PL187822B1

PL187822B1 - Sposób depolimeryzacji polisacharydów ze Streptococcus typu II i typu III z grupy antygenowej B, fragment polisacharydu GBS typu II albo typu III. skoniugowana cząsteczka, kompozycja szczepionki, surowica odpornościowa, sposób wydzielania przeciwciał GBS typu II albo typu III z surowicy oraz reagent do testów immunologicznych

Info

Publication number: PL187822B1
Application number: PL96323822A
Authority: PL
Inventors: Francis Michon; Catherine Dong; Joseph Y. Tai
Original assignee: Baxter Healtcare Sa
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2004-10-29
Also published as: ES2200067T3; NO975546D0; IL136125A0; CA2223080C; AU706479B2; US6372222B1; KR100431236B1; US20020031526A1; ATE236194T1; AU6095396A; EP0830380A1; IL118603A; JPH11507964A; HUP9900919A2; EP0830380B1; CA2223080A1; ZA964822B; DE69627149T2; DE69627149D1; US6602508B2

Abstract

1 . Sposób depolimeryzacji polisacharydów ze Streptococcus z grupy antygenowej B (GBS) typu II i typu III, z wytworzeniem fragmentów majacych nastepujaca strukture z koncowa grupa redukujacej 2,5-anhydro-D-mannozy, o wzorze w którym w przypadku GBS typu II R 1 oznacza H, a R 2 oznacza powtarzalna jednostke siahlowanego heptasacharydu o wzorze w którym n ma wartosc od okolo 5 do okolo 50, a w przypadku GBS typu III R1 oznacza powtarzalna jednostke sialilo- waneeo Dentasacharydu o wzorze. w którym n ma wartosc od okolo 5 do 50 a R2 oznacza dwusacharyd aNeuAc (2-3) ß-D-Galp1-, znamienny tym, ze obejmuje etapy otrzymania polisacharydu GBS typu II albo GBS typu III, przeznaczonego do depolimeryzacji, reakcji tego polisacharydu w srodowisku wodnym z zasada, z wytworzeniem czesciowo N-deacetylowanego produktu polisacha- rydowego, nastepnie depolimeryzacji tego N-deacetylowanego produktu w reakcji ze srodkiem nitrozujacym z wytwo- rzeniem fragmentów GBS typu II albo typu III i wyodrebnienia tych fragmentów. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób depolimeryzacji polisacharydów ze Strepaococcns z grupy antygenowej B (GBS) typu II i typu III, z wytworzeniem fragmentów mających następującą strukturę z końcową grupą redukującej 2,5-adhydro-D-maddozy, o wzorze:

w którym w przypadku GBS typu II R1 oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptaaacharydn o wzorze:

[->4)-p-D-GlcpNAc(1-»3)-p-D-Galp-(1->4)-p-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1->2)-p-D-Galp-(1->J_n ⁶ 3 t t

2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III R1 oznacza powtaraalnąjeddoaakę sialilowanego pentaaacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GlcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]_n β-D-Galp ΐ

α-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 aR2 oznacza dwusacharyd aNeuAc(2-»3)e-DGalp1-, charakteryzujący się tym, że obejmuje etapy otrzymania polisacharydu GBS typu II albo GBS typu III, przeznaczonego do depolimeryzacji, reakcji tego polisacharydu w środowisku wodnym z zasadą, z wytworzeniem częściowo N-deacelylowadego produktu polisacharydowego, następnie depolimeryzacji tego N-deacetylowanego produktu w reakcji ze środkiem

187 822 nitrozującym z wytworzeniem fragmentów GBS typu II albo typu III i wyoOrębnienia tych fragmentów'.

PrzeOmiotem wynalazku jest również antygenowy fragment aolisochoryOów z grupy antygenowej B (GBS) typu II albo typu III, otrzymany powyższym sposobem.

PrzeOmiotem wynalazku jest również antygenowy fragment polisacharyOów z grupy antygenowej B (GBS) typu II albo typu III, mający następującą strukturę z końcową grupą reOukującej 2,5-onhyOeo-D-monnozy, o wzorze:

w którym w przypaOku GBS typu II Ri oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jeOnostkę sialilowanego heptosochoeyOu o wzorze:

R4)-p-D-GlcpNAc(1 ->3)-p-D-Galp-( 1 ->4)-p-D-Glcp-( t -> 3 )-p-Glcp-{ 1 ->2)-p-D-Galp-( 1 ->]„ θ 3

T t

2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość oO około 5 Oo około 50, a w przypaOku GBS typu III Ri oznacza powtarzalną jeOnostkę sialilowanego pzntosochcryOu o wzorze:

H4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GłcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]_n ΐ

β-D-Galp ΐ

α-NeuNAc w którym n ma wartość oO około 5 Oo 50 a R2 oznacza OwusochoeyO aNeuAc (2—-3) β-DGalpl-.

Korzystny jest fragment polisacharyOowy GBS typu II posiaOający masę cząsteczkową oO około 5 kDa Oo około 50 kDa.

Korzystny jest fragment polisacharyOowy GBS typu III posiaOający masę cząsteczkową oO około 5 kDa Oo około 50 kDa.

Te fragmenty wytwarza się weOług wynalazku przez Oepolimeryzację polisacharyOów GBS typu II i typu III o większej masie cząsteczkowej, posiaOających strukturę o wzorze:

[->4)-p-D-GlcpNAc(1->3)-p-D-Galp-(1->4)-p-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1-»2)-P-D-Galp-(1->]_n

3 β-D-Galp

Typ u a-NeuNAc w którym n Ola polisacharyOu natywnego wynosi około 200, albo powtarzalną jeOnostkę Ola GBS typu III o wzorze:

187 822

H4)-p-D-Glcp(1 -»6)-p-D-GlcpNAc-(1 ->3)-p-D-Galp-(1 ->]„ t

β-D-Galp t

a-NeuNAc

Typ III w którym n dla polisacharydu natywnego wynosi około 100.

Stosowany w opisie termin „Streptococcus grupy B” albo „bakteria GBS” mają takie samo znaczenie, jakie jest przyjęte w stanie techniki, zwłaszcza w publikacji Lancefield'a (J. Exp., Med. 108, 329-341, 1938) i w następnej pracy dokładniej charakteryzującej serotypy grupy B, np. w publikacji Russell-Jones'a (J. Exp. Med. 160, 1476, 1984), szczególnie opisującej bakterie taksonomicznie oznaczone jako Streptococcus agalactiae.

W sposobie według wynalazku fragmentacji otoczkowego polisacharydu GBS typu II

III z wytworzeniem nowych fragmentów według wynalazku stosuje się łagodne, niedenaturujące warunki dla otrzymania polisacharydowych fragmentów GBS typu II i GBS typu III powstałych w wyniku chemicznej depolimeryzacji. Fragmenty te można otrzymać z wysoką wydajnością, co sprawia, że proces ten jest ekonomiczny w produkcji szczepionki na dużą skalę.

Otoczkowe polisacharydy GBS typu II i III depolimeryzuje się sposobem według wynalazku następująco: Szkielet reszt 2-dezoksy-2N-acetamido-e-D-glukopiranozylowych w otoczkowych polisacharydach GBS typu II i typu III (wzór 1) częściowo N-deacetyluje się słabą zasadą w roztworze wodnym. Nieograniczającymi przykładami zasad, które można użyć w tym sposobie są wodne roztwory wodorotlenków metali alkalicznych, przykładowo wodorotlenku sodu albo wodorotlenku potasu bądź innych zasad, takich jak wodorotlenek amonowy, hydrazyna, węglan sodu i wodorowęglan sodu. Po traktowaniu zasadą, otrzymana reszta glukozaminowa (wzór 2) jest podatna na nitrozowanie odpowiednim odczynnikiem, takim jak np. azotyn sodu albo kwas azotawy, z wytworzeniem nietrwałej pochodnej N-nitrozowej (wzór III). Przegrupowanie w wyniku ataku nukleofilowego przez pierścieniowy tlen na węglu powoduje zmniejszenie pierścienia i rozszczepienie sąsiadującego wiązania glikozydowego (wzór 4). Tę reakcję stosowano do badań struktury heparyny i różnych glukozaminoglukanów (Bamett w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.438.261).

187 822

Wzór 1

I c=o

I ch₃

1) zasada

wzór 3 wzór 4

2,5-anhydro-D-mannoza wzór 2

187 822

Grupa aldehydowa w otrzymanej reszcie 2,5-anhydro-D-mannozy (wzór 4) powstałej przy końcu redukującym fragmentu polisacharydowego może być użyta bezpośrednio, bez dalszych manipulacji chemicznych (np. bez użycia ramienia wydłużającego), do wiązania drogą redukcyjnego aminowania, z polimerem zawierającym grupę aminową, korzystnie z białkiem.

Bardziej konkretnie, w celu przeprowadzenia depolimeryzacji polisacharydów GBS według wynalazku, reakcję prowadzi się w naczyniu o dogodnej pojemności, w roztworze wodnym. Dla rozpoczęcia reakcji, na odpowiednią ilość polisacharydu w roztworze wodnym działa się zasadą, częściowo N-deacetylując resztę szkieletu glukopiranozylowego. Pokrótce, reakcję można prowadzić w zasadowym medium wodnym w podwyższonych temperaturach, przykładowo od około 50°C do 110°C i przy wartości pH w zakresie około 13 - 14. Optymalną ilość zasady określa się empirycznie. Korzystnie, stosunek zasady do grup N-acetylowych zawiera się w zakresie od około 10 do około 50 równoważników molowych. Bardziej korzystnie, stosunek ten wynosi około 20 - 25 równoważników molowych. Szybkość i zaawansowanie reakcji można optymalizować drogą dobrania stężenia zasady, temperatury reakcji albo czasu reakcji. Zaawansowanie reakcji N-deacetylacji można monitorować metodą 'H-NMR.

Dla uzyskania fragmentów o wielkości od około 5 do około 60 kDa, stopień N-deacetylacji powinien wynosić od około 20% do około 2% całkowitej liczby dostępnych miejsc. Dla zatrzymania reakcji deacetylacji, mieszaninę reakcyjną można oziębić, np. oziębić na lodzie albo zakwasić do wartości pH około 4. Zakwaszanie należy prowadzić ostrożnie, unikając hydrolizy pozostających grup sialowych.

Następnie prowadzi się reakcję nitrozowania, z wytworzeniem aldehydu, dodając azotyn sodu albo inny odpowiedni odczynnik, taki jak rozcieńczony kwas azotawy, do N-deacetylowanego polisacharydu. Odczynnik nitrozujący, taki jak azotyn sodu, korzystnie dodaje się w nadmiarze molowym w stosunku do ilości moli grup N-deacetylowanych. Reakcję tego polisacharydu z odczynnikiem nitrozującym prowadzi się w niskich temperaturach, przykładowo w temperaturze około 4°C, podczas mieszania, w czasie około 2 godzin lub aż do zakończenia reakcji. Postęp reakcji można monitorować poprzez oznaczanie obecności grup aldehydowych. W procesie przebiegu reakcji, stężenie grup aldehydowych powinno wzrastać aż do osiągnięcia plateau. Reakcję można zakończyć przez rozcieńczenie mieszaniny reakcyjnej i przez podniesienie pH do około 7 rozcieńczoną zasadą, taką jak NaOH. Nadmiar reagentów można usuwać przez dializę prowadzoną z użyciem technik standardowych.

Po zakończeniu reakcji, fragmenty polisacharydowe posiadające końcową grupę aldehydową na końcu szkieletu można rozdzielać według wielkości i zbierać stosując standardowe procedury chromatograficzne. Korzystne wielkości do koniugowania z białkiem mieszczą się pomiędzy 5 kDa a 50 kDa dla polisacharydu GBS typu II i pomiędzy około 5 kDa a 50 kDa dla polisacharydu GBS typu III. Bardziej korzystne wielkości leżą między 5 a 20 kDa dla polisacharydów GBS typu II i między 10 a 50 kDa dla polisacharydów GBS typu III. Fragmenty posortowane według wymiarów można użyć do reakcji koniugacji, wykorzystując standardowe procedury redukcyjnego aminowania opisane uprzednio (np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.356.170 i w Międzynarodowym opisie patentowym WO 94/06467) albo mogą być one przechowywane do dalszego użycia.

Deaminacyjne rozszczepienie i koniugację zastosowaną do GBS typu II można prowadzić według wynalazku następująco:

187 822

HO ~^)G lcNac( 1-. 3)Ga l( 1- 4 )G lc( 1 3X3 lc( 1 - 2)Ga ę ij -O

Ch^-nh- białko t

Gai τ 2

NeuAc

Proces depolimeryzacji polisacharydu typu ΙΠ przez deaminacyjne rozszczepienie z wytworzeniem antygenowych fragmentów typu III, które można, sprzęgać bezpośrednio przez redukcyjne aminowanie z białkiem nośnika jest przedstawione poniżej:

187 822

-GGk(S-O

O-3)Gal (SO1) zasada

2) NaNO₂

-4)Glc(l-0·

j CH₂-NH-białko

N e u A c ( 2 - 3 ) G a 1 (1 - O

Przedmiotem wynalazku jest również skoniugowana cząsteczka, zawierająca co najmniej jeden fragment polisacharydowy wybrany spośród fragmentów polisacharydowych GBS typu Π albo typu III, w której to cząsteczce fragment ten jest kowalencyjnie związany z białkiem, która to cząsteczka posiada strukturę o wzorze:

187 822

w którym w przypadku GBS typu II R1 oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowadego heptasacharydu o wzorze:

[_>4)-p-D-GlcpNAc(1 ->3)-p-D-Galp-(1 ->4)-p-D-Glcp-(1 -»3)-p-Glcp-(1 ->2)-p-D-Galp-(1 ->]_n6 3 t t

2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III R1 oznacza powtarzalną jednostkę aialilowanego pentaaacharydu o wzorze:

(->4)-p-D-Glcp(1 ^6)-p-D-GlcpNAc-(1 ->3)-0-D-Galp-(1 ->]_n4 t

β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 aR2 oznacza dwusacharyd aNeuAc(2-»3)e-DGalp1-.

Komponentem białkowym skodiugowanych cząsteczek według wynalazku może być fizjologicznie tolerowane białko albo polipeptyd o długości wystarczającej do wywołania odpowiedzi zależnej od komórek T. Nreogradicaanącymi przykładami takich białek są białka bakteryjne albo polipeptydy, w tym toksyna albo anatoksyda tężca, substancje reagujące krzyżowo, takie jak CRM 197, rekombinacyjde białko wiążące nie-IgA antygenu β-C Streplococcua grupy B typu Ia/Ib i rekombinantowe białko błony zewnętrznej (OMP) klasy 3 z Naiaaeria Medidgitidea.

Stosunek molowy polisacharydu do białka w skoniugowanych cząsteczkach według wynalazku wynosi korzystnie od około 1 mola do około 10 moli polisacharydu na mol białka. Bardziej korzystnie, stosunek ten wynosi od 3 do 10 fragmentów polisacharydowych na mol białka. Zmiany w stosunku: białko/polisacharyd można uzyskać przez odpowiednie dobranie proporcji składników wyjściowych do reakcji kodiugowądia.

Poza akoniugowadymi cząsteczkami zawierającymi polisacharydy GBS typu II albo III akodiugowade z białkiem, wynalazkiem są objęte również koniugaty wieloważne i ich szczepionki, w których różne typy polisacharydów są skon^gow/ane z pojedynczym białkiem. Przykładowo, polisacharydy GBS typów I, II, III, IV albo V można wiązać z białkiem w różnych kombinacjach. Również można użyć polisacharydy pochodzące z innych bakterii, takich jak np. Haemophilua idfluedaae typu b albo Medidgococcus typów A, B lub C. Korzystną kombinacją są polisacharydy GBS typu II i III.

Skon^ow^e cząsteczki wytworzone według wynalazku na ogół zawierają białko, z którym jest związany co najmniej jeden fragment polisacharydu GBS typu II albo III poprzez pojedyncze miejsce wiążące na końcowym miejscu szkieletu fragmentu polisacharydo187 822 wego. Tak więc, wynalazek daje możliwość , w razie potrzeby, wytworzenia skoniugowanych cząsteczek GBS typu II albo III, w których komponent polisacharydowy, za wyjątkiem jednego końca, jest niezasłonięty przez białko. Inne sposoby koniugowania polisacharydów GBS typu II i III z białkiem poprzez końcowe kwasy sialowe rozgałęzień mogą w rezultacie dawać usieciowania i przyłączenie polisacharydu do białka w wielu miejscach. Wynalazek obejmuje również skoniugowane cząsteczki, które można wytworzyć stosując kombinację różnych sposobów. Przykładowo, koniugaty zsyntetyzowane według wynalazku drogą wytworzenia jednej reaktywnej końcowej grupy 2,5-anhydro-D-mannozy można poddawać dalszym reakcjom z polisacharydami, które zostały aktywowane w wielu miejscach.

Przedmiotem wynalazku jest zatem również kompozycja szczepionki, zawierająca skoniugowane cząsteczki zawierające fragment polisacharydowy GBS typu II albo typu III związany kowalencyjnie z białkiem, która to Skoniugowana cząsteczka posiada strukturę o wzorze:

w którym w przypadku GBS typu II Ri oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-GlcpNAc(1-»3)-p-D-Galp-(1->4)-p-D-Glcp-(1-»3)-p-Glcp-(1-»2)-p-D-Galp-(1->]_nθ 3 t t

2 β-D-Galp u-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III Ri oznacza, powtarzalną jednostkę sialilowanego pentasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GlcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]„ ΐ

β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R2 oznacza dwusacharyd aNeuAc(2->3)e-DGalpi-.

Zgodnie z wynalazkiem, otrzymuje się użyteczne szczepionki, o dużym znaczeniu dla zapewnienia ochrony przed zakażeniami bakteriami GBS typu II i III u ssaków, zwłaszcza u osobników żeńskich w czasie ciąży, noworodków, dorosłych osobników o obniżonej odporności i u dzieci narażonych na infekcje GBS. Przewiduje się, że te szczepionki będą szczególnie użyteczne do podawania ciężarnym kobietom jako sposób na uniknięcie odpowiedzi immunologicznej u płodu przed narodzeniem.

Szczepionki podaje się w ilościach skutecznych do wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Na ogół, taką odpowiedź wywołuje dawka od około i pg do 50 pg polisacharydu. Dawki można dostosować odpowiednio do wielkości, wagi lub wieku osobnika otrzymującego tę szczepionkę. Odpowiedź w postaci wytwarzania przeciwciał u osobnika można śledzić

187 822 wykonując próby na miano przeciwciał lub na aktywność bakteriobójczą i jeśli trzeba, można podać dawkę podtrzymującą dla wzmocnienia odpowiedzi.

Szczepionki mogą zawierać standardowe nośniki, bufory lub środki konserwujące znane specjalistom z tej dziedziny i odpowiednie do szczepionek. Ponadto, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, do preparatu szczepionki można dodać adiuwanty, takie jak ałun albo stearylotyrozyna.

Przedmiotem wynalazku jest również surowica odpornościowa, zawierająca przeciwciała powstałe w organizmie ssaka immunizowanego koniugatem według wynalazku opisanym powyżej, zawierającym co najmniej jeden fragment polisacharydowy wybrany spośród fragmentów polisacharydowych GBS typu II albo typu III według wynalazku opisanych powyżej lub wytworzonych sposobem według wynalazku opisanym powyżej.

Fragmenty polisacharydowe wytworzone według wynalazku są również użyteczne do sporządzania różnych reagentów immunologicznych do stosowania w testach immunologicznych i do oddzielania przeciwciał przeciw GBS typu II i typu III.

Przedmiotem wynalazku jest zatem także sposób wydzielania przeciwciał GBS typu II albo typu III z surowicy, polegający na tym, że:

- immobilizuje się na stałym podłożu fragmfna polisacharydowy, mający następuaącą strukturę z końcową grupą redukującej 2,5-anOydro-D-mannazy, o wzorze:

w którym w przypadku GBS typu II Ri oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialikwanego heptasacharydu o wzorze:

H4)-p-D-GlcpNAc(1 ->3)-p-D-Galp-(1 ->4)-p-D-Glcp-(1 ->3)-p-Glcp-(1 ->2)-p-D-Galp-(1 ->]_n6 3

P-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od ukoła 5 do okała 50, a w przypadku GBS typu III Ri oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego pentasacOprydu o wzorze:

H4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GlcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]_n t

P-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od akało 5 do 50 aR2 oznacza dwuąacOpryd aNeuAc(2-»3)P-DGalpl-, który to fragment polispcOprydowy wytworzony jest przez reakcję polisacharydu GBS typu II albo GBS typu III w środowisku wodnym z zasadą, z wytworzeniem częściowo N-deacetylowanego produktu polisacharydowego, następnie depolimeryzację tego N-deacetylowanego produktu w reakcji ze środkiem nitrozującym z wytworzeniem fragmentów GBS typu II albo typu III i wyodrębnienie tych fragmentów;

187 822

- kontaktuje się surowicę z tym stałym podłożem ze związanym polisacharydem w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciał GBS typu II albo typu III ze związanym fragmentem polisacharydowym; i

- oddziela się pozostałą surowicę od stałego nośnika.

Przedmiotem wynalazku jest także reagent do testów immunologicznych, charakteryzujący się tym, że zawiera immobilizowany na stałym podłożu fragment polisacharydowy GBS typu II albo typu III, mający następującą strukturę z końcową grupą redukującej 2,5-anhydroD-mannozy, o wzorze:

w którym w przypadku GBS typu II R1 oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-GlcpNAc(1->3)-p-D-Galp-(1->4)-p-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1->2)-p-D-Galp-(1->J_n6 3

T ΐ

2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III R1 oznacza powtarzalnąjednostkę sialilowanego pentasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GlcpNAc-(1-^3)-p-D-Galp-(1->]n β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R₂ oznacza, dwusacharyd aNeuAc(2-»3)e-DGalpł-, który to fragment polisacharydowy wytworzony jest przez reakcję polisacharydu GBS typu II albo GBS typu III w środowisku wodnym z zasadą, z wytworzeniem częściowo N-deacetylowanego produktu polisacharydowego, następnie depolimeryzację tego N-deacetylowanego produktu w reakcji ze środkiem nitrozującym z wytworzeniem fragmentów GBS typu II albo typu III i wyodrębnienie tych fragmentów.

Przykładowo, do testów immunologicznych, fragmenty polisacharydowe można immobilizować albo bezpośrednio albo przez łącznik białkowy, związując je ze stałym podłożem, tak jak w koniugatach według wynalazku. Takie stałe podłoże może być stosowane w różnych układach prób immunologicznych i prób ELISA do wykrywania obecności przeciwciał przeciw bakteriom GBS typu II albo III. Takie próby mogą być stosowane do diagnozowania infekcji u osobników przez oznaczanie obecności przeciwciał GBS typu II albo III w surowicy.

Do celów zastosowań w chemii rozdziału, fragmenty polisacharydowe można immobilizować na stałym podłożu i podłożem rym wypełniać kolumny powinowactwa. W korzystnym rozwiązaniu, fragment polisacharydowy początkowo koniuguje się z białkiem sposobem według wynalazku i otrzymany koniugat sprzęga się następnie z matrycą podłoża. Sposoby sprzęgania białek z materiałem wypełniającym kolumny powinowactwa są znane w stanie

187 822 teshniki. Ogólnie stosowane podłoża do kolumn powinowastwa przygotowuje się z agarozy. Są one pdwezeshnie dostępne, np. aktywowana Oepharoee (Pharmazis). Takie kolumny powinowastwa można następnie stosować do oddzielenia przesiwsiał przesiw GBS typu Π i typn III ze źr^jdźi tskł ch jak Mo żna wydzielić prze pi weiawo z surowicy pszez połąpzeąie immoOilizowanyzh fragmentów polisasharydowyzh z snaowisą, w której spodziewana jest dOesność przesiwsiał GBS typu Π albo III w warunkash pozwalaiąsyzh na wiązanie tysh pazksiwsiał z immobilizowanymi fragmentami. Następnie, związane pazkziwsiało można albo wykryć etosująz kdnwenzjonalne teshniki analityszne alOo wydzielić i odzyskać z tysh fragmentów polieashaaydowysh po oSdzieleniu oS zdzoetałysh składników snrowisy z immobilizowanego nośnika.

Wynalazek jest dalej opisany w nastdpujązyzh przykładash nie draaniszaiąsysh jego zakresu.

Przykład I. Dkpdlimeryzasja zasadowa i kontrskzjs zierśsienia z użysiem azotynu soSu, z utworzeniem fragmentów GBS typn II i typu III, zakońszdnyzh resztami 2,5-anhySrdD-mannozy

GBS typn II

Ilość 75 mg natywnego polisasharydn dtoszkdwegd z GBS typu II o średniej masie sząstkzzkowej około 200.000 rozpuezszono w 3 ml 0,5 N roztworu NaOH i roztwór ten poSzielono na trzy szęśsi (po 1 ml). Próbki (SJ-SS) utrzymywano w temperaturze 70°C w szasie odpowiednio 60 minut, 90 minut i 180 minut, następnie oziębiono je na łaźni wody z lodem. Do każdej próbki SoSano po 125 pl lodowatego kwasu ostdwerd, netswiaiąs pH na wartość 4. Po dodaniu 200 μΐ 5% (wagowd-oOjętośsidwysh) roztworu NaNO2 próbki utrzymywano w temperaturze 4°C, mikszająs, w szasie 2 godzin. Próbki S1-S3 aozsieńszono następnie do 5 ml wodą dejonizowana. t doprowadzono pH do wartości 7 roztworem 0,5 N NaOH. Nadmiar reagentów usuwano przez dializowanie teshniką Siαfiltrazji wodą dejonizowaną przez membrany So ultrafiltrazji Diaflo (Amison YM 10), po szym roztwory lidfilizowαnd. Otrzymano trzy typy fragmentów polieasharyddwysh typn II (II-1 Su II-3).

GBS typu III

Ilość 125 mg natywnegd pdlisszhaaySn dtoszkowkro GBS typu III o śrkdniei masie sząsteszkdwei około 100.000 rdzpnezsddnd w 5 ml 0,5 N roztworu NaOH i roztwór podzielono na pięć zzęśsi (po 1 ml). Próbki (S1-S5) utrzymywano w temperaturze 70°C w szasie odpowiednio 60, 90, 120, 180 i 240 minut, następnie oziębiono w łaźni wody z lodem. Do każdej próbki dodano po 125 μl lodowatego kwasu dstdwerd, nstawiąiąz pH na wartość 4. Pu dodaniu 200 μΐ 5% (wagowo-oOjętośsiowysh) roztworu NaNO2 próbki utrzymywano w temperaturze 4°C, miesząiąz, w szasie 3 godzin. Próbki S1-S5 rozsieńszond następnie do 5 ml wodą Skjonizowaną i doprowadzono pH do wαatdśzi 7 roztworem 0,5 N NaOH. Nadmiar reagentów usuwano przez dializowanie teshniką diafiltrasji wodą dejdnizowaną przez membrany So nltrafiltrasji Diaflo (Amison YM 10), po szym roztwory liofilizowano. Otrzymano pięć typów fragmentów pdlieashaaydowysh typu III (III-1 do III-5).

Sortowanie fragmentów CP pod względem wielkośsi

Średnią masę sząsteszkową (avMw) każdego fragmentu oznaszono metodą HPLC stosująs kolumnę ekeklnzyjną 0ezhaaose-12 (Pharmasia) i serię dekstranu (Pharmasia) o średnish masash sząetkzzkdwysh w zakresie od 10.000 do 2.000 daltonów. Objętość mięSzyziarndwą (Vo) i objętość sałkowitą (Vt) oznαzzono odpowiednio dekstranem 2000 i azydkiem sodu. Średnia masa sząsteszkowa (avMw) każdego fragmentu oznaszona tą metodą wynosiła:

187 822

Fragment	Kav (zakres)	AvMw (kilodaltony)	(zakres)
II-1	0,23 (0,13-0,34)	51	(99-26)
II-2	0,30 (0,19-0,40)	33	(68-17)
II-3	0,43 (0,30-0,50)	15	(33-9)
III-1	0,21 (0,11-0,27)	41	(81-28)
III-2	0,26 (0,17-0,38)	30	(53-13)
III-3	0,29 (0,18-0,40)	24	(50-12)
III-4	0,37 (0,23-0,44)	14	(36-9)
III-5	0,41 (0,31-0,47)	11	(21-8)

Analiza fizyko-chemiczna fragmentów polisacharydowych

Całkowitość struktury każdego fragmentu w odniesieniu do wyjściowego, natywnego polisacharydu oznaczono metodą wysokorozdzielczej, jedno-wymiarowej spektroskopii H-NMR przy 500 MHz w spektrometrze Brukera AM500. Porównanie widm H-NMR fragmentów typu II i typu III z widmami dla odpowiednich polisacharydów natywnych wykazało, że podczas procesów chemicznych nie zaszły żadne zmiany strukturalne, a co najważniejsze, zostały zachowane końcowe reszty kwasu sialowego podczas nitrozowania.

Przykład II. Koniugowanie haptenów polisacharydowych typu II i typu III z anatoksyną tężca.

Anatoksynę tężca (SSI, Dania) oczyszczono do formy monomerycznej przez filtrację żelową prowadzoną na kolumnie Biogel-A (Biorad Laboratories). Otrzymany monomer anatoksyny tężca (TTm) o masie cząsteczkowej 150.000 daltonów rozpuszczono w 0,2 M buforze fosforanowym (pH=7,5) w stężeniu 25 mg/ml i dodano do wysuszonych polisacharydów GBS typu II (II-1 do II-3) albo typu III (III-1 do III-5) i sekystalizowanego cyjanoborowodorku sodu, NaCNBH3, i ilościach wykazanych poniżej:

	PS (mg)	TTm (mg)	NaCNBHa (mg)	Końcowa objętość (pl)
II-1	10	4	8	200
II-2	10	4	8	200
II-3	11	4,5	9	220
III-1	18	7,2	14	360
m-2	10	4	8	200
III-3	7,2	3	6	150
III-4	6,4	2,5	5	130
III-5	8	4	8	130

Powyższe mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 dni. Przebieg reakcji koniugowania monitorowano metodą HPLC na kolumnie Superose-12 (Pharmacia) małych próbek pobieranych z mieszanin reakcyjnych. Koniugaty oczyszczano metodą chromatografii ekskluzji molekularnej na kolumnie Superdex G-200 (Pharmacia), stosując do eluowania PBS z dodatkiem 0,01% tiomersalu. Frakcje spływające z kolumny oznaczano w refraktometrze różnicowym Waters R403 i metodą spektroskopii UV przy 280 nm. Frakcje zawierające koniugaty łączono, sterylizowano metodą filtracji przez membrany Millipore o wielkości porów 0,22 pm i analizowano na zawartość odpowiednio białka i kwasu sialowego metodą Bradforda (Bradford M.M., Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976) i w próbie z rezorcynolem. Średnią całkowitą ilość węglowodanów w poszczególnych skoniugowanych czą24

187 822 steczkach typu II i typu III wyliczono mnożąc zawartość kwasu sialowego przez współczynnik korygujący oOpowieOnio 4 i 3,3, oparty na skłaOzie występującej w nich powtarzającej się jeOnostki. Wyniki analizy każOego koniugatu są przeOstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Koniugot	Łańcuchy PS AvMw	Białko (Mg/ml)	CHO (Mg/ml)	% CHO w koniugocie	Ilość łańcuchów PS
II-1-TT	51,000	120	15	11	0,4
II-2-TT	33,000	140	42	23	1,4
II-3-TT	15,000	110	26	19	2,4
III-1-TT	41,000	190	70	27	1,2
III-2-TT	30,000	140	61	29	1,8
III-3-TT	24,000	100	39	28	2,0
II1-4-TT	14,000	70	17	20	2,0
III-5-TT	11,000	80	21	21	3,0

Swoistość immunochemiczną poligonalnych przeciwciał królika przeciw koniugatom polisacharyOowym typu II i typu III porównano ze swoistością obserwowaną Ola epitopów na natywnych polisacharyOach otoczkowych w oznaczeniach wykonanych metoOą ELISA, co jest przeOstawione na fig. 1 (GBS typ II) i fig. 2 (GBS typ III).

Przykład III. OOpowieOź immunologiczna samic myszy na immunizację szczepionkami zawierającymi koniugat: GBS typu II i typu III - anatoksyna tężca.

a. Immunizacja. Grupy po 10 samic myszy rasy Swiss Webster w wieku 4-6 tygoOni immunizowano poOskórnie ilością 2 pg albo natywnego polisochoeyOu typu II bąOź typu III albo oOpowicOojącego mu koniugatu z onctoksyną tężca. Szczepionkę absorbowano na woOorotlenku glinu (AlhyOrogel, Superfos, Dania) w stężeniu 1 mg pierwiastkowego glinu/ml 10 mM roztworu PBS zawierającego 0,01% tiomersalu. Myszy otrzymywały szczepionkę w Oniach 0, 21 i 42, po czym, w 52 Oniu były wykrwawiane. Surowice zbierano i arzechodywcuo w temperaturze -70°C.

b. Próby ELISA i aktywność opsonizacji antysurowic przeciw koniugatom

Próby ELISA: Płytki Oo mikromianowania (Nunc Polysorb ELISA plates) uwrażliwiano przez OoOanie 100 pl koniugatu: natywny polisochceyO typu II albo III - HSA (1 pg/ml) w PBS z OoOatkiem 0,02% azyOku na wgłębienie. Płytki inkubowano w temperaturze 37° przez goOzinę. Następnie płytki przemywano PBS zcwierojącym oO 0,05% Oo 20% PBS-T i blokowano 0,5 procentowym roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez goOzinę w temperaturze pokojowej. Do wgłębień OoOawano ilości po 100 pl seryjnych Owukrotnych rozcieńczeń antysurowicy mysiej w PBS-T i płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez goOzinę. Po przemyciu roztworem PBS-T, Oo płytek OoOano ilości po 100 pl znaczonej peroksyOazą anty-mysiej IgG kozła (H+L) (KirkegoorO & Perry Laboratories), po czym przemyto pięć razy roztworem PBS-T. W końcu, Oo każOego wgłębienia OoOano 50 pl substratu Ola peroksyOazy, TMB (KirkegaarO & Perry Laboratories) i po 10 minutowej inkubacji płytek w temperaturze pokojowej reakcję zatrzymywano przez OoOanie 50 pl M roztworu H3PO4. OOczyty na płytkach wykonywano przy 450 nm w czytniku Oo mikropłytek firmy Molecular Device Amex, stosując 650 nm jako referencyjną Oługość fali.

Miana przeciwciał swoistych wobec polisochoeyOu typu III u myszy szczepionych natywnym polisacharyOem typu III albo koniugatami: fragment polisochoeyOowy typu III - onctoksyna tężca, są poOane w tabeli 2.

187 822

Tabela 2

Średnia masa cząsteczkowa fragmentu	ELISA miano w 52 dniu*	Miano OP+
i 3,000	2,500	405
i8,000	2,500	6i0
26,000	3,000	i,050
34,000	3,000	520
48,000	i2,000	2.600
natywny PS	<i00	<i00

* Średnie miano w surowicy zebranej od i0 myszy.

+ Aktywność bójcza fagocytów w wyniku opsonizacji w zebranej surowicy w 52 dniu.

Miana przeciwciał swoistych wobec polisacharydów typu II u myszy szczepionych natywnym polisacharydem typu II albo koniugatami: fragment polisacharydowy typu III - anatoksyna tężca są podane w tabeli 3.

Tabela 3

Średnia masa cząsteczkowa fragmentu	ELISA miano w 52 dniu*	Miano OP+
i5,000	i 23.000	9.300
33,000	I5.000	i.400
5i,000	2.600	<500
Natywny PS	<500	<i00

* Średnie miano w surowicy zebranej od i0 myszy.

Aktywność opsonizacyjna antysurowic przeciw koniugatom: Zdolność opsonizacyjna antysurowic mysich wobec koniugatów: fragment polisacharydowy GBS typu II albo typu III anatoksyna tężca, oznaczano in vitro, w próbach aktywności bójczej fagocytów w wyniku opsonizacji, stosując ludzką linię komórek promielocytowych białaczki HL-60 (ATCC nr CCL 240). Pokrótce, zmieszano 200 jednostek kolonizujących (cfu) komórek GBS typu II, szczepu i8RS2i albo komórek typu III, szczepu M78i zrówna objętością przeciwciał surowicy i inkubowano podczas wstrząsania w czasie i5 minut w temperaturze 35°C w inkubatorze z zawartością 5% dwutlenku węgla. Do tej mieszaniny dodano komplement od noworodków królików i komórki HL-60 (5 x i0⁵) hodowane przez 5 dni wobec 90 mM DMF i prowadzono inkubację w temperaturze 37°C w ciągu godziny, wstrząsając. Do ilościowego oznaczenia hodowli pobierano próbki. Miana oznaczano przez ekstrapolację rozcieńczenia przeciwciała odpowiadającego 50 procentom żywych bakterii.

C. Próby wiązania w teście ELISA. Bezpośrednie wiązanie swoistych przeciwciał królika przeciw polisacharydom otoczkowym GBS typu II albo typu III (otrzymanych od królików hiper-immunizowanych całymi komórkami GBS typu II albo typu III) z różnymi koniugatami z anatoksyną tężca przeprowadzono następująco: płytki do mikromianowania uwrażliwiano przez dodanie i00 ul koniugatów o różnych wielkościach złożonych z polisacharydu GBS typu II albo III i anatoksyny tężca (TT) (i pg/ml) wPBS z dodatkiem 0,0i% tiomersalu na wgłębienie. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę, następnie postępowano w sposób opisany powyżej i uzupełniano ilością po 100 pl seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń antysurowicy królika wPBS-T. Pozostałe etapy testu ELISA są opisane powyżej, z tym wyjątkiem, że dodano wtórną przeciwkróliczą IgG znaczoną peroksydazą (Kirkegaard & Perry Laboratories).

187 822

Wiązanie króliczych przeciwciał swoistych wobec polisacharydu GBS typu II albo III z różnymi kodiugatami z anaaoksyną tężca jest wyrażone w procentach względem wiązania kodinaalów: nalywdy polisacharyd typu II albo typu tężca, co jest zilustrowane odpowiednio na fig. 1 i fig. 2.

Przykład IV. Immudizacja samic myszy w celu nadania ochrony przed zakażeniem GBS noworodków mysich.

Samicom myszy CD-1 (n=3) w wieku 6-8 tygodni pochodzącym z Charles River Laboratories, Wilmidalod, MA, wstrzyknięto dootrzewnowo w dwóch dawkach skodiugowąde szczepionki zawierające 2 pg (ilość odpowiadająca dawce 1 pg polisacharydu/mysz) fragmentu polisacharydowego (średnia masa cząsteczkowa około 11.000 daltonów) w nośniku Alhydrogel 1,3% (Superfos Biosector a/s, partia nr. 2043) w całkowitej objętości 0,5 ml) w dniach 0 i 21. Myszy kontrolne (n=3) otrzymały szczepionki zawierające 2 pg natywnego GBS CP typu III. Myszy pokrywano w 21 dniu i noworodkom (36 godzinnym) podawano dootrzewnowo śmiertelne dawki bakterii GBS M781 typu III (6 x 10 ^jednostek cfu). Po 48 godzinach od ekspozycji na bakterie oceniano przeżywalność. Jak pokazano w tabeli 4, szczepienie samic myszy koniugaaem GBS typu iIl-TT przed zapłodnieniem nadaje ochronę 94 procentom noworodków następnie urodzonych.

Tabela 4

Szczepionka	Ilość noworodków (ilość matek)	Ilość (%) noworodków, które przeżyły w czasie 48 godzin
GBS III-TT	33 (3)	31 (94)+
GBS III-PS	39(3)	0(0)
Sól fizjologiczna	34(3)	0(0)

+ statystycznie znamienne w stosunku do kontroli

Piśmiennictwo: Lawrence C. Madoff i wsp.: Ι^ι^^ and Immunity, 60, 4989-4994 (1992), Rodewald A. K. I wsp., Journal of Ideectioua Disease, 166, 635-639 (1992).

Jakkolwiek wynalazek został opisany pod kątem szczególnych rozwiązań, w świetle niniejszego opisu jest oczywiste dla specjalistów, że można wprowadzić szereg rozwiązań alternatywnych i odmian. Wynalazek obejmuje wszystkie te rozwiązania alternatywne i odmiany wchodzące w istotę i zakres załączonych zastrzeżeń. Ponadto, do opisu jest włączona treść cytowanych opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki jako odnośników.

187 822

Procent wiązania

Wielkość polisacharydu (kilodaltony)

FIG. 2

187 822 ιη

TYP

O

PO

O in o

iO

187 822

FIG. 5

187 822

Procent wiązania

Wielkość polisacharydu (kilodaltony)

FIG. I

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób depolimprizacji zalisaphaiydów ze Streptococcus z grupy anpygenowej B (GBS) typn II i typu III, z wytworzeniem fragmentów mających następniąsą strnktnaę z kuńsuwą grapą rednkniązej 2,5-anhydrd-D-mannuzy, u wzorze:

w którym w przypadkn GBS typn II Ri oznacza H, a R2 uznasza powtarzalną jednostkę sialiluwanegu heptasasharydn o wzorze:

[_>4)-p-D-GlcpNAc(1->3)-p-D-Galp-(1-^4)-3-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1->2)-ą-D-Galp-(1->J_n6 3

T ΐ

1 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do okuło 50, a w przypadkn GBS typn III Ri oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanegu pentasasharydn o wzorze:

H4)-p-D-Glcp(1->6)-3-D-GlcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]_n

T β-D-Galp

T a-NeuNAc w którym n ma wartość od okuło 5 do 50 a R2 oznasza dwnsasharyd aNenAs (2->3) β-DGalpl-, znamienny tym, ze obejmie etapy otrzymania polisasharydn GBS typn II albo GBS typn III, przeznaszonego du depdlimeiyzasii, reaksji tego polisasharydn w śrudowiskn wodnym z zasadą, z wytworzeniem zzęśsiowd N-deasetylowanego prudn^ polieashaaydowego, następnie depolimeryzasji tego N-deasetylowanego produkni w reaksji ze środkiem nitrozuiąsym z wytworzeniem fragmentów GBS typn II albo typn III i wyodrębnienia tysh fragmentów.
2. SposóS wsółuw zastrz. 1, znamienny tym, ze do re z zasadą ssosuje się zasid ę wybraną z grapy oOejmująsej wodorotlenek sudn, wodorotlenek potasn, wodorotlenek amom, węglan soSu, wodorowęglan soSu i hydrazynę.

187 822
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako środek nitrozujący stosuje się azotyn sodu albo kwas azotawy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodu, a jako środek nitrozujący stosuje się azotyn sodu.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że polisacharyd pochodzi z bakterii GBS typu II.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że uzyskuje się w nim fragmenty GBS typu II o masie cząsteczkowej od około 5 kDa do około 50 kDa.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że polisacharyd pochodzi z bakterii GBS typu III.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że uzyskuje się w nim fragmenty o masie cząsteczkowej od około 5 kDa do około 50 kDa.
9. Fragment polisacharydu GBS typu II albo typu III, znamienny tym, że został wytworzony sposobem określonym w zastrz. 1.
10. Fragment polisacharydu GBS typu II albo typu III według zastrz. 9, znamienny tym, że został wytworzony sposobem, w którym jako zasadę do N-deacetylacji zastosowano wodorotlenek sodu a jako odczynnik nitrozujący zastosowano azotyn sodu.
11. Fragment polisacharydowy z grupy antygenowej B (GBS) typu II albo typu III, mający następującą strukturę z końcową grupą redukującej 2,5-anhydro-D-mannozy, o wzorze:

w którym w przypadku GBS typu II R1 oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

H4Fp-D-GlcpNAc(1->3)-P-D-Galp-(1^4)-p-D-GlcH1-^3)-p-Glcp-(1->2)-p-D-Galp-(1->]„

6 3 t T

1 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III R1 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego pentasacharydu o wzorze:

H4)-p-D-Glcp(1 ^6)-p-D-GlcpNAc-(1 -»3)-ą-D-Galp-(1 ->]„ t

β-D-Galp

T a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R2 oznacza dwusacharyd uNeuAc (2->3) β-DGalp1-.
12. Fragment polisacharydowy GBS typu II według zastrz. 11, znamienny tym, że posiada masę cząsteczkową od około 5 kDa do około 50 kDa.
13. Fragment polisacharydowy GBS typu III według zastrz. 11, znamienny tym, że posiada masę cząsteczkową od około 5 kDa do około 50 kDa.

187 822
14. Skoniugowana cząsteczka, zawierająca co najnrniej jeden fragment polisacharydowy wybrany apośnód frtamedaóą polisacharydowych GBS typu II albo typu III, w kaónef to cząsteczce fragment ten jeat kowalencyjnie związany a białkiem, która to cząsteczka posiada strukturę o wzorze:

R1OH2C w którym w przypadku GBS typu II Ri oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

(->4)-p-D-GlcpNAc( 1 ->3)-p-D-Galp-( 1 ->4)-p-D-Glcp-( 1 ->3)-P-GJcp-( 1 ->2)-p-D-Galp-( 1 ? ³ ¹ 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III Ri oznacza powtarzalną jednostkę sialilowadeao pentasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GlcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]_n ΐ

β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R2 oznacza dwusacharyd aNeuAc (2->3) β-DGalpl-.
15. Skonrugowada cząsteczka według zastrz. 14, znamienna tym, że zawarte w niej białko pochodzi z bakterii.
16. Skodinaowada cząsteczka według zastrz. 15, znamienna tym, że białko jest wybrane z grupy obejmującej anatoksynę tężca, adatokaydę błonicy, CRM197, rekombinacyjne białko wiążące nie-IgA antygenu β-C Streptococcus grupy B typu Ia/Ib i rekombinacje białko błony zewnętrznej klasy 3 z Neisseria Medingitides.
17. Skomugow^ana cząsteczka według zastrz. 16, znamienna tym, że zawarty w niej fragment polisacharydowy jest polisacharydem GBS typu II, białko jest adatokaydą tężca, a masa cząsteczkowa fragmentu polisacharydowego wynosi od około 5 kDa do około 50 kDa.
18. Skodingowana cząsteczka według zaslrz. 16, znamienna tym, że zawarty w niej fragment polisacharydowy jest polisacharydem GBS typu III, białko jest adatokaydą tężca, a masa cząsteczkowa fragmentu polisacharydowego wynosi od około 50 kDa do około 50 kDa.
19. Skoniugowada cząsteczka według zastrz. 16, znamienna tym, że stosunek molowy polisacharydu do białka wynosi od około 1 do około 10.
20. Skodrngowada cząsteczka według zastrz. 19, znamienna tym, że stosunek molowy polisacharydu do białka wynosi od około 3 do około 10.
21. Skoniugowana cząsteczka według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera fragmenty GBS typu II i typu III.

187 822
22. Skoniugowana cząsteczka według zastrz. 21, znamienna tym, że zawarte w niej białko jest rekombinacyjnym białkiem wiążącym nie-IgA antygenu β-C Streptococcus grupy B typu Ia/Ib.
23. Kompozycja szczepionki, zawierająca skoniugowane cząsteczki zawierające fragment polisacharydowy GBS typu II albo typu IlI związany kowalencyjnie z białkiem, która to skoniugowana cząsteczka posiada strukturę o wzorze:

R-|OH₂C w którym w przypadku GBS typu II R] oznacza H, a R₂ oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-GlcpNAc(1->3)-p-D-Galp-(1->4)-p-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1-»2)-P-D-Galp-(1-»]_n

6 3

T T

1 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III R] oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego pentasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp(1 -»6)-p-D-GlcpNAc-(1 ->3)-p-D-Galp-(1 -»]„ t

β-D-Galp

T a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R₂ oznacza dwusacharyd aNeuAc (2->3) β-DGalpl-.
24. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, w której fragmentem polisacharydowym jest polisacharyd GBS typu II a masa cząsteczkowa tego fragmentu polisacharydowego wynosi od około 5 kDa do 50 kDa.
25. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, w której fragmentem polisacharydowym jest polisacharyd GBS typu III, a masa cząsteczkowa tego fragmentu polisacharydowego wynosi od około 5 kDa do 50 kDa.
26. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, w której białko pochodzi z bakterii i jest wybrane z grupy obejmującej anatoksynę tężca, anatoksynę błonicy, CRM197, rekombinacyjne białko wiążące nie-IgA antygenu β-C Streptococcus grupy B typu Ia/Ib i rekombinacyjne białko błony zewnętrznej klasy 3 z Neisseria Meningitides.
27. Kompozycja szczepionki według zastrz. 26, w której białko jest rekombinacyjnym białkiem wiążącym nie-IgA antygenu β-C Streptococcus grupy B typu Ia/Ib bądź rekombinacyjnym białkiem błony zewnętrznej klasy 3 z Neisseria Meningitides.
28. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, zawierająca koniugaty z fragmentami polisacharydów GBS typu II i typu III.

187 822
29. Surowica odpornościowa, znamiennz tym, ze zawiera przeciwciała powstałe w organizmie ssaka immunicnwonegn knniugatem, zawierającym cn najmniej jeden fragment polisacharydowy wybrany spoaróO fragmentów anlisachaeyOnwych GBS typu II albn typu III, w której tn knniugacie fragment ten jest knwalencyjnie związany z białkiem, która tn cząsteczka knniugatu ś^nsiaOa strukturę n wznrze:

R1OH2C w którym w przyaaOku GBS typu II Ri umacza H, a R2 umacza anwtoezolną jeOnnstkę sialilowonego heptosochoeyOu n wznrze:

R4)-p-D-GlcpNAc(1->3)-p-D-Galp-(1->4)-p-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1->2)-3-D-Galp-(1->]_n6 3

T t

1 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość nO nknłn 5 On nknłn 50, a w przypaOku GBS typu III Ri nznacza pnwtorzolnąjeOnostkę siolilnwonego pentasacharyOu o wzorze:

H4)-3-D-Glcp(1 ->6)-p-D-GlcpNAc-(1 ->3)-3-D-Galp-( 1 ->]_n4

T β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość oO około 5 Oo 50 a R2 oznacza OwusacharyO aNeuAc (2—-3) β-DGalpl-.
30. Surowica oOpornoaciowa weOług zastrz. 29, w której aolisochoeyOy koniugatu są fragmentami aolisochoeyOów GBS typu II.
31. Surowica oOpornoaciowa weOług zastrz^ 29, w której aoliscchoeyOy koniugatu są fragmentami aolisochoeyOów GBS typu III.
32. Sposób wyOzielania przeciwciał GBS typu II albo typu III z surowicy, znamienny tym, że:

- immobilizuje się na stałym poOłożu fragment aolisochoryOowy, mający następującą strukturę z końcową grupą reOukującej 2,5-cnhyOro-D-monnozy, o wzorze:

187 822 w którym w przypadku GBS typu II Ri oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

H4)-3-D-GlcpNAc(1 ->3)-p-D-Galp-(1 ->4)-p-D-Glcp-(1 ->3)-p-Glcp-(1 ->2)-p-D-Galp-(1 ->]_n6 3

T t

1 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III Ri oznacza powtarzalnąjednostkę sialilowanego pentasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp(1->6)-p-D-GlcpNAc-(1->3)-p-D-Galp-(1->]_n t

β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R2 oznacza dwusacharyd aNeuAc (2—>3) β-DGalpl-, który to fragment polisacharydowy wytworzony jest przez reakcję polisacharydu GBS typu II albo GBS typu III w środowisku wodnym z zasadą, z wytworzeniem częściowo N-deacetylowanego produktu polisacharydowego, następnie depolimeryzację tego N-deacetylowanego produktu w reakcji ze środkiem nitrozującym z wytworzeniem fragmentów GBS typu II albo typu III i wyodrębnienie tych fragmentów;

- kontaktuje się surowicę z tym stałym podłożem ze związanym polisacharydem w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciał GBS typu II albo typu III ze związanym fragmentem polisacharydowym; i

- oddziela się pozostałą surowicę od stałego nośnika.
33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że fragment polisacharydowy jest fragmentem polisacharydu GBS typu II.
34. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że fragment polisacharydowy jest fragmentem polisacharydu GBS typu III.
35. Reagent do testów immunologicznych, znamienny tym, że zawiera immobilizowany na stałym podłożu fragment polisacharydowy GBS typu II albo typu III, mający następującą strukturę z końcową grupą redukującej 2,5-anhydro-D-mannozy, o wzorze:

187 822 w którym w przypadku GBS typu II R1 oznacza H, a R2 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego heptasacharydu o wzorze:

[->4)-P-D-GlcpNAc(1-»3)-p-D-Galp-(1-»4)-p-D-Glcp-(1->3)-p-Glcp-(1->2)-3-D-Galp-(1->]_n

6 3 ί t

1 2 β-D-Galp a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do około 50, a w przypadku GBS typu III R1 oznacza powtarzalną jednostkę sialilowanego pentasacharydu o wzorze:

[->4)-p-D-Glcp( 1 —>6)-p-D-GlcpNAc-(1 ->3)-p-D-Galp-(1 —>]_n4 t

β-D-Galp t

a-NeuNAc w którym n ma wartość od około 5 do 50 a R2 oznacza dwusacharyd uNeuAc (2->3) β-DGalpl-, który to fragment polisacharydowy wytworzony jest przez reakcję polisacharydu GBS typu II albo GBS typu III w środowisku wodnym z zasadą, z wytworzeniem częściowo N-deacetylowanego produktu polisacharydowego, następnie depolimeryzację tego N-deacetylowanego produktu w reakcji ze środkiem nitrozującym z wytworzeniem fragmentów GBS typu II albo typu III i wyodrębnienie tych fragmentów.
36. Reagent do testów immunologicznych według zastrz. 35, znamienny tym, że zawiera fragment polisacharydowy GBS typu II.
37. Reagent do testów immunologicznych według zastrz. 35, znamienny tym, że zawiera fragment polisacharydowy GBS typu III.

Wynalazek dotyczy sposobu depolimeryzacji polisacharydów ze Streptococcus typu II i typu III z grupy antygenowej B, fragmentu polisacharydu GBS typu II albo typu III, skoniugowanej cząsteczki zawierającej takie fragmenty polisacharydów, zawierającej ją kompozycji szczepionki, surowica odpornościowa, sposób wydzielania przeciwciał GBS typu II albo typu III z surowicy z zastosowaniem tych fragmentów oraz reagenta do testów immunologicznych. W szczególności wynalazek dotyczy fragmentów antygenowych otoczkowych polisacharydów użytecznych do sprzęgania z białkiem, z wytworzeniem immunogenów wzbudzających powstawanie ochronnych przeciwciał. Wynalazek dotyczy zwłaszcza fragmentów polisacharydów otoczkowych Streptococcus z grupy antygenowej B (GBS CP) z dającymi się analizować

187 822

Zońsdwymi grapami redukniąsymi, ish wytwarzanie i zastosowanie du otrzymywania skuningdwanyzh ezszepionek.

Bakterie Streptozossue grapy B (GBS) są znanym szynnikiem etiolugisznym rozwoju bakteriemii i/lub zapalenia opon mózrowo-rdzenidwysh n niemowląt oraz zakazeń n Surusłysh (Baker: „Group B Streptozdszal Infestions” w szaeopiśmie Advansee in Internai Medisine, 25, 475-500, 1980). Dlatego też istnieje potrzeba uprasowania szybkish i wiaiygodnyzh metod snalitysznysh du diagnozowania infeksji GBS i dysponowania środkami generowania dshadny przed GBS, zwłaszzza n niemowląt i u osób z obniżoną oSpdanośsią.

Wiadomo, że otoszkowe pdliessharySy z bakterii GBS mają ważne znaszenie dla zjaSliwdśsi GBS i dla rozwoju ozhaonnej odpornossi (Kasper i wsp. w opisie patentowym Stanów ZjeSndSzonysh Ameryki nr 5.302.386). Ponadto, otoszkowe polieashsaydy (CP) rozpoznanysh typów GBS (typów I-V), są zhemizznie spokrewnione ale antygenowu zróżnisowane. Posiadają one powtarzająse się struktury złożone z golaktdzy, glukozy, N-asetylurlukdzaminy i kwasu N-asetyloneuaamindwego (sialowegd).

U niemowląt i n młoSezysh dziesi oSpowieSź immunologisz^ na antygeny polisasharydowe jest słaba. Odpowiedzi te sharakteryznją się tym, że są niezależne ud limfusytów T, a zatem, nie są związane z takimi ważnymi atrybutami jak pamięć antygenowa, zmiana izutypu bądź dojrzewanie pdwinowaztwa, niezbędnymi du nadania długotrwałej oshaony immunoldrizznei przed nadshodząsym zakażeniem. Dla dbejśzis tego braku skutesznej odpowiedzi immunologisznei na pdlisashaiydy n niemowląt i młdSezysh Sziesi uprasowano sposoby przekształ^nia odpowiedzi niezależnej oS limfosytów T na odpowiedź zalezną ud limfusytów T przez kowalensyjne sprzężenie polieasharydowysh antygenów baZteiyjnysh z białkiem nośnikowym i wytworzenie sząsteszki sZonSnrowαnei (Jennings i wsp. w opisie patentowym Stanów Zjedndszdnysh Ameryki nr 4.356.170 wprowadzonym do niniejszego opisu jako odnośnik).

Opisano różne padseSnry koniugowania otoszkowysh polieashαaydów z białkami. Przegląd tysh proseS^ znajduje się w pn0likazii: Cdntai0ntione to Mizrd0iology and Immunolog, tom 10, Cdnjngate Vassines, tom pod red. J. M. Cruse i R. E. Lewis^ Jr. (1989), w^szonej du niniejszego opisu jako odnośnik. W jednej z metod, polisasharyd poddaje się łagodnej hydrolizie kwaśnej w seln wytworzenia kdńzdwyzh grup reSukujązyzh zSolnysh do reaksji z białkiem z powstaniem wiązania kowalensyinego (Anderson P. A., Infest. Immnn., 39, 233-238). Jednakże Zońsowe grupy snkrowe, które uszestnizzą w sprzęganiu z białkiem występują w równowadze między hemiasetalem a aldehydem, a zatem sprzęgają się z białkiem z niską wydainośsią. Dla przezwysiężenia słabej reaktywnośsi końsdwyzh aednknjąsysh grup sukruwysh, prowadzono łagodne utlenienie w selu wprowadzenia trwałysh grup aldehydowyzh w końsdwyzh pozysjash polieasharySów stoedwanyzh do koniugowania z białkiem (Jennings i wsp. w opisie patentowym Stanów ZjeSndszonysh Ameryki nr 4.356.170, jak wyżej).

Kasper i wsp. w opisie patentowym Stanów ZjeSnozzonysh Ameryki nr 5.302.386 i w opisie Międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 94/06467 opisali odpowiednio skoniurowane szszepionki GBS typu III i II. Obydwa te opisy patentowe są w^szone do niniejszego opisu jaku oSnośniki. Według opisu patentowego 5.302.386, Su aozezszepienia szkieletu polieαshαrySowero użyto endd-β-galaZtdzydazd otazymuiąs produkty odpowiednie do koniurowania z białkiem. Utlenienie su najmniej dwPzh końsowysh grup kwasu eislowego z wytworzeniem siesiowanysh koningatów jest opisane w zgłoszeniu patentowym WO 94/06467.

Otoszkowe polieashαaySy GBS typn III składają się ze szkieletu powtaaząiąsysh się adzrałęzidnyzh jednostek pentasazhsaySowyzh (Jennings i wsp., Canadian J. Bioshem., 58, 112120, 1980). W jednym badaniu polisashaaySpw GBS typu III wykryto, że naturalne miej^;eze determinanty immunolo^znej jest zlokalizowane w mieiesn połąszenia: łańsnsh Ooszny - szkielet (Jennings i wsp. Bioshemistry, 20, 4511-4518, 1980). Autorzy donieśli, że obesność terminalnyzh reszt kwasu N-asetyld-nenrαmindwerd w łańsushu Oosznym jest Sezyd^iąsa dla ekspresji determinanty immnnologisznei.

Znane sposoby depolimeryzasii polisasharydów GBS II albo III polegają albo na daogish metodash enzymatyzznysh albo na kwaśnej hySrolizie, która może zmieniać antygeno10

187 822 wość CP w wyniku usuwania nietrwałych końcowych grup kwasu sialowego. Istnieje więc potrzeba opracowania względnie tanich i łagodnych procedur chemicznych skutecznych w depolimeryzacji otoczkowych polisacharydów GBS typu II i III w taki sposób, aby powstawały fragmenty użyteczne do wytwarzania skoniugowanych szczepionek CP-białko.

Celem wynalazku było opracowanie sposobów fragmentacji polisacharydów GBS typu II i typu III z wytworzeniem fragmentów nadających się do produkcji cząsteczek skoniugowanych. Innym celem wynalazku było wytworzenie cząsteczek polisacharydowych, które byłyby użyteczne jako szczepionki chroniące przed zakażeniem i jako odczynniki stosowane w immunologii.

Zgodnie z wynalazkiem, opracowano sposób depolimeryzacji polisacharydów otoczkowych (CP) Streptococcus typu II (GBS-II) i typu III (GBS-III) grupy B przez deaminujące rozszczepienie, z wytworzeniem produktów zawierających końcową strukturę 2,5-anhydro-Dmannozy. Według niniejszego wynalazku, na GBS-II CP i GBS-III CP działa się wodorotlenkiem sodu i odczynnikiem nitrozującym, takim jak azotyn sodu, depolimeryzując polisacharydy GBS i wytwarzając fragmenty posiadające końcową grupę aldehydową zlokalizowaną na końcu szkieletu polisacharydowego. Wytworzone fragmenty CP same są antygenowo a ponadto są użyteczne do sprzęgania z białkiem w celu produkcji immunogenów skutecznych w wywoływaniu ochronnych odpowiedzi immunologicznych u ssaków, w tym u noworodków.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania skoniugowanej cząsteczki do użycia jako szczepionka. Sposób ten polega na poddaniu otoczkowych polisacharydów GBS-II albo GBS-III działaniu zasady i odczynnika tworzącego sól diazoniową z utworzeniem fragmentu kończącego się resztą 2,5-anhydro-D-mannozy. Ten końcowy fragment 2,5-anhydro-D-mannozy łączy się następnie z białkiem i poddaje redukcyjnemu aminowaniu z wytworzeniem skoniugowanych cząsteczek według wynalazku. Tak więc, w następnym aspekcie, wynalazek dotyczy skoniugowanych cząsteczek otoczkowych polisacharydów GBSII i GBS-III zawierających fragmenty CP GBS-II albo GBS-III związane z białkiem poprzez końcową 2,5-anhydro-D-mannozę. Ponieważ proces depolimeryzacji polisacharydów GBS-II i GBS-III generuje fragmenty posiadające pojedyncze miejsce reaktywne na końcu szkieletu, niniejszy wynalazek stwarza możliwości wytwarzania skoniugowanych cząsteczek, w których każdy polisacharydowy łańcuch GBS-II albo GBS-III jest związany z pojedynczym białkiem, każdy przez drugorzędową aminę, poprzez końcowy cukier redukujący.

Koniugaty według wynalazku są użyteczne jako aktywne szczepionki do uodporniania osobników na zakażenie bakteriami GBS-II i GBS-III. Wynalazek obejmuje również szczepionki wieloważne zawierające polisacharydy pochodzące od różnych serotypów albo rodzajów bakterii.

Wynalazek obejmuje ponadto surowicę odpornościową lub przeciwciała powstałe w odpowiedzi na immunizację skoniugowanymi cząsteczkami według wynalazku, użyteczne jako odczynniki do wykrywania obecności bakterii GBS typu II lub typu III albo jako szczepionki nadające odporność bierną.

W innym aspekcie, wynalazek obejmuje sposoby i reagenty użyteczne do wyodrębniania i/lub wykrywania przeciwciał GBS typu II lub typu III. Według jednego z praktycznych sposobów realizacji, fragmenty polisacharydowe otrzymane sposobem według wynalazku immobilizuje się na stałym nośniku. Dzięki połączeniu źródła przeciwciała, takiego jak surowica, z fragmentem polisacharydu związanym ze stałym nośnikiem można wykryć przeciwciało wiążące się z tym fragmentem polisacharydu standardowymi technikami immunologicznymi albo oddzielić je od wyjściowego materiału albo od surowicy.

Na załączonych rysunkach:

Figura 1 przedstawia bezpośrednie wiązanie swoistego króliczego przeciwciała przeciw polisacharydowi typu II z koniugatami: fragment polisacharydowy typu II-anatoksyna tężca (fragmenty o średnich masach cząsteczkowych 15, 33 i 51 kilodaltonów) w porównaniu do wiązania z koniugatem natywnego polisacharydu typu II (200 kilodaltonów) z anatoksyną tężca przyjętym jako wzorcowe wiązanie 100 procentowe.

187 822

Figura 2 przedstawia bezpośrednie wiązanie swoistego króliczego przeciwciała przeciw polisacharydowi typu III z koniugatami: fragment polisacharydowy typu III-adatoksyda tężca (fragmenty o średnich masach cząsteczkowych 13, 18, 26, 34 i 48 kilodahonów) w porównaniu do wiązania z komugatem naaywdego polisacharydu typu III (90 kilodalaodów) z anatoksyną tężca przyjętym jako wzorcowe wiązanie 100 procentowe.

Figura 3 przedstawia widmo H-NMr datywdego polisacharydu GBS typu II posiadającego masę cząsteczkową około 200 kDa.

Figura 4 przedstawia widmo H-NMR otrzymanego sposobem według wynalazku fragmentu polisacharydowego GBS typu II, posiadającego masę cząsteczkową około 12 kDa i wykazującego piki protonowe związane z 2,5-adhydro-D-mandoaą.

Figura 5 przedstawia widmo H-NMR datywdego polisacharydu GBS typu III posiadającego masę cząsteczkową około 100 kDa.

Figura 6 przedstawia widmo H-NMR otrzymanego sposobem według wynalazku fragmentu polisacharydowego GBS typu III, posiadającego masę cząsteczkową około 9 kDa i wykazującego piki wodorowe związane z 2,5-adhydro-D-maddoaą.