DE69627149T2

DE69627149T2 - Antigene polysaccharidfragmente mit einer terminalen 2,5-anhydro-d-mannosegruppevon gruppe b-streptococcus, typ ii und typ iii, und daraus hergestellte konjugatimpfstoffe

Info

Publication number: DE69627149T2
Application number: DE69627149T
Authority: DE
Inventors: Dong Catherine; Tai Joseph; Francis Michon
Original assignee: North American Vaccine Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: HUP9900919A3; DE69627149D1; US20020031526A1; KR100431236B1; AU6095396A; HUP9900919A2; PL187822B1; JP4001625B2; IL136125A; US6602508B2; AU706479B2; CA2223080A1; EP0830380B1; ZA964822B; PL323822A1; IL118603A0; ATE236194T1; IL118603A; KR19990022747A; US6284884B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft antigene Kapselpolysaccharidfragmente, die von Nutzen sind für die Konjugation an ein Protein, um Immunogene zu erzeugen, die schützende Antikörper hervorrufen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Kapselpolysaccharide von Gruppe B- Streptococcus (GBS CP) mit analysierbaren, reduzierenden Endgruppen, ihre Herstellung und ihre Verwendung bei der Herstellung von Konjugatimpfstoffen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

GBS-Bakterien sind ein anerkanntes ätiologisches Agens für eine Bakterämie und/oder Meningitis bei Kleinkindern und für Infektionen bei Erwachsenen. Baker, "Group B Streptococcal Infections" in Advances in Internal Medicine, 25: 475-500 (1980). Entsprechend ist es wichtig, schnelle und eindeutige Tests für die Diagnose von GBS-Infektionen und Verfahren zur Erzeugung von Schutz gegen GBS zu entwickeln, insbesondere bei Kleinkindern und gefährdeten Individuen.
Von den Kapselpolysacchariden von GBS-Bakterien ist es bekannt, dass sie für die Virulenz von GBS und zur Entwicklung einer schützenden Immunität wichtig sind. Vgl. Kasper et al., U.S. Patent 5,302,386. Darüber hinaus sind die CP der bekannten GBS-Typen (I-V) chemisch verwandt, aber antigen unterschiedlich und haben sich wiederholende Strukturen, die aus Galactose, Glucose, N-Acetylglucosamin und N-Acetylneuraminsäure (Sialsäure) aufgebaut sind.
Kleinkinder und junge Kinder haben eine schlechte immunogene Antwort auf Polysaccharidantigene. Diese Antworten sind dadurch charakterisiert, dass sie unabhängig von T-Zellen sind und deshalb mit so wichtigen Eigenschaften wie Erinnerung, Isotyp-Wechsel oder Affinitätsreifung nicht assoziiert sind, die notwendig sind, um einen immunologischen Langzeitschutz gegen Folgeinfektionen hervorzurufen. Um dieses Fehlen einer wirksamen immunologischen Antwort auf Polysaccharide bei Kleinkindern und jungen Kindern zu umgehen, wurden im Stand der Technik Verfahren entwickelt, um die von T-Zellen unabhängige Antwort in eine von T-Zellen abhängige Antwort umzuwandeln, indem bakterielle Polysaccharidantigene an ein Trägerprotein gekoppelt wurden, um ein Konjugatmolekül zu bilden. Vgl. Jennings et al., U.S. Patent 4,356,170, das durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Im Stand der Technik wurden verschiedene Verfahren beschrieben, um Kapselpolysaccharide mit Proteinen zu konjugieren. Für einen Überblick vgl. Contributions to Microbiology and Immunology, Bd. 10, Conjugate Vaccines, Bandausgaben J. M. Cruse und R. E. Lewis, Jr., 1989. Bei einem Verfahren wird das Polysaccharid einer milden sauren Hydrolyse unterworfen, um reduzierende Endgruppen zu produzieren, die in der Lage sind, mit einem Protein zu reagieren, um eine kovalente Bindung einzugehen. Anderson, P. A., Infect. Imm., 39: 233-238 (1983). Die terminalen Zuckergruppen jedoch, die an der Konjugation mit dem Protein beteiligt sind, existieren in einem Gleichgewicht zwischen einem Hemiacetal und einem Aldehyd und koppeln daher nur mit geringer Effizienz an ein Protein. Um die geringe Reaktivität des terminalen reduzierenden Zuckers zu überwinden, wandte sich der Stand der Technik zu einer milden Oxidation, um stabile Aldehydgruppen an den terminalen Positionen von Polysacchariden einzuführen, die verwendet werden, um mit Proteinen zu konjugieren. Jennings et al., U.S. Patent 4,356,170, a.a.O.
Kasper et al., U.S. Patent 5,302, 386 beziehungsweise die internationale Anmeldung WO 94/06467 betreffen GBS-Typ III und -Typ II-Konjugatimpfstoffe. Gemäß dem 5,302,386- Patent wird Endo-β-Galactosidase verwendet, um das Polysaccharidrückgrat zu spalten, um für eine Konjugation mit einem Protein geeignete Produkte zu erhalten. Die Oxidation von mindestens zwei terminalen Sialsäuregruppen zur Herstellung von verknüpften Konjugaten wird in der Anmeldung WO 94/06467 beschrieben.
Kapselpolysaccharide von GBS-Typ III sind aus einem Rückgrat von sich wiederholenden, verzweigten Pentasaccharideinheiten aufgebaut. Jennings et al., Canadian J. Biochem., 58: 112-120 (1980). Eine Untersuchung von Polysacchariden von GBS-Typ III berichtet, daß die natürliche, immundeterminante Stelle an der Verzweigung von Rückgrat und Seitenkette liegt. Jennings et al., Biochemistry, 20: 4511-4518 (1980). Die Anwesenheit des terminalen N-Acetylneuraminsäurerests in der Seitenkette war kritisch für die immundeterminante Expression, wie berichtet wird.
Frühere Verfahren zur Depolymerisation von GBS II- oder III-Polysacchariden beruhen entweder auf teurem enzymatischen Verfahren oder auf Säurehydrolyse, was die antigenen Eigenschaften der CP wegen der Entfernung der labilen terminalen Sialsäuregruppen verändern kann. Entsprechend gibt es einen Bedarf für relativ billige und milde chemische Verfahren, die bei der Depolymerisation der GBS-Typ II- und III-CP auf eine Weise wirksam sind, die in Fragmenten resultiert, die bei der Herstellung von Konjugatimpfstoffen mit CP-Protein von Nutzen sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Depolymerisation von Kapselpolysacchariden (CP) von Gruppe B Streptococcus-Typ II (GBS-II) und -Typ III (GBS- III) durch desaminierende Spaltung, um Produkte herzustellen, die mit einer 2,5-Anhydro-D- Mannose-Struktur enden. Gemäß dieser Erfindung werden CP von GBS-II und GBS-III mit Natriumhydroxid und einem nitrosierenden Reagenz wie Natriumnitrit behandelt, um die GBS-Polysaccharide zu depolymerisieren und Fragmente herzustellen, die eine terminale Aldehydgruppe haben, die am Ende des Polysaccharidrückgrats liegt. Die resultierenden CP- Fragmente sind antigen und auch von Nutzen für die Konjugation an ein Protein, um Immunogene herzustellen, die wirksam sind beim Hervorrufen einer schützenden Immunantwort in Säugern einschließlich Neugeborener.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugatmoleküls zur Verwendung als Impfstoff. Das Verfahren umfaßt die Anwendung einer Behandlung von CP von GBS-II und GBS-III mit einer Base und einem Reagenz, das Diazoniumsalze bildet, um ein Fragment zu bilden, das mit einem 2,5-Anhydro- D-Mannose-Rest endet. Das mit 2,5-Anhydro-D-Mannose endende Fragment wird dann mit einem Protein kombiniert und einer reduktiven Aminierung unterworfen, um die Konjugatmoleküle der Erfindung zu bilden. Demgemäß sind ein anderer Aspekt dieser Erfindung GBS-II- und GBS-III-CP-Konjugatmoleküle, die GBS-II- oder GBS-III-CP- Fragmente enthalten, die mittels einer terminalen 2,5-Anhydro-D-Mannose mit einem Protein verknüpft sind. Weil das Verfahren der Depolymerisation der GBS-Typ II- und-Typ III- Polysaccharide Fragmente erzeugt, die am terminalen Ende des Rückgrats eine einzige reaktive Stelle haben, stellt diese Erfindung Mittel zur Herstellung von Konjugatmolekülen bereit, in denen jede GBS-Typ II- und -Typ III-Polysaccharidkette an ein einziges Protein gebunden ist, jede mittels eines sekundären Amins durch den terminalen reduzierenden Zucker.
Die Konjugate dieser Erfindung sind von Nutzen als aktive Impfstoffe zur Immunisierung von Individuen gegen bakterielle Infektionen mit GBS-II und GBS-III. Mit dieser Erfindung werden ebenfalls multivalente Impfstoffe bereitgestellt, die Polysaccharide umfassen, die von verschiedenen Serotypen oder Arten von Bakterien abgeleitet sind.
Zusätzlich umfaßt diese Erfindung Immunserum oder Antikörper, die als Antwort auf die Immunisierung mit den Konjugatmolekülen dieser Erfindung gebildet wurden und die als Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit von GBS-Typ II- oder III-Bakterien oder als Impfstoffe zur Erzeugung einer passiven Immunität von Nutzen sind.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung sind Verfahren und Zusammensetzungen, die bei der Trennung und/oder dem Nachweis von GBS-Typ II oder III- Antikörper von Nutzen sind. Gemäß einer Anwendungsart dieser Ausführungsform werden die gemäß dieser Erfindung hergestellten Polysaccharidfragmente an einem festen Träger immobilisiert. Durch Kombination einer Quelle eines Antikörpers wie Serum mit dem an den festen Träger gebundenen Polysaccharidfragment kann der Antikörper, der an das Polysaccharidfragmente bindet, mit Standard-Immuntestverfahren nachgewiesen oder aus dem Ausgangsmaterial oder Serum abgetrennt werden.
Ein Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Fragmentierung von GBS-Typ II- oder III-Polysacchariden zur Produktion von Fragmenten, die zur Herstellung von Konjugatmolekülen von Nutzen sind. Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist die Produktion von GBS-Typ II- oder III-Polysaccharidmolekülen, die als Impfstoffe zum Schutz gegen Infektionen und als Immunreagenzien von Nutzen sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1. Direkte Bindung von Kaninchen-anti-Typ II-Polysaccharid-spezifischem Antikörper an Typ II-Fragmentpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugate (mit Fragmenten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 15, 33 und 51 Kilodalton), verglichen mit der Bindung an natives Typ II-Polysaccharid (200 Kilodalton)-Tetanustoxoid-Konjugat, das als 100% Bindungsreferenz genommen wird.
Fig. 2. Direkte Bindung von Kaninchen-anti-Typ III-Polysaccharid-spezifischem Antikörper an Typ III-Fragmentpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugate (mit Fragmenten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 13, 18, 26, 34 und 48 Kilodalton), verglichen mit der Bindung an natives Typ III-Polysaccharid (90 Kilodalton)-Tetanustoxoid-Konjugat, das als 100% Bindungsreferenz genommen wird.
Fig. 3. H-NMR-Spektrum von nativem GBS-Typ II-Polysaccharid, das ein Molekulargewicht von etwa 200 kDa hat.
Fig. 4. H-NMR-Spektrum von GBS-Typ II-Polysaccharidfragment, das ein Molekulargewicht von etwa 12 kDa hat und das die Protonenpeaks zeigt, die mit 2,5- Anhydro-D-Mannose assoziiert sind und das gemäß dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt wurde.
Fig. 5. H-NMR-Spektrun von nativem GBS-Typ III-Polysaccharid, das ein Molekulargewicht von etwa 100 kDa hat:
Fig. 6. H-NMR-Spektrum von GBS-Typ III-Polysaccharidfragment, das ein Molekulargewicht von etwa 9 kDa hat und das die Wasserstoffpeaks zeigt, die mit 2,5- Anhydro-D-Mannose assoziiert sind und das gemäß dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt wurde.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft antigene Gruppe B Streptococcus-Typ II- und -Typ III- Polysaccharidfragmente, die die folgende 2,5-Anhydro-D-Mannose reduzierende Endstruktur haben:
worin R&sub1; H ist und R&sub2; eine sich wiederholende Einheit von sialyliertem Heptasaccharid der Formel
ist, worin n für GBS Typ II etwa 5 bis etwa 50 ist; und worin R&sub1; eine sich wiederholende Einheit von sialyliertem Pentasaccharid der Formel
ist, worin n etwa 5 bis 50 ist und R&sub2; für GBS Typ III das Disaccharid αNeuAc (2-3) β-D- Galp1- ist.
Diese Fragmente werden gemäß dieser Erfindung durch Depolymerisation von GBS- Typ II- und III-Polysacchariden höheren Molekulargewichts produziert, die die nachstehend gezeigte Struktur haben: TYP II
worin n für das native Polysaccharid etwa 200 ist; oder die sich wiederholende Einheit für GBS-Typ III TYP III
worin n für das native Polysaccharid etwa 100 ist.
Wie hier verwendet hat der Ausdruck Gruppe B Streptococcus- oder (GBS)-Bakterien die selbe Bedeutung, wie sie von Durchschnittsfachleuten verstanden wird, insbesondere mit Bezug auf Lancefield, J. Exp. Med., 108: 329-341 (1938) und folgende Arbeiten, die die Gruppe B-Serotypen weiter charakterisieren, vgl. Russell-Jones., J. Exp. Med., 160: 1476 (1984), um speziell Bakterien einzuschließen, die taxonomisch als Streptococcus agalactiae bezeichnet werden.
Das Verfahren der Erfindung zur Fragmentierung von GBS-Typ II- und III- Kapselpolysacchariden, um die neuen Fragmente der Erfindung zu produzieren, verwendet milde, nicht denaturierende Bedingungen, um GBS-Typ II- und III-Polysaccharidfragmente zu erhalten, die von der chemischen Depolymerisation stammen. Diese Fragmente können in hoher Ausbeute erhalten werden, was das Verfahren zur Produktion von Impfstoffen in großem Maßstab ökonomisch macht.
GBS-Typ II- und III-CP werden gemäß dem Verfahren dieser Erfindung wie folgt depolymerisiert. Die 2-Desoxy-2 N-acetamido-β-D-glucopyranosylreste des Rückgrats im Typ II- und III-GBS-CP (Formel 1) werden mit einer milden Base in wäßriger Lösung partiell des- N-acetyliert. Beispiele für Basen, die zur Verwendung bei dem Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, wäßrige Alkalimetallhydroxidlösungen, zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, oder andere Basen wie Ammoniumhydroxid, Hydrazin, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat. Nach der Basenbehandlung ist der resultierende Glucosaminrest (Formel II) dann, der Nitrosierung unter Verwendung eines geeigneten Reagenz wie zum Beispiel Natriumnitrit oder salpetriger Säure zugänglich, um ein instabiles N-Nitroso-Derivat (Formel III) zu bilden. Die Umlagerung wegen des nucleophilen Angriffs des Ringsauerstoffs auf das Kohlenstoffatom 2 resultiert in einem Zusammenziehen des Rings und einer Spaltung der benachbarten Glycosidbindung (Formel IV). Diese Reaktion ist verwendet worden, um die Struktur von Heparin und von verschiedenen Glycosaminoglycanen zu untersuchen. Barnett, U.S.-Patent 4,438,261.
2,5-Anhydro-D-Mannose
Die Aldehydgruppe in dem resultierenden 2,5-Anhydro-D-Mannoserest (Formel IV), der an dem reduzierenden Ende des Polysaccharidfragments gebildet wird, kann direkt ohne weitere chemische Manipulationen (z. B. Verwendung eines Spacerarms) zur Verknüpfung durch reduktive Aminierung mit einem Aminogruppen enthaltenden Polymer, vorzugsweise ein Protein, verwendet werden.
Genauer gesagt wird zur Durchführung der Depolymerisaflon der GBS-Polysaccharide gemäß der Erfindung die Reaktion in wäßriger Lösung in einem Gefäß geeigneter Größe durchgeführt. Um die Reaktion zu starten, wird eine geeignete Menge an Polysaccharid in wäßriger Lösung mit einer Base behandelt, um den Glucopyranosylrest des Rückgrats partiell zu des-N-acetylieren. Kurz gesagt kann die Reaktion in einem basischen wäßrigen Medium bei erhöhten Temperaturen, zum Beispiel etwa 50ºC bis 110ºC, und bei einem pH-Wert von etwa 13 bis 14 durchgeführt werden. Die Menge an Base sollte empirisch optimiert werden. Vorzugsweise ist das Verhältnis von Base zu N-Acetylgruppen zwischen etwa 10 bis 50 mÄq. Mehr bevorzugt ist das Verhältnis etwa 20 bis 25 mÄq. Die Rate und das Ausmaß der Reaktion können durch Anpassung der Basenkonzentration, der Reaktionstemperatur oder der Reaktionszeit optimiert werden. Das Ausmaß der Des-N-Acetylierung kann mittels H-NMR verfolgt werden.
Um Fragmente von etwa 5 bis 60 kDa zu erhalten, sollte das Ausmaß der Des-N- Acetylierung zwischen etwa 20 bis zu etwa 2 Prozent der Gesamtzahl an verfügbaren Stellen sein. Um die Desacetylierungsreaktion zu stoppen, kann die Reaktion abgekühlt werden, d. h. auf Eis abgeschreckt werden, oder auf einen pH-Wert von etwa 4 angesäuert werden. Die Ansäuerung muß sorgfältig vorgenommen werden, um die Hydrolyse der verbleibenden Sialsäuregruppen zu vermeiden.
Die Nitrosierungsreaktion zur Bildung des Aldehyds wird dann durch Zugabe von Natriumnitrit oder eines anderen geeigneten Reagenz wie verdünnte salpetrige Säure zu dem des-N-acetylieren Polysaccharid durchgeführt. Das Nitrosierungsreagenz wie Natriumnitrit wird vorzugsweise in einem molaren Überschuß im Vergleich mit den Molen an des-N- acetylierten Gruppen zugegeben. Die Reaktion des Polysaccharids mit dem Nitrosierungsreagenz wird bei niedrigen Temperaturen, zum Beispiel etwa 4ºC, unter Rühren etwa 2 Stunden oder bis zum Abschluß durchgeführt. Das Ausmaß der Reaktion kann durch Testen auf die Anwesenheit von Aldehydgruppen verfolgt werden. Im Verlauf der Reaktion sollte die Konzentration an Aldehydgruppen zunehmen, bis ein Plateau erreicht ist. Eine Beendigung der Reaktion kann durch Verdünnen der Reaktion und durch Anhebung des pH- Werts auf etwa 7 mit verdünnter Base wie NaOH erreicht werden. Die Entfernung von überschüssigen Reagenzien kann mittels Dialyse unter Verwendung von Standardverfahren erreicht werden.
Nach Abschluß der Reaktion können die Polysaccharidfragmente, die eine terminale Aldehydgruppe am Ende des Rückgrats haben, unter Verwendung von Standard- Chromatographieverfahren größenfraktioniert und gewonnen werden. Bevorzugte Größen für die Konjugation mit Proteinen sind zwischen 5 kDa and 50 kDa für das GBS-Typ II- Polysaccharid und zwischen etwa 5 kDa and 50 kDa für das GB 5-Typ III-Polysaccharid. Bevorzugtere Größen sind zwischen 5 and 20 kDa für die GBS-Typ II- und zwischen 10 and 50 kDa für die GBS-Typ III-Polysaccharide. Die größenfraktionierten Fragmente können unter Verwendung von zuvor beschriebenen Standardverfahren der reduktiven Aminierung für Konjugationsreaktionen verwendet werden (vgl. zum Beispiel U.S.-Patent 4,356,170 und internationale Anmeldung WO 94/06467) oder können für eine späterer Verwendung aufbewahrt werden.
Die desaminierende Spaltung und Konjugation, die auf GBS-Typ II angewendet wird, kann gemäß der Erfindung wie folgt erreicht werden:
Das Verfahren der Depolymerisation der Typ III-Polysaccharide durch desaminierende Spaltung unter Bildung von antigenen Typ III-Fragmenten, die mittels reduktiver Aminierung direkt an ein Trägerprotein gekoppelt werden können, wird nachstehend illustriert:
Die Proteinkomponente der Konjugatmolekule der Erfindung kann jedes physiologisch tolerierte Protein oder Polypeptid ausreichender Länge sein, um eine T-Zellabhängige Antwort hervorzurufen. Beispiele für solche Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, bakterielle Proteine oder Polypeptide, einschließlich Tetanus-Toxin oder Tetanus-Toxoid, kreuzreaktive Materialien wie CRM&sub1;&sub9;&sub7;, ein rekombinantes, nicht IgA bindendes Protein des β-C-Antigens von Typ Ia/Ib-Gruppe B-Streptococcus und rekombinantes Klasse 3-Äußeres Membranprotein und (OMP) von Neisseria Meningitides.
Das molare Verhältnis von Polysaccharid zu Protein in den Konjugatmolekülen der Erfindung ist vorzugsweise zwischen etwa 1 Mol bis zu etwa 10 Mol Polysaccharid pro Mol Protein. Mehr bevorzugt ist das Verhältnis zwischen 3 und 10 Polysaccharidfragmente pro Mol Protein. Variationen im Protein/Polysaccharid-Verhältnis können durch Anpassung des Verhältnisses der Ausgangskomponenten in der Konjugationsreaktion erreicht werden.
Zusätzlich zur Bereitstellung von Konjugatmolekülen, die GBS-Typ II- oder III- Polysaccharide umfassen, die mit einem Protein konjugiert sind, zieht diese Erfindung auch multivalente Konjugate und ihre Impfstoffe in Betracht, wobei verschiedene Arten von Polysacchariden mit einem einzigen Protein konjugiert sind. Zum Beispiel können die Polysaccharide von den GBS-Typen I, II, III, IV oder V in verschiedenen Kombinationen an ein Protein gebunden sein, ebenso wie Polysaccharide, die von anderen Bakterien abgeleitet sind, wie zum Beispiel Haemophilus influenzae-Typ B oder auch Meningococcus-Typen A, B oder C. Eine bevorzugte Kombination wären die Polysaccharide von den GBS-Typen II und III.
Die gemäß dieser Erfindung hergestellten Konjugatmoleküle umfassen typischerweise ein Protein, an das mindestens ein GBS-Typ II- oder III-Polysaccharidfragment mittels einer einzigen Bindungsstelle am terminalen Ende des Rückgrats des Polysaccharidfragments gebunden ist. Somit stellt die Erfindung die Fähigkeit bereit, wenn erwünscht, GBS-Typ II- oder III-Konjugatmoleküle zu produzieren, in denen die Polysaccharidkomponente nicht durch ein Protein verdeckt wird, außer an einem Ende. Andere Verfahren der Konjugation von GBS- Typ II- und III-Polysacchariden mit einem Protein mittels der terminalen Sialsäuren der Verzweigungen können in einer Vernetzung und einer Anheftung des Polysaccharids an das Protein an einer Vielzahl von Stellen resultieren. Diese Erfindung zieht auch Konjugatmoleküle in Betracht, die unter Verwendung einer Kombination von Verfahren hergestellt werden können. Zum Beispiel können Konjugate, die gemäß der Erfindung mittels Produktion einer einzelnen reaktiven 2,5-Anhydro-D-Mannose-Endgruppe synthetisiert wurden, weiterhin mit Polysacchariden reagieren, die an mehreren Stellen aktiviert wurden.
Das Verfahren der Herstellung von Impfstoffen gemäß dieser Erfindung stellt nützliche Impfstoffe bereit, die wichtig sind zur Erzeugung von Schutz gegen GBS-Typ II- und III- Infektionen in Säugern und insbesondere bei Frauen im gebärfähigen Alter, Neugeborenen, abwehrgeschwächten Erwachsenen und Kindern mit dem Risiko einer GBS-Infektion. Von diesen Impfstoffen ist zu erwarten, daß sie insbesondere von Nutzen sind zur Verabreichung an schwangere Frauen als ein Mittel zur Hervorrufung einer Immunantwort in dem Fötus vor der Geburt.
Impfstoffe werden in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine Immunantwort hervorzurufen. Typischerweise ist eine Dosis zwischen etwa 1 und 50 ug Polysaccharid ausreichend zur Erzeugung einer solchen Antwort. Die Dosierungen können basierend auf der Größe, dem Gewicht oder dem Alter des Individuums, das den Impfstoff empfängt, angepaßt werden. Die Antikörperantwort in einem Individuum kann durch Testung des Antikörpertiters oder der bakteriziden Aktivität verfolgt werden und kann gegebenenfalls verstärkt werden um die Antwort zu erhöhen.
Die Impfstoffe können Standardträger, -Puffer und -Konservierungsstoffe enthalten, die den Durchschnittsfachleuten bekannt sind und die für Impfstoffe geeignet sind. Zusätzlich können auch Adjuvantien wie Alaun oder Stearyltyrosin in den Formulierungen eingeschlossen sein, um die Immunantwort zu erhöhen.
Die gemäß dieser Erfindung hergestellten Polysaccharidfragmente sind auch von Nutzen zur Herstellung verschiedener Immunreagenzien zur Verwendung in Immuntests und zur Trennung von GBS-Typ II- oder III-Antikörpern. Zum Beispiel können für Immuntests die Polysaccharidfragmente entweder direkt oder mittels eines Proteinlinkers wie in den Konjugaten dieser Erfindung an einem festen Träger immobilisiert werden. Der feste Träger kann dann in verschiedenen, den Durchschnittsfachleuten bekannten Immuntestsystemen einschließlich Radioimmuntests und ELISA-Tests zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern gegen GBS-Typ II- oder III-Bakterien verwendet werden. Solche Tests können zur Diagnose der Anwesenheit von Infektionen bei Individuen durch Testung auf die Anwesenheit von GBS-Typ II- oder III-Antikörpern im Serum verwendet werden.
Zur Verwendung bei der Trennchemie können die Polysaccharidfragmente an einem festen Träger immobilisiert werden, um eine Affinitätssäule herzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polysaccharidfragment gemäß dem Verfahren der Erfindung zunächst mit einem Protein konjugiert, und das resultierende Konjugat wird dann mit einer Trägermatrix gekoppelt. Verfahren zur Kopplung eines Proteins an eine Affinitätssäule sind den Durchschnittsfachleuten bekannt. Allgemeine Träger für Affinitätssäulen werden aus Agarose hergestellt und sind kommerziell erhältlich, z. B. aktivierte Sepharose (Pharmacia). Solche Affinitätssäulen können dann zur Trennung von GBS-Typ II- oder III-Antikörpern aus Quellen wie Serum verwendet werden. Der Antikörper kann dann durch Kombination des immobilisierten Polysaccharidfragments mit Serum, das im Verdacht steht, GBS-Typ II- oder III-Antikörper zu enthalten, unter Bedingungen, die die Bindung von Antikörpern an immobilisierte Fragmente zulassen, aus dem Serum abgetrennt werden. Der gebundene Antikörper kann darin entweder mittels herkömmlicher Testtechniken nachgewiesen werden oder nach Abtrennung der restlichen Serumkomponenten von dem immobilisierten Träger von dem Polysaccharidfragment abgetrennt und gewonnen werden.
Die Erfindung wird nun unter Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Basen-Depolymerisation und von Natriumnitrit verursachte Ringkontraktion, um Fragmente mit 2,5-Anhydro-D-Mannose-Enden von GBS-Typ II und III zu produzieren.

GBS-Typ II

Natives Typ II-GBS-CP (75 mg) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 200.000 wurde in 3 ml 0,5 N NaOH aufgelöst, und die Lösung wurde dann in drei Teile aufgeteilt (jeweils 1 ml). Die Proben (S1-S3) wurden 60, 90 beziehungsweise 180 Minuten auf 70ºC erhitzt und dann in einem Eis-Wasserbad abgeschreckt. 125 mcl Eisessig wurden zu jeder Probe zugegeben, um ihren pH-Wert auf 4 zu bringen. Nach der Zugabe von 200 mcl 5% (Gew./Vol.) NaNO&sub2; wurden die Proben bei 4ºC 2 Stunden gerührt. Die Proben S1-S3 wurden dann mit DI-Wasser auf 5 ml verdünnt, und ihr pH-Wert wurde mit 0,5 N NaOH auf 7 eingestellt. Überschüssige Reagenzien wurden mittels Diafiltration durch eine Diaflo- Ultrafiltrationsmembran (Amicon YM 10) gegen DI-Wasser herausdialysiert, und die Lösungen wurden lyophilisiert. Drei Typ II-Polysaccharidfragmente (II-1-II-3) wurden erhalten.

GBS-Typ III

Natives Typ III-GBS-CP (125 mg) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 100.000 wurde in 5 ml 0,5 N NaOH aufgelöst, und die Lösung wurde dann in 5 Teile aufgeteilt (jeweils 1 ml). Die Proben (S1-S5) wurden 60, 90, 120, 180 beziehungsweise 240 Minuten auf 70ºC erhitzt und dann in einem Eis-Wasserbad abgeschreckt. 125 mcl Eisessig wurden zu jeder Probe zugegeben, um ihren pH-Wert auf 4 zu bringen. Nach der Zugabe von 200 mcl 5% (Gew./Vol.) NaNO&sub2; wurden die Proben bei 4ºC 3 Stunden gerührt. Die Proben S1-S5 wurden dann mit DI-Wasser auf 5 ml verdünnt, und ihr pH-Wert wurde mit 0,5 N NaOH auf 7 eingestellt. Überschüssige Reagenzien wurden mittels Diafiltration durch eine Diaflo-Ultrafiltrationsmembran (Amicon YM 10) gegen DI-Wasser herausdialysiert, und die Lösungen wurden Iyophilisiert. Fünf Typ III-Polysaccharidfragmente (III-1-III-5) wurden erhalten.

Größenverteilung der CP-Fragmente

Das durchschnittliche Molekulargewicht (avMw) jedes Fragments wurde unter Verwendung einer Superose-12-Größenausschlußsäule (Pharmacia) mit einer Dextranserie (Pharmacia) von einem durchschnittlichen Molekulargewicht, das von 10.000 bis 2.000 Dalton reichte, abgeschätzt. Todvolumen (Vo) und Gesamtvolumen (Vt) wurden mit Dextran 2.000 beziehungsweise Natriumazid bestimmt. Das durchschnittliche Molekulargewicht (avMw) jedes Fragments, das mittels dieses Verfahrens bestimmt wurde, war wie folgt:

Physikalisch-chemische Analyse der Polysaccharidfragmente

Die strukturelle Integrität jedes Fragments in Bezug auf das ursprüngliche, native Polysaccharid wurde durch hochauflösende, eindimensionale H-NMR-Spektroskopie bei 500 MHZ auf einem Bruker AM500-Spektrometer festgestellt. Der Vergleich der H-NMR- Spektren der Typ II- und Typ III-Fragmente mit denen ihrer entsprechenden nativen Polysaccharide zeigte, daß während der chemischen Prozesse keine Strukturveränderungen eingetreten waren und, am wichtigsten, daß die terminalen Sialsäurereste während der Nitrosierungsbehandlung erhalten geblieben waren.

Beispiel 2

Konjugation der Typ II- und Typ III-Polysaccharidhaptene an Tetanus-Toxoid

Tetanus-Toxoid (SSI, Dänemark) wurde zunächst mittels Gelfiltration über eine Biogel-A-Säule (Biorad Laboratories) zu seiner monomeren Form gereinigt. Das so erhaltene Tetanus-Toxoid-Monomer (TTm) (150.000 Dalton) wurde in 0,2 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, mit einer Konzentration von 2 5 mg/ml solubilisiert und zu getrockneten GBS-Typ II (II-1 bis II-3)- oder -TYP III (III-1 bis III-5)-Polysacchariden und rekristallisiertem Natriumcyanoborhydrid NaCNBH&sub3; in den nachstehend gezeigten Mengen zugegeben:
Die Reaktionsgemische wurden dann 4 Tage bei 37ºC inkubiert. Das Fortschreiten der Konjugationsreaktion wurde mittels HPLC kleiner Teilmengen der Reaktionsgemische überwacht, die auf Superose-12 (Pharmacia) analysiert wurden. Die Konjugate wurden mittels molekularer Ausschlußchromatographie auf einer Superdex G-200-Säule (Pharmacia) unter Verwendung von PBS, das 0,01% Thimerosal enthielt, als Eluierungsmittel gereinigt. Die von der Säule eluierenden Fraktionen wurden mittels eines Waters R403- Differentialrefraktometers und mittels UV-Spektroskopie bei 280 nm überwacht. Die die Konjugate enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, durch eine 0,22 um-Millipore- Membran sterilfiltriert und auf ihren Gehalt an Protein beziehungsweise Sialsäure gemäß dem Verfahren von Bradford (Bradford, M. M., 1976. Anal. Biochem., 72: 248-254) und mittels des Resorcinoltests analysiert. Die durchschnittliche Gesamtmenge an Kohlenhydrat in jedem einzelnen Typ II- und Typ III-Konjugatmolekül wurde berechnet, indem der Sialsäuregehalt genommen wurde und mit einem Korrekturfaktor von 4 beziehungsweise 3,3 multipliziert wurde, basierend auf der Zusammensetzung der sich wiederholenden Einheit. Die Analysen für jedes einzelne Konjugat sind, wie nachstehend in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Die immunchemische Spezifität von polyclonalen Kaninchenantikörpern für die Typ II- und Typ III-Polysaccharidkonjugate im Vergleich mit den für die nativen Kapselpolysaccharidepitope beobachteten wurde mittels ELISA gemessen und ist in den Fig. 1 (GBS-Typ II) und 2 (GBS-Typ III) dargestellt.

Beispiel 3

Immunogene Antwort von weiblichen Mäusen auf die Immunisierung mit GBS-Typ II- und- Typ III-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoffen

a. Immunisierungen Gruppen von 10 weiblichen Swiss Webster-Mäusen (4-6 Wochen alt) wurden subkutan mit 2 ug entweder nativem Typ II- oder Typ III-Polysaccharid oder den entsprechenden Tetanus-Toxoid-Konjugaten immunisiert. Die Impfstoffe wurden an Aluminiumhydroxid (Alhydrogel; Superfos, Dänemark) mit einer Konzentration von 1 mg an elementarem Aluminium/ml 10 mM PBS, das 0,01% Thimerosal enthielt, absorbiert. Die Mäuse erhielten den Impfstoff an den Tagen 0, 21 und 42 und wurden letztlich am Tag 52 entblutet. Die Seren wurden gesammelt und bei 70ºC aufbewahrt.
b. ELISAs und opsonisierende Aktivität von Konjugat-Antiseren
ELISAs: Mikrotiterplatten (Nung Polysorb-ELISA-Platten) wurden durch Zugabe von 100 ul an nativem Typ II- oder Typ III-Polysaccharid-HSA-Konjugat (1 ug/ml) in PBS mit 0,02% Azid pro Mulde sensibilisiert. Die Platten wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden mit PBS, das 0,05% zwischen 20 (PBS-T) enthielt, gewaschen und mit 0,5% BSA in PBS eine Stunde bei RT blockiert. Die Mulden wurden dann mit 100 ul von seriellen, zweifachen Verdünnungen von Mäuseantiserum in PBS-T gefüllt, und die Platten wurden eine Stunde bei RT inkubiert. Nach Waschen mit PBS-T wurden die Platten mit 100 ul von Peroxidase-markiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (H + L) (Kirkegaard & Perry Laboratories) gefüllt und dann fünfmal mit PBS-T gewaschen. Letztlich wurden 50 ul an TMB- Peroxidasesubstrat (Kirkegaard & Perry Laboratories) zu jeder Mulde zugegeben, und nach der Inkubation der Platten für 10 Min. bei RT wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 1M H&sub3;PO&sub4; gestoppt. Die Platten wurden bei 450 nm mittels eines Molecular Device Amex- Mikroplattenlesegeräts unter Verwendung von 650 nm als Referenzwellenlänge gelesen.
Typ III-Polysaccharid-spezifische Antikörpertiter von Mäusen, die mit nativem Typ III-Polysaccharid oder mit Typ III-Fragmentpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugaten geimpft worden waren, werden in Tabelle II gezeigt. Tabelle II
*Mittlerer Titer von Serum, das von 10 Mäusen gesammelt wurde.
&spplus;Opsonophagocytisches Abtöten von gesammeltem Serum am Tag 52.
Typ II-Polysaccharid-spezifische Antikörpertiter von Mäusen, die mit nativem Typ II- Polysaccharid oder mit Typ II-Fragmentpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugaten geimpft worden waren, werden in Tabelle III gezeigt. Tabelle III
*Mittlerer Titer von Serum, das von 10 Mäusen gesammelt wurde.
&spplus;Opsonophagocytisches Abtöten von gesammeltem Serum am Tag 52.
Opsonisierende Aktivität von Konjugatantiseren: Die opsonisierende Fähigkeit von Mäuseantiseren gegen die GBS-Typ II- oder -Typ III-Fragmentpolysaccharid- Tetanustoxoid-Konjugate wurde in einem opsonophagocytischen in vitro-Abtötungstest unter Verwendung der menschlichen promyeloischen Leukämie HL-60-Zelllinie (ATCC Nr. CCL 240) getestet. Kurz gesagt wurden 200 KbE von GBS-Typ II-Stamm 18RS21-Zellen oder Typ III-Stamm M781-Zellen in gleichen Volumina mit Serumantikörpern gemischt und unter Schütteln 15 Minuten bei 35ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Babykaninchen- Komplement und HL-60-Zellen (5 · 10&sup5;), die 5 Tage in der Anwesenheit von 90 mM DMF kultiviert worden waren, wunden zu dem Gemisch zugegeben und unter Schütteln 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Teilvolumina wurden für die quantitative Kultur entnommen. Die Titer wurden bestimmt, indem die Antikörperverdünnung, die 50 Prozent lebenden Bakterien entsprach, extrapoliert wurde.
c. ELISA-Bindungsexperimente: Die direkte Bindung von Kaninchen-anti- GBS-Typ II- oder -Typ III-Kapselpolysaccharid-spezifischen Antikörpern (erhalten von Kaninchen, die mit ganzen GBS-Typ II- oder Typ III-Zellen hyperimmunisiert worden waren) mit den verschiedenen Tetanus-Toxoid-Konjugaten wurde wie folgt durchgeführt:
Mikrotiterplatten wurden mit 100 ul der verschiedenen Größen der GBS-Typ II- oder Typ III-Polysaccharid-Tetanustoxoid (TT)-Konjugate (1 ug/ml) in PBS, das 0,01% Thimerosal enthielt, pro Mulde sensibilisiert. Die Platten wurden bei RT eine Stunde inkubiert, wie zuvor beschrieben verarbeitet und mit 100 ul an seriellen, zweifachen Verdünnungen an Kaninchenantiserum, in PBS-T verdünnt, gefüllt. Die restlichen ELISA- Schritte sind, wie vorstehend beschrieben, außer der Zugabe des sekundären, Peroxidasemarkierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H&L) (Kirkegaard & Perry Laboratories).
Die Bindung der Kaninchen-GBS-Typ II- oder -Typ III-Polysaccharid-spezifischen Antikörper an die verschiedenen Tetanus-Toxoid-Konjugate werden in Prozent im Verhältnis zu der Bindung der nativen Typ II- oder Typ III-Polysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugate ausgedrückt, wie in den Fig. 1 beziehungsweise 2 dargestellt.

Beispiel 4

Immunisierung von weiblichen Mäusen, um bei neugeborenen Mäusen Schutz gegen Infektion mit GBS zu erzeugen

Weibliche CD-1-Mäuse (n = 3), 6-8 Wochen alt, von den Charles River Laboratories, Wilmington, MA, wurden am Tage 0 und 21 i.p. mit zwei Dosen von Konjugatimpfstoffen (die 2 ug (was 1 ug Polysaccharid/Maus entspricht) Polysaccharidfragment (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 11.()00 Dalton) in Alhydrogel 1,3% (Superfos Biosector a/s, Charge #2043), Gesamtvolumen 0,5 ml I.P.) injiziert. Kontrollmäuse (n = 3) erhielten Impfstoffe, die 2 ug natives Typ III-GBSCP enthielten. Die Mäuse bekamen am Tag 21 Junge, und die Jungen (< 36 h alt) wurden i.p. mit tödlichen Dosen von Typ III-GBS M781-Bakterien (6 · 10&sup5; CPU) einer Challenge unterworfen. Das Überleben wurde 48 h nach der bakteriellen Challenge bestimmt.
Wie in Tabelle IV gezeigt, verlieh die Impfung der weiblichen Mäuse mit GBS-Typ III-TT-Konjugat vor der Geburt 94% der nachträglich geborenen Jungen Schutz. Tabelle IV
+Statistisch signifikant (p < 0,0001) von der Kontrolle
Referenzen: Lawrence C. Madoff et al., Infection and Immunity, 60: 4989-4994 (1992);
Rodewald, A. K. et al., Journal of Infectious Disease, 166: 635-639 (1992).

Claims

1. Verfahren zur Depolymerisation von Gruppe B Streptococcus (GBS)-Typ II- und -Typ III-Polysacchariden, um Fragmente mit der folgenden 2,5-Anhydro- D-Mannose reduzierenden Endstruktur herzustellen,

wobei für den Typ II R&sub1; H ist und R&sub2; sich wiederholende Einheiten sialylierter Heptasaccharide der Formel

ist, wobei n etwa 5 bis etwa 50 ist, und worin für den Typ III R&sub1; sich wiederholende Einheiten sialylierter Pentasaccharide der Formel

ist, wobei n etwa 5 bis 50 ist, und R&sub2; ein Disaccharid αNeuAc (2-3)-β-D- Galp1- ist, das Verfahren umfassend die Schritte der Bereitstellung eines zu depolymerisierenden GBS-Typ II- oder GBS-Typ III-Polysaccharides und das Umsetzen des Polysaccharides mit einer Base in wässrigem Medium, um ein partiell De-N-acetyliertes Polysaccharidprodukt zu erzeugen, das Depolymerisieren des De-N-acetylierten Produktes mit einem Nitrosierungsmittel, um die GBS-Typ II- oder -Typ III-Fragmente zu bilden, und die Gewinnung der Fragmente.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Base aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat und Hydrazin ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nitrosierungsreagens Natriumnitrit oder salpetrige Säure ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Base Natriumhydroxid und das Nitrosierungsreagens Natriumnitrit ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polysaccharid aus GBS-Typ II-Bakterien oder aus GBS-Typ III-Bakterien erhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die resultierenden CBS-Typ II-Fragmente oder die resultierenden GBS-Typ III-Fragmente ein Molekulargewicht von etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa haben.

7. GBS-Typ II- oder -Typ III-Polysaccharidfragment, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Das GBS-Typ II- oder -Typ III-Polysaccharidfragment nach Anspruch 7, wobei die Base zur De-N-Acetylierung Natriumhydroxid und das Nitrosierungsreagens Natriumnitrit ist.

9. GBS-Typ II- oder -Typ III-Polysaccharidfragment mit der folgenden 2,5- Anhydro-D-Mannose reduzierenden Endstruktur,

ist, wobei n etwa 5 bis etwa 50 beträgt, und wobei für den Typ III R&sub1; sich wiederholende Einheiten sialylierter Pentasaccharide der Formel

ist, wobei n etwa 5 bis 50 ist und R&sub2; ein Disaccharid αNeuAc (2-3)-β-D- Galp1- ist.

10. GBS-Typ II- oder -Typ III-Polysaccharidfragment nach Anspruch 9, wobei das Molekulargewicht im Bereich von etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa ist.

11. Konjugiertes Molekül, umfassend mindestens ein Polysaccharidfragment ausgewählt aus GBS-Typ II- und -Typ III-Polysaccharidfragmenten, und wobei das Fragment kovalent an ein Protein gebunden ist, wobei das konjugierte Molekül die Struktur

hat, wobei R&sub1; und R&sub2; die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 9 haben.

12. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 11, wobei das Protein von einem Bakterium stammt.

13. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 12, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetanus-Toxoid, Diphterie-Toxoid, CRM197, rekombinantem nicht-IgA Bindungsprotein des β-C-Antigens vom Typ Ia/Ib- Gruppe B-Streptococcus und rekombinantem Klasse 3 äußerem Membranprotein von Neisseria meningitides.

14. Konjugiertes Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Polysaccharidfragment ein GBS-Typ II- oder -III-Polysaccharid ist, das Protein Tetanus-Toxoid ist und das Molekulargewicht des Polysaccharidfragmentes zwischen etwa 5 und 50 kDa ist.

15. Konjugiertes Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Molverhältnis von Polysaccharid zu Protein zwischen etwa 1 und 10 ist.

16. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 15, wobei das Molverhältnis von Polysaccharid zu Protein zwischen 3 und 10 ist.

17. Konjugiertes Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 16, umfassend GBS- Typ II- und -Typ III-Fragmente.

18. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 17, wobei das Protein ein rekombinantes nicht-IgA Bindungsprotein des β-C Antigens vom Typ Ia/Ib- Gruppe B-Streptococcus ist.

19. Impfstoff, umfassend das konjugierte Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 18.

20. Immunserum, umfassend Antikörper erzeugt in einem Säuger, der mit dem konjugierten Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 18 immunisiert wurde.

21. Immunserum nach Anspruch 20, wobei die Polysaccharide des konjugierten Moleküls Fragmente von GBS-Typ II-Polysacchariden sind.

22. Immunserum nach Anspruch 20, wobei die Polysaccharide des konjugierten Moleküls Fragmente von GBS-Typ III-Polysacchariden sind.

23. Verwendung des konjugierten Moleküls nach einem der Ansprüche 11 bis 18 für die Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung eines Säugers gegen GBS-Typ II- oder -Typ III-Infektion.

24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei der Säuger eine schwangere Frau oder ein Neugeborenes ist.

25. Verfahren zur Abtrennung von GBS-Typ II- oder -Typ III-Antikörpern aus Serum, umfassend

(a) Immobilisieren eines Polysaccharidfragmentes hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auf einem festen Träger;

(b) Zusammenbringen des festen Trägers mit gebundenem Polysaccharid mit Serum unter Bedingungen, die das Binden von GBS-Typ II- oder -Typ III-Antikörpern an das gebundene Polysaccharidfragment erlauben; und

(c) Abtrennen des restlichen Serums von dem festen Träger.

26. Immuntest-Reagens, umfassend ein GBS-Typ II- oder -III- Polysaccharidfragment, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polysaccharidfragment auf einem festen Träger immobilisiert ist.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder Immuntest-Reagens nach Anspruch 26, wobei das Polysaccharidfragment GBS-Typ II ist.

28. Verfahren nach Anspruch 25 oder Immuntest-Reagens nach Anspruch 26, wobei das Polysaccharidfragment GBS-Typ III ist.