CZ302615B6

CZ302615B6 - Zpusob cištení kapsulárních polysacharidu od bunecných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií a modifikovaný kapsulární polysacharid

Info

Publication number: CZ302615B6
Application number: CZ20002373A
Authority: CZ
Inventors: Michon@Francis; Blake@Milan
Original assignee: Baxter Healthcare S.A.
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2011-08-03
Also published as: ATE468403T2; DK1051506T3; KR100641490B1; JP4435413B2; CA2316975A1; JP5144613B2; CZ20002373A3; AU2307199A; KR20060086978A; ES2611464T3; KR20010033494A; AU754256B2; CA2316975C; JP2010011862A; WO1999032653A1; AU754256C; EP1051506B2; JP2001526902A; EP1051506B1; EP1051506B8

Abstract

Zpusob cištení kapsulárního polysacharidu od bunecných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií pri kterém se (a) extrahuje kapsulární polysacharid z bunecných komponent kontaktováním izolovanými bakteriálními bunkami, koncentrovanými bakteriovými supernatanty z homogenizovaných bakteriových bunek ci podmíneného prostredku, ci peletovaných bunek s bazickým cinidlem prí pH rozsahu 9 až 14, a (b) oddeluje extrahovaný kapsulární polysacharid od necistot vyplývajících z bunecných komponent; uvedené necistoty zahrnují slouceniny vybrané ze skupiny sestávající se z proteinu a nukleových kyselin.

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se vztahuje ke způsobům čištění a izolace kapsulárních polysacharidů (CPS) z gramnegativních i grampozitivních bakterií. Extrahované polysacharidy jsou užitečné pro přípravu vakcín, obsahujících buď samotné polysacharidy nebo polysacharidy konjugované s proio terny.

Dosavadní stav techniky

Bakteriální infekce, způsobené grampozitivní bakterií jako jsou Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listería, Erysipelothrix a Clostridium a gramnegativních bakterií jako jsou Haemophilus, Shigella, Vibrio cholerae, Neisseria a určité typy Escherichia coli, způsobují vážná onemocnění na celém světě. Toto spolu s vyskytující se rezistencí bakterií vůči antibiotikům indikuje potřebu vyvinout bakteriální vakcíny.

Např. streptokokové tvoří široký rod různých grampozitivních bakterií, které byly na základě antigenicity a struktury polysacharidů jejich buněčné stěny (26, 27) uspořádány do několika skupin. Dvě z těchto skupin jsou spojovány s vážnými lidskými infekcemi. Streptokokové skupiny A způsobují řadu infekčních onemocnění včetně „streptokokové angíny“, revmatické horeč25 ky, streptokokového impetiga a sepse.

Streptokokové skupiny B nebyly až do počátku sedmdesátých let uváděny v běžných lékařských učebnicích jako lidské patogeny. Od té doby však studie ukázaly, že streptokokové skupiny B jsou významnými perinatálními patogeny jak v USA tak i v rozvojových zemích (37). Infekce, způsobené streptokoky systémové skupiny B v průběhu prvních dvou měsíců života, postihují přibližně tri z každých 1000 porodů (12), čímž vzniká ročně v USA 11 000 nových případů. Tyto infekce způsobují symptomy vrozené pneumonie, sepsi a meningitidu. Podstatné číslo těchto dětí umírá nebo má trvalé neurologické následky. Dále mohou být infekce streptokoky skupiny B příčinou onemocnění ve vysokém stupni těhotenství, která se vyskytují přibližně u 50 000 žen roč35 ně. Další rizikovou skupinu, ohroženou infekcemi streptokoky skupiny B, tvoří ti, kteří mají změněnou imunitní odpověď ať již vrozeně, chemoterapeuticky nebo jinými způsoby.

Streptokokové skupiny B mohou být dále rozděleny na základě bakteriálních kapsulárních polysacharidů do několika odlišných typů. Typy la, Ib, II, ΠΙ, IV, V, VI, VII a VIII vysvětlují většinu patogenicity následkem infekce skupinou B, přičemž streptokokové skupiny B typu la, Ib, II, III a V reprezentují více než 90 % všech známých případů. Struktura polysacharidu každého z těchto různých typů byla charakterizována (19 až 22, 44), Podobně jako bylo zjištěno u mnoha dalších lidských bakteriálních patogenů, mohou kapsulární polysacharidy streptokoků skupiny B, jsou-li použity ve vakcínách, poskytnout účinnou ochranu vůči infekcím těmito bakteriemi viz 4, 6, 24,

29,30,42,43,45.

Významnou příčinou onemocnění jsou také gramnegativní bakterie. Až do nedávné doby, kdy byly vyvinuty a začaly být používány vakcíny na bázi polysacharid-protein proti bakterii Haemophilus influenza typ b (Hib), byly infekce bakterií Hib odpovědně za mnoho případů mentální retardace u dětí. Infekce bakteriemi N. meningitidis a E. coli Kl jsou odpovědné za neonatální meningitidu. Kmeny gramnegativní bakterie E. coli jsou spojovány s vážnými onemocněními včetně smrti v důsledku požití masa, nakaženého kmeny £. coli.

Produkce vakcín na bázi kapsulárních polysacharidů a vakcín na bázi polysacharidových konju55 gátů ve velkém měřítku vyžaduje odpovídající zajištění dodávky přečištěných kapsulárních poly- 1 CZ 302615 B6 sacharidu. Způsoby izolace kapsu lamích polysacharidu z bakteriálních buněk, které jsou uvedeny ve stavu techniky (40, 42), spočívají v působení enzymu mutanoíysinu na buňky. Mutanolysin štěpí bakteriální buněčnou stěnu, která propouští buněčné komponenty. Tento postup zahrnuje působení dalších enzymů na buněčný lyzát, jehož cílem je odstranit proteiny a nukleové kyseliny a přečištění preparátu různými sráženími a chromatografie kým i postupy. Žádoucí jsou takové způsoby získávání přečištěných kapsulárních polysacharidu, které jsou účinné, jednoduché a které poskytují vysoké výtěžky.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu čištění kapsulárního polysacharidu od buněčných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií, kde při čištění se (a) extrahuje kapsulárnt polysacharid z buněčných komponent kontaktováním izolovanými bakteriálními buňkami, koncentrovanými bakteriovými supematanty z homogenizovaných bakteriových buněk či podmíněného prostředku, či peletovaných buněk s bazickým činidlem při pH rozsahu 9 až 14 a (b) odděluje extrahovaný kapsulámí polysacharid od nečistot vyplývajících z buněčných komponent; uvedené nečistoty zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající se z proteinů a nukleových kyselin.

Ve výhodném provedení je určité procento V-acetylskupin, přítomných v kapsulámím polysacharidu, které jsou během extrakce hydrolyzovány, poté dostatečně reacylovány, aby byly zachovány imunogenní vlastnosti kapsu lárn ího polysacharidu.

Výhodně způsob dále zahrnuje kroky:

a) případnou separaci kapsulárního polysacharidu od jiné buněčné komponenty pomocí chromatografie;

h) reakci kapsulárního polysacharidu z kroku b) s acylačním činidlem;

c) přečištění kapsulárního polysacharidu z kroku b) pomocí chromatografie.

Výhodné je pH bazického činidla asi 12.

Výhodně je kapsulární polysacharid odvozen od bakterie rodu Streptococcus, výhodněji rodu Streptococcus skupiny B, nej výhod něj i rodu Streptococcus skupiny B typ I a, lb, II, III nebo V.

Bazické činidlo výhodně obsahuje organickou bázi nebo anorganickou bázi, případně NaOH, KOH nebo LiOH.

Chromatografie kým separačním krokem je výhodně chromatografie s hydrofobní interakcí.

Acy lační činidlo je výhodně acetanhydrid, acetylehlorid, pentafluorfenylacetát nebo 4-nitrofenylacetát.

Kapsulámí polysacharid je výhodně přečištěn chromatografícky a to gelovou permeační chromatografií.

Při ještě výhodnějším provedení způsobu bazické činidlo obsahuje anorganickou bázi, chromatograflcká separace je uskutečněna chromatografií s hydrofobní interakcí, acy lační činidlo je

CZ 302615 Β6 acetan hydrid, acety leh lorid, pentafl uorfeny láce tát nebo 4-nitrofenylacetát a kapsulámí polysacharid je přečištěn gelovou permeační chromatografií.

Při nej výhodnějším provedení bazické činidlo obsahuje NaOH, chromatografie ký separační krok zahrnuje kolonu Phenyl Sepharose, acylační činidlo je acetanhydrid.

Dalším předmětem vynálezu je modifikovaný kapsulámí polysacharid v podobě vakcíny, získaný způsobem zahrnujícím:

(a) extrahování kapsulámího polysacharidu z buněčných komponent kontaktováním izolovanými bakteriálními buňkami, koncentrovanými bakteriálními supematanty z homogenizovaných bakteriálních buněk či upraveného média, či peletovaných buněk s bazickým činidlem při pH 9 až 14, a (b) Oddělování extrahovaného kapsulámího polysacharidu od nečistot vzniklých z buněčných komponent, aby získaly modifikovaný kapsulámí polysacharid; kde uvedené nečistoty zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z proteinů a nukleových kyselin.

Modifikovaný kapsulámí polysacharid podle vynálezu je výhodně dále acylovaný acetanhydridem a pak přečištěn chromatograficky pomocí gelové permeační chromatografie. S výhodou je modifikovaný kapsulámí polysacharid získán z rodu Streptococci, výhodněji Streptococci skupiny B, nejvýhodněji kapsulámí polysacharid (CPS) v podobě vakcíny, kde CPS je odvozen z typu la, Ib, II, III, či V skupina B streptococcal bakterie získaný procesem zahrnujícím úpravy kompozice zahrnující skupinu B streptococcal kapsulámího polysacharidu a nukleová kyselina a/nebo protein s bazickým Činidlem a oddělováním čištěného kapsulámího polysacharidu, kde:

CPS typu la má: K_av přibližně v rozmezí 0,010 až 0,005

M_w přibližně v rozmezí 318 až 311 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,35 až 1,31

CPS typu Ib má: K_av přibližně v rozmezí 0,191 až 0,150

M_w přibližně v rozmezí 218 až 170 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,61 až 1,20

CPS typu II má: K_av přibližně v rozmezí 0,152 až 0,115

M_w přibližně v rozmezí 289 až 246 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,46

CPS typu III má: K_av přibližně v rozmezí 0,343 až 0,268

M_w přibližně v rozmezí 108 až 104 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,24 až 1,22

CPS typu V má: K_av přibližně v rozmezí 0,257 až 0,156

M_w přibližně v rozmezí 179 až 92 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,28 až 1,15

Dalším předmětem vynálezu je farmaceutický prostředek zahrnující uvedený kapsulámí polysacharid a farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodně je kapsulámí polysacharid konjugovaný k proteinu. S výhodou uvedený farmaceutický prostředek dále zahrnuje fyziologické přijatelné látky zvyšujícího účinku antigenu.

Farmaceutický prostředek se s výhodou používá pro přípravu kompozice vakcíny pro imunizaci savců.

- 3 CZ 302615 B6

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy konjugované polysacharidové vakcíny, vyznačující se tím, že pri uvedené metodě se (a) Čistí kapsu lární póly sacharidy odvozené od grampozitivních či gram negativ nich bakterií způsobem uvedeným výše, (b) konjuguje se takto čištěný polysacharid k bílkovině.

Při výhodném provedení způsobu se konjugace provádí uvedením terminálových aldehydových skupin do kapsulárního polysacharidů přes oxidační rozštěp vicinálních diolů v kapsulámím polysacharidů, a potom konjuguje terminálová aldehydová skupina k polypeptidovým aminoskupinám přes reduktivní aminaci.

Výhodně je pri způsobu kapsulární polysacharid odvozený z N. meningitidis typu C a je po extrakci s acylačním činidlem převeden do formy .Vacylováného kapsulárního polysacharidů N. meningitidis typu C, přičemž A-acylovaný kapsulární polysacharid odvozený z N. meningitidis typu C je oxidován okysličovadlem na oxidační štěpení vicinálních diolů, aby produkovaly terminálové aldehydové skupiny, a přičemž uvedené terminálové aldehydové skupiny jsou konjugované k aminoskupinám polypeptidu přes redukční aminaci.

Pri způsobu se výhodně dále odděluje de-A-acetylováný polysacharid a izoluje znovuacylováný produkt.

Dalším předmětem vynálezu je konjugovaná vakcína polysacharid-protein zahrnující farmaceuticky přijatelný nosič; konjugát polysacharid-protein, kde konjugát pólysacharid-proteinu je získaný (a) extrahováním kapsulárního polysacharidů z buněčných komponent grampozitivních či gramnegativních bakterií kontaktováním izolovaných bakteriálních buněk, koncentrovaných bakteriálních supernatantů z homogenizovaných bakteriálních buněk či upraveného média, či peletovaných buněk s bazickým činidlem pri pH 9 až 14, (b) oddělování extrahovaného kapsulárního polysacharidů od nečistot vzniklých z buněčných komponent; kde uvedené nečistoty zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z proteinů a nukleových kyselin; a (c) konjugování takto čištěného polysacharidů a polypeptidu.

Podle tohoto vynálezu mohou být CPS extrahovány z bakteriálních supernatantů nebo bakteriálních buněk hydrolýzou vazby, která je labilní vůči bázi a která spojuje CPS a další buněčné komponenty. Výhodou extrakčního postupu, který je poskytován tímto vynálezem, je fakt, že extrahované CPS jsou vysoce neporušené.

Způsob získávání přečištěného kapsulárního polysacharidů deacetylací určitého procenta A-acetylových skupin CPS v průběhu bazické extrakce, usnadňuje separaci CPS od dalších buněčných komponent. Aby byl poskytnut přečištěný CPS, který bude mít stejnou opakující se jednotku struktury co se týče A-acetylových skupin jako nativní polysacharid, může být určité procento acetylových skupin zpětně opět začleněno nebo může být použita acylace modifikovanými alkylovými skupinami s cílem získat modifikovaný CPS.

-4CZ 302615 B6

Přečištění kapsulámích polysacharidů z bakteriálních supematantů nebo bakteriálních buněk podle tohoto vynálezu má oproti jiným způsobům následující výhody: (a) jednoduchost (minimální počet kroků, (b) účinnost (vysoký výtěžek a čistota), (c) bezpečnost (např. omezení nebo vyloučení použití hořlavých organických rozpouštědel) a (d) obecnou apl i kováte lnost na všechny gramnegativní a gram pozitivní bakterie.

Kromě extrahování CPS způsobuje bazická extrakce také deacetylaci A-acetylskupin. Stupeň deacetylace může být změněn úpravou reakčních podmínek. Aby byly získány CPS, jsou extrahované CPS separovány od buněčných komponent, výhodněji chromatografícky. Aby byl získán io CPS nebo modifikovaný CPS, mohou být některé nebo většina acetylskupin opětovně začleněna.

Konečného přečištění CPS může být dosaženo gelovou permeační chromatografií. V dalším provedení poskytuje vynález jako výsledek extrakce za bazických podmínek nové, případně modifikované CPS, které jsou vhodné pro použití jako vakcíny nebo konjugované vakcíny.

Účelem tohoto vynálezu je poskytnout způsob přípravy podstatně čistých CPS, které jsou schopny vyvolat u savců tvorbou protilátek, které jsou baktericídní a chrání živočichy vůči infekcí.

CPS se používají ve vakcínách a to buď samostatně nebo konjugované s polypeptidem, s cílem chránit lidi nebo zvířata vůči infekci a to zejména tím kmenem bakterie, ze kterého byl CPS izolován. V určitých případech může polysacharid, použitý v tomto vynálezu, indukovat tvorbu protilátek, které vykazují křížovou reaktivitu sjinými patogenními bakteriemi, čímž vytváří ochranu vůči infekci těmito jinými bakteriemi.

Způsob izolace kapsulámích polysacharidů z buněčných komponent, obsažených v supematan25 těch gramnegativních nebo grampozitivních bakterií nebo v buňkách gramnegativních nebo grampozitivních bakterií umožňuje použít tyto kapsulámí polysacharidy buď jako vakcíny nebo mohou být vázány na polypeptidy za vzniku konjugovaných molekul, které jsou užitečné jako vakcíny.

Získávání kapsulámích polysacharidů z gramnegativních a grampozitivních bakterií použitím bazické hydrolýzy vazby, kteráje labilní vůči bázi a která připojuje CPS k buněčným komponentám se skládá z extrakce CPS gramnegativní a gramnegativní bakterie uvedením bakterie nebo roztoku, obsahujícího fragmenty bakterie, do kontaktu s bází. CPS může být poté různými postupy získán z báze zpět. Příklady grampozitivních bakterií, které však nejsou v žádném smyslu limitující a které mohou být použity podle tohoto vynálezu jsou Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix a Clostridium. Přesněji, výhodnější je použití bakterie Streptococcus a nej výhodnější je použití streptokoků skupiny B typ Ia, lb, II, III, IV, V, VI, VII a Vlil. Mezi příklady gramnegativních bakterií, které jsou užitečné pro tento vynález, ale které nejsou v žádném směru limitující, patří Haemophilus influenza,

Neisseria meningitidis a Escherichia coli. Přesněji, pro použití jsou výhodnější H. influenza typ b, N. meningitidis typ B, C, Y a W135 a E. coli K1.

Podle vynálezu může být použita pro hydrolýzu vazby, kteráje labilní vůči bázi, ve vodném nebo organickém rozpouštědle řada různých podmínek. Stupeň, do kterého jsou hydrolyzovány

V-acetylvazby sacharidů, může být regulován reakčními podmínkami. Hydrolýza V-acetylových skupin je výhodná pro separací CPS od jiných buněčných komponent, protože čím více V-acetyl vazeb je štěpeno, tím hydrofilnější bude CPS v porovnání se zbylými buněčnými komponentami. Tento rozdíl v polaritě může být využit pro účinnost chromatografícké separace. Separace dvou nebo více složek ze směsi, kteráje založena na rozdílu v polaritě, je odborníkům v dané oblasti techniky dobře známá.

Například při chromatografií s hydrofobní interakcí jsou sloučeniny s relativně vysokou hydrofobicitou zadržovány na koloně déle než sloučeniny, které jsou hydrofilnější. Naopak při chromatografií s hydrofilní interakcí jsou hydrofilní sloučeniny zadržovány na koloně déle než

- 5 CZ 302615 B6 sloučeniny, kteréjsou hydrofobnější. Použití obou metod za sebou umožňuje odstranit nečistoty, které jsou v porovnání se sledovanou sloučeninou méně či více polární.

Volné aminoskupiny nebo karboxyskupiny, přítomné na CPS, mohou být využity pro usnadnění účinné chromatografické separace. Separace dvou nebo více složek ze směsi, která je založena na rozdílech v náboji, je odborníkům v dané oblasti techniky dobře známá. Pri ionexové chromatografii na katexu jsou sloučeniny, které obsahují kladně nabité skupiny jako např. protonované aminy, zadržovány na koloně déle než sloučeniny s malým nebo nulovým kladným nábojem, které procházejí kolonou relativně rychle. Naopak pří ionexové chromatografii na anexu jsou záporně nabité sloučeniny jako např. karboxylové kyseliny zadržovány na koloně, zatímco sloučeniny s malým nebo žádným nábojem procházejí kolonou relativně rychle.

Po separaci deacetylovaných CPS od ostatních buněčných komponent mohou být aminoskupiny zpětně acetylovány. Různá acetylační činidla a reakční podmínky umožňují regulovat stupeň, do kterého jsou aminoskupiny reacetylovány. Nečistoty, začleněné v acetylačním kroku, jsou co se týče velikosti malé ve srovnání s reacetylovaným CPS a proto mohou být odseparovány od CPS gelovou permeační chromatografii.

Gelová permeační chromatografie například umožňuje účinnou separaci relativně velkých CPS. Rozdíl v polaritě nebo náboji může být také příležitostně využit při prečišťování CPS od zbývajících nečistot.

Příprava kapsulárních polysacharídů

Podle předmětného vynálezu může být bakteriální polysacharid izolován a přečištěn od buněčných komponent ve 4 krocích: bazická extrakce, chromatografická separace, /V-acylace a chromatografické přečištění.

Výchozí materiály

Materiály pro extrahování CPS mohou být získány ze zahuštěných bakteriálních supernatantů, z homogenizovaných bakteriálních buněk nebo upraveného média. Buňky mohou být odděleny odstředěním nebo mikrofiltrací a supernatant bývá většinou 10 až 15 krát zahuštěn. Výhodněji jsou bakteriální supernatanty a upravená média zahuštěny tak, aby CPS byly přítomny v koncentraci asi 5 až 20 mg/ml. Dále mohou být také extrahovány přímo peletované buňky.

Bazická extrakce

Zahuštěný bakteriální supernatant nebo upravené médium mohou být uvedeny do kontaktu s řadou různých bází s cílem extrahovat CPS. Případně mohou být uvedeny do kontaktu s řadou různých bází také izolované bakteriální buňky. Příklady bází, které mohou být použity podle tohoto vynálezu a které nejsou v žádném směru limitující, jsou NaOH, KOH, LiOH, NaHCOi, Na^CO}, KiCOs, KCN, Et,N, NH₃, H2N2H1, NaH, NaOMe, NaOEt nebo KO/Bu. Báze jako NaOH, KOH, LiOH, NaH, NaOMe nebo KO/Bu jsou nejúčinněji používány v rozmezí koncentrací 0,5 až 5,0 N. Báze jako NaHCOi, Na₂CO₃, K7CO3, KCN mohou být použity v tak vysokých koncentracích, jaké jim umožňuje jejich rozpustnost. Organické báze jako Et₃N mohou být použity ve středních až vysokých koncentracích (50 až 100%) a to tak dlouho, dokud je zde činidlo jako např. voda nebo alkohol, nutné ktomu, aby proběhla hydrolýza. Báze jako je NH₃nebo Η₂Ν₂Η₂ mohou být použity v téměř jakékoliv koncentraci včetně 100%. Mohou být použita rozpouštědla jako je voda, alkoholy (výhodněji C, až C₄), dimethylsulfoxid, dimethylformamid nebo směsi těchto a jiných organických rozpouštědel. Bazické extrakční roztoky, obsahující vodu, jsou nejvýhodnější.

Nejúčinnější rozsah pH pro extrahování CPS z buněčných složek je od asi 9 do 14, přičemž pH optimum je okolo 12. Ačkoli může být extrakce dosaženo pri teplotě od asi 4 °C, vyšší výtěžky

-6CZ 302615 B6 jsou očekávány při zvýšení teploty, výhodněji do oblasti mezi asi 40 až IOO°C, a/nebo pri míchání reakční směsi. Výhodnější je použít přibližně 1 až 20 g buněčné pasty do asi 1 1 roztoku báze. Příležitostně mohou být zahuštěné supematanty zředěny ION roztokem NaOH až na konečnou koncentraci NaOH v reakční směsi 2 N.

Chromatografická separace

Extrahované CPS, které jsou přítomny v bazickém extrakčním roztoku, mohou být odděleny od nečistot, pocházejících z buněčných komponent, chromatograficky. Příkladem chromatograficio kých separačních metod, které však nejsou nijak limitující, je ionexová chromatografie (kationtová nebo aniontová), chromatografie s hydrofilní interakcí, chromatografie s hydrofobní interakcí nebo gelová permeační chromatografie. Výhodnějším způsobem je chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC). Ještě výhodnější je chromatografie s hydrofobní interakcí na nosiči phenyl sepharose, kdy dochází k odstranění většiny vysokomolekulamích uv-aktivních kontaminant z bazického extraktu. Kapsulámí polysacharid bude eluován na počátku eluce vysokým pH (pH 10 až pH 8) a vysokou koncentrací soii (2 N až 1 N), zatímco hydrofobnější protein a nukleové kyseliny budou zadržovány. Nelimitujícím příkladem chromatografie s hydrofobní interakcí je chromatografie na pryskyřici alkylsepharose nebo sepharose, přičemž výhodnější pryskyřice je Phenyl Sepharose HP (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ). Kolona může být předem ekvilibrována 0,5 až 5,0 N roztokem NaHCO₃ a eluce je prováděna objemem, který je roven jednomu objemu kolony a při průtoku 0,5 až 50 ml/mín. Po eluci roztokem NaHCO₃, jehož objem je roven jednomu objemu kolony, může být použita pro eluci z kolony voda, jejíž objem je roven jednomu až deseti objemům kolony. U frakcí mohou poté být stanoveny polysacharidy a to způsoby, které jsou v dané oblasti techniky známé. Výhodnějším způsobem detekce poly25 sacharidu, obsahujícího kyselinu sialovou, je stanovení pomocí orcinolu, které je popsáno v Příkladech provedení vynálezu. yV-acetylace

Separace extrahovaného kapsu lamího póly sacharidu za bazických podmínek je podporována odstraněním /V-acetylskupin z kyseliny sialové a aminocukemých zbytků kapsuiárních polysacharidů, jinak stabilních vůči bázi, v průběhu extrakce.

Shromážděné frakce po HIC, obsahující kapsulámí polysacharidy, mohou být příležitostně reace35 tylovány do požadovaného stupně pomocí řady různých acetylačních činidel. Nelimitujícími příklady acetylačních činidel jsou acetanhydrid, acetylchlorid, pentafluorfenylacetát, 4-nitrofenylacetát. Toto je uvedeno např. v Theodora W. Greene a Peter G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntheses, 2^nd Ed. (1991). Výhodnějším způsobem je smíchání s acetanhydridem o koncentraci od asi 0,5 M do asi 2 M, přičemž výhodnější jsou koncentrace od asi 0,7 M do asi 1 M, kdy dochází k reacetylaci volných aminoskupin kapsu lamího polysacharidu a tudíž k regeneraci nativní struktury polysacharidu.

Chromatografické přečištění

Přečištěním reacetylováného CPS může být získán CPS, který je vhodný pro použití při přípravě imunologických činidel jako jsou antigeny a vakcíny. Pro tento vynález jsou vhodné různé příklady chromatografíckého přečištění. Pro účinné odseparování reacetyl ováných CPS od reakčních složek může být použita například ionexová chromatografie (kationtová nebo aniontová), chromatografie s hydrofobní interakcí, chromatografie s hydrofilní interakcí nebo gelová perme50 ační chromatografie. Výhodnějším postupem je použití gelové permeační chromatografie na náplni Superdex (zesítěná agaróza a dextran), kdy dochází k odstranění zbytkových kontaminant a výsledkem je přečištěný CPS.

-7CZ 302615 B6

Konkrétně je výhodnější Superdex 200 PG, který má frakci on ač ní rozsah (Mw) pro dextrany 1000 až 100 000. Při použití PBS jako eluentu jsou rychlosti průtoků výhodněji od asi 0,1 do 10 ml/min.

Kapsulární polysacharidy, získané bazickou extrakcí podle tohoto vynálezu, jsou nové (viz obr. 11 a obr. 12) a zachovávají epitopy na svých nativních strukturách (obr. 5 až 10). Dále, CPS, připravené podle vynálezu, vyvolávají tvorbu protilátek, které vykazují křížovou reaktivitu s nativním CPS a bakterie je exprimují. Postupy podle tohoto vynálezu, kterými lze získat CPS, jsou v porovnání s postupy, které jsou uvedeny ve stavu techniky lepší a to z důvodu (a) relativní jednoduchosti s jakou jsou postupy tohoto vynálezu prováděny, (b) vyšších výtěžků izolace a (c) vyšších výtěžků pro konjugaci. Při bazické extrakci jsou navíc degradovány bakteriální DNA a RNA a tudíž nejsou v konečném produktu, který je připraven podle tohoto vynálezu, přítomny v patrnějších množstvích.

Struktura extrahovaných CPS

Kapsulární polysacharidy získané způsobem, který je uveden v tomto vynálezu, mají ve srovnání s CPS, extrahovanými dříve uvedenými způsoby, specifickou strukturu. CPS jsou získány hydrolýzou, která je katalyzována bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících kapsulární polysacharidy a polyrhamnózu a peptidoglykan, (viz obr. II). Podle alternativního modelu pro strukturu bakteriální buněčné stěny, jsou stejné, strukturálně jedinečné CPS získány hydrolýzou, která je katalyzována bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících kapsulární polysacharidy a peptidoglykan a hydrolýzou, kata lyžovanou bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících polyrhamnózu a peptidoglykan (viz obr. 12).

Způsoby, uvedené ve stavu techniky, používají pro štěpení odlišných vazeb enzymy. Například lysozym byl použit pro hydrolýzu polymeru N-acetylglukosamin/.V aectylmuramová kyselina. Mutanolysin byl použit pro hydrolýzu vazby mezi polymerem /V-acetylglukosamin/jV-acetylmuramová kyselina a částí peptidů a lysostaphin byl použit pro hydrolýzu částí peptidů bakteriální buněčné stěny.

Distribuce absolutní molámí hmotnosti kapsulámích polysacharidů tohoto vynálezu je úzká, což naznačují nízké hodnoty polydisperzíty (M_W/M_N) viz tab. 2. Tato jednotnost je významná zejména při přípravě trvalých a účinných vakcín.

Vakcíny

Tento vynález je rovněž zaměřen na přípravu vakcín. V souladu s tímto vynálezem může být izolovaný CPS, popsaný výše, použit jako antigen pro tvorbu protilátek, které vykazují reaktivitu vůči CPS a proto také vykazují reaktivitu vůči organismu, ze kterého byl CPS izolován.

Vakcíny tohoto vynálezu mohou poskytovat aktivní nebo pasivní imunitu. Vakcíny pro poskytování aktivní imunity obsahují přečištěný CPS tohoto vynálezu. Výhodněji tato vakcína obsahuje CPS, konjugovaný na alespoň jeden antigenní peptid.

Protilátky

Techniky extrakce a izolace CPS, které jsou popsány výše, umožňují přípravu velkých množství CPS tohoto vynálezu. Toto usnadňuje tvorbu protilátek reaktivních vůči CPS.

V jiném provedení mohou být protilátky proti CPS vytvořeny jakoukoliv technikou, která je dobře známá vdané oblasti techniky. Podle jednoho přístupu mohou být protilátky vytvářeny prostřednictvím aplikace preparátu izolovaného CPS nebo jeho derivátů nebo fragmentů hostitelskému organismu (zvíře). Hostitelské zvíře může být potkan, myš, králík, primát (ne člověk) nebo člověk. Tyto příklady však nejsou nijak limitující. Výhodněji je hostitelem člověk. Imuno-8CZ 302615 Β6 logické odezvy mohou být znásobeny použitím adjuvants, která jsou v dané oblastí techniky známá.

Proti CPS mohou být také připraveny monoklonální protilátky a to jakoukoliv technikou, která je v dané oblasti techniky dobře známá. Jeden postup používá kultury hybridomových buněčných linií (Kohler a Milstein (1975) Nátuře 256: 495 až 497). Monoklonální protilátky proti CPS mohou být lidské monoklonální protilátky, chimérické monoklonální protilátky nebo polidštěné monoklonální protilátky, připravené jakoukoliv z technik, které jsou v dané oblasti techniky dobře známé. V jednom přístupu mohou být chimérické monoklonální protilátky vytvořeny tak, že mají jinou než lidskou (např. myšší) doménu pro vazbu antigenu, kombinovanou s lidskou konstantní oblastí (Takeda a kol. (1985), Nátuře 314:452). Polidštěné protilátky mohou být vytvořeny podle postupů, které uvádí Queen akol.,US5 585089.

Protilátky proti CPS mohou být přečištěny jakoukoliv technikou, která je dobře známá vdané oblasti techniky včetně imunoabsorpce a imunoafínitní chromatografíe nebo jinými chrom atografíckými technikami (např. HPLC). Tyto příklady však nejsou nijak limitující. Protilátky mohou být také přečištěny ze séra, plasmy nebo média buněčné kultury jako imunoglobulinové frakce.

Molekuly protilátky tohoto vynálezu mohou být neporušené imunoglobulinové molekuly, podstatně neporušené imunoglobulinové molekuly nebo ty části imunoglobulinové molekuly, které obsahují vazebné místo pro antigen např. Fab fragmenty.

Fragmenty protilátek proti CPS mohou být vytvořeny jakoukoliv technikou, která je dobře známá v dané oblasti techniky (Campbell (1985) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Sv. 13, Burdon a kol., Elsevier Science Publishers, Amsterdam).

Konjugované molekuly

CPS tohoto vynálezu může být použit u řady gramnegativních a grampozitivních bakterií pro vyvolání protilátkové odezvy a to buď samostatně nebo konjugovaný na jinou imunogenní molekulu jako je polypeptid nebo protein. Konjugace CPS na polypeptid přeměňuje imunitní odezvu na CPS, která je většinou nezávislá na T-buňkách na závislou na T-buňkách. Dále, velikost polypeptidu je výhodněji taková, aby byla dostatečná pro způsobení změny odezvy z nezávislé na T-buňkách na závislou na T-buňkách. Toto může být užitečné při použití menších polypeptidů za účelem poskytování druhého imunogenu.

Pro konjugaci CPS s peptidem může být použit jakýkoliv způsob konjugace. Výhodnější způsob je popsán v dokumentu US4 356 170, který popisuje začlenění terminálních aldehydových skupin do polysacharidu přes oxidační štěpení vtcinálních diolů a spojení aldehydových skupin a peptidových aminoskupin redukční aminací.

Mělo by však být zřejmé, že konjugované vakcíny vynálezu nejsou omezeny pouze na ty, které jsou vytvářeny prostřednictvím redukční aminace. Vakcíny mohou být také produkovány konjugováním CPS s peptidem pomocí jakékoliv spojovací metody, které jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti techniky, jako je např, použití raménka na bázi dihydrazinu kyseliny adipové, které je popsáno v Schneerson, R. a kol. (1980) J. Exp. Med. 1952:361 až 476 a v US 4 644 059 nebo např. technologie binárního raménka, která je pospána v Marburg, S. a kol. (1986)7. Am. Chem. Soc. 108:5282 až 5287,

Tento vynález poskytuje možnost vytvořit konjugované molekuly, ve kterých je peptid připojen na CPS prostřednictvím jednoho nebo více míst na CPS. Dále, konjugované molekuly, připravené podle tohoto vynálezu, mohou být s ohledem na proteinovou složku monomery, dimery, trimery a ještě více zesítěné molekuly, kde CPS zesíťuje současně více proteinů.

-9 CZ. 302615 Β6

V jiném provedení tohoto vynálezu mohou být protilátky proti CPS tohoto vynálezu použity jako farmaceutické preparáty v terapeutické nebo profylaktické aplikaci s cílem propůjčit pasivní imunitu jednoho hostitele jinému jedinci (tzn. znásobit imunitní odezvu jedince vůči gramnegativní nebo grampozitivní bakterii nebo poskytnout odezvu u jedinců se sníženou nebo téměř žádnou imunitou, včetně pacientů s AIDS). Pasivní přenos protilátek je v dané oblasti techniky známý a může být proveden jakoukoliv známou metodou. Podle jedné metody jsou protilátky proti CPS nebo jejích konjugáty, které jsou předmětem předmětného vynálezu, vytvořeny v imunokompetentním hostitelském („donor) zvířeti, poté jsou z hostitele získány a přeneseny do příjemce. Například pro tvorbu protilátek, reaktivních vůči CPS nebo konjugátu CPS tohoto vynálezu, může být použit lidský donor. Protilátky mohou být poté v průběhu léčby aplikovány v terapeuticky nebo profylakticky účinných množstvích lidským příjemcům, čímž je příjemci udělena rezistence vůči bakteriím, které jsou vázány protilátkami, jejichž tvorba byla vyvolána polysacharidovou složkou (viz Grossman, M. a Cohen, S, N. „Basic and Clinical Immunology“, 7. vyd., (Stites, D. P. a Terr, A. T., Appleton & Lange 1991), Kapitola 58 „Immunization“).

Farmaceutické prostředky

Farmaceutické prostředky tohoto vynálezu mohou obsahovat CPS nebo konjugované molekuly, obsahující CPS a farmaceuticky přijatelné nosiče jako je fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol apod. V jiném provedení obsahuje farmaceutický prostředek jinou imunogenní skupinu jako je peptid nebo prostředky, obsahující protilátky, jejichž tvorba byla vyvolána některým z CPS tohoto předmětného vynálezu. Aby byla zvýšena imunologická odezva příjemce, může prostředek obsahovat také adjuvants. Tato adjuvants mohou být činidla na bázi hliníku jako je ledek nebo činidla s dlouhým alkylovým řetězcem jako je stearyltyrosin (viz US 583 372, podaný 17.9. 1990; EP 0 549 617 Β1; Moloney a kol. US 4 258 029). Toto je uvedeno také v Jennings a kol., CS 5 683 699 a Paoletti a kol. J Infictious Diseases 1997, 175:1237 až 1239. Tyto farmaceutické prostředky jsou konkrétně užitečné jako vakcíny.

Pro vyvolání pasivní imunity mohou být farmaceutické prostředky tvořeny polyklonálními nebo monoklonálními protilátkami nebo jejich deriváty nebo fragmenty, což je popisováno výše. Množství protilátky, fragmentu nebo derivátu bude odpovídat terapeuticky nebo profylakticky účinnému množství, stanovenému standardními klinickými technikami.

Farmaceutické preparáty tohoto vynálezu mohou být jedinci aplikovány prostřednictvím účinných způsobů, známých ve stavu techniky. Mezi jednotlivé cesty patří intradermální, intraperitoneální, intravenózní, podkožní, intramuskulámí, orální a intranazální aplikace, přičemž existují i další způsoby.

Prostředky podle vynálezu mohou obsahovat takové standardní nosiče, pufry nebo ochranná činidla, známé odborníkům vdané oblasti, které jsou vhodné pro vakcíny včetně, nikoliv však pouze, jakéhokoliv vhodného farmaceuticky přijatelného nosiče jako je fyziologický roztok nebo další kapaliny, které je možno aplikovat injekčně. Rovněž přítomna mohou být aditiva, běžná pro vakcíny, např. stabilizátory jako je laktóza nebo sorbitol a adjuvants, zvyšující imunogenní odpověď jako je fosforečnan, hydroxid nebo síran hlinitý a stearyltyrosin. Vakcíny, připravené podle tohoto vynálezu, mohou být také použity jako složky polyvalentních vakcín, které vyvolávají imunitní odezvu vůči mnoha infekčním činidlům.

Vakcíny předmětného vynálezu jsou podávány v množstvích, která jsou dostatečná pro vyvolání tvorby protilátek, jakožto součásti imunogenní odpovědi. Dávky mohou být upraveny na základě velikosti, hmotnosti nebo věku jedince, který vakcínu přijímá. Proti látková odezva může být u jedince monitorována prostřednictvím stanovení ti tru protilátky nebo bakterie idn i aktivity, které, je-li to třeba, mohou být proto, aby se zvýšila odpověď, znásobeny. Pro dítě je většinou jedna dávka asi 10 pg konjugované vakcíny nebo asi 0,5 pg až 20 pg/kg. Dospělým je podávána dávka konjugované vakcíny asi 0,5 pg až 20 pg/kg. Pro CPS vakcíny je typická dávka asi 25 pg

- 10CZ 302615 B6 každého jednotlivého CPS v jedné dávce. To znamená, že vakcína proti streptokokovi skupiny B by měla obsahovat 25 gg každé formy CPS každého z devíti sérotypů.

Diagnostické soupravy

V jiném provedení mohou být použity CPS předmětného vynálezu nebo jeho deriváty nebo fragmenty pro přípravu bezpečnějších diagnostických souprav, které neobsahují toxiny jako je toxin pneumolýzy, ale které mohou ještě indikovat přítomnost protilátek proti gramnegativní nebo grampozitivní bakterii. Přítomnost těchto protilátek může indikovat dřívější vystavení působení patogenů a předpovídat jedince, kteří by mohli být rezistentní vůči infekci. Diagnostická souprava může obsahovat alespoň jeden z CPS tohoto vynálezu nebo jeho deriváty nebo fragmenty a činidla, vhodná pro detekci reakce protilátky. Při detekci jsou smíchány modifikovaný CPS nebo jeho deriváty nebo fragmenty a vzorek, který obsahuje protilátku proti gram negativní nebo grampozitivní bakterii. Reakce protilátky může být identifikována jakoukoliv metodou, popsanou ve stavu techniky včetně např. stanovení ELISA. identifikace je důležitá a může zabránit zbytečné vakcinaci.

Diagnostická souprava může dále také obsahovat pevný nosič nebo magnetické kuličky nebo plastikovou matrici a alespoň jeden CPS tohoto vynálezu nebo jeho deriváty nebo fragmenty.

V některých případech může být výhodnější, aby CPS nebo deriváty nebo fragmenty byly změněny. Činidla pro značení jsou v dané oblasti techniky dobře známá. Činidla pro značení například zahrnují, ale nejsou tím nijak omezena, radioaktivitu, chemiluminiscenci, bioluminiscenci, luminiscenci nebo jiné identifikační „konce“, které lze vhodně analyzovat. Do diagnostické soupravy mohou být aplikovány shromážděné a přečištěné tělní tekutiny nebo tkáňové vzorky (např. krev, sérum, sliny), CPS, deriváty nebo fragmenty mohou, ale nemusí být přečištěny a mohou být složeny ze směsi molekul.

Pevné nosiče jsou v dané oblasti techniky známé, jsou dostupné a zahrnují, aniž by tím byly limitovány, polystyren, polyethylen, polypropylen, polykarbonát nebo jakýkoliv pevný plastikový materiál ve tvaru zkumavky, kuliček, mikročástic, měřící tyčky, destiček apod. Mezi matrice dále příležitostně patří membrány, mikrotitrační destičky s 96 jamkami, zkumavky a mikrozkumavky Eppendorf. Tyto matrice obecně obsahují jakýkoliv povrch, na který může být zachyceno činidlo, vážící ligand, nebo povrch, který sám o sobě poskytuje místo pro zachycení ligandu.

Všechny publikace, patenty a články, které jsou zde uvedeny, jsou zde úmyslně zvlášť začleněny in toto jako odkazy. Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci předmětného vynálezu, ale nejsou v žádném smyslu chápány jako omezení rozsahu vynálezu. Odborníkům v dané oblasti by mělo být zřejmé, že může být provedena řada změn a nahrazení, aniž by tím došlo k odchýlení se od smyslu a rozsahu vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: NMR spektrum (500 MHz) kapsulárního polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ la, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 2: NMR spektrum (500 MHz) kapsulárního polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ lb, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 3: NMR spektrum (500 MHz) kapsulárního polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ JI, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

-11CZ 302615 B6

Obr. 4; NMR spektrum (500 MHz) kapsulámího polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ III, zaznamenané v DiO při 50 °C.

Obr. 5: NMR spektrum (500 MHz) kapsulárního polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ V, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 6*. Inhibice králičího antiséra proti GBSPIa na destičkách potažených GBSPIa-HSA.

Obr. 7: Inhibice králičího antiséra proti GBSPIb na destičkách potažených GBSPlb-HSA.

Obr. 8: Inhibice králičího antiséra proti GBSPII na destičkách potažených GBSPII I ISA.

Obr. 9; Inhibice králičího antiséra proti GBSPIII na destičkách potažených GBSPHI-HSA.

Obr. 10: Inhibice králičího antiséra proti GBSPV-TT a na destičkách potažených GBSPV-HSA.

Obr. II: Schematické znázornění struktury GBS, zobrazující peptidoglykan i se skupinovým subkapsulárním antigenem (polyrhamnóza) a kapsulárním polysacharidem (Michon a kol., Biochemistry 1988, 27:5341 až 5351). X a Y představují zbytky /V-acetylglukosamin a zY -acetvlmu rámo vou kyselinu. Prázdné šipky naznačují předpokládaná místa štěpení: lysozymem (A), mutano lysí nem (B), lysostaphinem (C) nebo bází a to hydrolýzou fosfod i esterových vazeb, připojujících kapsulární polysacharid a polyrhamnózu na peptidoglykan.

Obr. 12: Schematické znázornění struktury GBS, zobrazující peptidoglykan spolu se skupinovým subkapsulárním antigenem (polyrhamnóza) a kapsulárním polysacharidem (Michon a kol., Biochemistry 1988, 27:5341 až 5351). X a Y představují zbytky Y-acetylglukosamin a ;V-acety[muraniovou kyselinu. Prázdné šipky naznačují předpokládaná místa štěpení: lysozymem (A), mutanolysinem (B), lysostaphinem (C) nebo bází a to hydrolýzou fosfod iesterových vazeb, připojujících kapsulární polysacharid na peptidoglykan a hydrolýzou fosfod iesterových vazeb, připojujících polyrhamnózu na peptidoglykan.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Bakteriální kmeny, růstová média a kultivační podmínky

Kmen streptokoka skupiny B typ lb H36b (ATCC 12401) byl získán ze sbírky American type Culture Collection (Rockville, MD). Ostatní použité kmeny 090 (typ Ia), I8RS21 (typ II), M781 (typ III) a 1169-NT I (typ V) laskavě poskytl D. L. Kasper, Harvard Medical School. Neisseria meningitidis typ B, C, Y a W135 laskavě poskytl Carl Frasch zCBER, FD A a Escherichia coli Kl laskavě poskytl Willie Vann zCBER, FDA.

Každý kmen streptokoka skupiny B byl kultivován individuálně v dialyzačním (membrána s vylučovacím limitem molekulové hmotnosti (NMWL) 10 000) kazetovém systému (Pellicon, Millipore Corp., Bedford, MA) s 3,5% médiem Columbia (Difco Laboratories, lne., Detroit, MI), obohaceném 6% glukózou. Pro inokulaci 14 I růstového média (vide supra) ve fermentoru Bioflo IV o objemu 20 1 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) bylo použito 150 ml kultury, kultivované v Erlenmayerově baňce 8h při 37 °C a za stálého třepání. Teplota fermentační kultury byla udržována na 37 °C, pH bylo nepřetržitě upravováno přídavkem 10 N NaOH na hodnotu 7,1 a kultura byla vzdušněna při průtoku 1,5 l/min. Buňky byly sklizeny po 17 h mikrofiltrací přes dutá vlákna (hollow-fiber) MiniKros s porozitou 0,2 gm (Microgon, lne. Laguna Hilis, CA). Supernatant kultury byl až do dalšího zpracování sterilně uchováván při 4 °C. Pelety buněk byly získány odstředěním separovaných buněk při 9000 ot/min v odstředivce Sorvall GSA rotor (DuPont Clinical & Instruments Div., Wilmington, DE) po dobu 50 min.

- 12CZ 302615 B6

Příklad 2. Obecný postup přípravy kapsulárních polysacharidů

Extrakce a chromatografie s hydrofobní interakcí

Pelety byly suspendovány ve 4 násobném objemu 1 N NaOH, přičemž jeden gram vlhké buněčné pasty byl brán jako jeden objem. Suspenze byla přes noc inkubována při 37 °C. Zbytky buněk byly odstraněny odstředěním při 12 000 ot/min po dobu 30 min v odstředivce Sorvall GSA rotor. Po neutralizaci koncentrovanou HCI (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) byl supematant diafiltrován přes membránu Pellicon 10 000 NMWL proti 2 N NaHCO^ (pH 9,6). Vznikající retenát byl poté aplikován na kolonu Pharmacia XK 26/60 s náplní Phenyl Sepharose HP (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ), předem ekvilibrovanou 2 N NaHCOj. Byl použit preparativní chromatografieký systém Pharmacia, který je popsán níže. Kolona byla nejdříve eluována při průtoku 4 ml/min roztokem 2 N NaHCCh, jehož objem byl roven jednomu objemu kolony, následovalo promytí vodou, jejíž objem byl roven dvěma objemům kolony. U frakcí byl stanoven obsah polysacharidů (vide infra) a ty frakce, které obsahovaly kapsulámí polysacharid, byly spojeny.

Kapsulámí polysacharidy byly také přečištěny ze supematantu kultury. Po odstranění buněk bylo médium 10 až 15 krát zahuštěno (Pellicon, membrána 10 000 NMWL) a diafiltrováno proti 10 násobnému objemu vody. Do vznikajícího retenátu byl přidán 10 N NaOH, aby byla konečná koncentrace 1 M, Tento roztok byl přes noc inkubován při 37 °C a zneutralizován koncentrovanou HCI. Zpracování pokračovalo podle postupu, který je uveden výše pro extrakci buněk.

Pro zisk jedné dávky kapsulámího polysacharidů typu III byly buňky a supematant kultury extrahovány společně a to následujícím způsobem. Supematant kultury, oddělený od buněk byl zahuštěn a diafíltrován a vznikající retenát byl vystaven působení báze, což je popsáno výše. Peleta buněk byla suspendována ve 4 objemech retenátu, ošetřeného bází a dále byl zpracováván postupem, popsaným výše pro extrakci buněk (vide supra).

Re-V-acetylace

Vzhledem ktomu, že v důsledku vystavení polysacharidů dříve popsaným extrakčním podmínkám dochází k uvolnění jV-acetylskupin z polysacharidů, byly polysacharidy re-/V-acetylovány a to tak, že byl do spojených frakcí po kapkách přidáván acetanhydrid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) do konečné koncentrace 0,8 M. Tato reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 1 h, a pH bylo přídavkem 10N NaOH udržováno na hodnotě 9. Reakční pH bylo poté zvýšeno na 13 a reakce probíhala dalších 30 min. Roztok, obsahující re-Vaeetylovaný kapsulámí polysacharid, byl diafíltrován proti vodě pomocí kazetového systému Minitan (membrána 10 000 NMWL, Millipore) a retenát byl zlyofilizován. Lyofilizovaný preparát byl znovu rozpuštěn v PBS (pH 7,4) a přečištěn gelovou permeační chromatografií na koloně Superdex 200 PG (vida infra). Frakce, obsahující kapsulámí polysacharid, byly spojeny, díafiltrovány proti vodě (vida supra), retenát byl zlyofilizován a výsledkem byl přečištěný CPS. Gelová permeační chromatografie

Analytická gelová permeační chromatografie (GPC) byla provedena na FPLC systému Pharmacia, vybaveném UV detektorem Pharmacia UV-1 (s filtrem 280 nm), diferenčním refraktometrem R401 firmy Waters Corp. (Milford, MA) a kolonou firmy Pharmacia Superose 6 HR 10/30 (vysoce zesítěná agaróza). Kolona byla eluována pri průtoku 0,5 ml/min PBS, pH 7,4. Pro stanovení mrtvého objemu (V_o) byt použit dextran (molekulová hmotnost přibližně 2 x 10\ Sigma Chem Co., St. Louis, MO) a pro stanovení celkového objemu náplně kolony (V_t) byl použit azid sodný. Relativní eluční objemy jsou vyjadřovány jako K_av - (V_e - V₀)/(V, - Vo), kde V_e je eluční objem, odečtený ze zápisu refraktometru. Preparativní GPC byla provedena na systému Pharmacia, který obsahoval výše zmíněné detektory, pumpu P-50, sběrač frakcí j CZ 302615 B6

FRAC-100, kontrolní jednotku GP-250 Plus a kolonu XK 26/100 s náplní Superdex 200 PG (Pharmacia). Kolona byla eluována PBS při průtoku I inl/min.

Příklad 3. Analýza polysacharidů

Stanovení molámí hmotnosti

Distribuce absolutní molární hmotnosti polysacharidů byla stanovena analytickou GPC s in—line připojenou ťotometrickou detekcí pomocí víceúhlového rozptylu laserového světla a diferenční reťraktometrickou detekcí (GPC-MALLS/RI). Tento postup byl proveden v chromatografickém systému pro kapalinovou chromatografií, který se skládal z HPLC pumpy Jasco PU-980 (Easton, MD), nástřikového ventilu Rheodyne model 7125 (Cotati, CA) a kolony Superose 6HR 10/30, ekvilibrované PBS při průtoku 0,5 ml/min. Mobilní fáze byla připravena v ultračisté vodě (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) a byla filtrována přes in—line připojený filtr o průměru 25 mm (Millipore), vybavený membránou Millipore typ GV 0,22 mm. Vzorky polysacharidů (1 až 2 mg) byly v mobilní fázi rozpuštěny na koncentraci 10 mg/ml a vzniklé roztoky byly v mikrozkumavce odstředěny 2 až 3 min při 14 000 ot/min. Cílem odstředění bylo odstranit mechanické nečistoty před nástřikem. Efluenty z kolony byly přímo analyzovány inline připojeným fotometrem mini DAWN s pevným tří úhlovým rozptylem laserového světla (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA), připojeným k diferenčnímu refraktometru, byl přiváděn do mini DAWN pres pomocný vstupní kanál. Získaná data o rozptylu byla zpracována pomocí Wyattova softwaru ASTRette a EASI. Plocha píku byla vypočítána pomocí Wyattova softwaru jako suma ploch 200 až 300 lichoběžníků nebo „kousků“, na které byl rozdělen celý pík. Z takto získané plochy byly vypočítány průměrná molekulová hmotnost a průměrná molámí hmotnost (M_w a M„) polysacharidu, eluovaného v daném píku. Specifický přírůstek refrakčního indexu (í/w/í/c), určený pro všechny polysacharidy pomocí on-line připojeného refraktometru HP 1047A, byl 0,140 ml/g. Tato hodnota byla srovnatelná s hodnotami, které byly dříve získány pro jiné polysacharidy (7, 8, 38).

NMR spektroskopie

Jednorozměrná 'HNMR spektra vzorků polysacharidů (4 až 5 mg/ml) v D2O (Aldrich) byla zaznamenána při 500 MHz na spektrofotometru AMX 500 (Bruker Instruments, Billerica, MA). Spektra byla získána při 50 °C a chemické posuny byly vztaženy na vnější standard 2,2,3,3-tetradeuterio-3-(trimethylsilyl)proptonát (Aldrich) v D₃Ó.

Chemické analýzy

Množství polysacharidů v efluentu z preparativní kolony a v přečištěných polysacharidech byl stanoven modifikovanou mikrometodou s použitím orcinolu, kterou popsali Reuter a Schauer (35) pro kyselinu sialovou. Stručně, 100 μΙ vzorku nebo kontroly, které obsahují 1 až 1,5 μg standardu NeuAc nebo až 300 pg/ml přečištěného kapsulárního polysacharidu bylo přidáno do 1,5 ml mikrozkumavky pro odstředění, ve které bylo 100μ1 orcinolového činidla (35). Vzorky byly dobře promíchány a povařený 15 min ve vroucí vodní lázni. Poté byly vzorky ochlazovány 5 min v ledové vodní lázni a pak bylo ke každému vzorku přidáno 500 μΙ isoamylalkoholu (Fluka Chemical Co., Ronkonkoma, NY). Vzorek byl důkladně promíchán a 2 až 3 min odstředěn v mikrozkumavce při 3000 ot/min. Tento postup byl opakován, aby byla zajištěna úplná extrakce chromoforu do alkoholu. Do nízkovazebné polystyrénové mikrotitrační destičky s 96 jamkami ve tvaru T (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) bylo převedeno 200 μΙ alkoholové fáze každého vzorku a poté byla destička změřena při 560 nm na zařízení pro čtení mikrotitračních destiček Molecular Devices Emax (Menlo Park, CA). Čistota konečných preparátů polysacharidů byla odvozena z obsahu kyseliny sialové pomocí následujících hmotností: 314,3 g/mol pro terminální zbytek NeuAc; 1004 g/mol pro opakující se jednotku CPS typu la, Ib nebo III; 1328 g/mol pro opakující se jednotku CPS typu II nebo V.

- 14CZ 302615 B6

Obsah proteinů byl stanoven u vzorků, obsahujících 1 až 2 mg kapsulárního polysacharidu v 1 ml v PBS, pomocí postupu podle Bradfordové (9) s použitím činidla Pierce Coomassie Plus a koňských IgG jako standardu. Obsah nukleových kyselin byl stanoven přímou (JV-fotometrií při 260 nm. Fotometrická měření při těchto stanoveních byla provedena na spektrofotometru Shimadzu model UV160U (Shimadzu Scientific Inst., Columbia, MD).

Příklad 4. Výtěžky

Výtěžky

Výtěžky kapsulárního polysacharidu, získaného z různých sérotypů streptokoků skupiny B, jsou ukázány v tab. 1. Pro všechny sérotypy byly výtěžky polysacharidu přečištěného z pelet buněk vyšší než ze supematantů kultury a pohybovaly se v rozmezí od 4 násobných výtěžků pro typ II do 60 násobných výtěžků pro typ lb. Výtěžky ze supematantu stejně tak jako z buněk jsou v tab. 1 pro srovnání udány jako miligramy polysacharidu na 1 litr kultury (mg/1). Jsou-li tedy uvažovány fermentace 14 litrů, pak se celkové výtěžky z buněk pohybovaly od 1,1 g pro typ la do 0,6 g pro typ II, přičemž celkové výtěžky ze supematantů se pohybovaly od 150 mg pro typ 11 do 14 mg pro typ lb. V případě, že byly zpracovávány buňky a supematant z fermentace typu III dohromady, byl výtěžek 63 mg/l nebo 0,9 g celkově podobný výtěžku, který byl získán v případě samotné pelety buněk. Různost mezi kmeny streptokoků skupiny B, studovaná prostřednictvím poměrů výtěžků kapsulárních póly sacharidů, získaných z buněk ku póly sacharidům ze supernatantů, naznačuje odlišné tendence sérotypů uvolňovat kapsulámí polysacharidy za daných růstových podmínek. Množství kapsulárních polysacharidů, spojených $ buňkou, které jsou přeci šťovány zde uvedeným postupem, se blíží množstvím, která je možno získat ze sád ko vých fermentací kmenů streptokoků skupiny B typ la, III, IV, V a VI a která lze odvodit od množství kyseliny sialové, vázané na buňku (je použita jako značka kapsulárního polysacharidu), jak uvedl von Hunoistein a kol. (39). Silnější extrakční podmínky (např. silnější báze, vyšší teplota nebo míchání extrakční směsi) by měly zvyšovat výtěžky kapsulárních polysacharidů, vázaných na buňku.

Tabulka 1

Výtěžky	kapsulárního polysacharidu streptokoka	skupiny B
S éro typ	Výtěžek ze supematantu (mg/l)^A	Výtěžek z pelety buněk (mg/l)^A
la	4	79
lb	1	64
II	11	42
nP	4	65
V	5	65

^A Výtěžky jsou vyjádřeny jako mg konečného přečištěného kapsulárního polysacharidu na 1 litr růstové kultury.

⁸ Jsou-li médium a buňky zpracovávány dohromady, je výtěžek ze streptokoka skupiny B typu III 63 mg/l.

- 15C7. 302615 B6

Výsledky

Analýza přečištěných polysacharidu

Pro každý studovaný sérotyp streptokoka skupiny B potvrdila jednorozměrná 'H NMR spektrometrie preparátů polysacharidu zobou zdrojů jejich identitu s dříve publikovanými spektrálními daty pro odpovídající typy polysaeharidů (41, 44). NMR spektra všech těchto preparátů také naznačují velmi nízké hladiny kontaminace. Reprezentativní NMR spektra pěti polysaeharidů streptokoka skupiny B jsou ukázána na obr, I až 5. Množství nukleových kyselin, detekované io přímou UV fotometrií při 260 nm, nepřekročilo I hmotn. %, zatímco protein, stanovovaný metodou podle Bradfordové (9), nebyl detekován v žádném preparátu polysacharidu v množství vyšším než je spodní detekční limit této metody (1 μ£/πι1). Čistoty všech polysaeharidů, spočítané z obsahu kyseliny sialové, která byla stanovena pomocí mikrometody s orcinolem (35), byly asi 100%. Pro všechny preparáty polysaeharidů, získané výše popsaným způsobem, jsou tudíž spektrální a fotometrická data v souladu s vysoce přečištěnými kapsulárními polysacharidy s minimální kontaminací proteiny a nukleovými kyselinami.

Velikost molekuly polysaeharidů

2o Relativní eluční objemy (jako K_av) polysaeharidů, přečištěných na koloně Superose 6, odečtené ze záznamů GPC s RI detekcí ve vrcholu píku, jsou uvedeny v tab. 2.

V jednotlivých analýzách byly stanoveny absolutní molární hmotnosti polysaeharidů pomocí GPC-MALLS/R1. Tato metoda umožňuje přímý odhad molární hmotnosti makromolekul nezávisle na chromatografických parametrech jako je průtoková rychlost a retenční objem a aniž by byly třeba sekundární standardy, jejichž hydrodynamické vlastnosti se mohou velmi lišit od vlastností analytu, který je testován. GPC MALLS/Rl byla ustanovena jako metoda pro charakterizaci v případě polysaeharidů, které jsou předmětem zájmu ve farmaceutické oblasti (7, 8, 10, 17, 25). Distribuce molárních hmotností jsou obvykle uváděny jako průměrné molekulové hmot3o nosti (M_w) a jako polydisperzita (M_W/M_N), což naznačuje rozsah distribuce. Zatímco polydisperzita určuje jednotnost, rozložení molámí hmotnosti určuje homogenitu.

Údaje o molární hmotnosti přečištěných polysaeharidů streptokoka skupiny B jsou uvedeny v tab. 2. Pro každý sérotyp byla rozložení molární hmotnosti preparátů polysaeharidů z obou zdrojů podobná. Průměrné molekulové hmotnosti těchto preparátů se pohybují v rozmezí 92 kg/mol pro kapsulámí polysacharidy, spojené s buňkou, z typu V do 318 kg/mol pro kapsulámí polysacharidy typu la, přečištěné ze supernatantu kultury. Distribuce pro všechny preparáty jsou úzké, což naznačují nízké hodnoty jejich polydisperzity (Mw/M_N < 1,6). Tyto hodnoty byly srovnatelné s hodnotami, které byly získány podobnými analýzami kapsulárních polysaeharidů několika séro40 typů S. pneunwniae a Haemophilus injluenzae typ b (7, 17).

- 16CZ 302615 B6

Tabulka 2

Biochemická a biofyzikální charakterizace přečištěných kapsulámích polysacharidů streptokoka skupiny B
Sérotyp	K_av	M_w (kg/mol)^A	Polydisperzita M_w/M_n	Obsah nukleových kyselin (%)	Obsah proteinů. (%)
laíS)“	0,005	318	1,35	0,23	0,21
Ia(C)^c	0,010	311	1,31	0,15	<0,01
Ib(S)	0,191	170	1,20	0,95	<0,01
Ib(C)	0,150	218	1,61	0,33	<0,01
Π (S)	0,152	246	1,46	0,13	<0.01
Π (C)	0,115	289	1,46	0,12	<0,01
ΙΠ (S)	0,343	NS	NS	0,58	<0,01
ΙΠ (C)	0,268	108	1,24	0,10	<0,01
III (S+C)	0,272	104	1,22
V(S)	0,257	92	1,28	0,26	0,27
V(C)	0,156	179	1,15	0,17	0,09
V(C)	0.241	99	1,20

^A molámí hmotnost byla stanovena GPC-MALLS/Rl ^B (S) označuje polysacharid přečištěný ze supematantu ^c (C) označuje polysacharid přečištěný z pelety buněk

Podle NMR spekter molámí hmotnosti naznačují, že u každého sérotypů jsou rozdíly mezi polysacharidy, které byly přečištěny ze supematantu nebo z pelet buněk (stejnějako z obou kombinovaných zdrojů u typu III) nevýznamné. Protože NMR spektra preparátů každého sérotypů naznaio čují, že jsou chemicky identické, předpokládá se také stejné imunochemické chování těchto preparátů. Rozhodnutí, zda při extrakci kombinovat supematant s buňkami proto tudíž záleží pouze na příspěvku k výtěžku, kterýje očekáván ze supematantu (tab. 1). Z tohoto důvodu může být použití kombinovaného extraktu typu II výhodnější.

Příklad 4. Imunochemícká analýza Kompetitivní inhibice ELISA

Mikrotitrační destičky (Nunc Polysorp) byly pasivně potaženy buď GBSP_)a-HSA, GBSP_tb~HSA, GBSPu-HSA, GBSPni-HSA nebo GBSPy-HSA (lOOng polysacharidu ve 100 μΐ pro každou jamku), které byly rozpuštěny vPBS(50nM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH = 7,4). Potahování probíhalo 1 h při 37 °C, poté byly destičky promyty PBS + 0,05% Tween 20 (PBSTween, pH - 7,4), poté byly blokovány 150 μΙ/jamku roztokem PBS sO, 1% BSA. Po tomto sekundárním potažení byly destičky opět promyty a skladovány až do dalšího použití při 4 °C.

Králičí anti séra proti celým buňkám Streptococcus skupiny B proti GBSP_[a, GBSP₍b, GBSPn, GBSPm (Dennis Kasper) byla jednotlivě titrována na destičky, potažené GBSPj_a-HSA, GBSPfb-HSA, GBSPu-HSA, GBSPmHSA. Podobně bylo králičí antisérum proti GBSPyTT

- 17 CZ 302615 Bň titrováno na destičku potaženou GBSP_V-HSA. Pro inhibiční studie bylo vybráno jako vhodné ředění, odpovídající asi 50 % maximálního signálu.

Antiséra byla zředěna PBS-Tween. Inhibitory byly zředěny 5 krát v po sobě následujících ředěních pufrem, obsahujícím zředěná antiséra. Do jamek potažené mikrotitrační destičky bylo duplicitně pipetováno 100 μΙ těchto vzorku a destička byla inkubována při laboratorní teplotě 1 h. Poté byla promyta a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ konjugátu kozlích protilátek proti králičím a křenové peroxidázy (Kirkegaard & Perry), který byl rozpuštěn v roztoku PBS-Tween podle návodu od výrobce. Destičky byly inkubovány při laboratorní teplotě a poté byly znovu promyty. Do každé jamky bylo pipetováno 100μ1 substrátu TMB (k.č. 50-76-04, Kirkeggard & Perry). Reakce byla zastavena po 5 min přídavkem 100 μΐ jednosložkového roztoku (k.č. 50-85-04, Kirkeggard & Perry) a byla změřena absorbance při 450 nm. Inhibice byla stanovena jako procento maximálního signálu, kterého je dosaženo u zředěného antiséra bez přítomnosti jakéhokoliv inhibitoru.

Výsledky

Vazebně inhibiční křivky pro každé specifické antisérum la, Ib, II, III, V s odpovídajícími homolognímí kapsulárními polysacharidovými antigeny jsou ukázány na obr. 5 až 10. Jak je vidět z těchto křivek, měl každý PS antigen, jestliže byl extrahován ze supernatantů kultury nebo kultivačního média, podobné inhibiční vlastnosti, které naznačují jejich antigenní rovnocennost. Postup, používaný pro získání těchto kapsulámích polysacharidů, tedy negativně neovlivňuje jejich antigen icitu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čištění kapsulárního polysacharidů od buněčných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií, vyznačující se tím, že při čištění se

a) extrahuje kapsulární polysacharid z buněčných komponent kontaktováním izolovanými bakteriálními buňkami, koncentrovanými bakteriovými supematanty z homogenizovaných bakteriových buněk či podmíněného prostředku, či peletovaných buněk s bazickým činidlem pri pH v rozsahu 9 až 14 a (b) odděluje extrahovaný kapsulární polysacharid od nečistot vyplývajících z buněčných komponent; přičemž uvedené nečistoty zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající se z proteinů a nukleových kyselin.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že určité procento A-acetylskupin, přítomných v kapsulárním polysacharidů, které jsou během extrakce hydro lyžovány, je poté dostatečně reacylováno, aby byly zachovány imunogenní vlastnosti kapsulárního polysacharidů.
3. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m , že se dále:

a) případně separuje kapsulární polysacharid od jiné buněčné komponenty pomocí chromatografie;

b) reaguje s kapsulárním polysacharidem z kroku a) s acylačním činidlem:

c) prečišťuje kapsulární polysacharid z kroku b) pomocí chromatografie.

- 18 CZ 302615 B6
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije bazické Činidlo jehož pHje 12.
5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije kapsulární polysacharid, který je odvozen od bakterie rodu Streptococcus.
6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije kapsulární polysacharid, který je odvozen od bakterie rodu Streptococcus skupiny B.
7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije kapsulární polysacharid odvozený od bakterie rodu Streptococcus skupiny B typ la, lb, II, 111 či V.
8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije bazické činidlo obsahující organickou bázi.
9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije bazické činidlo obsahující anorganickou bázi.
10. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije bazické činidlo obsahující NaOH, KOH nebo LiOH.
11. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije chromatografie ký separační krok, kterým je chromatografie s hydrofobní interakcí.
12. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije acylační činidlo aeetanhydrid, acetyIchlorid, pentafluorfenylacetát nebo 4-nitrofenvl acetát.
13. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije kapsulární polysacharid přečištěný chromatograficky ge lovou permeační chromatografii.
14. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije bazické činidlo obsahující anorganickou bázi, chromatografická separace je uskutečněna chromatografii s hydrofobní interakcí, acylační činidlo je aeetanhydrid, acety Ichlorid, pentafluorfenylacetát nebo 4-nitrofenylacetát a kapsulární polysacharid je přečištěn gelovou permeační chromatografii.
15. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se použije bazické činidlo obsahující NaOH, chromatografícký separační krok zahrnuje kolonu Phenyl Sepharose, acylační činidlo je aeetanhydrid.
16. Modifikovaný kapsulární polysacharid v podobě vakcíny, získaný způsobem zahrnujícím:

(a) extrahování kapsulámího polysacharidu z buněčných komponent kontaktováním izolovanými bakteriálními buňkami, koncentrovanými bakteriálními supernatanty z homogenizovaných bakteriálních buněk či upraveného média, či peletovaných buněk s bazickým činidlem při pH 9 až 14, a (b) oddělování extrahovaného kapsulámího polysacharidu od nečistot vzniklých z buněčných komponent, aby získaly modifikovaný kapsulární polysacharid; kde uvedené nečistoty zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z proteinů a nukleových kyselin.
17. Modifikovaný kapsulární polysacharid podle nároku 16, vyznačující se tím, že se použije modifikovaný kapsulární polysacharid, který je dále acylovaný acetanhydridem a pak přečištěn chromatografícký pomocí gelové permeační chromatografie.

- 19CZ 302615 B6
18. Modifikovaný kapsulární polysacharid podle nároku 17, vyznačující se tím, že se použije modifikovaný kapsulární polysacharid získaný z rodu Streptococci.
19. Modifikovaný kapsulární polysacharid podle nároku 18, vyznačující se t í m , že se použije modifikovaný kapsulární polysacharid získaný ze Streptococci skupiny B.
20. Kapsulární polysacharid CPS v podobě vakcíny, kde CPS je odvozen z typu la, lb, II, 111 či V skupina B streptococcal bakterie získaný způsobem zahrnujícím úpravy kompozice zahrnující skupinu B streptococcal kapsulárního polysaeharidu a nukleové kyseliny a/nebo protein s bazickým Činidlem a oddělováním Čištěného kapsulárního polysaeharidu, kde

CPS typu la má: K_av v rozmezí 0,010 až 0,005

M_w v rozmezí 318 až 311 kg/mol M_u/M_n v rozmezí 1,35 až 1,31

CPS typu lb má: K_;iV v rozmezí 0,191 až 0,150

M_w v rozmezí 218 až 170 kg/mol M_w/M_n v rozmezí 1,61 až 1,20

CPS typu II má: K_av v rozmezí 0,152 až 0,115

M_w v rozmezí 289 až 246 kg/mol M_w/M_n 1,46

CPS typu III má: K_av v rozmezí 0,343 až 0,268

M_w v rozmezí 108 až 104 kg/mol M_w/M„ v rozmezí 1,24 až 1,22

CPS typu V má: K_)v v rozmezí 0,257 až 0,156

M_w v rozmezí 179 až 92 kg/mol M_w/M_n v rozmezí l ,28 až l, 15
21. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kapsulární polysacharid podle nároku 20 a farmaceutický přijatelný nosič.
22. Farmaceutický prostředek podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije kapsulární polysacharid konjugovaný k proteinu.
23. Farmaceutický prostředek podle nároku 21 nebo 22, dále zahrnující fyziologicky přijatelné látky zvyšující účinek antigenu.
24. Použití farmaceutického prostředku uvedeného v nároku 21 až 23 pro přípravu kompozice vakcíny pro imunizaci savců.
25. Způsob přípravy konjugované polysacharidové vakcíny, vyznačující se tím, že se (a) čistí kapsulární polysacharidy odvozené od grampozitivních či gramnegativních bakterií způsobem podle nároku I, (b) konjuguje takto čištěný polysacharid k bílkovině.
26. Způsob podle nároku 25, v y z n a č u j í c í se t í m , že se konjugace provádí uvedením terminálových aldehydových skupin do kapsulárního polysaeharidu přes oxidační rozštěp vicinálních diolů v kapsulámím polysaeharidu, a potom se konjuguje terminálová aldehydová skupina k polypeptidovým aminoskupinám pres reduktivní aminaci.

-20CZ 302615 B6
27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid je odvozený z N. meningitidis typu C a je po extrakci s acylačním činidlem převeden do formy V-acylovaného kapsulámího polysacharidu N. meningitidis typu C, přičemž V-acylovaný kapsulární polysacharid odvozený z N. meningitidis typu C je oxidován okysličovadlem na oxidační štěpení vicinálních diolů, aby produkovaly terminálové aldehydové skupiny, a přičemž uvedené terminálové aldehydové skupiny jsou konjugované k aminoskupinám polypeptidů přes redukční aminaci.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že se dále odděluje de-V-acetylovaný polysacharid a izoluje znovu-acylovaný produkt.
29, Konjugovaná vakcína polysacharid-protein, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič;

konjugát polysacharid-protein, kde konjugát polysacharid-proteinu je získaný (a) extrahováním kapsulámího polysacharidu z buněčných komponent grampozitivních či gramnegativních bakterií kontaktováním izolovanými bakteriálními buňkami, koncentrovanými bakteriálními supematanty z homogenizovaných bakteriálních buněk či upraveného média, či peletováných buněk s bazickým činidlem při pH 9 až 14, (b) oddělováním extrahovaného kapsulámího polysacharidu od nečistot vzniklých z buněčných komponent; kde uvedené nečistoty zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající se z proteinů a nukleových kyselin; a (c) konjugováním takto čištěného polysacharidu a polypeptidů.