KR19990022747A - 2, 5-안히드로-ｄ-만노오스 터미널 구조를 갖는 항원성 ｂ족 연쇄구균 타입 ⅱ 및 타입 ⅲ 다당류 및 그의 복합 백신 - Google Patents
2, 5-안히드로-ｄ-만노오스 터미널 구조를 갖는 항원성 ｂ족 연쇄구균 타입 ⅱ 및 타입 ⅲ 다당류 및 그의 복합 백신 Download PDFInfo
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Abstract
B족 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 연쇄구균을 해중합하는 과정이 설명되며, 단백질에 결합하기에 적절한 환원단을 갖는 다당류 단편의 결과를 수반한다. 복합분자들, 백신 및 사람을 포함한 포유류를 면역화하기 위한 그들의 사용법이 또한 기술된다.
Description
GBS 박테리아는 유아의 균혈증이나 뇌막염 및 성인에게 전염을 일으키는 것으로 알려진 병인성 병원체이다. 베이커(Baker), 내과학의 진보(Advance in internal Medicine), 25: 475-500에서, B족 연쇄구균 전염 . 따라서, GBS 감염의 진단을 위한 신속하고 명료한 평가 및 특별히 유아 및 감염되기 쉬운 개인들에게서 GBS에 대한 보호를 마련하는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
GBS 박테리아로부터의 캡슐형 다당류는 GBS 독성 및 보호적 면역성의 발달에 중요한 것으로 알려지고 있다. 카스퍼(Kasper) 등의 미국 특허 제 5,302,386호 참조. 게다가, 인지된 GBS 타입(Ⅰ-Ⅳ)의 캡슐형 다당류(CP)는 화학적으로 관련되어지나 항원적으로 갈락토오스, 글루코스, N-아세틸 글루코사민 및 N-아세틸-노이라민(시알)산으로 구성된 반복구조를 갖는 것으로 구분된다.
유아 및 어린이들은 다당류 항원에 대한 약한 면역응답을 갖는다. 이러한 응답은 ,T 세포 독립성(T cell independent)으로 특징되며 그러므로 기억, 아이소타입 스위칭(isotype switching)또는 친화력 성숙같은 차후의 감염에 대항하는 장기간의 면역적인 보호를 부여하기 위해 필요한 중요한 속성들과는 관련되지 않는다.
유아 및 어린이들에 있어서의 다당류에 대한 효율적인 면역반응의 결핍을 극복하기 위해, 당업계는 복합분자(conjugate molecule)를 형성하기 위해 다당류 박테리아성 항원들을 캐리어 단백질에 공유적으로 결합시키므로써 T 세포 독립적인 응답을 T 세포 의존적인 응답으로 전환하는 수단을 개발해오고 있다. 여기서 참고로 병합된 제닝스(Jennings) 등의 미국 특허 제 4,356,170호를 참조.
캡슐형 다당류를 단백질에 결합하기 위한 다양한 과정들이 당업계에서 기술되어져 왔다. 미생물학 및 면역학에의 기여, 10권, 복합 백신, J.M. 크루즈 및 R.E. 루이스, Jr., 1989가 여기서 참고로 병합된다. 한가지 방법에서, 공유결합을 형성하기 위해 단백질과 반응할 수 있는 환원단 그룹(reducing end groups)을 생성하기 위해 다당류가 약산 가수분해된다. 앤더슨(Anderson), P.A., Infect. Immun, 39 : 233-238(1983). 그러나, 단백질에 결합하는데 참여하는 말단의 당(sugar)그룹은 헤미아세탈과 알데히드 사이에서 평형상태로 존재하고 그러므로 저효율로 단백질에 결합한다. 말단의 환원당의 저반응성을 극복하기 위하여, 단백질에 결합하도록 사용되는 다당류의 말단 위치에서 안정한 알데히드 그룹을 도입하기 위하여 약한 산화를 사용하게 되었다. 제닝스 등의 미국 특허 제 4,356,170호 참조.
카스퍼 등의 미국특허 제 5,302,386호 및 국제출원 WO 94/06467호 각각은 GBS 타입 Ⅱ 및 타입 Ⅲ와 관련되며, 양자는 여기서 참고로 병합되었다. 제 5,302,386호 특허에 따르면, 엔도-β-갈락토시다아제가 단백질에 결합할 적절한 산물을 만들기 위해 다당류 백본(backbone)을 분할하는 데 사용된다. 교차 링크된 결합을 만들기 위한 적어도 두 개의 말단 시알산(sialic acid)의 산화가 WO 94/06467호에서 기술된다.
타입 Ⅲ GBS 캡슐형 다당류들은 분지된 5당류 단위들의 반복에 의한 백본으로 구성된다. 제닝스 등, Canadian J. Biochem., 58 : 112-120 (1980) 참조. 타입 Ⅲ GBS 다당류에 대한 한 연구는 천연의 면역결정자 위치가 측면 체인-백본 결합에 위치한다고 보고한다. 제닝스 등, Biochmistry 20 : 4511-4518 (1980). 보고에 의하면 측면 말단의 N-아세틸-노이라민산 레지듀(residues)는 면역결정자 표현에 중요했다고 한다.
GBS Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류의 해중합(depolymerizing)을 위한 이전의 방법들은 불안정한 말단의 시알산 그룹의 제거로 인한 CP의 항원성을 변경할 수 있는 산 가수분해 또는 값비싼 효소방법에 의존한다. 따라서, CP-단백질 복합 백신의 생산에 유용한 단편을 만들어내는 방법으로 GBS Ⅱ 또는 Ⅲ를 해중합하는 데 효과적인 상대적으로 값싸고 유연한 화학반응 과정이 요구된다.
본 발명은 보호 항체를 추출하는 면역원을 생성하기 위해 단백질에 결합시키기에 유용한 항원성 캡슐형 다당류 단편(fragments)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 분석가능한 환원단 그룹(reducing-end groups)을 갖는 B족 연쇄구균 캡슐형 다당류(GBS CP), 그들의 제조 및 복합백신을 만들기 위한 그들의 이용에 관한 것이다.
도 1은 100% 결합기준으로 설정된 타입 Ⅱ 천연 다당류(200 kilodaltons)-텐타누스 톡소이드 결합물에의 결합에 비교되는 토끼의 앤티-타입 Ⅱ 특성의 다당류 항체의 타입 Ⅱ-단편 다당류-텐타누스 톡소이드 결합물(평균 분자량 15, 33 및 51 kilodalton의 단편들로)에의 직접적인 결합을 도시한 도면,
도 2는 100% 결합기준으로 설정된 타입 Ⅲ 천연 다당류(90 kilodaltons)-텐타누스 톡소이드 결합물에의 결합에 비교되는 토끼의 앤티-타입 Ⅲ 특성의 다당류 항체의 타입 Ⅲ-단편 다당류-텐타누스 톡소이드 결합물에의 직접적인 결합(평균 분자량 13, 18, 26, 34 및 48 kilodalton의 단편들로)을 도시한 도면,
도 3은 약 200 kDa의 분자량을 갖는 천연 GBS 타입 Ⅱ 다당류의 H-NMR 스펙트럼,
도 4는 약 12 kDa의 분자량을 갖는 GBS 타입 Ⅱ 다당류단편의 H-NMR 스펙트럼과 본 발명에 따라 준비되는 2,5-안히드로-D-만노오스와 관련한 프로톤 피크치를 도시한 도면,
도 5는 약 100 kDa의 분자량을 갖는 천연 GBS 타입 Ⅲ 다당류의 H-NMR 스펙트럼,
도 6은 약 9 kDa의 분자량을 갖는 GBS 타입 Ⅲ 다당류 단편의 H-NMR 스펙트럼과 본 발명에 따라 준비되는 2,5-안히드로-D-만노오스와 관련한 수소 피크치를 도시한 도면이다.
본 발명은 2, 5-안히드로-D-만노오스 구조로 말단을 갖는 생산물을 만들어내기 위하여 탈아미노화 절단에 의해 B족 연쇄구균 타입 Ⅱ(GBS-Ⅱ) 및 타입 Ⅲ(GBS-Ⅲ) 캡슐형 다당류를 해중합하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, GBS-Ⅱ CP 및 GBS- Ⅲ CP는 다당류 백본의 끝에서 위치하는 말단 알데히드 그룹을 갖는 단편을 생산하기 위하여 GBS 다당류를 해중합하는 질산나트륨같은 니트로소화 시약과 수산화나트륨에 의해 처리된다. 결과되는 CP 단편은 항원성이고 신생아를 포함하는 포유류에서 보호성 면역응답을 이끌어내는 데 효과적인 면역원을 생성하는 단백질에 결합하는 데 또한 유용하다.
그러므로, 본 발명에 따른 또하나의 실시예는 백신으로서 사용을 위한 복합 분자를 반드는 방법이다. 상기 방법은 2, 5-안히드로-D-만노오스 레지듀(residue)의 말단을 갖는 단편을 형성하기 위한 시약을 형성하는 디아조늄염 및 염기(base)에 의해 처리된다. 그리고, 2, 5-안히드로-D-만노오스 말단 단편은 단백질과 결합되고 본 발명의 복합 분자를 형성하기 위해 환원성 아미노화가 이루어진다. 따라서, 본 발명의 다른측면은 말단의 2, 5-안히드로-D-만노오스를 통해 단백질에 링크되는 GBS-Ⅱ CP 및 GBS- Ⅲ CP 단편으로 구성되는 GBS-Ⅱ CP 및 GBS- Ⅲ CP 복합분자이다. GBS 타입 Ⅱ 및 타입 Ⅲ 다당류를 해중합하는 과정이 백본 말단에서 단일 반응위치를 갖는 단편을 생성하기 때문에, 본 발명은 각각의 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 다당류 체인이 단일 단백질에 결합되고, 말단 환원당을 통해 2차 아민에 의해 결합되는 복합 분자를 생성하는 수단을 제공한다.
본 발명의 결합물은 GBS-Ⅱ 및 GBS-Ⅲ 박테리아 감염에 대해 개인들을 면역화하는 백신으로서 유용하다. 본 발명에 의해 상이한 항원형(serotypes) 또는 박테리아종으로부터 도출되는 다당류로 구성되는 다원자가의(multivalent) 백신이 제공된다.
추가로, 본 발명은 복합 분자에 의해 면역화 응답에서 얻어지는 면역혈청 또는 항체를 포함하고 그것은 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 박테리아의 출현을 탐지하는 시약으로서 또는 면역을 부여하는 백신으로서 유용하다.
본 발명의 또다른 실시예는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 항체를 분리 또는 탐지하기 위해 유용한 방법 및 조성물이다. 본 실시예구현의 한 형태에 따르면, 본 발명에 의해 준비된 다당류 단편이 고체 지지체(solid support)상에서 고정된다. 혈청같은 항체 소스를 고체 지지체에 결합된 다당류 단편과 결합하므로써, 다당류 단편에 결합된 항체는 표준 면역측정 기술에 의해 탐지되거나 또는 시작물질이나 혈청으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 목적은 복합 분자들을 생성하기에 유용한 단편들을 생성하기 위해 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류를 단편화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은 감염에 대해 보호작용을 하는 백신 및 면역시약으로서 유용한 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 분자를 만드는 것이다.
본 발명은 다음의 2, 5-안히드로-D-만노오스 환원당 구조를 갖는 B족 연쇄구균 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 항원성 다당류-단편에 관한 것이며,
GBS 타입 Ⅱ에서 상기 R1은 H이고 R2은 다음 식의 시알리레이티드(sialylated) 7당류 반복단위이고,
상기 n은 약 5내지 약 50이며;
GBS 타입 Ⅲ에서 상기 R1은 다음식의 시알리레이티드(sialylated) 5당류 반복단위이고,
상기에서 n은 약 5 내지 50 이며 R2은 이당류 αNeuAc(2-3)β-D-Galp1-이다.
본 발명에 의해 이들 단편들은 아래에 나타낸 다음의 구조,
타입 Ⅱ
(상기 n은 천연 다당류에 대해 약 200)
또는 다음의 GBS 타입 Ⅲ의 반복 단위
타입 Ⅲ
(상기 n은 천연 다당류에 대해 약 100)
를 갖는 큰 분자량의 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 다당류를 해중합하므로써 생산된다.
여기서 사용된 것처럼, 용어 B족 연쇄구균 또는 (GBS) 박테리아는, 특히 란세필드(Lancefield), J. Exp. Med., 108 : 329-341(1938) 및 B 족 혈청을 추가로 특징짓는 계속된 연구, 예를들어, 러셀-존스(Russell-Jones), J. Exper. Med., 160 : 1476(1984)를 참조하면 당업자에게 자명하듯이 같은 의미를 가진다.
본 발명의 신규한 단편들을 생성하기 위해 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 캡슐형 다당류를 단편하는 본 발명의 과정은 화학적 해중합으로부터 결과되는 GBS 타입 Ⅱ 및 GBS 타입 Ⅲ 다당류 단편을 얻기 위해 약한(mild) 비변질화 조건을 사용한다. 이들 단편들은 백신의 대량생산을 위해 이 공정을 경제적으로 만드는 고수율로 얻어질 수 있다.
GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ CP는 다음과 같은 본 발명의 방법에 의해 해중합된다. 타입 Ⅱ 및 Ⅲ GBS CP(구조식 Ⅰ)에서 백본 2-데옥시-2N-아세타미도(acetamido)-β-D 글루코피라노실 (glucopyranosyl) 레지듀가 수용액에서 약염기에 의해 부분적으로 de-N-아세틸레이티드된다. 본 발명의 과정에서의 사용에 적절한 염기의 실시예는 알칼리 금속 수산화물 용액, 예를들면, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 또는 수산화 암모늄, 히드라진(hydrazine), 탄산나트륨 및 중탄산나트륨같은 다른 염기들을 포함하며 이에 한정이 되는 것은 아니다. 염기처리에 이어서, 결과되어지는 글루코사민 레지듀(구조식 Ⅱ)는 예를들어, 불안정한 N-니트로소(nitroso) 유도체(구조식 Ⅲ)를 형성하기 위해 아질산 나트륨 또는 아질산같은 적절한 시약을 사용하여 니트로소화할 수 있다. 탄소(2)에서의 환(ring) 산소에 의한 구핵(nucleophilic) 공격에 기인한 재배열은 환축약(ring contraction) 및 인접한 글리코사이딕(glycosidic) 연결의 깨짐으로 귀결된다(구조식 Ⅳ). 이러한 반응은 헤파린 및 다양한 글리코사미노글리칸의 구조를 연구하는데 사용되어 오고 있다. 바넷트(Barnett)의 미국특허 제 4,438,261호가 여기서 참고로 병합된다.
다당류 단편의 환원단에서 형성되는 결과적인 2,5-안히드로-D-만노오스(구조식 Ⅳ) 레지듀에서 알데히드족은 추가적인 화학적인 조작없이(예를들어 스페이서 암(spacer arm)의 사용) 환원성 아미노화를 통한 아마노족 함유 중합체, 바람직하기로는 단백질에 링크하기 위하여 직접 사용되어질 수 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명에 따른 GBS 다당류의 해중합을 실행하기 위해서 적절한 크기의 용기의 수용액에서 반응이 실행된다. 반응을 시작하기 위해서, 수용액에서 적절한 양의 다당류가 부분적으로 백본 글루코피라노실 레지듀를 de-N-아세틸레이트하기 위해 염기에 의해 처리된다. 간략히, 본 반응은 승온, 예를들어, 약 50℃에서 110℃사이에서 약 pH 13-14에서 염기 수용매질에서 실행될 수 있다. 염기의 양은 경험적으로 최적화된다. 바람직하기로는 염기대 N-아세틸족의 비율은 약 10-50 meq. 이다. 더욱 바람직하기로는 상기 비율은 약 20-25 meq이다. 상기 비율 및 반응정도는 염기농도, 반응온도 또는 반응시간을 조절하는 것에 의해 최적화될 수 있다. de-N-아세틸레이션의 정도는 'H-NMR에 의해 모니터될 수 있다.
약 5-60 kDa 사이의 단편들을 성취하기 위해서는 de-N-아세틸레이션의 정도는 유용한 사이트(site)의 총수의 약 2 내지 20 % 사이이어야 한다. 디아세틸레이션 반응을 멈추기 위해서는, 반응은 냉각(즉, 얼음에서 냉각)되어야 하거나 약 pH 4로 산성화되어야 한다. 산성화는 남아있는 시알산족의 가수분해를 피하기 위해 신중하게 행해져야 한다.
그리고, 알데히드를 형성하기 위한 니트로소화 반응이 아질산나트륨이나 묽은 아질산같은 적절한 시약을 de-N-아세틸레이티드된 다당류에 첨가하므로써 달성된다. 바람직하게, 아질산나트륨같은 니트로소화 시약은 de-N-아세틸레이티드족의 몰에 비해 그램분자 초과량만큼 더해진다. 다당류의 니트로소화 시약과의 반응은 낮은 온도, 예를들어, 약 4℃로 약 2시간이나 또는 완전할 때까지 저으면서 수행된다. 반응의 정도는 알데히드족의 발생을 분석하는 것에 의해 모니터될 수 있다. 반응과정동안에, 알데히드족의 농도는 안정상태에 다를때까지 증가해야 한다. 반응의 종료는 반응의 희석화 및 NaOH같은 희석된 염기에 의해 pH를 약 7까지 상승시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 과도한 시약의 제거는 표준 과정을 사용한 다이알리시스(dialysis)에 의해 달성될 수 있다.
반응의 완료후에, 백본의 끝에서 말단의 알데히드족을 갖는 다당류 단편들은 표준 크로마토그래피 과정을 사용하여 크기가 재어지고 수집될 수 있다.
단백질에 결합하기 위해 바람직한 크기는 GBS 타입 Ⅱ 다당류의 경우에는 5 내지 50 kDa 사이 그리고 GBS 타입 Ⅲ 다당류는 5 내지 50 kDa이다. 더욱 바람직한 크기는 GBS 타입 Ⅱ 다당류의 경우에는 5 내지 20 kDa 사이 그리고 GBS 타입 Ⅲ 다당류는 10 내지 50 kDa이다. 크기가 조정된 단편들은 이미 설명한 표준 아미노화 반응을 사용한 결합반응을 위해 사용되거나( 예로서, 미국특허 4,356,170호 및 국제출원 WO 94/06467호를 참조) 나중의 사용을 위해 저장될 수 있다.
GBS 타입 Ⅱ에 적용되는 탈아미노화 절단은 본발명에 의해 다음과 같이 달성될 수 있다.
환원성 아미노화에 의해 캐리어 단백질에 직접 결합될 수 있는 항원성 타입 Ⅲ 단편들을 생성하는 탈아미노화 절단에 의해 타입 Ⅲ 다당류를 해중합하는 과정은 아래에서 설명된다.
본 발명의 복합 단백질의 단백질 성분은 생리학적으로 내성(tolerated) 단백질 또는 T 셀 의존적인 반응을 일으키기에 충분한 길이의 폴리펩티드이다.
그러한 단백질들의 예들은 파상균 톡신 또는 톡소이드, CRM197같은 교차 반응물질, B족 연쇄구균 타입 Ia/Ib의 β-C 항원의 재조합 논(non) IgA 결합 단백질 및 나이세리아 메닝기티데스(Neisseria Meningitides)로부터의 재조합 클래스 3 외부 세포막 단백질(OMP)를 포함하고 박테리아 단백질, 또는 폴리펩티드를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
복합단백질에서 단백질에 대한 다당류의 몰비는 바람직하기로는 1몰의 단백질당 약 1몰 내지 약 10몰의 다당류 사이이다. 더욱 바람직하기로는 상기 비율은 1몰의 단백질당 3 내지 10몰의 다당류 단편들 사이이다.
단백질/다당류의 비율의 변화는 결합반응에서 시작성분의 비율을 조절하므로써 달성될 수 있다.
단백질에 결합된 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류로 구성된 복합 단백질을 제공하는 것외에도, 본 발명은 상이한 타입의 다당류가 단일 단백질에 결합되는 다원자가의 결합 및 그들의 백신을 또한 도출한다. 예를 들어, 다른 박테리아로부터 도출되는 다당류들, 예로서, 헤모필루스(Haemophilus) 인플루엔자 타입 b, 또는 수막염구균(meningococcus) 타입 A, B, 또는 C 같은 것뿐만 아니라 GBS 타입Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, 또는 Ⅴ의 다당류들도 다양한 조합에 의해 단백질에 결합될 수 있다. 바람직한 조합은 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ의 다당류이다.
본 발명에 따른 복합 분자들은 전형적으로 다당류의 단편의 백본의 말단에서 단일의 결합 사이트를 통해 적어도 하나의 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 단편이 결합되는 단백질로 구성된다. 그러므로, 본 발명은 다당류 성분의 한 끝단을 제외하고, 단백질에 의해 가려지지 않는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 북합 분자들을 생산하는 능력을 제공한다. 분지들(branches)의 말단의 시알산을 통하여 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ를 단백질에 결합하는 것은 복수의 사이트들에서 단백질로의 다당류의 교차링크 및 접착으로 결과되어질 수 있다. 예를 들어, 단일의 반응성 2, 5-안히드로-D-만노오스 말단을 생성하는 것에 본 발명에 의해 합성되는 결합은 복수의 사이트에서 활성화된 다당류와 추가적으로 반응할 수 있다.
본 발명에 따른 백신을 준비하는 과정은 포유류, 특히 가임 연령의 여성, 신생아, 면역이 약한 성인들 및 GBS 감염의 위험에 있는 아이들에 있어서 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 대한 보호를 제공하는 데 중요하고 유용한 백신을 제공한다. 이들 백신은 출생전의 태아에게서 면역응답을 도출케하는 수단으로서 임산부의 관리에 특히 중요할 것으로 기대된다.
백신은 면역응답을 발현하기에 충분한 양으로 제공된다. 전형적으로 그러한 응답을 발현하기에 적절한 복용량은 1 내지 50μg의 다당류이다. 투약은 백신을 투여받는 개인의 체형, 체중 또는 연령에 기초하여 조절될 수 있다. 개인에서 항체반응은 항제의 적정량 또는 살균성의 평가에 의해 모니터될 수 있으며 필요한 경우 반응을 중가시키도록 증대될 수 있다.
백신은 백신에 적합한 캐리어, 완충액 또는 당업자에게 알려진보존료(preservatives)를 포함할 수 있다. 추가로, 면역반응을 증가시키기 위한 처방에서 명반(alum), 스테아릴 티로신(stearyl tyrosine) 같은 어드저번트(adjuvants)들이 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 마련되는 다당류 단편들은 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 항체의 면역평가 및 분리에서의 사용을 위한 다양한 면역시약들을 만드는 데 유용하다. 예를 들어, 면역평가를 위해 다당류 단편들이 직접 또는 단백질 링커를 통해 본 발명의 결합에서 고체 지지체에 고정될 수 있다. 그리고 상기 고체 지지체는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 에 대한 항체의 출현을 검출하기 위한 방사성면역 및 ELISA 평가를 포함한 당업자에게 알려진 다양한 면역평가 시스템에 사용될 수 있다. 그러한 평가들은 혈청에서 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 항체의 발현을 평가하므로써 개인의 감염 여부를 진단하는 데 사용될 수 있다. 분리 화학의 용도를 위해,다당류 단편들은 친화력 칼럼(column)을 만들기 위해 고체 지지체에 고정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 다당류 단편은 먼저 단백질에 결합되고 그리고 결과적인 결합물은 지지 매트릭스에 결합된다. 단백질을 친화력 칼럼에 결합하는 방법은 당업자에게 자명하다. 친화력 칼럼을 위한 일반적인 지지체들은 아가로스(agarose)로부터 만들어질 수 있고 상업적으로 이용가능한 예를들면, 활성화된 세파로스(Sepharose)이다. 그리고, 그러한 친화력 칼럼들은 혈청같은 소스로부터 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 항체를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 항체의 고정된 단편들과 결합을 허용하는 조건하에서 고정된 다당류 단편들을 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ를 함유하고 있는 혈청과 결합하므로써 혈청으로부터 분리될 수 있다. 그리고 결합된 항체는 종래의 평가기법에 의해 탐지되거나 고정된 지지체로부터 잔류 혈청 성분의 분리가 이어지는 다당류 단편으로부터 분리 또는 복구될 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예들을 참고로 설명될 것이며, 이에 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1
GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 2, 5-안히드로-D-만노오스 말단 단편들을 제조하기 위한 염기 해중합 및 환축약 조정된 아질산나트륨
GBS 타입 Ⅱ
약 200,000의 평균 분자량의 천연 타입 Ⅱ GBS CP가 0.5N NaOH 3ml에 용해되고 3부분(각각 1ml)으로 분리되었다. 표본들(S1-S3)은 70℃에서 각각 60, 90, 180분간 가열되고 냉수수조에서 냉각되었다. 그들의 pH를 4로 하기 위해 각 표본에 125mcL의 빙초산을 첨가하였다. 5% (w/v) NaNO2의 200 mcL 첨가에 이어 표본들은 4℃에서 2시간동안 저어진다. 그리고 S1-S3표본들은 DI수에 의해 5ml로 희석되고 그들의 pH가 O.5N NaOH에 의해 7로 조정된다. 과도한 시약은 디아플로(Diaflo) 한외여과 막(Amicon YM 80)을 통해 DI수로 투석되고 용액은 동결건조된다. 세가지 타입의 다당류 단편( Ⅱ-1-Ⅱ-3)이 얻어졌다.
GBS 타입 Ⅲ
약 100,000의 평균 분자량의 천연 타입 Ⅲ GBS PCP가 0.5N NaOH 5ml에 용해되고 용액은 5부분(각각 1ml)으로 분리되었다. 표본들(S1-S5)은 70℃에서 각각 60, 90, 120, 180 및 240분간 가열되고 냉수수조에서 냉각되었다. 각 표본들의 pH를 4로 하기 위해 각 표본에 125mcL의 빙초산을 첨가하였다. 5% (w/v) NaNO2의 200 mcL 첨가에 이어 표본들은 4℃에서 3시간동안 저어진다. 그리고 S1-S5표본들은 DI수에 의해 5ml로 희석되고 그들의 pH가 O.5N NaOH에 의해 7로 조정된다. 과도한 시약은 디아플로(Diaflo) 한외여과 막(Amicon YM 80)을 통해 DI수로 투석되고 용액은 동결건조된다. 다섯가지 타입의 다당류 단편(Ⅲ -1-Ⅲ-5)들이 얻어졌다.
CP 단편의 크기
각 단편의 평균 분자량(avMw)는 2,000 내지 10,000 달톤 범위의 평균 분자량의 덱스트린 시리즈(Pharmacia)와 수퍼로제(Superose)-12 사이즈 배제 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 HPLC에 의해 측정되었다. 공공 체적(Void volume)(Vo) 및 총체적(Vt)는 각각 덱스트란 2,000 및 아지드화 나트륨에 의해 판별되었다. 본 방법에 의해 판별된 각 단편의 평균 몰중량(avMw)은 다음과 같다.
단편 Kav(범위) AvMw (범위)
kilodalton
Ⅱ-1 0.23(0.13-0.34) 51 (99-26)
Ⅱ-2 0.30(0.19-0.40) 33 (68-17)
Ⅱ-3 0.43(0.30-0.50) 15 (33-9)
Ⅲ-1 0.21(0.11-0.27) 41 (81-28)
Ⅲ-2 0.26(0.17-0.38) 30 (53-13)
Ⅲ-3 0.29(0.18-0.40) 24 (50-12)
Ⅲ-4 0.37(0.23-0.44) 14 (36-9)
Ⅲ-5 0.41(0.31-0.47) 11 (21-8)
다당류 단편들의 물리화학적 분석
각 단편의 천연의 다당류에 대한 각 단편의 구조적 인테그리티(integrity)가 브루커 AM500 분광계상에서 500MHZ로 고해상도의 1차원 H-NMR 분광기 사용술에 의해 마련되었다. 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 단편들의 H-NMR 스펙트럼의 그들 각각의 천연 다당류와의 비교는 화학처리 과정동안 아무런 구조적 변화도 일어나지 않았음을 나타내고, 가장 중요하게는 말단의 시알산 레지듀가 니트로소화 처리동안 보존되었다는 것이다.
실시예 2
타입 Ⅱ 및 타입 Ⅲ 다당류 합텐의 텐타누스 톡소이드(tentanus toxoid)에의 결합
텐타누스 톡소이드(SSI, 덴마크)가 바이오겔 -A 칼럼(비오라드 레버러터리(Biorad Laboratories)) 칼럼을 통한 겔 여과에 의해 단량체 형태로 정제된다. 그렇게 얻어진 텐타누스 톡소이드 단량체(TTm)(150,000 달톤)가 25 mg/ml의 농도에서, pH 7.5 0.2M 인산염 버퍼에서 용해되었고 건조된 GBS 타입 Ⅱ(Ⅱ-1 내지 Ⅱ-3) 또는 타입 Ⅲ(Ⅲ-1 내지 Ⅲ-5) 다당류에 첨가되고 아래에 나타낸 양으로 NaCNBH3를 재결정화한다.
PS(mg) TTm(mg) NaCNBH3(mg) 최종 체적(ul)
Ⅱ-1 10 4 8 200
Ⅱ-2 10 4 8 200
Ⅱ-3 11 4.5 9 220
Ⅲ-1 18 7.2 14 360
Ⅲ-2 10 4 8 200
Ⅲ-3 7.2 3 6 150
Ⅲ-4 6.4 2.5 5 130
Ⅲ-5 8 4 8 130
그리고 반응혼합물은 37℃에서 4일간 배양되었다. 결합반응의 진행은 수퍼로제-12 상에서 분석된 반응혼합물의 작은 앨리콧(aliquots)의 HPLC에 의해 모니터된다. 상기 결합은 용이제(eluent)로서 0.01% 티머로졸(thimerosol)을 함유하는 PBS를 사용하여 수퍼덱스 G-200(Pharmacia)의 칼럼상에서 분자 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
칼럼으로부터 용이되는 단편들은 워터스(Waters) R403 원소 굴절계 및 UV 분광기 사용술에 의해 모니터되었다.
상기 결합을 포함하는 단편들은 단백질 및 시알산 내용물을 위해 브래드포드법(Bradford, M.M., 1976. Anal. Biochem., 72:248-254) 및 레소시놀(resorcinol) 평가법에 의해 0.22μm 밀리포어막(Millipore membrane)을 통해 무균-여과되고 분석된다
각각의 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 개개의 결합에서 탄수화물 총량의 평균은 시알산 내용물을 취하고 그들 반복단위에 기초하여 각각 4 및 3.3의 교정인자로 곱하므로써 계산되어졌다. 각 개개의 결합에 대한 분석은 아래의 테이블 1과 같다.
테이블 1
결합 AvMw PS체인 단백질 CHO 결합에서%CHO #PS 체인
(mcg/ml) (mcg/ml)
Ⅱ-1-TT 51,000 120 15 11 0.4
Ⅱ-2-TT 33,000 140 42 23 1.4
Ⅱ-3-TT 15,000 110 26 19 2.4
Ⅲ-1-TT 41,000 190 70 27 1.2
Ⅲ-2-TT 30,000 140 61 29 1.8
Ⅲ-3-TT 24,000 100 39 28 2.0
Ⅲ-4-TT 14,000 70 17 20 2.0
Ⅲ-5-TT 11,000 80 21 21 3.0
천연의 캡슐형 다당류 항원결정기(epitopes)에 관해 관찰된 면역화확적 특이성과 비교되는 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 다당류 결합에 대한 토끼의 다클론성 항체의 특이성이 ELISA에 의해 측정되고 도 1(GBS 타입 Ⅱ) 및 도 2(GBS 타입 Ⅲ)에 의해 도시된다.
실시예 3
암쥐의 GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ -텐타누스 톡소이드 결합의 면역화에 대한 면역원 반응.
a. 면역화 천연의 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 또는 그들의 대응하는 텐타누스-톡소이드 결합물중 어느하나의 2μg으로 스위스 웹스터 암쥐(4-6주된 것)를 면역되게 하였다. 상기 백신은 티머로젤을 함유한 10mM PBS의 알루미늄의/ml의 1mg 농도에서 수산화알루미늄(알히드로겔(Alhydrogel ; 수퍼포스(Superfos), 덴마크)상에서 흡수된다. 쥐들은 0, 21 및 42일에 백신을 맞고 마침내 52일째 방혈하였다. 혈청들은 70℃에서 수집 및 저장되었다.
b. ELISAs 및 결합 항혈청의 옵소닌 활동
ELISAs : 미량역가(Microtiter) 플레이트(넝크 폴리소브(Nunc Polysorb) ELISA 플레이트)는 PBS에서 웰당 0.02%의 아지드화물과 함께 100μL의 천연 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류-HSA 결합(1μg/ml)을 첨가하므로써 항원에 민감해진다. 플레이트는 37℃에서 한시간동안 배양되었다. 플레이트는 0.05% 내지 20% PBS(PBS-T)에 의해 세척되고 상온으로 PBS에서 0.5% BSA에 의해 차단되었다. 그리고 상기 웰은 쥐들의 항혈청의 PBS-T에서 100μL의 일련의 두층의 희석액으로 채워졌고 플레이트는 상온에서 한시간동안 배양되었다. PBS-T로 세척된 후에 플레이트는 100μL의 고우트 앤티-마우스 IgG(H+L)로 명명된 페록시다아제(키르케가아드 페리 레버러터리)로 채워지고 PBS-T로 5회 세척된다. 마지막으로, 50μL의 TMB 페록시다아제 기질(키르케가아드 페리 레버러터리)가 각 웰에 첨가되고 상온에서 10분동안 플레이트의 배양에 이어 반응이 50μL의 1M H3PO4의 첨가에 의해 중단되었다. 플레이트는 몰레큘러 디바이스 아멕스(Molecular Device Amex) 마이크로 플레이트 리더에 의해 기준파장으로 650nm를 사용하여 450nm로 읽어졌다.
천연의 타입 Ⅲ 다당류 또는 타입 Ⅲ 단편 다당류-텐타누스 톡소이드 결합에 백신접종이 된 쥐의 타입 Ⅲ 다당류-특성 항체 역가(titers)는 테이블 Ⅱ에 보인바와 같다.
테이블 Ⅱ
단편의 평균 MW 52일에서 ELISA 역가*OP 역가+
13,000 2,500 405
18,000 2,500 610
26,000 3,000 1,050
34,000 3,000 520
48,000 12,000 2,600
천연 PS 100 100
* 10마리 쥐로부터 울혈된 혈청의 평균역가
+52일에서 울혈된 혈청의 옵소노파고시틱 (Opsonophagocytic) 죽임
천연의 타입 Ⅱ 다당류 또는 타입 Ⅱ 단편 다당류-텐타누스 톡소이드 결합에 백신접종이 된 쥐의 타입 Ⅱ 다당류-특성 항체 역가(titers)는 테이블 Ⅲ에 보인바와 같다.
테이블 Ⅲ
단편의 평균 MW 52일에서 ELISA 역가*OP 역가+
15,000 123,000 9,300
33,000 15,000 1,400
51,000 2,600 500
천연 PS 500 100
* 10마리 쥐로부터 울혈된 혈청의 평균역가
+52일에서 울혈된 혈청의 옵소노파고시틱 (Opsonophagocytic) 죽임
결합 항혈청의 옵소닌 활동 : GBS 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ 다당류-단편-텐타누스 톡소이드 결합에 대한 쥐의 항혈청의 옵소닌 능력은 사람의 전골수구(promyelocytic) 백혈병 HL-60 세포 라인(ATTC No. CCL 240)을 사용하여 인비트로 옵소노파고시틱 죽음 평가에서 시험되었다. 간략하게, 200 cfu의 GBS 타입 Ⅱ계 18RS21 세포 또는 타입 Ⅲ계 M781 세포들이 동일 체적으로 혈청 항체와 혼합되었고 35℃의 5% CO2인큐베이터내에서 15분간 흔들어진다. 새끼 토끼 보체(complement) 및 90mM의DMF의 존재하에 5일간 배양된 HL-60(5×105) 세포들이 상기 혼합물에 첨가되었고 1시간동안 흔들림하에서 37℃로 배양되었다. 정량적 배지를 위해 부분표본(Aliquots)이 제거되었다. 역가들은 50% 생존 박테리아에 해당하는 항체 희석액을 외삽하므로써 판별되었다.
c. ELISA 결합 실험 : 토끼의 앤티-GBS 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ 캡슐형 다당류 특성의 항체들을 다양한 텐타누스-톡소이드 결합물에 직접 결합하는 것은 다음과 같이 수행된다.
미량역가 플레이트는 웰당 0.01%의 티머로잘을 함유하는PBS에서 100μl의 다양한 크기의 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류-텐타누스-톡소이드(TT) 결합에 의해 항원에 민감해진다. 플레이트는 상온에서 한시간동안 배양되었고 PBS-T에서 희석된 토끼의 항혈청의 일련의 두층 희석액으로 채워졌다. 나머지 ELISA 단계들은 고우트 앤티-래빗 IgG(HL)로 명명된 2차의 페록시아아제(키르케가아드 페리 레버러터리)를 첨가하는 것을 제외하고는 상기에서 설명한것과 동일하다.
토끼의 앤티-GBS 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ 캡슐형 다당류 특성의 항체들을 다양한 텐타누스-톡소이드 결합물에 직접 결합하는 것은 도 1 및 도 2에서 각각 기술된 천연 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ 다당류-텐타누스-톡소이드 결합물의 결합에 상대적인 백분율로 표현된다.
실시예 4
신생한 쥐에서 GBS 감염에 대항하는 보호를 부여하기 위한 암쥐의 면역화
매서츄세츠, 윌밍톤, 찰스 리버 레버러터리로부터의 6-8주된 암컷 CD-1 쥐(n=3)에게 0 및 21일에 알히드로겔 1.3%(수퍼포스 바이오섹터(Superfos Biosector) a/s, 배치 #2043)에서 다당류-단편(평균 MW 약11,000 달톤)의 결합 백신(2μg을 포함하고, 동등하게 다당류 1μg/쥐)의 2회 복용분이 주사되었다. 대조군 쥐는 2μg의 천연 타입 Ⅲ GBSCP를 함유한 백신이 주사되었다. 21일째 태어난 쥐 그리고 새끼쥐(36시간)들이 치명적인 복용량의 타입 Ⅲ GBS M781 박테리아(6×105CFU)로 시험된다. 생존여부는 박테리아 시험 48시간후에 평가되었다.
테이블 Ⅳ에 보인 바와 같이 출산전에 GBS 타입 Ⅲ-TT로 백신접종된 암쥐는 이어 태어나는 새끼쥐에게 94%의 보호력을 부여한다.
테이블 Ⅳ
새끼수 No.(%)
백 신 (No.of dams) 48시간 생존수
GBS Ⅲ-TT 33(3) 31(94)+
GBS Ⅲ-PS 39(3) 0(0)
살 린 34(3) 0(0)
+ 통계적으로 대조군으로부터 유효함(P0.0001)
참조문헌: 로렌스 씨. 마도프(Lawrence C. Madoff) 등, 감염 및 면역(Infection and Immunity), 60 : 4989-4994(1992)
로드월드(Rodewald), A.K. 등, 감염성 질병에 대한 저널(Journal of Disease), 166 :635-639(1992)
본 발명의 바람직한 실시예는 예시의 목적을 위해 개시된 것이며, 당업자라면 본 발명의 사상과 범위안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능한 것이며, 이러한 수정, 변경 등은 이하의 특허 청구의 범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
Claims (39)
- 다음의 2, 5-안히드로-D-만노오스 환원당 구조를 갖는 단편을 생산하기 위해 B족 연쇄구균 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 다당류를 해중하기 위한 방법으로서,GBS 타입 Ⅱ의 경우 상기 R1은 H이고 R2은 다음 식의 시알리레이티드(sialylated) 7당류 반복단위이고,상기 n은 약 5내지 약 50이며;GBS 타입 Ⅲ의 경우 상기 R1은 다음식의 시알리레이티드(sialylated) 5당류 반복단위이고,상기에서 n은 약 5 내지 50 이며 R2은 이당류 αNeuAc(2-3)β-D-Galp1-이며,상기 방법은,GBS 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ 다당류를 해중합되게 하기 위해 제공하는 단계, 상기 다당류를 부분적으로 de-N-아세틸레이티드 다당류 제품을 형성하기 위해 수용매질에서 염기와 반응시키는 단계, GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 단편들을 형성하기 위해 니트로소화 시약에 의해 de-N-아세틸레이티드 제품을 해중합하는 단계 및 단편들을 복구하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 수산화칼륨, 수산화 암모늄, 히드라진(hydrazine), 탄산나트륨 및 중탄산나트륨으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 니트로소화 시약은 아질산 나트륨 또는 아질산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨이고 상기 니트로소화 시약은 아질산나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 다당류는 GBS 타입 Ⅱ 박테리아로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 결과되어지는 GBS 타입 Ⅱ 단편들은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 다당류는 GBS 타입 Ⅲ 박테리아로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 결과되어지는 단편들은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항의 방법에 의해 얻어지는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 단편.
- 제 9항에 있어서, de-N-아세틸레이션을 위한 상기 염기는 수산화나트륨이고 상기 니트로소화 시약은 아질산나트륨인 것을 특징으로 하는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 단편.
- 다음의 2, 5-안히드로-D-만노오스 환원당 구조를 갖는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 단편으로서,GBS 타입 Ⅱ의 경우 상기 R1은 H이고 R2은 다음 식의 시알리레이티드(sialylated) 7당류 반복단위이고,상기 n은 약 5 내지 약 50이며;GBS 타입 Ⅲ의 경우 상기 R1은 다음식의 시알리레이티드(sialylated) 5당류 반복단위이고,상기에서 n은 약 5 내지 50 이며 R2은 이당류 αNeuAc(2-3)β-D-Galp1-인 것을 특징으로 하는 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 단편.
- 제 11항에 있어서, 상기 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 GBS 타입 Ⅱ 다당류 단편.
- 제 11항에 있어서, 상기 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 GBS 타입 Ⅲ 다당류 단편.
- GBS 타입 Ⅱ 및 타입 Ⅲ로부터 선택되는 적어도 하나의 다당류 단편을 포함하는 복합분자로서, 상기 단편은 복합분자가 다음의 구조를 갖고 단백질에 공유적으로 결합하며GBS 타입 Ⅱ의 경우 상기 R1은 H이고 R2은 다음 식의 시알리레이티드(sialylated) 7당류 반복단위이고,상기 n은 약 5내지 약 50이며;GBS 타입 Ⅲ의 경우 상기 R1은 다음식의 시알리레이티드(sialylated) 5당류 반복단위이고,상기에서 n은 약 5 내지 50 이며 R2은 이당류 αNeuAc(2-3)β-D-Galp1-인 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 14항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아부터 도출되는 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 15항에 있어서, 상기 단백질은 텐타누스 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, CRM197, B족 연쇄구균 타입 Ia/Ib의 β-C 항원의 재조합 논(non) IgA 결합 단백질 및나이세리아 메닝기티데스(Neisseria Meningitides)로부터의 재조합 클래스 3 외부 세포막 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 박테리아로부터 도출되는 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 16항에 있어서, 상기 다당류 단편은 GBS 타입 Ⅱ 다당류이고 상기 단백질은 텐타누스 톡소이드이며 상기 다당류 단편의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 사이인 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 16항에 있어서, 상기 다당류 단편은 GBS 타입 Ⅲ 다당류이고 상기 단백질은 텐타누스 톡소이드이며 상기 다당류 단편의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 사이인 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 16항에 있어서, 상기 다당류 대 단백질의 몰비율은 약 1 내지 10 사이인 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 19항에 있어서, 상기 다당류 대 단백질의 몰비율은 약 3 내지 10 사이인 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 14항에 있어서, GBS 타입 Ⅱ 및 타입 Ⅲ 단편들을 포함하는 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 제 21항에 있어서, 상기 단백질은 B족 연쇄구균 타입 Ia/Ib의 β-C 항원의 재조합 논(non) IgA 결합 단백질인 것을 특징으로 하는 복합분자.
- 단백질에 공유적으로 결합된 GBS 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ 다당류 단편을 포함하는 복합분자로 구성된 백신 조성물로서, 상기 복합분자가 다음의 구조를 갖고,GBS 타입 Ⅱ의 경우 상기 R1은 H이고 R2은 다음 식의 시알리레이티드(sialylated) 7당류 반복단위이고,상기 n은 약 5내지 약 50이며;GBS 타입 Ⅲ의 경우 상기 R1은 다음식의 시알리레이티드(sialylated) 5당류 반복단위이고,상기에서 n은 약 5 내지 50 이며 R2은 이당류 αNeuAc(2-3)β-D-Galp1-인 것을 특징으로 하는 백신조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 단편은 GBS 타입 Ⅱ 다당류이고 상기 다당류 단편의 분자량은 약 5 kDa 내지 50 kDa 사이인 것을 특징으로 하는 백신조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 단편은 GBS 타입 Ⅲ 다당류이고 상기 다당류 단편의 분자량은 약 5 kDa 내지 50 kDa 사이인 것을 특징으로 하는 백신조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 단백질 성분은 텐타누스 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, CRM197, B족 연쇄구균 타입 Ia/Ib의 β-C 항원의 재조합 논(non) IgA 결합 단백질 및나이세리아 메닝기티데스(Neisseria Meningitides)로부터의 재조합 클래스 3 외부 세포막 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 박테리아로부터 도출되는 것을 특징으로 하는 백신조성물.
- 제 26항에 있어서, 상기 단백질은 B족 연쇄구균 타입 Ia/Ib의 β-C 항원의 재조합 논(non) IgA 결합 단백질 및나이세리아 메닝기티데스(Neisseria Meningitides)로부터의 재조합 클래스 3 외부 세포막 단백질인 것을 특징으로 하는 백신조성물.
- 제 23항에 있어서, GBS 타입 Ⅱ 및 Ⅲ 다당류 단편을 갖는 결합들을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신조성물.
- 제 14항에 의한 복합분자로 면역화되어 포유류내에서 생성되는 항체를 포함하는 면역혈청.
- 제 29항에 있어서, 복합분자들의 다당류는 GBS 타입 Ⅱ 다당류의 단편들인 것을 특징으로 하는 면역혈청.
- 제 29항에 있어서, 복합분자들의 다당류는 GBS 타입 Ⅲ 다당류의 단편들인 것을 특징으로 하는 면역혈청.
- 제 23항에 의한 백신의 면역화양을 포유류에 공급하는 것을 포함하여 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ에 대항하여 포유류를 면역화시키는 방법.
- 제 32항에 있어서, 상기 포유류는 임산부 또는 신생아인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 의해 준비된 다당류 단편을 고체 지지체에 고정화하는 단계, 상기 다당류 단편이 고정된 고체 지지체를 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 항체를 결합된 다당류 다편에 결합하는 것을 허용하는 조건하에서 혈청과 결합하는 단계, 및 고체 지지체로부터 잔류 혈청을 분리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 혈청으로부터 GBS Ⅱ 또는 Ⅲ 항체들을 분리하는 방법.
- 제 34항에 있어서, 상기 다당류 단편은 GBS 타입 Ⅱ인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항에 있어서, 상기 다당류 단편은 GBS 타입 Ⅲ인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다당류 단편이 고체 지지체상에 고정되는 제 1항의 방법에 의해 준비된 GBS 타입 Ⅱ 또는 Ⅲ 다당류 단편으로 구성되는 면역평가 시약.
- 제 37항에 있어서, 상기 다당류 단편은 GBS 타입 Ⅱ인 것을 특징으로 하는 면역평가 시약.
- 제 37항에 있어서, 상기 다당류 단편은 GBS 타입 Ⅲ인 것을 특징으로 하는 면역평가 시약.
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