Ό). O sobrenadante foi coletado e a microesfera foi descartada. Filtração profunda com um Pré-filtro Millipore (Millipore Corp., Billerica, MA) com a adição de coadjuvantes de filtro Celpure® (Advanced Minerais, Santa Barbara, CA) pode também ser usada nesta etapa.
[0048] Absorção de carbono: Na maioria dos casos, apareceu uma cor amarela clara após centrifugação de 100 K de retentato acidificado. A remoção da cor foi obtida por absorção de carbono empregando ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira. Esta etapa também removeu a proteína residual que permaneceu após acidificação. A solução de polissacarídeo clarificada foi recirculada através do filtro de carbono por 5-6 horas ou por toda noite (para 19A, o pH foi ajustado para 6 antes da absorção do carbono).
[0049] UF/DF de 30 K Final: Esta foi outra etapa de concentração
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25/47 e troca de tampão para concentrar a solução em uma concentração de polissacarídeo (PS) final > 2 g/L, que foi diafiltrada em água deionizada. A solução de PS filtrada com carbono foi concentrada. Então o concentrado foi diafiltrado 10 vezes com água Dl. O pH foi ajustado para 7,4 durante a diafiltração.
[0050] Filtração Estéril de 0,2 um Final: A solução de PS final foi filtrada e esterilizada com um filtro de 0,22 pm ou unidade de filtro descartável estéril e armazenada em um refrigerador a 4Ό.
Métodos Analíticos [0051] Quantificação da proteína, PS e concentrações de ácido nucléico foram realizadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica, incluindo análise SDS-PAGE (Eleroforese de Gel Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Sódio), HPLC (Cromatografia de Líquido de Alto Desempenho) e SEC (Cromatografia por Exclusão de Tamanho), ensaios de Lowry modificados, espectrofotometria, SEC-MALLS (Cromatografia de Exclusão por Tamanho/Difusão de Luz de Laser em Múltiplos Ângulos) e NMR (Ressonância Magnética Nuclear). Resultados e Discussão [0052] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 5: A comparação do rendimento de PS final, peso molecular de PS e níveis de impureza principais das três bateladas de purificação empregando o processo abreviado e aquelas empregando o processo corrente para Tipo 5 são mostrados na Tabela 1. Todos os caldos de partida eram bateladas de fermentação de alta densidade de célula DOC, que possuíam uma concentração de polissacarídeo maior (~0,5 g/L) em relação ao caldo de fermentação SOP padrão (~0,3 g/L). Uma membrana de 30K ou 50K foi usada para a primeira etapa UF/DF final. Os níveis de impureza foram calculados usando taxas de impureza/PS. A mesma abordagem foi usada para todos os outros sorotipos descritos no presente documento.
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| Tabela 1. Dados de Teste para Bateladas do Processo de Purificação Abre- | |||||
| Número da Bate- lada | Rendimento do PS (%) | Taxa da Proteína (%) | Taxa de NA (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C-PS (%) |
| L29276-27 (30KUFIDF) | 56,7 | 1,2 | 0,12 | 299 | 20,7 |
| L29276-32 (30KUFIDF) | 54,6 | 1,8 | 0,12 | 282 | 24,7 |
| L29276-52 (50KUFIDF) | 60,2 | 1,4 | 0,03 | 275 | 22,8 |
| Processo atual | 57 | 3,6 | 0,18 | 320 | 15,9 |
| Especificação ou valor esperado | 50-60 | <7,5 | <2,0 | NA | <35 |
| [0053] Conforme mostrado nos d | ados da Tabela 1, as | taxas da |
proteína de todas as três bateladas empregando o processo de purificação abreviado satisfizeram a especificação de <7,5% e foram também comparáveis aqueles do processo atual. As taxas de ácido nucléico (NA) bem como de polissacarídeo-C (C-PS) também estavam bem abaixo das especificações de <2,0% e <35%, respectivamente e foram comparáveis aqueles do processo atual. Os resultados do rendimento de PS final e níveis de impureza das três bateladas mostrados na Tabela 1 demonstram a capacidade de reprodução e robustez do processo abreviado.
[0054] Existem algumas questões com relação a se os polissacarídeos poderíam ser hidrolisados em um pH inferior a 3,5. A alteração do tempo de retenção durante o processo de purificação foi portanto monitorada e o peso molecular do PS purificado final foi medido. Nenhuma alteração significativa no tempo de retenção de PS de sorotipo 5 do cromatograma foi observada. Também não houve diferença significativa nos pesos moleculares para PS purificada pelo processo abreviado e aqueles do processo atual (284 kg/mol) com base nas medições de MALLS. Assim, foi concluído que o peso molecular de PS puPetição 870180149001, de 07/11/2018, pág. 33/67
27/47 rificado não foi adversamente afetado pelo processo de purificação abreviado.
[0055] O rendimento do polissacarídeo no processo, taxa de proteína/polissacarídeo e taxa de ácido nucléico/polissacarídeo em cada uma das etapas de processamento para as três bateladas do processo abreviado são resumidas na Tabela 2.
| Tabela 2. Rendimento do PS no Processo, Taxas de Proteína (SDS-PAGE) e Ácido Nucléico do Tipo 5 | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | ||||
| L29276-27 | L29276-32 | L29276-52 | L29276-27 | L29276-32 | L29276- | |
| Caldo | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 384,40 | 1026,60 | 193,26 |
| Centrifu- | 99,9 | 95,6 | 94,6 | 274,60 | 642,00 | 209,78 |
| 30/50K UF/DF | 71,1 | 82,8 | 93,9 | 152,10 | 561,00 | 204,76 |
| Acidificação | 56,1 | 65,9 | 58,6 | 9,00 | 7,50 | 0,20 |
| Carbono | 57,7 | 55,7 | 58,7 | 0,20 | 1,90 | 0,50 |
| 30K UF/DF | 54,5 | 54,6 | 60,3 | 0,10 | 1,00 | 0,09 |
| Tabela 2. continuação | |||
| ETAPA | ÁCIDO NUCLÉICO/PS (%) | ||
| L29276-27 | L29276-32 | L29276-52 | |
| Caldo | 825,80 | 579,83 | 344,70 |
| Centrifugação | 505,10 | 484,30 | 311,90 |
| 30/50K UFIDF | 107,30 | 139,90 | 137,60 |
| Acidificação | 9,44 | 16,40 | 7,38 |
| Carbono | 0,22 | 0,30 | 0,74 |
| 30K UF/DF | 0,11 | 0,12 | 0,19 |
[0056] Existe sempre uma perda de produto durante cada etapa de qualquer processo de purificação. Para estas três bateladas de processo abreviado, a perda de PS ocorreu em sua maior parte na primeira etapa de UF/DF e na etapa de acidificação. A perda de PS na primeira etapa de UF/DF se deveu à absorção de PS ou complexo de PS-proteína na superfície da membrana. Esta perda foi minimizada por enxágue do lado do retentato da membrana com água Dl após diafil
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28/47 tração e combinação do enxágue com o retentato original. A perda de PS na etapa de acidificação podería ser devida a duas razões: absorção física de PS em relação à precipitação dos sólidos e ligação do polissacarídeo à proteína com coprecipitação durante acidificação. Esta segunda possibilidade foi adicionalmente investigada e os resultados mostraram evidência de ligação de PS/proteína.
[0057] A figura 1 mostra a redução da taxa de proteína/PS em cada etapa de purificação. Embora a etapa de centrifugação tenha removido uma pequena porcentagem de proteínas, a maior parte da proteína foi removida na etapa de acidificação. Apenas uma quantidade de traço da proteína foi detectada após tratamento do pH a 3,5 mesmo para batelada de potência de proteína mais alta.
[0058] Semelhante à taxa da proteína/PS, a taxa de ácido nucléico/PS removeu uma quantidade significativa de ácido nucléico quando comparada à remoção da proteína na mesma etapa de processamento. A etapa 30/50 UF/DF removeu uma quantidade significativa de ácido nucléico quando comparada à remoção da proteína na mesma etapa de processamento. Sem desejar estar ligado a qualquer teoria, isto pode ser devido ao tamanho molecular dos ácidos nucléicos menores que os das proteínas, o que torna as mesmas mais fáceis de serem removidas através da etapa 30/50 K UF/DF. A primeira etapa de centrifugação e acidificação também removeu uma quantidade considerável de ácido nucléico.
[0059] A tabela 2 mostra que a etapa de absorção de carbono ativado também reduz o nível de proteína/PS e ΝΑ/PS. A redução da porcentagem não foi tão significativa como as duas primeiras etapas, porém esta etapa foi importante para remoção da cor da solução e garantiu que o nível de impureza satisfizesse a especificação.
[0060] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 4: Um resumo das três bateladas de purificação abreviadas para o Tipo 4 é mostrado
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29/47 na Tabela 3. Os caldos de alimentação para todas as três bateladas foram lisados com DOC.
| Tabela 3. Resumo das Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 4 | |||||
| Número da Bate- lada | Rendimento do PS (%) | Taxa da Proteína/ PS (%) | Taxa do Ácido Nucléico (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L29276-47 | 56,3 | 0,7 | 0,04 | 289 | 15,4 |
| L29276-55 | 53,0 | 1,3 | 0,03 | 354 | 14,7 |
| L29276-148 | 57,3 | 1,16 | 0,02 | 293 | 10,0 |
| Processo Atual | 71,1 | 0,05 | 0,02 | 285 | |
| Especificação | NA | <3,0 | <2,0 | >350 | <25 |
| [0061] O rendimento de PS tipo 4 também esl | eve entre | 50-60%. A |
taxa da proteína/PS e taxa de ácido nucléico/PS estiveram bem dentro de suas especificações. A taxa C-PS também esteve bem dentro da especificação. O peso molecular de todas as três bateladas esteve próximo de ~300 kg/mol. O PS do sorotipo 4 purificado pelo processo de purificação atual empregando o caldo de fermentação também forneceu um peso molecular inferior a 285 kg/mol. A comparação dos cromatógrafos de HPLC de PS do caldo de fermentação e a solução purificada final mostraram que não houve diferenças no tempo de retenção de PS. Isto sugeriu que a diferença no peso molecular não foi causada pela alteração do processo, porém ao invés disto foi em razão da natureza intrínseca do processo de fermentação.
[0062] O PS Tipo 4 contém um grupo piruvato na molécula na molécula purificada e este piruvato foi importante para conjugação para uso em uma vacina conjugada pneumocócica. Para garantir que a quantidade de piruvato não fosse afetada adversamente por tratamento ácido, a análise de NMR foi conduzida. A figura 2 mostra os espectros de NMR para PS tipo 4 padrão e aqueles da batelada L29276-47. Não foram observadas diferenças significativas entre os dois espec
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30/47 tros. A segunda máxima da direita em ambos os espectros foi piruvato, e a altura máxima do grupo piruvato foi comparável em ambos espectros. As taxas de piruvato para todas três bateladas de processo abreviado foram de 0,8 mol/mol, e satisfizeram a especificação de >0,7 mol/mol.
[0063] O rendimento do PS no processo, taxa de proteína/PS e ΝΑ/PS para as três bateladas do tipo 4 são resumidos na Tabela 4. A perda de PS ocorreu em sua maior parte nas primeiras etapas de centrifugação, acidificação e absorção de carbono ativado, com uma média de 10%, 8% e 20%, respectivamente. O rendimento de PS total foi próximo aquele do Tipo 5, ao redor de 55%.
| Tabela 4. Rendimento do PS no Processo, Taxa da Proteína (SDS-PAGE)/PS e Taxa de ΝΑ/PS do Tipo 4 | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | ||||
| L29276-47 | L29276-55 | L29276-148 | L29276-47 | L29276- 55 | L29276-1 48 | |
| Caldo | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 231,22 | 297,33 | 499,75 |
| Centrifugação | 85,8 | 97,8 | 86,0 | 247,40 | 534,61 | |
| 50/100K UF/DF | 85,1 | 86,4 | 87,7 | 235,90 | 249,24 | 364,98 |
| Acidificação | 84,2 | 72,0 | 78,6 | 0,42 | 1,81 | 0,41 |
| Carbono | 65,3 | 48,9 | 58,6 | 0,09 | 0,39 | 0,34 |
| 30K UF/DF | 57,9 | 50,6 | 57,4 | 0,08 | 0,09 | 1,31 |
| Tabela 4. Continuação | |||
| ETAPA | NA/PS (%) | ||
| L29276-47 | L29276-55 | L29276-148 | |
| Caldo | 312,84 | 282,50 | 302,71 |
| Centrifugação | 301,40 | 261,82 | 243,28 |
| 50/100K UF/DF | 80,99 | 67,67 | 92,00 |
| Acidificação | 4,24 | 5,01 | 1,17 |
| Carbono | 0,08 | 0,92 | 0,38 |
| 30K UF/DF | 0,05 | 0,06 | 0,07 |
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31/47 [0064] A figura 3 mostra rendimento médio de PS, alteração de taxa de proteína/PS e ΝΑ/PS em cada uma das etapas de purificação para as três bateladas na Tabela 4. A remoção da proteína ocorreu em sua maior parte na etapa de acidificação conforme esperado. As primeiras etapas de centrifugação e UF/DF também removeram coletivamente uma determinada quantidade de proteína, porém a redução da proteína foi inferior à etapa de acidificação.
[0065] Semelhante ao tipo 5, a maior parte da redução da taxa de ácido nucléico/PS é realizada em 50/100 K UF/DF, primeiras etapas de centrifugação e acidificação e a redução de NA na primeira etapa de UF/DF foi mais significativa que para as proteínas. Novamente, conforme mostrado na figura 3, a etapa de carbono ativado removeu uma determinada quantidade de proteína e NA e colocou os níveis de impureza abaixo das especificações. A cor da solução também foi removida.
[0066] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 19A: O polissacarídeo Tipo 19A é instável e o peso molecular altera durante a purificação. O processo de purificação abreviado foi ligeiramente modificado a fim de estabilizar o polissacarídeo 19A. Estas modificações são resumidas como se segue: 1) as etapas de purificação foram conduzidas em sua maior parte em 4Ό em ambiente resfriado; 2) a primeira 100 K diafiltração foi resfriada usando tampão 25 mM fosfato (4Ό) com um pH de 6 ao invés de empregar água à temperatura ambiente; 3) o tempo de manutenção da acidificação foi reduzido de toda a noite para 2 horas; e 4) após clarificar o 100 K retentato acidificado, o pH foi ajustado para 6 e absorção de carbono ativado foi conduzida em pH 6 ao invés de 3,5.
[0067] Os resultados das duas bateladas de 19A purificadas pelo processo de purificação abreviado são mostrados na Tabela 5.
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| Tabela 5. Resumo das Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 19a | |||||
| Batelada | Rendimento do PS (%) | Proteína/PS (%) | NA/PS (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L29276-116 | 61,58 | 0,14 | 0,01 | 525 | 3,8 |
| L29276-143 | 76,15 | 1,43 | 0,01 | 488 | 2,8 |
| Especificação | NA | <2 | <2 | NA | <10 |
[0068] Os rendimentos do PS das duas bateladas de purificação abreviadas foram 62 e 76% respectivamente. A taxa de proteína/PS final, taxa de ácido nucléico e taxa C-PS todas satisfizeram suas respectivas especificações. Os pesos moleculares finais dos polissacarídeos das duas bateladas foram de 525 kg/mol e 488 kg/mol respectivamente e estavam próximos daqueles do PS e de 19A nos experimentos clínicos de fase III (486 kg/mol).
[0069] As taxas de proteína/PS para as duas bateladas ambas satisfizeram a especificação de <2%. Ambas a taxa de Na e C-PS das duas bateladas estavam bem dentro de suas especificações.
[0070] O rendimento do PS, redução de proteína e NA em cada uma das etapas de purificação são mostrados na Tabela 6 e figura 4. Os resultados mostraram perda de PS em cada uma das etapas de purificação exceto a primeira etapa de purificação. Como os sorotipos 5 e 4, a remoção da proteína e de NA ocorreu nas primeiras três etapas e dificilmente qualquer proteína e NA foi deixado após acidificação. Ambora a etapa de absorção de carbono ativado não removesse uma quantidade significativa de proteína e NA, possivelmente devido à concentração de proteína e NA baixa após a acidificação, a etapa ainda foi necessária para remoção da cor.
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| Tabela 6. Rendimento do PS no Processo, Taxa da Proteína/PS e Taxa de NA/PS | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | NA/PS(%) | |||
| L29276- 116 | L29276- 143 | L29276- 116 | L29276-143 | L29276- 116 | L29276- 143 | |
| Caldo | 100,0 | 100,0 | 224,41 | 144,08 | 277,55 | 134,73 |
| Centrato | 100,8 | 101,2 | 121,60 | 119,11 | 189,64 | 100,64 |
| 50/100K UF/DF | 87,7 | 90,3 | 103,83 | 105,16 | 56,87 | 26,36 |
| Acidificação | 90,4 | 72,1 | 0,28 | 0,84 | 0,03 | 0,03 |
| Carbono | 77,8 | 71,7 | 0,96 | 0,03 | 0,04 | 0,02 |
| 30K UF/DF | 61,0 | 76,1 | 0,54 | 0,00 | 0,02 | 0,01 |
[0071] Bateladas de Purificação Abreviadas Tipo 7F: O tipo 7F é um polissacarídeo não iônico, que requer tipicamente alteração nas etapas durante purificação empregando o processo existente em comparação aos sorotipos descritos acima. Contudo, o processo de purificação abreviado da presente invenção foi sucessivamente aplicado ao sorotipo 7F sem a necessidade de desvio do processo. Duas bateladas do caldo 7F foram purificadas usando o processo abreviado. Uma era um caldo de fermentação (L29276-107) e uma era um caldo de densidade celular alta (L29276-157). Os resultados das duas bateladas são resumidos na Tabela 7.
| Tabela 7. Resumo das Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 7F | |||||
| Número da Batelada | Rendimento do PS (%) | Proteína/PS (%) | NA/PS (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L29276-107 | 65,27 | 0,49 | 0,02 | 968 | 3,3 |
| L29276-157 | 79,06 | 0,26 | 0,04 | 881 | 2,9 |
| Especificação | NA | <5 | <2 | NA | <17 |
[0072] O rendimento do PS do tipo 7F foi realmente maior que os outros sorotipos, possivelmente devido a menos ligação do polímero
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34/47 não iônico em relação às moléculas de proteína carregadas. As taxas de proteína final, NA e C-PS estavam todas bem dentro de suas especificações. O peso molecular do tipo 7F foi comparável ao das bateladas padrão e mesmo através do peso molecular 7F foi bem alto, a solução do PS não era muito viscosa devido ao volume excluído menor do polímero não iônico.
[0073] O rendimento do PS Tipo 7F, taxa da proteína e de NA em cada uma das etapas de purificação são mostrados na Tabela 8 e a média das duas bateladas foi colocada em gráfico na figura 5.
| Tabela 8. Rendimento do PS no Processo, Taxa da Proteína/PS e Taxa de NA/PS do Tipo 7F | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | ÁCIDO NUCLÉICO/PS(%) | |||
| L29276- 107 | L29276- 157 | L29276- 107 | L29276- 157 | L29276- 107 | L29276-157 | |
| Caldo | 100,00 | 100,00 | 274,10 | 189,24 | 258,55 | 134,64 |
| Centrifugação | 100,31 | 95,57 | 110,60 | 107,20 | 163,38 | 83,14 |
| 100K UF/DF | 84,19 | 95,39 | 139,38 | 27,53 | 54,02 | 32,74 |
| Acidificação | 70,89 | 84,08 | 0,44 | 0,10 | 1,80 | 0,94 |
| Carbono | 63,96 | 79,40 | 0,70 | 0,09 | 2,29 | 0,23 |
| 30K UF/DF | 57,24 | 77,70 | 0,30 | 0,05 | 0,06 | 0,00 |
[0074] Houve algum tipo de perda de PS Tipo 7F em cada etapa de purificação. No total, a perda de PS foi inferior aquela dos sorotipos 5 e 4. A redução das taxas de proteína e NA foi em sua maior parte devida às primeiras etapas de centrifugação, 100K UF/DF e de acidificação. Semelhante a outros sorotipos, 100K UF/DF foi mais eficiente na remoção de NA que as proteínas. Embora a etapa de absorção de carbono ativado não tenha removido uma quantidade significativa da proteína e NA em razão dos baixos níveis de impureza após a acidificação, a etapa foi ainda necessária para remoção da cor.
[0075] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 6B: Duas bateladas de 6B foram purificadas usando o processo de purificação
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35/47 abreviado. Foi verificado que a clarificação de 100 K retentato acidificado foi realizada em um tempo superior ao de outros sorotipos (6 horas ao invés de 1 hora). Exceto por esta diferença, o processo de purificação foi semelhante aquele dos sorotipos. Os resultados das duas bateladas são resumidos na Tabela 9.
| Tabela 9. Resumo das Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 6B | |||||
| Batelada | Rendimento do PS (%) | Proteína/PS (%) | NA/PS (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L29276- | 69,50 | 1,73 | 0,28 | 857 | 3,6 |
| L29276- | 74,50 | 1,41 | 0,17 | 1.142 | 3,9 |
| Especifi- | NA | <4 | <1 | >800 | <10 |
[0076] Todos os níveis de impureza (proteína, NA e C-PS) estavam dentro de suas especificações. O rendimento de PS foi relativamente alto e assim as taxas de proteína e NA foram comparadas aos outros sorotipos.
[0077] O rendimento do PS no processo, taxas de proteína e NA em cada uma das etapas de purificação são mostrados na Tabela 10 e figura 6.
| Tabela 10. Rendimento médio do PS no Processo, Taxa da Proteína e NA do Tipo 6B | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | ÁCIDO NUCLÉICO/PS(%) | |||
| L29276- 161 | L29276- 164 | L29276- 161 | L29276- 164 | L29276- 161 | L29276-164 | |
| Caldo | 100,00 | 100,00 | 238,20 | 288,80 | 215,12 | 237,67 |
| Centrifugação | 101,43 | 116,54 | 95,88 | 123,59 | 104,08 | 104,47 |
| 100K UF/DF | 104,11 | 105,47 | 68,15 | 88,14 | 22,13 | 47,81 |
| Acidificação | 91,98 | 101,45 | 0,71 | 0,43 | 1,06 | 2,24 |
| Carbono | 80,71 | 91,42 | 0,39 | 0,23 | 0,45 | 0,74 |
| 30K UF/DF | 72,67 | 77,28 | 1,23 | 0,46 | 0,37 | 0,25 |
[0078] Semelhante à 19A, a perda de PS ocorreu em cada uma das etapas de purificação exceto a primeira etapa de purificação, onde
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36/47 houve um ligeiro aumento de PS. A remoção da proteína e de NA foi obtida em sua maior parte pela primeira centrifugação e as primeiras etapas de 100K UF/DF e acidificação. Contudo, houve também alguma redução da taxa de proteína e NA e na etapa de absorção de carbono ativado.
[0079] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 6A: Duas bateladas do tipo 6A foram purificadas usando o processo de purificação abreviado. O rendimento do PS, níveis de impureza e peso molecular das soluções finais são resumidos na Tabela 11.
| Tabela 11. Resumo das Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 6A | ||||||
| Batelada | Caldo | Rendimento do PS (%) | Proteína/ PS (%) | NA/PS (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L29276-138 | Padrão | 75,75 | 1,23 | 0,04 | 640 | 7,3 |
| L29276-183 | Alta densidade celular | 72,56 | 0,20 | 0,01 | 670 | 5,1 |
| Especificação | NA | <2,00 | <2,00 | NA | <15 |
[0080] Os rendimentos finais do PS das duas bateladas 6A foram ambos > 70%, os quais foram os maiores entre os sorotipos processados durante o processo abreviado. As taxas de proteína, NA e C-PS estavam todas dentro das especificações.
[0081] A tabela 12 e a figura 7 mostram o rendimento do PS no processo, alteração de taxa de proteína e NA em cada uma das etapas de purificação. Não houve qualquer perda de PS na primeira centrifugação e etapas de 100K UF/DF. Houve cerca de 10-15% de perda de PS nas etapas de acidificação e absorção de carbono ativado, estando perto daquela de outros sorotipos. A maior parte da redução da taxa de proteína e NA foi em razão da primeira centrifugação, 100 K UF/DF e acidificação. Após a acidificação, ambas as taxas de proteína e NA já estavam abaixo de suas especificações. Para a proteína, a acidificação foi a etapa mais eficiente, enquanto para NA, 100 K
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UF/DF reduziu a maior parte da taxa de ΝΑ/PS. Embora a etapa de absorção de carbono ativado não tivesse removido uma quantidade significativa da proteína e NA devido aos níveis muito baixos de impureza após a acidificação, a etapa ainda precisou de remoção de cor.
| Tabela 12. Rendimento do PS no Processo, Taxa da Proteína e NA do Tipo 6A | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | ÁCIDO NUCLÉICO/PS(%) | |||
| L29276- 138 | L29276-183 | L29276-138 | L29276- 183 | L29276- 138 | L29276-183 | |
| Caldo | 100,00 | 100,00 | 214,35 | 138,71 | 211,45 | 163,88 |
| Centrifu- gação | 99,35 | 97,80 | 183,43 | 149,71 | 177,03 | 150,41 |
| 100K UF/DF | 93,19 | 100,40 | 114,72 | 103,00 | 43,38 | 40,43 |
| Acidificação | 89,87 | 87,90 | 0,16 | 0,87 | 1,09 | 0,97 |
| Carbono | 76,02 | 75,70 | 0,62 | 0,85 | 0,09 | 0,07 |
| 30K UF/DF | 75,57 | 72,90 | 0,00 | 0,07 | 0,04 | 0,02 |
[0082] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 1: Duas bateladas do tipo 1 purificadas pelo processo abreviado são resumidas na Tabela 13. A batelada L29276-170 foi purificada do caldo de fermentação de densidade celular alta e L29276-173 foi do caldo de fermentação padrão.
| Tabela 13. Resumo da Batelada de Purificação Abreviada do Tipo 1 | ||||||
| Batelada | Caldo | Rendimento do PS (%) | Proteína/ PS (%) | NA/PS (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L29276-170 | Alta den- sidade celular | 50,96 | 0,44 | 0,08 | 501 | 5,3 |
| L29276-173 | SOP | 53,84 | 1,23 | 0,01 | 458 | 11,9 |
| Especificação | NA | <2 | <2 | NA | <15 |
[0083] Os rendimentos do PS de ambas as bateladas foram de cerca de 50% e os níveis de impurezas para proteína, NA e C-PS estavam todos dentro de suas especificações.
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38/47 [0084] No rendimento do PS no processo, as taxas de proteína e NA após cada uma das etapas de purificação são mostradas na Tabela 14 e figura 8. As tendências foram semelhantes para outros sorotipos purificados. A perda de PS ocorreu em sua maior parte nas etapas de acidificação e absorção de carbono ativado e a maior parte da proteína e remoção de NA ocorreu nas primeiras três etapas. Mais NA foi removido na etapa de 100 K UF/DF que as proteínas. Embora a etapa de absorção de carbono ativado não tenha removido uma quantidade significativa da proteína e NA devido aos níveis de impureza muitos baixos após acidificação, a etapa ainda foi necessária para remoção da cor.
| Tabela 14. Rendimento Médio do PS no Processo, Taxa de Proteína e NA do Tipo 1 | ||||||
| ETAPA | RENDIMENTO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | NA/PS (%) | |||
| L29276- 170 | L29276- 173 | L29276- 170 | L29276- 173 | L29276- 170 | L29276- 173 | |
| Caldo | 100,00 | 100,00 | 453,30 | 595,20 | 594,41 | 1178,98 |
| Centrifugação | 93,99 | 105,63 | 301,86 | 396,97 | 340,55 | 1018,47 |
| 50/100K UF/DF | 88,33 | 105,62 | 232,34 | 235,08 | 17,49 | 182,56 |
| Acidificação | 66,54 | 87,67 | 0,54 | 4,87 | 1,09 | 5,85 |
| Carbono | 55,85 | 59,69 | 1,91 | 1,86 | 0,49 | 0,01 |
| 30K UF/DF | 51,24 | 55,59 | 0,36 | 0,92 | 1,65 | 0,01 |
[0085] Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 14: Duas bateladas do sorotipo 14 foram purificadas usando o processo de purificação abreviado sem desvios de processo. O rendimento do PS final e níveis de impureza são resumidos na Tabela 15.
| Tabela 15. Resumo das Bateladas de Purificação Abreviadas do Tipo 14 | ||||||
| Batelada | Caldo | Rendimento do PS (%) | Proteína/PS (%) | NA/PS (%) | Peso Molecular do PS (Kg/mol) | Taxa de C- PS (%) |
| L32874-155 | Alta densidade celular | 51,3 | 2,06 | 0,03 | 520 | 4,2 |
| L32874-163 | SOP | 56,7 | 1,39 | 0,03 | 662 | 2,9 |
| Especificação | NA | <3 | <2 | >400 | <15 |
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39/47 [0086] Semelhante ao sorotipo 7F, o sorotipo 14 é um polissacarídeo não iônico e seu processo de purificação atual é ligeiramente diferente dos outros sorotipos. Contudo, o processo de purificação abreviado da presente invenção foi sucessivamente aplicado ao sorotipo 14, sem a necessidade de tais etapas adicionais. Os rendimentos do PS das duas bateladas de processo de purificação abreviadas foram de 50-60% e as taxas de proteína e NA estavam dentro de suas especificações. Os pesos moleculares do PS purificado também satisfizeram a especificação.
[0087] O rendimento do PS no processo, taxas de proteína e NA são resumidos na Tabela 16 e figura 9. Tendências semelhantes de perda do PS, remoção de proteína e NA foram observadas como para outros sorotipos testados descritos acima.
Tabela 16. Rendimento Médio do PS no Processo, Taxa de Proteína e NA do Tipo 14
| ETAPA | RENDIMENTO DO PS (%) | PROTEÍNA/PS (%) | ||
| L32874-155 | L232874-163 | L32874-155 | L232874-163 | |
| Caldo | 100,00 | 100,00 | 109,73 | 286,56 |
| Centrifugação | 91,40 | 90,80 | 10,88 | 201,48 |
| 50/100K UF/DF | 82,40 | 68,70 | 45,52 | 165,69 |
| Acidificação | 65,40 | 93,90 | 0,65 | 0,47 |
| 74,60 | ||||
| Carbono | 59,40 | 0,60 | 0,10 | |
| 30K UF/DF | 53,10 | 57,60 | 0,57 | 0,41 |
| Tabela 16, continuação | ||
| ETAPA | NA/PS (%) | |
| L32874-155 | L232874-163 | |
| Caldo | 192,80 | 272,50 |
| Centrifugação | 135,50 | 201,82 |
| 50/100K UF/DF | 47,10 | 64,54 |
| Acidificação | 0,89 | 1,08 |
| Carbono | 0,17 | 0,21 |
| 30K UF/DF | 0,13 | 0,25 |
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Exemplo 2. Comparação de Sorotipos Diferentes (Sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A e 19F) [0088] De modo a comparar a purificação dos sorotipos diferentes usando o processo de purificação abreviado da presente invenção, a remoção do PS para todos os sorotipos descritos no Exemplo 1 mais sorotipos 9V, 18C e 19F foi colocada em gráfico na figura 10. A maioria dos sorotipos seguiu uma tendência semelhante com perda do PS em cada uma das etapas de purificação. Houve um aumento do rendimento do PS para tipo 6B na primeira etapa de centrifugação e tipo 14 na etapa de acidificação. A porcentagem de perda do PS variou de sorotipo para sorotipo. O tipo 5 pareceu perder mais PS na etapa de acidificação e o tipo 4 na etapa de absorção de carbono ativada.
[0089] Conforme mostrado na figura 12, taxas de ΝΑ/PS também variaram de sorotipo para sorotipo. Os tipos 1 e 5 tiveram a maior taxa de ΝΑ/PS, seguido pelos tipos 18C e 4. A primeira etapa de centrifugação e UF/DF removeu uma quantidade significativa de NA para estes sorotipos e tipo 1 pareceu ser o mais eficiente. Restou muito pouco NA após a etapa de acidificação.
Exemplo 3. Análise de Eficiência das Etapas de Acidificação e Absorção de Carbono Ativado (Sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19Ae 19F) [0090] Na purificação dos polissacarídeos de PnC, a impureza mais significativa e difícil de ser removida é a proteína. De modo a entender melhor a eficiência da remoção da proteína do processo abreviado, duas ou mais etapas de purificação principais, a acidificação e a absorção do carbono ativado foram analisadas para a remoção da proteína. Para a etapa de acidificação, a diferença na concentração da proteína (SDS-PAGE) antes e após a acidificação foi colocada em gráfico contra a concentração de proteína inicial antes da acidificação para os sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 18C, 19A e 19F usan
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41/47 do o processo de purificação abreviado da invenção 9figura 13).
[0091] Devido às alterações relativamente pequenas no volume da solução antes e após a etapa de acidificação, a diferença da concentração da proteína dividida pela concentração da proteína inicial refletiu a taxa de remoção da proteína pela etapa de acidificação. A figura 13 mostra a inclinação do ajuste linear da diferença da concentração da proteína com relação à concentração da proteína inicial (por ensaio de SDS-PAGE). Uma relação linear muito boa foi observada entre a alteração da concentração da proteína e a concentração inicial, com R2 próximo de 1. A inclinação foi de 0,9876 o que corresponde a uma remoção de 98,76% da proteína (presumindo-se alteração mínima do volume da solução). Portanto, para todos os sorotipos estudados, a etapa de acidificação foi muito eficiente e em média foram removidos mais de 98% da proteína.
[0092] Semelhante à etapa de acidificação, a eficiência da etapa de absorção de carbono ativado foi também avaliada por colocação em gráfico da proteína removida (absorvida no carbono) com relação à carga de proteína inicial (figura 14). Uma boa relação linear entre a proteína removida e a carga de proteína inicial foi observada, embora o R2 (0,9723) não fosse tão alto quanto para a etapa de acidificação. Uma vez que a inclinação deste ajuste linear corresponde à taxa de remoção da proteína, a etapa de absorção de carbono ativado produziu uma remoção de 93,87% da proteína.
[0093] Com base na análise das etapas de acidificação e absorção do carbono ativado, após as duas etapas apenas 0,1% da proteína foi deixado na solução.
Conclusões para os Exemplos 1-3 [0094] Um processo de purificação abreviado foi desenvolvido para substituir o processo de purificação atual para polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae. O processo de purificação abreviado foi
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42/47 diretamente aplicado aos sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C e 19F e ao 19A com leve desvio. O processo foi conduzido em escala de 10L usando caldos de fermentação lisados com DOC. Os níveis de impureza, incluindo taxas de proteína/PS, ΝΑ/PS e C-PS;/PS todos satisfizeram suas respectivas especificações. Os rendimentos de PS estiveram acima de 50% e comparáveis aos do processo de purificação atual. O rendimento de PS no processo, taxas de proteína/PS e ΝΑ/PS foram colocados em gráfico para comparar o comportamento de sorotipos diferentes. Foi verificado que os sorotipos 1, 5, 9V, 19F e 18C são os mais difíceis de serem purificados com base nas taxas de proteína/PS antes e após a etapa de 100K UF/DF.
[0095] A análise da etapa mostrou que as etapas de acidificação e absorção de carbono ativado removeram mais de 98% e 90% da proteína, respectivamente (conforme medido por SDS-PAGE).
Exemplo 4. Substituição do Agente Lítico Não Derivado de Animais por Desoxicolato de Sódio na Produção de Polissacarídeos [0096] O presente exemplo investigou se os agentes líticos não derivados de animal seriam usados como substitutos para desoxicolato de sódio (DOC) dentro do processo descrito acima para a produção de polissacarídeos capsulares substancialmente purificados de Streptococcus pneumoniae. Conforme descrito acima, DOC ativa a proteína LytA, que é uma autolisina que está envolvida no crescimento da parede celular e divisão no Streptococcus pneumoniae. A proteína LytA possui domínios de ligação de colina em sua porção terminal C e mutações gênicas lytA são conhecidos por produzir mutantes LytA que são resistentes á lise com DOC.
[0097] Um ensaio de placa de microtitulação rápido foi desenvolvido para identificar compostos que causam lise celular por um mecanismo semelhante ao do DOC. Várias alternativas ao DOC não derivadas de animal foram identificadas, as quais foram igualmente eficazes
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43/47 como o DOC no extermínio das células de Streptococcus pneumoniae e liberação do polissacarídeo. Seguindo-se o procedimento usando condições padrão, o tamanho e pureza dos polissacarídeos produzidos com os compostos não derivados de animal foram idênticos aos produzidos com DOC.
Métodos [0098] Lise celular: Os compostos a serem testados foram adicionados ao caldo de fermentação a uma concentração final de 0,1 a 0,01% (v/v) e a solução foi deixada incubar a 37Ό por uma hora. A solução foi então armazenada a 2-8Ό por toda noite. Na manhã seguinte a solução foi centrifugada para remover os fragmentos de célula. O caldo isento de célula foi analisado por SEC-HPLC para determinar a concentração de polissacarídeo liberado. A lise seria realizada em qualquer temperatura entre 2-37Ό, preferivelmente em uma faixa de pH de 6,0-7,5. A concentração do detergente estava tipicamente entre 0,05-0,2% dependendo do detergente específico.
[0099] Ensaio de microtitulação: Um ensaio de placa de microtitulação rápido foi recomendado para exame de lise dependente de lytA de pneumococos por diferentes detergentes ou agentes tensoativos. Dois pares de cepas isogênicas de S. pneumoniae foram usados no ensaio; um elemento de cada par era do tipo selvagem para o gene lytA enquanto a outra cepa transportou uma deleção no gene lytA. Assim, se a lise fosse dependente de uma função de lytA ativo, aquele detergente não lisaria as cepas mutantes. As quatro cepas, R6X, R6X, AlytA, D39 e D39 AlytA, foram cultivadas no meio HySoy para aproximadamente meia log-fase (ODeoo ~0,3-0,8; ODeoo - Densidade Óptica em 600 nm). As células foram então centrifugadas e as microesferas foram ressuspensas em meio HySoy. A cada poço da placa de microtitulação foram adicionados 100 μΙ_ de suspensão de célula, juntamente com 10 pL de soluções mestras de detergente ou água como um con
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44/47 trole. Após cerca de 15 minutos a 36Ό, a ODeoo das amostras foi medida com um espectrofotômetro Sepectramax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os resultados que se seguem foram observados para células preparadas recentemente ou células congeladas e descongeladas: células do tipo selvagem expostas ao DOC, dodecil sulfato de sódio, Triton® X-100 e N-lauril sarcosina todas tinham valores OD comparáveis aos da peça em bruto do meio, o que indicou que a lise havia ocorrido. Por outro lado, as células Δ/ytA não lisaram na presença destes detergentes, o que indica que a função de LytA é necessária para estes detergentes de modo a lisar as células.
[00100] Isolamento do PS Empregado para Estudos Analíticos Comparativos: Culturas foram desenvolvidas em meio Hy-Soy em bioreatores de 10 litros. O pH foi controlado ao redor de 7,0 usando tanto NaOh quanto Na2CO2. Ao final do desenvolvimento (conforme indicado pelo não aumento adicional na densidade óptica), as culturas foram tratadas tanto com 0,12% DOC quando 0,1% NLS. As culturas foram incubadas por 12-16 horas. A eficácia do extermínio celular foi confirmada por colocação em placa de uma amostra de caldo tratado nas placas de ágar TSA-Sangue. O polissacarídeo foi purificado do lisado clarificado usando procedimentos padrão (conforme descrito acima). Polissacarídeo purificado foi examinado usando uma variedade de técnicas analíticas padrão apropriadas para determinar a pureza e identidade do material.
[00101] O teor de PS do lisado foi determinado usando SEC-HPLC acoplado a um detector de índice refratário (RI).
Classificação para Agentes Líticos Não Derivados de Animal Usando Sorotipos 1 e 6B [00102] Sorotipos S. pneumoniae 1 e 6B foram desenvolvidos separadamente em meio com base em Hy-Soy. As culturas foram colhidas separadamente e dispensadas separadamente nos tubos. Os compos
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45/47 tos não derivados de animal a serem classificados quanto à atividade lítica comparáveis ao DOC foram preparados como soluções mestras (nos solventes apropriados) e adicionados às culturas. Após incubação por toda noite, os tubos foram centrifugados e o teor de PS dos lisados para cada sorotipo foi determinado por SEC-HPLC e comparado ao DOC.
Classificação para Agentes Líticos Não Derivados de Animal Usando Mutantes LytA [00103] Pares isogênicos de cepas contendo mutação /yfA foram desenvolvidos em um meio com base em Hy-Soy. As células foram colhidas e dispensadas nos poços em uma placa de microtitulação. O composto de teste foi adicionado e a cultura foi incubada. Após 15 minutos a 36Ό, a densidade óptica (ODeoo) de cada poço foi determinada usando um leitor de placa Sepectramax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) (vide tabelas 17 e 18, que resumem os resultados dos dois testes separados para compostos exemplares).
| Tabela 17. Alteração na Densidade Óptica para Cepas Mutantes lytA (Teste 1) | ||||
| Alteração na Οϋθοο | ||||
| Composto | R6X | R6X Δ/yfA | D39 | D39 Δ/yfA |
| Peça em bruto | ||||
| Sem adição | ||||
| Ácido desoxicólico, 0,1% | 100% | 34% | 99% | 47% |
| Ácido litocólico 0,1% | 20% | 16% | 8% | -2% |
| Ácido tauroglicocólico, 0,1%, | 51% | -16% | 47% | -20% |
| Ácido heptanóico, 0,1% | 25% | -57% | 7% | -30% |
| SDS, 0.1% | 99% | 28% | 95% | 36% |
| Ácido octanossulfônico, 0,1% | 43% | 6% | 34% | 16% |
| Triton® X-100, 0,1% | 91% | 22% | 97% | 30% |
| Tween 80, 0,1% | 36% | 14% | 20% | 19% |
| Tween 20, 0,1% | 44% | 22% | 28% | 19% |
| N-lauril sarcosina, 0,1% | 100% | -34% | 89% | -44% |
| Plutonic L31, 0,1% | 39% | 0% | 17% | -38% |
| Plutonic L-61, 0,1% | 23% | -3% | -19% | 14% |
| Plutonic L81, 0,1% | 21% | -3% | -14% | 10% |
| Antarox 17-R-2, 0,1% | 37% | 24% | 7% | 16% |
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| Tabela 18. Alteração na Densidade Óptica para Cepas Mutantes lytA (Teste 2) | ||||
| Alteração na Οϋθοο | ||||
| Composto | R6X | R6X AlytA | D39 | D39 Δ/y/A |
| Peça em bruto | ||||
| Sem adição | ||||
| Água | -8% | -8% | 3% | -8% |
| Ácido desoxicólico, 0,1 % | 103% | 20% | 101 % | 41 % |
| SDS, 0,1% | 102% | -13% | 100% | 16% |
| N-lauril sarcosina, 0,1 % | 102% | -40% | 101 % | 14% |
| Triton® X-100, 0,1% | 101 % | -19% | 100% | 4% |
| Tween 20, 0,1% | 6% | -17% | -5% | -3% |
| Ácido octanossulfônico, 0,1% | 13% | 3% | 18% | -3% |
[00104] Com base nos estudos de classificação descritos acima, as alternativas de agente lítico não derivado de animal que se seguem para DOC foram identificadas: ácido decanossulfônico, Igepal® CA630 (t-octilfenoxi) poli(oxietileno)etanol; CAS número 9002-93-1; disponível na Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauril sarcosina de sódio (NLS), lauril iminodipropionato, dodecil sulfato de sódio, Triton(R) X100, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato e colato.
Comparação de PS lisado com DOC com o PS lisado com NLS [00105] Sorotipos do polissacarídeo de S. pneumoniae 1, 4, 5, 6A, 6B e 7F foram purificados na escala de 10L conforme descrito acima nos Exemplos 1 e 2 usando o processo aperfeiçoado na presente invenção. Contudo, em um grupo NLS (0,1%) foi usado como o agente lítico enquanto em outro grupo DOC (0,12%) foi usado como o agente lítico.
[00106] O rendimento de PS, taxas de proteína/PS, taxas de NA/PS e peso molecular do PS foram medidos conforme descrito acima e os resultados resumidos na Tabela 19. Estes resultados mostraram que o
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47/47 uso de NLS como um agente lítico dentro dos métodos de purificação da invenção produziu rendimentos de PS relativamente altos com níveis de proteína e ácido nucléico relativamente baixos. De fato, para a maioria dos sorotipos testados, o uso de NLS como um agente lítico produziu rendimentos de PS maiores em comparação ao uso do DOC.
Tabela 19. Caracterização de PS para Sorotipos Diferentes Usando DOC vs. NLS
| Sorotipo | Agente Líti- co | Rendimento PS (%) | Proteína/PS (%) | Ácido Nucléi- co/PS (%) | Peso molecular SEC MALLS (g/mol, 106) |
| 1 | 0,12% DOC | 20% | 4,2% | 0,04% | 0,615 |
| 1 | 0,1% NLS | 41% | 2% | 0,04% | 0,65 |
| 4 | 0,12% DOC | 72% | 0,05% | 0,02% | 0,38 |
| 4 | 0,1% NLS | 57% | 0,67% | 0,25% | 0,34 |
| 5 | 0,12% DOC | 57% | 3,6% | 0,18% | 0,32 |
| 5 | 0,1% NLS | 63% | 1,8% | 0,01% | 0,35 |
| 6A | 0,12% DOC | 56% | 0,7% | 0,00% | 0,55 |
| 6A | 0,1% NLS | 66% | 1,1% | 0,05% | 0,43 |
| 6B | 0,12% DOC | 38% | 0,6% | 0,05% | 0,969 |
| 6B | 0,1% NLS | 55% | 0,1% | 0,01% | 1,0 |
| 7F | 0,12% DOC | 73% | 0,7% | 0,06% | 0,814 |
| 7F | 0,1% NLS | 76% | 0,5% | 0,02% | 0,912 |
[00107] Todas as publicações e Pedidos de Patente mencionados no relatório descritivo indicam o nível dos versados na técnica a qual a invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados ao presente documento como referência à medida que cada publicação ou Pedido de Patente individual tenha sido específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.
[00108] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplos para fins de clareza do entendimento, fica claro que determinadas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações ora apensas.
Claims (41)
1/9
REIVINDICAÇÕES
1. Processo para produção de polissacarídeos capsulares purificados de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação que compreende células bacterianas que produzem um sorotipo selecionado de Streptococcus pneumoniae-, (b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular que compreende fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato;
(e) diminuição do pH do retentato da etapa (d) para menos de 4,5 de modo a precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
(g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) através de um filtro de carbono ativado;
(h) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (g), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo
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2/9 concentrada e purificada; e (i) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (h) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares purificados na forma de uma solução.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sorotipo selecionado de Streptococcus pneumoniae é selecionado do grupo consistindo em 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C,19A,19F e 23F.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pH da etapa (e) é diminuído para cerca de
3,5.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para cerca de 7,4.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato da etapa (d).
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa (g) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f).
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o filtro de carbono ativado
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3/9 da etapa (g) compreende ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) compreende manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o agente lítico da etapa (b) é desoxicolato de sódio.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o agente lítico da etapa (b) é um agente lítico não derivado de animal.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente lítico não derivado de animal é selecionado do grupo consistindo em: ácido decanossulfônico, f-octilfenoxi poli(oxietileno)etanóis, condensados de óxido de octilfenol etileno, Nlauril sarcosina de sódio (NLS), lauril iminodipropionato, dodecil sulfato de sódio, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato e colato.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente lítico não derivado de animal é N-lauril sarcosina de sódio.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação que compreende células bacterianas que produzem sorotipo de Streptococcus pneumoniae 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F;
(b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular que compreende fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacaríPetição 870180149001, de 07/11/2018, pág. 57/67 deos;
4/9 (c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) a temperatura ambiente em pH neutro em meios isentos de sal para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato isento de sal;
(e) diminuição do pH do retentato isento de sal da etapa (d) para menos de 4,5, de modo a precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas a temperatura ambiente de modo a permitir o assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
(g) filtração da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) através de um filtro de carbono ativado;
(h) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (g), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (i) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (h) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares purificados que compreendem sorotipo 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F na forma de uma solução.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o pH da etapa (e) é diminuído para cerca de 3,5.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caPetição 870180149001, de 07/11/2018, pág. 58/67
5/9 racterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (h) compreende um ajuste de pH para cerca de 7,4.
20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato isento de sal da etapa (d).
21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que a etapa (g) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f).
22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que o filtro de carbono ativado da etapa (g) compreende ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira.
23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que o agente lítico da etapa (b) é desoxicolato de sódio.
24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que o agente lítico da etapa (b) é um agente lítico não derivado de animal.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o agente lítico não derivado de animal é selecionado do grupo consistindo em: ácido decanossulfônico, f-octilfenoxi poli(oxietileno)etanóis, condensados de óxido de octilfenol etileno, Nlauril sarcosina de sódio (NLS), lauril iminodipropionato, dodecil sulfato
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6/9 de sódio, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato e colato.
26. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o agente lítico não derivado de animal é N-lauril sarcosina de sódio.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) provisão de um caldo de fermentação que compreende células bacterianas que produzem sorotipo de Streptococcus pneumoniae 19A;
(b) lise das células bacterianas na etapa (a) com um agente lítico, desta forma, produzindo um lisado celular que compreende fragmentos de células, proteínas solúveis, ácidos nucléicos e polissacarídeos;
(c) clarificação do lisado celular da etapa (b) empregando centrifugação ou filtração para remover fragmentos de células, desta forma, produzindo um lisado celular clarificado;
(d) ultrafiltração e diafiltração do lisado celular clarificado da etapa (c) a cerca de 4Ό, a um pH de cerca de 6 em tampão de fosfato de sódio para remover impurezas de peso molecular baixo e aumentar a concentração de polissacarídeo, desta forma, produzindo um retentato;
(e) diminuição do pH do retentato da etapa (d) para menos de 4,5 de modo a precipitar proteína e ácidos nucléicos, deste modo formando uma solução de retentato acidificada;
(f) manutenção da solução de retentato acidificada formada na etapa (e) por pelo menos 2 horas a cerca de 4Ό, de modo a permitir o assentamento do precipitado, seguido por filtração ou centrifugação da solução de retentato acidificada, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada;
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7/9 (g) ajuste do pH da solução de polissacarídeo clarificada da etapa (f) para cerca de 6, desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado;
(h) filtração da solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado da etapa (g) através de um filtro de carbono ativado;
(i) ultrafiltração e diafiltração da solução filtrada produzida pela etapa (h), desta forma, produzindo uma solução de polissacarídeo concentrada e purificada; e (j) filtração da solução de polissacarídeo concentrada e purificada produzida pela etapa (i) empregando um filtro estéril;
pelo que são produzidos polissacarídeos capsulares purificados que compreendem sorotipo 19A na forma de uma solução.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o pH da etapa (e) é diminuído para cerca de 3,5.
29. Processo, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 5,5 a cerca de 7,5.
30. Processo, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para entre cerca de 7,0 a cerca de 7,5.
31. Processo, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a diafiltração da etapa (i) compreende um ajuste de pH para cerca de 7,4.
32. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) remove pelo menos 98% da proteína do retentato da etapa (d).
33. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de que a etapa (h) remove pelo menos 90% da proteína da solução de polissacarídeo clarificada de pH ajustado da etapa (g).
Petição 870180149001, de 07/11/2018, pág. 61/67
8/9
34. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 33, caracterizado pelo fato de que o filtro de carbono ativado da etapa (h) compreende ácido fosfórico-carbono ativado à base de madeira.
35. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 34, caracterizado pelo fato de que o tampão fosfato de sódio da etapa (d) é 25 mM fosfato de sódio.
36. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 35, caracterizado pelo fato de que o agente lítico da etapa (b) é desoxicolato de sódio.
37. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 35, caracterizado pelo fato de que o agente lítico da etapa (b) é um agente lítico não derivado de animal.
38. Processo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o agente lítico não derivado de animal é selecionado do grupo consistindo em: ácido decanossulfônico, f-octilfenoxi poli(oxietileno)etanóis, condensados de óxido de octilfenol etileno, Nlauril sarcosina de sódio (NLS), lauril iminodipropionato, dodecil sulfato de sódio, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato e colato.
39. Processo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o agente lítico não derivado de animal é N-lauril sarcosina de sódio.
40. Processo para a fabricação de uma vacina pneumocócica, caracterizado pelo fato de que compreende produção de polissacarídeos capsulares purificados de um lisado celular de Streptococcus pneumoniae por um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, e utilizando os ditos polissacarídeos capsulares purificados na fabricação de uma vacina pneumocócica.
41. Processo, de acordo com a reivindicação 40, caracteriPetição 870180149001, de 07/11/2018, pág. 62/67 zado pelo fato de que a dita vacina pneumocócica contém polissacarídeo conjugado com um veículo de proteína.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 20/03/2008 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |
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