ES2200067T3 - Fragmentos de polisacaridos antigenicos de tipo ii y tipo iii de streptococcus del grupo b, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-d-manosa, y su vacuna conjugada. - Google Patents

Fragmentos de polisacaridos antigenicos de tipo ii y tipo iii de streptococcus del grupo b, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-d-manosa, y su vacuna conjugada.

Info

Publication number
ES2200067T3
ES2200067T3 ES96918253T ES96918253T ES2200067T3 ES 2200067 T3 ES2200067 T3 ES 2200067T3 ES 96918253 T ES96918253 T ES 96918253T ES 96918253 T ES96918253 T ES 96918253T ES 2200067 T3 ES2200067 T3 ES 2200067T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
type
gbs
polysaccharide
iii
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96918253T
Other languages
English (en)
Inventor
Francis Michon
Dong Catherine
Y. Tai Joseph
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter Healthcare SA
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Healthcare SA filed Critical Baxter Healthcare SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2200067T3 publication Critical patent/ES2200067T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCESO PARA DESPOLIMERIZAR STREPTOCOCCUS DEL GRUPO B DE TIPOS II Y III, LO QUE RESULTA EN FRAGMENTOS DE POLISACARIDOS QUE POSEEN UN EXTREMO REDUCIDO ADECUADO PARA SU CONJUGACION A PROTEINAS. SE DESCUBREN ASIMISMO MOLECULAS CONJUGADAS, VACUNAS Y SU USO PARA INMUNIZAR MAMIFEROS INCLUYENDO HUMANOS.

Description

Fragmentos de polisacáridos antigénicos de tipo II y tipo III de Streptococcus del grupo B, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-D-manosa, y su vacuna conjugada.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a fragmentos de polisacáridos capsulares antigénicos, útiles para conjugarlos con una proteína para crear inmunógenos que produzcan anticuerpos protectores. Más específicamente, la invención se refiere a polisacáridos capsulares de Streptococcus del grupo B (GBS CP) con grupos terminales reductores analizables, a su preparación y su uso para fabricar vacunas conjugadas.
Antecedentes de la invención
Las bacterias GBS son un agente etiológico reconocido para la bacteremia y/o meningitis en niños y para infecciones en adultos. Baker, "Group B Streptococcal Infections" en Advances in Internal Medicine, 25: 475-500 (1980). Consecuentemente, es importante desarrollar ensayos rápidos y definitivos para el diagnóstico de la infección por GBS, y métodos para generar protección frente a GBS, particularmente en lactantes e individuos inmunodeprimidos.
Se sabe que los polisacáridos capsulares de bacterias GBS son importantes para la virulencia de GBS y el desarrollo de la inmunidad protectora. Véase Kasper et al. patente de EE.UU. 5.302.386. Además, los CP de los tipos reconocidos de GBS (I-V) están relacionados químicamente pero son distintos antigénicamente, presentando estructuras repetitivas compuestas por galactosa, glucosa, N-acetil glucosamina y ácido N-acetil-neuramínico (siálico).
Los lactantes y niños pequeños tienen una escasa respuesta inmunógena frente a antígenos polisacáridos. Estas respuestas se caracterizan porque son independientes de las células T y, por tanto, no están asociadas con atributos importantes como la memoria, cambio de isotipo o maduración de afinidad, que son necesarios para conferir protección inmunológica a largo plazo frente a una infección posterior. Para solventar esta carencia de respuesta inmunógena efectiva frente a polisacáridos en lactantes y niños pequeños, la técnica ha desarrollado medios para convertir la respuesta independiente de células T en una respuesta dependiente de células T, acoplando covalentemente antígenos bacterianos polisacáridos a un vehículo de proteína, para formar una molécula conjugada. Véase, Jennings et al, patente de EE.UU. 4.356.170, que se incorpora aquí mediante referencia.
Se han descrito diversos procedimientos en la técnica para conjugar polisacáridos capsulares con proteínas. Para revisión, véase Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10, Conjugate Vaccines, ediciones Volume J.M. Cruse y R.E. Lewis, Jr., 1989. En un método, el polisacárido se somete a una hidrólisis ácida suave, para producir grupos terminales reductores, capaces de reaccionar con la proteína para formar un enlace covalente. Anderson, P.A., Infect. Immun., 39: 233-238 (1983). Sin embargo, los grupos de azúcar terminales que participan en la conjugación con la proteína se encuentran en equilibrio entre un hemiacetal y un aldehído, y, por tanto, se acoplan a la proteína con escasa eficiencia. Para superar la escasa reactividad del azúcar reductor terminal, la técnica cambió a la oxidación suave para introducir grupos aldehído estables en las posiciones terminales de los polisacáridos usados para conjugar con la proteína. Jennings et al, patente de EE.UU. 4.356.170, supra.
Kasper et al. patente de EE.UU. 5.302.386 y la solicitud internacional WO 94/06467, repectivamente, se refieren a vacunas conjugadas de tipo III y II de GBS. Según la patente 5.302.386, se usa la endo-\beta-galactosidasa para escindir la cadena principal de polisacárido a fin de producir productos adecuados para conjugar con la proteína. En la solicitud WO 94/06467 se describe la oxidación de al menos dos grupos de ácido siálico terminales para producir conjugados reticulados.
Los polisacáridos capsulares de GBS de tipo III están compuestos por una cadena principal de unidades pentasacáridas ramificadas repetitivas. Jennings et al., Canadian J. Biochem., 58: 112-120 (1980). Un estudio de polisacáridos de GBS de tipo II describe que el sitio inmunodeterminante natural se localiza en la unión de la cadena lateral con la cadena principal. Jennings et al., Biochemistry, 20: 4511-4518 (1980). La presencia de los residuos terminales de ácido N-acetil-neuramínico de la cadena lateral, según se describió, era crítica para la expresión del inmunodeterminante.
Los métodos previos de despolimerización de polisacáridos II o III de GBS, se basan, bien en métodos enzimáticos costosos, bien en hidrólisis ácida que puede alterar la antigenicidad de los CP debido a la eliminación de los grupos de ácido siálico terminales lábiles. Consecuentemente, se necesitan procedimientos químicos relativamente baratos y suaves que sean efectivos para espolimerizar CP de tipo II y III de GBS, de forma que produzcan fragmentos que sean útiles para producir vacunas conjugadas CP-proteína.
Sumario de la invención
Esta invención se refiere a un método para despolimerizar polisacáridos capsulares (CP) de tipo II (GBS-II) y del tipo III (GBS-III) de Streptococcus del grupo B, mediante escisión desaminativa, para generar productos que terminan con una estructura 2,5-anhidro-D-manosa. Según esta invención, los CP de GBS-II y los CP de GBS-III se tratan con hidróxido sódico y con un reactivo de nitrificación, como nitrito sódico, para despolimerizar los polisacáridos de GBS, para producir fragmentos que tienen un grupo aldehído terminal localizado en el extremo de la cadena principal polisacárida. Los fragmentos de CP resultantes son antigénicos y son útiles también para conjugarlos con la proteína, para producir inmunógenos que son efectivos para producir respuestas inmunitarias protectoras en mamíferos, incluyendo neonatos.
Por tanto, otra realización de esta invención es un método de fabricación de una molécula conjugada para uso como vacuna. El método comprende someter los CP de GBS-II o GBS-III a tratamiento mediante una base y un reactivo que forma una sal de diazonio, para formar un fragmento terminado en un residuo de 2,5-anhidro-D-manosa. El fragmento extremo de 2,5-anhidro-D-manosa se combina a continuación con una proteína y se somete a aminación reductiva, para formar las moléculas conjugadas de la invención. Consecuentemente, otro aspecto de esta invención son moléculas conjugadas de CP de GBS-II y GBS-III, que comprenden fragmentos de CP de GBS-II o GBS-III unidos a una proteína a través de una 2,5-anhidro-D-manosa terminal. Debido a que el proceso de despolimerización de los polisacáridos de tipo II y tipo III de GBS genera fragmentos que tienen un único sitio reactivo en el extremo terminal de la cadena principal, esta invención proporciona un medio para producir moléculas conjugadas, en las que cada cadena polisacárida de tipo II o III de GBS está unida a una única proteína, cada una por una amina secundaria a través del azúcar reductor terminal.
Los conjugados de esta invención son útiles como vacunas activas para inmunizar individuos frente a la infección bacteriana por GBS-II y GBS-I. Asimismo, esta invención proporciona vacunas multivalentes que comprenden polisacáridos derivados de diferentes serotipos o especies de bacterias.
Además, esta invención abarca el suero inmunológico o anticuerpos producidos en respuesta a la inmunización con las moléculas conjugadas de esta invención, y que son útiles como reactivos para detectar la presencia de bacterias de tipo II y III de GBS o como vacunas para proporcionar inmunidad pasiva.
Otra realización de esta invención son métodos y composiciones útiles para separar y/o detectar anticuerpos de tipo II o tipo III de GBS. Según un método de puesta en práctica de esta realización, los fragmentos de polisacáridos preparados según esta invención se inmovilizan sobre un soporte sólido. Combinando una fuente de anticuerpo como suero, con el fragmento de polisacárido unido al soporte sólido, el anticuerpo que se une al fragmento de polisacárido se puede detectar mediante técnicas de inmunoanálisis estándar o separarse del material de partida o suero.
Un objeto de esta invención es proporcionar métodos para fragmentar polisacáridos de tipo II y III de GBS, para producir fragmentos útiles que producen moléculas conjugadas. Otro objeto de esta invención es producir moléculas de polisacárido de tipo II y de tipo III de GBS, que son útiles como vacunas para proteger frente a la infección, y como inmunorreactivos.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1. Unión directa de anticuerpo de conejo anti-polisacárido específico de tipo II, con conjugados de fragmento de polisacárido de tipo II-toxoide del tétanos (con fragmentos de pesos moleculares promedio 15, 33 y 51 kilodaltons), comparada con la unión al conjugado de polisacárido nativo de tipo II (200 kilodaltons)-toxoide del tétanos, tomada como referencia del 100% de unión.
Fig. 2. Unión directa del anticuerpo de conejo anti-polisacárido específico de tipo III, con conjugados de fragmento de polisacárido de tipo III-toxoide del tétanos (con fragmentos de pesos moleculares promedio 13, 18, 26, 34 y 48 kilodaltons), comparada con la unión al conjugado de polisacárido nativo de tipo III (90 kilodaltons)-toxoide del tétanos, tomada como referencia del 100% de unión.
Fig. 3. Espectro H-NMR del polisacárido de tipo II de GBS nativo, que tiene un peso molecular de aproximadamente 200 KDa.
Fig. 4. Espectro de H-NMR del fragmento de polisacárido de tipo II de GBS, que tiene un peso molecular de aproximadamente 12 kDa y muestra los picos protónicos asociados con la 2,5-anhidro-D-manosa preparada según el método de esta invención.
Fig. 5. Espectro H-NMR del polisacárido de tipo III de GBS nativo, que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa.
Fig. 6. Espectro de H-NMR del fragmento de polisacárido de tipo III de GBS, que tiene un peso molecular de aproximadamente 9 KDa y muestra los picos de hidrógeno asociados con la 2,5-anhidro-D-manosa preparada según el método de esta invención.
\newpage
Descripción detallada de la invención
Esta invención se refiere a fragmentos de polisacáridos antigénicos de tipo II y de tipo III de Streptococcus del grupo B, que tienen la siguiente estructura de extremo reductor de 2,5-anhidro-D-manosa:
1
en la que R_{1} es H y R_{2} es una unidad repetitiva de heptasacárido sialilado de fórmula
2
en la que n es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 para el tipo II de GBS; y en la que R_{1} es una unidad repetitiva de pentasacárido sialilado de fórmula
3
en la que n es de aproximadamente 5 a 50 y R_{2} es el disacárido \alphaNeuAc(2-3) \betaD-Galp1- para el tipo III de GBS.
Estos fragmentos se producen, según esta invención, mediante despolimerización de los polisacáridos de tipo II y III de GBS, de mayor peso molecular, que tienen las estructuras mostradas debajo:
4
Tipo II
en la que n para el polisacárido nativo es aproximadamente 200; o la unidad repetitiva para el tipo III de GBS
5
Tipo III
en la que n para el polisacárido nativo es aproximadamente 100.
Según se usa aquí, el término bacterias Streptococcus del grupo B o GBS tiene el mismo significado entendido por los técnicos en la materia, particularmente con referencia a Lancefield, J. Exp. Med., 108: 329-341 (1938) y trabajo posterior que caracteriza más los serotipos del grupo B, p.ej. Russell-Jones, J. Exper. Med., 160: 1476 (1984), hasta incluir específicamente las bacterias designadas taxonómicamente Streptococcus agalactiae.
El procedimiento de esta invención para fragmentar los polisacáridos capsulares de tipo II y III de GBS para producir los nuevos fragmentos de la invención usa condiciones no desnaturalizantes suaves, para obtener fragmentos de polisacáridos de tipo III de GBS y de tipo II de GBS resultantes de la despolimerización química. Estos fragmentos se pueden obtener con elevado rendimiento, haciendo este procedimiento económico para producción de vacunas a gran escala.
Los CP de tipo II y III de GBS se despolimerizan según el método de esta invención, como sigue. Los residuos de 2-desoxi-2N-acetamido-\beta-D-glucopiranosilo de la cadena principal en los CP de tipo II y de tipo III de GBS (Fórmula I), se desacetilan parcialmente en N con una base suave en una disolución acuosa. Ejemplos de bases que son adecuadas para su uso en el procedimiento de esta invención incluyen, pero no están limitadas a soluciones de hidróxido de metal alcalino, por ejemplo, hidróxido sódico o hidróxido potásico, u otras bases como hidróxido amónico, hidracina, carbonato sódico y bicarbonato sódico. A continuación del tratamiento con la base, el residuo de glucosamina resultante (Fórmula II), es entonces susceptible de nitrificación usando un reactivo apropiado como nitrito sódico o ácido nitroso, por ejemplo, para formar un derivado N-nitroso (Fórmula III). La reorganización debida al ataque nucleófilo cerca del anillo de oxígeno sobre el carbono 2, produce la contracción del anillo y la escisión de la unión glucosídica adyacente (Fórmula IV). Esta reacción se ha usado para estudiar la estructura de la heparina y de varios glucosaminoglicanos. Barnett patente de EE.UU. 4.438.261.
(Fórmulas pasan a página siguiente)
6 
\newpage
El grupo aldehído en el residuo de 2,5-anhidro-D-manosa resultante (Fórmula IV) formado en el extremo reductor del fragmento de polisacárido se puede usar directamente, sin manipulación química posterior (p.ej. uso de un brazo espaciador), para unión a través de aminación reductiva a un polímero que contiene un grupo amino, especialmente una proteína.
Más específicamente, para realizar la despolimerización de los polisacáridos de GBS según la invención, la reacción se realiza en un recipiente de tamaño adecuado en una solución acuosa. Para comenzar la reacción, se trata una cantidad apropiada de polisacárido en una solución acuosa, con una base, para desacetilar parcialmente en N el residuo de glucopiranosilo de la cadena principal. En resumen, la reacción se puede realizar en un medio acuoso básico a temperaturas elevadas, por ejemplo aproximadamente de 50ºC a 110ºC, y a un pH de aproximadamente 13 a 14. La cantidad de base se optimiza empíricamente. Preferiblemente, la proporción de base a grupos N-acetilo está entre aproximadamente 10 y 50 meq. Más preferiblemente, la proporción es aproximadamente 20-25 meq. La proporción y extensión de la reacción se puede optimizar ajustando la concentración de la base, la temperatura de reacción o el tiempo de reacción. La extensión de desacetilación en N se puede controlar mediante 'H-NMR.
Para conseguir fragmentos de entre aproximadamente 50 y 60 kDa, el grado de desacetilación en N debe estar entre aproximadamente 20 y aproximadamente 2 por ciento del número total de sitios disponibles. Para parar la reacción de desacetilación, la reacción se puede enfriar, es decir, enfriarla sobre hielo, o acidificarla hasta aproximadamente pH 4. La acidificación se tiene que realizar cuidadosamente para evitar la hidrólisis de los grupos de ácido siálico restantes.
Después, la reacción de nitrificación para formar el aldehído se logra mediante adición de nitrito sódico, u otro reactivo adecuado, como ácido nitroso diluido, al polisacárido desacetilado en N. El reactivo de nitrificación, como nitrito sódico, se añade preferiblemente en exceso molar, comparado con los moles de grupos desacetilados en N. La reacción del polisacárido con el reactivo de nitrificación se realiza a temperaturas frías, por ejemplo aproximadamente 4ºC, con agitación durante aproximadamente 2 horas o hasta la terminación. El alcance de la reacción se puede controlar analizando la presencia de grupos aldehído. Durante el curso de la reacción, la concentración de grupos aldehído debería incrementarse hasta alcanzar una meseta. La terminación de la reacción se puede efectuar diluyendo la reacción y aumentando el pH hasta aproximadamente 7 con una base diluida, como NaOH. La extracción de los reactivos en exceso se puede efectuar mediante diálisis usando procedimientos estándar.
Tras la terminación de la reacción, los fragmentos de polisacárido que tienen un grupo aldehído terminal en el extremo de la cadena principal se pueden medir y recoger usando procedimientos de cromatografía estándar. Los tamaños preferidos para la conjugación con la proteína están entre 5 kDa y 50 kDa para el polisacárido de tipo II de GBS, y entre aproximadamente 5 kDa y 50 kDa para el polisacárido de tipo III de GBS. Los tamaños de mayor preferencia están entre 5 y 20 kDa para el tipo II de GBS y entre 10 y 50 kDa para los polisacáridos de tipo III de GBS. Los fragmentos medidos se pueden usar para reacciones de conjugación, usando los procedimientos de aminación reductiva estándar descritos previamente (véanse por ejemplo la patente de EE.UU. 4.356.170 y la solicitud internacional WO 94/06467), o se pueden almacenar para un uso posterior.
La escisión desaminativa y la conjugación aplicadas al tipo II de GBS se pueden efectuar según la invención, como sigue:
(Fórmulas pasan a página siguiente)
7
El procedimiento de despolimerización del polisacárido de tipo III mediante escisión desaminativa, que genera fragmentos de tipo III antigénicos que se pueden acoplar directamente mediante aminación reductiva a un vehículo de proteína, se ilustra debajo:
8
El componente proteínico de las moléculas conjugadas de la invención, puede ser cualquier proteína o polipéptido tolerado fisiológicamente, de longitud suficiente para provocar una respuesta dependiente de células T. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no están limitados a proteínas o polipéptidos bacterianos, incluyendo la toxina o toxoide del tétanos, materiales de reacción cruzada como CRM_{197}, una proteína recombinante del antígeno \beta-C de Streptococcus del grupo B de tipo Ia/Ib, que no se une a la IgA y proteína recombinante de la membrana externa de clase 3 y (OMP) de Neisseria Meningitides.
La proporción molar de polisacárido a proteína en las moléculas conjugadas de la invención está preferiblemente entre aproximadamente 1 mol y aproximadamente 10 moles de polisacárido por mol de proteína. Más preferiblemente, la proporción está entre 3 y 10 fragmentos de polisacárido por mol de proteína. Se pueden lograr variaciones en la proporción de proteína/polisacárido ajustando la proporción de los componentes de partida en la reacción de conjugación.
Además de proporcionar moléculas conjugadas que comprenden polisacáridos de tipo II o III de GBS conjugados con la proteína, esta invención considera también conjugados multivalentes y sus vacunas, en los que se conjugan diferentes tipos de polisacáridos con una única proteína. Por ejemplo, los polisacáridos de tipos I, II, III, IV o V de GBS pueden estar unidos a la proteína en diversas combinaciones, así como polisacáridos derivados de otras bacterias, como por ejemplo, tipo b de Haemophilus influenzae, o también los tipos A, B o C de Meningococcus. Una combinación preferida sería la de los polisacáridos de tipo II y III de GBS.
Las moléculas conjugadas preparadas según esta invención comprenden típicamente una proteína a la que está unido al menos un polisacárido de tipo II o III de GBS, a través de un único sitio de unión en el extremo terminal de la cadena principal del fragmento de polisacárido. Por tanto, esta invención proporciona la capacidad, si se desea, de producir moléculas conjugadas de tipo II o III de GBS, en las que el componente polisacárido, excepto por un extremo, no está impedido por la proteína. Otros métodos para conjugar polisacáridos de tipo II y III de GBS con proteína a través de los ácidos siálicos terminales de las ramificaciones, pueden originar reticulación y unión del polisacárido a la proteína en una pluralidad de sitios. Esta invención considera también moléculas conjugadas que se pueden obtener usando una combinación de métodos. Por ejemplo, los conjugados sintetizados según la invención, produciendo un único grupo reactivo terminal de 2,5-anhidro-D-manosa, se pueden hacer reaccionar nuevamente con polisacáridos que se han activado en múltiples sitios.
El procedimiento de preparación de vacunas según la invención proporciona vacunas útiles que son importantes para proporcionar protección frente a la infección de tipo II y III de GBS en mamíferos, y en particular en hembras en edad de procrear, neonatos, adultos inmunodeprimidos y niños que presentan riesgo de infección por GBS. Estas vacunas se espera que sean especialmente útiles para administración a mujeres embarazadas, como medio para provocar una respuesta inmunogénica en el feto, previamente al nacimiento.
Las vacunas se administran en cantidades suficientes para provocar una respuesta inmunogénica. Típicamente, se precisa una dosis de entre aproximadamente 1 y 50 \mug de polisacárido para generar tal respuesta. Las dosis se pueden ajustar basándose en el tamaño, peso o edad del individuo que recibe la vacuna. La respuesta de anticuerpos en un individuo se puede medir realizando determinaciones de la titulación de anticuerpos o de la actividad bactericida, y se puede reforzar si es necesario para incrementar la respuesta.
Las vacunas pueden comprender vehículos estándar, tampones o conservantes conocidos por los expertos en la técnica, que sean adecuados para vacunas. Además, se pueden incluir también en la formulación aditivos como alumbre o estearil-tirosina, para incrementar la respuesta inmunogénica.
Los fragmentos de polisacáridos preparados según esta invención son útiles también para preparar diversos inmunorreactivos para uso en inmunoanálisis y separaciones de anticuerpos de tipo II y III de GBS. Por ejemplo, para inmunoanálisis los fragmentos de polisacáridos se pueden inmovilizar, bien directamente, o a través de un conector de proteína, como en los conjugados de esta invención, a un soporte sólido. El soporte sólido se puede usar entonces en diversos sistemas de inmunoanálisis conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo radioinmunoanálisis y análisis ELISA, para detectar la presencia de anticuerpos frente a bacterias de tipo II o III de GBS. Tales análisis se pueden usar para diagnosticar la presencia de infección en individuos, analizando la presencia de anticuerpos de tipo II o III de GBS en el suero.
Para uso en química de separación, los fragmentos de polisacáridos se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido, para preparar una columna de afinidad. En una realización preferida, el fragmento de polisacárido se conjuga primero con una proteína según el método de esta invención, y el conjugado resultante se acopla luego a una matriz de soporte. Los métodos de acoplamiento de la proteína a columnas de afinidad son conocidos para los expertos en la técnica. Los soportes comunes para columnas de afinidad se preparan a partir de agarosa y están disponibles en el comercio, p.ej. Sepharose activada (Pharmacia). Tales columnas de afinidad se pueden usar luego para separar anticuerpos de tipo II o III de GBS de fuentes como el suero. Después, los anticuerpos se pueden separar del suero combinando los fragmentos de polisacáridos inmovilizados, con suero sospechoso de contener anticuerpos de tipo II o III de GBS, bajo condiciones que permitan a los anticuerpos unirse a los fragmentos inmovilizados. A continuación, el anticuerpo unido puede, bien detectarse usando técnicas de análisis convencionales, o separarse y recuperarse del fragmento de polisacárido, después de la separación de los restantes componentes del suero, a partir del soporte inmovilizado.
La invención se describirá a continuación, haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos Ejemplo 1 Despolimerización con base y contracción de anillo mediada por nitrito sódico, para producir fragmentos de tipo II y III de GBS terminados en 2,5-anhidro-D-manosa Tipo II de GBS
Los CP de GBS de tipo II nativos (75 mg), de peso molecular promedio aproximadamente 200.000, se disolvieron en 3 ml de NaOH 0,5 N, y la solución se dividió luego en 3 partes (1 ml cada una). Las muestras (S1-S3) se calentaron a 70ºC durante 60, 90 y 180 min, respectivamente, y después se enfriaron en un baño de agua helada. Se añadieron 125 mcl de ácido acético glacial a cada muestra, para llevar su pH hasta 4. Después de la adición de 200 mcl de NaNO_{2} al 5% (p/v), las muestras se mantuvieron con agitación a 4ºC durante 2 horas. Las muestras S1-S3 se diluyeron a continuación hasta 5 ml con agua desionizada y su pH se ajustó hasta 7 con NaOH 0,5 N. Los reactivos en exceso se eliminaron mediante diálisis por diafiltración con agua desionizada, a través de una membrana de ultrafiltración Diaflo (Amicon YM 10), y las soluciones se liofilizaron. Se obtuvieron tres fragmentos de polisacáridos de tipo II (II-1-II-3).
\newpage
Tipo III de GBS
Los CP de GBS de tipo III nativos (125 mg), de peso molecular promedio aproximadamente 100.000, se disolvieron en 5 ml de NaOH 0,5 N, y la solución se dividió en 5 partes (1 ml cada una). Las muestras (S1-S5) se calentaron a 70ºC durante 60, 90, 120, 180 y 240 min, respectivamente, y luego se enfriaron en un baño de agua helada. Se añadieron 125 mcl de ácido acético glacial a cada muestra, para llevar su pH hasta 4. Después de la adición de 200 mcl de NaNO_{2} al 5% (p/v), las muestras se mantuvieron con agitación a 4ºC durante 3 horas. Las muestras S1-S5 se diluyeron a continuación hasta 5 ml con agua desionizada y su pH se ajustó hasta 7 con NaOH 0,5 N. Los reactivos en exceso se eliminaron por diálisis mediante diafiltración con agua desionizada, a través de una membrana de ultrafiltración Diaflo (Amicon YM 10), y las soluciones se liofilizaron. Se obtuvieron cinco fragmentos de polisacáridos de tipo III 
\hbox{(III-1-III-5).}
Medición de fragmentos de CP
El peso molecular promedio (avMw) de cada fragmento se estimó mediante HPLC, usando un columna de exclusión por tamaños Superose-12 (Pharmacia) con una serie de dextrano (Pharmacia) de peso molecular promedio que variaba de 10.000 a 2.000 daltons. El volumen vacío (Vo) y el volumen total (Vt) se determinaron con Dextran 2.000 y azida sódica, respectivamente. El peso molecular promedio (avMw) de cada fragmento, determinado mediante este método es el siguiente:
Fragmento Kav (intervalo) AvMw Kilodaltons (intervalo)
II-1 0,23 (0,13-0,34) 51 (99-26)
II-2 0,30 (0,19-0,40) 33 (68-17)
II-3 0,43 (0,30-0,50) 15 (33-9)
III-1 0,21 (0,11-0,27) 41 (81-28)
III-2 0,26 (0,17-0,38) 30 (53-13)
III-3 0,29 (0,18-0,40) 24 (50-12)
III-4 0,37 (0,23-0,44) 14 (36-9)
III-5 0,41 (0,31-0,47) 11 (21-8)
Análisis físico-químico de los fragmentos de polisacáridos
Se estableció la integridad estructural de cada fragmento con respecto a su polisacárido nativo original, mediante espectroscopía H-NMR unidimensional de alta resolución a 500 MHz, en un espectrómetro Bruker AM500. La comparación de los espectros de H-NMR de los fragmentos de tipo II y de tipo III, con los de sus polisacáridos nativos respectivos indicaba que no se había producido ningún cambio estructural durante los procesos químicos y, lo más importante, que los residuos de ácido siálico terminales se habían conservado durante el tratamiento de nitrificación.
Ejemplo 2 Conjugación de los haptenos de polisacáridos de tipo II y de tipo III con el toxoide del tétanos
El toxoide del tétanos (SSI, Dinamarca) se purificó primero hasta su forma monómera mediante filtración en gel a través de una columna de Biogel-A (Laboratorios Biorad). El monómero del toxoide del tétanos (TTm) así obtenido (150.000 Daltons) se disolvió en tampón fosfato 0,2 M, pH 7,5, a una concentración de 25 mg/ml y se añadió a polisacáridos de tipo II (II-1 a II-3) o de tipo III (III-1 a III-5) de GBS y cianoborohidruro sódico NaCNBH_{3} recristalizado, en las cantidades mostradas debajo:
\newpage
PS (mg) TTm(mg) NaCNBH_{3} (mg) Volumen final (\mul)
II-1 10 4 8 200
II-2 10 4 8 200
II-3 11 4,5 9 220
III-1 18 7,2 14 360
III-2 10 4 8 200
III-3 7,2 3 6 150
III-4 6,4 2,5 5 130
III-5 8 4 8 130
Las mezclas de reacción se incubaron después a 37ºC durante 4 días. El transcurso de la reacción de conjugación se midió mediante HPLC de pequeñas alícuotas de las mezclas de reacción analizadas sobre Superose-12 (Pharmacia). Los conjugados se purificaron mediante cromatografía de exclusión molecular sobre una columna de Superdex G-200 (Pharmacia), usando timerosal al 0,01% que contenía PBS, como eluyente. Las fracciones que eluían desde la columna se midieron mediante un refractómetro diferencial R403 de Waters y mediante espectroscopía a 280 nm. Las fracciones que contenían los conjugados se mezclaron y filtraron en condiciones de esterilidad a través de una membrana de Millipore de 0,22 \mu m y se analizaron sus contenidos de proteína y ácido siálico, mediante el método de Bradford (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72: 248-254) y mediante el análisis del resorcinol, respectivamente. La cantidad promedio total de carbohidrato en cada molécula de conjugado individual de tipo II y de tipo III, se calculó tomando los contenidos de ácido siálico y multiplicándolos por un factor de corrección de 4 y 3,3, respectivamente, basado en la composición de su unidad repetitiva. Los análisis para cada conjugado individual son como se muestran en la Tabla I, debajo:
TABLA I
Conjugado Cadenas de PS Proteína CHO % de CHO en % de cadenas de
AvMw (mcg/ml) (mcg/ml) conjugado PS
II-1-TT 51.000 120 15 11 0,4
II-2-TT 33.000 140 42 23 1,4
II-3-TT 15.000 110 26 19 2,4
III-1-TT 41.000 190 70 27 1,2
III-2-TT 30.000 140 61 29 1,8
III-3-TT 24.000 100 39 28 2,0
III-4-TT 14.000 70 17 20 2,0
III-5-TT 11.000 80 21 21 3,0
La especificidad inmunoquímica de los anticuerpos policlonales de conejo para los conjugados de polisacárido de tipo II y de tipo III, comparada con las observadas para los epítopes de polisacáridos capsulares nativos, se midió mediante ELISA y se describe en las Figuras 1 (tipo II de GBS) y 2 (tipo III de GBS).
\newpage
Ejemplo 3 Respuesta inmunogénica de ratones hembra a la inmunización con vacunas conjugadas de tipo II y tipo III de GBS-toxoide del tétanos a. Inmunizaciones
Se inmunizaron subcutáneamente grupos de 10 ratones hembra Swiss Webster (4-6 semanas de edad) con 2 \mug, bien de polisacárido nativo de tipo II o III, o de sus correspondientes conjugados con toxoide del tétanos. Las vacunas se adsorbieron sobre hidróxido de aluminio (Alhydrogel; Superfos, Dinamarca) a una concentración de 1 mg de aluminio elemental/ml de timerosal al 0,01% que contenía PBS 10mM. Los ratones recibieron la vacuna en los días 0, 21 y 42 y, finalmente, se desangraron en el día 52. Los sueros se recogieron y se almacenaron a 70ºC.
b. ELISAs y actividad opsónica de antisueros conjugados
ELISAs: Se sensibilizaron placas de microtitulación (placas de ELISA de Nunc Polysorb), añadiendo 100 \mul de conjugado de polisacárido (PS) de tipo II o III nativo-HSA (1 \mug/ml) en PBS con azida al 0,02% por pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC durante una hora. Las placas se lavaron con Tween 20 al 0,05% que contenía PBS (PBS-T) y se bloquearon con BSA al 0,5% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se llenaron luego con 100 \mul de diluciones sucesivas a la mitad en PBS-T, de antisuero de ratón, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Tras lavar con PBS-T, las placas se llenaron con 100 \mul de IgG (H+L) anti-ratón de cabra, marcada con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories) y luego se lavaron cinco veces con PBS-T. Finalmente, se añadieron 50 \mul de sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) a cada pocillo y, después de la incubación de las placas durante 10 min. a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de H_{3}PO_{4} 1M. Las placas se leyeron a 450 nm con un lector de microplacas Molecular Device Amex, usando 650 nm como longitud de onda de referencia.
Las titulaciones anticuerpo específico de polisacárido de tipo III de ratones vacunados con polisacárido de tipo III nativo o con conjugados de fragmento de polisacárido de tipo III-toxoide del tétanos, se muestran en la Tabla II.
TABLA II
Peso molecular promedio del Titulación ELISA en el día 52* Titulación OP^{+}
fragmento
13.000 2.500 405
18.000 2.500 610
26.000 3.000 1.050
34.000 3.000 520
48.000 12.000 2.600
PS nativo < 100 < 100
* Titulación media de mezcla de sueros de 10 ratones.
+ Opsonofagocitolisis de mezcla de sueros en el día 52.
Las titulaciones de anticuerpo específico del polisacárido de tipo II, de ratones vacunados con polisacárido nativo de tipo II o con conjugados de fragmento de polisacárido de tipo II-toxoide del tétanos, se muestran en la Tabla III.
TABLA III
Peso molecular promedio del fragmento Titulación ELISA en el día 52* Titulación OP^{+}
15.000 123.000 9.300
33.000 15.000 1.400
51.000 2.600 <500
PS nativo <500 <100
* Titulación media de mezcla de sueros de 10 ratones.
+ Opsonofagocitolisis de mezcla de sueros en el día 52.
Actividad opsónica de antisueros conjugados: La actividad opsónica de antisueros de ratón frente a los conjugados de fragmento de polisacárido de tipo II o III de GBS-toxoide del tétanos, se analizó en un análisis in vitro de opsonofagocitolisis, usando la línea celular HL-60 de leucemia promielocítica humana (nº ATCC CCL 240). En resumen, se mezclaron 200 ufc de células de la cepa 18RS21 de tipo II o células de la cepa M781 de tipo III de GBS, a igual volumen con anticuerpos séricos y se incubaron con agitación durante 15 min. a 35ºC, en una incubadora de CO_{2} al 5%. Se añadieron a la mezcla complemento de crías de conejo y células HL-60 (5x10^{5}), cultivadas 5 días en presencia de DMF 90 mM, y se incubó a 37ºC durante 1 hora con agitación. Se extrajeron alícuotas para cultivo cuantitativo. Se determinaron las titulaciones extrapolando la dilución de anticuerpo correspondiente al cincuenta por ciento de bacterias vivas.
c. Experimentos de unión a ELISA
Se efectuó la unión directa de anticuerpos de conejo específicos anti-polisacárido capsular de tipo II o de tipo III (obtenidos de conejos hiper-inmunizados con células completas de GBS de tipo II o de tipo III), con los diversos conjugados del toxoide del tétanos, como sigue:
Se sensibilizaron placas de microtitulación con 100 \mul por pocillo de diversos tamaños de los conjugados de polisacárido de tipo II o de tipo III de GBS-toxoide del tétanos (1 \mu/ml) en timerosal al 0,01% que contenía PBS. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se trataron como se describe anteriormente, y se llenaron con 100 \mul de diluciones a la mitad sucesivas de antisuero de conejo diluido en PBS-T. Las restantes etapas de ELISA son como se describió anteriormente, excepto por la adición de IgG anti-conejo de cabra, marcada con peroxidasa (H&L) (Kirkegaard & Perry Laboratories).
La unión de los anticuerpos de conejo específicos de polisacárido de tipo II o III de GBS, con los diversos conjugados del toxoide del tétanos se expresa en porcentaje relativo a la unión con los conjugados de polisacárido nativo de tipo II o III-toxoide del tétanos, como se ilustra en las Figs. 1 y 2, respectivamente.
Ejemplo 4 Inmunización de ratones hembra para proporcionar protección frente a la infección por GBS en ratones neonatos
Se inyectaron i.p. ratones CD-1 hembra (n = 3), de 6-8 semanas de edad, de Charles River Laboratoires, Wilmington, MA, con dos dosis de vacunas conjugadas (que contenían 2 \mug (equilibrados para polisacárido 1 \mug/ratón) de fragmento de polisacárido (PM promedio aproximadamente 11.000 Daltons) en Alhydrogel al 1,3% (Superfos Biosector a/s, lote nº 2043), volumen total 0,5 ml I.P.) en los días 0 y 21. Los ratones testigo (n=3) recibieron vacunas que contenían 2 \mug de GBS CP de tipo III nativos. Los ratones se cruzaron en el día 21 y las crías (<36 h de edad) se estimularon i.p. con dosis letales de bacterias GBS M781 de tipo III (6x10^{5} UFC). La supervivencia se valoró 48 h después de la estimulación bacteriana.
Como se muestra en la Tabla IV, la vacunación de los ratones hembra con conjugado de tipo III de GBS-toxoide del tétanos (TT) antes del cruce, confiere protección frente al mismo en 94% de las crías nacidas posteriormente.
TABLA IV
Vacuna Nº de crías (Nº de madres) Nº (%) superviviente a las 48 h
GBS III-TT 33 (3) 31 (94)^{+}
GBS III-PS 39 (3) 0 (0)
Solución salina 34 (3) 0 (0)
+ Significativo estadísticamente (P<0,0001) respecto al grupo de referencia
Refs.: Lawrence C. Madoff et al, Infection and Immunity, 60: 4989-4994 (1992)
\hskip0.8cm Rodewald, A.K. et al, Journal of Infectious Disease, 166: 635-639 (1992)

Claims (28)

1. Un procedimiento para despolimerizar polisacáridos de tipo II y de tipo III de Streptococcus del Grupo B (GBS), para producir fragmentos que tienen la siguiente estructura terminal reductora de 2,5-anhidro-D-manosa
9
en la que R_{1} es H y R_{2} es una unidad repetitiva de heptasacárido sialilado de fórmula
10
en la que n es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 para el tipo II, y en la que R_{1} es una unidad repetitiva de pentasacárido sialilado, de fórmula
11
en la que n es de aproximadamente 5 a 50 y R_{2} es el disacárido \alphaNeuAc (2-3) \beta-D-Galp1- para el tipo III,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar un polisacárido de tipo III de GBS o de tipo II de GBS a despolimerizar, y hacer reaccionar el polisacárido en un medio acuoso con una base para formar un producto polisacárido desacetilado parcialmente en N; despolimerizar el producto desacetilado en N con un agente de nitrificación para formar los fragmentos de tipo II o de tipo III de GBS, y recuperar los fragmentos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la base se selecciona del grupo formado por hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido amónico, carbonato sódico, bicarbonato sódico e hidracina.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el reactivo de nitrificación es nitrito sódico o ácido nitroso.
4. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la base es hidróxido sódico y el reactivo de nitrificación es nitrito sódico.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polisacárido se obtiene de bacterias de tipo II de GBS o de bacterias de tipo III de GBS.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que los fragmentos de tipo II de GBS resultantes o los fragmentos de tipo III de GBS resultantes tienen un peso molecular de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa.
7. Un fragmento de polisacárido de tipo II o de tipo III de GBS, preparado según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. El fragmento de polisacárido de tipo II o de tipo III de GBS de la reivindicación 7, en el que la base para desacetilación en N es hidróxido sódico y el reactivo de nitrificación es nitrito sódico.
9. Un fragmento de polisacárido de tipo II o de tipo III de GBS, que tiene la siguiente estructura terminal reductora de 2,5-anhidro-D-manosa,
12
en la que R_{1} es H y R_{2} es una unidad repetitiva de heptasacárido sialilado de fórmula
13
en la que n es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 para el tipo II, y en la que R_{1} es una unidad repetitiva de pentasacárido sialilado, de fórmula
14
en la que n es de aproximadamente 5 a 50 y R_{2} es el disacárido \alphaNeuAc (2-3) \beta-D-Galp1- para el tipo III.
10. El fragmento de polisacárido de tipo II o de tipo III de GBS de la reivindicación 9, en el que el peso molecular está en el intervalo de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa.
11. Una molécula conjugada que comprende al menos un fragmento de polisacárido seleccionado de fragmentos de polisacáridos de tipo II y de tipo III de GBS, y en la que el fragmento está unido covalentemente a una proteína, en la que la molécula conjugada tiene la estructura
15
en la que R_{1} y R_{2} tienen el mismo significado que en la reivindicación 9.
12. La molécula conjugada de la reivindicación 11, en la que la proteína está derivada de una bacteria.
13. La molécula conjugada de la reivindicación 12, en la que la proteína se selecciona del grupo formado por el toxoide del tétanos, toxoide de la difteria, CRM_{197}, una proteína recombinante del antígeno \beta-C de Streptococcus del Grupo B de tipo Ia/Ib, que no se une a IgA, y una proteína de la membrana externa de clase 3 de Neisseria meningitides.
14. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el fragmento de polisacárido es un polisacárido de tipo II o III de GBS, la proteína es el toxoide del tétanos y el peso molecular del fragmento de polisacárido está entre aproximadamente 5 kDa y 50 kDa.
15. La molécula conjugada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que la proporción molecular de polisacárido a proteína está entre aproximadamente 1 y 10.
16. La molécula conjugada de la reivindicación 15, en la que la proporción molecular de polisacárido a proteína está entre 3 y 10.
17. La molécula conjugada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, que comprende fragmentos de tipo II y de tipo III de GBS.
18. La molécula conjugada de la reivindicación 17, en la que la proteína es una proteína recombinante del antígeno \beta-C de Streptococcus del Grupo B de tipo Ia/Ib, que no se une a IgA.
19. Una composición de vacuna que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18.
20. Un antisuero que comprende anticuerpos producidos en un mamífero inmunizado con el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18.
21. El antisuero de la reivindicación 20, en el que los polisacáridos del conjugado son fragmentos de polisacáridos de tipo II de GBS.
22. El antisuero de la reivindicación 20, en el que los polisacáridos del conjugado son fragmentos de polisacáridos de tipo III de GBS.
23. Uso de la molécula conjugada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 para la preparación de una vacuna para inmunizar a un mamífero frente a la infección por el tipo II o el tipo III de GBS.
24. El uso de la reivindicación 23, en el que el mamífero es una mujer embarazada o un neonato.
25. Un método para separar anticuerpos de tipo II o III de GBS del suero, que comprende:
(a)
inmovilizar un fragmento de polisacárido preparado según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, sobre un soporte sólido;
(b)
combinar el soporte sólido con polisacárido unido, con suero, bajo condiciones que permitan la unión de los anticuerpo de tipo II o III de GBS al fragmento de polisacárido unido; y
(c)
separar el suero restante del soporte sólido.
26. Un reactivo de inmunoanálisis que comprende un fragmento de polisacárido de tipo II o III de GBS preparado según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento de polisacárido está inmovilizado sobre un soporte sólido.
27. El método de la reivindicación 25 o el reactivo de inmunoanálisis de la reivindicación 26, en el que el fragmento de polisacárido es de tipo II de GBS.
28. El método de la reivindicación 25 o el reactivo de inmunoanálisis de la reivindicación 26, en el que el fragmento de polisacárido es de tipo III de GBS.
ES96918253T 1995-06-07 1996-06-06 Fragmentos de polisacaridos antigenicos de tipo ii y tipo iii de streptococcus del grupo b, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-d-manosa, y su vacuna conjugada. Expired - Lifetime ES2200067T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/481,883 US6284884B1 (en) 1995-06-07 1995-06-07 Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof
US481883 1995-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2200067T3 true ES2200067T3 (es) 2004-03-01

Family

ID=23913768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96918253T Expired - Lifetime ES2200067T3 (es) 1995-06-07 1996-06-06 Fragmentos de polisacaridos antigenicos de tipo ii y tipo iii de streptococcus del grupo b, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-d-manosa, y su vacuna conjugada.

Country Status (15)

Country Link
US (3) US6284884B1 (es)
EP (1) EP0830380B1 (es)
JP (1) JP4001625B2 (es)
KR (1) KR100431236B1 (es)
AT (1) ATE236194T1 (es)
AU (1) AU706479B2 (es)
CA (1) CA2223080C (es)
DE (1) DE69627149T2 (es)
ES (1) ES2200067T3 (es)
HU (1) HUP9900919A3 (es)
IL (3) IL136125A (es)
NO (1) NO975546L (es)
PL (1) PL187822B1 (es)
WO (1) WO1996040795A1 (es)
ZA (1) ZA964822B (es)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1311550A2 (en) * 2000-08-22 2003-05-21 National Research Council Of Canada Synthesis of complex carbohydrates
SG165981A1 (en) 2000-10-27 2010-11-29 Chiron Srl Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
AU2003257003A1 (en) * 2002-07-30 2004-02-16 Baxter Healthcare S.A. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
US20070053924A1 (en) * 2002-08-26 2007-03-08 Herve Tettelin Conserved and specific streptococcal genomes
PT1551357E (pt) * 2002-09-13 2014-10-10 Novartis Vaccines & Diagnostic Vacina contra os estreptococos do grupo b
ES2317043T3 (es) * 2003-06-23 2009-04-16 Baxter International Inc. Proteinas portadoras para vacunas.
US7709009B2 (en) * 2003-07-31 2010-05-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for streptococcus pyogenes
US8945589B2 (en) * 2003-09-15 2015-02-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae
JP2008508320A (ja) 2004-07-29 2008-03-21 カイロン コーポレイション Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅのようなグラム陽性細菌に対する免疫原性組成物
AU2005294275B2 (en) * 2004-10-08 2012-09-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic and therapeutic compositions for Streptococcus pyogenes
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
EP1937304A2 (en) * 2005-08-24 2008-07-02 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Zwitterionization of capsular saccharides
ATE522541T1 (de) * 2006-06-09 2011-09-15 Novartis Ag Bakterielle adhäsine konformere
WO2008108830A2 (en) * 2006-10-30 2008-09-12 Novartis Ag Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes
CA2698157C (en) * 2007-09-11 2016-10-11 University Of Guelph Novel polysaccharide immunogens from clostridium difficile
ES2561483T3 (es) 2007-09-12 2016-02-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antígenos mutantes de GAS57 y anticuerpos de GAS57
KR101773114B1 (ko) 2007-12-21 2017-08-30 노파르티스 아게 스트렙토라이신 ｏ의 돌연변이 형태
EP2411039A4 (en) * 2009-03-23 2015-05-06 Brigham & Womens Hospital Glycoconjugate VACCINES
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
US9149541B2 (en) 2011-07-08 2015-10-06 Novartis Ag Tyrosine ligation process
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
CN104080479B (zh) 2011-11-07 2019-11-05 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包括spr0096和spr2021抗原的运载体分子
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
CN104717977A (zh) 2012-10-03 2015-06-17 诺华股份有限公司 免疫原性组合物
FI2968427T3 (fi) * 2013-03-12 2023-03-01 Konjugaatti sienisoluseinämän polysakkarideihin kohdentuvien vasta-aineiden indusoimiseksi
EP3613755A1 (en) 2013-07-11 2020-02-26 Novartis AG Lysine-specific chemoenzymatic protein modifications using microbial transglutaminase
BE1024634B1 (fr) 2016-04-05 2018-05-14 Gsk Vaccines S.R.L. Compositions immunogenes
US20230210975A1 (en) 2020-06-12 2023-07-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial immunization using nanoparticle vaccine
WO2023111826A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial immunization using qbeta hairpin nanoparticle constructs

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3352773A (en) 1964-09-16 1967-11-14 Gillette Res Inst Inc Method of degrading polysaccharides using light radiation and a watersoluble metal or nitrogen base salt of nitrous or hyponitric acid
US3922260A (en) 1973-08-24 1975-11-25 Quintin P Peniston Process for depolymerization of chitosan
US4207414A (en) 1978-08-16 1980-06-10 President And Fellows Of Harvard College Polysaccharide antigens
US4324887A (en) * 1978-08-16 1982-04-13 President And Fellows Of Harvard College Type II group B Streptococci polysaccharide
US4500519A (en) * 1978-11-06 1985-02-19 Choay S.A. Mucopolysaccharides having biological properties, preparation and method of use
US4439422A (en) 1980-01-02 1984-03-27 Research Corporation Group B Streptococcus antigens and vaccines
US4413057A (en) 1980-04-14 1983-11-01 Merck & Co., Inc. Group B streptococcal capsular polysaccharides
PT72812B (en) 1980-04-14 1983-02-16 Merck & Co Inc Process for preparing group b streptococcal capsular polysccha-rides
US4438261A (en) 1980-05-19 1984-03-20 Riker Laboratories, Inc. Anticoagulant substance
US4356263A (en) 1980-06-09 1982-10-26 President And Fellows Of Harvard College Method of making a polysaccharide vaccine
US4367222A (en) 1980-06-09 1983-01-04 President And Fellows Of Harvard College Immune globulin specific to Group B streptococci
US4367223A (en) 1980-06-09 1983-01-04 President And Fellows Of Harvard College Vaccine against Group B streptococci
US4367221A (en) 1980-06-09 1983-01-04 President And Fellows Of Harvard College Immunization against Group B streptococci
US4284537A (en) 1980-07-03 1981-08-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate of streptococcal M protein peptide vaccine
US4425330A (en) 1981-05-20 1984-01-10 Cornell Research Foundation, Inc. Bovine mastitis vaccine and method for detecting efficacy thereof
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4619828A (en) 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
US4757134A (en) 1982-12-02 1988-07-12 The Rockefeller University IgA binding protein
EP0175261B1 (en) 1984-09-12 1991-12-11 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
FR2581877B1 (fr) 1985-05-14 1987-12-18 Louvain Universite Catholique Conjugue constitue d'une adhesine de paroi de s. mutans, de nature proteique et d'un polysaccharide de s. mutans, sa preparation et son utilisation notamment dans des vaccins anti-caries
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5302386A (en) 1986-04-16 1994-04-12 Brigham And Women's Hospital, Inc. Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture
DE3750139T2 (de) 1986-04-16 1994-10-06 Brigham & Womens Hospital Bakterielle antigene, antikörper, impfstoffe und deren herstellung.
EP0419462A4 (en) 1987-07-17 1991-07-17 Xoma Corporation Improved immunotoxin therapies utilizing purified ricin a-chain species
JP2871822B2 (ja) 1989-08-29 1999-03-17 玉造株式会社 末端に２，５―アンヒドロマンニトール基または２，５―アンヒドロマンノース基を有するキチン・キトサンオリゴマーおよびその製造方法
IL95578A (en) 1989-09-15 1998-08-16 Gen Hospital Corp A vaccine made from polysaccharide and protein
AU6538490A (en) 1989-09-18 1991-04-18 Brigham And Women's Hospital Enzymatic generation and recovery of group b streptococcus type iii capsular oligosaccharides
ES2071288T3 (es) 1989-12-14 1995-06-16 Ca Nat Research Council Vacuna mejorada de conjugado de polisacarido de meningococos.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
WO1992017588A2 (en) 1991-03-29 1992-10-15 Ervin Faulmann METHOD FOR PRODUCTION OF AN IgA BINDING PROTEIN DERIVED FROM GROUP B STREPTOCOCCI
FR2682388B1 (fr) 1991-10-10 1995-06-09 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal.
US5352588A (en) 1991-12-24 1994-10-04 Rockefeller University Streptococcal immunoglobulin a binding protein encoded by emmL2.2
EP0646179A4 (en) * 1992-02-04 1996-10-02 Quidel Corp PROCESS FOR SIMPLIFIED EXTRACTION OF BACTERIAL ANTIGENS USING DEHYDRATE REAGENTS.
ZA937034B (en) 1992-09-24 1995-06-23 Brigham & Womens Hospital Group B streptococcus type II and type V polysaccharide-protein conjugate vaccines
IL107458A0 (en) 1992-11-02 1994-02-27 Gen Hospital Corp Conjugate vaccine against group b streptococcus
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US5595740A (en) * 1994-05-16 1997-01-21 University Of Florida Cloning of non-IgA FC binding forms of the group B streptococcal beta antigens
EP1058331A4 (en) 1998-12-22 2004-07-07 Mitsubishi Electric Corp ELECTROLYTIC SOLUTION FOR CELLS AND CELLS MADE WITH SUCH A SOLUTION

Also Published As

Publication number Publication date
PL323822A1 (en) 1998-04-27
WO1996040795A1 (en) 1996-12-19
EP0830380A1 (en) 1998-03-25
KR19990022747A (ko) 1999-03-25
JPH11507964A (ja) 1999-07-13
AU6095396A (en) 1996-12-30
NO975546L (no) 1998-02-06
PL187822B1 (pl) 2004-10-29
JP4001625B2 (ja) 2007-10-31
HUP9900919A3 (en) 2000-04-28
NO975546D0 (no) 1997-12-02
US6284884B1 (en) 2001-09-04
US20020031526A1 (en) 2002-03-14
US6602508B2 (en) 2003-08-05
EP0830380B1 (en) 2003-04-02
DE69627149T2 (de) 2003-12-04
CA2223080C (en) 2007-03-20
HUP9900919A2 (hu) 1999-06-28
AU706479B2 (en) 1999-06-17
IL118603A0 (en) 1996-10-16
IL136125A (en) 2006-08-01
IL118603A (en) 2000-12-06
CA2223080A1 (en) 1996-12-19
ATE236194T1 (de) 2003-04-15
DE69627149D1 (de) 2003-05-08
US6372222B1 (en) 2002-04-16
ZA964822B (en) 1997-01-07
KR100431236B1 (ko) 2004-09-16
IL136125A0 (en) 2001-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2200067T3 (es) Fragmentos de polisacaridos antigenicos de tipo ii y tipo iii de streptococcus del grupo b, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-d-manosa, y su vacuna conjugada.
JP2736248B2 (ja) 莢膜ポリマーフラグメントの製造方法
EP0939647B2 (en) Neisseria meningitidis serogroup b glycoconjugates and methods of using the same
JP4097691B2 (ja) Ｃ群髄膜炎菌に対するワクチン
US8168195B2 (en) Vaccines against Escherichia coli O157 infection
US20060134142A1 (en) Modified streptococcal polysaccharides and uses thereof
PT667787E (pt) Vacinas de conjugado de polissacarido-proteina de estreptococos do grupo b do tipo ii e tipo v
AU767047B2 (en) Vaccines against (escherichia coli) O157 infection
US9616139B2 (en) Conjugating amines
Liao et al. Characterization of a human monoclonal immunoglobulin M (IgM) antibody (IgMBEN) specific for Vi capsular polysaccharide of Salmonella typhi
Szu et al. Vaccines for prevention of enteric bacterial infections caused by Salmonellae
Schneerson et al. VACCINES FOR PREVENTION OF ENTERIC BACTERIAL INFECTIONS CAUSED BY SALMONELLAE
by Different Group B