DE69130955T2

DE69130955T2 - Adhesin-oligosaccharid-impfstoffkonjugate für -i(haemophilus influenza)

Info

Publication number: DE69130955T2
Application number: DE69130955T
Authority: DE
Inventors: Howard C. Bethesda Md 20817 Krivan; Nils Thomas S-222 41 Lund Norberg; James E. German Town Md 20876 Samuel
Original assignee: Antex Biologics Inc
Current assignee: Emergent Product Development Gaithersburg Inc
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1999-07-01
Anticipated expiration: 2011-12-21
Also published as: DE69130955D1; CA2098598A1; EP0565590A1; JPH06508346A; ATE176989T1; ES2131066T3; EP0565590A4; EP0565590B1; DK0565590T3; WO1992010936A1; JP3330935B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Anmeldung ist ein Antrag auf Teilweiterbehandlung der U.S.-Patentanmeldung Serien- Nr. 07/631 698, eingereicht am 21. Dezember 1990.
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Impfstoffe gegen Haemophilus influenzae. Insbesondere betrifft sie einen Konjugatimpfstoff, in welchem ein synthetisches Oligosaccharid, entsprechend einem Fragment der Polysaccharidkapsel von H. influenzae Typ b, an ein H. influenzae-Adhäsinprotein gekoppelt worden ist. Der Impfstoff kann sowohl gegen invasive als auch nicht-invasive H. influenzae-Infektion bei Menschen, insbesondere sehr jungen Kleinkindern, und anderen Säugern verwendet werden.
H. influenzae (Hi) ist in zwei Gruppen unterteilt, diejenigen Stämme, welche eine Polysaccharidkapsel besitzen, und jene, bei denen dies nicht der Fall ist. Die kapseltragenden Stämme werden durch eine serologische Reaktion einer Kapsel mit Referenz-Antiseren typisiert. Es sind die Typen a-f identifiziert worden. Die nichtkapseltragenden Stämme, die darin fehlschlagen, mit irgendeinem der Referenzantiseren zu reagieren, sind als nichttypisierbar bekannt.
Hi sind weltweit ein bedeutendes Gesundheitsproblem. Der Typ b-Stamm (Hib) ist der virulenteste der Hi-Stämme, der Meningitis, akute Epiglottitis und andere lebensbedrohliche Infektionen in fünf Jahre alten und jüngeren Kindern verursacht. Die Sterblichkeitsrate an Typ b-Meningitis beträgt etwa 5%, selbst bei den besten modernen Antibiotika-Behandlungen, und neurologische Folgeerscheinungen werden bei nicht weniger als 25-35% der Überlebenden beobachtet. Tatsächlich ist von Typ b-Stämmen verursachte bakterielle Meningitis als führende Ursache der erworbenen geistigen Retardation in den Vereinigten Staaten identifiziert worden. Daher hat die Weltgesundheitsorganisation die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs gegen Hib zu einer Priorität erklärt.
Nicht-typisierbare Hi verursachen auch verschiedene Erkrankungen, einschließlich Lungenentzündung, Bakterämie, Meningitis, nachgeburtlicher Sepsis, Bronchitis, Sinusitis, Konjunktivitis und Mittelohrentzündung. Die nicht-typisierbaren Hi verursachen etwa 20-40% aller Mittelohrentzündungen bei Kindern und jungen Erwachsenen. Die derzeitige Therapie für chronisches oder wiederholtes Auftreten von Mittelohrentzündung beinhaltet im allgemeinen die Verabreichung von Antibiotika. Kinder können mehrfache Infektionen erfahren, weil eine Infektion nicht zu einer dauerhaften Immunität beiträgt.
Ein großes Ausmaß an Zeit, Geld und Bemühungen ist beim Versuch aufgebracht worden, einen wirklich wirksamen Impfstoff gegen H. influenzae zu finden. Das überwiegende Augenmerk richtete sich auf die Entwicklung eines Impfstoffs für Hib, aufgrund von dessen ernsthafter Bedrohung für sehr junge Kinder. Unglücklicherweise sind die bewährten Typ b- Polysaccharidimpfstoffe bei unter 18 Monate alten Kindern nicht wirksam, bei denen es sich um die durch Hib am stärksten gefährdete Gruppe handelt.
Es ist seit vielen Jahren bekannt gewesen, daß gegen die Typ b-Kapsel gerichtete Antikörper Individuen gegen invasive Hib-Infektion, einschließlich Meningitis, schützen werden. In einem statistischen, klinischen Doppel-Blindversuch in Finnland wurde festgestellt, daß ein Typ b- Polysaccharidimpfstoff zu 90% wirksam bei der Verhinderung von Krankheit in Kindern ist, die bei einem Alter zwischen 24 und 72 Monaten geimpft wurden. Jedoch vermittelte der Impfstoff keine schützende Immunität bei Kindern, die jünger als 18 Monate waren, und stellte lediglich eine beschränkte Immunität bei Kindern im Alter von 18-23 Monaten bereit; Peltola et al., N. Engl. J. Med., 310: 1561-1566 (1984). Das Typ b-Polysaccharid ruft eine T-Zellunabhängige Immunantwort hervor, welche wahrscheinlich für die geringe Immunogenität in jungen Kindern verantwortlich ist.
Basierend auf diesen Daten wurden drei Typ b-Polysaccharidimpfstoffe 1985 in den Vereinigten Staaten lizensiert und zur Anwendung bei Kindern im Alter von 24-60 Monaten empfohlen. Diese Impfstoffe wiesen offensichtlich ein größeres Problem auf. Sie schützten Kinder mit einem Alter unter 24 Monaten, die für H. influenzae-Erkrankung anfälligste Gruppe, nicht angemessen.
Es bestehen andere Probleme, und zwar in Bezug auf die Tatsache, daß das Polysaccharid aus natürlichen Quellen erhalten wird. Obwohl gereinigt, sind die Polysaccharidfragmente von verschiedenen Längen und deswegen nicht so gut charakterisiert, wie gewünscht. Dies erzeugt Probleme hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und schwankender Wirksamkeit. Auch müssen sich Sicherheitsbedenken sowohl auf die Herstellung als auch die Verwendung des Impfstoffs richten, da natürlich vorkommende Polysaccharide aus einem Pathogen isoliert werden müssen.
Es sind Versuche unternommen worden, das Polysaccharid zu einem besseren Immunogen zu machen. Das Polysaccharid oder Fragmente davon sind mit verschiedenen immunogenen Proteinen kovalent gekoppelt worden, wie Diphtherie- oder Tetanustoxoiden; siehe zum Beispiel das U.S.-Patent Nr. 4 673 574, erteilt am 16. Juni 1987 an Anderson, das U.S.-Patent Nr. 4 808 700, erteilt am 28. Februar 1989 an Anderson et al., die Europäische Patentamts- Veröffentlichung Nr. 0 245 045, datiert vom 11. November 1987, und die Europäische Patentamts-Veröffentlichung Nr. 0 098 581, datiert vom 18. Januar 1984.
Von mehreren der Konjugatimpfstoffe ist gezeigt worden, daß sie sicher und immunogener als die herkömmlichen Polysaccharidimpfstoffe bei Kindern, insbesondere Kleinkindern, sind. Die Daten legen nahe, daß die Konjugatimpfstoffe als T-Zell-abhängige Antigene wirken. Eine T- Zell-abhängige Antwort liefert eine bessere Gesamtimmunantwort in einem Patienten. Einer der Konjugatimpfstoffe ist in den Vereinigten Staaten für Kinder von 15-18 Monaten Alter genehmigt worden. Zwei der Konjugatimpfstoffe sind in den Vereinigten Staaten für Kleinkinder, die nicht älter als zwei Monate alt sind, lizensiert worden.
Die derzeitig für den praktischen Arzt erhältlichen Impfstoffe haben mehrere bedeutende Beschränkungen. Erstens schützen sie nicht gegen andere Hi-Infektionen neben Hib. Das Polysaccharid wird nicht in nicht-typisierbaren H. influenzae gefunden; deshalb sind Antikörper dagegen nicht-schützend gegen diese Stämme. Zweitens verursachen sie Probleme im Hinblick auf Reproduzierbarkeit, Wirksamkeit und Sicherheit.
Es gibt mehrere Hauptrouten der laufenden Forschung auf dem Wege, diese Beschränkungen zu überwinden. Eine Vorgehensweise bestand dann, Verfahren zur Hib-Polysaccharidsynthese zu entwickeln. Die Hib-Kapsel besteht aus einem linearen Homopolymer von alternierenden Ribose- und Ribitolmolekülen, verknüpft durch eine Phosphodiesterbindung, repräsentiert durch die folgende Formel:
Das Polymer ist als Polyribosylribitolphosphat bekannt und wird als PRP abgekürzt.
Das aus natürlichen Quellen erhaltene PRP ist unreines, abgebautes Polysaccharid. Es variiert hinsichtlich des Molekulargewichts zwischen 200 kD und 200 000 kD.
Einige Gruppen sind in der Lage gewesen, kleine PRP-Oligosaccharide zu synthetisieren. Zum Beispiel offenbart die Europäische Patentamts-Veröffentlichung 0 320 942, datiert vom 21. Juni 1989, die Synthese von synthetischen PRP-Oligosacchariden von 2-20 Einheiten und ihre kovalente Anknüpfung an immunogene Proteine, spezifisch Tetanus- oder Diphtherietoxine oder -toxoide. Die Oligosaccharide werden über einen Abstandshalter bzw. Spacer an die Proteine geknüpft. Ein Phosphittriester-Syntheseverfahren wurde für die Oligomerisierung angewandt. Die Europäische Patentamts-Veröffentlichung 0 276 516 mit Datum vom 3. August 1988 offenbart auch synthetische PRP-Oligosaccharide von 2-20 Monomeren Länge, ihre Konjugation an Trägerproteine und die Verwendung der Konjugate als Impfstoffe gegen Hib. Die Oligosaccharide werden unter Verwendung des synthetischen Phosphotriesterverfahrens für die Oligomerisierung hergestellt. Beide von diesen beinhalten synthetische Techniken vom Lösungs-Typ für die Herstellung der PRP-Oligosaccharide.
Elie, et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 108: 219-223 (1989), offenbart die Festphasensynthese eines PRP-Hexamers. Die Einheiten wurden unter Verwendung eines Phosphittriesterverfahrens und von Glas mit kontrollierter Porengröße als dem festen Träger gekoppelt.
Die Verwendung von synthetischen PRP-Fragmenten sollte mehrere Vorteile gegenüber dem aus natürlichen Quellen erhaltenen PRP bereitstellen. Synthetisches PRP ist chemisch gut definiert und charakterisiert. Es ist von höherwertiger Qualität und zeigt eine geringere Neigung zur Hervorrufung von Nebenwirkungen bei Menschen. Seine Anwendung würde auch die Probleme hinsichtlich Reproduzierbarkeit, Wirksamkeit und Sicherheit, welche mit aus natürlichen Quellen erhaltenem PRP assoziiert sind, aus dem Weg räumen. Während das natürlich vorkommende PRP im allgemeinen an den Proteinträger an zufälligen Punkten längs seiner Kette vernetzt ist, kann synthetisches PRP außerdem über einen einzigen Punkt konjugiert werden, was weniger unerwünschte Epitope erzeugt.
Diese Forschung verspricht Verbesserungen für bestehende Impfstoffe, aber es gibt immer noch Nachteile. Erstens ist die PRP-Synthese kompliziert und relativ ineffizient. Daher besteht ein Bedarf nach verbesserten Syntheseverfahren. Zweitens werden die Verbesserungen auf Impfstoffe gegen Hib begrenzt sein.
Eine andere Vorgehensweise bestand darin, sich auf das Protein zu konzentrieren. Es gibt einige verfügbare Daten, welche nahelegen, daß die Protein- und die Kohlenhydrateteile der Konjugatimpfstoffe als unabhängige Immunogene wirken. Deshalb wird die Auswahl der Proteinkomponente wichtig beim Bestreben, die Immunogenität zu verbessern. Es wäre wünschenswerter, wenn ein immunogenes Protein oder Polypeptid, das aus H. influenzae abgeleitet ist, als die Proteinkomponente anstatt eines "Nonsense"-Proteins vorliegt.
Wenigstens eine Gruppe hat ein Protein der Hib-Außenmembran an PRP-Fragmente konjugiert; siehe Europäische Patentamts-Veröffentlichung Nr. 0 338 265 mit Datum vom 25. Oktober 1989. Diese Anmeldung offenbart 38 und 40 kD große Proteine der äußeren Membran von Hib und ihre Isolierung und Reinigung. Die zwei Proteine sind ziemlich ähnlich. Sie sind als Protein 2 (P2) oder Protein b/c bekannt, weil sie als eine Dublette auftreten. Das Molekulargewicht hängt von dem Stamm, aus welchem sie erhalten werden, ab. Sie sind kreuzreaktiv, haben sehr ähnliche Aminosäurezusammensetzungen und weisen dieselben amino- und carboxyterminalen Sequenzen auf. Die Proteine werden durch reduktive Aminierung an PRP-Fragmente gekoppelt. Die PRP-Fragmente werden aus natürlich vorkommendem PRP unter Verwendung von Standardtechniken erhalten. Die Anmeldung gibt an, daß die Trägerproteine selbst Immunität vermitteln können.
Diese Vorgehensweise wird ebenfalls von bestimmten Einschränkungen beeinträchtigt. Die Proteine der äußeren Membran können unter Hib-Typen oder Serotypen innerhalb eines bestimmten Typs variieren; Granoff et al., in S. H. Sell und P. F. Wright (Hrsg.), Haemophilus Influenzae: Epidemiology, Immunology, and Prevention, (New York: Elsevier Biomedical (1982)). Deshalb kann ein auf einem bestimmten äußeren Membran Protein basierender Impfstoff gegen das breitere Spektrum an pathogenen H. influenzae-Bakterien nicht wirksam sein und kann nicht einmal gegen alle Stämme von Hib effektiv sein.
Andere haben sich auf Hi-Proteine und -Peptide allein als Impfstoffkandidaten konzentriert; siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/02557, veröffentlicht am 22. März 1990. Diese Anmeldung offenbart zwei antigenisch verwandte Hi-Außenmembranproteine mit einem Molekulargewicht von etwa 16 kD. Sie offenbart ferner verwandte Fusionsproteine und Peptidfragmente der Außenmembranproteine, Verfahren zum Reinigen der Proteine und Verfahren zur Herstellung derselben durch Gentechnik. Von allen diesen wird behauptet, daß sie als Immunogene in Impfstoffen nützlich sind. Solche Impfstoffe werden ebenfalls die unmittelbar obenstehend erwähnten Nachteile aufweisen.
Es besteht in deutlicher Weise ein dringender Bedarf nach einem sicheren Impfstoff, der sowohl gegen invasive als auch nicht-invasive H. influenzae wirksam ist, insbesondere in 2-6 Monaten alten Kleinkindern. Dieser ideale Impfstoff wäre auch gegen eine breite Vielfalt von Stämmen innerhalb jeder der zwei Kategorien durch Hervorrufen von Antikörpern gegen eine Determinante, welche auf der Oberfläche der meisten oder aller Stämme von H. influenzae gefunden wird, wirksam.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Einschränkungen der bestehenden Technologie und begegnet dieser Anforderung. Sie stellt ein neues synthetisches PRP, konjugiert an neu isolierte und gereinigte H. influenzae-Adhäsinproteine, bereit.
Die Fähigkeit, ein Adhäsinprotein in einem Impfstoff gegen H. influenzae zu verwenden, ist äußerst wünschenswert. Aufgrund des Weges, auf welchem sie funktionieren, nimmt man an, daß Adhäsinproteine unter Stämmen eines jeweiligen Typs von Bakterien hoch konserviert sind. Dies ist der Fall, weil sie die Proteinmoleküle sind, welche die Anheftung durch Binden von Bakterien an Wirtszellen vermitteln, dem einleitenden Schritt im Infektionsvorgang. Daher wäre zu erwarten, daß die Adhäsine in allen Stämmen (sowohl kapseltragenden als auch nichtkapseltragenden) von Haemophilus vorhanden sind. Deshalb wäre der vorliegende Impfstoff wirksam gegen eine breite Vielfalt von Typen und Stämmen von Hi. Darüber hinaus sollten auf Adhäsinproteinen basierende Impfstoffe wirksamer sein als diejenigen, welche auf anderen Außenmembranproteinen beruhen, und zwar selbst bei denjenigen Bakterienstämmen, aus welchen die Außenmembranproteine abgeleitet sind. Antikörper gegen das Adhäsinprotein werden das Anhaften der Bakterien an das Gewebe des Wirtstieres verhindern. Das Anhaften ist der einleitende Schritt in einer Hi-Infektion. Das Stoppen der Infektion an diesem Punkt wäre der bestmögliche Vorgehensweg.
Das neue PRP der Erfindung hat auch Vorteile gegenüber der bestehenden Technologie. Es ist besser definiert und charakterisiert, und es ist von überlegener Qualität im Vergleich zu aus natürlichen Quellen erhaltenem PRP. Auch ist es effizienter hergestellt worden als das obenstehend beschriebene synthetische PRP.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel der Erfindung, ein immunogenes Oligosaccharid-H. influenzae-Adhäsinprotein- Konjugat und ein Verfahren zur Herstellung davon zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, einen Impfstoff zum Schützen eines Säugers gegen H. influenzae bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Herbeiführen einer Immunantwort gegen H. influenzae in einem Säuger bereitzustellen.
Ein ferneres Ziel der Erfindung ist es, gereinigte H. influenzae-Adhäsinproteine zur Verfügung zu stellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein gereinigtes Polypeptid zur Verfügung zu stellen, welches fähig zur Hervorrufung einer antigenen Antwort gegen H. influenzae in einem tierischen Wirt ist.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung von gereinigten H. influenzae-Adhäsinproteinen bereitzustellen.
Ein ferneres Ziel der Erfindung ist es, DNA, die für die Adhäsinproteine und abgeleitete Polypeptide codiert, die DNA enthaltende Vektoren, durch solche DNA und Vektoren transformierte Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung derartiger Materialien zur Verfügung zu stellen.
Zusätzliche Ziele und Vorteile der Erfindung werden teilweise in der Beschreibung, welche nachfolgt, dargestellt werden, und werden teilweise aus der Beschreibung offensichtlich werden, oder können durch die Ausführung der Erfindung erfahren werden. Die Ziele und Vorteile der Erfindung werden durch die Mittel und Kombinationen, welche in den beigefügten Ansprüchen besonders hervorgehoben sind, erreicht werden.
Um die Ziele der Erfindung und Übereinstimmung mit ihrem Zweck zu erreichen, wie hierin beinhaltet und in breitem Maße beschrieben, sieht die vorliegende Erfindung ein immunogenes Oligosaccharid-Protein-Konjugat vor, welches in einem Impfstoff zum Schützen eines Säugers gegen H. influenzae nützlich ist. Das Konjugat besteht aus einem PRP-Fragment, vorzugsweise einem synthetischen Oligosaccharid, gekoppelt an ein H. influenzae-Adhäsinprotein. Vorzugsweise enthalten die Oligosaccharide 2-30 Ribosylribitolphosphat-Monomere, und 1-30 derartiger Oligosaccharide sind an das Protein angeheftet. In einer alternativen Ausführungsform ist das Oligosaccharid an ein Polypeptid gebunden, welches eine aktive Stelle des Adhäsinproteins ist.
Vorzugsweise wird das Konjugat durch die folgende Formel repräsentiert:
worin m 1-30 ist, n 2-30 ist, R (CH&sub2;)pCH&sub2;NH oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NHCSNH ist, wobei p eine ganze Zahl von 1-3 ist, und X ein H. influenzae-Adhäsinprotein oder ein Fragment davon, enthaltend eine aktive Stelle des Proteins, ist.
Der Impfstoff umfaßt eine immunologisch wirksame Menge des Konjugats in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Vorzugsweise enthält der Impfstoff auch ein Adjuvanz. Die Verabreichung des Impfstoffs oder Konjugats an einen Menschen oder einen anderen Säuger induziert eine T-Zell-abhängige schützende Immunantwort.
Die Erfindung umfaßt ferner ein gereinigtes H. influenzae-Adhäsinprotein und modifizierte Proteine und Polypeptide, die von dem Adhäsinprotein abgeleitet sind, mit der Maßgabe, daß derartige abgeleitete Proteine und Polypeptide immunologisch kreuzreaktiv mit dem Adhäsinprotein sind. Vorzugsweise handelt es sich bei solchen Derivaten um ein oder mehrere Epitope des Adhäsinproteins. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Epitop auch eine Rezeptor-bindende Stelle. Die Proteine und Polypeptide können auch in Impfstoffen verwendet werden, ohne an das synthetische PRP konjugiert zu sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Adhäsinprotein ein kleineres H. influenzae- Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 41 000 Dalton. In einer anderen Ausführungsform ist das Adhäsinprotein ein H. influenzae-Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 47 000 Dalton.
In einer Ausführungsform wird das Adhäsinprotein aus H. influenzae-Bakterien gereinigt. Hi- Membranen werden solubilisiert. Das solubilisierte Material enthält das Adhäsinprotein. Dieses Material wird von dem unlöslichen Material getrennt und mit Rezeptoren für das Adhäsinprotein während einer ausreichenden Zeitdauer kontaktiert, damit die Proteinmoleküle an die Rezeptoren binden. Die Rezeptoren sind an einen unlöslichen festen Träger angeheftet. Als Ergebnis wird das Protein von dem solubilisierten Material getrennt. Die Proteinmoleküle werden dann von den Rezeptoren entfernt, wodurch sie in gereinigter Form gewonnen werden.
In einer anderen Ausführungsform sind die Adhäsinproteine und verwandten Polypeptide der Erfindung vorzugsweise rekombinante Proteine und Polypeptide, welche durch gentechnische Vorgehensweisen hergestellt worden sind. Sie werden von einer passenden Wirtszelle erzeugt, welche durch DNA transformiert worden ist, die für derartige Proteine oder Polypeptide codiert.
Eine isolierte oder im wesentlichen reine DNA-Sequenz, welche für die Adhäsinproteine der Erfindung codiert, wird wie folgend erhalten. Adhäsin-Proteinrezeptoren oder Antikörper gegen das Adhäsin, vorzugsweise monoklonale Antikörper, werden verwendet, um eine genomische Bibliothek, welche H. influenzae-DNA enthält, zu screenen. Die Bibliothek ist aus Klonen aufgebaut, welche unterschiedliche Sequenzen der DNA enthalten, die funktionstüchtig und wiedergewinnbar in einen Vektor eingefügt worden sind, wobei jeder der Vektoren lediglich eine Sequenz der DNA enthält. Die monoklonalen Antikörper oder Rezeptoren identifizieren die Klone, welche das Adhäsin erzeugen. Der Klon wird dann isoliert. Vorzugsweise werden die exogenen DNA-Sequenzen aus dem Klon gewonnen.
Die Erfindung umfaßt ferner isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA, abgeleitet aus dieser DNA, zum Beispiel durch Einzel- oder Mehrfachmutationen. Vorzugsweise hybridisiert solche DNA mit der aus der genomischen Bibliothek erhaltenen DNA unter Bedingungen hoher Stringenz.
Ein synthetisches PRP-Oligosaccharid, welches verwendet wird, um Konjugate der Erfindung herzustellen, wird durch die folgende Formel wiedergegeben:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 30 ist, und R¹ (CH&sub2;)pCHO oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
Eine als Zwischenstufe bei der Herstellung von synthetischem PRP der Erfindung nützliche Verbindung wird durch die Formel:
repräsentiert, worin n eine ganze Zahl von 2 bis 30 ist, Bn für Benzyl steht, und R² (CH&sub2;)pCH(OR³)&sub2; oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;R&sup4; ist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, R³ eine Alkylgruppe von 1-4 Kohlenstoffatomen Länge ist, und R&sup4; eine Gruppe ist, die zu einer Aminogruppe umgewandelt werden kann.
Diese Verbindung wird unter Verwendung einer Festphasensynthese hergestellt. Das Monomer für die Ketteninitiation ist eine Verbindung, welche durch die folgende Formel repräsentiert wird:
worin Bn für Benzyl und MMTr für Monomethoxytrityl steht. Dieses Monomer wird an eine feste Phase gekoppelt und dann detrityliert. Die resultierende detritylierte Verbindung wird mit einem Monomer für die Kettenelongation gekoppelt, das repräsentiert wird durch die Formel:
worin Bn Benzyl und MMTr Monomethoxytrityl ist. Die resultierende Verbindung wird dann detrityliert. Die Kettenelongations- und Detritylierungsschritte werden eine ausreichende Anzahl von Malen wiederholt, bis ein Oligomer der gewünschten Länge erhalten wird. Dann wird das Ketten-terminierende Monomer zugesetzt. Das Ketten-terminierende Monomer wird durch die Formel:
repräsentiert, worin Bn Benzyl ist und R² (CH&sub2;)pCH(OR³)&sub2; oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;R&sup4; ist, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, R³ eine Alkylgruppe von 1-4 Kohlenstoffatomen Länge ist, und R&sup4; eine Gruppe ist, welche zu einer Aminogruppe umgewandelt werden kann.
Die Phosphonatgruppen des Träger-gebundenen Oligomers werden dann oxidiert, um Phosphatgruppen zu bilden. Die resultierende Verbindung wird dann vom festen Träger entfernt und gewonnen.
Die Schutzgruppen auf dieser Zwischenstufe werden danach durch Hydrierung entfernt. Wenn R² (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;R&sup4; ist, führt dies zu dem synthetischen PRP der Erfindung. In dem Fall, in dem R² (CH&sub2;)pCH(OR³)&sub2; ist, wird die hydrierte Verbindung ferner einer selektiven Säurehydrolyse unterzogen.
Das bevorzugte Konjugat der Erfindung wird danach durch Koppeln des synthetischen PRPs mit dem Hi-Adhäsinprotein durch reduktive Aminierung, falls R¹ (CH&sub2;)pCHO ist, oder, falls R¹ (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist, durch Herstellen des entsprechenden Isothiocyanates und danach Koppeln des Isothiocyanates mit dem Protein, hergestellt.
Die begleitenden Zeichnungen, welche in dieser Beschreibung eingebunden sind und einen Teil davon ausmachen, veranschaulichen eine Ausführungsform der Erfindung und dienen, zusammen mit der Beschreibung, dazu, die Grundlagen der Erfindung zu erklären.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt eine Analyse von Präparationen der äußeren Membran durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese. Die Proben schlossen die nachfolgenden ein (Spuren): 1, Gesamtpräparation des Proteins der äußeren Membran von Haemophilus influenzae Typ b, gefärbt mit Coomassie-Blau; 2, Autoradiographie von ³&sup5;S-markierten Gesamt-Außenmembran-Proteinen; 3, Autoradiographie von ³&sup5;S-markiertem Adhäsinprotein, eluiert aus immobilisiertem Rezeptor-Asialo-GM&sub1;; 4, Autoradiographie von Material, das von immobilisiertem Globosid, einem Nonsense-Glykolipid, eluiert wurde. Der Pfeil zeigt das Adhäsin an, welches zwischen P1 und P2 bei einem Molekulargewicht von etwa 41 kD wandert.
Die Fig. 2 zeigt die Neutralisierung vom Haemonhilus-Adhäsin an den Glykolipidrezeptor Asialo-GM&sub1;. [³&sup5;S]-Methionin-markierte Membranen aus Haemonhilus influenzae-Typ b wurden mit Verdünnungsreihen von Mausseren inkubiert und danach an Rezeptor binden gelassen (0,5 Mikrogramm/Vertiefung). Die verwendeten Mausseren wurden aus 5 Mäusen, bezeichnet mit M-0 bis M5, erhalten, welche mit Haemophilus-Membranen immunisiert worden waren. Das Serum aus einer nicht-herausgeforderten Maus (NMS) wurde als eine Negativkontrolle verwendet.
Die Fig. 3 zeigt die Inhibition der Bindung von Haemophilus-Membran an Asialo-GM&sub1; mit ausgewählten monoklonalen Antikörpern. [³&sup5;S]-Methionin-markierte Membranen aus Haemophilus wurden mit Überständen von Hybridomkulturen inkubiert und danach an Rezeptor binden gelassen (0,5 Mikrogramm/Vertiefung). Eine negative Rezeptorkontrolle von Gb&sub4; zeigt die Spezifität der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung. Das in Fig. 2 verwendete Mausserum (M-2) (Verdünnung von 1: 500) zeigt starke positive Inhibition. Medium zeigt keine Inhibition der Bindung von Membranen an Asialo-GM&sub1;. Es wurden zwei Klassen von positiv inhibierenden Hybridomen gefunden. Hib 10 zeigt vollständige Inhibition der Bindung. Hib 30 und Hib 43 zeigen teilweise (etwa 35%ige) Inhibition. Die meisten Hybridomkulturen, wie Hib 2, zeigten keine Inhibition. Alle hinsichtlich Bindung getesteten Hybridomkulturen reagierten in einem ELISA positiv mit Membranen. Die Fehlerbalken sind eingeschlossen, um die Variabilität zwischen Vertiefungen in zweifacher Ausführung aufzuzeigen.
Die Fig. 4 zeigt die Identifizierung und Charakterisierung des 47 kD großen Haemophilus- Adhäsins. Der monoklonale Antikörper, welcher die Membranbindung teilweise inhibierte, Hib 43, wurde auf einem Westernblot reagieren gelassen, um das Molekulargewicht des Proteins, das er erkennt, zu identifizieren. Es wurden Gesamt-Zellen aufgetragen, und zwar nach gar keiner Proteinase K-Behandlung oder entweder Behandlung mit Proteinase K vor der Lyse in Probenpuffer oder Behandlung mit Proteinase K nach Lyse in Probenpuffer (abgelesen von links nach rechts). Die Nicht-Behandlung identifiziert das 47 kD große Protein, die Behandlung von Gesamtzellen mit Proteinase K vor der Lyse zeigt die Empfindlichkeit des Proteins gegenüber dieser Protease in seiner nativen Lokalisierung; und die Behandlung mit Proteinase K nach der Lyse zeigt die allgemeine Empfindlichkeit gegenüber dieser Protease nach Herausspalten aus dieser nativen Lokalisierung. Der Escherichia coli XL-1, transformiert mit pMC101, exprimiert das 47 kD große Haemophilus-Protein, welches mit Hib 43 reagiert. Das 47 kD große Protein war auch gegenüber Proteinase K-Behandlung von XL-1/pMC101- Gesamtzellen empfindlich. Diese Daten legen eine Oberflächen-Lokalisierung für dieses Protein in beiden Wirten nahe.
Die Fig. 5 zeigt eine Restriktionskarte der Region in Haemophilus influenza-Typ b, welche für das 47 kD große Adhäsin codiert. Ein 10,5 kb großes Eco R1-Fragment, welches das 47 kD große Protein erzeugt, das mit dem monoklonalen Hib 43-Antikörper reagiert, wurde aus einer Haemophilus-Lambda ZAPII-Genbank kloniert. Der Helferphage R408 wurde verwendet, um ein Plasmid, welches dieses Insert enthielt, in den Vektor pSK(-) einzuführen. Die Lokalisierung des für dieses Protein codierenden Gens innerhalb dieses 10,5 kb großen Fragmentes ist durch den Pfeil angezeigt. Die Richtung der Transkription ist ebenfalls durch den Pfeil angezeigt und wurde durch Deletionsanalyse ermittelt. Die dicke Linie zeigt die Vektor-DNA an.
Die Fig. 6 zeigt den Glykolipid-Bindungs-Phänotyp von Escherichia coli, der das Hib 47 kD- Protein exprimiert. Die Fähigkeit von Membranen aus E. coli, XL-1, oder aus XL-1, transformiert mit pMC101, bezeichnet als 3, wurde unter Verwendung des Standardbindungsassays verglichen. Es wurden Verdünnungsreihen von Glykolipiden mit folgender Rezeptoraktivität angefertigt: Asialo-GM&sub1;, Asialo-GM&sub2;, Sulfatid oder die Negativkontrolle, Gb&sub4;. XL-1/pMC101 bindet mit hoher Affinität an diese Rezeptoren, ähnlich wie Haemophilus.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Es wird nun ausführlich Bezug genommen auf die vorliegend bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, welche zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Grundlagen der Erfindung zu erklären.
Die Erfindung umfaßt ein immunogenes Oligosaccharid-H. influenzae-Adhäsinprotein-Konjuat, das verwendbar als ein Impfstoff gegen H. influenzae ist, gereinigte H. influenzae- Adhäsinproteine und verwandte Proteine und Polypeptide, für die Proteine und Polypeptide codierende DNA, Wirtszellen, welche die DNA enthalten und die Proteine und Polypeptide herstellen, synthetische PRP-Oligosaccharide und für ihre Synthese verwendbare Zwischenstufen und Verfahren zur Herstellung und Anwendung dieser Materialien.

Immunogenes Konjugat

Das Konjugat umfaßt ein Polyribosylribitolphosphatfragment, das chemisch an ein gereinigtes H. influenzae-Adhäsinprotein gekoppelt ist. Vorzugsweise ist das PRP-Fragment ein synthetisches Oligosaccharid. Von 1 bis etwa 30 und vorzugsweise von etwa 5 bis 20 der natürlichen Fragmente oder synthetischen Oligosaccharide sind an das Protein angeheftet.
Die Fragmente werden an das Protein durch bekannte Techniken zum kovalenten Anheften von Polysacchariden an Proteine oder Polypeptide, angewandt auf die hierin enthaltenen Lehren, angeknüpft. Die bevorzugten Techniken sind hier die reduktive Aminierung oder Isothiocyanatkopplung.
Das gereinigte Adhäsinprotein ist ein kleineres Hi-Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 41 000 Dalton, verschieden von P1 oder P2, oder das Adhäsinprotein ist ein Hi-Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 47 000 Dalton, das verschieden von P1-P6 ist.
Alternativ dazu kann das Protein durch ein Polypeptid ersetzt werden, welches eine aktive Stelle des Adhäsinproteins ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "aktive Stelle" ein Epitop (antigene Determinante) oder eine H. influenzae-Rezeptorbindungsstelle, welche ebenfalls ein Epitop sein kann, oder nicht. Wie hierin verwendet, handelt es sich bei dem Begriff "Rezeptor" um ein Makromolekül, das an ein Hi-Adhäsinprotein bindet. Das Makromolekül ist vorzugsweise ein Glykosphingolipid. Ohne zu beabsichtigen, den Umfang der Erfindung einzuschränken, wird angenommen, daß die Bindungsstelle ein Epitop ist.
Wenn das PRP-Fragment aus natürlichen Quellen erhalten wird, ist es von variierenden Längen, jedoch vorzugsweise von etwa 8 bis 120 Monomeren Länge. Derartige Fragmente werden durch bekannte Techniken erhalten, wie denjenigen, welche in der obenstehend angeführten Europäischen Patentamts-Veröffentlichung Nr. 0 338 265 beschrieben wurden.
Synthetisches PRP ist ein lineares Homopolymer von alternierenden Molekülen von Ribose und Ribitol, verknüpft durch eine Phosphodiesterbindung und repräsentiert durch die Formel:
worin n 2 bis 30 und vorzugsweise 5-20 beträgt. Solche synthetischen PRP's schließen diejenigen, welche im Fachgebiet bekannt sind, ein. Zum Beispiel offenbaren die vorstehend erwähnten Europäischen Patentamtsveröffentlichungen 0 320 942 und 0 276 516 synthetische PRP's, die in dem Konjugat der Erfindung verwendet werden könnten.
Vorzugsweise ist das synthetische PRP eine Verbindung, die repräsentiert wird durch die Formel:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 30 ist und R¹ (CH&sub2;)pCHO oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist. Vorzugsweise ist n 5- 20 und p ist 1. Das synthetische PRP wird mit einem Gegenion assoziiert sein. Vorzugsweise ist das Ion Natrium (Na&spplus;).
Die synthetischen Oligosaccharide enthalten gewöhnlicherweise einen chemischen Abstandshalter oder Linker, durch den sie an das Protein verknüpft sind. Ein derartiger Abstandshalter kann jedwede chemische Verknüpfung sein, welche dazu dient, das PRP und das Protein zu verbinden, und welche einen eingeschränkten oder keinen nachteiligen Effekt auf den tierischen Wirt aufweist, wenn das Konjugat verabreicht wird. Derartige Abstandshalter können diejenigen einschließen, die im Fachgebiet bekannt sind, als auch die neuen Abstandshalter der Erfindung. Bekannte Abstandshalter schließen diejenigen ein, welche in den zuvor erwähnten Europäischen Patentamtsveröffentlichnugen 0 320 942 und 0 276 516 offenbart werden, als auch jene, die in dem U.S.-Patent 4 830 852, erteilt am 16. Mai 1989 an Marburg et al., offenbart sind. Vorzugsweise ist der chemische Abstandshalter ein Rest, der durch die Formel:
repräsentiert wird, worin R (CH&sub2;)pCH&sub2;NH oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NHCSNH ist und p eine ganze Zahl von 1-3, vorzugsweise 1 ist.
In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Konjugat durch die folgende Formel repräsentiert:
worin m 1-30 ist, n 2-30 ist, R (CH&sub2;)pCH&sub2;NH oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NHCSNH ist, wobei p eine ganze Zahl von 1-3 ist, und X ein H. influenzae-Adhäsinprotein oder ein Fragment davon, welches eine aktive Stelle des Proteins enthält, ist. Vorzugsweise ist m 5-20, n ist 5-20 und p ist 1. Das Symbol X in der obenstehend angeführten Formel kann auch bestimmte abgeleitete oder modifizierte Proteine oder Polypeptide repräsentieren, welche nachstehend erörtert werden. Das Konjugat wird mit einem Gegenion assoziiert sein. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Ion um Na&spplus;.

Adhäsinproteine

Die Erfindung umfaßt ferner ein gereinigtes H. influenzae-Adhäsinprotein. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "gereinigt" und verwandte Begriffe, daß das Protein zu mindestens 95 Gew.-% rein ist, vorzugsweise zu mindestens 98 Gew.-%, und am stärksten bevorzugt zu mindestens 99 Gew.-% rein ist. Das Protein bindet an einen Rezeptor, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fucosylasialo-GM1, Asialo-GM1 und Asialo-GM2, von denen alle die Struktur N-Acetylgalactosamin(beta 1-4)galactose(beta 1-4)glucose-(beta 1-1)ceramid enthalten, abgekürzt als GalNac(beta 1-4)Gal(beta 1-4)Glc(beta 1-1)Cer.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein kleineres Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 41 kD, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Es ist von den verschiedenen größeren Außenmembranproteinen, welche für Hi identifiziert worden sind, unterscheidbar. Insbesondere erscheint das Protein als eine schwächere Bande zwischen den Banden für die Außenmembranproteine, die als P1 und P2 bekannt sind, auf einem Polyacrylamidgel; siehe Fig. 1.
Dieses gereinigte Hi-Adhäsinprotein wird vorzugsweise wie folgend aus natürlichen Quellen hergestellt. Bakterielle Hi-Membranen werden durch Standardtechniken erhalten und solubilisiert, wobei eine solubilisierende Verbindung, wie ein Detergenz, verwendet wird. Vorzugsweise werden die Membranen mit dem Detergenz gemischt, und die Mischung wird ultraschallbehandelt. Das am stärksten bevorzugte solubilisierende Mittel ist eine Lösung, enthaltend etwa 1,0% bis etwa 1,5% und vorzugsweise etwa 1,3% Octylglucopyranosid. Das Adhäsinprotein ist in dem solubilisierten Material. Das verbleibende unlösliche Material aus der Membran wird, vorzugsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt.
Der Überstand wird mit Rezeptoren, die das Protein binden und an einen unlöslichen festen Träger oder eine Matrix, wie eine Mikrotitervertiefung oder ein Gel, angeheftet sind, während einer Zeitdauer und unter Bedingungen kontaktiert, welche ausreichen, damit das Protein an die Rezeptoren bindet, wodurch das Protein von dem anderen Material getrennt wird. Die bevorzugten Rezeptoren für das Adhäsinprotein sind Fucosylasialo-GM1, Asialo-GM1 und Asialo-GM2. Diese Rezeptoren können gemäß den Verfahren hergestellt werden, die in Krivan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6157-6161 (1988), beschrieben sind. Der am stärksten bevorzugte Rezeptor, Asialo-GM1, ist auch im Handel erhältlich. Alle diese Rezeptoren enthalten die Kohlenhydratsequenz GalNac(beta 1-4)Gal(beta 1-4)Glc, welche folglich als ein Rezeptor für die Reinigung des Adhäsinproteins verwendet werden kann. Diese Sequenz kann unter Verwendung von Standard-Kohlenhydratsynthesetechniken hergestellt werden.
Das Adhäsinprotein wird dann unter Verwendung des geeigneten Mittels eluiert. Bei diesem kann es sich um einen freien Rezeptor in Lösung, SDS-Elutionspuffer oder ein chaotropes Mittel, wie KSCH, NaCl oder Guanidinhydrochlorid, handeln. Das eluierte Protein wird dann gegenüber dem Rezeptor getestet, um zu bestätigen, daß das Protein an ihn bindet. Die Reinheit des isolierten Proteins wird durch SDS-PAGE analysiert. Im allgemeinen wird es nach einer Affinitätsreinigung mit dem am stärksten bevorzugten Rezeptor zu 99% rein sein.
Für die Reinigung von größeren Mengen des Adhäsinproteins wird eine Chromatographie, bevorzugt. Der Rezeptor wird auf einem hydrophoben Gelträger, wie Octyl-Agarose, immobilisiert. Diese Matrix wird durch Adsorbieren der Rezeptoren an das hydrophobe Gel in Gegenwart von Salzen hergestellt, wie beschrieben von Hirabayashi et al., für andere Glykolipide; Hirabayashi et al., J. Biochem., 94: 327-330 (1983). Auch photoaktivierbare heterobifunktionale Vernetzungsmittel sind verwendet worden, um Glykolipidaffinitätsmatrizes herzustellen; Lingwood, C., J. Lipid Res., 25: 1010-1012 (1984). In diesem Fall wird das Rezeptor-aktive Lipid kovalent an den Gelträger vernetzt. Die Säule wird dann vorzugsweise mit einer geeigneten Pufferlösung, wie TMS-Puffer-Kochsalzlösung, umfassend gewaschen, bevor das Protein eluiert wird.
Ein weiter bevorzugtes Verfahren besteht darin, das Adhäsin durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Adhäsin-Antikörpers, der durch Standardtechniken hergestellt wird, zu reinigen. In diesem Fall werden die Antikörper kovalent an Agarosegele verknüpft, die durch Cyanogenbromid oder Succinamidester (Affi-Gel, BioRad Inc.) oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren aktiviert wurden. Der ultraschallbehandelte Extrakt wird auf die Spitze des Gels, wie obenstehend beschrieben, aufgetragen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Adhäsinproteine ein H. influenzae-Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 47 000 Dalton. Dieses Protein ist von den bekannten Hi-Proteinen P1-P6 auf Grundlage des Molekulargewichts und der Tatsache, daß jene Proteine integrale Membranproteine sind, während dieses Protein ein Außenmembranprotein ist, unterscheidbar. Dieses Protein bindet auch an die zuvor erwähnten Rezeptoren sowie an Sulfatid (SO3&supmin;-Galactose (beta 1-1) ceramid) und es ist in 1% Sarkosyl (N-Lauroylsarkosin) löslich.
Dieses Protein wird bevorzugt in gereingter Form, wie folgend, hergestellt. Hi-Membranen werden mit einer Lösung extrahiert, welche Membran-assoziierte Proteine entfernt, was einen Extrakt erzeugt, der das Adhäsinprotein zusammen mit anderen Membran-assoziierten Proteinen enthält. Vorzugsweise ist diese Lösung ein nichtionisches Detergenz, wie Sarkosyl oder Octylglucopyranosid. Das unlösliche Material wird aus dem Extrakt, vorzugsweise durch Zentrifugation, abgetrennt. Dies erzeugt einen Überstand, welcher das Adhäsinprotein enthält. Der Überstand wird dann in Kontakt mit einem monoklonalen Antikörper gebracht, welcher das Adhäsinprotein erkennt. Der Antikörper ist an einen unlöslichen festen Träger gebunden. Der Kontakt erfolgt während einer Zeitdauer und unter Standardreaktionsbedingungen, die ausreichen, damit das Adhäsinprotein an den monoklonalen Antikörper bindet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem festen Träger um ein Material, das in einer chromatographischen Säule verwendet wird. Das Adhäsinprotein wird dann von dem Antikörper entfernt, wodurch das Gewinnen des Proteins in gereinigter Form ermöglicht wird. Vorzugsweise wird die nichtionische Detergenzlösung aus dem Überstand entfernt, bevor der Überstand der Affinitätschromatographie unterzogen wird. Eine derartige Entfernung wird vorzugsweise durch Dialysieren des Überstands bewerkstelligt, um ein Dialysat herzustellen, welches im wesentlichen frei von dem Detergenz ist.
Die monoklonalen Antikörper können durch Standardtechniken, in Anbetracht der hierin enthaltenen Lehren, hergestellt werden. Derartige Techniken sind, zum Beispiel, im U.S.- Patent Nr. 4 271 145, erteilt am 2. Juni 1981 an Wands et al., und im U.S.-Patent Nr. 4 196 265, erteilt am 1. April 1980 an Koprowski et al., beschrieben. Kurz gesagt, werden Mäuse mit Hi-Membranen immunisiert. Hybridome werden hergestellt, indem Milzzellen aus den Mäusen mit Myelomzellen fusioniert werden. Die Fusionsprodukte werden hinsichtlich denjenigen gescreent, welche Antikörper herstellen, die an die Hi-Membranen binden. Die positiven Klone werden dann gescreent, um jene zu identifizieren, deren Bindung mit den Hi- Membranen durch einen Hi-Adhäsinrezeptor inhibiert wird. Die positiven Hybridomklone werden isoliert, und die monoklonalen Antikörper werden aus diesen Klonen gewonnen.

DNA

Die Adhäsinproteine der Erfindung werden vorzugsweise durch gentechnische Verfahrensweisen hergestellt. In diesem Falle werden sie durch eine geeignete Wirtszelle hergestellt, welche durch DNA transformiert worden ist, die für die Proteine codiert.
Die DNA der Erfindung ist eine isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz (d. h. Polydesoxyribonukleotid), welche für ein Protein oder Polypeptid codiert, das an die bereits erwähnten Rezeptoren bindet. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "isoliert" und Variationen davon, daß die DNA in Isolierung von DNA vorliegt, welche für andere Proteine oder Polypeptide codiert, die normalerweise die Hi-Adhäsinproteine begleiten. Somit schließt die DNA der Erfindung für das Protein oder Polypeptid codierende DNA ein, wenn diese DNA in einen mikrobiellen Vektor, wie ein Plasmid, oder in einen viralen Vektor, der von einem Bakteriophagen beherbergt werden kann, kloniert worden ist, vorausgesetzt daß derartige Klone von Klonen isoliert sind, welche DNA enthalten, die für andere Proteine oder Polypeptide codiert, welche dieses eine normalerweise begleiten. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen rein" und Varianten davon, daß die DNA im wesentlichen frei von DNA und RNA ist, welche nicht für die Proteine oder Polypeptide der Erfindung codiert. Das heißt, es wird nicht mehr als etwa 1 Gew.-% an anderer DNA und RNA und vorzugsweise nicht mehr als etwa 0,2 Gew.-% an anderer DNA und RNA in irgendeiner Probe geben, welche die DNA der Erfindung enthält.
Vorzugsweise wird die DNA durch Verwendung entweder der Rezeptoren oder monoklonalen Antikörper gegen die Adhäsine zum Screenen einer geeigneten genomischen Bibliothek, welche H. influenzae-DNA enthält, erhalten. Eine derartige Bibliothek umfaßt Kolonien eines einzelnen Typus von Mikroorganismus, im allgemeinen Bakterien, wie E. coli K12 (XL-1), in welche Stücke der fremden DNA eingefügt worden sind, im allgemeinen indem sie in ein Plasmid, Cosmid oder einen Phagenvektor eingebaut wurden, welcher) mit dem Mikroorganismus kompatibel ist. Genauer gesagt, umfaßt die Bibliothek Klone von Vektoren, in welche verschiedene Sequenzen der DNA funktionstüchtig und wiedergewinnbar eingefügt worden sind, wobei jeder der Vektoren nur eine Sequenz der DNA enthält. Die Vektoren können Plasmide, Cosmide, Phagmide oder Phagengenome sein. Falls aufgrund des verwendeten Typs von Bibliothek notwendig, werden die DNA-Segmente in die Vektoren auf eine Weise eingefügt worden sein, daß sie unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden (d. h. in richtiger Orientierung und korrektem Leserahmen und mit entsprechenden Expressionssequenzen, einschließlich einer RNA-Polymerase-Bindungssequenz und einer ribosomalen Bindungssequenz). Die Mikroorganismen werden solche sein, welche das Adhäsinprotein nicht exprimieren, wie E. coli HB101.
Klone aus der Bibliothek werden in Kontakt mit den Rezeptoren oder Antikörpern gebracht, um jene Klone zu identifizieren, welche binden. Die Klone werden isoliert und die exogene DNA-Sequenz wird aus einem der Klone gewonnen. Die Sequenz wird vorzugsweise ausgewertet, um festzustellen, ob sie für das Protein codiert.
Vorzugsweise umfaßt die genomische Bibliothek Bakterien, wie E. coli, infiziert durch einen Phagen, vorzugsweise den Bakteriophagen Lambda. Von den Phagen-infizierten Bakterien hervorgerufene Plaques werden mittels monoklonaler Antikörper gescreent, um diejenigen Plaques zu identifizieren, welche Bakterien enthalten, die das Adhäsinprotein erzeugen. Das Screenen beinhaltet das Kontaktieren der Plaques mit dem monoklonalen Antikörper, um festzustellen, ob eine Bindung aufgetreten ist, unter Verwendung von Standardtechniken. Vorzugsweise werden Immunoassays angewandt.
In dieser bevorzugten Ausführungsform werden die positiven Klone dann durch Reinigen der positiven Plaques und Induzieren der Plasmidbildung in den Bakterien im gereinigten Plaque mit einem Helferphagen gemäß Standardtechniken isoliert.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform konnten Kolonien, welche DNA enthalten, die für ein Hi-Adhäsinprotein codiert, unter Verwendung von DYNA-Perlen gemäß Olsvick et al., 29. ICAAC, Houston, Tex. 1989, nachgewiesen werden. Die zuvor beschriebenen Rezeptoren werden an tosylierte Dyna-Perlen M280 vernetzt, und diese Rezeptor-enthaltenden Perlen werden dann verwendet, um an Kolonien, welche das Adhäsinprotein exprimieren, zu adsorbieren. Kolonien, die das Adhäsin nicht exprimieren, würden durch Waschen entfernt werden, und dieses Verfahren würde wiederholt werden, um eine angemessene Anreicherung zu erhalten. Vermutliche Adhäsin-exprimierende Kolonien würden dann ausplattiert und durch metabolisches Markieren jeder Kolonie mit ³&sup5;S-Methionin und Testen der Fähigkeit der Kolonie, an den Rezeptor zu binden, wie vorstehend beschrieben, bestätigt werden. Die DNA aus mehreren adhärierenden Klonen wird verglichen, um gemeinsame Sequenzen zu identifizieren, und diese gemeinsamen Sequenzen werden weiter subkloniert und charakterisiert.
In einer anderen alternativen bevorzugten Ausführungsform würde das Gen für ein spezifisches Adhäsin lokalisiert und durch Konstruieren von nicht-adhärenten Mutamen eines spezifischen Pathogens identifiziert werden. Die würde bewerkstelligt werden, indem Mutanten unter Verwendung eines transponierbaren Elementes, wie TnPhoA, erzeugt werden, wie beschrieben in Manoil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 81129-81133 (1985). Alkalische Phosphatasepositive Mutanten würden Mutationen innerhalb exportierter Proteine anzeigen. Da das Adhäsin für jedes Pathogen auf der Oberfläche der äußeren Membran lokalisiert und deswegen exportiert ist, würde dieser Satz von Mutanten einen sehr verringerten Untersatz von Mutanten enthalten. Sie würden danach hinsichtlich eines Verlustes der Bindungsaktivität gescreent werden.
Es wird vom Fachmann erkannt werden, daß eine DNA-Sequenz für ein Hi-Adhäsinprotein durch bekannte Techniken im Hinblick auf die hierin offenbarten Lehren modifiziert werden kann. Zum Beispiel können verschiedene Codons substituiert werden, welche für dieselbe Aminosäure codieren, wie das Originalcodon. Alternativ dazu, können die substituierten Codons für eine unterschiedliche Aminosäure codieren, welche die Immunogenität des Proteins nicht beeinträchtigen wird oder welche dessen Immunogenität verbessern kann. Zum Beispiel können Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagenese oder andere Techniken zur Erzeugung von Einfach- oder Mehrfachmutationen, wie Ersetzungen, Insertionen, Deletionen und Transpositionen, wie beschrieben in Botstein und Shortle, "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis", Science, 229: 1193-1210 (1985), angewandt werden. Da derartige modifizierte DNA durch die Anwendung von bekannten Techniken auf die hierin enthaltenen Lehren erhalten werden kann, liegt eine solche DNA innerhalb des Umfanges der beanspruchten Erfindung.
Darüber hinaus wird es vom Fachmann auf dem Gebiet erkannt werden, daß die DNA-Sequenz (oder Fragmente davon) der Erfindung verwendet werden kann, um andere DNA-Sequenzen zu erhalten, welche damit unter Bedingungen mäßiger bis hoher Stringenz hybridisieren, wobei allgemeine, im Fachgebiet bekannte Techniken angewandt werden. Folglich schließt die DNA der Erfindung eine derartige DNA ein.
Die DNA der Erfindung kann gemäß bekannten Techniken verwendet werden, welche angemessenerweise im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren modifiziert sind, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, welcher dann verwendet wird, um einen Mikroorganismus für die Expression und Herstellung der Adhäsine der Erfindung zu transformieren. Derartige Techniken schließen diejenigen ein, welche in den U.S.-Patenten Nr. 4 440 859, erteilt am 3. April 1984 an Rutter et al., 4 530 901, erteilt am 23. Juli 1985 an Weissman, 4 582 800, erteilt am 15. April 1986 an Crowl, 4 677 063, erteilt am 30. Juni 1987 an Mark et al., 4 678 751, erteilt am 7. Juli 1987 an Goeddel, 4 704 362, erteilt am 3. November 1987 an Itakura et al., 4 710 463, erteilt am 1. Dezember 1987 an Murray, 4 757 006, erteilt am 12. Juli 1988 an Toole, Jr., et al., 4 766 075, erteilt am 23. August 1988 an Goeddel et al., und 4 810 648, erteilt am 7. März 1989 an Stalker, beschrieben werden.
Die DNA der Erfindung kann an eine breite Vielzahl von anderen DNA-Sequenzen für die Einbringung in eine geeignete Wirtszelle geknüpft werden. Die Begleiter-DNA wird von der Natur der Wirtszelle, der Art der Einführung der DNA in die Wirtszelle und davon, ob eine episomale Beibehaltung oder eine Integration gewünscht wird, abhängen.
Im allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, in richtiger Orientierung und im korrekten Leserahmen für die Expression eingefügt. Falls notwendig, kann die DNA an die passenden regulatorischen Transkriptions- und Translations-Steuerungsnukleotidsequenzen, welche vom gewünschten Wirt erkannt werden, verknüpft werden, obwohl solche Steuerungen im allgemeinen in dem Expressionsvektor verfügbar sind. Der Vektor wird dann über Standardtechniken in den Wirt eingeführt.
Im allgemeinen werden nicht alle der Wirte durch den Vektor transformiert. Deshalb wird es notwendig sein, nach transformierten Wirtszellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik beinhaltet das Einbinden einer DNA-Sequenz, mit jedweden notwendigen Steuerungselementen, in den Expressionsvektor, die für ein selektierbares Merkmal in der transformierten Zelle, wie eine Antibiotikum-Resistenz, codiert. Alternativ dazu kann das Gen für ein derartiges selektierbares Merkmal auf einem anderen Vektor vorliegen, welcher verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle zu co-transformieren. Bei dem bevorzugten Expressionsvektor zur Verwendung in der Erfindung handelt es sich um das Plasmid pMC 101. Die bevorzugte Wirtszelle ist E. coli.
Die transformierten Wirtszellen exprimieren die Proteine oder Polypeptide der Erfindung. Solche Zellen werden durch bekannte Techniken kultiviert, und die Proteine oder Polypeptide werden durch bekannte Techniken gewonnen. Abhängig vom verwendeten Wirt und dem verwendeten Expressionssystem können die rekombinanten Proteine und Polypeptide der Erfindung Teil eines von den transformierten Wirtszellen hergestellten Fusionsproteins sein. Solche Proteine werden durch bekannte Techniken gewonnen, und der unerwünschte Teil kann durch bekannte Techniken entfernt werden. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein selbst immunogener sein als das rekombinante Protein oder Polypeptid allein und kann deshalb selbst in einem Impfstoff verwendet werden.
Falls erwünscht, können die Adhäsine durch die Anwendung von Standardproteinreinigungstechniken, modifiziert und angewandt gemäß den Festsellungen und Lehren, welche hierin beschrieben sind, weiter gereinigt werden. Derartige Techniken schließen Elektrophorese, Zentrifugation, Gelfiltration, Präzipitation, Dialyse, Chromatographie (einschließlich Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Immunadsorptions-Affinitätschromatographie, Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Gelpermeations- Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie), isoelektrische Fokussierung und Variationen und Kombinationen davon ein.
Eine oder mehrere dieser Techniken werden sequentiell in einem Verfahren angewandt, welches ausgelegt ist, um Moleküle gemäß ihren physikalischen oder chemischen Merkmalen zu trennen. Diese Merkmale beinhalten die Hydrophobizität, Ladung, das Bindungsvermögen und Molekulargewicht des Proteins. Die verschiedenen nach jeder Technik erhaltenen Fraktionen von Materialien werden hinsichtlich ihres Vermögens, mit den Adhäsin-Rezeptoren zu reagieren, getestet. Diejenigen Fraktionen, welche eine derartige Aktivität zeigen, werden dann der nächsten Technik in dem sequentiellen Verfahren unterzogen, und die neuen Fraktionen werden wiederum getestet. Das Verfahren wird wiederholt, bis nur eine mit den Rezeptoren reaktive Fraktion übrig bleibt, und diese Fraktion nur eine einzige Bande erzeugt, wenn sie einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen wird.
Die bevorzugten Techniken schließen jene ein, welche im U.S.-Patent Nr. 4 446 122, erteilt am 1. Mai 1984 an Chu et al., angegeben und beschrieben worden sind. Vorzugsweise werden die Adhäsine durch Rezeptor-Affinitätschromatographie oder monoklonale Antikörper-Affinitätschromatographie gereinigt.

Modifizierte Adhäsine

Die Adhäsine der Erfindung können durch bekannte Proteinmodifikationstechniken modifiziert werden. Solche Modifikationen schließen daß Zerbrechen des Proteins in Fragmente, welche mindestens eine aktive Stelle enthalten, oder die Addition, Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an dem Protein oder einem Fragment davon, ein. Vorzugsweise sind derartige abgeleitete Proteine oder Polypeptide immunologisch kreuzreaktiv mit den Hi- Adhäsinproteinen, wodurch sie in der Lage sind, eine antigene Antwort gegen H. influenzae in einem tierischen Wirt hervorzurufen. Am stärksten bevorzugt binden derartige abgeleitete Proteine oder Polypeptide auch an einen H. influenzae-Rezeptor, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Fucosylasialo-GM1, Asialo GM1 und Asialo-GM2 (wie in dieser Beschreibung verwendet, schließt der Begriff "Polypeptid" auch kürzere Ketten von Aminosäuren ein, welche häufig als Peptide bezeichnet werden). Solche Modifikationen können die Immunogenität des Proteins steigern oder haben keine Auswirkung auf diese Aktivität. Die Modifikationstechniken schließen jene ein, welche im U.S.-Patent Nr. 4 526 716, erteilt am 2. Juli 1985 an Stevens, beschrieben sind.
Die Proteine der Erfindung können eine oder mehrere Aminosäuresequenzen enthalten, welche für deren Immunogenität nicht notwendig sind. Es kann zum Beispiel der Fall sein, daß lediglich die Aminosäuresequenzen eines besonderen Epitops des Antigens für immunogene Aktivität notwendig sind. Unerwünschte Sequenzen können durch im Fachgebiet gut bekannte Techniken entfernt werden. Zum Beispiel können unerwünschte Aminosäuresequenzen über limitierten proteolytischen Verdau unter Verwendung von Enzymen, wie Trypsin, Papain oder verwandten proteolytischen Enzymen, entfernt werden.
Dieses letztgenannte Vorgehen ist erwartungsgemäß besonders nützlich für das Adhäsinprotein der Erfindung. Da das Protein an mehrere verwandte Rezeptoren mit einer Konsensus-Sequenz bindet, sollte das Protein eine gut konservierte Region aufweisen, welche als die Rezeptor- Bindungsstelle wirkt. Diese Stelle ist das besonders bevorzugte Polypeptid der Erfindung.
Alternativ dazu können zu verschiedenen immunogenen Epitopen und/oder der Rezeptorbindungsstelle des Proteins entsprechende Polypeptide chemisch durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren, unter Betrachtung der hierin angegebenen Lehren, synthetisiert werden. Diese schließen die Verfahren ein, welche in dem U.S.-Patent Nr. 4 290 944 offenbart sind, das am 22. September 1981 an Goldberg erteilt wurde.
Modifizierte Proteine oder Polypeptide, die im wesentlichen homolog zu dem Hi-Adhäsinprotein oder zu den obenstehend erörterten Polypeptiden sind, können durch die Anwendung von bekannten Techniken und Routineexperimenten im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren hergestellt werden. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen homolog" immunologisch kreuzreaktiv. Ein solches Protein oder Polypeptid kann durch die Tatsache identifiziert werden, daß es an Antikörper, die gegen das Adhäsinprotein der Erfindung erzeugt wurden, binden wird, wobei die Antikörper durch Standardtechniken hergestellt werden können. Einige von solchen modifizierten Proteinen oder Polypeptiden können eine verbesserte Immunogenität im Vergleich zu demjenigen, von dem sie abgeleitet wurden, aufweisen.
Somit schließt die Erfindung eine Klasse von abgeleiteten Proteinen und Polypeptiden, einschließlich synthetisch abgeleiteten Peptiden oder Fragmenten des Adhäsinproteins, mit gemeinsamen Elementen des Ursprungs, der Struktur und des Wirkungsmechanismus, wie dem immunogenen Effekt oder dem Vermögen, an die bereits erwähnten Rezeptoren zu binden, ein, welche innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, da sie vom Fachmann ohne übermäßigen experimentellen Aufwand hergestellt werden können, sobald die Lehren der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus liegen, zumal der Fachmann Modifikationen an oder Derivate von Epitopen oder der Rezeptorbindungsstelle auf den Proteinen oder Polypeptiden der Erfindung anfertigen kann, sobald derartige Epitope oder eine solche Stelle identifiziert sind, solche Modifikationen oder Derivate innerhalb des Umfangs der Erfindung. Solche abgeleiteten Proteine und Polypeptide sind vorzugsweise rein, wie dieser Begriff hierin bereits definiert wurde.
Das Hi-Adhäsinprotein der Erfindung (sowie die verwandten Proteine und Polypeptide, die daraus abgeleitet sind) findet nicht nur in dem Konjugatimpfstoff Anwendung, sondern als ein Immunogen an sich. Somit kann es in einem Impfstoff Ihr Tiere, einschließlich Säugern, Nagern, Primaten, und Menschen, verwendet werden. Die bevorzugte Anwendung ist ein Impfstoff für Menschen, vorzugsweise Kinder, und am stärksten bevorzugt junge Kleinkinder.
Ein solcher Impfstoff kann durch dem Fachmann bekannte Techniken hergestellt werden und würde, zum Beispiel, das Antigen, einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein geeignetes Adjuvanz und andere herkömmlicherweise in Impfstoffen anzutreffende Materialien umfassen. Eine in dem Impfstoff zu verwendende immunologisch wirksame Menge des Antigens wird durch im Fachgebiet bekannte Mittel, im Hinblick auf die hierin beschriebenen Lehren, bestimmt.

Synthetisches PRP

Das synthetische PRP wird repräsentiert durch die Formel:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 30, vorzugsweise 5-20, ist, und R¹ (CH&sub2;)pCHO oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; ist, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 3, bevorzugt 1, ist. Die Fähigkeit, dieses synthetische PRP herzustellen, erlaubt die Herstellung von Zusammensetzungen, worin alle der PRP-Oligosaccharide dieselbe Länge besitzen (d. h. die gleiche Anzahl von monomeren Einheiten besitzen), im Gegensatz zu PRP, das aus natürlichen Quellen erhalten wurde, wo die Fragmente hinsichtlich der Länge außerordentlich variieren.
Das PRP der Erfindung wird durch eine Kombination von Festphasensynthese und dem hochwirksamen H-Phosphonat-Verfahren für die Konstruktion der Phosphodiesterbindung hergestellt. Ebenfalls beinhaltet ist die Verwendung von Gelen mit höheren Funktionalisierungsgraden, welche für Vorgehensweisen im kommerziellen Maßstab besser geeignet sind.
Das allgemeine Vorgehen besteht darin, ein geschütztes oligomeres Ribosylribitolphosphatderivat durch die folgenden Schritte herzustellen. Zuerst wird ein Monomer für die Ketteninitiation an eine feste Phase gekoppelt. Das Monomer wird durch die Formel:
repräsentiert, worin Bn Benzyl ist und MMTr Monomethoxytrityl ist; siehe Verbindung 7, Tabelle 1. Die bevorzugte Festphase ist ein Aminoharz vom Merrifield-Typ. Das Ketteninitiationsmonomer (Verbindung 7) wird durch bekannte Techniken an die feste Phase gekoppelt, wie der Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid, gefolgt von Kopplung des erhaltenen Succinates von Verbindung 7 an Aminogruppen der festen Phase. Die Beladung wird durch kolorimetrische Quantifizierung des bei Säurebehandlung freigesetzten Tritylkations bestimmt. Die gekoppelte Verbindung wird darin detrityliert, wie durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan.
Die Kettenelongation wird durch Koppeln des detritylierten Ketteninitiationsmonomeren mit einer Verbindung bewerkstelligt, welche repräsentiert wird durch die Formel:
worin Bn für Benzyl steht und MMTr Monomethoxytrityl ist; siehe Verbindung 8, Tabelle 1. (Die Verbindung wird mit einem Gegenion assoziiert sein. Vorzugsweise ist das Ion ein organisches Kation, wie Triethylammonium). Die Kopplung wird unter Verwendung eines Kondensierungsreagenz, wie Pivaloylchlorid, berwerkstelligt. Die resultiernde Verbindung wird dann detrityliert. Die Kettenelongations-Detritylierungs-Schritte werden eine ausreichende Anzahl von Malen wiederholt, um ein Oligosaccharid der gewünschten Länge herzustellen. Wenn n die gewünschte Anzahl von PRP-Monomeren in dem Oligosaccharid repräsentiert, werden somit die Kettenelongations-Detritylierungs-Zyklen n-2-mal nach der Kopplung des Ketteninitiationsmonomeren und des ersten Kettenelongationsmonomeren wiederholt.
Die Kette wird terminiert, indem sie mit einem Kettenterminationsmonomer gekoppelt wird, das durch die folgende Formel repräsentiert wird:
worin Bn für Benzyl steht und R² (CH&sub2;)pCH(OR³)&sub2; oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;R&sup4; ist, wobei p 1-3, R³ eine Alkylgruppe von 1-4 Kohlenstoffatomen Länge ist, und R&sup4; eine Gruppe ist, welche zu einer Aminogruppe umgewandelt werden kann; siehe Verbindungen 10 und 12, Tabelle 2. (Die Verbindung wird mit einem Gegenion assoziiert sein. Vorzugsweise ist das Ion ein organisches Kation, wie Triethylammonium). Vorzugsweise ist p 1, und R³ ist Methyl oder Ethyl. Vorzugsweise ist R&sup4; N&sub3;, Trifluoracetyl, Benzyloxycarbonyl oder Fluorenylmethoxycarbonyl.
Die Phosphonatgruppen des an den Feststoff gebundenen Oligomers werden dann oxidiert, um Phosphatgruppen zu bilden. Vorzugsweise wird dies durch Behandlung mit Ind in wäßrigem Pyridin bewerkstelligt.
Die resultierende Verbindung wird dann von diesem festen Träger entfernt, vorzugsweise durch Spaltung durch Methanolyse. Die gewonnene Verbindung wird repräsentiert durch die Formel:
worin n eine ganze Zahl von 2-30, vorzugsweise 5-20, ist, Bn für Benzyl steht, und R² wie obenstehend definiert ist; siehe Verbindung 13 und 15, Tabelle 3. (Die Verbindung wird mit einem Gegenion assoziiert sein. Vorzugsweise ist das Ion Ammonium oder substituiertes Ammonium).
Die resultierende Verbindung wird dann durch Hydrierung mit Palladium auf Aktivkohle entschützt. In dem Fall, wo R² (CH&sub2;)pCH(OR³)&sub2; ist, wird die hydrierte Verbindung ferner einer selektiven Säurehydrolyse unterzogen, wie durch Behandlung mit wäßriger Trifluoressigsäure. Die resultierenden PRP-Oligomere werden durch Standardtechniken gereinigt, vorzugsweise durch Ionenaustauschchromatographie, HPLC oder Gelfiltration; siehe Verbindungen 14 und 16, Tabelle 3.
Die Tabelle 1 zeigt die Synthese des Ketteninitiationsmonomeren, Verbindung 7, und des Kettenelongationsmonomeren, Verbindung 8. Das einfach erhältliche Methyl-2,3-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 1) (Leonard et al., J. Het. Chem. 3: 485 (1966)) wird als Ausgangsmaterial verwendet. Die Allylierung von Verbindung 1 mit Allylbromid/Natrium hydroxid in N,N-Dimethylformamid ergibt die erwartete 5-O-Allyl-Verbindung 2 als ein Öl, das destilliert werden kann. Diese Verbindung wird einer Abfolge von Reaktionen unterzogen, umfassend die Hydrolyse mit wäßriger Ameisensäure, Natriumborhydrid-Reduktion, Tritylierung mit Triphenylmethylchlorid/Pyridin, Benzylierung mit Benzylchlorid/Natriumhydroxid in N,N-Dimethylformamid und Hydrolyse mit wäßriger Essigsäure. Die resultierende Verbindung 3 wird durch Silicagel-Chromatographie gereinigt.
Die Benzylierung von Verbindung 1 mit Benzylchlorid/Natriumhydroxid in N,N-Dimethylformamid ergibt die erwartete 5-O-Benzyl-Verbindung 4 als ein Öl, das destilliert werden kann. Diese Verbindung wird einer Abfolge von Reaktionen unterzogen, umfassend Hydrolyse mit wäßriger Ameisensäure und Benzoylierung mit Benzoylchlorid in Pyridin, was die Verbindung 5 ergibt, welche durch Chromatographie und Kristallisation gereinigt wird. Die Verbindung 5 wird einer weiteren Abfolge von Reaktionen unterzogen, umfassend die Behandlung mit Bromwasserstoff in Dichlormethan, um das Glykosylbromid herzustellen, gefolgt von Behandlung mit Methanol und Collidin. Der resultierende Orthoester wird dann mit Natriummethoxid in Methanol debenzoyliert. Das resultierende Produkt wird mit Allylbromid/Natriumhydroxid in N,N-Dimethylformamid allyliert, um, nach Reinigung durch Silica-Gelchromatographie, die Verbindung 6 zu ergeben.
Die Glykosylierung kann durch zwei Verfahren bewirkt werden. Bei dem bevorzugten Verfahren wird Verbindung 6 mit Trimethylsilylchlorid behandelt, um das entsprechende Glykosylchlorid zu ergeben, welches, bei Behandlung mit Verbindung 3 in Gegenwart von Molekularsieben, dasselbe Ribitolglykosid ergibt. Alternativ dazu wird Verbindung 6 in Gegenwart von Verbindung 3 umgeestert. Der resultierende Ribitolorthoester wird dann in situ rearrangiert, um das Ribitolglykosid zu ergeben.
Das Glykosid wird dann einer Debenzoylierung mit Natriummethoxid in Methanol und einer Benzylierung mit Benzylchlorid/Natriumhydroxid in N,N-Dimethylformamid unterzogen. Das resultierende 5-O-Allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1-O-(3-O-allyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosyl)-D-ribitol wird mit Tris-(triphenylphosphin)rhodium(I)-chlorid/Quecksilber(II)-chlorid/- Wasser deallyliert und mit Monomethoxytritylchlorid monomethoxytrityliert. Das resultierende Ketteninitiationsmonomer (Verbindung 7) wird durch Chromatographie gereinigt.
Die Kondensationsreaktion von Verbindung 7 mit Phosphorsäure/5,5-Dimethyl-2-oxo-2-chlor- 1,3,2-dioxaphosphorinan ergibt das Kettenelongationsmonomer (Verbindung 8).
Die Tabelle 2 zeigt die Synthese der Monomeren für die Kettentermination. Die Verbindung 6 wird mit Trimethylsilylchlorid umgesetzt, um das entsprechende Chlorid zu ergeben, welches mit den geeigneten Alkoholen in Gegenwart von Molekularsieben umgesetzt wird, um beta- Glykoside der Alkohole zu ergeben. Vorzugsweise handelt es sich bei den Alkoholen um 2-(2- Azidoethoxy)ethanol, 2-[2-Benzyloxycarbonylamido)ethoxy]ethanol oder 2,2-Diethoxyethanol. Die beta-Glykoside werden der Reaktionsabfolge Debenzoylierung, Benzylierung und Deallylierung unterzogen, wie bei der Herstellung von Verbindung 7, was die Verbindungen 9 oder 11 ergibt. Die Kondensation mit Phosphorsäure/5-5-Dimethyl-2-oxo-2-chlor-1,2,3,-dioxa-phosphorinan gemäß demselben Verfahren, das verwendet wurde, um Verbindung 8 herzustellen, ergibt die gewünschten Spacer enthaltenden Monomeren (Verbindungen 10 oder 12).
Die Tabelle 3 zeigt die spezifischen PRP-Oligomere, welche nach Festphasensynthese unter Verwendung der Verbindungen 7, 8 und 10 oder 12 erhalten werden. Die Verbindungen 13 und 15 sind die geschützten Oligomere nach Entfernung von dem festen Träger, und die Verbindungen 14 und 16 sind die letztendlichen Oligomere nach dem Entschützen.
Die bevorzugte Anwendung des neuen PRP liegt bei der Herstellung der neuen immunogenen Konjugate. Das Oligomer wird an eines der Proteine oder Polypeptide der Erfindung durch Standardtechniken, angewandt auf die hierin enthaltenen Lehren, gekoppelt. Wenn der Spacer in einer Aldehydgruppe endigt, ist die bevorzugte Technik die reduktive Aminierung unter Verwendung von Natriumborhydrid, wie beschrieben in Roy et al., J. Carbohydr. Chem. 6: 161- 165 (1987), und Lee et al., Carbohydr. Res., 77: 149-156 (1979). Wenn der Spacer mit einer Aminogruppe endigt, wird das PRP in das Isothiocyanat durch Behandlung mit einem aktivierten Thiokohlensäurederivat, wie Thiophosgen, umgewandelt und danach an das Protein bei einem pH-Wert von 9-10 gemäß den Verfahren gekoppelt, welche beschrieben sind in Kallin et al., Glycoconjugate J., 3: 311-319 (1986) und Zopf et al., Methods Enzymol., 50: 171- 175 (1978). Das Verhältnis von Protein/Kohlenhydrat wird durch eine Kombination der Lowry-Proteinbestimmung und der Ribose-Bestimmung ermittelt. Das Verhältnis ist hauptsächlich eine Funktion des Verhältnisses von Kohlenhydrat zu Protein in der anfänglichen Reaktionsmischung und des verwendeten Typs von Spacer. Wie gezeigt in Beispiel 3, führt die Verwendung eines Spacers, welcher mit einer Aminogruppe endigt (Verbindung 16), zu einer größeren Anzahl von Oligosacchariden, welche an das Protein gekoppelt werden, als die Verwendung eines Spacers, der in einer Aldehydgruppe endigt (Verbindung 14). Die Tabelle 4 zeigt die Formeln der letztendlichen Konjugate.

Impfstoffe

Die Adhäsin-Oligosaccharid-Konjugate sowie ihre Proteinkomponenten, wie bereits erwähnt, können in Impfstoffen sowohl gegen invasive als auch nicht-invasive Stämme von H. influenzae verwendet werden. Die Konjugatimpfstoffe sollten größte Nützlichkeit gegen H. influenzae- Typ b aufweisen.
Die Impfstoffe umfassen eine immunologisch wirksame Menge des Immunogens in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Das Immunogen und der Träger vereinigt können als eine wäßrige Lösung, Emulsion oder Suspension vorliegen. Eine immunologisch wirksame Menge ist mittels im Fachgebiet bekannter Methoden ohne übermäßigen experimentellen Aufwand in Anbetracht der hierin enthaltenen Lehren feststellbar. Im allgemeinen wird die Menge an Immunogen zwischen 0,1 und 100 Mikrogramm pro Dosis betragen. Die Träger sind dem Fachuran bekannt und schließen Stabilisatoren, Verdünnungsmittel und Puffer ein. Geeignete Stabilisatoren schließen Kohlenhydrate, wie Sorbitol, Lactose, Manitol, Stärke, Sucrose, Dextran und Glucose, und Proteine, wie Albumin oder Casein, ein. Geeignete Verdünnungsmittel schließen Kochsalzlösung, Hank's balancierte Salzlösung und Ringer- Lösung ein. Geeignete Puffer schließen ein Alkalimetallphosphat, ein Alkaimetallcarbonat oder ein Erdalkalimetallcarbonat ein. Der Impfstoff kann auch ein oder mehrere Adjuvanzien enthalten, um die Immunogenität zu verbessern. Geeignete Adjuvanzien beinhalten Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder Aluminiumoxid oder eine Zusammensetzung, welche aus einem Mineralöl, wie Marcol 52, oder einem Pflanzenöl und einem oder mehreren Emulgiermitteln besteht.
Der Impfstoff kann auch andere Immunogene enthalten. Ein derartiger Cocktail-Impfstoff besitzt den Vorteil, daß Immunität gegen mehrere Pathogene durch eine einzige Verabreichung erhalten werden kann. Beispiele von anderen Immunogenen sind diejenigen, welche in den bekannten DPT-Impfstoffen verwendet werden.
Die Impfstoffe der Erfindung werden durch dem Fachmann bekannte Techniken im Hinblick auf die hierin enthaltenen Lehren hergestellt. Im allgemeinen werden die Immunogene mit dem Träger gemischt, um eine Lösung, Suspension oder Emulsion zu bilden. Einer oder mehrere der obenstehend erörterten Zusatzstoffe können in dem Träger vorliegen oder können anschließend zugesetzt werden. Die Impfstoffzubereitungen können, zum Beispiel, durch Gefriertrocknen für Aufbewahrungszwecke entwässert werden. Wenn dies der Fall ist, können sie anschließend durch die Zugabe eines geeigneten flüssigen Trägers zu flüssigen Impfstoffen rekonstituiert werden.
Die Impfstoffe werden Menschen oder anderen Säugern, einschließlich Nagern und Primaten, verabreicht. Vorzugsweise werden sie menschlichen Kindern, am stärksten bevorzugt Kindern, die jünger als 18 Monate alt sind, verabreicht. Sie können in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. Die Impfstoffe können durch für diesen Typ von Impfstoff bekannte Verabreichungsrouten verabreicht werden. Die bevorzugten Routen sind die intramuskuläre oder subkutane Injektion. Folglich umfaßt die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen Hi in einem Säuger, um den Säuger gegen Infektion durch invasive oder nicht-invasive Hi zu schützen. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge des Immunogens der Erfindung an den Wirt und, bevorzugt, die Verabreichung der Impfstoffe der Erfindung an den Wirt.

Reagenzien

Die Konjugate, Proteine/Polypeptide und Oligomere der Erfindung sind auch als Reagenzien für die wissenschaftliche Forschung an den Eigenschaften der Pathogenität, Virulenz und Infektiosität von Hi, als auch Wirtsabwehrmechanismen, verwendbar. Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die als ein Untersuchungsreagenz nützlich ist, enthält eine Menge von Konjugat, Protein/Polypeptid oder Oligomer, die wirksam ist, um die angestrebte Information oder Analyse zur Verfügung zu stellen. Die Bestimmung der zur Vollendung eines jeweiligen Forschungsziels notwendigen Menge hängt von dem spezifischen Typ der beteiligten Untersuchung ab und liegt ohne weiteres innerhalb der Routinefähigkeiten einer Person, die sich in derartiger Forschung engagiert, sobald die hierin enthaltenen Lehren in Betracht gezogen werden.
Es sollte verstanden werden, daß die Anwendung der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine spezifische Umgebung innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns in Betrachtung der hierin enthaltenen Lehren liegen wird. Beispiele der Produkte der vorliegenden Erfindung und von Verfahren für ihre Herstellung und Anwendung erscheinen in den nachfolgenden Beispielen.

Beispiel 1

Herstellung von synthetischem PRP-Oligosaccharid

Die Herstellung des synthetischen PRP-Oligosaccharides der Erfindung wird veranschaulicht, wie hierin beschrieben und wie in den Reaktionsschemen gezeigt, welche in den Tabellen 1-3 angegeben sind.

Methyl-5-O-allyl-2,3-O-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 2)

Eine Lösung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 1, 50,0 g), N,N-Dimethylformamid (250 ml) und pulverförmigem Natriumhydroxid (55,0 g) wurde gerührt, während Allylbromid (50,0 ml) tropfenweise zugesetzt wurde. Nach 2 Stunden wurde das überschüssige Allylbromid durch Zusetzen von Methanol (50 ml) zerstört. Nach weiterem einstündigen Rühren wurde die Mischung zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Bariumcarbonat (250 mg) wurde zugegeben und das Öl wurde bei 90-95ºC, 0,75 mm Hg, destilliert. Die Ausbeute von Verbindung 2 betrug ungefähr 90%.

5-O-Allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-D-ribitol (Verbindung 3)

Methyl-5-O-allyl-2,3-O-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 2, 1,5 g) in wäßriger Ameisensäure (25 ml) wurde 10 Stunden lang auf einem Ölbad bei 100ºC erwärmt und dann konzentriert und koevaporiert, und zwar zweimal mit Wasser. Das erhaltene sirupartige Material, hauptsächlich bestehend aus 5-O-Allyl-D-ribose und restlicher Ameisensäure, wurde in Wasser (25 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit wäßrigem Ammoniak auf 7 eingestellt. Natriumborhydrid (0,5 g) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 3 Stunden lang gerührt, dann mit Essigsäure auf pH-Wert 7 eingestellt und konzentriert. Nach drei Co-Konzentrationen mit Essigsäure-Methanol (1 : 1) und zwei Co-Konzentrationen mit Methanol wurde der Rückstand in Wasser (50 ml) gelöst, und die Lösung wurde langsam durch eine Säule aus Dowex-50Wx2 (H+-Form, 50-100 mesh, 2 · 20 cm)-Ionenaustauscherharz hindurchlaufen gelassen. Das Eluat, hauptsächlich bestehend aus 5-O-Allyl-D-ribitol, wurde konzentriert, in Pyridin aufgenommen, konzentriert und erneut in Pyridin (25 ml) aufgenommen. Triphenylmethylchlorid (8,0 g) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach Methanol (2,0 ml) zugesetzt wurde. Nach 15 Minuten wurde die Mischung zwischen Dichlormethan und Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Wasser, Schwefelsäure und wäßrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, getrocknet (Magnesiumsulfat) und konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N- Dimethylformamid (25 ml) gelöst. Die Lösung wurde gerührt, während pulverförmiges Natriumhydroxid (3,5 g) zugesetzt wurde, gefolgt von Benzylchlorid (4,40 ml, tropfenweise). Nach 2 Stunden wurde Methanol (5 ml) zugesetzt, und nach 15 Minuten wurde die Mischung zwischen Toluol und Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde in 90%iger wäßriger Essigsäure (50 ml) gelöst und 2 Stunden lang auf 100ºC erwärmt, danach konzentriert und mit Toluol co-konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf Silica-Gel gereinigt. Die Verbindung wurde mit Toluol-Ethylacetat, 9 : 1, eluiert. Die Ausbeute an sirupartiger Verbindung 3 belief sich auf 48%.

Methyl-5-O-benzyl-2,3-O-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 4)

Eine Lösung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 1, 50 g), N,N-Dimethylformamid (250 ml) und pulverförmigem Natriumhydroxid (50 g) wurde gerührt, während Benzylchlorid (64 ml) tropfenweise zugesetzt werden. Nach 2 Stunden wurde der Überschuß von Benzylchlorid durch Zugabe von Methanol (50 ml) zerstört. Nach weiterem einstündigen Rühren wurde die Mischung zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Bariumcarbonat (250 mg) wurde zugesetzt und das Öl wurde bei 115-120ºC, 0,4 mm Hg, destilliert. Die Ausbeute an Verbindung 4 belief sich auf ungefähr 90%.

Methyl-5-O-benzyl-2,3-di-O-benzoyl-beta-D-ribafuranosid (Verbindung 5)

Eine Lösung von Methyl-5-O-benzyl-2,3-O-isopropyliden-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 4, 23 g) in 95 : 5 Ameisensäure-Wasser (200 ml) wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten und danach in Eis gekühlt. Die gekühlte Lösung wurde in eine heftig gerührte Mischung von zerstoßenem Eis, wäßrigem Natriumhydroxid (240 g in 2000 ml) und Dichlormethan (1000 ml) gegossen. Die Mischung wurde in einem Trenntrichter gut geschüttelt, die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht wurde viermal mit 500 ml-Portionen von Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte, welche hauptsächlich Methyl-5-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid enthielten, wurden konzentriert. Trockenes Pyridin (50 ml) wurde zugesetzt, die Mischung wurde konzentriert und danach wurde erneut trockenes Pyridin (150 ml) zugegeben. Die Mischung wurde in Eis gekühlt, während Benzoylchlorid (34 ml) tropfenweise zugesetzt wurde. Die Mischung wurde fernerhin über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und danach wurde Wasser (2 ml) zugegeben, um überschüssiges Benzoylchlorid zu zerstören. Die Mischung wurde dann zwischen Wasser (1000 ml) und Dichlormethan (500 ml) geteilt. Die organische Schicht wurde mit 2 M wäßriger Schwefelsäure und danach mit 1 M wäßrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Eine Konzentration ergab einen Sirup, welcher auf einer Säule aus Silicagel gereinigt wurde. Die Fraktionen, welche reines Material enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Das Material konnte aus Methanol im Kalten kristallisiert werden, Schmp. 68- 69ºC. Die Ausbeute an Verbindung 5 belief sich auf 22-41%. Die Chromatographie ergab ebenfalls einiges Ausgangsmaterial (Verbindung 4) in reiner Form (5-20%).

3-O-Allyl-5-O-benzyl-1,2-O-methoxybenzyliden-alpha-D-ribofuranose (6)

Eine Lösung von Bromwasserstoff in Dichlormethan wurde durch Mischen von Dichlormethan (150 ml), Methanol (3,0 ml) und Acetylbromid (6,0 ml) hergestellt. Dann wurde Methyl-2,3- di-O-benzoyl-5-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid (Verbindung S. 4,62 g) zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Mischung, welche hauptsächlich 2,3-Di-O-benzoyl-5-O-benzyl-alpha-D-ribofuranosidbromid enthielt, in Eis gekühlt, während Collidin (25 ml) tropfenweise unter Rühren zugesetzt wurde, gefolgt von Methanol (10 ml). Die Mischung wurde 3 Stunden lang weiter bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Wasser gewaschen, konzentriert und mit Methanol co-konzentriert. Der Rückstand, der hauptsächlich 3-O-Benzoyl-5-O-benzyl-1,2-O-methoxybenzyliden-alpha-D-ribofuranose enthielt, wurde in Methanol (50 ml) gelöst, und eine Lösung von Natriummethoxid in Methanol (0,5 M, 20 ml) wurde zugesetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung durch Zugabe von CO&sub2;(s) neutralisiert, dann konzentriert und einmal mit N,N- Dimethylformamid co-konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt, während pulverförmiges Natriumhydroxid (3,0 g) zugegeben wurde, gefolgt von Allylbromid (3,0 ml). Nach 1 Stunde wurde die Mischung zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt, die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf Silica-Gel unter Verwendung von Toluol-Ethylacetat-Pyridin (90 : 10 : 1) als Elutionsmittel gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, um die Verbindung 6 (1,90 g, 48%) als farblosen Sirup zu ergeben.

2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosyl)- 5-O-monomethoxytrityl-D-ribitol (Verbindung 7)

Glykosidierungsverfahren A

Die Verbindungen 3 (4,6 g) und 6 (4,0 g) wurden in trockenem Nitromethan (60 ml) gelöst. Methanol wurde durch kontinuierliche Destillation bei konstantem Volumen unter kontinuierlicher Zugabe von Nitromethan entfernt, bis die Dünnschichtchromatographie eine vollständige Umesterung von Verbindung 6 zeigte. Quecksilber(II)-bromid (500 mg) wurde zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde bei konstantem Volumen unter kontinuierlicher Zugabe von Nitromethan abdestilliert, bis die Dünnschichtchromatographie die Bildung eines neuen Produktes zeigte. Die Mischung wurde filtriert und konzentriert, und der Rückstand wurde in 0,04 M methanolischem Natriummethoxid (50 ml) aufgenommen. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Mischung durch Zugabe von CO&sub2;(s) neutralisiert, dann konzentriert und einmal mit N,N-Dimethylformamid co-konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt, während pulverförmiges Natriumhydroxid (3,0 g) zugesetzt wurde, gefolgt von Benzylchlorid (3,0 ml). Nach 1 Stunde wurde die Mischung zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt, und die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule von Silica-Gel unter Verwendung von Toluol- Ethylacetat (9 : 1) als Elutionsmittel gereinigt. Die Fraktionen, welche 5-O-Allyl-2,3,4-tri-O- benzyl-1-O-(3-O-allyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosyl)-D-ribitol enthielten, wurde vereinigt und konzentriert. Der Rückstand wurde in 30 : 12 : 4 Ethanol-Toluol-Wasser (75 ml) gelöst, und die Lösung wurde in Gegenwart von Tris(triphenylphosphin)rhodium(I)-chlorid (200 mg) refluxiert, bis die Dünnschichtchromatographie eine vollständige Umwandlung zeigte. Die Mischung wurde danach mit Dichlormethan verdünnt, mit gesättigtem wäßrigen Kaliumchlorid gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde in 10 : 1 Aceton-Wasser (30 ml) gelöst und Quecksilber(II)-oxid (3,0 g), gefolgt von Quecksilber(II)-chlorid (3,0 g), wurde zugegeben. Nach 30 Minuten langem Rühren bei Raumtemperatur wurden die Feststoffe durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde zwischen Diethylether und Wasser aufgeteilt, mit wäßrigem Kaliumiodid gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand, der hauptsächlich 2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosyl)-D-ribitol enthielt, wurde in trockenem Pyridin (50 ml) aufgenommen, und Monomethoxytritylchlorid (3,5 g) wurde zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht gerührt, wonach Methanol zugesetzt wurde, um das überschüssige Chlorid zu zerstören. Nach 30 Minuten wurde die Mischung zwischen Dichlormethan und Wasser geteilt, danach mit wäßriger Schwefelsäure und wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer Säule aus Silicagel unter Verwendung von Toluol- Ethylacetat (9 : 1, enthaltend 1% Pyridin) als Elutionsmittel gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, um die Verbindung 7 (4,9 g, 50%, errechnet aus 6) als farblosen Sirup zu ergeben.

Glykosidierungsverfahren B

Die Verbindung 6 (4,0 g) wurde in Trimethylsilylchlorid (20 ml) gelöst. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Lösung konzentriert und dann mit trockenem Dichlormethan co- konzentriert. Der Rückstand wurde in trockenem Dichlormethan (25 ml), enthaltend pulverförmige 4A-Molekularsiebe (5,0 g) und Verbindung 3 (4,6 g), gelöst. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde in 0,04 M methanolischem Natriummethoxid (50 ml) aufgenommen und weiter behandelt, wie unter Verfahren A obenstehend beschrieben.

2,3,4-Tri-O-benzyl-1-O-(2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosyl)-5-O-monomethoxytrityl-D- ribitol-3-H-phosphonat (Verbindung 8).

Die Verbindung 7 (4,9 g) wurde in trockenem Pyridin aufgenommen und zur Trockenheit konzentriert, danach in Pyridin (20 ml) aufgenommen und zu einer Lösung von Phosphonsäure (4,1 g) in Pyridin (20 ml) zugegeben. 5,5-Dimethyl-2-oxo-2-chlor-1,3,2-dioxaphosphorinan (5,0 g) wurde zugesetzt. Als eine Dünnschichtchromatographie die vollständige Umwandlung zeigte, wurden 1 M wäßriges Triethylammoniumbicarbonat (5 ml) zugesetzt, und die Mischung wurde zwischen Dichlormethan (200 ml) und 0,5 M wäßrigem Triethylammoniumbicarbonat (130 ml) aufgeteilt. Die organische Schicht wurde konzentriert, und der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule aus Silica-Gel unter Verwendung eines stufenweisen Gradienten von Methanol in Dichlormethan (0-20%, enthaltend 1% Pyridin) als Elutionsmittel gereinigt. Die Ausbeute an amorpher Verbindung 8 belief sich auf 80-90%.

2,2-Diethoxyethyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 9, p = 1, R³ = Ethyl)

Eine Mischung von Verbindung 6 (2,0 g) und Trimethylsilylchlorid (15 ml) wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, dann konzentriert und mit trockenem Dichlormethan co- konzentriert. Der Rückstand wurde mit Glykolaldehyddiethylacetal (1,0 g), pulverisierten 4A- Molekularsieben (3,0 g) und trockenem Dichlormethan (15 ml) gemischt und wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, danach filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde in 0,04 M methanolischem Natriummethoxid (25 ml) aufgenommen. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Mischung durch Zugabe von CO&sub2;(s) neutralisiert, dann konzentriert und einmal mit N,N-Dimethylformamid co-konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt, während pulverförmiges Natriumhydroxid (3,0 g) zugesetzt wurde, gefolgt von Benzylchlorid (3,0 ml). Als die TLC eine vollständige Umwandlung anzeigte, wurde Methanol (2 ml) zugesetzt, und nach 15 Minuten wurde die Mischung zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt, die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule aus Silica-Gel unter Verwendung von Toluol-Ethylacetat (8 : 2) als Elutionsmittel gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert, danach in 30 : 12 : 4 Ethanol-Toluol-Wasser (50 ml) aufgenommen, und die Lösung wurde in Gegenwart von Tris(triphenylphosphin)rhodium(I)-chlorid (100 mg) refluxiert, bis die Dünnschichtchromatographie eine vollständige Umwandlung zeigte. Die Mischung wurde danach mit Dichlormethan verdünnt, mit gesättigtem wäßrigen Kaliumchlorid gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde in 10 : 1 Aceton-Wasser (20 ml) gelöst und Quecksilber(II)- oxid (2,0 g), gefolgt von Quecksilber(II)-chlorid (2,0 g), wurde zugesetzt. Nach 30 Minuten langem Rühren bei Raumtemperatur wurden die Feststoffe durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde zwischen Diethylether und Wasser aufgeteilt, mit wäßrigem Kaliumiodid gewaschen, getrocknet und konzentriert. Eine Reinigung auf einer kurzen Silica-Gelsäule unter Verwendung von Toluol-Ethylacetat (8 : 2) als Elutionsmittel ergab die sirupartige Verbindung 9. Die Ausbeute betrug 60-65%.

2-[2-(Benzyloxycarbonylamido)ethoxy]ethyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 11, p = 1, R&sup4; = NHCOOBn)

Eine Mischung von Verbindung 6 (2,0 g) und Trimethylsilylchlorid (15 ml) wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, dann konzentriert und mit trockenem Dichlormethan co- konzentriert. Der Rückstand wurde mit 2-[2-(Benzyloxycarbonylamido)ethoxy]ethanol (1,5 g), pulverisierten 4 A-Molekularsieben (3,0 g) und trockenem Dichlormethan (15 ml) gemischt und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde in 0,04 M methanolischem Natriummethoxid (25 ml) aufgenommen. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Mischung durch Zugabe von CO&sub2;(s) neutralisiert, dann konzentriert und einmal mit N,N-Dimethylformamid co-konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt, während frisch hergestelltes Silberoxid (3,0 g) zugegeben wurde, gefolgt von Benzylbromid (3,0 ml). Als die Dünnschichtchromatographie eine vollständige Umwandlung zeigte, wurde die Mischung filtriert. Das Filtrat wurde zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt, die organische Schicht wurde mit Wasser und wäßrigem Natriumthiosulfat gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule aus Silica-Gel unter Verwendung von Toluol-Ethylacetat (8 : 2) als Elutionsmittel gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert, dann mit Selendioxid (570 mg) und Essigsäure (0,4 ml) in Dioxan (14 ml) unter Rückfluß 40 Minuten lang behandelt. Die Mischung wurde danach durch Celite filtriert. Die Ausbeute der sirupartigen Verbindung 11 nach chromatographischer Reinigung belief sich auf 50%.

2-(2-Azidoethoxy)ethyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid (Verbindung 11, p = 1, R&sup4; = N3)

Eine Mischung von Verbindung 6 (2,0 g) und Trimethylsilylchlorid (15 ml) wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, dann konzentriert und mit trockenem Dichlormethan co- konzentriert. Der Rückstand wurde mit 2-(2-Azidoethoxy)ethanol (2,0 g), pulverförmigen 4A- Molekularsieben (3,0 g) und trockenem Dichlormethan (15 ml) vermischt und wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, dann filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde in 0,04 M methanolischem Natriummethoxid (25 ml) aufgenommen. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur würde die Mischung durch Zugabe von CO&sub2;(s) neutralisiert, dann konzentriert und einmal mit N,N-Dimethylformamid co-konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt, während pulverförmiges Natriumhydroxid (3,0 g) zugegeben wurde, gefolgt von Benzylchlorid (3,0 ml). Als die Dünnschichtchromatographie eine vollständige Umwandlung anzeigte, wurde Methanol (2 ml) zugegeben und nach 15 Minuten wurde die Mischung zwischen Wasser und Toluol aufgeteilt, die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule aus Silica-Gel unter Verwendung von Toluol- Ethylacetat (8 : 2) als Elutionsmittel gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert, wonach sie aufeinanderfolgend mit Tris(triphenylphosphin)- rhodium(I)-chlorid und Quecksilber(II)-chlorid/Quecksilber(II)-oxid, im wesentlichen wie bei der Herstellung von Verbindung 9 beschrieben, behandelt wurden. Die Ausbeute an sirupartiger Verbindung 11 nach chromatographischer Aufreinigung belief sich auf 50%.

2,2-Diethoxyethyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid-3-H-phosphonat (Verbindung 10, p = 1, R³ = Ethyl)

Die Verbindung 9 wurde mit Phosphonsäure und Kondensierungsreagenz im wesentlichen, wie für die Herstellung von Verbindung 8 beschrieben, behandelt, wodurch die amorphe Verbindung 10 (67%) erhalten wurde.

2-[2-(Benzyloxycarbonylamido)ethoxy]ethyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofurano sid-3-Hphosphonat (Verbindung 12, p = 1, R&sup4; = NHCOOBn)

Die Verbindung 11 wurde mit Phosphonsäure und Kondensierungsreagenz im wesentlichen, wie für die Herstellung von Verbindung 8 beschrieben, behandelt, wodurch die amorphe Verbindung 12 (75%) erhalten wurde.

2-(2-Azidoethoxy)ethyl-2,5-di-O-benzyl-beta-D-ribofuranosid-3-H-phosphonat (Verbindung 12, p = 1, R&sup4; = N&sub3;)

Die Verbindung 11 wurde mit Phosphonsäure und Kondensierungsreagenz im wesentlichen, wie für die Herstellung von Verbindung 8 beschrieben, behandelt, wodurch die amorphe Verbindung 12 (70%) erhalten wurde.

Festphasensynthese: Ketteninitiation

1. Herstellung des 3-Succinates von Verbindung 7

Zu einer Lösung von Verbindung 7 (4 mmol) in trockenem Pyridin (25 ml), enthaltend 4- Dimethylaminopyridin (1 mmol), wurde Bernsteinsäureanhydrid (10 mmol) zugegeben. Nach Rühren über Nacht wurde Wasser (0,5 ml) zugegeben. Nach 3 Stunden wurde die Mischung zwischen 1 : 1 Toluol-Ethylacetat und wäßrigem Phosphatpuffer (pH 6,5) aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Puffer gewaschen und konzentriert. Das erhaltene 3-Succinat von 7 wurde im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

2. Kopplung des 3-Succinates an die feste Phase

Das obenstehend erhaltene Succinat (10 Äquivalente über dem Harz-Aminogruppengehalt) wurde in Dichlormethan (5 ml/g) gelöst und mit einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (5 Äquivalente über dem Harz-Aminogruppengehalt) in einem kleinen Volumen Dichlormethan gemischt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethylformamid (5 ml/g) gelöst und die Lösung wurde filtriert und dann zu einem Merrifield-Typ-Aminomethylharz (vorgewaschen mit N,N- Dimethylformamid) zugegeben. Nach 6 Stunden wurde das Harz mit N,N-Dimethylformamid und danach mit Pyridin gewaschen. Das Harz wurde 2 Stunden lang mit 9 : 1 Pyridin- Essigsäureanhydrid behandelt, mit Pyridin gewaschen und dann mit Dichlormethan gewaschen. Das Ausmaß der Funktionalisierung wurde durch Behandlung einer getrockneten und abgewogenen Menge des Harzes mit 0,5% Trifluoressigsäure in 1,2-Dichlorethan und Abschätzen des Tritylkationen-Gehaltes im Überstand durch Spektralphotometrie (495 nm) bestimmt. Ein typischer Wert belief sich auf 0,5 mmol/g.

Festphasensynthese: Kettenelongations-Zyklus

Die Festphasensynthese-Verfahrensschritte wurden in einer halbautomatischen Vorrichtung durchgeführt, welche aus einem Reaktionsgefäß mit einem Glasfilterboden, einer Rührvorrichtung (Ansätze im kleinen Maßstab wurden durch Einpressen von trockenem Stickstoff durch den Bodenfilter bewegt), einem Flüssigkeitsauslaß (Boden) und einem Flüssigkeiteinlaß (Oberseite) bestand. Flüssigkeit wurde aus dem Gefäß durch den Bodenfilter mittels Absaugen entfernt und an der Oberseite durch ein Einpressen mit Stickstoff aus anderen Gefäßen durch Teflonschlauchleitung zugegeben.

1. Trityl-Entschützung

Das Harz wurde mit einer 0,5%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan behandelt, bis kein weiteres Tritylkation freigesetzt wurde (wie spektrophotometrisch festgestellt), danach wurde das Harz mit Dichlormethan, gefolgt von 4 : 1 Dichlormethan-Pyridin, gewaschen.

2. Kopplung

Pivaloylchlorid (4 Äquivalente über den Harz-Hydroxylgruppen) in Dichlormethan (2 ml/mmol Chlorid) wurde zu einer Lösung von Verbindung 8 (4 Äquivalente) in 4 : 1 Dichlormethan- Pyridin (8 ml/mmol Chlorid) gegeben. Nach 2 Minuten wurde die Mischung dem Harz zugegeben. Das Rühren wurde 10 Minuten lang fortgesetzt, dann wurde das Harz aufeinanderfolgend mit Pyridin und 4 : 1 Dichlormethan-Pyridin und Dichlormethan gewaschen. Die Ausbeute in jedem Kopplungsschritt belief sich auf 97% - 99%, wie spektrophotometrisch durch die Menge des im Entschützungsschritt freigesetzten Tritylkations bestimmt wurde.

Kettentermination

Detrityliertes Harz wurde wie unter (2) behandelt, jedoch mit Verbindung 9 oder 11 anstatt von 8.

Oxidation

Das Harz wurde mit einer frisch hergestellten 1%igen Lösung von Iod in 98%igem wäßrigen Pyridin 30 Minuten lang behandelt und dann aufeinanderfolgend mit Pyridin und Dichlormethan gewaschen.

Entfernen von dem Harz

Das Harz wurde mit Natriummethoxid/1 : 1-Dioxan-Methanol (0,05 M) 16 Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt, Essigsäure wurde zugegeben, und die Mischung wurde dann filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert. Der Rückstand enthielt, gemäß einer NMR- Analyse, die Verbindung 13 (wenn 10 für die Kettentermination verwendet wurde) oder 15 (wenn 12 für die Kettentermination verwendet wurde) zusammen mit Verunreinigungen.

Entschützen

1. Umwandlung von Verbindung 13 in Verbindung 14

Das Material, welches wie obenstehend beschrieben von dem Harz entfernt wurde, wurde in 1 : 2 : 2 Ethylacetat-Ethanol-Wasser (0,1 ml/mg Material), enthaltend Essigsäure (0,3%), gelöst, und 10% Pd/C (0,5-2 mg/mg Material) wurde zugegeben. Die Mischung wurde bei 60ºC und atmosphärischem Druck über Nacht hydriert, dann filtriert, auf pH-Wert 7 eingestellt und konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Diethylether und Wasser aufgeteilt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und konzentriert. Der Rückstand wurde in 50%iger wäßriger Trifluoressigsäure bei 0ºC aufgenommen. Nach 4 Stunden wurde die Mischung bei 0ºC mit Ammoniak auf pH-Wert 7 neutralisiert, dann wurde die Mischung auf ein Volumen von ungefähr 10 mg/ml konzentriert und auf eine Säule aus Fractogel TSK HW-50 aufgetragen, welche mit 10 mM Ammoniumbicarbonatpuffer, pH-Wert 6,2, gepackt und eluiert wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und erneut in Wasser gelöst (0,1 ml/mg Material). Diese Lösung wurde langsam durch eine Säule von Dowex-50 · 8 (Na-Form, gepackt und eluiert mit Wasser) hindurchgelassen. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Eine NMR-Spektroskopie in D&sub2;O-Lösung zeigte, unter anderem, Signale von den anomeren Protonen in der Region 4,9-5,1 ppm und Signale von der Spacer- Einheit (Aldehydproton, Dihydrat-Form) bei 5,1-5,2 ppm. Die Menge an erfolgreichen Kopplungszyklen (d. h. der Wert von n in der Formel für Verbindung 14) wurde durch Integration über die anomeren Signale bzw. die Spacer-Signale verifiziert.

2. Umwandlung von Verbindung 15 in Verbindung 16

Das Material, welches von dem Harz entfernt worden war, wurde im wesentlichen wie obenstehend für die Umwandlung von Verbindung 13 in 14 beschrieben behandelt, außer daß die Trifluoressigsäure-Behandlung weggelassen wurde. Eine NMR-Spektroskopie in D&sub2;O- Lösung des lyophilisierten Produktes zeigte, unter anderem, Signale von den anomeren Protonen in der Region 4,9-5,1 ppm und Signale von der Spacer-Einheit (CH&sub2;N-Triplet) bei 3,2 ppm. Die Menge an erfolgreichen Kopplungszyklen (d. h. der Wert von n in der Formel für Verbindung 16) wurde durch Integration über die anomeren Signale bzw. die Spacer-Signale verifiziert. Die Reinigung von 14 und 16 konnte ebenfalls durch präparative HPLC auf Nucleosil C-18 unter Verwendung von 0,1 M wäßrigem Triethylammoniumacetat (pH-Wert 5,3) mit 2,5% Acetonitril als Elutionsmittel bewerkstelligt werden.

Beispiel 2

Reinigung eines Hib-Adhäsins

Bakterien wurden 24 Stunden lang in definiertem Medium herangezogen und metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin markiert. Die Zellen wurden durch dreimalige Zentrifugation in Kochsalzlösung geerntet und gewaschen und in ungefähr 20 ml 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, suspendiert und auf Eis gekühlt. Die Bakteriensuspension wurde dann auf Eis 6mal je 30 Sekunden lang bei einer Einstellung von 4 auf einem Bronson-Ultraschallgerät ultraschallbehandelt. Der ultraschallbehandelte Extrakt wurde 10 Minuten lang bei 4ºC bei 10 000 · g zentrifugiert und das resultierende Außenmembranprotein (OMP)-Pellet wurde bis zur Verwendung in Hepes-Puffer aufbewahrt, welcher Proteaseinhibitoren (PIC I & PIC II) enthielt.
Als nächstes wurden die OMPs 30 Minuten lang bei 4ºC bei 100 000 · g zentrifugiert und das resultierende Pellet wurde in 4 ml 10 mM Hepes, pH-Wert 8,0, enthaltend 1,3 Octylglucopyranosid (Sigma), suspendiert, 5 Minuten lang ultraschallbehandelt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden solubilisierten OMPs wurden erneut 30 Minuten lang bei 4ºC bei 100 000 · g zentrifugiert und der Überstand, der teilweise gereinigtes Adhäsin enthielt, wurde dekantiert und aufbewahrt.
Das Adhäsin wurde durch ein Rezeptoraffinitäts-Festphasenverfahren wie folgend gereinigt. Der Überstand wurde 1/10 in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7, 8, enthaltend 150 mM NaCl und 1% Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt und in Rezeptor-beschichteten Mikrotitervertiefungen (0,8 Mikrogramm Gangliotetraosylceramid/Vertiefung) inkubiert, welche zuvor mit BSA blockiert worden waren. Kontrollvertiefungen ohne Rezeptor wurden ebenfalls verwendet. Nach einer 2 Stunden langen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Ver tiefungen 4mal mit kalter Kochsalzlösung gewaschen. Das Rezeptor-gebundene Adhäsin wurde durch 30 Minuten langes Inkubieren der Vertiefungen bei 37ºC mit 0,05 ml 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, enthaltend 0,1% SDS, welches zuvor auf 60ºC erwärmt worden war, eluiert. Der SDS-Elutionspuffer wurde aus den Vertiefungen entfernt und hinsichtlich Protein durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Alternativ dazu kann das Adhäsin durch Verwenden einer Affinitätschromatographiesäule gereinigt werden, wobei der Lipidrezeptor auf einem geeigneten festen Gelträger immobilisiert ist. Der Ultraschallextrakt wird auf die Spitze des Gels aufgetragen und die Säule wird gewaschen, um nicht-gebundenes Material zu entfernen. Das Adhäsin wird danach mit SDS- Elutionspuffer oder einem chaotropen Mittel, wie NaCl oder KSCN, eluiert und dialysiert und durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Das Molekulargewicht des gereinigten Adhäsinproteins wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ermittelt. Die Fig. 1 zeigt die Probenanalyse in den folgenden Spuren: 1: Gesamt-Außenmembranprotein-Präparation aus Haemophilus influenzae-Typ b, gefärbt mit Coomassie-Blau; 2: Autoradiographie von ³&sup5;S-markierten Gesamt-Außenmembranproteinen; 3: Autoradiographie von ³&sup5;S-markiertem Adhäsinprotein, eluiert von immobilisiertem Rezeptor-Asialo-GM&sub1;; 4: Autoradiographie von Material, eluiert aus immobilisiertem Globosid, einem Nonsense-Glykolipid. Der Pfeil zeigt das Adhäsin an, welches zwischen P1 und P2 bei einem Molekulargewicht von etwa 41 kD wandert.

Beispiel 3

Neutralisation der Adhäsin-Bindung an Rezeptor

BALB C-Mäuse wurden intraperitoneal mit 10 Mikrogramm teilweise gereinigtem Adhäsinprotein (Hib-OMPs) in vollständigem Freundschen Adjuvanz (1 : 1) injiziert. Nach einem Monat wurden die Mäuse mit einer zweiten IP-Injektion (10 Mikrogramm Protein) unter Verwendung von unvollständigem Freundschen Adjuvanz geboostert, gefolgt von einer dritten Injektion 10 Tage später.
Das Antiserum wurde dann hinsichtlich der neutralisierenden Aktivität gegenüber ³&sup5;S-markiertem Hib-Adhäsin in einem Rezeptorbindungsassay getestet. In diesem Fall wurden Antiserum und normales Mausserum bei verschiedenen Verdünnungen mit ³&sup5;S-markiertem Hib- Adhäsinprotein 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und danach zu Mikrotitervertiefungen gegeben, welche mit Asialo-GM1 oder Globosid, als einer Negativkontrolle, beschichtet waren. Nach 2 Stunden langer Inkubation der Mikrotiterplatten bei Raumtemperatur wurden die Mikrotitervertiefungen gewaschen, aus den Platten geschnitten und die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Beta-Szintillationszählers quantifiziert. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß das Adhäsin immunogen ist und daß Antikörper gegen das Adhäsin die Rezeptorbindungsaktivität des Adhäsins wirksam neutralisieren.

Beispiel 4

Identifizierung und Klonierung eines Haemonhilus influenzae-Adhäsins

1. Bindung von Membranproteinen an Rezeptor.

Membranproteine wurden wie folgend hergestellt. Haemophilus wurden bis zur stationären Phase herangezogen, pelletiert, in Kochsalzlösung-Puffer resuspendiert und durch Ultraschall aufgebrochen. Dieses Material wurde danach 15 Minuten lang bei 12 000 · g zentrifugiert, und der Überstand wurde 1 Stunde lang bei 100 000 · g zentrifugiert. Das resultierende Pellet enthielt Haemophilus-Membranen, welche in Kochsalzlösung resuspendiert und hinsichtlich Adhäsinaktivität getestet wurden, wie beschrieben in Krivan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6157-6161 (1988), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Kurz gesagt, wurden Membranen aus mit [³&sup5;S]-Methionin metabolisch markierten Zellen (1 uCi/ml Medium) hergestellt. Glykolipide wurden in Chloroform : Methanol (1 : 1, v/v) resuspendiert, und Verdünnungsreihen wurden in 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten angefertigt. Diese Platten wurden trocknen gelassen, 5mal mit Tris/BSA (25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1% Rinderserumalbumin) gewaschen, danach wurden 2 · 10&sup6; CPM markierte Membranen in jede Vertiefung gegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann 5mal mit Tris/BSA gewaschen und die individuellen Vertiefungen wurden herausgeschnitten und auf einem Szintillationszähler ausgezählt, um die Menge von an jede Vertiefung gebundenen CPM zu bestimmen. Dies zeigte, daß Hi-Membranen ähnlich wie Hi-Gesamtzellen gebunden hatten.

2. Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche die Adhäsion von Haemophilus inhibieren.

Balb/c-Mäuse wurden mit Membranen aus Haemophilus immunisiert und ihre Seren wurden hinsichtlich der Entwicklung von Antikörper getestet, welcher die Membranen an der Bindung an Rezeptor hinderte (Fig. 2). Die Milzen aus diesen Mäusen wurden verwendet, um Splenozyten für die Fusion mit SP2/o-AG14 (ATCC CRL 8287)-Maus-Myelomzellen gemäß Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1985) zu isolieren. Siebenhundertundfünfzig positive Fusions-Hybridomkulturen aus vier getrennten Fusionen wurden hinsichtlich der Herstellung von Antikörper gescreent, welcher auf einem ELISA mit Membranen reagierte. Der ELISA wurde wie folgend durchgeführt. Membranen, die 1 Mikrogramm Protein enthielten, wurden verwendet, um 96- Vertiefungs-Mikrotiterplatten zu beschichten. Die beschichteten Vertiefungen wurden mit PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung, 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 167 mM Natriumchlorid) gewaschen und danach mit 100 Mikrolitern Hybridomkulturüberstand inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen, mit 100 Mikrolitern sekundärem Ziegen-Anti-Maus- Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, 1 Stunde lang inkubiert, und danach wurde gebundender Antikörper kolorimetrisch (Biorad) nachgewiesen. Fünfundsiebzig Membranreaktive Hybridomkulturen wurden danach hinsichtlich der Fähigkeit getestet, Membranbindung zu inhibieren (Fig. 3). Hybridomkulturüberstände wurden mit 4 · 10&sup6; CPM [³&sup5;S]- Methionin-markierten Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde dann zu Verdünnungsreihen von Rezeptor zugegeben, welcher passiv an 96- Vertiefungs-Mikrotiterplatten gebunden war, und hinsichtlich Bindung geassayt. Zwei Klassen von inhibierenden Antikörpern wurden identifiziert. Eine Klasse, wie die als Hib 10 bezeichneten Antikörper, inhibierten die Bindung vollständig, und von ihnen wurde anschließend gezeigt, daß sie mit der Lipooligosaccharidkomponente dieser Membranen reagieren. Die zweite Klasse von Antikörpern, wie diejenigen, welche als Hib30 und Hib43 bezeichnet wurden, inhibierten die Bindung teilweise.

3. Identifikation des vermutlichen Adhäsins.

Die Hybridomkulturen, welche Antikörper herstellten, die die Bindung teilweise inhibierten, wurden gemäß Harlow et al. kloniert, indem die Verdünnung beschränkt wurde, um stabile Zeillinien zu erhalten. Große Mengen von Antikörper wurden in der Aszitesflüssigkeit von Balb/c-Mäusen hergestellt, und die Klasse jedes Antikörpers wurde gemäß Harlow et al. ermittelt. Die Antikörper wurden dann auf einem Western-Blot von Haemophilus-Membranen und -Gesamtzellen eingesetzt, um ein potentielles Proteinadhäsin gemäß Harlow et al. zu identifizieren. Alle dieser Antikörper erkannten ein etwa 47 kD großes Protein durch diese Technik (Fig. 4). Eine Western-Blot-Analyse mit diesen Antikörpern gemäß Harlow et al. erlaubte eine weitere Charakterisierung dieses Proteins. Mehrere Beweislinien legten nahe, daß dieses Protein auf der Oberfläche von Haemonhilus lokalisiert ist, wie es für ein funktionales Adhäsin erwartet werden würde. Zuerst wurde die Fähigkeit von Gesamtzellen, den Rezeptor zu binden, durch diese Antikörper in einem Assay inhibiert, wie obenstehend für die Inhibition von Membranbindung beschrieben, jedoch unter Verwendung von radioaktiv markierten Gesamtzellen (4 · 10&sup6; CPM/ Vertiefung). Als zweites wurde das 47 kD große immunoreaktive Protein abgebaut, als Gesamtzellen mit Proteinase K behandelt wurden (Fig. 4). Kurz gesagt, wurden Gesamtzellen bis zur stationären Phase herangezogen, durch Zentrifugation pelletiert (12 000 · g) und in PBS resuspendiert. Verdünnungsreihen von Proteinase K wurden den Zellen zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Dann wurden die Zellen mit SDS-PAGE- Probenpuffer gemäß Laemmli, Nature (London), 227: 680 (1970), gemischt, gekocht und auf SDS-PAGE aufgetrennt. Diese Gel wurde dann Western-geblottet, um die Gegenwart eines immunreaktiven 47 kD großen Proteins nachzuweisen. Drittens enthielten iodierte Gesamtzellen ein radioaktiv markiertes 47 kD großes Protein, welches aus solubilisierten Proteinen durch die Anti-Adhäsin-Antikörper immunpräzipitiert werden konnte. Kurz gesagt, wurden gesamte Haemophilus bis zur stationären Phase herangezogen und durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen wurden in PBS resuspendiert und mit Iodogen (Pierce) gemäß den Empfehlungen des Herstellers iodiert. Die Zellen wurden danach in Radioimmunpräzipitationspuffer (RIPA-Puffer, 20 mM Tris, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P- 40,1% Desoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM PMSF) solubilisiert und dann mit Gammabind- Perlen (Pharmacia) über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Perlen wurden dann durch Zentrifugation pelletiert (2000 · g, 5 Min), 5mal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen und in SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert. Diese Probe wurde dann durch SDS-PAGE auf getrennt, und das Gel wurde getrocknet und autoradiographiert. Dies zeigt, daß das 47 kD große Protein einer Iodierung zugänglich war. Viertens verloren Gesamtzellen und Membranen, welche wiederholt mit 1% Triton X-100 extrahiert worden waren, dieses 47 kD große immunreaktive Protein. Dies wurde durchgeführt durch Verwenden von Gesamtzellen oder Membranen und Mischen dieser mit dem Detergenz, Pelletieren des Materials durch Zentrifugation (12 000 · g für Membranen und 2000 · g für Gesamtzellen) und Abnehmen des Überstands. Dieses Material (Pellet und Überstand) wurde durch ein SDS-PAGE-Gel getrennt, einem Western-Blot unterzogen, und die Gegenwart des 47 kD großen Proteins wurde mit Hib43-Antikörper in der löslichen Fraktion (Überstand) nachgewiesen.

4. Klonierung und Sequenzierung des Gens, welches für das 47 kD große Adhäsin codiert.

Klonierungsverfahren wurden durch Standardverfahrensweisen durchgeführt, wie beschrieben von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1982). Gesamt-DNA aus Haemophilus influenza-Typ b wurde isoliert und mit den Restriktionsenzymen Eco R1, gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Boeringer-Mannheim), teilweise verdaut. DNA-Fragmente von 4-15 kb Länge wurden auf einem Sucrosegradienten isoliert und an EcoR1-verdaute Lambda ZAPII-Arme ligiert, wie diese von Stratagene, Inc., geliefert werden. Diese Ligation wurde danach in Phagenpartikel verpackt und verwendet, um den Eschericha coli-Wirtsstamm XL-1 (gemäß dem Protokoll von Stratagene) zu transfizieren, um Phagenplaques zu erhalten, welche Haemophilus-Proteine exprimieren. Diese Plaques wurden in einem Immunoblot-Screen mit Hib43 verwendet, wobei ein Stratagene Picoblue-Detektionskit eingesetzt wurde. Positiv reagierende Plaques wurden gereinigt und verwendet, um die Herstellung eines Plasmids über die Verwendung des Helferphagen R408 (gemäß dem Stratagene-Protokoll) zu induzieren. Diese Plasmide trugen die Haemophilus-Insert-DNA, welche für das 47 kD große immun reaktive Protein codierte. Die Restriktionskarte für eines dieser Plasmide, bezeichnet als pMC101, ist in der Fig. 5 gezeigt. Alle Plasmide, welche das 47 kD große Protein exprimierten, enthielten die 10,5 kb-DNA von Hi. Die Lokalisierung des für dieses Protein codierenden Gens wurde durch Deletionsanalyse von pMC101 bestimmt und ist durch den Pfeil wiedergegeben, der auch die Transkriptionsrichtung anzeigt. Die Deletionsanalyse wurde durch Erzeugung von Subklonen von pMC101 durchgeführt, welche verschiedene Restriktionsfragmente in dem Vektor pSK(-) (Stratagene) enthielten. Diese Subklone sind in der Fig. 5 mit einer Angabe, ob jeder einzelne ein Hib 43-immunreaktives Protein exprimiert, repräsentiert. pMC102 exprimierte ein ungefähr 45 kD großes Protein, was anzeigt, daß der Carboxyterminus des Proteins in diesem Klon entfernt war. Da das reife Protein 47 kD groß ist, legt dies nahe, daß die gesamte codierende Sequenz eine Länge von ungefähr 1500-1800 Basenpaaren DNA aufweist. Deshalb wird vorausgesagt, daß die Startstelle des für das 47 kD große Protein codierenden Gens ungefähr 1500-1800 Basenpaare von dieser BamH1-Stelle entfernt liegt. Die Expression des 47 kD großen Proteins war ungeachtet der Orientierung des Gens im Hinblick auf den beta-Galaktosidase-Promotor, der in pSK(-) enthalten ist, ähnlich, was anzeigt, daß dieses Protein in E. coli. unter seinem eigenen Promotor exprimiert wird. Membranen von E. coli.-Klonen, welche dieses Protein exprimierten, wurden mit den Membranen von E. coli. verglichen, welche dieses Protein nicht exprimierten (Fig. 6). Die Bindungskurven für beide Membranpräparationen zeigen, daß dieses Protein die Fähigkeit an E. coli. vermittelt, an den Rezeptor mit hoher Affinität, wie Haemophilus, zu binden.

5. Das 47 kD große Adhäsin ist ein neues Protein.

Eine Reihe von größeren integralen Membranproteinen ist von mehreren Forschem charakterisiert worden (Gonzales et al., Infect. Immun., 55: 2993-3000 (1987)). Diese schließen P1, das ungefähr 43 kD groß ist, und P6, das ungefähr 18 kD groß ist ein. Das 47 kD große Adhäsin wurde analysiert, um sicher zustellen, daß es nicht irgendeines dieser bereits charakterisierten Proteine war. Unter Verwendung eines E. coli.-Klons, welcher P1 oder P6 exprimierte, reagierte kein einziger der Klone mit Hib 43, was zeigte bzw. nahelegte, daß dieser Antikörper keines von diesen Proteinen erkennt. Da das P1-Protein eine ähnliche Größe wie das 47 kD große Adhäsin aufweist, haben wir darüber hinaus durch Hitzemodifikation gezeigt, daß es sich bei dem 47 kD großen Adhäsin nicht um P1 handelt. Der E. coli., welcher P1 exprimierte, wurde durch SDS-PAGE nach Behandlung bei Raumtemperatur oder 100ºC aufgetrennt. Es ist bereits gezeigt worden, daß P1 durch Hitze modifizierbar ist (Gonzales et al.). Nach Behandlung bei 100ºC wandert das Protein bei etwa 43 kD, während P1 nach Behandlung bei Raumtemperatur bei etwa 32 kD wandert. Von dem 47 kD großen Protein wurde gezeigt, daß es nicht durch Hitze modifizierbar war.

6. Aufreinigung des 47 kD großen Adhäsins.

Das 47 kD große Protein wurde bis zur Homogenität unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Hib 43 als ein Immunoabsorbens gemäß Krivan et al. gereinigt. Kurz gesagt, wurde Antikörper an Cyanogen-aktivierte Sepharose-4CL-Perlen (Pharmacia) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gekoppelt. Es wurde eine 4 ml große Säule mit etwa 8 mg gekoppeltem Antikörper verwendet. Das 47 kD große Protein wurde durch XL-1/pMC101 hergestellt, welcher in einer 4 Liter großen Kultur in Luria-Nährmedium bis zur stationären Phase herangezogen worden war. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (12 000 · g, 15 Min), in PBS resuspendiert und ultraschallbehandelt. Der Ultraschall-Ansatz wurde durch Zentrifugation pelletiert (12 000 · g, 15 Minuten), und der Überstand wurde durch Zentrifugation pelletiert (1 000 000 · g, 1 Stunde). Das resultierende Membranpellet wurde in 1 Sarkosyl (N-Lauroylsarkosin) (Sigma Chemical) resuspendiert und durch Zentrifugation pelletiert (100 000 · g, 1 Stunde). Der Überstand wurde in erschöpfender Weise gegen PBS dialysiert und dann auf die Antikörpersäule aufgetragen. Danach wurde die Säule mit PBS gewaschen, und gebundenes Protein wurde mit 3,5 M MgCl&sub2; eluiert. Dieses Material wurde gegen PBS dialysiert und durch Auftrennung auf SDS-PAGE analysiert. Das Gel wurde mit Silber gefärbt (Biorad). Das 47 kD große Protein erschien als eine Einzel-Spezies, was die Aufreinigung bis zur Homogenität anzeigte.

7. Konservierung des 47 kD großen Adhäsins bei der Gattung Haemophilus.

Die Konservierung dieses 47 kD großen Proteins in der Haemophilus-Gattung wurde unter Verwendung von Western-Blots von Gesamtzellen aus den gewählten Organismen analysiert, die in Tabelle 5 aufgelistet sind. Nicht-typisierbare, Typ b- und nicht-typisierte klinische Isolate von Haemophilus influenzae besitzen ein ungefähr 47 kD großes Protein, welches mit Hib 43 reagierte.

Beispiel 5

Kopplung von synthetischem PRP an Protein

Verwendung der Oligomere von Verbindung 14

Eine Lösung von menschlichem Serumalbumin (41 mg, 1,0 uMol) in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 8,0, 1,5 ml) wurde mit einer Lösung von Verbindung 14 (40 uMol) gemischt, und dann, nach 1 Stunde, wurde Natriumcyanoborhydrid (26 mg, 410 uMol) zugesetzt. Die Mischung wurde 4 Tage lang bei 37ºC vorsichtig gerührt, dann ultrafiltriert, mit Wasser verdünnt und wiederum ultrafiltriert. Das zurückgehaltene Material wurde lyophilisiert und durch Gel filtration auf Bio-Gel P4 gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Das Ausmaß der Funktionalisierung (als Haptene/Proteinmolekül) wurde durch eine Kombination von Lowry-Proteinbestimmung und Orcinol-Ribosebestimmung abgeschätzt. Im allgemeinen wurde ein Wert von 5-10 Haptenen/Proteinmolekül erhalten.

Verwendung von Oligomeren von Verbindung 16

Eine Lösung von Verbindung 16 (100 uMol) in einer Mischung von wäßrigem Natriumhydroxid (0,5 M, 6,0 ml), Ethanol (4,0 ml) und Essigsäure (180 Mikroliter) wurde gerührt, während Thiophosgen (30 Mikroliter) zugesetzt wurde. Nach 10 Minuten wurde die Mischung zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt, die wäßrige Phase wurde auf das halbe Volumen konzentriert und zu einer Lösung von menschlichem Serumalbumin (164 mg, 4,0 uMol) in Boratpuffer (0,1 M, pH 9,3, 6 ml) zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 9,5 eingestellt und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur vorsichtig gerührt, dann ultrafiltriert, mit Wasser verdünnt und wiederum ultrafiltriert. Das zurückgehaltene Material wurde lyophilisiert und durch Gelfiltration auf Bio-Gel P4 gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Das Ausmaß der Funktionalisierung (als Haptene/Proteinmolekül) wurde durch eine Kombination von Lowry-Proteinbestimmung und Orcinol-Ribosebestimmung abgeschätzt. Im allgemeinen wurde ein Wert von 10-20 Haptenen/Proteinmolekül erhalten. Tabelle 1: Herstellung von Monomeren für Festphasensynthese von PRP-Fragmenten
Monomer für die Ketteninitiation bei Festphasensynthese
Monomer für die Kettenelongation bei Festphasensynthese Tabelle 2: Herstellung von einen Spacer enthaltenden Monomeren für die Kettentermination bei der Festphasensynthese
Monomere für die Kettentermination bei Festphasensynthese Tabelle 3: Nach vervollständigter Festphasensynthese erhaltene Oligomere Tabelle 4: Struktur von Konjugaten zwischen synthetischem PRP-Fragment und Adhäsin-Protein Tabelle 5. Reaktivität von ausgewählten Haemophilus-Spezies mit Hib 43.

Claims

1. Immunogenes Oligosaccharid-Protein-Konjugat, umfassend ein Polyribosylribotolphosphat- (PRP)-Fragment, gekoppelt an ein H. influenzae-Adhäsinprotein, wobei das Adhäsinprotein ein Molekulargewicht von 41000 Dalton oder 47000 Dalton aufweist.

2. Konjugat von Anspruch 1, wobei das PRP-Fragment ein synthetisches Oligosaccharid ist.

3. Konjugat von Anspruch 2, wobei das synthetische Oligosaccharid ein lineares Homopolymer aus alternierenden Molekülen von Ribose und Ribitol, verknüpft durch eine Phosphodiesterbindung, ist, welches repräsentiert wird durch die Formel:

worin n 2 bis 30 ist.

4. Konjugat von Anspruch 3, wobei 1 bis 30 der Oligosaccharide an das Protein geknüpft sind.

5. Konjugat von Anspruch 1, wobei es sich bei dem Protein um ein H. influenzae- Adhäsinprotein mit einem Molekulargewicht von 47000 Dalton handelt.

6. Konjugat von Anspruch 1, wobei das Oligosaccharid an ein Polypeptid gebunden ist, welches eine aktive Stelle des Adhäsinproteins enthält.

7. Verfahren zur Herstellung des Konjugats von Anspruch 1, umfassend das kovalente Koppeln des PRP-Fragmentes an das Protein.

8. Immunogenes Oligosaccharid-Protein-Konjugat, repräsentiert durch die Formel:

worin m 1-30 ist, n 2-30 ist, R (CH&sub2;)pCH&sub2;NH oder (CH&sub2;CH&sub2;O)pCH&sub2;CH&sub2;NHCSNH ist, worin p 1-3 ist, und X ein H. influenzae-Adhäsinprotein oder Fragment davon, welches eine aktive Stelle des Proteins enthält, ist, wobei das Protein ein Molekulargewicht von 41000 Dalton oder 47000 Dalton aufweist.

9. Gereinigtes H. influenzae-Adhäsinprotein, wobei das Protein ein Molekulargewicht von 41000 Dalton oder 47000 Dalton aufweist.

10. Protein von Anspruch 9, wobei das Protein an einen Rezeptor für das Protein bindet, welcher gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Fucosylasialo-GM1, Asialo-GM1 und Asialo-GM2.

11. Protein von Anspruch 9, wobei das Protein ein kleineres H. influenzae-Adhäsinprotein mit einem Molekulargewicht von 41000 Dalton ist.

12. Protein von Anspruch 9, wobei das Protein ein H. influenzae-Adhäsinprotein mit einem Molekulargewicht von 47000 Dalton ist.

13. Gereinigtes Polypeptid, welches ein Fragment des Proteins von Anspruch 11 oder 12 ist, wobei das Fragment eine aktive Stelle enthält.

14. Gereinigtes Polypeptid, welches eine aktive Stelle des Proteins von Anspruch 11 oder 12 ist.

15. Gereinigtes Polypeptid von Anspruch 14, wobei die aktive Stelle eine H. influenzae- Rezeptorbindungsstelle ist.

16. Gereinigtes Polypeptid von Anspruch 15, wobei die Rezeptorbindungsstelle in der Lage zur Hervorrufung einer antigenen Antwort gegen H. influenzae in einem tierischen Wirt ist und immunologisch mit dem Protein von Anspruch 11 oder 12 kreuzreaktiv ist.

17. Gereinigtes Protein oder Polypeptid, abgeleitet aus dem Protein von Anspruch 11 oder 12 durch die Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer der Aminosäuren des Proteins oder Polypeptids, wobei das abgeleitete Protein oder Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv mit dem Protein von Anspruch 11 oder 12 ist.

18. Gereinigtes Polypeptid, abgeleitet aus dem Polypeptid von Anspruch 13 durch die Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren des Polypeptids.

19. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten H. influenzae-Adhäsinproteins von einem Molekulargewicht von 41000 Dalton oder 47000 Dalton, umfassend die folgenden Schritte:

Solubilisieren der Membranen von H. influenzae-Bakterien, wodurch solubilisiertes Material, welches das Adhäsinprotein enthält, und unlösliches Material hergestellt wird;

Trennen des solubilisierten Materials von dem unlöslichen Material;

Kontaktieren des solubilisierten Materials mit einem Rezeptor für das Adhäsinprotein, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fucosylasialo-GM1, Asialo-GM1 und Asialo-GM2, wobei der Rezeptor an einen unlöslichen festen Träger geheftet ist, während einer Zeitdauer, die ausreichend ist, damit das Adhäsinprotein an den Rezeptor bindet; und

Entfernen des Proteins von dem Rezeptor, wodurch das Adhäsinprotein in gereinigter Form gewonnen wird.

20. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten H. influenzae-Adhäsinproteins von einem Molekulargewicht von 41000 Dalton oder 47000 Dalton, umfassend die folgenden Schritte:

Extrahieren von H. influenzae-Bakterienmembranen mit einer Lösung, welche Membranassoziierte Proteine entfernt, um einen das Adhäsinprotein enthaltenden Extrakt herzustellen;

Trennen des das Adhäsinprotein enthaltenden Überstands von dem festen Material in dem Extrakt;

Kontaktieren des Überstands mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Adhäsinprotein, wobei der Antikörper an einen unlöslichen festen Träger gebunden ist, während einer Zeitdauer, die ausreicht, damit das Adhäsinprotein an dem monoklonalen Antikörper bindet; und

Entfernen des Proteins von dem Antikörper, wodurch das Adhäsinprotein in gereinigter Form gewonnen wird.

21. Isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz, codierend für ein H. influenzae- Adhäsinprotein von Anspruch 11 oder 12.

22. Verfahren zur Herstellung einer isolierten DNA-Sequenz, codierend für ein H. influenzae- Adhäsinprotein von Anspruch 11 oder 12, umfassend die folgenden Schritte:

Screenen einer genomischen Bibliothek, welche die DNA von H. influenzae enthält, wobei die Bibliothek Klone umfaßt, welche verschiedene Sequenzen der DNA enthalten, die funktionstüchtig und wiedergewinnbar in einen Vektor eingefügt worden sind, wobei jeder der Vektoren lediglich eine Sequenz der DNA enthält, durch Kontaktieren der die Bibliothek umfassenden Klone mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Adhäsinprotein oder einem Rezeptor für das Adhäsinprotein, um einen Klon zu identifizieren, der an die Antikörper oder den Rezeptor bindet; und

Isolieren des Klons.

23. Verfahren von Anspruch 22, ferner umfassend den Schritt des Gewinnens der exogenen DNA-Sequenz aus dem Klon.

24. Isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz, abgeleitet aus der DNA-Sequenz von Anspruch 21 durch einzelne oder mehrere Mutationen, oder einer DNA-Sequenz, welche daran unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert, wobei die DNA-Sequenz für ein Protein oder Polypeptid codiert, das immunologisch mit dem Protein von Anspruch 9 kreuzreaktiv ist.

25. Rekombinante DNA-Sequenz, umfassend die DNA-Sequenz von Anspruch 21 in funktionstüchtiger Verknüpfung an geeignete regulatorische Steuerungsnukleinsäuresequenzen, welche fähig zum Bewirken der Expression der DNA-Sequenz in transformierten Wirtszellen sind.

26. Expressionsvektor zum Exprimieren von DNA, welche für ein H. influenzae-Adhäsinprotein codiert, in einer kompatiblen Wirtszelle, umfassend einen Expressionsvektor, der fähig zum Transformieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle ist, und die DNA von Anspruch 25, welche in den Vektor in richtiger Orientierung und korrektem Leserahmen für die Expression eingefügt ist.

27. Wirtszelle, die mit der rekombinanten DNA-Sequenz von Anspruch 25 transformiert ist.

28. Rekombinantes Protein, hergestellt durch die transformierte Zelle von Anspruch 27.

29. Verfahren zur Herstellung eines H. influenzae-Adhäsinproteins eines Molekulargewichts von 41000 Dalton oder 47000 Dalton, umfassend die folgenden Schritte:

Kultivieren von Wirtszellen, transformiert durch eine rekombinante DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz, welche für ein H. influenzae-Adhäsinprotein codiert, in funktionstüchtiger Verknüpfung an geeignete regulatorische Steuerungsnukleinsäuresequenzen, welche in der Lage zur Bewirkung der Expression der DNA-Sequenz in den transformierten Zellen sind, umfaßt; und

Gewinnung des Proteins, dessen Expression durch die Sequenz codiert worden ist.

30. Impfstoff zum Schützen eines Säugers gegen H. influenzae. umfassend eine immunologisch wirksame Menge des Konjugates von Anspruch 1 oder des Proteins von Anspruch 11, 12 oder Anspruch 28 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

31. Impfstoff zum Schützen eines Säugers gegen H. influenzae, umfassend eine immunologisch wirksame Menge des Konjugates von Anspruch 8 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei n und p für alle der Konjugate gleich sind.

32. Immunogenes Polypeptid, umfassend ein Fusionsprotein, welches ein H. influenzae- Adhäsinprotein von Anspruch 11 oder 12 enthält.

33. Konjugat gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in der Medizin.

34. Protein gemäß Anspruch 9, 11 oder 12 zur Verwendung in der Medizin.