JP5944480B2 - 多糖を調製するための新規な方法 - Google Patents

Description

発明の背景

ストレプトコッカス・ニューモニエ（肺炎球菌、Ｐｎ）として分類される病原細菌は、この生物の莢膜多糖（ＰｎＰｓ）に基づいて、８４種の抗原血清型に細分化されている。これらの生物に起因する疾患状態としては、肺炎、髄膜炎、中耳炎、菌血症、ならびに、慢性の気管支炎、副鼻腔炎、関節炎および結膜炎の急性増悪が挙げられる。しかしながら、これらの疾患の大半は、８４種の既知の単離体の限られた部分集合により引き起こされる。したがって、この生物の最も流行性かつ病原性の単離体からのＰｎＰｓを含む多価ワクチンは、最も頻繁に報告されているこのクラスの病原体の非常に高い割合からの保護を提供することができる。

結合型ワクチンを調製するために利用されるＰｎＰｓは、相当な量のＣ−多糖（Ｃ−Ｐｓ）と呼ばれる一般的な不純物／汚染物質を常に伴っている。Ｃ−多糖汚染物質の存在は、型特異的抗原に対する免疫応答を妨害しないが、抗Ｃ多糖抗体の産生は、いくつかの未解決の肺炎球菌感染症で観察される組織破壊と相関している可能性がある。Ｃ−Ｐｓ含量は、肺炎球菌結合型ワクチンの効果を損なう恐れがある。

Ｃ−Ｐｓはまた、ＷＨＯにより多糖不純物として分類されている。２００９年１０月ＷＨＯ ＴＲＳ１９〜２３（肺炎球菌結合型ワクチンの品質、安全性および効果を保証するための勧告）を参照されたい。

したがって、多糖の純度を改善すること、すなわち、群特異的Ｃ−多糖による汚染を減少させることが産業界で必要とされている。

米国特許第４２４２５０１号は、Ｃ−多糖含量が０．５％未満に減少した、硫酸アンモニウムをベースとする多糖沈殿について特許請求している。しかしながら、その精製法は、１２のステップからなり、沈殿のためにアルコールも利用する。

米国特許第５６２３０５７号は、イソプロピルアルコールをベースとするＰｎＰｓ精製を利用することによる３％未満のＣ−多糖含量について特許請求しており、多糖の部分加水分解（音波もしくは熱）前または後にイオン交換クロマトグラフィーも使用する。

米国特許第５７１４３５４号は、「アルコールを使用しない」ＰｎＰｓ精製法について特許請求しており、ＣＴＡＢ（１〜４％）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを利用している。ここでは、ＣＴＡＢステップにより、Ｃ−多糖の大部分が除去される。

米国特許第５８４７１１２号は、Ｃ−Ｐｓの３〜２０倍の減少について特許請求されている。しかしながら、ここでは、ＰｎＰｓ精製は、イソプロピルアルコールおよびセタブロンの複数のステップから構成されている。

１５７２／ＭＵＭ／２０１０は、デオキシコレートおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーに基づく（すなわち、アルコールおよびＣＴＡＢを使用しない）精製について特許請求している。ここでは、Ｃ−Ｐｓ含量は４〜１４％である。

従来技術の方法は、ＣＴＡＢ、アルコールを利用しており、多段階である。ＣＴＡＢは、多糖の選択的な沈殿のために以前は利用されていたが、ＣＴＡＢは有害化学物質である。

沈殿したＰｎＰｓからＣＴＡＢをさらに除去するにはエタノールが必要である。肺炎球菌多糖精製中のエタノールの使用は、以下の操作上の問題を伴う：ａ）エタノールの使用は防炎施設を必要とする、ｂ）このような施設を設計することは極めて高価である、ｃ）エタノールは税関／政府規制下にある、ｄ）エタノールは有害である、ｅ）廃液処理が極めて困難である、ｆ）エタノール必要量が莫大であり、その量は加工材料１リットル当たりほぼ約４〜６Ｌのエタノールである、およびｇ）高価な炭濾過および凍結乾燥ステップを要する。

エタノールおよびＣＴＡＢステップを利用する従来技術の方法は、Ｃ−Ｐｓが減少した多糖調製を達成するために７７〜９０時間を要するので、手がかかる。

驚くべきことに、本発明者らは、好ましい一段階または多段階クロマトグラフィーを肺炎球菌多糖の調製に利用すると、群特異的Ｃ−Ｐｓ含量の相当な減少が観察されることを見出した。アルコールおよびＣＴＡＢを使用しない前記方法は、容易に規模を変更でき、採算性に優れ、あまり手がかからない。

本発明は、多糖ワクチンの調製に使用される肺炎球菌多糖の精製のためのアルコールおよびＣＴＡＢを使用しない方法である。本方法は、正味の表面電荷の違いに基づく多糖（ＰｎＰｓ）からのＣ−Ｐｓのクロマトグラフ分離を利用する。この方法は肺炎球菌多糖を精製するための一般的方法である。

本方法により調製されるＰｎＰｓは約６０〜７０％の回収率を示す一方で、Ｃ−多糖汚染の減少は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）後またはイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）前のＣ−Ｐｓ含量と比べて１〜５倍であり、タンパク質汚染は１％未満であり、核酸汚染は１％未満である。前記方法は、研究、パイロットおよび商業の規模で行った。

この方法は、ＣＴＡＢ／アルコールに基づく方法と比べて８０〜９０％少ない時間消費および９０％少ない費用で多糖を精製することができる。

ＨＩＣ、その後のイオン交換クロマトグラフィーに関する図
ＨＩＣ前の肺炎球菌多糖１９Ｆ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）後の肺炎球菌多糖１９Ｆ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図。 １９Ｆ ＰｎＰｓ−ＨＩＣクロマトグラフィー後のＮＭＲを示す図。 ＨＩＣ精製したＰｎＰｓのイオン交換クロマトグラムを示す図。 ＩＥＸ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＨＰＬＣプロファイルを示す図（最終ＰｎＰｓ／例１）。 ＩＥＸ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＮＭＲを示す図。

直接イオン交換クロマトグラフィーに関する図
ＩＥＸ前の肺炎球菌多糖１９Ｆ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図。 ＨＩＣ前のイオン交換クロマトグラムを示す図（部分精製ＰｎＰｓ）。 ＩＥＸ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＨＰＬＣプロファイルを示す図。 ＩＥＸ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＮＭＲを示す図。

イオン交換クロマトグラフィー、その後のＨＩＣに関する図
ＩＥＸ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＨＰＬＣプロファイルを示す図。 ＨＩＣ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＨＰＬＣプロファイルを示す図。 ＩＥＸ−ＨＩＣ後の１９Ｆ ＰｎＰｓのＮＭＲを示す図。

発明の詳細な説明

定義：
「不純物」および「汚染物質」という用語、ならびにこれらの文法上の変形は、互換的にＣ−多糖を意味するために使用される。

「標的多糖」という用語は、上記したように、肺炎球菌莢膜多糖を指すために使用される。

「クロマトグラフィー」という用語は、混合物中の対象となる溶質、例えば対象となる多糖を、溶質の特性により幾分か強く溶質を吸着または保持する吸着剤を通した混合物の濾過により、混合物中の他の溶質から分離する方法を指す。

「疎水性相互作用クロマトグラフィー」という用語は、疎水性分離基質との相対的疎水性相互作用の強度に基づいて標的を分離する方法を指す。本文脈において、「疎水性」は、非極性化合物と極性環境の間の反発として定義される。

「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、対象となるイオン性溶質が、ｐＨおよび伝導率の適当な条件下で固相イオン交換材料に連結した逆帯電リガンドと相互作用して、結果として対象となる溶質が混合物中の溶質不純物または汚染物質よりも幾分か帯電化合物と非特異的に相互作用するクロマトグラフ法を指す。混合物中の汚染溶質は、対象となる溶質よりも速くまたは遅く、イオン交換材料のカラムから洗い流すことができる、または樹脂に結合するもしくは樹脂から除かれる。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には陽イオン交換、陰イオン交換および混合モードクロマトグラフィーを含む。

本発明の肺炎球菌多糖精製法は、以下のステップを含む：
（ａ）細菌細胞を、肺炎球菌細菌を含む発酵培地中で洗剤により溶解さっせ、それによって多糖溶液および固体細胞片を含む溶解物を製造すること；
（ｂ）多糖溶液から固体を分離することにより、この水性細胞溶解物を清澄化すること；
（ｃ）１００Ｋ分子量カットオフ膜を使用して低分子量汚染物質を除去する限外濾過により多糖溶液を濃縮して、濃縮多糖溶液を形成すること；
（ｄ）多糖を含む溶液のヌクレアーゼによる処理；
（ｅ）硫酸アンモニウムまたはＤＯＣ−ＮａＣｌ処理を使用した不純物の沈殿；
（ｆ）１００Ｋ分子量カットオフ膜を使用したダイアフィルトレーション；
（ｇ）多糖溶液を一段階または多段階クロマトグラフィーに供すること；
（ｈ）濃縮およびダイアフィルトレーション；ならびに
（ｉ）多糖溶液の無菌濾過。

本発明によると、イオン交換は、その正味の表面電荷の違いに基づいてＰｓとＣ−Ｐｓを分離する。分子はその電荷特性が極めて多様なので、その全体的な電荷、電荷密度および表面電荷の分布の違いにより、帯電クロマトグラフィー媒体との様々な程度の相互作用を示すことになる。

本発明によると、前記一段階または多段階クロマトグラフィーは、ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、その後のイオン交換、またはｉｉ）直接イオン交換、またはｉｉｉ）イオン交換、その後のＨＩＣから構成され得る。

好ましくは、疎水性吸着剤は、これらに限らないが、ブチル−、フェニル−ならびにオクチル−アガロースおよびブチル−、フェニル−ならびにエーテル−有機ポリマー樹脂から選択することができる。莢膜多糖は、高塩（２Ｍ〜５Ｍまたは５０％飽和のアンモニウム塩）で、カラムへの充填中のフロースルーおよび充填後の洗浄液として出てくるが、より疎水性のタンパク質および核酸は保持される。

さらに、前記第２のクロマトグラフィーカラムは、陽イオン交換、陰イオン交換および混合モードクロマトグラフィーから選択することができるイオン交換クロマトグラフィーである。

「陰イオン交換樹脂」とは、正に帯電した、したがって、１種以上の正に帯電したリガンドがそこに付着した固相を指す。陰イオン交換樹脂を形成するのに適した固相に付着した任意の正に帯電したリガンド、例えば第四級アミノ基を使用することができる。市販の陰イオン交換樹脂には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＤＥＡＥセルロース、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ２０、ＰＩ ５０、ＨＱ １０、ＨＱ ２０、ＨＱ ５０、Ｄ ５０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、ＭｏｎｏＱ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｅｓｈｍｉｎｏ Ｑ、Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ ６５０Ｍ、Ｎｕｖｉａ−Ｑ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｑ−ｈ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑおよび３０Ｑ、Ｑ、ＤＥＡＥおよびＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ製のＷＰ ＰＥＩ、ＷＰ ＤＥＡＭ、ＷＰ ＱＵＡＴ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＱＡ、Ｂｉｏｒａｄ製のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｐａｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｑ、ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＤＥＡＥ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＭおよびＬＳ ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＤＥＡＥ、ＱＭＡ Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ ＬＳ、ＱＭＡ Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ ＭおよびＭｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製のＤＯＷＥＸ Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ Ａｎｉｏｎ ＲｅｓｉｎｓおよびＤＯＷＥＸ ＭＯＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｅ ７７、弱塩基陰イオン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＩｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｑ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００およびＱ８００、ＥＭＤ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＭＡＥ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ弱強陰イオン交換体ＩおよびＩＩ型、ＤＯＷＥＸ弱および強陰イオン交換体ＩおよびＩＩ型、Ｄｉａｉｏｎ弱および強陰イオン交換体ＩおよびＩＩ型、Ｄｕｏｌｉｔｅ、Ｔｏｓｏｈ製のＴＳＫゲルＱおよびＤＥＡＥ ５ＰＷおよび５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＱＡＥ−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５０Ｍおよび６５０Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ製のＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ ＤおよびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ Ｑが含まれる。

本発明の別の態様は、前記陰イオン交換カラムが、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４５％および６０％含んだリン酸緩衝液で溶出させるものである。

本発明のさらに別の態様は、前記陰イオン交換カラムが、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて直線的または段階的な変化度で含んだリン酸緩衝液で溶出させる、特に、陰イオン交換カラムが、ａ）血清型１については、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％、２０％、２５％および３０％含んだリン酸緩衝液で；ｂ）血清型５については、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％、２０％および４５％含んだリン酸緩衝液で；ｃ）血清型６Ｂ、６Ａ、１９Ａおよび１９Ｆについては、１Ｍ ＮａＣｌを２０％および３５％含んだリン酸緩衝液で；ｄ）血清型２３Ｆについては、１Ｍ ＮａＣｌを１５％、２０％および３０％含んだリン酸緩衝液で；ｅ）血清型９Ｖについては、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％および３０％含んだリン酸緩衝液で、ならびにｆ）血清型７Ｆ、１４および３３Ｆについては、それぞれフロースルー及び１Ｍ ＮａＣｌを１００％含んだリン酸緩衝液で、溶出させる。

本発明の好ましい態様では、単一イオン交換クロマトグラフィーステップを使用することにより、莢膜多糖はＣ−多糖に関して大部分が精製されるが、疎水性カラムとイオン交換カラムを組み合わせることにより、Ｃ−多糖ならびに他の汚染物質、例えばタンパク質の除去が保証され、この組み合わせにより、多糖の品質、例えばより大きな均質性もしくはより少ない不均質性または低い多分散性が改善される（図４）。

本発明に従った使用のためのグラム陽性菌の好ましい例は連鎖球菌である。

本方法により精製される莢膜多糖は、１、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）の血清型のいずれかから得ることができる。

高度に精製された莢膜多糖を得るために、疎水性相互作用クロマトグラフィーとイオン交換ステップまたは直接イオン交換との組み合わせを含む単純かつ新規な方法が開発された。

本発明の別の態様は、本方法により調製されるＰｎＰｓが約６０〜７０％の回収率を有することができ、Ｃ−多糖汚染減少が、ＨＩＣ後またはイオン交換クロマトグラフィー前のＣ−多糖のＣ−Ｐｓ含量と比べて１〜５倍であり、タンパク質汚染が１％未満であり、核酸汚染が１％未満であり得るものである。

本発明の更に別の態様は、粗製濃縮物１リットル当たり、アルコール／ＣＴＡＢ法では５０００ＩＮＲ必要とされるのに対して、わずか約４００ＩＮＲしか必要とされないので、Ｃ−Ｐｓ除去の本精製法が極めて費用対効果が高いというものである。本クロマトグラフィーに基づく方法は、ＣＴＡＢ／アルコールに基づく方法と比べると、８０〜９０％少ない時間および９０％少ない費用を要し、操作ミスは最小限である。

本発明の別の態様は、イオン交換クロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーとを組み合わせることがＣ−多糖および他の汚染物質の相当な減少のために好ましい方法であるというものである。あるいは、一段階イオン交換クロマトグラフィーの使用により、他の汚染物質（例えば、タンパク質、核酸）は多いが、ＩＰ／ＥＰ／ＢＰ／ＷＨＯ限界に応じて、ＨＩＣ−ＩＥＸの組み合わせと同じ程度にＣ−多糖を減少させることができる。

［実施例］
例１
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖血清型１９Ｆ（ＨＩＣ、その後のＩＥＸ）
Ｓ．ニューモニエ血清型１９Ｆの発酵培養液からの清澄化ブロス５Ｌを、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して５００ｍｌに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性ｐＨの２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水（ＷＦＩ）によるダイアフィルトレーションを行った。

ヌクレアーゼを多糖溶液に添加して、最終濃度８Ｕ／ｍｌの溶液を得た。酵素処理を、攪拌しながら３７℃で１０±２時間行った。

ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に硫酸アンモニウムを添加して５０％飽和にし、２〜８℃で１２±２時間インキュベートした（血清型５および４を除く）。混合物を遠心分離に供した。ペレット（沈殿）を捨てた。溶液（〜５００ｍｌ）を、ＮａＣｌ、引き続いて冷ＷＦＩを使用した１００ｋＤダイアフィルトレーションに供した。多糖を含むこのダイアフィルトレーション溶液を緩衝液と共に高塩濃度でＨＩＣカラムに充填した。

疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）を５０％飽和硫酸アンモニウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ範囲６〜８、好ましくはｐＨ６〜７のｐＨでカラムに充填した。さらに、カラムを、５０％飽和硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した。これらの条件下、多糖をカラムからフロースルーおよび平衡化洗浄液で回収した。

次いで、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して多糖溶液を濃縮し、次いで、ＮａＣｌおよび注射用蒸留水（ＷＦＩ）を使用してダイアフィルトレーションした。

イオン交換クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）（強陰イオン交換体）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ範囲６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５のｐＨでカラムに充填した。さらに、カラムを緩衝液で洗浄した。吸着多糖を１．０Ｍ ＮａＣｌを使用して段階的な変化度の溶出で溶出した（種々の多糖を異なるイオン強度のＮａＣｌで溶出した）。

次いで、多糖溶液を１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮し、次いで、注射用蒸留水（ＷＦＩ）を使用してダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、０．２２μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を−２０±５℃で凍結した。

上記方法を血清型４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆにも利用した。

結果：−
ＨＩＣ後とイオン交換クロマトグラフィー後のＣ−多糖をＨ¹／Ｐ³¹ＮＭＲスペクトルにより推定した（表１参照）。

例２
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖血清型１９Ｆ（直接ＩＥＸ）
Ｓ．ニューモニエ血清型１９Ｆの発酵培養液からの清澄化ブロス５Ｌを、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して約５００ｍｌに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性ｐＨの２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水（ＷＦＩ）によるダイアフィルトレーションを行った。

ヌクレアーゼを多糖溶液に添加して、最終濃度８Ｕ／ｍｌの溶液を得た。酵素処理を、３７℃で１０±２時間行った。

ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に硫酸アンモニウムを添加して５０％飽和にし、２〜８℃で１２±２時間インキュベートした。混合物を遠心分離に供した。ペレット（沈殿）を捨てた。多糖を含む溶液（〜５００ｍｌ）を、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を使用して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ８．０±０．２に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、多糖溶液を、一定の伝導率が得られるまで、１００ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを使用して注射用蒸留水（ＷＦＩ）に対してさらにダイアフィルトレーションした。

イオン交換クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）（強陰イオン交換体）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ範囲６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５のｐＨでカラムに充填した。さらに、カラムを緩衝液で洗浄した。吸着多糖を１．０Ｍ ＮａＣｌを使用して段階的な変化度の溶出で溶出した（種々の多糖を異なるイオン強度のＮａＣｌで溶出した）。

次いで、多糖溶液を１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮し、次いで、注射用蒸留水（ＷＦＩ）を使用してダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、０．２２μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を−２０±５℃で冷凍保存した。

上記方法を血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆにも利用した。

結果：−
イオン交換クロマトグラフィー後のＣ−多糖のみをＨ¹／Ｐ³¹ＮＭＲスペクトルにより推定した（表２参照）。

例３
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖血清型１９Ｆ（ＩＥＸ、その後ＨＩＣ）
Ｓ．ニューモニエ血清型１９Ｆの発酵培養液からの清澄化ブロス５Ｌを、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して約５００ｍｌに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性ｐＨの２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水（ＷＦＩ）によるダイアフィルトレーションを行った。

ヌクレアーゼを多糖溶液に添加して、最終濃度８Ｕ／ｍｌの溶液を得た。酵素処理を、３７℃で１０±２時間行った。

ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に硫酸アンモニウムを添加して５０％飽和にし、２〜８℃で１２±２時間インキュベートした。混合物を遠心分離に供した。ペレット（沈殿）を捨てた。多糖を含む溶液（５００ｍｌ）を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ８．０±０．２に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、多糖溶液を、一定の伝導率が得られるまで、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して注射用蒸留水（ＷＦＩ）に対してさらにダイアフィルトレーションした。

イオン交換クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）（強陰イオン交換体）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ範囲６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５のｐＨでカラムに充填した。さらに、カラムを緩衝液で洗浄した。吸着多糖を１．０Ｍ ＮａＣｌを使用して段階的な変化度の溶出で溶出した（種々の多糖を異なるイオン強度のＮａＣｌで溶出した）。

疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）を５０％飽和硫酸アンモニウム緩衝液で平衡化し、次いでイオン交換溶出液からの多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ範囲６〜８、好ましくはｐＨ６〜７のｐＨでカラムに充填した。さらに、カラムを、５０％飽和硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した。これらの条件下、多糖をカラムからフロースルーおよび洗浄液で回収した。

次いで、多糖溶液を濃縮し、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して、ＮａＣｌ、次いで注射用蒸留水（ＷＦＩ）に対してダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、０．２２μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を−２０±５℃で冷凍保存した。

上記方法を血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、２３Ｆにも利用した。

結果：−
イオン交換クロマトグラフィー後と疎水性相互作用クロマトグラフィー後のＣ−多糖をＨ¹／Ｐ³¹ＮＭＲスペクトルにより推定した（表３参照）。

例４
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖血清型４
Ｓ．ニューモニエ血清型４の発酵培養液からの清澄化ブロス５Ｌを、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して約５００ｍｌに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性ｐＨの２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水（ＷＦＩ）によるダイアフィルトレーションを行った。

酵素を多糖溶液に添加して、最終濃度１０Ｕ／ｍｌの溶液を得た。酵素処理を、３７℃で１０±２時間行った。

デオキシコール酸ナトリウム（０．５％ｗ／ｖ）およびＮａＣｌ（６０ｍＭ）を酵素処理した多糖溶液に添加し、２〜６℃で１０±２時間インキュベートした。混合物を遠心分離に供した。ペレット（沈殿）を捨てた。多糖を含む溶液（約４００ｍｌ）を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ｐＨ８．０±０．２に対してダイアフィルトレーションした。

次いで、多糖溶液を、一定の伝導率が得られるまで、１００ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを使用して注射用蒸留水（ＷＦＩ）に対してさらにダイアフィルトレーションした。

多糖を、例１または２または３に示す技術によりクロマトグラフ上で精製した。

ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、０．２２μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を−２０±５℃で冷凍保存した。

上記方法を血清型４にも利用した。

結果は、約６０〜７０％の多糖回収率が得られ、Ｃ−多糖汚染減少がＨＩＣ後またはイオン交換クロマトグラフィー前のＣ−Ｐｓ含量と比べて１〜５倍であり、タンパク質汚染が１％未満であり、核酸汚染が１％未満であることを示しており、ＣＴＡＢ／アルコールに基づく従来技術の方法と比べると、消費される時間が８０〜９０％少なく、負担費用が９０％少ない。

疎水性相互作用クロマトグラフィー、その後のイオン交換クロマトグラフィーは、Ｃ−多糖および他の汚染物質の相当な減少のために好ましい方法である。クロマトグラフィーの順序を逆にした方法（すなわち、イオン交換、その後の疎水性相互作用）も相当なＣ−多糖除去をもたらす。あるいは、一段階イオン交換クロマトグラフィーの使用により、基準規格に適合するＣ−多糖減少および他の汚染物質（例えば、タンパク質、核酸）の最終多糖が得られる。

本発明は以上の例証的実施例の詳細に限定されないこと、および、本発明はその本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態に具体化され得ることは、当業者に明らかであり、そのため、本態様および実施例は、全ての点において、例証的なものであり制限的ではなく、以上の記載よりもむしろ添付の特許請求の範囲のための参照であると解釈することが望まれ、それゆえ特許請求の範囲と均等な意味および範囲の内に入る全ての変更は、その範囲に包含されることが意図される。
以下に、本願の種々の実施態様を付記する。
［１］費用対効果が高く、アルコールおよびＣＴＡＢを使用しないクロマトグラフィーに基づいた、抗原性多糖からＣ−多糖を除去するための方法であって、
（ａ）細菌細胞を発酵培地中でデオキシコレートにより溶解させ、それによって多糖溶液および固体細胞片を含む溶解物を製造すること；
（ｂ）前記多糖溶液から固体を分離することにより、この水性細胞溶解物を清澄化すること；
（ｃ）１００Ｋ分子量カットオフ膜を使用して低分子量汚染物質を除去する限外濾過により前記多糖溶液を濃縮して、濃縮多糖溶液を形成すること；
（ｄ）多糖を含む前記溶液のヌクレアーゼによる処理；
（ｅ）硫酸アンモニウムまたはデオキシコール酸ナトリウム処理を使用した不純物の沈殿；
（ｆ）１００Ｋ分子量カットオフ膜を使用したダイアフィルトレーション；
（ｇ）多糖溶液を一段階または多段階クロマトグラフィーに供すること；
（ｈ）濃縮およびダイアフィルトレーション；ならびに
（ｉ）精製した多糖溶液の無菌濾過
を含む方法。
［２］精製した莢膜多糖が、イオン交換クロマトグラフィー前またはＨＩＣ後のＣ−多糖に対して、１〜５倍の型特異的Ｃ−多糖汚染の減少、１％未満のタンパク質汚染、および１％未満の核酸汚染を示す［１］に記載の方法。
［３］ＣＴＡＢ／アルコールに基づく方法よりも少なくとも８０％少ない時間および少なくとも９０％少ない費用を要する［１］に記載の方法。
［４］前記多糖抗原が、限定されないがＳ．ニューモニエおよびＳ．アガラクチアから選択される［１］に記載の方法。
［５］前記Ｓ．ニューモニエ多糖抗原が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される［４］に記載の方法。
［６］前記一段階または多段階クロマトグラフィーが、ｉ）疎水性相互作用、その後のイオン交換、ｉｉ）直接イオン交換、およびｉｉｉ）イオン交換、その後のＨＩＣから構成され得る［１］に記載の方法。
［７］前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの支持体が、ブチル−、フェニル−、オクチル−アガロース、ブチル−、フェニル−、エーテル−有機ポリマー樹脂、およびフェニルセファロースからなる群から選択される［６］に記載の方法。
［８］前記疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、５〜８、好ましくは６〜７．６のｐＨ範囲で運用される［６］に記載の方法。
［９］前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、５０％飽和硫酸アンモニウム塩、２Ｍ〜５Ｍ濃度の範囲の塩化ナトリウムおよび２Ｍ〜３Ｍ濃度のナトリウムのみの硫酸塩を含んだリン酸ナトリウムまたはカリウムの緩衝液を使用する［６］に記載の方法。
［１０］前記イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである［６］に記載の方法。
［１１］前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＤＥＡＥセルロース、ＭｏｎｏＱ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｅｓｈｍｉｎｏ Ｑ、Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ ６５０Ｍ、Ｎｕｖｉａ−Ｑ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｑ−ｈ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑおよび３０Ｑ、Ｑ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｂｉｏｒａｄ製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｑ、ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＱＡＥ−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５０Ｍからなる群から選択される陰イオン交換樹脂で行われる［１０］に記載の方法。
［１２］前記陰イオン交換カラムは、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて１０〜６０％含んだリン酸緩衝液で溶離される［１０］に記載の方法。
［１３］前記陰イオン交換カラムは、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４５％および６０％含んだリン酸緩衝液で溶離される［１２］に記載の方法。
［１４］前記陰イオン交換カラムは、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて直線的なまたは段階的な変化度で含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項［１３］に記載の方法。
［１５］前記陰イオン交換カラムは、
ａ）血清型１については、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％、２０％、２５％および３０％含んだリン酸緩衝液で；
ｂ）血清型５については、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％、２０％および４５％含んだリン酸緩衝液で；
ｃ）血清型６Ｂ、６Ａ、１９Ａおよび１９Ｆについては、１Ｍ ＮａＣｌを２０％および３５％含んだリン酸緩衝液で；
ｄ）血清型２３Ｆについては、１Ｍ ＮａＣｌを１５％、２０％および３０％含んだリン酸緩衝液で；
ｅ）血清型９Ｖについては、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％および３０％含んだリン酸緩衝液で；
ｆ）血清型７Ｆ、１４および３３Ｆについては、フロースルー及び１Ｍ ＮａＣｌを１００％含んだリン酸緩衝液で
それぞれで溶離される［１３］に記載の方法。
［１６］前記陰イオン交換カラムは、１０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲のリン酸緩衝液を使用して行われる［１２］に記載の方法。
［１７］前記陰イオン交換カラムは、５〜８、好ましくは６〜７．６のｐＨ範囲で運用される［１０］に記載の方法。

Claims (17)

1. 費用対効果が高く、アルコールおよびＣＴＡＢを使用しないクロマトグラフィーに基づいた、Ｓ．ニューモニエ抗原性多糖からＣ−多糖を除去するための方法であって、
   （ａ）細菌細胞を発酵培地中でデオキシコレートにより溶解させ、それによって多糖溶液および固体細胞片を含む溶解物を製造すること；
   （ｂ）前記多糖溶液から固体を分離することにより、この水性細胞溶解物を清澄化すること；
   （ｃ）１００Ｋ分子量カットオフ膜を使用して低分子量汚染物質を除去する限外濾過により前記多糖溶液を濃縮して、濃縮多糖溶液を形成すること；
   （ｄ）多糖を含む前記溶液のヌクレアーゼによる処理；
   （ｅ）硫酸アンモニウムまたはデオキシコール酸ナトリウム処理を使用した不純物の沈殿；
   （ｆ）１００Ｋ分子量カットオフ膜を使用したダイアフィルトレーション；
   （ｇ）多糖溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および、その後の強陰イオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供すること；
   （ｈ）濃縮およびダイアフィルトレーション；ならびに
   （ｉ）精製した多糖溶液の無菌濾過
   を含む方法。
2. 精製しようとする抗原性多糖が莢膜多糖であり、精製した莢膜多糖が、イオン交換クロマトグラフィー前または疎水性相互作用クロマトグラフィー後のＣ−多糖に対して、１〜５倍の型特異的Ｃ−多糖汚染の減少、１％未満のタンパク質汚染、および１％未満の核酸汚染を示す請求項１に記載の方法。
3. ＣＴＡＢ／アルコールに基づく方法よりも少なくとも８０％少ない時間および少なくとも９０％少ない費用を要する請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｓ．ニューモニエ多糖抗原が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される請求項３に記載の方法。
5. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの支持体が、ブチル−、フェニル−、オクチル−アガロース、ブチル−、フェニル−、エーテル−有機ポリマー樹脂、およびフェニルセファロースからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
6. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、５〜８のｐＨ範囲で運用される請求項１に記載の方法。
7. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、６〜７．６のｐＨ範囲で運用される請求項６に記載の方法。
8. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、５０％飽和硫酸アンモニウム塩、２Ｍ〜５Ｍ濃度の範囲の塩化ナトリウムおよび２Ｍ〜３Ｍ濃度のナトリウムのみの硫酸塩を含んだリン酸ナトリウムまたはカリウムの緩衝液を使用する請求項１に記載の方法。
9. 前記イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項１に記載の方法。
10. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、第四級アミノ基を有するリガンドが固相に付着した陰イオン交換樹脂で行われる請求項９に記載の方法。
11. 前記陰イオン交換カラムは、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて１０〜６０％含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項９に記載の方法。
12. 前記陰イオン交換カラムは、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４５％または６０％含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項１１に記載の方法。
13. 前記陰イオン交換カラムは、１Ｍ ＮａＣｌを血清型に応じて直線的なまたは段階的な変化度で含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項１２に記載の方法。
14. 前記陰イオン交換カラムは、
    ａ）血清型１については、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％、２０％、２５％または３０％含んだリン酸緩衝液で；
    ｂ）血清型５については、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％、２０％または４５％含んだリン酸緩衝液で；
    ｃ）血清型６Ｂ、６Ａ、１９Ａおよび１９Ｆについては、１Ｍ ＮａＣｌを２０％または３５％含んだリン酸緩衝液で；
    ｄ）血清型２３Ｆについては、１Ｍ ＮａＣｌを１５％、２０％または３０％含んだリン酸緩衝液で；
    ｅ）血清型９Ｖについては、１Ｍ ＮａＣｌを１０％、１５％または３０％含んだリン酸緩衝液で；
    ｆ）血清型７Ｆ、１４および３３Ｆについては、フロースルー及び１Ｍ ＮａＣｌを１００％含んだリン酸緩衝液で
    それぞれで溶離される請求項１２に記載の方法。
15. 前記陰イオン交換カラムは、１０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲のリン酸緩衝液を使用して行われる請求項１１に記載の方法。
16. 前記陰イオン交換カラムは、５〜８のｐＨ範囲で運用される請求項９に記載の方法。
17. 前記陰イオン交換カラムは、６〜７．６のｐＨ範囲で運用される請求項１６に記載の方法。