JPH06508346A - インフルエンザ菌に対するアドヘシン−オリゴ糖複合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３５、請求の範囲第３４項ｇ己載の形質転換された細胞によって産生された組換 えたん白質。

３６、インフルエンザ薗アトへシンたん白質を産生する方法において。

前記形質転換された細胞において前記ＤＮＡ配列の発現をもたらす能力のある、 適切な制御調節核酸配列に操作的に結合されたインフルエンザ薗アトへシンたん 白質をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列によって形質転換された宿 主細胞を培養するステップと、 前記配列によってその発現がコード化されたたん白質を回収するステップと、を 含む産生方法。

３７、次の化学式で表される合成ＰＲＰオリゴ糖であり、ここにおいて、ｎは２ 〜３０の！１数、Ｒ１は（ＯＨ：ｌ　、ＣＨＯまたは（ＣＨ７ＣＨｐｏ　ｌ　、 ＣＨｙｃ　Ｈ７Ｎ　Ｈ、テ、ｐは１〜３の整数。

３８、請求の範囲第３７項記載の合成ＰＲＰオリゴ塘を含む物質の組成にお（１ て、前君己オリゴ糖のすべてが、同一数の単量体単位体を有する組成。

３９、次の化学式によって表される化合物であり、二二において、Ｂｎはベンジ ル、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである。

４０、次の化学式によって表される化合物であり、ここにおいて、Ｂｎはベンジ ル、Ｒ；はｆｃＨ：）、ＣＨ（ＯＲ３１２または（ＣＨｘｃＨｙｏ）−ＣＨｔＣ Ｈ２Ｒ’で、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基である。

４１、次の化学式によって表される化合物であり、二二において、ｎは２〜３０ の整数、Ｂｎはベンジル、Ｒは（ＣＨｊ　、ＣＨ（ＯＲ’）　ンまたは（ＣＨ， ＣＨ；０１　、ＣＨ，ＣＨ，Ｒ’で、ｐは１〜３、Ｒ１は炭素１〜４個分の長さ のアルキル基、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基である。

４２、請求の範囲第４１項記載の化合物を合成する方法において、（ａｔ　Ｂｎ がベンジル、ＭＭＴｒがモノメトキシトリチルである、次の化学式で表される化 合物を固相にカップリングさせるステップと、（ｂｌ前記化合物を脱トリチル化 するステップと、ｆｃｌ前記前記リチル化した化合物を、Ｂｎがベンジル、ＭＭ Ｔｒがモノメトキシトリチルである、次の化学式で表される化合物とカップリン グさせるステップと、 （ｄｌステップ（ｃｌがも生成する化合物を脱トリチル化するステップと、ｔｅ ｌステップ（Ｃ）および（ｄ）をｎ−２回反復するステップと。

げ）ステップ（ｅｌから生成する化合物を、Ｂｎがベンジル、Ｒ・が（ＣＨ，） 、、ＣＨ（ＯＲ’ｌ　；または（ＣＨ；ＣＨ７０１ｒＣＨ；ＣＨ：Ｒ４で、ｐが １〜３、Ｒ３が炭素１〜４１分の長さのアルキル基、Ｒ４がアミノ基に変換可能 な基である、次の化学式で表される化合物とカップリングさせるステップと、（ ｇ）生成した化合物のホスホネート基を酸化してリン酸基を形成するステップと 、 （ｈｌ生成した化合物を前記固体支持体から除去するステップと、を含む合成方 法。

４３、請求の範囲第３７項記載の合成ＰＲＰオリゴ糖を合成する方法において、 請求の範囲第４１項記載の化合物を水素化するステップと、Ｒ）が（ＣＨ；ｌ　 、ＣＨ（ＯＲ’）；である場合、水素化した化合物を選択的酸加水分解に供する ステップと、 を含む合成方法。

４４、請求の範囲第９項記載の、ＲがｆｃＨン）、ＣＨ）ＮＨである複合体を合 成する方法において、請求の範囲第３７項記載の、Ｒ１が（ＣＨｊ　、ＣＨＯで ある合成ＰＲＰオリゴ塘を、請求の＠囲第９項記載のたん白質と、還元アミノ化 によりてカップリングさせるステップを含む合成方法。

４５、請求の範囲第９項記載の、Ｒが（ＣＨｐ　ＣＨ２０）　、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ 　ＨＣＳ　ＮＨである複合体を合成する方法において、請求の範囲第３７項記載 の、Ｒ１が（ＣＨ，ＣＨ・Ｏ）、ＣＨ，ＣＨ，ＮＨ，である合成ＰＲＰオリゴ糖 を、活性化チオカルボン酸誘導体と反応させ、対応するイソチオシアネートを合 成するステップと、 前記イソチオシアネートを請求の範囲第１０項記載のたん白質とカップリングさ せるステップを含む合成方法。

４６、哺乳動物をインフルエンザ園に対して保護するワクチンにおいて、免疫学 的に有効な量の請求の範囲第１項記載の複合体を、薬剤学的に容認されるキャリ ヤ内に含むワクチン。

４７　＠乳動物をインフルエンザ菌に対して保護するワクチンにおいて、免疫学 的に有効な量の請求の範囲第９項記載の複合体を、薬剤学的に容認されるキャリ ヤ内に含み、ｎおよびｐは、酊記複合体のすべてについて同一であるワクチン。

４８、ＤＪｉ乳動物をインフルエンザ菌に対して保護するワクチンにおいて、免 疫学的に有効な量の請求の範囲第１ｏ項記載のたん白質を、薬剤学的に容認され るキャリヤ内に含むワクチン。

４９、インフルエンザ菌アトへシンたん白質を含む融合たん白質を含む免疫原性 ポリペプチド。

５０、免疫学的に有効な量の請求の範囲第３５項記載の組換えたん白質を薬剤学 的に許容されるキャリヤ内に含むワクチン。

５１、哺乳動物においてインフルエンザ閑に対する免疫応答を誘発する方法にお いて、免疫学的に有効な量の請求の範囲第１項記載の複合体を前記動物に投与す ることを含む免疫応答誘発方法。

５２．０１乳動物においてインフルエンザ園に対する免疫応答を誘発する方法に おいて、免疫学的に有効な量の請求の範囲第１０項記載のたん白質を前記動物に 投与することを含む免疫応答誘発方法。

明細書 インフルエンザ菌に対する アドヘシンーオリゴ糖複合ワクチン １東肢勇 本申請は、１９９０年１２月２１日に８見出し、全文が引用されて添付の参考文 献に含まれる米国特許出願第０７／６３１，６９８号の継続中の申請である。

本発明は一般にインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚ ａｅ）に対するワクチンに関連する。特に、本発明はｂ型インフルエンザ菌の多 糖被膜のフラグメントに対応する合成オリゴ糖がインフルエンザ薗アトへシンた ん白質に結合された複合ワクチンに関する。本ワクチンは、ヒト、特に生後間も ない乳児、およびその他の哺乳動物の侵襲性および非侵襲性のインフルエンザ菌 の感染に使用することができる。

インフルエンザ菌（Ｈｌ）は、多糖被膜を有する菌株と有していない菌株の２詳 に分類される。、被包性の菌株は、対照抗血清との被膜の血清反応によって分類 される。いずれの対照抗血清とも反応しない非被包性の菌株は、分類不能なもの として知られている。

１−１　ｉは全世界的に深刻な健康問題である。ｂ型菌株（ＨｉｂｌはＨｉｌ１ 株のうち最も悪性で、５癩以下の小児において、髄膜炎、急性喉頭蓋炎、その他 の生命に関る感染を引起す。ｂ型髄膜炎による死亡率は、最良の現代の抗生物貿 治療によっても約５％であり、神経学的な後遺症が、生存者の２５〜３５％程度 に奴察される。事実、ｂ　型１１１ｆｍによって引起される細菌性の髄膜炎は、 米国において後天性精神遅滞の主要原因となっている。こうしたことから、世界 像１１！機構はＨｉｂに対する有効なワクチンの開発を優先事項とした。

分類不能Ｈ１もまた、肺炎、菌血症、髄膜炎、産後敗血症、気管支炎、静脈濃炎 、結膜炎、中耳炎などの様々な疾病を引起す。分類不能Ｈ１は、小児および若年 成人におけるすべての中耳炎の約２０〜４０％の原因となっている。慢性または 再発性の中耳炎に対する現在の治療法は、一般に抗生物質の投与である。感染は 持続性の免疫を与えないため、小児は複数の感染を経験する。

インフルエンザ園に対して真に有効なワクチンを見出すために、非常に多くの時 間、費用、努力が賛やされてきた。非常に年少の小児に対する重大な脅威のため 、Ｈｉｂに対するワクチンの開発に圧倒的に焦点が置かれてきた。残念ながら、 承認されたｂ型多糖ワクチンは１８ケ月未満の乳児に対しては有効でないが、こ れはＨｉｂによる脅威が最も大きい群である。

ｂ型の被膜に対する抗体が、髄膜炎を含む侵襲性のＨｉｂ感染に対して個体を保 護することが長年に渡って知られていた。フィンランドにおける無作為の二重盲 検臨床試験において、ｂ型多糖ワクチンは、２４〜７２ケ月の間に免疫化された 小児において発症している疾病で、９０％有効であることが明かとなった。しか しながら、本ワクチンは１８ケ月未満の小児においては防御免疫を与えず、１８ 〜２３ケ月の小児においては限定された免疫を与えただけであった。Ｐｅ１ｔｏ ｌａら。

Ｎ、　Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１０：　１５６１−＋５６６　（１９ ８４）。ｂ型多糖はＴ４１１１１１非依存型免疫応答を引起すが、恐らくこれが 年少の小児における低免疫厘性の原因と考えられる。

これらのデータに基づき、１９８５年に米国で３種類のｂ型多糖ワクチンが認可 され、２４〜６０ケ月の小児においての使用が推奨された。これらのワクチンは 明らかに大きな問題を有している。これらは、インフルエンザ菌疾患に最も５Ｕ ｃｃｅｐｔｉｂｌｅな２４ケ月未満の小児を適切に保護しない。

多糖が天然原料から得られるという事実に関連した他の問題がある。精製されて も、多糖フラグメントは様々な長さのものであり、したがって所属どおりにはよ く特性付けできない。これにより、再現性および一定しない力価に関して問題を 起す。また、天然に存在する多糖は病原体から単離しなければならないため、ワ クチンの製造および使用の双方に関して安全性の考慮がなされなければならな多 糖をより良い免疫原に変える試みがなされてきた。これらの多糖またはフラグメ ントは、ジフテリアトキソイドあるいは破傷風トキソイドといった様々な免疫属 性たん白質に共有結合されてきた。たとえば、１９８７年７月１６日にＡｎｄｅ ｒｓｏｎに発行された米国特許第４，６７３，５７４号、１９８９年２月２８日 に八〇ｄｅｒｓｏｎらに発行された米国特許第４，８０８．７００号、１９８７ 年１１月１１日付けの欧州特許庁文書第０　２４５０４５号、１９８４年１月１ ８日付は欧州特許庁文書第０　０９８　５８１号を参照のこと。これらはすべて 、添付の参考文献に含まれている。

複合ワクチンのうちのいくつかは、小児、特に乳児において、安全で、従来の多 糖ワクチンよりもより免疫原性が高いことが示されてきた。データは、複合ワク チンがＴ細胞依存型抗原として機能していることを示唆している。Ｔ細胞依存型 反応は、患者においてより良い総合的な免疫応答を与える。複合ワクチンの１つ は、米国において１５〜１８ケ月の小児に対して認可された。複合ワクチンのう ちの２つは、米国において２ケ月の乳児に対して認可された。

現在開業医が入手できるワクチンには、いくつかの大きな制限がある。第１に、 これらはＨｉｂ以外のＨ１感染に対しては保護しない。多糖は分類不能インフル エンザ菌には見出されず、したがって、多糖に対する抗体はこれらの株に対して は非防御的である。第２に、再現性、力価、安全性に関して問題を引起す。

これらの制限を克服する方法について進行中の研究がいくつかある。１つの方法 は、Ｈｉ　ｂ多糖合成の処理を開発することであった。Ｈｉｂ被膜は、次の化学 式で表される、ホスホジエステル結合によって結合されたリポースとりビトール の分子が交互に続く直線のホモポリマーから成る。

このポリマーはポリリボシルリビトールホスフェートとして知られ、ＰＲＰと省 略される。

天然原料から得られるＰＲＰは素分解多糖である。これは分子量が２００ＫＤか も２００，０ＯＯＫＤと一様でない。

少数のグループが小さいＰＲＰオリゴ糖を合成することができる。たとえば、添 付の参考文献に含まれる１９８９年７月２１日付けの欧州特許庁文書第０３２０ ９４２号は、２〜２０個の単位体の合成ＰＲＰオリゴ糖の合成と、これらの、免 疫たん白質、具体的には破傷風毒素または破傷風トキソイド、あるいはジフテリ ア青票またはジフテリアトキソイドへの共有結合を開示している。オリゴ糖はス ペーサによってたん白質に結合される。このオリゴ糖重合には、亜リン酸トリエ ステル合成法が用いられる。添付の参考文献に含まれる１９８８年８月３日付け の欧州特許庁文書第０　２７６　５１６号はまた、モノマー２〜２０１分の長さ の合成ＰＲＰオリゴ糖と、これらのキャリヤたん白質への結合と、Ｒｌｂに対す る複合体の使用とを開示している。オリゴ糖は、オリゴ糖鳳合にリン酸トリエス テル合成法を用いて合成される。これらは双方とも、ＰＲＰオリゴ糖の合成に溶 解性合成技法をａ１要とした。

添付の参考文献に含まれる、Ｈｉｅら、　Ｒｅｅｌ、　Ｔｒａｖ、　Ｃ１ｍ、　 Ｆ’ａ　５−Ｂａｓ、　１０８：　２１９−２２３　（１９８９）は、ＰＲＰヘ キサマーの固相合成を開示している。これらの単位体は、亜リン酸トリエステル 法と、固体支持体として制限的ボアガラスを使用して結合される。

合成ＰＲＰフラグメントの使用は、天然原料から得られるＰＲＰに対していくつ かの利点を提供する。合成ＰＲＰは、化学的に明確に定義され、特性付けされる 。すぐれた品質であり、ヒトにおいて副作用を起す傾向が低い。合成ＰＲＰの使 用は、天然原料から得られたＰＲＰに伴う再現性、力価、安全性に関する問題を 取除く。さらに、天然に存在するＰＲＰは、一般にたん白質のキャリヤにＰＲＰ 鎖に沿ったランダムな点で架橋されているが、合成ＰＲＰは単一の点で結合する ことができ、より有害性の低いエピトープを生成する。

この研究は現存するワクチンの改善を約束するものであるが、依然として欠点が ある。第１に、ＰＲＰ合成が複雑で、比較的効率が悪い。従って、合成法の改善 に対する必要性がある。第２に、これらの改善はＨｌｂに対するワクチンに限定 されてしまう。

別の方法では、焦点がたん白質に当てられてきた。複合ワクチンのたん白質と炭 水化物の部分が独立した抗原として作用することを示唆するデータがいくつかあ る。したがって、免疫原性の亢進を模索する上で、たん白質複合体の選択が重要 になる。′意味のない”たん白質からよりも、インフルエンザ菌由来の免疫原性 たん白質またはポリペプチドをたん白質複合体として得ることがより望ましい。

少なくとも１つのグループがＨｌｂの膜外に存在するたん白質をＰＲＰフラグメ ントに結合させている。添付の参考文献に含まれる１９８９年１０月２５日付け の欧州特許庁文書第０　３３８　２６５号を参照のこと。この申請書は、３８Ｋ Ｄと４０ＫＤのＨｉｂの膜外に存在するたん白質と、これらの単離および精製を 開示している。２つのたん白質は極めて類似している。これらは１対となって存 在するため、プロティン２　（Ｐ２）またはプロティンｂ　／　ｃとして知られ ている。

分子量は、これらが得られた菌株によって異なる。これらは交差反応性で、非常 に良く似たアミノ酸組成を有し、同一のアミノ末端およびカルボキシ末端配列を 有している。たん白質は、還元アミノ化反応によってＰＲＰフラグメントに結合 される。ＰＲＰフラグメントは、標準的な技法を使用して、天然に存在するＰＲ Ｐから得られる。この申請書は、キャリヤたん白質自体が免疫を与えると述べて いる。

この方法にもある限界がある。膜外に存在するのたん白質は、Ｈｉｂの種類の中 、あるいは特定の種類の中の血清型で異なる。Ｇｒａｎｏｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、 、　ｉｎ　Ｓ、Ｈ，５ｅｌｌ　ａｎｄ　Ｐ、Ｆ、　Ｗｒｉｇｈｔ　（ｅｄ、）、 　１月」虫ｕ」−Ｉ−ｎｆｌｕｅｎｚａｅ：　ｉ、ｐ−道垣知如９電〕ｌ辿１邸 Ｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　（１９８２））。したがって、■ 定の膜外に存在するたん白質に基づくワクチンは、病原性インフルエンザ菌の広 域抗菌スペクトラムについては有効でなく、Ｈｉｂのすべての菌株に対しては有 効でない。

別の研究者は、ワクチンの候補としてＨｉのたん白質およびペプチドだけに焦点 を当てている。たとえば、添付の参考文献に含まれる１９９０年３月２２日発行 のＰＣＴ文書第Ｗ０９０１０２５５７号を参照のこと。この申請書は、抗原的に 関連のある分子量約１６ＫＤの、Ｈｉの膜外に存在する２つのたん白質を開示し ている。この申請書はさらに、膜外に存在するたん白質の類縁融合たん白質とペ プチドフラグメントと、これらのたん白質の精製方法と、遺伝子工学によってこ れらを作る方法とを開示している。これらのすべてがワクチン中の免疫原として 有用であると述べられている。このようなワクチンも、直前で述べた欠点を有す る。

明らかに、侵襲性および非侵襲性の双方のインフルエンザ菌に対し、特に２〜６ ケ月の乳児において有効で、安全なワクチンに対する必要性が高まっている。

この理想的なワクチンは、はとんどまたはインフルエンザ菌のすべての菌株の表 面に見られる決定基に対して抗体を発現することにより、２種類のそれぞれの様 々な菌株に対しても有効である。

本発明は、現存する技術の限界を克服し、必要性を満たす。本発明は、新たに単 離され、精製されたインフルエンザ菌アトへシンたん白質に結合された新規の合 成ＰＲＰを提供する。

インフルエンザ菌に対するワクチンにアトへシンたん白質を使用する技能は非常 に望ましい。これらの作用方式から、アトへシンたん白質は、細菌の特定の種類 の菌株の中で高度に保存されていると考えられる。これは、これらのたん白質が 、細菌を宿主細胞に結合させることによって感染プロセスの初期段階である付着 を仲介するたん白質分子だからである。こうしたことから、アトへシンはインフ ルエンザ菌のすべての菌株（被包および非被包の双方）に存在することが予想さ れる。したがって、本ワクチンは広範囲のＨｉの種類および菌株に対して有効で ある。さらに、アトへシンたん白質に基づくワクチンは、他の膜外に存在するた ん白質に基づいたワクチンに比べ、膜外に存在するたん白質が由来している細菌 株に対しても、より有効である。アトへシンたん白質に対する抗体は、細菌の宿 主動物の組織への付着を妨げる。付着はＨ１感染の初期段階である。この点で感 染を停止するのが、可能性のある最良の方法である。

本発明の新規ＰＲＰは、現存の技術に対しても利点がある。本発明の新規ＰＲＰ はより明確で特性化でき、天然原料から得られたＰＲＰに比較した場合、すぐれ た８買である。また、前述の合成ＰＲＰよりもより効率的に生産される。

発見じＪ」要 本発明の目的は、免疫原性オリゴ糖−インフルエンザ菌アトへシンたん白質複合 体と、その合成方法とを提供することである。

本発明の他の目的は、インフルエンザ菌に対して哺乳動物を保護するワクチンを 提供することである。

さらに、本発明のたの目的は、哺乳動物において、インフルエンザ菌に対する免 疫応答を誘発する方法を提供することである。

さらに１本発明の目的は、精製インフルエンザアドヘシンたん白質を提供するこ とである。

さらに、本発明の目的は、動物宿主においてインフルエンザ菌に対する抗原応答 を発現する能力のあるｇ製ポリペプチドを提供することである。

本発明の他の目的は、精製インフルエンザ菌アトへシンたん白質を生成する方法 を提供することである。

さらに、本発明の目的は、アトへシンたん白質および誘導ポリペプチドに対する ＤＮＡ暗号と、ＤＮＡを含むベクタターと、このようなりＮＡおよびベクターに よって形質転換された微生物と、これらの物質を合成する方法を提供することで ある。

さらに、本発明の目的は、同一数の単量体の単位体を有する合成ＰＲＰオリゴ塘 を本質的に含む物質の組成と、合成Ｐ’ＲＰを合成する方法とを提供することで ある。

本発明の他の目的は、合成ＰＲＰの合成において、中間体として有用な化合物と 、このような化合物を合成する方法を提供することである。

本発明の他の目的および利点は、以下の説明に一部説明されており、この説明か ら一部明らかになり、あるいは本発明の実施によって理解される。本発明の目的 および利点は、添付の請求項において特に指摘された手段および組合せによって 達成される。

これらの目的を達成し、ここに具体化し、大まかに説明したように、本発明の目 的に従い、本発明は、インフルエンザ菌に対して哺乳動物を保護するワクチンに 有用な、免疫属性オリゴ塘−たん白質複合体を提供する。本複合体は、インフル エンザ菌アトへシンたん白質に結合されたＰＲＰフラグメント、好適には、合成 オリゴ糖を含む。好適には、オリゴ糖は２〜３０個のりボシルリビトールホスフ エートを含み、このようなオリゴ糖の１〜３０個がたん白質に結合されている。

別の実施態様においては、オリゴ糖は、アトへシンたん白質の活性部位であるポ リペプチドに結合される。

好適には、複合体は次の化学式で表される。

ここで、ｍは１〜３０、ｎは２〜３０、Ｒは（ＣＨ２）、ＣＨ２ＮＨまたは（Ｃ Ｈ２ＣＨ２０）　−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ　ＨＣＳ　Ｎ　Ｈで、ｐは１〜３の整数、Ｘ はインフルエンザ菌アトへシンたん白質またはたん白質の活性部位を含むフラグ メントである。

ワクチンは、免疫学的に有効な量の複合体を薬剤学的に容認されるキャリヤ内に 含む。好適には、ワクチンは抗原性補強剤も含む。ワクチンまたは複合体のヒト または他の哺乳類への投与は、Ｔ細胞依存型防御免疫応答を誘発する。

本発明は、さらに、精製インフルエンザ菌アトへシンたん白質と、アトへシンた ん白質から誘導された修飾たん白質およびポリペプチドを含み、このような誘導 たん白質およびポリペプチドは、アトへシンたん白質と免疫学的に交差反応性で ある。好適には、これらの誘導体は、アトへシンたん白質の１つまたはそれ以上 のエピトープである。特に好適な実施態様では、本エピトープは、受容体結合部 位でもある。また、たん白質およびポリペプチドは、ワクチン中で合成ＰＲＰに 結合されずに用いられる。

１つの好適な実施態様では、アトへシンたん白質は、分子量約４１，０００ダル トンの、少量のインフルエンザ菌の膜外に存在するたん白質である。他の実施態 様では、アトへシンたん白質は分子量約４７，０００ダルトンの、インフルエン ザ菌の膜外に存在するたん白質である。

１つの実施態様では、アトへシンたん白質はインフルエンザ菌から精製される。

Ｒ１膜は可溶化される。可溶化された物質はアトへシンたん白質を含む。この物 質は不溶性の物質から分離され、アトへシンたん白質の受容体と、たん白質分子 が受容体に結合するのに十分な時間接触する。受容体は不溶性の固体支持体に付 着される。その結果、たん白質は可溶化物質から分離される。次いで、たん白質 分子は受容体から取出され、精製体として回収される。

他の実施態様では、本発明のアトへシンたん白質および類縁ポリペプチドは、好 適には、遺伝子工学技術によって生成された組換えたん白質およびポリペプチド である。これらは、このようなたん白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ によって形質転換された、適切な宿主細胞によって生成される。

本発明のアトへシンたん白質をコードする単離または本質的に純粋なりＮＡ配列 は、次のように得られる。アトへシンたん白質またはアトへシンに対する抗体、 好適にはモノクローナル抗体が、インフルエンザ菌ＤＮＡを含むゲノムライブラ リーをスクリーニングするのに用いられる。本ライブラリーは、ベクターのそれ ぞれがＤＮＡの１つの配列のみを含むよう、操作的に、回収できるようベクター に挿入された、異なるＤＮＡの配列を含むクローンを含む。モノクローナル抗体 または受容体は、アトへシンを生成するクローンを認識する。次いで、クローン が単離される。好適には、外因性ＤＮＡ配列はクローンから回収される。

本発明は、さらに、たとえば単一または複数の突然変異によって、このＤＮＡか ら誘導される、単離または本質的に生成されたＤＮＡを含む。好適には、このよ うなりＮＡは、高緊縮の条件下で、ゲノムライブラリーがら得られたＤＮＡと二 本鎖構造をつくる。

本発明は、さらに、以下の化学式で表される合成ＰＲＰオリゴ糖を含む。

二二テ、ｎは２〜３０の整数、Ｒ１は（ＣＨ２１、ＣＨＯまたは（ＣＨ２ＣＨ２ ０）　−ＣＨｙ　ＣＨ２Ｎ　Ｈ２で、ｐは１〜３の整数である。

さらに別の実施態様では、本発明は本発明の合成ＰＲＰの合成における中間体と して有用な化合物を提供する。本化合物は次の化学式で表される。

ココテ、ｎは２〜３０の整数、Ｂｎはヘンシル、Ｒンは（ＣＨｒ）、ＣＨ（ＯＲ ３）、または（ＣＨ２ＣＨ２０）　−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ’　ｉ’、ｐは１〜３の整 数、Ｒ３は炭素１〜４個の長さのアルキル基、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基で ある。

本化合物は固相合成を用いて合成される。連鎖開始用の単量体は、次の化学式で 表される化合物である。

ここで、Ｂｎはベンジル、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである。本単量体は 固相と結合され、次いで脱トリチル化される。生成する脱トリチル化化合物は、 次の化学式で表される連鎖延長用の単量体と結合される。

ここで、Ｂｎはベンジル、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである。生成する化 合物は１次いで脱トリチル化される。連鎖延長および脱トリチル化段階は、所望 の長さのオリゴマーが得られるまで十分な回数だけ反復される。次いで、連鎖停 止単量体が添加される。連鎖停止単量体は次の化学式で表される。

二コテ、Ｂｎはベンジル、Ｒ’ｌ＊　（ＣＨ；）、ＣＨＴＯＲ３）　、＊たは（ ＣＨ２ＣＨ２０）−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ’で、ｐは１〜３の整数、Ｒ３は炭素１〜４ 個の長さのアルキル基、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基である。次いで、支持体 に結合したオリゴマーのホスホネート基は酸化され、ホスフェート基を形成する 。次いで、生成する化合物は、固体支持体より取出され、回収される。

次いで、本中間体に対する保護基が水素添加によって除去される。Ｒ２が（ＣＨ ２ＣＨ２０１ｐｃＨ２ｃＨ２Ｒ’の場合、本発明の合成ＰＲＰが生成する。Ｒ２ が（ＣＨ２１、ＣＨ（ＯＲ３）　２の場合、水素添加された化合物は、さらに選 択的な酸加水分解に供される。

次いで、本発明の好適な複合体は、Ｒ１が（ＣＨ７）　ＰＣＨＯの場合は還元ア ミノ化によって合成ＰＲＰをＨ１アトへシンたん白質に結合することにより、ま た、Ｒ’がｆｃＨ：ｃＨ２０）ｐｃＨ２ｃＨ２ＮＨ２の場合は対応するイソチオ シアネートを合成し、次いでイソチオシアネートをたん白質と結合することによ って合成される。

添付の図は本明細書に含まれ、本明細書の一部を構成するものであり、本発明の １実施態様を示し、説明と共に本発明の詳細な説明している。

図面の簡単な説明 図１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、膜外に存在する試料 の分析を示している。試料は次のもの（レーン）を含んでいた。１、ｂ型インフ ルエンザ醒がら得られた、クマシープルーで染色したすべての膜外に存在するた ん白質試料；２、Ｉｓｓで標識したすべての膜外に存在するたん白質のオートラ ジオグラフ；３、固定化した受容体ａｓｉａｌｏ−ＧＭ＋がら溶出された３’＋ ３標識アトへシンたん白質のオートラジオグラフ：４、無意味な糖脂質である、 固定化グロボシドから溶出された物質のオートラジオグラフ。矢印は、Ｐｌおよ びＲ２の間に移動した分子量約４１ｋＤのアトへシンを示す。

図２は、ヘモフィルス属アトへシンの糖脂質受容体ａｓｉａｌｏ　ＧＭ＋に対す る中和を示している。ｂ型インフルエンザ菌の［７５Ｓ］メチオニン標謀の膜を マウス血清の系列希釈によってインキュベートし、次いで放置し、受容体に結合 した（０．５μｇ／ウェル）、使用したマウス血清は、ヘモフィルス属の膜で免 疫化し、Ｍ−０〜Ｍ−４と呼ばれる５匹のマウスから得た。非免疫化マウスの血 清をネガティブコントロールとして使用した。

５！１３は、ヘモフィルス属の膜のａｓｉａｌｏ−ＧＭ＋への結合の１選択され たモノクローナル抗体による阻害を示している。［）’−３ｌメチオニンでｔｍ ｍｔ、たヘモフィルス属の膜をハイブリドーマ培養の上清とインキュベートし、 次いで受容体（０，５μｇ／ウェル）。Ｇｂ４の陰性の受容体対照は、受容体− リガント相互作用の特異性を示した。図２で使用されたマウス血清（Ｍ−２）（ １：５００希釈）は、強力で明確な阻害を示している。媒体は膜によってａｓｉ ａｌｏ−ＧＭ＋への結合の阻害を示さない。明確に阻害する２種類のハイブリド ーマが見い出された。

ＨｉｂｌＯは結合の完全阻害を示す。Ｈｉｂ３０およびＨｉｂ４３は部分的（約 ３５％）阻害を示す。Ｈｉｂ２のような、はとんどのハイプリドーマ培養は、阻 害を示さなかった。結合について調べたすべてのハイプリドーマ培養は、ＥＬＩ ＳＡにおいて、膜と明確に反応した。重複して行ったウェル間のばらつきを示す ため、エラーバーが含まれている。

図４は、４７ｋＤａのへモフィルス属アトへシンの同定と特性化を示している。

膜の結合を部分的に阻害したモノクローナル抗体、Ｈｉｂ４３を、ウェスタンプ ロットにおいて反応させ、これが認識するたん白質の分子量を同定した。全細胞 を、プロテイナーゼに未処理か、サンプル緩衝液中での分解前のプロティキナー ゼに処理、あるいはサンプル緩衝液中での分解後のプロティキナーゼに処理の後 （左から右へ読む）に泳動した。未処理は４７ｋＤａのたん白質を同定し、分解 前のプロティキナーゼＫによる全細胞の処理は、このプロテアーゼに対するたん 白質の本来の位置での感受性を示し、分解後のプロテイナーゼＫによる処理は、 本来の位置から引き離された後の全体的なこのプロテアーゼに対する感受性を示 す。ｐＭｃｌ（０によって形質転換された大腸菌ＸＬ−１は、）（ｉｂ４３と反 応する４７ｋＤａのへモフイルス属たん白質を発現する。４７ｋＤａのたん白質 も、ＸＬ−１／ｐＭｃ１０１全細胞のプロテイナーゼＫに対して敏感だった。こ れらのデータは、双方の宿主におけるこのたん白質に対する表面位置を示唆する 。

図５は、４７ｋＤａのアトへシンをコード化するｂ型インフルエンザ菌の制限マ ツプを示している。Ｈ１ｂ４３モノクローナル抗体と反応する４７ｋＤａのたん 白質を産生する１　０−　５　ｋ　ｂ　Ｅ’　Ｌ立ユＲ１フラグメントを、ヘモ フィルス属ｌａｍｂｄａ　ＺＡＰＩエジーンパンクからクローン化した。ヘルパ ーファージＲ４０８を、ベクターｐＳＫ　（−）へのこの挿入を含むプラスミド を尋人するのに使用した。このたん白質をコード化する遺伝子の位置は、矢印で 示したこの１０゜５ｓｃｐｂフラグメント内にある。転写の方向も、矢印で示さ れており、これは欠損分析によって決定した。太線は、ベクターＤＮＡを示す。

図６は、Ｈｉｂ４７ｋＤａのたん白質を発現する大腸菌の糖脂質結合の表現型を 示している。大腸菌ＸＬ−１またはｐＭｃｌｏｌによって形質転換された３番の ＸＬ−１の膜の能力を、標準的な結合測定を用いて比較した。受容体活性：ａｓ ｉａｌｏ−ＧＭ＋、ａｓｉａｌｏ−０Ｍ２、スルファチド、陰性対照、Ｇｂ、を 有する糖脂質の系列希釈を調製した。ＸＬ−１／ｐＭｃＬＯ１は、ヘモフィルス 属と同様に、これらの受容体と高親和性で結合した。

ｉ咀曳用鳳皇且朋 本発明の、現在のところ好適な実施態様について詳細に説明し、以下の例と共に 、本発明の詳細な説明する。

本発明は、インフルエンザ菌に対するワクチンとして有用な免疫属性オリゴ糖− インフルエンザ菌アトへシンたん白質複合体と、精製インフルエンザ菌アトへシ ンたん白質および類縁たん白質およびポリペプチドと、前記たん白質およびポリ ペプチドに対するＤＮＡ暗号と、ＤＮＡを含み、前記たん白質およびポリペプチ ドを生成する宿主細胞と、合成ＰＲＰオリゴ糖およびこれらの合成に有用な中間 体と、これらの物賀を合成および使用する方法と、を含む。

免疫見比Ｉ金差 複合体は、精製インフルエンザ菌アトへシンたん白質に化学的に結合されたポリ リボシルリビトールホスフェートフラグメントを含む。好適には、ＰＲＰフラグ メントは合成オリゴ糖である。１〜約３０．好適には約５〜２ｏの天然のフラグ メントまたは合成オリゴ糖がたん白質に結合されている。

フラグメントは、多糖をたん白質またはポリペプチドに共有結合させる、本明細 書に含まれる内容に適用される既知の技法によって、たん白質に結合される。

ここでの好適な技法は、還元アミノ化またはイソチオシアネートカップリングで ある。

任意のアトへシンたん白質を使用する。１つの好適な実施態様では、精製アトへ シンたん白質は、分子量約４１，０００ダルトンで、ＰｌまたはＰ２とは別の少 量のＨｉの膜外に存在するたん白質である。

別の好適な実施態様では、精製アトへシンたん白質は、分子量約４７，０００ダ ルトンで、Ｐ１〜Ｐ６とは別のＨｌの膜外に存在するたん白質である。

これとは別に、たん白質は、アトへシンたん白質の活性部位であるポリペプチド に代えられる。ここで用いた“活性部位”という用語は、エピトープ（抗原決定 ！＆）またはインフルエンザ菌受容体結合部位のことであり、エピトープである 場合か、あるいはエピトープでない場合がある。ここで用いた“受容体”という 用語は、Ｈ１アトへシンたん白質に結合する巨大分子である。巨大分子は好適に はグリコスフィンゴリピドである。本発明の範囲を限定する意図はないが、結合 部位はエピトープであると考えられる。

ＰＲＰフラグメントが天然の１料かも得られる場合、長さは異なるが、好適には 約８〜１２０の単量体の長さである。このようなフラグメントは、以前に引用し た欧州特許庁文書第０　３３８　２６５号に記載されているような既知の技法に よって得られる。

合成ＰＲＰはホスホジエステル結合によって結合されたリボースとりビトールの 分子が交互に連なる直線のホモポリマーで、次の化学式によって表される。

二こで、ｎは２〜３０、好適には５〜２ｏである。このような合成ＰＲＰは、当 該技術において既知のもの、および本発明の新規のものを含む。たとえば、前述 の欧州特許庁文書第０３２０　９４２号および第０　２７６　５１６号は、本発 明の複合体で使用される合成ＰＲＰを開示している。

好適には、合成ＰＲＰは次の化学式で表される化合物である。

ここで、ｎは２〜３０の整数、Ｒ１は（ＣＨ２１−ＣＨＯまたは（ＣＨ２ＣＨ２ ０）　−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ　Ｈ２で、ｐは１〜３の整数である。好適にはｎは５〜 ２０、ｐは１である。合成ＰＲＰは対イオンを伴う。好適には、このイオンはナ トリウム（Ｎａ゛）である。

合成オリゴ糖は、通常化学的なスペーサまたはリンカを含み、これらによってた ん白質に結合されている。このようなスペーサは、ＰＲＰとたん白質を継ぎ合せ る働きをする任意の化学結合で、複合体が投与された場合の動物宿主に対する有 害作用は、限定されているか、ない。このようなスペーサは、当該技術におし） で既知のもの、および本発明の新規スペーサを含む。既知のスペーサ（よ、前述 の欧州特許庁文書第０　３２０９４２号および第０　２７６　５１６号に開示さ れたものと、１９８９年５月１６日にＭａｒｂｕｒｇらに発行された米国特許第 ４゜８３０．８５２号に記載のものを含み、後者は参考文献に含まれている。好 適ζこは、化学的スペーサは、次の化学式で表される部分である。

ここで、Ｒは（ＣＨｚ）−ＣＨ２ＮＨまたは（ＣＨ２ＣＨｚ　０１−　ＣＨ２Ｃ Ｈ２Ｎ　ＨＣＳＮＨで、ｐは１〜３の整数、好適には１である。

本発明の最も好適な実施態様では、複合体は次の化学式で表される。

ココで、ｍは１〜３０、ｎは２〜３０、Ｒは（ＣＨ２）　−ＣＨ２Ｎ　Ｈまたは （ＣＨ。

ＣＨ２０）　ｐＣＨ２ＣＨ２Ｎ　ＨＣＳ　Ｎ　Ｈ１’、ｐは１〜３の整数、ｘは インフルエンザ菌アトへシンたん白質またはたん白質の活性部位を含むフラグメ ントである。好適にはｍは５〜２０、ｎは５〜２０、ｐは１である。前記化学式 中の記号Ｘは、以下に説明する、ある誘導または修飾されたたん白質またはポリ ペプチドを表す。

複合体は対イオンを伴う。好適には、このイオンはナトリウム（Ｎａ’）である 。

ア′へ２ン一 本発明は、さらに精製インフルエンザ菌アトへシンたん白質を含む。ここで用い た゛′精製″という用語および関連の用語は、たん白質は少なくとも重量で９５ ％純粋、好適には少なくとも重量で９８％純粋、最も好適には少なくとも重量で ９９％純粋であるという意味である。たん白質は、ｆｕｃｏｓｙｌａｓｉａｌ。

−ＧＭＩ、ａｓｉａｌｏ−ＧＭＩ、ａｓｉａｌｏ−０Ｍ２から成る基より選択さ れた受容体に結合する。これらの基はすべて、Ｎ−アセチルガラクトサミン（β １−４）ガラクトース（β１−４）グルコース（β１−１）セラミド、略してＧ ａ１ＮＡｃ　（β１−４１Ｇａｌ（β１−４１Ｇｌｃ（β１−１）ｃｅｒという 構造を含む。

１つの好適な実施態様では、たん白質は、ＳＤＳ　ＰＡＧＥによって決定された 分子量約４１ＫＤの少量の膜外に存在するたん白質である。本たん白質は、Ｈｌ について確認されている様々な主要な膜外に存在するたん白質と区別できる。特 に、本たん白質は、Ｐｌおよびβ２として知られる膜外に存在するたん白質に対 するポリアクリルアミドゲル上のバンドの間に、かすかなバンドとして現れる。

図１を参照のこと。

木精ｔＪＨｉアトへシンたん白質は、好適には、次のように天然１料から合成さ れる。Ｈ１細菌膜は、標準的な技法によって得られ、洗剤のような可溶化化合物 を使用して可溶化される。好適には、膜は洗剤と混合され、混合物は音波破砕さ れる。最も好適な可溶化剤は、約１．　０％〜約１．５％、好適には約１．３％ のオクチルグルコピラノシドを含む溶液である。アトへシンたん白質は可溶化さ れた物質中にある。膜の残りの不溶性物質は、好適には遠心によって分離される 。

上清は、ミクロタイターウェルまたはゲルといった、不溶性の固体支持体または マトリクスに付着された、たん白質を結合する受容体と、一定期間、たん白質が 受容体に結合するのに十分な条件下で接触され、たん白質を他の物質から分離す るうアトへシンたん白質に対する好適な受容体は、ｆｕｃｏｓｙｌａｓｉａｌｏ −ＧＭｌ、ａｓｉａｌｏ−ＧＭＩ、ａｓｉａｌｏ−０Ｍ２である。これらの受容 体は、参考文献に含まれる。　Ｋｒ１ｖａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ’、　ＩＪＳＡ。

［１５：８１５７−６１６１　（１９８８１に開示された手順に従ってｉＩ製さ れる。最も好適な受容体であるａｓｉａＬｏ−ＧＭＩは、市販もされている。こ れらの受容体のすべては炭水化物の配列Ｇａ１ＮＡｃ　（β１−４１Ｇａｌ（β １−４１０ＩＣを含み、したがって、これらはまた、アトへシンたん白質の精製 用の受容体としても使用される。この配列は、標準的な炭水化物合成技法を使用 して合成される。

次いで、アトへシンたん白質は、適切な物質によって溶出される。本溶出液は、 溶液中の遊離受容体、ＳＤＳ溶出緩衝液、または、ＫＳＣＮ、ＮａＣ１、塩酸キ ニジンといったカオトロビズム剤である。次いで、溶出したたん白質は、受容体 に対して試験し、受容体に結合するか確認する。単離されたたん白質の純度は、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。一般に、最も好適な受容体によるアフィニ ティー精製の後では、約９９％純粋である。

より大量のアトへシンたん白質の精製には、クロマとグラフ法が好適である。

受容体は、オクチルアガロースのような、疎水性ゲルの支持体に固定化される。

このマトリクスは、Ｈｌｒａｂａｙａｓｈｉらにより、他の糖脂質について記載 されているように、受容体を塩の存在下で疎水性ゲルに吸収することによって調 製される。参考文献に含まれる、Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９４：３２７−３３０　（＋９８３１゜光活性化へ テロ重機能性架橋化剤（Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　ｈｅｔｅｒｏｂｉ ｆｕｎｃｔｌｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ）も、糖脂質 アブイニテイーマトリクスを調製するのに使用されてきた。参考文献に含まれる 、Ｌｉｎｇｗｏｏｄ、　Ｃ，、ム」道中Ｉ　Ｒｅｓ、、　２５：１０１０−１０ １２　（１９８４１゜この場合、受容体−活性脂賀は、ゲルの支持体に共有結合 によって架橋している。次いで、カラムは、たん白質が溶出される前に、好適に ζよ、ＴＭＳＩ衝食塩水食塩水な、適切な緩衝溶液によって十分洗浄する。

より好適な方法は、標準的な技法によって調製された抗アトへシンモノクローナ ル抗体を使用して、アトへシンをアフィニティークロマトグラフィーによって精 製することである。この場合、抗体は、共有結合によって、臭化シアンまたはス クシンイミドエステル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ、ＢｉｏＲａｄ社）、あるいは、当業 者に既知の他の方法によって活性化されたアガロースゲルに結合される。音波破 砕抽出物は、上記のように、ゲルの上部に添加される。

別の好適な実施例では、アトへシンたん白質は、分子量約４７，０００ダルトン のインフルエンザ菌の膜外に存在するたん白質である。このたん白質は、分子量 と、他のたん白質が膜内に存在するたん白質であるのに対し、このたん白質が膜 外に存在するたん白質であるという事実に基づいて、既知のＨｉたん白質Ｐ１〜 Ｐ６からは区別される。本たん白質は、前述の受容体およびフルファチド（ＳＯ ｌ−−ガラクトース（β１−１）セラミド）に結合し、１％サルコシル（Ｎ−ラ ウロイルサルコシン）に溶ける。

本たん白質は、好適には、次のように精製体として調製される。Ｈｌ膜は膜に存 在するたん白質を除去する溶液によって抽出され、他の膜に存在するたん白質と ともにアトへシンたん白質を含む抽出物を生成する。好適にはこの溶液は、サル コシルまたはオクチルグルコピラノシドといった、非イオン性の洗剤である。

不溶性物質は、好適には遠心によって抽出物から分離される。これによって、ア トへシンたん白質を含む上清が生成される。次いで、本上清は、アトへシンたん 白質を認識するモノクローナル抗体との接触に供される。抗体は、不溶性の固体 の支持体に結合されている。接触は、アトへシンたん白質がモノクローナル抗体 体に結合するのに十分な時間で、標準的な反応条件である。好適には、固体の支 持体は、クロマトグラフィーのカラムで使用される物質である。次いでアトへシ ンたん白質は抗体から取出され、精製体でのたん白質の回収を可能にする。好適 には、非イオン性の洗剤′ａ液は、上清がアフィニティークロマトグラフィーに 供される以前に、上清から除去される。このような除去は、好適には上清を透析 し、本質的に洗剤を含まない透析物を生成することによって実施される。

モノクローナル抗体は、本明細書に含まれる内容を考慮して、標準的な技法によ って生成される。このような技法は、たとえば、１９８１年６月２日Ｗ　ａ　ｎ 　ｄＳらに発行された米国特許第４，２７１，１４５号および１９８０年４月１ 日にｏｐｒｏｗｓｋｉらに発行された米国特許第４，１９６．２６５号に開示さ れている。双方とも参考文献に含まれる。簡単に説明すると、マウスをＫ１膜に よって免疫化する。ハイブリドーマは、マウスの牌臓細胞を骨髄腫細胞と融合す ることによって調製される。次いで、陽性クローンがスクリーニングされ、Ｋ１ 膜との結合がＨ１アトへシン受容体によって阻害されるかを識別する。陽性ハイ ブリドーマクローンは単離され、モノクローナル抗体はこれらのクローンの中か ら回収される。

ｍ凡人 本発明のアトへシンたん白質は、好適には遺伝子工学技術によって生成される。

この場合、アトへシンたん白質は、当該たん白質をコードするＤＮＡによって形 質転換された、適切な宿主細胞によって生成される。

本発明のＤＮＡは、前述の受容体に結合するたん白質またはポリペプチドをコー ド化する、単離若しくは本質的に純粋なりＮＡ配列（すなわち、ポリデオキシリ ボヌクレオシド）である。ここで用いた゛単離”およびこれに類する用語は、Ｄ ＮＡは、通常Ｈｉアトへシンたん白質に付随する他のたん白質またはポリペプチ ドをコード化するＤＮＡから単離されているという意味である。したがって、本 発明のＤＮＡは、そのＤＮＡが、プラスミドのような微生物ベクター、または。

バクテリオファージによって運ばれるウィルス性ベクターにクローンされた場合 、このようなりローンが、このＤＮＡに付随している他のたん白質またはポリペ プチドをコード化するＤＮＡを含むクローンから単離されているならば、たん白 質またはポリペプチドをコード化するＤＮＡを含む。ここで用いた“本質的に純 粋”およびこれに類する用語は、ＤＮＡは、本発明のたん白質またはポリペプチ ドをコード化しないＤＮＡおよびＲＮＡを本質的に含まないことを意味する。す なわち、本発明のＤＮＡを含む試料には、重量で約１％未満の他のＤＮＡおよび ＲＮＡ、好適には、重量で約０．２％未満の他のＤＮＡおよびＲＮＡが存在する だけである。

好適には、ＤＮＡは、アトへシンに対する受容体またはモノクローナル抗体のい ずれかを使用し、インフルエンザｌＤＮＡを含む適切なゲノムライブラリーをス クリーニングすることによって得られる。このようなライブラリーは、一般には 微生物と適合性のあるプラスミド、コスミド、またはファージベクターを取込む ことによって、外因性ＤＮＡの断片が挿入された微生物、一般には旦エニリ旦」 １ｉ　Ｋ１２　（ＸＬ−１）のような細菌の単一種のコロニーを含む。より詳細 には、ライブラリーは、異なる配列のＤＮＡが、操作的に、回収できるよう挿入 されたベクターのクローンを含み、ベクターのそれぞれは、１つのみのＤＮＡ配 列を含む。ベクターはプラスミド、コスミド、ファジエミド、またはファージゲ ノムである。使用されるライブラリーの種類によって必要な場合は、ＤＮＡの断 片が、適切な条件下で発現されるよう（すなわち、適切な方向と正しい読み取り 枠において、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列およびリポソーム結合配列を含む、適 切な発現配列によって）、ベクターに挿入される。微生物は、旦、」Ｌす」」４ ＨＢ　１０１のような、アトへシンたん白質を発現しないものである。

ライブラリー由来のクローンは、受容体または抗体との接触に供され、結合する クローンを識別される。クローンは単離され、外因性ＤＮＡ配列がクローンの１ つから回収される。配列は、好適には検査され、当該たん白質をコード化するか どうか決定される。

好適には、ゲノムライブラリーは、ファージ、好適にはバクテリオファージラム ダに感染した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉｌのような細菌を含む。ファージに感染した 細菌によって生成されたプラークは、モノクローナル抗体によってスクリーニン グされ、これらのプラークがアトへシンたん白質を生成する細菌を含むものかど うか識別される。スクリーニングは、標準的な技法を使用して、プラークをモノ クローナル抗体に接触させ、結合が起ったがどうかを決定するステップを含む。

好適には、免疫化学定量が用いられる。

本好適な実施態様では、標準的な技法に従い、次いで、陽性プラークを精製し、 ヘルパーファージによって精製したプラーク中の細菌中でのプラスミドの形成を 誘導することにより、陽性クローンが単離される。

別の好適な実施態様では、参考文献に含まれる０１ｓｖｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、 　２９ｔｈ　ＩＣＡＡＣ。

Ｈｏｕｓｔｏｎ、　Ｔｅｘ、　１９８９に従うＤＹＮＡビーズを使用して、Ｈ１ アトへシンたん白質をコード化するＤＮＡを含むコロニーが検出される。前述の 受容体はトシル化ｄｙｎａビーズＭ２８０に架橋され、次いで、これらの受容体 含有ビーズは、アトへシンたん白質を発現するコロニーを吸収するのに使用され る。アトへシンを発現しないコロニーは洗浄により除去され、適切な濃縮が得ら れるまで、このプロセスが反復される。次いで、コロニーを発現すると考えられ るアトへシンは培養され、代謝的に各コロニーを３５３−メチオニンで標識し、 前述のように、コロニーの受容体に結合する能力を試験することにより、確認さ れる。いくつかの粘着性のクローン由来のＤＮＡは比較され、共通の配列が識別 され、これらの共通の配列は、さらにサブクローン化され、特性付けされる。

別の好適な実施態様では、特定の病原体の非付着性突然変異体を作製することに より、特異的なアトへシンに対する遺伝子の位置が特定され、識別される。これ は、参考文献に含まれる、Ｍａｎｏｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｊ、　Ｓｃ、ｉ　、　Ｕ−ｊ＾、８２：８１１２９−８１１３３　（ １９８５１に証載されているような、ＴｎＰｈｏＡといった転位可能な要素を使 用して突然変異体を作製することによって実施される。アルカリホスファターゼ に陽性な突然変異体は、排出されるたん白買内に突然変異を示す。各病原体に対 するアトへシンは膜外表面に存在し、したがって排出されているため、この突然 変異体の集合は突然変異体の非常に減少した部分集合を含んでいる。次いで、こ れらは結合活性の失活についてスクリーニングされる。

当業者により、Ｈｉアトへシンたん白質に対するＤＮＡ配列は１本明細書に開示 した内容を考慮して、既知の技法によって修正可能であることが認識される。

たとえば、異なる遺伝暗号が、元の遺伝暗号と同一のアミノ酸をコードするのに 代用できる。これとは別に、代用遺伝暗号は、当該たん白質の免疫原性に影響を 及ぼさないか、あるいは当該たん白質の免疫π性を向上する異なるアミノ酸をコ ードする。たとえば、オリゴヌクレオチド誘導の部位特異的突然変異、または、 参考文献に含まれるＢｏｔｓｔｅｉｎおよび５ｈｏｒｔｌｅ、　”Ｓｔｒａｔｅ ｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔ ａｇｅｎｅｓｉｓ　（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ突然変異の方法と応用）、”５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２２９：１１９３−１２１０　（１９８５１に記載されているような、 置換、挿入、欠失、転位といった単一または多重突然変異を形成するその他の技 法が採用できる。このような修正ＤＮＡは既知の技法を本明細書に含まれる内容 に適用することによって得ることができるため、このようなりＮＡは、請求され た本発明の範囲内にある。

さらに、当業者により、本発明のＤＮＡ配列（またはそのフラグメント）が、緩 和から高緊縮の条件下で、当該技術において既知の一般的な技法を使用して、本 発明のＤＮＡとハイブリダイゼーションする他のＤＮＡ配列を得るのに使用でき ることが認識される。したがって、本発明のＤＮＡは、このようなりＮＡを含む 。

本発明のＤＮＡは、本明細書に含まれる内容を考慮して適切に修正された既知の 技法に従い、発現ベクターを作製するのに用いられる。次いで、発現ベクターは 、微生物を当該発現に形質転換して本発明のアトへシンを産生ずるのに使用され る。このような技法は、１９８４年４月３日Ｒｕｔｔｅｒらに発行された米国特 許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日Ｗｅｉｓｓｍａｎに発行され た米国特許第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日Ｃｒｏｗｌに発行さ れた米国特許第４，５８２，８００号、１９８７年７月３０日Ｍａｒｋらに発行 された米国特許第４，６７７．０６３号、１９８７年７月７日Ｇｏｅｄｄｅｌに 発行された米国特許第４，８７８，７５１号、１９８７年１１月３日Ｉ　ｔａｋ ｕｒａらに発行された米国特許第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日 Ｍｕｒｒａｙに発行された米国特許第４，７１０．４６３号、１９８８年７月１ ２日Ｔｏｏｌｅ、Ｊｒ、らに発行された米国特許第４，７５７，００８号、１９ ８８年８月２３日Ｇｏｅｄｄｅｌらに発行された米国特許第４．７６６．０７５ 号、１９８９年３月７日５ｔａｌｋｅｒに発行された米国特許第４．　８１０． 　６４８号に開示されたものを含んでいる。これらはすべて参考文献に含まれて いる。

本発明のＤＮＡは、広範な他のＤＮＡ配列に結合され、適切な宿主細胞に導入さ れる。対になるＤＮＡは、宿主細胞の性質、宿主細胞へのＤＮＡの導入方式、一 般に、ＤＮＡは、発現に対して適切な位置で、正しい読み取り枠において、プラ スミドのような発現ベクターに挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿 主に認識される、適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に結合される が、このような制御は一般に発現ベクターも有している。次いでベクターは標準 的な技法によって宿主に導入される。

一般に、宿主のすべてがベクターによって形質転換されるわけではない。したが って、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。かっての選択技法は、形 質転換された細胞における抗生物質抵抗性のような選択可能な形質をコード化す るＤＮＡ配列を、任意の必要な制卸要素と共に、発現ベクターに挿入することを 含む。その他には、このような選択可能な形質に対する遺伝子を別のベクターに 乗せ、所望の宿主を形質転換するのに使用することができる。本発明に使用する 好適な発現ベクターは、プラスミドｐＭｃ１０１である。好適な宿主細胞は大腸 菌である。

形質転換された宿主細胞は、本発明のたん白質またはポリペプチドを発現する。

このような細胞は、既知の技法によって培養され、たん白質またはポリペプチド は、既知の技法によって回収される。使用される宿主および発現系に基づいて、 本発明の組換えたん白質およびポリペプチドは、形質転換された宿主細胞によっ て生産される融合たん白質の一部となる。このようなたん白質は、既知の技法に よって回収され、所望でない部分は、既知の技法によって除去される。その他に は、融合たん白質自体が組換えたん白質またはポリペプチド単独よりも免疫原性 が強く、したがって、これ自体がワクチンに使用される。

所望であれば、本明細書に記載の発見や内容に従って修正され、適用された、標 準的なたん白質精製技法の適用により、アトへシンはさらに精製される。このよ うな技法は、電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー （イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸 着アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、ゲル 浸透高速液体クロマトグラフィーを含む）、等電点電気泳動、およびこれらの修 正法と組合せを含む。

これらの技法の１つ以上が、分子をその物理的または化学的特性に従って分離す るよう設計された手順において、連続して採用される。これらの特性は、たん白 質の疎水性、電荷、結合能、分子量を含む。各技法の後に得られた物質の様々な 分画は、アトへシン受容体と反応する能力について試験される。次いで、このよ うな活性を示すこれらの分画は、連続する手順における次の技法に供され、次に 新たな分画が再び試験される。このプロセスは、受容体と反応性のある１つの分 画のみが残り、その分画がポリアクリルアミドゲル電気泳動に供されたとき、単 一のバンドを生成するまで反復される。

好適な技法は、参考文献として含まれる、１９８４年５月１日Ｃｈｕらに発行さ れた米国特許第４，４４６，１２２号で確認され、記載されたものを含む。好適 には、アトへシンは受容体アフィニティークロマトグラフィーまたはモノクロー ナル抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。

１腹１工△之２ 本発明のアトへシンは、既知のたん白質修飾技法によって修飾される。このよう な修飾は、少なくとも１つの活性部位を含むフラグメントへのたん白質の分解、 たん白質またはそのフラグメントへの１つ以上のアミノ酸の付加、置換、あるい は削除を含む。好適には、このような誘導たん白質またはポリペプチドは、Ｈ１ アトへシンたん白質と免疫学的に交差反応性であり、動物宿主において、インフ ルエンザ菌に対する抗原応答を発現することができる。より好適には、このよう な誘導たん白質またはポリペプチドは、ｆｕｃｏｓｙｌａｓｉａｌｏ−ＧＭＩ、 ａｓｉａｌｏ−ＧＭＩ、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ２がら成る詳から選択されたインフ ルエンザ薗受容体にも結合する。（この明細書で使用した“ポリペプチド”とい う用語は、通常ペプチドと呼ばれることが多い、アミノ酸の短鎖も含む。）この ような修飾は、たん白質の免疫原性を増強するが、このような活性に対する影響 を有していない。修飾技法は、参考文献に含まれる、１９８５年７月２日５ｔｅ ｖｅｎｓに発行された米国特許第４，５２６，７１６号に開示されているものを 含む。

本発明のたん白質は、免疫原性には必要のない１つ以上のアミノ酸配列を含む。

これは、たとえば、抗原の特定のエピトープのアミノ酸配列のみが、免疫原性活 性に必要な場合である。望ましくない配列は、当該技術において周知の技法によ って除去することができる。たとえば、望ましくないアミノ酸配列は、トリプシ ン、パパインといった酵素、あるいは関連するタンパク分解酵素を使用して、制 限的なタンパク分解によって除去することができる。

この後者の方法は、本発明のアトへシンたん白質については特に有用であること が予想される。たん白質は、共通配列を有するいくつかの類縁受容体に結合する ため、たん白質は、受容体結合部位として働く十分に保護された領域を有する。

この部位は、本発明の特に好適なポリペプチドである。

これとは別に、様々な抗原性エピトープおよび当該たん白質の受容体結合部位の 双方またはいずれが一方に対応するポリペプチドが、本明細書に含まれる内容を 考慮して、当該技術において周知の方法により、化学的に合成される。これらは 、１９８１年９月２２日Ｇｏｌｄｂｅｒｇに発行された米国特許第４．　２９０ ゜９４４号に開示された方法を含む。

本明細書に含まれる内容を考慮して既知の技法と型通りの実験作業を使用するこ とにより、前述のインフルエンザ菌アトへシンたん白質またはポリペプチドに本 質的に同種の修飾されたたん白質またはポリペプチドが合成される。ここで用い た゛″本質的に同種”という用語は、免疫学的に交差反応性であるという意味で ある。このようなたん白質またはポリペプチドは、本発明のアトへシンたん白質 に対して作られた抗体に結合するという事実によって識別される。この抗体は、 標準的な技法によって合成される。このようなたん白質またはポリペプチドの中 には、これらがＭＷされる元となったものに比べて免疫原性が増強されているも のがある。

したがって、本発明は、合成的に誘導された、アトへシンたん白質のペプチドま たはフラグメントを含む、共通の起源の要素、構造、免疫原性効果または前述の 受容体に結合できるといった作用の機序を有する誘導たん白質およびポリペプチ ドの群を含んでおり、これらは、本発明の内容を知れば、当業者によって不適当 な実験作業なしに合成されるため、本発明の範囲内にある。さらに、当業者は、 本発明のたん白質またはポリペプチド上のエピトープまたは受容体結合部位に対 して、このようなエピトープまたは部位が同゛定されれば、修正を加えたり、誘 導体を作ること′ができるため、このような修正または誘導体は本発明の範囲内 にある。このような誘導たん白質およびポリペプチドは、好適には、以前定義さ れたように純枠である。

本発明のＨｉアトへシンたん白質（およびこれがら誘導された類縁たん白質およ びポリペプチド）ば、複合ワクチンとしてだ・けでなく、当然免疫原としても有 用である。したがって、これは、哺乳動物、醤歯頷、霊長類、ヒトを含む動物用 のワクチンに使用できる。好適な使用は、ヒト、好適には小児、最も好適には生 後間もない乳児用のワクチンである。

このようなワクチンは、当業者には既知の技法によって調製することができ、た とえば、抗原、薬剤学的に容認されるキャリヤ、適切な賦形剤、その他の従来か らワクチンに見られる物質を含む。ワクチン中に使用される抗原の免疫学的に有 効な量は、当該技術で既知の手段により、本明細書の内容を考慮して決定される 。

１戒ＰＲＰ 本発明は、さらに、次の化学式で表される新規合成ＰＲＰを含む。

ココテ、ｎは２〜３０．好適には５〜２ｏの整数、Ｒ１は（ＣＨ７）　−ＣＨＯ または（ＣＨ２ＣＨ２’　Ｏ）　−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ　Ｈ２テ、ｐは１〜３の整数 、好適には１である。

天然１科がら得られた、フラグメントの長さが大幅に異なるＰＲＰとは対象的に 、本新規合成ＰＲＰを合成できることにより、すべてのＰＲＰオリゴ糖が同一の 長さくすなわち、同数の単量体の単位体を有する）である組成を調製することが 可能となる。

本発明のＰＲＰは、固相合成と、ホスポジエステル結合を構成する高効率のＨ− ホスホネート法の組合せによって合成される。商業スケールの操作にさらに適し た高水準の機能を有するゲルを使用することもある。　′一般的な方法は、以下 のステップによって、保護されたオリゴマーリボシルリビトールホスフエート誘 導体を合成することである。第１に、連鎖開始用の単量体が面相に結合される。

単量体は次の化学式で表される。

ここで、Ｂｎはベンジル、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである。表１の化合 物７を参照のこと。好適な固相は、メリフィールド型アミノ樹脂である。連鎖開 始単量体（化合物７）は、無水コハク酸と反応し、次いで、得られた化合物７の コハク酸塩を固相のアミノ基にカップリングさせるといった、既知の技法によっ て固相に結合される。充填度は、酸処理で放出されるトリチル陽イオンの比色定 量によって定量される。次いで、結合した化合物は、ジクロロメタン中のトリフ ルオロ酢酸による処理などにより、脱トリチル化される。

連鎖延長は、脱トリチル化された連鎖開始単量体を、次の化学式で表される化合 物と結合させることによって実施される。

次いで、生成する化合物は、好適には加メタノール分解による開裂によって、二 こで、Ｂｎはベンジル、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである。表１の化合物 ８を参照のこと。（化合物は対イオンを伴う。好適には、このイオンはトリエチ ルアンモニウムのような有機陽イオンである。）この結合は、塩化ピパロイルの ような縮合試薬を使用することによって実施される。次いで、生成する化合物は 、説トリチル化される。連鎖延長−説トリチル化ステップは、所望の長さのオリ ゴ塘を合成するのに十分な回数だけ反復される。したがって、ｎがオリゴ糖にお けるＰＲＰ単量体の所望の数を表す場合、連鎖延長−説トリチル化のサイクルは 、連鎖開始単量体と第１の連鎖延長単量体の結合の後、ｎ−２回反復される。

連鎖は、連鎖を次の化学式で表される連鎖停止単量体と結合させることによって 停止される。

ココテ、Ｂｎはヘンシル、Ｒ２はｆｃＨ２１−ＣＨ（ＯＲ’）２または（ＣＨ２ ＣＨ２０）−ＣＨ２ＣＨ２Ｒ’で、ｐは１〜３、Ｒ３は炭素１〜４個の長さのア ルキル基、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基である。表２の化合物１０および１２ を参照のこと。

（化合物は、対イオンを伴う。好適には、このイオンはトリエチルアンモニウム のような有機陽イオンである。）好適には、ｐは１、Ｒ３はメチルまたはエチル である。好適には、Ｒ４はＮ３か、トリフルオロアセチルが、ベンジルオキシカ ルボニルか、フルオレニルメトキシカルボニルである。

面相結合オリゴマーのホスホネート基は次いで酸化され、ホスフェート基を形成 する。好適には、これは水性ピリジン中のヨウ素による処理によって実施される 。

酸水溶液による加水分解、水素化ホウ素ナトリウム還元、塩化トリフェニルメチ この固体支持体から除去される。回収される化合物は次の化学式で表される。

ル／ピリジンによるトリチル化、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド中での塩化ベ ンジル／水酸化ナトリウムによるベンジル化、酢酸水溶液による加水分解から成 る、一連の反応に供される。生成する化合物３は、シリカゲルクロマトグラフィ ーに７）は、クロマトグラフィーによって精製される。

亜リン酸７５．５−ジメチルー２−オキソ−２−クロロ−１，３，２−ジオキサ ホスホリナンによる化合物７の縮合反応は、連鎖延長単量体（化合物８）を与え る。

表２は、連鎖停止用単量体の合成を示す。化合物６は、塩化トリメチルシリルと 反応され、対応する塩化物を与え、この塩化物は、分子ふるいの存在下で適切な アルコールと反応させられ、そのアルコールのβ−グリコシドを与える。好適に は、そのアルコールは２−（２−アジドエトキシ）エタノール、２−［２−ベン ジルオキシカルボニルアミド）エトキシ］エタノール、または、２．２−ジェト キシエタノールである。前記β−グリコシドは、化合物７の合成と同様に、一連 の脱ベンゾイル化、ベンジル化、および脱アリル化に供され、化合物９および１ １を与える。化合物８を合成するのに用いられたのと同一の手順に従い、亜リン 酸１５−５−ジメチルー２−オキソ−２−クロロ−１，２，３−ジオキサホスホ リナンによる縮合は、所望のスペーサを含む単量体（化合物１０または１２）を 与える。

表３は、化合物７．８．および１０または１２を用いた固相合成の後に得られた 特定のＰＲＰオリゴマーを示している。化合物１３および１５は、固体支持体よ り除去された後は、保護晟のあるオリゴマーであり、化合物１４および１６は、 保護晟が除去された後の最終的なオリゴマーである。

新規ＰＲＰの好適な使用は、新規免疫原複合体の合成においてのものである。

オリゴマーは、本明細書に含まれる内容に適用される標準的な技法により、本発 明のたん白質またはポリペプチドの１つに結合される。スペーサの末端がアルデ ヒド基である場合、好適な技法は、Ｒｏｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃａｒｂ ｏｈ　ｄｒ、　Ｃｈｅｎ、　６：１６１−１６５　（１９８７）およびＬｅｅ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｒｂｏｈ　ｄｒ、　Ｒｅｓ、、　７７：１４９−１５６ 　（１９７９）に記載された、水素化ホウ素ナトリウムを使用した還元アミノ化 である。双方とも参考文献に含まれている。スペーサの末端がアミノ基である場 合、ＰＲＰはチオホスゲンのような活性化チオカルボン酸誘導体による処理によ ってイソチオシアン酸塩に変換され、次いで、Ｋａｌｌｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、 リエ並立ｌＪＪ組切工ｔ、　３：３１１−３１９　（１９８６）およびＺｏｐｆ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ａ　１．、５０：＋７１−１７ ５　（１９７８）に記載された処理に従い、ｐＨ９〜１０でたん白質に結合され る。双方とも参考文献に含まれている。たん９賀／炭水化物の比は、Ｌｏｗｒｙ たん白質定量とリボース定量の組合せにより決定される。この比は、主として、 初期の反応混合物においてのたん白質に対する炭水化物の比と、使用されるスペ ーサの種類の関数となる１例３に示したように、アミノ基を末端とするスペーサ （化合物１６）を使用した場合、アルデヒド基を末端とするスペーサ（化合物１ ４）を使用した場合よりも、たん白質に結合されるオリゴ糖の数は大きくなる。

表４は、最終的な複合体の化学式を示す。

Ｊ久±之 前述のアトへシンーオリゴ糖複合体およびこれらのたん９賀成分は、侵−性およ び非侵襲性の双方のインフルエンザ菌株に対するワクチンに使用される。複合ワ クチンは、ｂ型インフルエンザ菌に対する高い有用性を有する。

ワクチンは免疫学的に有効な量の免疫原を、薬剤学的に容認されるキャリヤ内に 含む。混合された免疫原とキャリヤは、水剤、乳剤、または懸濁剤である。免疫 学的に有効な量は、不適当な実験作業をすることなく、当該技術で既知の手段に より、本明細書の内容を考慮して決定可能である。一般に、免疫原の量は用量当 り０．１および１００μｇの間である。キャリヤは当業者には既知であり、安定 化剤、希釈液、および緩衝液を含む。適切な安定化剤は、ソルビトール、乳糖、 マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン、ブドウ糖といった炭水化物や 、アルブミンまたはカゼインといったたん白質を含む。適切な希釈液は、食塩水 、ハンクスバランス液、リンゲル液を含む。適切な緩衝液は、アルカリ金属のリ ン酸塩、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩を含む。ワクチンは 、抗厘性を向上させる１つ以上の賦形剤も含む。適切な賦形剤は、水酸化アルミ ニウム、リン酸アルミニウム、または酸化アルミニウム、Ｍａｒｃｏｌ　５２の ような、鉱物油の組成物、または植物油、および、１つ以上の乳化剤を含む。

ワクチンは、他の免疫原も含有する。このようなカクテルワクチンは、単一の投 与によって、複数の病原体に対して免疫が得られるという利点を有する。その他 の免疫原の例は、既知のＤＰＴワクチンに使用されているものである。

本発明のワクチンは、当業者に既知の技法により、本明細書に含まれる内容を考 慮してｍ製される。一般に、免疫原はキャリヤと混合され、水剤、懸濁剤、また は乳剤を形成する。前述の添加物の１つ以上が、キャリヤ内にあるか、後で添加 される。ワクチン製剤は、保存の目的のため、たとえば凍結乾燥により、乾燥さ れる。この場合、これらは後に適切な液体のキャリヤの添加により、液体ワクチ ンに戻される。

ワクチンは、ヒト、または蓄歯顛および霊長類を含むその他の哺乳動物に投与さ れる。好適には、これらは、ヒトの小児、最も好適には、１８ケ月未満の小児に 投与される。これらは、１回以上の用量で投与することができる。本ワクチンは 、この壇のワクチンに既知の投与経路によって投与される。好適な経路は、筋肉 または皮下注射である。したがって、本発明は、侵襲性または非侵襲性Ｈ１によ る感染に対して哺乳動物を保護するために、哺乳動物においてＨｌに対する免疫 応答を誘発する方法を含む。本方法は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原の 宿主への投与、好適には、本発明のワクチンの宿主への投与を含む。

本発明の複合体、たん白質／ポリペプチド、およびオリゴマーは、Ｈｉの病原性 、１力、および感染力、また、宿主の防御機序の特性についての科学的研究用の 試薬としても有用である。試験用として有用な本発明に従う組成は、目的となる 情報または分析結果を提供するのに有効な量の複合体、たん白質／ポリペプチド 、またはオリゴマーを含む。特定の研究目的を達成するのに必要な量の決定は、 試験の具体的なｆｌＦＪによって異なり、本明細書に含まれる内容を考慮すれば 、このような研究に携わる者の通常の能力内にある。

本発明の内容の特定の問題または環境への適用は、本明細書に含まれる内容を考 慮すると、当該技術における通常の能力を有する者の能力内にある。本発明の産 物およびこれらの合成プロセスおよび使用の例は１次の例に明示される。

Δ　ＰＲＰオ替ゴ　Δ 本発明の合成ＰＲＰオリゴ糖の合成は、ここで説明し、表１〜３に概略した反応 スキームに示したように説明される。

メチル５−０−アリル−２，３−０−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシ ド（化合物２） メチル２．３−０−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシド（化合物１．５ ０．０ｇ）と、Ｎ、Ｎ−ジメチルボルムアミド＋２５０ｍ１）と、粉末化した水 酸化ナトリウム（５５，０ｇ）との溶液を、臭化アリル（５０，０ｍ１）を滴加 しながら、攪拌した。２時間後、過剰の臭化アリルは、メタノール（５０ｍｌ） の添加によって分解した。さらに１時間攪拌した後、混合液を水とトルエンで分 液した。有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。炭酸バリ ウム（２５０ｍｇｌを加え、オイルを９０〜９５°Ｃ，０，７５ｍｍＨｇで蒸留 した。化合物２の収率は約９０％だった。

５−０−ｙクルー２．　３．　４−ト！Ｊ−０−ヘンシｈ−Ｄ−１ｅヒトール（ 化合物３）メチル５−０−アリル−２，３−Ｑ−イソプロピリデン−β−Ｄ−リ ボフラノシド（化合物２．１．５ｇ）ギ酸水溶液（２５ｍｌ）を油浴上１００’ Ｃ１’ＩＯ時間加熱し、次いで濃縮し、水で２回共沸した。得られた、主として ５−０−アリル−Ｄリボースおよび残留するギ酸がら成るシロップ状の物質を、 水（２５ｍｌｌに溶がし、アンモニア水でｐＨ７に調整した。水素化ホウ素ナト リウム４０．５ｇ）を加え、混合液を３時間攪拌し、次いで酢酸でｐＨ７にｍ整 し、濃縮した。酢酸−メタノール＋１　：　１）と３回共濃縮し、メタノールと ２回共濃縮シタ後、残渣を水（５０ｍｌ）ｉ＝溶カシ、コノ水溶液を、Ｄｏｗｅ ｘ−５０Ｗｘ２（Ｈ生型、５０〜１ｏｏメツシユ、２ｘ２０ｃｍ）イオン交換樹 脂のカラムにゆっくり通過させた。主として５−０−アリル−Ｄ−リビトールが ら成る溶出物を濃縮し、ピリジンで回収し、濃縮し、再びとリジン（２５ｍｌ） で回収した。

塩化トリフェニルメチル（８，０ｇ）を加え、混合液を室温で１６時間攪拌し、 次いでメタノール（２，０ｍ１ｌを加えた。１５分後、混合液をジクロロメタン と水で分液した。有機相を水、硫酸、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥 しく硫酸マグネシウム）、濃縮した。残漬をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ ５ｍｌｌに溶かした。粉末化した水酸化ナトリウム（３，５ｇ）を加え１次に塩 化ベンジル（４，４０ｍ１、滴加）を加えながら、この溶液を攪拌した。２時間 後、メタノール（５ｍｌ＋を加え、１５分後、混合物をトルエンと水で分液した 。

有機相を水で洗浄して濃縮した。残渣を９０％酢酸水溶液（５０ｍｌ）ｌ：：溶 力）し、ｔｏｏ”　ｃで２時間加熱し、次いで濃縮し、トルエンと共沸した。残 渣をシＩＪ力ゲルグロマトグラフイーによって精製した。化合物をトルエン−酢 酸エチル９：１で溶出した。シロップ状の化合物３の収率は４８％だった。

メチル５−０−ベンジル−２，３−０−イソプロピリデン−β−］）−１ノボフ ラノシド（化合物４） メチル−２，３−０−イソプロピリデン−β−］）−１ノボフラノシド（（ヒ合 物１．５０ｇ）と、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５０ｍｌｌと、粉末イし した水酸化ナトリウム（５０ｇｌとのａｌｆｅｌ、を攪拌しながら、塩化ペン・ ノイル（６４ｍｌ）を滴加した。２時間後、過剰の塩化ベンジルをメタノール（ ５０ｍｌｌの添加によって分解した。さらに１時間攪拌した後、混合液を水とト ルエンで分液した。

有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。炭酸）＜１ノウム （２５ｏｍｇ）を加え、オイルを１１５〜１２０°ｃ、ｏ、４ｍｍＨｇで蒸留し た。

化合物４の収率は約９０％だった。

メチｌし５−０−ベンジル−２，３−ジー０−ベンゾイル−β−Ｄ−−ノボフラ ノシド（化合物５） メチル５−０−ベンジル−２，３−０−イソプロピリデン−β−１）−１ノボフ ラノシド（化合物４．２３ｇ）を９５＝５ギ酸−水（２００ｍｌ）に溶かした溶 液を室温で３０分間放置し、水中で冷却した。冷却した溶液を、激しく攪拌した 、破砕氷と、水酸化ナトリウム水溶液（２０００ｍｌ中２４０ｇ１と、ジクロロ メタン（１０００ｍｌ）との混合液中に注入した。混合液を分液漏斗中でよく攪 拌し、有機相を分離し、水相をジクロロメタン５００ｍ１で４回抽出した。主と してメチル５−０−ベンジル−β−Ｄ−リボフラノシドを含む、集められた有機 抽出物を濃縮した。乾燥とリジン（５０ｍｌ）を加え、混合液を濃縮し、次いで 乾燥ピリジン（１５０ｍｌ）を再び加えた。混合液を水中で冷却しながら、塩化 ベンゾイル（３４ｍｌ）を滴加した。混合液をさらに室温で終夜攪拌し、次いで 水（２ｍｌｌを添加し、過剰の塩化ベンゾイルを分解した。次いで混合液を水（ １０００ｍｌ）とジクロロメタン（５００ｍｌｌで分液した。有機相を２Ｍ硫酸 水溶液、次いで１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した。濃縮によってシロップを生 成し、シリカゲルカラムで精製した。純粋な物質を含む分画を集め、濃縮した。

物質は、冷却したメタノールから再結晶でき、融点は６８〜６９°Ｃだった。化 合物５の収率は２２〜４１％だった。クロマトグラフィーによっても開始物質（ 化合物４）を純粋な形で生成した（５〜２０％）。

３−０−アリル−５−０−ベンジル−１，２−０−メトキシベンジリデン−α− Ｄ−リボフラノース（６） 水素化ホウ素のジクロロメタン溶液を、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）と、メタ ノール（３，０ｍ１ｌと、臭化アセチル（６，０ｍ　ｌ　）とを混合することに よりｒｌＩ製した。次いで、メチル２，３−ジー０−ベンゾイル−５−０−ベン ジル−β−Ｄ−リボフラノシド（化合物５，４．６２ｇ）を加え、混合液を室温 で３０分間攪拌し、その後で、主として臭化２．３−ジーＯ−ベンゾイルー５− ０−ベンジル−α−Ｄ−リボフラノシルを含む混合液を水中で冷却しながら、コ リジン（２５ｍｌ）を、次いでメタノール（１０ｍｌｌを攪拌しながら滴加した 。混合液をさらに室温で３時間攪拌し、次いで水で洗浄し、濃縮し、メタノール と共沸した。主として３−０−ベンゾイル−５−０−ベンジル−１，２−０−メ トキシ溶かし、　ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０，５Ｍ、２０ｍ１ ）を加えた。室温で２時間後、ＣＣｈの添加によって混合液を中和し、次Ｌ−で 濃縮し、Ｎ。

Ｎ−ジメチルホルムアミドと１回共沸した。残渣をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ ド（３．０ｇ）を、次いで臭化アリル（３，、Ｏｍｌｌを加えた．、１時間後、 混合液を水とトルエンで分液し、有機相を水で洗浄し、濃縮した。残渣をシーノ カゲルクロマトフラフイーによって、トルエン−酢酸エチル−ピリジン（９０： １０：１）を溶出液として使用して精製した。適切な分画を集めて濃縮し、イし 合物６（１。

９０ｇ、４８％）を無色のシロップとして生成した。

２、３．　４−トリー〇ーベンジル−１−０−　（２．５−ジーＯーベンジルー βーＤーリボフラノシル）−５−０−モノメトキシトリチル−１）−１ノビトー ル（イし合物７） 乞Ｕコ」ヨヨＬ成人 化合物３　（４．６ｇｌおよび６　（４．０ｇ＋を乾燥ニトロメタン（６０ｍｌ ）に溶かした。薄層クロマトグラフィーが化合物６の完全なエステル交換を示す までニトロメタンを連続添加し、一定量の連続した蒸留によってメタノールを除 去した。臭化水ＩＩＩ（ＩＩ）（５００ｍｇｌを加え、薄層クロマトグラフィー カイ新たな生成物の形成を示すまで、ニトロメタンを連続して加え、溶媒を一定 量留去した。混合液をろ過して濃縮し、残渣をＱ．０４Ｍメタノール性ナトリウ ムメトキシド（５０ｍｌｌで回収した。室温で１時間後、混合液はＣ　Ｏ　２の 添加によって中和し、次いで濃縮し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで１回共沸 した。残渣↓よＮ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド＋５０ｍｌ＋に溶かし、室温で攪拌しな力τも粉末イ ヒした水酸化ナトリウム（３．０ｇ）を、続いて塩化ベンジル（３．０ｍｌ）を 加えた。１時間後、混合液を水とトルエンで分液し、有機相を水で洗浄し、濃縮 したＯ残渣をシリカゲルの短いカラムによるクロマトグラフィーにより・　トル エン−酢酸エチル（９：１）を溶出液として使用して精製した。５−０−ア１ツ ルー２，３。

４−トリー〇ーベンジル−１−０−　（３−０−アリル−２，５−ジー０−ベン ジル−β−Ｄ−リボフラノシル）−Ｄ−リビトールを含む分画を集め、濃縮した 。

残渣を３０：１２：４のエタノール−トルエン−水（７５ｍｌ）に溶かし、塩化 トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）（２００ｍｇ）の存在下で、 薄層クロマトグラフィーが完全に変換されたことを示すまで、溶液を還流した。

次いで混合液をジクロロメタンで希釈し，塩化カリウムの飽和水溶液で洗浄し、 濃縮した。残渣を１０：１酢酸−水（３０ｍｌ）に溶力礼、酸化水銀（３．０ｇ ）、続いて塩化水銀（３．０ｇ）を加えた。室温で３０分間攪拌した後，固体を ろ過によって除去し、ろ液をジエチルエーテルおよび水で分潰し、ヨードカリウ ム水溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。主として２，　３．　４−トリー〇ーベ ンジル−１−０−　＋２．５−ジ−０−ベンジルーβ−Ｄ−リボフラノシル］− Ｄ−リビトールを含む残漬を乾燥ピリジン＋５０ｍｌ）で回収し、塩化モノメト キシトリチル＜３．５ｇ＋を加えた。残渣を終夜攪拌し、次いでメタノールを加 え、過剰の塩化物を分解した．３０分後、混合液をジクロロメタンと水で分液し 、次いで硫酸の水溶液と重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、濃縮した。残渣をシ リカゲルカラムのクロマトグラフィーにより、トルエン−酢酸エチル（９：１、 １％ピリジンを含む）を溶出液として精製した。適切な分画を集めて濃縮し、化 合物７（４。

９ｇ、６から計算して５０％）を無色のシロップとして生成した。

久丈ユ之上上蓬ヱ 化合物６　（４．　０ｇ）を塩化トリメチルシリル（２０ｍｌ）に溶かした。室 温で２０分後、溶液を濃縮し、次いで乾燥ジクロロメタンで共沸した。残漬を、 粉末化した４人分子ふるい＋５．０ｇ）と化合物３　（４．　６ｇ）を含む乾燥 ジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶かした。混合液を室温で終夜攪拌し、次いでろ 過し、濃縮した。残渣を０．０４Ｍメタノール性ナトリウムメトキシド　（５０ ｍｌ）で回収し、さらに上記方ｍＡで説明したように処理した。

２、３．　４−１−リーＯーベンジル−１−０−　（２．５−ジー０−ベンジル −β−Ｄ−リボフラノシル）−５−０−モノメトキシトリチル−Ｄ−リビトール ３−Ｈホスホネート（化合物８） 化合物？　（４，９ｇ）を乾燥ピリジンで回収し、製着乾固し、次いでとリジン （２０ｍｌ）で回収し、ホスホン酸（４，１ｇ）のとリジン（２０ｍｌ）溶液に 加えた。５，５−ジメチル−２−オキソ−２−クロロ−１，３，２−ジオキサホ スホリネート（５，０ｇ）を加えた。薄層クロマトグラフィーが完全な変換を示 した時、１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（５ｍｌｌを加え、混合液を ジクロロメタン（２００ｍｌ）と０．５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液 （１３０ｍｌ）で分液した。有機相を濃縮し、残渣をシリカゲルの短いカラムの クロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中のメタノールの段階濃度勾配（０ 〜２０％、１％ピリジンを含む）を溶出液として使用して精製した。非晶質の化 合物８の収率は８０〜９０％だった。

２．２−ジェトキシエチル２，５−ジーＯ−ベンジルーβ−Ｄ−リボブラノシド （化合物９、ｐ＝ｌ、Ｒ３＝エチル） 化合物６　（２，０ｇｌと塩化トリメチルシリル（１５ｍｌ）の混合液を室温で ２０分間放置し、次いで濃縮し、乾燥ジクロロメタンで共濃縮した。残渣をグリ コールアルデヒドジエチルアセクール＋１．０ｇ）と、粉末化した４人分子ふる い＋３．０ｇ）と、乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）と温合し、室温で終夜攪拌 し、次いでろ過し、濃縮した。残漬を０．０４Ｍメタノール性ナトリウムメトキ シド（２５ｍｌｌで回収した。！！！温で１時間後、混合物をＣＯ７の添加によ って中和し、次いで濃縮し、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ＋で１ 回共濃縮した。残渣をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）に溶かし、室 温で攪拌しながら、粉末化した水酸化ナトリウム（３，０ｇ）、次いで塩化ベン ジル（３゜０ｍ１）を加えた。ＴＬＣが完全な変換を示した時、メタノールＴ２ ｍｌ）を加え、１５分後、混合液を水とトルエンで分液し、有機相を水で洗浄し 、濃縮した。

残渣をシリカゲルの短いカラムのクロマトグラフィーにより、トルエン−酢酸エ チル＋８：２１を溶出液として使用して精製した。適切な分画を集めて濃縮し、 次いで３０：Ｌ２：４エタノール−トルエン−水（５０ｍｌ）で回収し１本溶液 を、塩化トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）（１００ｍｇ）の存 在下で、薄層クロマトグラフィーが完全に変換されたことを示すまで、溶液を還 流した。次いで混合液をジクロロメタンで希釈し、塩化カリウムの飽和水溶液で 洗浄し、濃縮した。残渣を１０；１酢酸−水（２０ｍｌ）に溶かし、酸化水銀（ ２，Ｏｆ）、続いて塩化水銀（２，０ｇ）を加えた。室温で３０分間攪拌した後 、固体をろ過によって除去し、ろ液をジエチルエーテルおよび水で分液し、ヨー ドカリウム水溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。トルエン−酢酸エチル（８：２ ）を溶出液として使用し、短いシリカゲルカラムによる精製で、シロップ状の化 合物９を生成した。収率は６０〜６５％だった。

２−［２−（ベンジルオキシカルボニルアミド）エトキシ］エチル２．５−ジー ０−ベンジル−β−Ｄ−リボフラノシド（化合物１１、ｐ＝１、Ｒ’＝ＮＨＣＯ ＯＢｎ） 化合物６　（２，０ｇ）と塩化トリメチルシリル（１５ｍｌ）の混合液を室温で ２０分間放置し、次いで濃縮し、乾燥ジクロロメタンで共濃縮した。残渣をグリ コールアルデヒドジエチルアセタール（１，０ｇｌと、粉末化した４Ａ分子ふる い（３，Ｏｇ）と、乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）と混合し、室温で終夜攪拌 し１次いでろ過し、濃縮した。残渣を２−　［２−（ベンジルオキシカルボニル アミド）エトキシ〕エタノール（１，５ｇ）と、粉末化した４八分子ふるい（３ ゜０ｇ）と、乾燥ジクロロメタン！１５ｍ１）と混合し、室温で終夜攪拌し、次 いでろ過し、濃縮した。残渣を０．０４Ｍメタノール性ナトリウムメトキシド　 （２５ｍｌ）で回収した。室温で１時間後、混合物をＣＯ−の添加によって中和 し、次いで濃縮し、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで１回共濃縮した。残渣をＮ 、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）に溶かし、室温で攪拌しながら、新た に調製した酸化銀＋３．０ｇ１．次いで臭化ベンジル（３，０ｍ１）を加えた。

薄層クロマトグラフィーが完全な変換を示した時、混合液を濃縮した。ろ液を水 およびトルエンで分液し、有機相を水とチオ硫酸ナトリウムで洗浄し、濃縮した 。残渣をシリカゲルの短いカラムのクロマトグラフィーにより、トルエン−酢酸 エチル（８：　２１を溶出液として使用して精製した。適切な分画を集めて濃縮 し、次いでジオキサン（１４ｍｌｌ中二酸化モレン（５７０ｍｇ）と酢酸＋０． ４ｍ１）により、還流で４０分間処理した。次いで混合液をセライトでろ過した 。クロマトグラフィーｆｌｌＷ後のシロップ状の化合物１１の収率は５０％だっ た。

２−（２−アジドエトキシ）エチル２．　５−ジー０−ベンジル−β−Ｄ−リボ フラノシド（化合物１１、ｐ＝ｔ、Ｒ’＝Ｎ３１化合物６　（２，０ｇ）と塩化 トリメチルシリル（１５ｍｌｌの混合液を室温で２０分間放置し、次いで４１１ し、乾燥ジクロロメタンで共濃縮した。残渣を２−（２−アジドエトキシ）エタ ノール（２，Ｏｇ＋と、粉末化した４八分子ふるい（３，Ｏｇ）と、乾燥ジクロ ロメタン（１５ｍｌ）と混合し、室温で終夜攪拌し、次いでろ過し、濃縮した。

残液を０．０４Ｍメタノール性ナトリウムメトキシドｆ２５ｍｌ）で回収した。

室温で１時間後、混合物を００７・の添加によって中和し、次いで濃縮し、Ｎ、 Ｎ−ジメチルホルムアミドで１回共濃縮した。残渣をＮ、Ｎ−ジメチルホルムア ミド（２０ｍｌｌに溶かし、室温で攪拌しながら、粉末化した水酸化ナトリウム （３，Ｏｇ）、続いて塩化ベンジル（３，０ｍ１）を加えた。

薄層クロマトグラフィーが完全な変換を示した時、メタノール＋２ｍｌ＋を加え 、１５分後、混合液を水およびトルエンで分液し、有機相を水で洗浄し、濃縮し た。

残渣をシリカゲルの短いカラムのクロマトグラフィーにより、トルエン−酢酸エ チル＋８　二２）を溶出液として使用して精製した。適切な分画を集めて濃縮し 、次いで、塩化トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉｌおよび塩化水 銀／酸化水銀によって、化合物９の合成法で説明したように、連続して処理した 。

クロマトグラフィー精製後のシロップ状の化合物１１の収率は５０％だった。

２、　２−ジェトキシエチル２．　５−ジー０−ベンジル−β−Ｄ−リボフラノ シド３−）（−ホスホネート（化合物１０、ｐ＝ｌ、Ｒ’＝エチル）化合物９を ２本質的に化合物８の合成法について説明したように、ホスホン酸および縮合試 薬で処理し、非晶質化合物１０を生成した（６７％）。

２−　［２−（ベンジルオキシカルボニルアミド）エトキシ］エチル２，５−ジ ー０−ベンジル−β−Ｄ−リボフラノシド３−Ｈ−ホスホネート（化合物１２、 ｐ＝１、Ｒ’＝ＮＨＣＯＯＢｎ） 化合物１１を、本質的に化合物８の合成法について説明したように、ホスホン酸 および縮合試薬で処理し、非晶質化合物１２を生成した（７５％）。

２−（２−アジドエトキシ）エチル２，５−ジー０−ベンジル−β−Ｄ−リボフ ラノシド３−Ｈ−ホスホネート（化合物１２、ｐ＝ｌ、Ｒ４＝Ｎ３）化合物１１ を、本質的に化合物８の合成法について説明したように、ホスホン酸および縮合 試薬で処理し、非晶質化合物１２を生成した（７０％）。

Δ　： １、化合物７の３−コハク酸塩の合成 ４−ジメチルアミノピシリン（１ｍｍａｌｌを含む化合物７　（４ｍｍｏｌ）の 乾燥ピリジン（２５ｍｌ）溶液に、無水コハク５＃！（１０ｍｍｏｌ）を加えた 。終夜攪拌した後、水（０，５ｍ１ｌを加えた。３時間後、混合液を１：１トル エン−酢酸エチルとリン酸水溶液の緩衝液（ｐＨ６，５）で分液した。より大き な有機を緩衝液で洗浄し、濃縮した。Ｎられた７の３−コハク酸塩を五酸化リン 上で真空乾燥した。

２．３−コハク酸塩の面相へのカップリング上記で得られたコハク酸塩（樹脂の アミノ基含量の１０当量）をジクロロメタン（５ｍｌ／ｇ）に溶かし、少量のジ クロロメタン中で、ジクロロへキシルカルボジイミド（樹脂のアミノ基含量の５ 当量）の溶液と混合した。混合液を室温で１５分間攪拌し、次いで濃縮した。残 渣をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ／ｇ）に溶かし、溶液をろ過し、次 いでメリフィールド型アミオメチル樹脂（あらかじめＮ、Ｎ−ジメチルホルムア ミドで洗浄）に添加した。６時間後、樹脂をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、次 いでピリジンで洗浄した。樹脂を９：１ピリジン−無水酢酸で２時間処理し、ピ リジンで洗浄し、次いでジクロロメタンで洗浄した。機能性の程度は、乾燥して 秤取した樹脂を、１．２−ジクロロエタン中で０．５％トリフルオロ酢酸で処理 し、上清中のトリチル陽イオンの含量を分光測定（４９５ｎｍｌによって推定す ることによって定量した。

ム　：°　ル 面相合成の操作は、ガラスフィルタの底部を有する反応槽と、攪拌装置（小スケ ールパッチは、乾燥窒素を底部のフィルタから送り込むことによって攪拌する） と、液体排出口（底部）と、液体吸入口（上部）とを備える半自動装置において 実施した。液体は、反応槽から底部のフィルタを通して吸引により除去し、窒素 を送り込むことにより、テフロンチューブを通して他の反応槽がら上部に加えた 。

１、トリチルの脱保護 樹脂は、トリチル陽イオンが放出されなくなるまで（分光測定によって定量）、 ０．５％トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液で処理し、次いで樹脂をジクロ ロメタン、続いて４：１ジクロロメタン−ピリジンで洗浄した。

２、カップリング 塩化ピバロイル（ｍｌ脂の水酸基に対して４当量）のジクロロメタン溶液（塩化 物１ｍｍｏ１当り２ｍ１）を化合物８（４当量）の４＝１ジクロロメタン−ピリ ジン溶液（塩化物１ｍｍｏｌ当り８ｍ１）に加えた。２分後混合液を樹脂に添加 した。攪拌を１０分間続け、次いで樹脂をピリジンと、４：１ジクロロメタンピ リジンおよびジクロロメタンで連続して洗浄した。各カップリングステップの収 率は、脱保護ステップの場合のように、放出したトリチル陽イオンの量を分光測 定法で定量した場合、９７％〜９９％だった。

連延停且 脱トリチル化した樹脂を（２）に従い、８の代りに化合物９または１１で処理し た。

樹脂を、新たに調製したヨウ素の９８％ピリジン水溶液による１％溶液で３０分 間処理し、次いでピリジンおよびジクロロメタンで連続して洗浄した。

徴また旦少徐法 樹脂をナトリウムメトキシド　１：１ジオキサン−メタノール（０，０５Ｍ）に より、室温で１６時間処理し、酢酸を加え、次いで混合物をろ過し、ろ液を濃縮 した。ＮＭＲ分析によると、残渣は不純物とともに、化合物１３　（１０を連鎖 停止に使用した場合）または１５　ｆ１２を連鎖停止に使用した場合）を含んで いた。

１傑１ １、化合物１３の化合物１４への変換 前述のように樹脂から除去された物質を、酢酸（０，３％）を含む１：２：２酢 酸エチル−エタノール−水（物質１ｍｇ当りＯ，１ｍ１）に溶かし、１ｏ％Ｐｄ ／Ｃ（物質１ｍｇ当り０．　５〜２ｍｇ）を加えた。混合液を６０″″Ｃ大気圧 で終夜水素添加し、次いでろ過し、ｐＨ７に調整し、濃縮した。残渣はジエチル エーテルと水で分液した。水相を分離して濃縮した。残渣を５０％トリフルオロ 酢酸の水溶液により、０＠Ｃで回収した。４時間後、混合液をｏ”ｃにおいてア ンモニアで中和してｐＨ７とし、次いで混合液を約１０ｍｇ／ｍｌの容量まで濃 縮し、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ６，２で充填および溶出したＦ ｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ　ＨＷ−５０のカラムに供した。適切な分画を集め、 濃縮し、再び水に溶かした（物質１ｍｇ当りＯ，１ｍ１ｌ。本水溶液は、Ｄｏｗ ｅｘ−５０ｘ　８　（Ｎａ型、水で充填および溶出）をゆっくりと通過させた。

適切な分画を集め、凍結乾燥した。Ｄ２０溶液のＮＭＲスペクトルは、特に、ア ノマープロトンのシグナルを４．９〜５．１ｐｐ’ｍの領域に、スペーサ単位体 （アルデヒドのプロトン、二水和物の形）を５．１〜５．２ｐｐｍに示した。良 好なカップリングサイクルの量（すなわち、化合物１４の化学式におけるｎの値 ）は、アノマーのシグナルとスペーサのシグナルにつき、それぞれ積分すること によって確認した。

２、化合物１５の化合物１６への変換 樹脂から除去された物質は、トリフルオロ酢酸処理を省略した以外は、化合物１ ３の１４への変換について前述したのと本質的に同様に処理した。凍結乾燥品の ｏ　２　ＯＷｉ液のＮＭＲスペクトルは、特に、アノマープロトンのシグナルを ４．９〜５．ｌｐｐｍの傾城に、スペーサ単位体（ＣＨ７Ｎ　トリプレット）を ３．　２ｐｐｍに示した。良好なカップリングサイクルの量（すなわち、化合物 １６の化学式におけるｎの値）は、アノマーのシグナルとスペーサのシグナルに つき、それぞれ積分することによって確認した。１４および１６の精製は、２． ５％アセトニトリルを含むＯ，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶ｊｆｆｌ（ ｐＨ５，３）を使用する、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８の分取ＨＰＬＣによっ ても可能だった。

■ Ｈｌｂ　゛へシン　製 細菌は既定の培地で２４時間培養し、代謝的に３″Ｓ−メチオニンで標識した。

細胞を採取し、食塩水中で遠心分離によって３回洗浄し、約２０ｍ１の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝掖、ｐＨ７，４中液懸濁し、氷上で冷却した。次いで細菌の懸濁 液を、氷上で、Ｂｒｏｎｓｏｎソニケータの設定４で、３０秒ずつ６回超音波処 理した。超音波抽出物を１０．ＯＯＯＸｇで１０分間、４°Ｃで遠心分離し、生 成した膜外に存在するたん白質（ＯＭＰ）のペレットを、使用までプロテアーゼ 疎外剤（ＰＩＣＩおよびＰＩＣＩ工）を含むＨｅｐｅｓ緩衝液中に保存した。

ＯＭ　Ｐ　ハ、次に１ｏｏｌ　ｏｏｏｘｇで３０分間、４＠Ｃ１’遠心分離し、 生成したペレットを、１．３％オクチルグリコピラノシド（シグマ）を含む４ｍ ｌの１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８，０に懸濁し、５分間超音波処理し、室温で ３０分間インキュベートした。生成したＯＭＰを再びｉｏｏ、ＯＯＯＸｇで３０ 分間、４＠Ｃで遠心分離し、部分精製されたアトへシンを含む懸濁液をデカント し、保存した。

アトへシンを、次のように受容体−親和性固相処理によって生成した。上清を。

１５０ｍＭＮａＣＬおよび１％ウシ血清アルブミンｆＢｓＡ）を含む５０ｍＭト リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，８中で１／１０に希釈し、あらがじめＢＳＡでブロック しである、受容体で被覆したミクロタイターウェル（ガングリオテトラオシルセ ラミド０．８μｇ／ウェル）中でインキュベートした。受容体のない対照ウェル も使用した。室温でのインキュベーションの２時間後、ウェルを冷食塩水で４回 洗浄した。受容体結合性アトへシンは、ウェルを３０分間、３７°Ｃにおいて、 ０．１％ＳＤＳを含み、あらがしめ６ｏ＠ｃに加温した０、０５ｍ１の１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８でインキュベートすることによって溶出した。ＳＤ Ｓ溶出緩衝液をウェルがも除去し、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ ィーによってたん白質を分析した。

別法として、アトへシンは、脂質受容体が適切なゲル固体支持体に固定化された アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製することができる。

超音波抽出物はゲルの上部に添加され、カラムが洗浄され、非結合性の物質が除 去される。次いでアトへシンがＳＤＳ溶出Ｍ衝液、あるいはＮａＣ１またはＫＳ ＣＮのようなカオトロビズム剤によって溶出され、透析され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ およびオートラジオグラフィーによって分析される。

精製したアトへシンたん白質の分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動によって決定した。図１は、次のレーンにおけるサンプルの分析を示してい る。１、ｂ型インフルエンザ菌から得られた、クマシーブルーで染色したすべて の膜外に存在するたん０賀試料；２．３５ｓで標識したすべての膜外に存在する たん白質のオートラジオグラフ；３、固定化した受容体ａｓｉａｌｏ−ＧＭ＋が ら溶出された３５３標識アトへシンたん白質のオートラジオグラフ；４、無意味 な糖脂質である。固定化グロボシドから溶出された物質のオートラジオグラフ、 矢印は、ＰｌおよびＰ２の間に移動した分子量約４１ｋＤのアトへシンを示す。

医ｌ へ　゛ヘシン　４ ＢＡＬＢ　Ｃマウスに、１０μｇの部分精製したアトへシンたん白質（ＨｉｂＯ ＭＰｓ）／完全フロインドアジュバント＋１　：　１１を腹腔内投与した。１ケ 月後、これらのマウスに、不完全フロインドアジュバントを用いて、２回目の腹 腔内投与（１０μｇのたん白質）によって追加投与し、１０日後３回目の投与を 行った。

次いで、抗血清を、受容体結合測定における３５Ｓ標！１Ｈｉｂアトへシンに対 する中和活性について調べた。この場合、抗血清および正常マウス血清を、様々 な希釈において、”３１１ｍＭ１　ｂアトへシンたん白質で１時間、室温におい てインキュベーションし、次いで、ａｓｉａｌｏ−ＧＭＩで被覆したマイクロタ イターウェル、またはネガティブコントロールとして、グロボシドに加えた。マ イクロタイター平板で２時間室温におけるインキュベーションの後、マイクロタ イターウエルを洗浄し、平板から切り出し、ベーターシンチレーションカウンタ を使用して、放射活性を定量した。結果は図２に示す。結果は、アトへシンは免 疫原性であり、アトへシンに対する抗体は、有効にアトへシンの受容体結合活性 を効果的に中和することを示している。

氾 ンフルエン　゛ヘシン の同定とクローニング １、受容体に結合する膜たん白質。

膜たん白質は、次のように調製した。ヘモフィルス属を定常期まで培養し、ベレ ットをとり、食塩緩衝液中で再懸濁し、超音波処理によって破砕した。この物で １時間遠心分離した。生成したベレットは、ヘモフィルス属の膜を含んでおり、 これらを、食塩水中で再懸濁し、参考文献に含まれる、Ｋｒ１ｖａｎ、　ｅｔ　 ａｌ、　ＰＪＭ、ｊｉａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：６１５ ７−６１６１　（１９８８）に記載のように、アトへシン活性について調べた。

簡単に説明すると、膜は、［３５３］メチオニンで代謝的に標識化した細胞（媒 体１ｍｌ当り１μｍＣ１）からｍ製した。糖脂質をクロロホルム：メタノール（ １：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）中で再！！濁し、９６ウエルマイクロタイター平板中 に系列希釈した。これらの平板を乾燥させ、トリス／ＢＳＡ　（２５ｍＭトリス 、ｐＨ７，５，１％ウシ血清アルブミン）で５回洗浄し、次いで標識化した膜２ ｘｌＯ’ＣＰＭを各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした０次いで平 板をトリス／ＢＳＡで５回洗浄し、個々のウェルを切り出し、シンチレーション カウンタでカウントし、各ウェルに結合したＣＰＭの量を決定した。これは、結 合したＨｉ膜がＨｉの全体細胞に同様であることを示した。

２、ヘモフィルス属のアトへシンを阻害するモノクローナル抗体の精！！、Ｂａ １ｂ／ｃマウスをヘモフィルス属の膜で免疫化し、これらの血清を、膜が受容体 に結合するのを阻害する抗体の産主について調べた（図２）。これらのマウスの 膵臓を、参考文献に含まれるＨａｒｌｏｗ、　ｅｔ　ａｌ、、知旦畑ｄｉｅ＋法 １１ゆ五犯犯１１紐剋Ｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）　（１９８ ５jに従い、 ５Ｐ２１０−ＡＧ１４　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８２８７）　マウス骨髄腫細胞との 融合に用いる牌細胞を単離するのに使用した。４つの別々の融合がらの、７５０ の陽性融合ハイブリドーマ培養を、膜によってＥＬＩＳＡに反応する抗体の産生 についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡは次のように実施した。１μｇのたん 白質を含む膜を使用して、９６−ウェルマイクロタイター平板を被覆した。被覆 したウェルをＰＢＳ　（リン酸緩衝化食塩、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７ ，５，１６７ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、次いで１００μｍのハイプリドー マ培養上清でインキュベートした。ウェルを洗浄し、ホースラディツシュベルオ キシダーゼに結合した二次ヤギ抗マウス抗体１００μｍで１時間インキュベート し、次いで結合した抗体を比色定量法によって検出した（Ｂｉｏｒａｄ）。次い で、７５の膜反応性ハイブリドーマ培養を、膜結合を阻害する能力について調べ た（図３）。ハイブリドーマ培養の上清を、［３５Ｓ］メチオニンで標識した膜 ４Ｘ１０’ＣＰＭで、１時間室温でインキュベートした。この混合液を次いで受 動的に９６−ウェルマイクロタイター平板に結合した受容体の系列希釈に加え、 結合について測定した。２種類の阻害抗体が同定された。ＨｉｂｌＯと呼ばれる 抗体のような１種類は、結合を完全に阻害し、次いで、これらの膜のりボオリゴ 糖成分との反応が見られた。Ｈｉｂ３０およびＨｉｂ４３と呼ばれるような抗体 の第２の種類は、部分的に結合を阻害した。

３、アトへシンであると判断されるもの７７の同定。　Ｈａｒｌｏｗらの方法に 従い、結合を部分的に阻害する抗体を産生じたハイブリドーマの培養を、限界希 釈によりクローン化し、安定な細胞系を得た。大量の抗体がＢ　ａ　ｌ　ｂ　／ 　ｃマウスの腹水中に産生され、各抗体の１頬を、Ｈａｒｌｏｗらの方法に従っ て決定した。Ｈａｒｌｏｗらの方法に従い、次いで抗体をヘモフィルス属の膜と 全細胞のウェスタンプロットに使用し、潜在的なたん白質アトへシンを同定した 。これらの抗体のすべてが、この技法により、約４７ｋＤａのたん白質を認識し た（図４）。

Ｈａｒｌｏｗらの方法に従い、これらの抗体によるウェスタンプロット分析によ って、このたん白質の特性化がさらに可能となった。一連の証拠により、機能ア トへシンについて予想されるように、このたん白質がヘモフィルス属の表面に存 在することを示唆した。第１に、前述の、ただし、放射樟縄した全細胞（４×１ ０’−ＣＰＭ／ウェル）を使用した膜結合阻害についての測定において、全細胞 の受容体に結合する能力は、これらの抗体によって阻害された。第２に、全細胞 をプロテイナーゼにで処理すると、４７ｋＤａの免疫応答たん白質は分解された 。藺胤に説明すると、全細胞を定常期まで培養し、遠心分離（１２，ＯＯＯｘｇ ｌによってペレット化し、ＰＢＳ中で再懸濁した。プロテイナーゼにの系列希釈 を細胞ニ加え、１時間インキュベートした。次いで、Ｌａｅｍｍｌｌ、　Ｉ■」 Ａｌ■包０．２２７：６８０−６８５　（１９７０）　（参考文献に含まれる） に従って細胞を５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合し、煮沸し、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ上で分離した。このゲルを次いでウェスタンプロット法で測定し、免疫応 答性の４７ｋＤａのたん白質の存在を検出した。第３に、ヨウ素化した全細胞は 、安定化したたん白質がら抗アトへシン抗体によって免疫沈降される、放射標識 した４７ｋＤａのたん白質を含んでいた。簡単に説明すると、全ヘモフィルス属 を定常期まで培養し、遠心分離によってペレット化した。１ｍ１１をＰＢＳ中で 再！！！濁し、Ｉｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ）により、製造業者の忠告に従 ってヨウ素化した。次いで、細胞を放射免疫沈降緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液、２０ ｍＭトリス、ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％Ｎｏ ｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０，１％デオキシコール酸塩、０゜１％ＳＤＳ、１ｍＭ　Ｐ ＭＳＦｌ中で安定化し、続いてＯａｍｍａｂｉｎｄビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）により、終夜４°Ｃでインキュベートした。次いでこれらのビーズを遠心分１ １　（２０００ｘｇ、５分）によってペレット化し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２ ０を含むＰＢＳで５回洗浄し、５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で再懸濁した 。このサンプルを、次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを乾燥し、オ ートラジオグラフィーによって測定した。これにより、４７ｋＤａのたん白質は 、ヨード化可能であることが示された。第４に、１％Ｔｒ１ｔｏｎＸ−１００に よってくり返し抽出された全細胞および膜は、この４７ｋＤａ免疫応答性たん白 質を失っていた。これは、全細胞または膜をとり、これらを洗剤と混合し、遠心 分離（膜に対しては１２．ＯＯＯＸｇ、全細胞に対しては２０００ｇ）によって 物質をペレット化し、上清を採取することにより、実施した。

この物質（ベレットおよび上清）を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ウェスタン プロット法で測定し、Ｈｉｂ４３抗体により、４７ｋＤａのたん白質の存在を可 溶性分画（上清）中に検出した。

４７ｋＤａアトへシンをコード化する遺伝子のクローニングと配列決定、　クロ ーニング法は、参考文献に含まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　ニーＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　 （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　gａｒｂｏｒ。

ＮＹ）　（１９８２）に記載された標準的な方法によって実施した。ｂ型インフ ルエンザ菌の全ＤＮＡを単離し、制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ１により、製造業者ｆＢｏ ｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ）の忠告に従い、部分的に分解した。４〜１ ５ｋｂｐの長さのＤＮＡフラグメントをショ糖勾配上で単離し、Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ社によって供給されたＥｃｏＲｌ−分解Ｌａｍｂｄａ　ＺＡＰＩＩアーム に結合させた。この結合を’１ｉｄｓでファージ粒子に入れ、大腸菌宿主株ＸＬ −１にトランフエクションしく３ｔａｔａｇｅｎｅプロトコルに従った）、ヘモ フィルス属たん白質を発現するファージプラークを得た。これらのプラークは、 ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｐｉｃｏｂｌｕｅ検出キットを使用して、Ｈｉｂ４３に よる免疫プロットスクリーンで使用した。

陽性の反応プラークを精製し、ヘルパーファージＲ４０Ｂを用し１てプラスミド の産生を誘発するのに使用した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルに従った）。

これらのプラスミドは、４７ｋＤａの免疫応答性たん白質をコード化するヘモフ ィルス属挿入ＤＮＡを有していた。ｐＭｃｌｏｌと呼ばれる、これらのプラルミ ドの１つに対する制御マツプは、図５に示しである。４７ｋＤａのたん白質を発 現するプラスミドは、すべてＨｉの１０．５ｋｂｐ　ＤＮＡを含んでｂ）た。こ のたん白質をコード化する遺伝子の位置は、ｐＭｃｌｏｌの内質分析によって決 定し、矢印で示した。矢印は転写の方向も示している。内質分析は、様々な制限 フラグメントをベクターｐＳＫ　（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に含むｐＭ Ｃ１０１のサブクローンの生成によって実施した。これらのサブクローン番よ、 図５におし）て、それぞれがＨｉｂ４３免疫応答性たん白質を発現するかどう力 ）の表示と共（こホした。ｐＭＣ１０２は約４５ｋＤａのたん白質を発現し、こ のたん白質のカルボキシ末端がこのクローンにおいて除去されていることを示し た。成”したたん白質が４７ｋＤａであることから、全コード配列は、約１５０ ０〜１８００のＤＮＡ塩五対であることを示唆する。したがって、４７ｋＤａの たん白質をコード化する遺伝子の開始部位は、このＢａｍＨ１部位から約１５０ ０〜１ｓｏｏ１１１基対であることが予測される。４７ｋＤａのたん白質の発現 ζよ、ｐｓＫ　（−１１こ含まれるβ−ガラクトシダーゼプロモーターに関して 、遺伝子の方向Ｃ二無関係蓚こ。

同様であり、このたん白質が、大腸菌において、それ自体のプロモーターの下で 発現されることを示している。このたん白質を発現する大腸菌のクローンの膜を 、このたん白質を発現しない大腸菌の膜と比較した（図６）。双方の膜標本６二 対する結合曲縁は、このたん白質が、大腸菌に、ヘモフィルス属のようシこ、受 容体に高親和性で結合する能力を与えていることを示している。

５．４７ｋＤａのアトへシンは新規たん白質である。　一連の主要な膜内に存在 するたん白質が何人かの研究者（参考文献に含まれる、Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　５５：２９９３−３０００　（ ＋９８７））によって特性化されてきた。これらには、約４３ｋＤａのＰｌ、約 １８ｋＤａのＰ６が含まれる。４７ｋＤａのアトへシンは、これらの以前に特性 化されたたん白質のいずれでもないことが分析により確認された。ＰｌまたはＰ ６を発現する大腸菌クローンを使用した結果、いずれのクローンもＨｉｂ４３と 反応せず、この抗体は、これらのたん白質のいずれをも認識しないことを示唆し た。さらに、Ｐまたん白質は大きさが４７ｋＤａのアトへシンと同様であるため 、我々は、熱修飾により、４７ｋＤａのアトへシンがＰｌでないことを確認した 。Ｐｌを発現する大腸菌を、室温または１００”Ｃにおける処理の後、５ＤＳ− ＰＡＧＥによって分離した。Ｐｌは熱によって修飾されることが、以前に示され ている（Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）。１００’Ｃでの処理後、たん白質 は約４３ｋＤａで泳動したが、室温での処理後、Ｐｌは約３２ｋＤａで泳動した 。４７ｋＤａのたん白質は熱による修飾を受けないことが示された。

６．４７ｋＤａのアトへシンの精製　Ｋｒ１ｖａｎらの方法に従い、モノクロー ナル抗体Ｈｉｂ４３を免疫吸収剤として使用し、４７ｋＤａのたん白質を単一物 に精製した。簡単に説明すると、抗体を、シアン活性化セファロース４ＣＬビー ズ（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａｌに、製造業者の忠告に従って結合させた。約８ｍｇ の結合抗体を含む４ｍｌカラムを使用した。４７ｋＤａのたん白質は、Ｌｕｒｉ ａ　Ｂｒｏｔｈで４Ｌの培地中で定常期まで培養したＸＬ−１／ｐＭｃ１０１に よって産生じた。細胞は遠心分離（１２，ｏｏｏｘｇ、１５分間）によってペレ ット化し、ＰＢＳ中で再懸濁し、超音波処理した。超音波処理物を遠心分離（１ ２１０００ｘｇ、１５分間）によってペレット化し、上清を遠心分１！（１００ ０，０００×ｇ、１時間）によってペレット化した。生成した膜ベレットを１％ ５ａｒｋｏｓｙｌ　（Ｎ−ラウリルサルコシン）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ）中で再＠濁し、遠心分ｍｌ＋１００．’ＯＯＯｘｇ、１時間）によってペレ ット化した。上清をＰＢＳで十分に透析し、抗体カラムに供した。次いでカラム をＰＢＳで洗浄し、結合たん白質を３．５Ｍ　Ｍ１ｉＣ１２で溶出した。この物 質をＰＢＳで透析し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の分離によって分析した。ゲルはｌ１ ｌ（Ｂｉｏｒａｄ）によって染色した。４７ｋＤａのたん白質は単一種として出 現し、精製が単一であることを示した。

ヘモフィルス属による４７ｋＤａアトへシンの保存　この４７ｋＤａのたん白質 のへモフィルス属の保存を、表５にリストした、選択された生物の全細胞のウェ スタンプロットを用いて分析した。臨床的に単離したインフルエンザ菌の分類不 能型、ｂ型、未分類型が、Ｈ１ｂ４３と反応する約４７ｋＤａのたん白質を有し ている。

匠） Ａ　ＰＲへ　ドブ１ン ４　Ｉゴマ− ヒト血清アルブミン（４１ｍｇ、１．０ＬＬｍｏｌ）のリン酸緩衝液（０，１Ｍ 。

ｐＨ８，０，１，５ｍｌ＋の溶液を、化合物１４　（４０ｇｍｏｌ）の溶液と混 合し、次いで１時間後、水素化シアノホウ素ナトリウム（２６ｍｇ、４１０μｍ ０１）を加えた。混合物を穏やかに３７’Ｃで４日間攪拌し、次いで限外ろ過し 。

水で洗浄し、再び限外ろ過した。保持された物質を凍結乾燥し、Ｂｌｏ−Ｇｅ１ Ｐ４でゲルろ過して精製した。適切な分画を採取し、凍結乾燥した。機能性の度 合（ハプテン／たん白質分子として）は、Ｌｏｗｒｙたん白質定量とオルシノー ルリボース定量の組合せによって推定した。一般に、５〜１０というハプテン／ たん白質分子の値が得られた。

ね１１Ｌｌａ土呈亘ヱニ豊１月 化合物１６　（ｌｏｏｇｍａｌｌの、水酸化ナトリウム水ｉ８液（０，５Ｍ、６ ゜０ｍ１）とエタノール（４，０ｍ１）と酢酸（１８０μｌ）の混合液の溶液を 攪拌しながら、チオホスゲン（３０μｌ）を加えた。１０分後、混合液を酢酸エ チルと水で分液し、水相を半量にｆｉＩＩｌ、、、ヒト血清アルブミン（１６４ ｍｇ、４゜０μｍｏｌ）のホウ酸緩衝液（０，ＬＭ、　ｐＨ９，３，６ｍ１）の 溶液に加えた。

ｐＨを９．５に調整し、混合液を穏やかに終夜室温で攪拌し、次いで限外ろ過し 、水で希釈し、再び限外ろ過した。保持された物質を凍結乾燥し、Ｂｌｏ−Ｇｅ １Ｐ４でゲルろ過して精製した。適切な分画を採取し、凍結乾燥した。機能性の 度合（ハプテン／たん白質分子として）は、Ｌｏｗｒｙたん白質定量とオルシノ ールリボース定量の組合せによって推定した。一般に、１０〜２０というノ１ブ テン／たん白質分子の値が得られた。

表１　：　ＰＲＰフラグメントの固相合成用単量体の合成ａｓ開始用単を体　連 鎖延長用単量体 表２：面相合成における連鎖停止用のスペーサーを含む単量体の合成面相合成に おける 連鎖停止用単量体 表３：固相合成終了後に得られたオリゴマーまたは、別法として、 表４＝合成ＰＲＰフラグメントおよびアトへシンたん白質間の複合体の構造表５ ：選択されたヘモフィルス属のＨ１ｂ４３との反応性生物　種　型　Ｈ１ｂ４３ との 反応 ）１ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ＡＴＣＣ９７９５ｂＨ，１ｎ ｆｌｕｅｎｚａ　ＡＴＣＣ３３５３３ｂＨ，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ＡＴＣＣ４３ ０９５分類不能Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ＡＴＣＣ１０２００ｂＨ，１ｎｆｌｕ ｅｎｚａ　臨床　未分類Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎＺ１１　臨床　未分類Ｈ，１ｎｆｌ ｕｅｎｚａ　臨床　未分類Ｈ，ｓｏｍｎｕｓ　ウシ　未分類 図１ 結合１．、ｆ″３５−８−標ｉ１０ＭＰ（ｃｐ”）　へ区 図３ ＰＫ処理　−＋＋−＋＋　−＋＋ 図４ ０　０　０　０　ロ Ｏ呂 。、８呂８ Ｓ−３５＋！識ＯＭＰ（ｃｐｍｌ　（０区 国際調査報告 ｌｍｅｍｍｅ＋＋−＾ｍｌ軸！１＠ｎ　ｋ＊、　ＰｃＴルｌ１１１０８＋１３フ ロントページの続き （５１）　［ｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　３１０６ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４８ Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．インフルエンザ菌アドヘシンたん白質に結合されたポリリボシルリビトール ホスフェート（ＰＲＰ）フラグメントを含む、免疫原性オリゴ糖−たん白質複合 体である。
2. ２．請求の範囲第１項記載の複合体において、前記ＰＲＰフラグメントが合成オ リゴ糖である複合体。
3. ３．請求の範囲第２項記載の複合体において、前記合成オリゴ糖は、次の化学式 で表される、リボースとリビトールの分子がホスホジエステル結合によって交互 につながる直鎖のホモポリマーである複合体であり、▲数式、化学式、表等があ ります▼ ここにおいて、ｎは２〜３０である。
4. ４．請求の範囲第３項記載の複合体において、前記オリゴ糖の１〜３０が、前記 たん白質に結合されている複合体。
5. ５．請求の範囲第１項記載の複合体において、前記たん白質が、分子量約４１、 ０００ダルトンの少量のインフルエンザ菌の膜外に存在するたん白質である複合 体。
6. ６．請求の範囲第１項記載の複合体において、前記たん白質が、分子量約４７、 ０００ダルトンのインフルエンザ菌の膜外に存在するたん白質である複合体。
7. ７．請求の範囲第１項記載の複合体において、前記オリゴ糖が、前記アドヘシン たん白質の活性部位を含むポリペプチドに結合している複合体。
8. ８．請求の範囲第１項記載の複合体の合成の工程において、前記ＰＲＰフラグメ ントを前記たん白質に共役的にカップリングさせる工程を含む工程。
9. ９．次の化学式で表される免疫原性オリゴ糖−たん白質複合体であり、▲数式、 化学式、表等があります▼ ここにおいて、ｍは１〜３０、ｎは２〜３０、Ｒは（ＣＨ２）ｐＣＨ２ＮＨまた は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＳＮＨで、ｐは１〜３、Ｘはインフ ルエンザ菌アドヘシンたん白質または前記たん白質の活性部位を含むフラグメン トである。
10. １０．精製インフルエンザ菌アドヘシンたん白質。
11. １１．請求の範囲第１０項記載のたん白質において、前記たん白質が、ｆｕｃｏ ｓｙｌａｓｉａｌｏ−ＧＭ１と、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１と、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ ２と、から成る群から選択された、前記たん白質に対する受容体に結合するたん 白質。
12. １２．請求の範囲第１１項記載のたん白質において、前記たん白質が、分子量約 ４１、０００ダルトンの少量のインフルエンザ菌の膜外に存在するたん白質であ るたん白質。
13. １３．請求の範囲第１１項記載のたん白質において、前記たん白質が、分子量約 ４７、０００ダルトンのインフルエンザ菌の膜外に存在するたん白質であるたん 白質。
14. １４．請求の範囲第１０項記載のたん白質のフラグメントである精製ポリペプチ ドにおいて、前記フラグメントが活性部位を含んでいる精製ポリペプチド。
15. １５．請求の範囲第１０項記載のたん白質の活性部位である精製ポリペプチド。
16. １６．請求の範囲第１５項記載の精製ポリペプチドにおいて、前記活性部位がイ ンフルエンザ菌受容体結合部位である精製ポリペプチド。
17. １７．請求の範囲第１６項記載の精製ポリペプチドにおいて、前記受容体結合部 位が、動物宿主においてインフルエンザ菌に対して抗原応答を発現する能力があ り、請求の範囲第１１項記載のたん白質と免疫学的に交差反応性である精製ポリ ペプチド。
18. １８．請求の範囲第１０項記載のたん白質から、前記たん白質またはポリペプチ ドの１つ以上のアミノ酸の付加、置換、または除去によって誘導された精製たん 白質またはポリペプチドにおいて、前記誘導されたたん白質またはポリペプチド が、請求の範囲第１０項記載のたん白質と免疫学的に交差反応性である精製たん 白質またはポリペプチド。
19. １９．請求の範囲第１４項記載のポリペプチドから、前記ポリペプチドの１つ以 上のアミノ酸の付加、置換、または除去によって誘導された精製ポリペプチド。
20. ２０．精製インフルエンザ菌アドヘシンたん白質を産生する方法において、イン フルエンザ菌の膜を安定化し、前記アドヘシンたん自質および不溶性物質を含む 安定化された物質を産生するステップと、前記安定化された物質を前記不溶性物 質から分離するステップと、ｆｕｃｏｓｙｌａｓｉａｌｏ−ＧＭ１と、ａｓｉａ ｌｏ−ＧＭ１と、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ２と、から成る群から選択された、前記ア ドヘシンたん白質に対する受容体に、前記安定化した物質を接触させるステップ と、前記たん白質を前記受容体から除去し、前記アドヘシンたん白質を精製体と して回収するステップと、から成り、 前記受容体が、前記アドヘシンたん白質が前記受容体に結合するのに十分な時間 、不溶性の固体支持体に結合される、産生方法。
21. ２１．請求の範囲第２０項記載の工程によって産生される、精製インフルエンザ 菌アドヘシンたん白質。
22. ２２．精製アドヘシンたん白質を産生する方法において、膜付随のたん白質を取 り出す溶液でインフルエンザ菌膜を抽出し、前記アドヘシンたん白質を含む抽出 物を産生するステップと、前記アドヘシンたん白質を含む上清を、前記抽出物中 の固体物質から分離するステップと、 前記上清を、前記アドヘシンたん自質に対するモノクローナル抗体と接触させる ステップと、 前記アドヘシンたん白質を前記受容体から除去し、前記アドヘシンたん白質を精 製体として回収するステップと、から成り、前記抗体が、前記アドヘシンたん白 質が前記モノクローナル抗体に結合するのに十分な時間、不溶性の固体支持体に 結合される、産生方法。
23. ２３．請求の範囲第２２項記載の方法によって産生される精製アドヘシンたん白 質。
24. ２４．単離または本質的に精製されたインフルエンザ菌アドヘシンたん白質をコ ード化するＤＮＡ配列。
25. ２５．インフルエンザ菌アドヘシンたん白質をコード化する単離ＤＮＡ配列を産 生する方法において、 インフルエンザ菌のＤＮＡを含むゲノムライブラリーを、前記ライブラリーを含 むクローンを、前記アドヘシンだん白質に対するモノクローナル抗体または前記 アドヘシンたん白質に対する受容体と接触させ、前記抗体または前記受容体に結 合するクローンを同定することによってスクリーニングするステップと、前記ク ローンを単離するステップと、から成り、前記ライブラリーが、操作的に、回収 可能なようにベクターに挿入される前記ＤＮＡの異なる配列を含むクローンから 成り、前記ベクターのそれぞれは、前記ＤＮＡの配列を１つのみ含む、産生方法 。
26. ２６．請求の範囲第２５項記載の方法において、さらに、外因性ＤＮＡ配列を前 記クローンから回収するステップを含む方法。
27. ２７．請求の範囲第２５項記載の方法において、前記ライブラリーが、ファージ 感染細菌を含む方法。
28. ２８．請求の範囲第２５項記載の工程によって産生される単離ＤＮＡ配列。
29. ２９．請求の範囲第２６項記載の工程によって産生される精製ＤＮＡ配列。
30. ３０．単一回または複数回の変異により、請求の範囲第３２項記載のＤＮＡ配列 から誘導される、単離または本質的に精製されたＤＮＡ配列において、前記ＤＮ Ａ配列が、請求の範囲第１０項のたん白質と免疫学的に交差反応性であるたん白 質またはポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列。
31. ３１．高度緊縮状態において請求の範囲第３０項記載のＤＮＡ配列とハイブリッ ドを形成するＤＮＡ配列において、前記ＤＮＡ配列が、請求の範囲第１０項記載 のたん白質と免疫学的に交差反応性であるたん白質またはポリペプチドをコード 化するＤＮＡ配列。
32. ３２．形質転換された宿主細胞において前記ＤＮＡ配列の発現をもたらす能力の ある、適切な制御調節核酸配列に操作的に結合された請求の範囲第２４項記載の ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列。
33. ３３．原核または真核細胞を形質転換する能力のある発現ベクターと、発現に適 切な方向と適切な読み取り枠で挿入される請求の範囲第３２項のＤＮＡと、を含 む、整合性のある宿主細胞において、インフルエンザ菌アドヘシンたん白質をコ ード化するＤＮＡを発現する発現ベクター。
34. ３４．請求の範囲第３２項記載の組換えＤＮＡ配列によって形質転換された宿主 細胞。
35. ３５．請求の範囲第３４項記数の形質転換された細胞によって産生された組換え たん白質。
36. ３６．インフルエンザ菌アドヘシンたん白質を産生する方法において、前記形質 転換された細胞において前記ＤＮＡ配列の発現をもたらす能力のある、適切な制 御調節核酸配列に操作的に結合されたインフルエンザ菌アドヘシンたん白質をコ ードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列によって形質転換された宿主細胞を 培養するステップと、 前記配列によってその発現がコード化されたたん白質を回収するステップと、を 含む産生方法。
37. ３７．次の化学式で表される合成ＰＲＰオリゴ糖であり、▲数式、化学式、表等 があります▼ ここにおいて、ｎは２〜３０の整数、Ｒ１は（ＣＨ２）ｐＣＨＯまたは（ＣＨ２ ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で、ｐは１〜３の整数。
38. ３８．請求の範囲第３７項記載の合成ＰＲＰオリゴ糖を含む物質の組成において 、前記オリゴ糖のすべてが、同一数の単量体単位体を有する組成。
39. ３９．次の化学式によって表される化合物であり、▲数式、化学式、表等があり ます▼ ここにおいて、Ｂｎはベンジル、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチルである。
40. ４０．次の化学式によって表される化合物であり、▲数式、化学式、表等があり ます▼ ここにおいて、Ｂｎはベンジル、Ｒ２は（ＣＨ２）ｐＣＨ（ＯＲ３）２または（ ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２Ｒ４で、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基である 。
41. ４１．次の化学式によって表される化合物であり、▲数式、化学式、表等があり ます▼ ここにおいて、ｎは２〜３０の整数、Ｂｎはベンジル、Ｒ２は（ＣＨ２）ｐＣＨ （ＯＲ３）２または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２Ｒ４で、ｐは１〜３、Ｒ １は炭素１〜４個分の長さのアルキル基、Ｒ４はアミノ基に変換可能な基である 。
42. ４２．請求の範囲第４１項記載の化合物を合成する方法において、（ａ）Ｂｎが ベンジル、ＭＭＴｒがモノメトキシトリチルである、次の化学式で表される化合 物を固相にカップリングさせるステップと、▲数式、化学式、表等があります▼ （ｂ）前記化合物を脱トリチル化するステップと、（ｃ）前記脱トリチル化した 化合物を、Ｂｎがベンジル、ＭＭＴｒがモノメトキシトリチルである、次の化学 式で表される化合物とカップリングさせるステップと、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ｄ）ステップ（ｃ）から生成する化合物を脱トリチル化するステップと、（ｅ ）ステップ（ｃ）および（ｄ）をｎ−２回反復するステップと、（ｆ）ステップ （ｅ）から生成する化合物を、Ｂｎがベンジル、Ｒ２が（ＣＨ２）ｐＣＨ（ＯＲ ３）２または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２Ｒ４で、ｐが１〜３、Ｒ３が炭 素１〜４個分の長さのアルキル基、Ｒ４がアミノ基に変換可能な基である、次の 化学式で表される化合物とカップリングさせるステップと、▲数式、化学式、表 等があります▼ （ｇ）生成した化合物のホスホネート基を酸化してリン酸基を形成するステップ と、 （ｈ）生成した化合物を前記固体支持体から除去するステップと、を含む合成方 法。
43. ４３．請求の範囲第３７項記載の合成ＰＲＰオリゴ糖を合成する方法において、 請求の範囲第４１項記載の化合物を水素化するステップと、Ｒ２が（ＣＨ２）ｐ ＣＨ（ＯＲ３）２である場合、水素化した化合物を選択的酸加水分解に供するス テップと、 を含む合成方法。
44. ４４．請求の範囲第９項記載の、Ｒが（ＣＨ２）ｐＣＨ２ＮＨである複合体を合 成する方法において、請求の範囲第３７項記載の、Ｒ１が（ＣＨ２）ｐＣＨＯで ある合成ＰＲＰオリゴ糖を、請求の範囲第９項記載のたん自質と、還元アミノ化 によってカップリングさせるステップを含む合成方法。
45. ４５．請求の範囲第９項記載の、Ｒが（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ ＳＮＨである複合体合成する方法において、請求の範囲第３７項記載の、Ｒ１が （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である合成ＰＲＰオリゴ糖を、活性化 チオカルボン酸誘導体と反応させ、対応するイソチオシアネートを合成するステ ップと、 前記イソチオシアネートを請求の範囲第１０項記載のたん白質とカップリングさ せるステップを含む合成方法。
46. ４６．哺乳動物をインフルエンザ菌に対して保護するワクチンにおいて、免疫学 的に有効な量の請求の範囲第１項記載の複合体を、薬剤学的に容認されるキャリ ヤ内に含むワクチン。
47. ４７．哺乳動物をインフルエンザ菌に対して保護するワクチンにおいて、免疫学 的に有効な量の請求の範囲第９項記載の複合体を、薬剤字的に容認されるキャリ ヤ内に含み、ｎおよびｐは、 前記複合体のすべてについて同一であるワクチン。
48. ４８．哺乳動物をインフルエンザ菌に対して保護するワクチンにおいて、免疫学 的に有効な量の請求の範囲第１０項記載のたん白質を、薬剤学的に容認されるキ ャリヤ内に含むワクチン。
49. ４９．インフルエンザ菌アドヘシンたん白質を含む融合たん白質を含む免疫原性 ポリペプチド。
50. ５０．免疫学的に有効な量の請求の範囲第３５項記載の組換えたん白質を薬剤学 的に許容されるキャリヤ内に含むワクチン。
51. ５１．哺乳動物においてインフルエンザ菌に対する免疫応答を誘発する方法にお いて、免疫学的に有効な量の請求の範囲第１項記載の複合体を前記動物に投与す ることを含む免疫応答誘発方法。
52. ５２．哺乳動物においてインフルエンザ菌に対する免疫応答を誘発する方法にお いて、免疫学的に有効な量の請求の範囲第１０項記載のたん白質を前記動物に投 与することを含む免疫応答誘発方法。