DE60127421T2

DE60127421T2 - Innen-kern oligosaccharide epitopes aus lipopolysacchariden von haemophilus influenza als vakzinen in der prophylaktischen behandlung von haemophilus influenzae infektionen

Info

Publication number: DE60127421T2
Application number: DE60127421T
Authority: DE
Inventors: James C. Ottawa RICHARDS; Andrew Gloucester COX; Richard Moxon; Derek Institute of HOOD; Elke K. H. Schweda; Martin Mansson
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-27
Publication date: 2007-11-29
Also published as: JP2004506086A; ES2284681T3; WO2002016440A2; CA2420477A1; WO2002016440A9; EP1313771A2; ATE357461T1; WO2002016440A8; AU2001285633A1; DE60127421T8; DE60127421D1; EP1313771B1; WO2002016440A3; US20050153057A1; US7364739B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft definierte Mutationen in der biosynthetischen Maschinerie zur Expression von Lipopolysacchariden (LPS) in Haemophilus influenzae. Die Erfindung betrifft ebenfalls das Verwenden von Konjugaten der LPS aus den so erhaltenen mutierten Stämmen, um eine heterologe Immunantwort gegen ein breites Spektrum an krankheitsverursachenden H. influenzae-Stämmen hervorzurufen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Impfstoffe zur Prävention von bakteriellen Infektionen umfassend Kern-Lipopolysaccharide von Haemophilus influenzae.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bei Haemophilus influenzae handelt es sich um die weltweit bedeutendste Krankheitsursache. Es sind sechs kapselförmige Serotypen ("a" bis "f") sowie eine unbestimmte Anzahl von nicht kapselförmigen (nicht typisierbaren) Stämmen von H. influenzae bekannt. Kapselförmige Stämme des Typs b sind mit invasiven Krankheiten assoziiert, einschließend Meningitis und Lungenentzündung, während es sich bei dem nicht typisierbaren H. influenzae (NTHi) um eine primäre Ursache für Mittelohrentzündung bei Kindern und für Atemwegsinfektionen bei Erwachsenen handelt. Bei der Mittelohrentzündung handelt es sich um eine verbreitete Kinderkrankheit, die das häufige Aufsuchen von Kinderärzten in den Vereinigten Staaten erklärt (Stool et al., Pediatr. Infect. Dis. Suppl.: 8: S11-S14, 1989).
Die Entwicklung eines Impfstoffs für NTHi-Krankheiten hat sich aufgrund des fehlenden Verständnisses der Antigene, welche die schützende Immunität verleihen, als schwierig erwiesen. Bestrebungen hinsichtlich der Entwicklung eines NTHi-Impfstoffs konzentrierten sich bisher auf Zelloberflächenantigene wie Proteine der äußeren Membran und Pili oder Fimbrien (Kyd et al., Infect. Immun., 63: 2931-2940, 1995; Deich et al., Vaccine Res., 2: 31-39, 1995).
Neueste Fortschritte auf den Gebieten der Molekulargenetik, der molekularen Strukturanalyse sowie der Immunchemie stellen leistungsfähige Hilfsmittel bereit, welche die Identifikation von Kohlenhydratstrukturen als in Frage kommende Impfstoffantigene ermöglichten.
Gram-negative Bakterien weisen eine äußere Membran auf, die sich aus Komponenten einschließend Proteine, Lipoproteine, Phospholipide und Glykolipide zusammensetzt. Die Glykolipide umfassen in erster Linie Endotoxin-Lipopolysaccharide (LPS). Bei LPS handelt es sich um Moleküle, welche sich zusammensetzen aus: a) einem Lipid A-Anteil, der aus einem Glukosamindisaccharid besteht, welches mit Phosphatgruppen und langkettigen Fettsäuren in Ester- und Amidbindungen substituiert ist; b) einem Kernpolysaccharid, das an einem Lipid A befestigt ist mittels eines Zuckers mit acht Kohlenstoffen, Kdo (Ketodesoxyoctonat), sowie Heptose, Glukose, Galaktose und N-Acetylglukosamin; sowie, gegebenenfalls, c) O-spezifischen Seitenketten, bestehend aus sich wiederholenden Oligosaccharideinheiten, die je nach den Gattungen und Spezies der Bakterien, Mannose, Galaktose, D-Glukose, N-Acetylgalaktosamin, N-Acetylglukosamin, L-Rhamnose und eine Didesoxyhexose (Abequose, Colitose, Tyvelose, Paratose, Trehalose) enthalten können. LPS, dem die sich wiederholenden O-Seitenketten fehlen, wird manchmal als kurzkettiges Lipopolysaccharid oder als Lipooligosaccharid (LOS) bezeichnet. In der vorliegenden Anmeldung schließt der Begriff Lipopolysaccharid (oder LPS) ein kurzkettiges Lipopolysaccharid und Lipooligosaccharid (und LOS) ein.
Es wird angenommen, dass sich die hauptsächlichen antigenen Determinanten von gramnegativen Bakterien in der komplexen Kohlenhydratstruktur von LPS befinden. Diese Kohlenhydratstrukturen unterscheiden sich signifikant voneinander, sogar unter verschiedenen Spezies der gleichen Gattung von gram-negativen Bakterien, und zwar primär aufgrund von Variationen in einer oder mehrerer der Zuckerzusammensetzungen, der Sequenz von Oligosacchariden, der Bindung zwischen den monomeren Einheiten der Oligosaccharide und zwischen den Oligosacchariden selbst, sowie Substitutionen/Modifikationen der Oligosaccharide (insbesondere des terminalen Oligosaccharids). Aus diesem Grund war die Entwicklung eines Impfstoffs mit einer Breitspektrumwirkung gegen Haemophilus influenzae (insbesondere gegen NTHi) erfolglos.
Bei LPS handelt es sich um eine bakterielle Komponente, die aufgrund der antigenen Determinanten ("Epitope"), die sich in ihren Kohlenhydratstrukturen befinden, Potential als ein Impfstoff-Immunogen aufweist. Die chemische Natur von LPS beeinträchtigt jedoch dessen Verwendung in Impfstoff-Formulierungen; d.h. aktive Immunisierung mit LPS ist untragbar, aufgrund der inhärenten Toxizität des Lipid A-Anteils in manchen Tieren. Die durch Lipid A des LPS (direkt oder indirekt) induzierten pathophysiologischen Effekte im Blutkreislauf schließen ein: Fieber, Leukopenie, Leukozytose, die Shwartzman-Reaktion, disseminierte intravaskuläre Koagulation, Fehlgeburt sowie, bei höheren Dosen, Schock und Tod.
Es wurde bereits festgestellt, dass Impfstoffe, die sich aus kapselförmigen Polysacchariden zusammensetzen, wirksam bei der Prävention von menschlichen Krankheiten sind, welche durch die homologen verkapselten Bakterien verursacht werden. Diese Kohlenhydratantigene sind häufig nur schwach immunogen aufgrund einer fehlenden von T-Zellen abhängigen Antwort im Menschen. Durch Konjugieren des spezifischen Polysaccharidantigens an einen geeigneten Proteinträger kann jedoch die Immunogenität des Kohlenhydratantigens in Patienten, die nicht auf das Polysaccharid alleine ansprechen, in hohem Maße verstärkt werden. Glykokonjugatimpfstoffe, die auf dem spezifischen kapselförmigen Polysaccharid von H. influenzae des Typs b (Hib), z. B. ProHiBit^TM und ActHib^TM basieren, erwiesen sich bereits als erfolgreich bei der Kontrolle von invasiven Hib-Krankheit bei Kleinkindern. Kapselförmige Polysaccharid-Protein-Konjugat-Hib-Impfstoffe bieten keinen Schutz gegen Krankheiten, die von nicht kapselförmigen (nicht typisierbaren) Stämmen von H. influenzae verursacht werden, (d.h. gegen durch NTHi verursachte Krankheiten), da sie nur gegen Infektionen schützen, die durch H. influenzae-Stämme verursacht werden, welche die Kapsel des Typs b tragen.
Bei Lipopolysaccharid (LPS) handelt es sich um ein bedeutendes NTHi-Zelloberflächenantigen. Es wurde bisher nur gefunden, dass LPS aus Haemophilus influenzae Lipid A- sowie Oligosaccharid (OS)-Komponenten enthält. Da die Lipid A-Komponente des LPS toxisch ist, muss sie vor der Konjugation an einen immunogenen Träger detoxifiziert werden, wie zuvor besprochen.
Barenkamp et al. (Pediatr. Infect. Dis. J., 9: 333-339, 1990) zeigten, dass LOS die Produktion von gegen NTHi gerichteten bakteriziden Antikörpern stimuliert. McGehee et al. (Am. Journal Respir. Cell Biol., 1: 201-210, 1989) zeigten, dass passive Immunisierung von Mäusen mit gegen LOS aus NTHi gerichteten monoklonalen Antikörpern die Lungenreinigung von NTHi verstärkte.
Green et al. (Vaccines, 94: 125-129, 1994) offenbaren einen NTHi-Impfstoff, der ein Konjugat von NTHi-Oligosaccharid und dem mutanten nicht toxischen Diphtherieprotein CRM.sub.197 umfasst. Der Lipid A-Rest wurde mittels einer Behandlung mit Säure, gefolgt von einer Derivatisierung des daraus resultierenden OS mit Adipinsäuredihydrazid (ADH) sowie einer Kopplung an CRM.sub.197 von LOS entfernt. Trotz der von Barenkamp et al. aufgezeigten Tatsache, dass LOS die Produktion von bakteriziden Antikörpern gegen NTHi stimulierte, wurde festgestellt, dass die Konjugate von Green et al. nur schwach immunogen waren, nachdem sie in Mäuse injiziert wurden. Darüber hinaus riefen die Konjugate keine bakteriziden Antikörper gegen NTHi hervor.
Gu et al. (US-Patent Nr. 6,207,157) befasst sich mit der Detoxifikation von isoliertem NTHi-LOS mittels der Entfernung von Ester-gebundenen Fettsäuren davon, so dass es möglicherweise zur Impfstoff-Herstellung geeignet ist. Gu beschreibt jedoch keine weiteren Modifikationen oder erwünschte chemische Attribute von NTHi-LOS.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist kein Impfstoff verfügbar, der einen Breitspektrumschutz gegen Infektionen bietet, die durch Haemophilus influenzae verursacht werden. Es besteht daher ein Bedarf an einem Impfstoff mit einer Breitspektrumwirkung gegen Haemophilus influenzae, insbesondere NTHi.
Um ein Antigen zur Impfstoff-Entwicklung nutzen zu können, müssen vier essentielle Kriterien erfüllt sein. Das heißt, das immunogene Epitop muss sein:

1. genetisch stabil;
2. in allen klinisch relevanten Stämmen der gesamten Spezies konserviert;
3. (in vitro und in vivo) für Wirts-Immunmechanismen zugänglich; sowie
4. in der Lage, schützende Antikörper in vivo zu induzieren.

Es besteht ein Bedarf, LPS-Kohlenhydratepitope von H. influenzae, insbesondere NTHi, zu identifizieren, die diese Kriterien erfüllen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft Immunität-vermittelnde B-Zell-aktivierende Moleküle, die von H. influenzae-Lipopolysaccharide (LPS) abgeleitet sind, wobei diese Moleküle eines oder mehrere Epitope eines konservierten inneren Kernoligosaccharidanteils des Lipopolysaccharids umfassen. Ebenfalls offenbart wird eine Strategie zum Identifizieren und Charakterisieren besagter Epitope, welche repräsentativ für LPS sind, das von H. influenzae-Stämmen über das ganze Spektrum der krankheitsverursachenden Isolate exprimiert wird. Ebenfalls offenbart werden Verfahren zum Gewinnen solcher Epitope, sowohl synthetisch als auch mittels gentechnischer Methoden, sowie Konjugate von Molekülen, welche besagte Epitope mit geeigneten Trägern umfassen, gegebenenfalls in Liposomformulierungen.
In einem Aspekt stellt die Erfindung einen isolierten Lipopolysaccharidrest nach Anspruch 1 bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche den Lipopolysaccharidrest der Erfindung nach Anspruch 1 umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, welcher spezifisch den Lipopolysaccharidrest von Anspruch 1 bindet.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung bereit, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, welche durch Infektion mit Haemophilus influenzae verursacht wird.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Glykokonjugat, welches den Lipopolysaccharidrest der Erfindung nach Anspruch 17 umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Ernte eines kreuzreaktiven Antikörpers gegen H. influenzae bereit, welches umfasst: (a) das Erzeugen von Antikörpern gegen den zuvor beschriebenen Lipopolysaccharidrest, (b) das Testen solcher Antikörper gegen eine Vielzahl von Haemophilus influenzae-Stämmen, und (c) das Auswählen der Antikörper, die kreuzreaktiv sind.
Ebenfalls von der Erfindung bereitgestellt werden Haemophilus influenzae-Stämme Rd lic1lpsA und 1003 lic1lpsA, welche jeweils unter den Zugangsnummern ISAC 250801-1 und ISAC 250801-2 hinterlegt sind.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ebenfalls ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Lipopolysaccharidrests nach Anspruch 12.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ebenfalls bereit eine Impfstoffzusammensetzung, die eines oder mehrere erfindungsgemäße Glykokonjugate sowie ein Adjuvans umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
A ist ein Diagramm des konservierten Triheptosylrests des inneren Kerns eines Haemophilus influenzae-Lipopolysaccharids.
B ist eine strukturelle Verifikation der Form RM118 mit hohem Molekulargewicht.
C ist ein Schema für die Konjugation eines Impfstoffs an ein Trägerprotein.
1. Die elektrophoretischen Gelmigrationsmuster nach T-SDS-PAGE von LPS, aufgereinigt aus RM118-Wildtyp und Stämmen, die in mutmaßlichen Glykosyltransferasegenen mutiert sind. RM118 entspricht dem Wildtyp-LPS und die isogenen Mutanten sind durch das relevante LPS-Gen angegeben.
2. Negativionen-ESI-MS des O-deacylierten LPS aus der lpsA-Mutante von H. influenzae-RM118, worin die doppelt und dreifach geladenen Ionen der Haupt-Hex1-Glykoform (Struktur 3) gezeigt sind.
3. ¹H-NMR-Spektrum des O-deacylierten LPS aus der lpsA-Mutante von H. influenzae-RM118, worin die α-anomere Protonenregion zwischen 5,0 und 6,0 ppm gezeigt ist. Anomere Resonanzen, die dem 3,4-disubstituierten Hep(HepI), 6-PEtn-substituierten Hep(HepII), terminalen Hep(HepIII) sowie dem phosphorylierten α-GlcN in der Lipid-A-Region entsprechen, sind angezeigt.
4. Kapillarelektrophoretische Analyse der LgtD-Aktivität in dem H. influenzae-Stamm RM118. Panel A, Spur 1 ist ein komplettes Reaktionsgemisch unter Verwendung des 100.000 xg-Pellets eines Sonikats als Enzymquelle; Spur 2 ist ähnlich dem Reaktionsgemisch in 1, mit der Ausnahme, dass UDP-GalNAc fehlt; Spur 3 ist ein komplettes Reaktionsgemisch aus der Mutante RM118:lgtD; Spur 4 ist ähnlich der Spur 3, mit der Ausnahme, dass UDP-GalNAc fehlt. Der Peak A ist eine Verunreinigung in dem FCHASE-P^K-Präparat, Peak b ist FCHASE-Globotetraose, Peak c ist FCHASE-P^K. Panel B, Die Spur 1 ist das TLC-gereinigte Produkt aus einer Reaktion, wie sie für Panel A, Spur 1 beschrieben wurde. Spur 2 ist das gleiche Material wie Spur 1, nur mit β-Hexosaminidase behandelt.
5. Negativionen-ESI-MS der dreifach geladenen molekularen Ionenregion des O-deacylierten LPS aus der lgtF-Mutante von H. influenzae-RM118. Aus Hex2 (β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp), Hex3 (α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp) sowie Hex3·HexNAc (β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp) entstandene Peaks sind angezeigt.
6. Eine schematische Darstellung der Struktur von LPS aus dem H. influenzae-Stamm RM118, basierend auf den Ergebnissen der Analyse von Risberg et al., (16). Der vorgeschlagene Wirkungsort bei der LPS-Biosynthese von im Rahmen dieser Studie charakterisierten Loci sind dargestellt durch auf die relevante Saccharidbindung weisenden Pfeile. Phasenvariable Loci sind unterstrichen. In der LPS-Struktur dargestellt: KDO, 2-Keto-3-Desoxyoctulosonsäure; Hep, L-Glycero-D-Manno-Heptose; Glc, D-Glukose; Gal, D-Galaktose; GalNAc, N-Actylgalaktosamin; PEtn, Phosphoethanolamin; P, Phosphat; Pcho, Phosphocholin. Für die Heptosereste, von oben nach unten aufgelistet: Heptose I, Heptose II, dann Heptose III.
7. Gene, die an der Kettenverlängerung aus dem inneren Kern von LPS aus dem H. influenzae-Stamm Rd^– beteiligt sind. Die Gene orf3 und lic2b in dem lic2-Locus kontrollieren Kettenverlängerung von HepII in Stämmen des Typs b: diese Gene fehlen im Stamm Rd^-. LicI kontrolliert die Aufnahme von PCho.
8: Ein Teil des Negativionen-ESI-MS-Spektrums von O-deacyliertem LPS aus dem NTHi-Stamm 486. Die vorgeschlagenen Zusammensetzungen der hauptsächlichen Glykoformen sind angezeigt. Natriumaddukte sind durch einen Stern (*) angezeigt.
9. Struktur der hauptsächlichen Hex-LPS-Glykoform, beobachtet in NTHi 285.
10. Die vorläufige Struktur der hauptsächlichen LPS-Glykoform in NTHi 1158.
11. Das Biogel-P-4-Chromatogramm von LPS (100 mg) von NTHi 176 nach milder saurer Hydrolyse. Angezeigt sind Fr. 1 (1 mg), Fr. 2 (10 mg) sowie Fr. 3 (6,4 mg).
12. 270 MHz-¹H-NMR-Spektren von Fr. 2, abgeleitet von NTHi 175 (a) und Fr. 3 (b).
13. Teile des 500 MHz sD NOESY-Spektrums von Fr.2 von NTHi 176.
14 Strukturen von Oligosacchariden, abgeleitet von NTHi 176 LPS.
14. Strukturen von Oligosacchariden, abgeleitet von NTHi 176 LPS.
15. Struktur der hauptsächlichen NeuAc-enthaltenden LPS-Glykoform von NTHi 486.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Lipopolysaccharid (LPS) ist ein essentielles und charakteristisches oberflächenexponiertes Antigen von H. influenzae. (Wie zuvor besprochen, umfassen die Begriffe Lipopolysaccharid und LPS, wie hierin verwendet, kurzkettige Lipopolysaccharide und Lipooligosaccharide (LOS).) H. influenzae-Stämme exprimieren heterogene Populationen von LPS mit niedrigem Molekulargewicht, die eine extensive antigene Vielfalt unter multiplen Oligosaccharidepitopen aufweisen können. Die vom Anmelder hierin beschriebenen LPS-Kohlenhydratstrukturen von H. influenzae können eine Quelle schützender Antigene bereitstellen, wenn sie dem humanen Immunsystem in einer geeigneten Form präsentiert werden, z. B. als ein Proteinkonjugat oder in einer Liposomformulierung. Antikörper gegen bestimmte NTHi-LPS zeigten in vitro eine bakterizide Aktivität (Sun et al., Vaccine 18: 1264-1272). Eine neuerliche Studie (Gu et al., US-Patent Nr. 6,207,157) deutete darauf hin, dass Immunisierung mit auf LPS basierenden Konjugaten das Auftreten von NTHi-induzierter Mittelohrentzündung aufgrund eines homologen Stamms in einem Tiermodell reduzieren kann. In einer Studie des Anmelders erwies sich LPS nützlich als ein Impfstoffkandidat, da überraschenderweise oberflächenexprimierte Kohlenhydratantigene identifiziert wurden, welche Oligosaccharidepitope aufweisen, die genetisch und physiologisch stabil sind, die über das gesamte Spektrum klinisch relevanter Stämme konserviert sind, und die dem Wirts-Reinigungs-Mechanismus zugänglich sind.
Die Kohlenhydratregionen von H. influenzae-LPS-Molekülen stellen Targets für die Erkennung durch Wirts-Immunantworten bereit. Es ist bekannt, dass die Expression von bestimmten Oligosaccharidepitopen zur Pathogenese von H. influenzae-Infektionen beiträgt. Die Bestimmung der Struktur ist entscheidend für das Verständnis der Biologie von H. influenzae-LPS und seiner Rolle in der bakteriellen Virulenz. H. influenzae-LPS umfasst ein heterogenes Gemisch von Molekülen, welche aus einem variablen Oligosaccharidrest und einer membranverankernden Lipid A-Komponente bestehen (Zamze, S. E., und Moxon, E. R. (1987), J. Gen. Microbiol. 133: 1443-1451). Basierend auf den hierin beschriebenen Experimenten wurde ein Strukturmodell für Haemophilus-LPS entwickelt, das aus einem konservierten Triheptosylrest des inneren Kerns besteht, welcher über einen phosphorylierten Ketodesoxyoctonoatrest an eine Lipid A-Komponente gebunden ist. In jedem vom Anmelder bisher untersuchten Stamm besteht dieser Triheptosylrest aus dem nachfolgenden Strukturelement
L-(α)-D-Hepp-(1→2)-L-(α)-D-Hepp-[β-D-Gicp-(1→4)]-(1→3)-L-α-D-Hepp-(1→5)-Kdo
Zusätzlich ist in jedem vom Anmelder bisher untersuchten Stamm der 1,2-gebundene Heptoserest (HepII) an der 6-Position mit einem Phosphoethanolaminrest substituiert.
Jeder der Heptosereste innerhalb der inneren Kernregion kann eine Stelle zur Elongation durch Hexose-enthaltende Oligosaccharidketten oder zur Befestigung von Nicht-Kohlenhydrat-Substituenten bereitstellen. Veröffentlichte Daten (H. Masoud et al., Biochem. 36: 2091-2103, 1997; Risberg et al., Eur. J. Biochem., 261: 171-180, 1999) deuten darauf hin, dass der distale Heptoserest (HepIII) in diesem konservierten Rest im inneren Kern durch einen β-D-Glcp- oder β-D-Galp-Rest an der O-2-Position substituiert werden kann. Substitutionen sind ebenfalls möglich an HepII, spezifisch durch eine α-D-Glukose oder eine substituierte α-D-Glukose an der 3-Position. Der β-D-Glukoserest, der 1,4 an den proximalen Heptoserest (HepI) gebunden ist, kann selbst durch eine β-D-Glukose, eine β-D-Galaktose, eine Heptose (einschließend L-Glycero-D-Manno-Heptose und D-Glycero-D-Manno-Heptose) oder Oligosaccharide davon, weiter substituiert werden. Zusätzlich zu diesen Zuckerresten können Oligosaccharid-Kettenverlängerungen β-D-Galaktose, β-D-Glukosamin, β-D-Galaktosamin und 5-N-Acetylneuraminsäure (Sialsäure) umfassen.
Der Grad der Substitution und der Kettenverlängerung aus dem Triheptosylrest variiert innerhalb eines Stammes sowie zwischen den Stämmen (Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A., Krajcarski, D. und Richards, J. C., (1996) Biochem. 36: 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem., 261: 171-180). Phosphat-enthaltende Substituenten, die freie Phosphatgruppen (P), Phosphoethanolamin (PEtn), Pyrophosphoethanolamin (PPEtn) und Phosphocholin (PCho) einschließen, tragen zu der strukturellen Variabilität dieser Moleküle bei. Darüber hinaus tragen Estersubstituenten (einschließend O-Acetyl und O-Glycyl) ebenfalls zur strukturellen Variabilität von LPS bei. Es sind andere Modifikationen von LPS möglich, wie Addition von Sialsäureresten. Sialylierte Oligosaccharide sind für gewöhnlich im Gewebe von Säugern vorhanden und es wird angenommen, dass diese Modifikation die Mimikry humaner Gewebestrukturen verbessert.
Detaillierte strukturelle Studien von LPS aus definierten Mutationen des Typ-b-Stamms RM7004 (Schweda, E. K. M., Hegedus, O. E., Borrelli, S., Lindberg, A. A., Weiser, J. W., Maskell, D. J., und Moxon, E. R. (1993) Carbohydr. Res. 246: 319-330; Schweda, E. K. H., Jansson, P.-E., Moxon, E. R. und Lindberg, A. A. (1995) Carbohydr. Res. 272: 213-224), von transformierten Varianten des von Typ d abgeleiteten Stammes RM118 (Risberg, A., Schweda, E. K. H. und Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243: 701-707; Risberg, A., Alvelius, G. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 265: 1067-1074) sowie Transposonmutanten des Typ b Stammes A2 (Phillips, N. J., McLaughlin, R., Miller, T. J., Apicella, M. A. und Gibson, B. W. (1996) Biochem. 35: 5937-5947) liefern weitere Beweise für das Vorhandensein eines gemeinsamen Heptose-enthaltenden Trisaccharidrests im inneren Kern von H. influenzae-LPS. Es wurde bereits zuvor die Struktur einer Globotetraose (β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp) berichtet (Risberg et al., Eur. J. Biochem. 261: 171-180, 1999), die LPS aus dem H. influenzae-Stamm RM118 enthält (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180), dem Stamm (Rd), für den die komplette Genomsequenz bestimmt wurde (Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F., Kerlavage, A. R., Butt, C. J., Tomb, J.-F., Dougherty, B. A., Merrick, J.
M., Mc Kenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fields, C., Gocayne, J. D., Scott, J., Shirley, R., Liu, L.-I., Glodek, A., Kelley, J. M., Weidman, J. F., Phillips, C. A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D., Utterback, T. R., Hanna, M. C., Nguyen, D. T., Saudek, D. M., Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritchman, J. L., Fuhrmann, J. L., Geoghagen, N. S. M., Gnehm, C. L., McDonald, L. A., Small, K. V., Fraser, C. M., Smith, H. O. und Venter, J. C. (1995) Science 269: 496-512). In dieser Studie wurden drei Haupt-Populationen von LPS-Glykoformen identifiziert, die alle eine PCho→6-β-d-Glcp-Gruppe von Hep, die am Kdo-Rest befestigt ist (HepI), enthalten, sich jedoch in der Länge der Oligosaccharidketten der distalen Hep(HepIII) des inneren Kernelements unterschieden. Zusätzlich zu den LPS-Glykoformen, die eine vollständig assemblierte Globotetraose-Seitenkette exprimieren, wurden sequentiell verkürzte Glykoformen charakterisiert, die Globosid-(α-D-Galp-(1→4)-β D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp) und Laktose-(β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp) enthalten (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180).
Die Verfügbarkeit der kompletten Genomsequenz des H. influenzae-Stamms Rd ermöglichte eine umfassende Studie von multiplen biosynthetischen LPS-Loci in repräsentativen Hi-Stämmen.
Nicht typisierbare Stämme wurden von Prof. Eskola als Teil einer finnischen Gruppenstudie der Otitis media erhalten, bei denen es sich in der Hauptsache um Isolate handelt, die aus dem Innenohr von Kindern erhalten wurden. Diese Stämme sind eingehender in D. W. Hood et al., Mol. Microbiol. 33:679-792, 1999 beschrieben. Es wurden 102 NTHi-Otitis media-Stämme an Richard Goldstein in Boston gesandt, um in eine Studie zur Diversität von über 600 verkapselten H. influenzae und NTHi-Stämmen, die über einen Zeitraum von 35 Jahren weltweit erhalten wurden, mittels Ribotypisierungsanalyse integriert zu werden. Als aus den Ergebnissen der Ribotypisierung ein Dendrogramm gezeichnet wurde, fand man heraus, dass die NTHi-Otitis media-Isolate in fast allen der Zweige vorhanden waren. Die 25 repräsentativen Stämme wurden aus den das gesamte Dendrogramm überspannenden Zweigen ausgewählt und repräsentieren daher die bekannte mit der Spezies H. influenzae assoziierte Diversität. Unter diesen 25 Stämmen waren auch einige, die aus dem gleichen Cluster ausgewählt wurden, um eine Bewertung der Diversität von eng miteinander verwandten Isolaten zu ermöglichen.
Viele vorhergesagte Genfunktionen wurden mit bestimmten Schritten in der Synthese des LPS durch Analyse der LPS-Struktur aus den geeigneten Mutantenstämmen korreliert (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R. Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). Über die genetische Basis für die Expression der Globotetraosestruktur wurde zuvor nicht berichtet.
Wie in einem der Beispiele beschrieben, wandte der Anmelder eine strukturelle Fingerabdruck-Strategie an, um die Strukturen von LPS, die aus einer Reihe definierter Mutanten in biosynthetischen LPS-Genen in dem H. influenzae-Stamm RM118 erhalten wurde, zu bestimmen und zu vergleichen. (Bezüglich einer Beschreibung des Stamms RM118, siehe Risberg et al., 1999, supra.) Mit der Untersuchung von LPS aus Stämmen, in denen spezifische Gene inaktiviert sind, liefert der Anmelder den endgültigen Beweis, der zur Identifikation der Glykosyltransferasen führt, die an der Biosynthese der inneren Kernregion des LPS-Moleküls beteiligt sind. Der Anmelder identifizierte ebenfalls Gene, die, wie weiter unten beschrieben, an der Assemblierung der sialylierten Laktoseseitenkette beteiligt sind. Darüber hinaus wurden die Transferasefunktionen von Genen, die an der Addition von α-2,3-gebundenem Neu5Ac (lic3A), α-1,4-gebundenem Galp (lgtC) und β-1,3-gebundenem GalpNAc (lgtD) beteiligt sind, um der Globotriose bzw. Globotetraose Strukturen zu verleihen, in enzymatischen Assays mit synthetischen Akzeptoren eindeutig bestimmt. Dies ist die erste Studie zum Identifizieren einer genetische Blaupause für die Biosynthese eines LPS-Oligosaccharidrests für einen Stamm von H. influenzae.
In unserer Untersuchung des inneren Kerns des H. influenzae-LPS schlugen Versuche, Kdo, den ersten an das Lipid A addierten Zucker zu entfernen, wiederholt fehl; vermutlich, da Kdo zum Vervollständigen der Lipid A-Synthese erforderlich und daher wahrscheinlich essentiell für die Lebensfähigkeit der Zelle ist. Die Kdo-Transferasefunktion von kdtA wurde anhand von Komplementationsexperimenten in E. coli gezeigt (White, K. A. und Raetz, C. R. H. (1998) FASEB J. 12, L44). Die Studien des Anmelders deuten darauf hin, dass es sich bei opsX, rfaF und orfH um die Gene handelt, welche die Enzyme kodieren, die die ersten, zweiten und dritten Heptosen (HepI, HepII und HepIII) zu dem Kdo addieren, um den inneren Kern zu bilden. opsX weist eine gewisse Homologie zu den Heptosyltransferasen der enterischen Bakterien auf (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22:951-965) und entspricht einem Gen, das verantwortlich für die Addition von HepI zu Kdo ist. Die rfaF-Mutante weist ein funktionelles opsX-Gen auf und ihr LPS verfügt über eine einzelne Hep, welche an das Kdo-Lipid A gebunden ist. Das rfaF-Gen von RM118 (Rd) weist eine Homologie zu anderen Heptosyltransferasen auf (Allen, A. G., Isobe, T. und Maskell, D. J. (1998) J. Bacteriol. 180: 35-40). LPS aus RM118orfH, welches funktionelle opsX und rfaF-Gene aufweist, umfasst Strukturen, die zwei Heptosereste enthalten (Strukturen 1 und 2). Die Daten zu den Strukturanalysen von LPS aus RM118opsX-, rfaF- und orfH-Mutanten stimmen mit denen überein, die mit den selben Mutationen in den Typ-b-Stämmen RM153 (auch bekannt als Stamm Eagan) und RM7004 erhalten wurden (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). In den Typ-b-Stämmen werden opsX, rfaF und orfH als die Gene vorgeschlagen, die die HepI-, HepII- beziehungsweise HepIII-Transferasen kodieren.
Der Anmelder hat gezeigt, dass das LPS aus H. influenzae den zuvor erwähnten Triheptosylrest im inneren Kern aufweist, in welchem jeder Heptoserest einen Punkt für die Elongation durch Oligosaccharidketten bereitstellt (Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A., Krajcarski, D. und Richards, J. C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180). Jedes der Gene lpsA, lic2A, lic3A, lgtC und lgtF kodiert Glykosyltransferaseenzyme, die an der Oligosaccharidelongation beteiligt sind.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass das lpsA-Genprodukt eine Rolle bei der Kontrolle der Oligosaccharid-Kettenverlängerung von HepIII spielt. Eine Mutation im lpsA-Gen bringt ein verkürztes LPS hervor, in welchem HepIII keine Oligosaccharid-Kettenverlängerungen aufweist. ESI-MS-Analyse des von RM118lpsA abgeleiteten O-deacylierten LPS zeigte eine Pcho-enthaltende Glykoform an, die einen einzelnen Hexoserest als die hauptsächliche LPS-Spezies enthält (Struktur 2), was bestätigt, dass HepI in der Abwesenheit von Hexoseverlängerung aus HepIII substituiert werden kann. Die lic2A-, lgtC- und lgtD-Mutanten, die ein funktionelles lpsA-Gen enthalten, sind in der Lage, einen β-Glcp-Rest zu einer 1,2-Verbindung zu addieren, um die Kettenverlängerung aus HepIII zu initiieren (Tabelle 4). Bei lpsA handelt es sich um ein Homolog eines Gens, das eine Glykosyltransferase in Pasteurella haemolytica kodiert (Potter, M. D. und Lo, R. Y. (1995) FEMS Microbiol. Lett. 129:75-81), dessen Protein eine Homologie zu der Gruppe von Galaktosyltransferasen aufweist, die durch Lic2A und LgtB aus Haemophilus beziehungsweise Neisseria typisiert sind. Im Stamm RM153 wurde ebenfalls gefunden, dass LPS aus einer lpsA-Mutante keinerlei Kettenverlängerung ab der dritten Heptose aufweist (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22:951-965). Darüber hinaus bestätigte der Anmelder, dass LpsA-Mutanten in einigen NTHi-Stämmen keine Kettenverlängerungen ab HepIII aufweisen. Daher ist LpsA die Transferase für die Addition des ersten Zuckers an HepIII bei der LPS-Biosynthese von H. influenzae.
Die RM118lic2A-Mutante zeigte eine Pcho-enthaltende Hex2-Glykoform als eine hauptsächliche LPS-Spezies (Struktur 4) und RM118lgtC, welches ein funktionelles lic2A-Gen enthält, bildet LPS aus, das eine Laktoseseitenkette bei HepIII enthält (Struktur 5). Dies ist in Übereinstimmung mit der Beteiligung des lic2a-Gens bei der Addition der β-D-Galp-Einheit in einer 1,4-Verbindung an den terminalen β-D-Glcp-Rest, der an HepIII befestigt ist. Es wurde gezeigt, dass Lic2A-Homologe in den Typ-b-Stämmen, RM153 und RM7004, an der Expression des Digalaktosid-enthaltenden P^K-Epitops beteiligt sind (wobei das Globosid-Trisaccharid die Struktur α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp aufweist). Die Rolle von lic2A bei der phasenvariablen Expression dieses Epitops wurde bereits zuvor demonstriert (High, N. J., Deadman, M. E. und Moxon, E. R. (1993) Mol. Microbiol. 9: 1275-1282). Homologievergleiche mit anderen Datenbanksequenzen unterstützen die Funktion von Lic2A als eine β-Galaktosyltransferase. Es ist ein wichtiger Umstand, dass es eine signifikante Homologie zu den LgtB- und LgtE-Proteinen aus Neisseria aufweist, von denen beide Galaktosyltransferasen sind (Wakarchuk, W., Martin, A., Jennings, M. P., Moxon, E. R. und Richards, J. C. (1996) J. Biol. Chem. 271: 1916-1917).
Eine Strukturanalyse von LPS aus einem RM118-Stamm, mutiert in lgtC, bestätigte den Verlust von α-D-Galp, welches die α-Galaktosyltransferasefunktion für dieses Gen unterstützt. Es wurde gezeigt, dass es sich bei einem Homolog dieses Gens in N. meningitidis um eine α-Galaktosyltransferase handelt (Gotschlich, E. C. (1994) J. Exp. Med. 180: 2181-2190; White, K. A. und Raetz, C. R. H. (1998) FASEB J 12, L44; Wakarchuk, W. W., Cunningham, A. M., Watson, D. C. und Young, N. M. 1998. Role of paired basic residues in the expression of active recombinant galactosyltransferases from the bacterial pathogen Neisseria meningitidis. Protein Eng. 11: 295-302; Wakarchuk et al., 1998, Protein Engineering). lgtC aus H. influenzae weist eine assoziierte Tetranukleotidwiederholung (5'-GACA-3') genau innerhalb des 5'-Endes des Leserahmens (44) auf, und trägt daher zum variablen Phänotyp des Oligosaccharids in RM118-LPS bei. Entsprechend sind die lgtD-Mutante und der Elternstamm, die ein funktionales lgtC-Gen enthalten, dazu in der Lage, ein α-D-Galp zu einer 1,4-Verbindung an das terminale β-D-Galp des Laktoseepitops zu addieren (Struktur 6). Die Funktion von LgtC wurde bestätigt, indem die α-Galaktosyltransferaseaktivität mit dem rekombinanten LgtC-Protein und einem synthetischen FCHASE-Lac-Akzeptor gezeigt wurde. Daraus folgt, dass das lgtC-Gen die spezifische α-Galaktosyltransferase für die Synthese des α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp der RM118-Hex4-LPS-Glykoform kodiert (6).
Bei dem lgtD-Gen aus H. influenzae handelt es sich um ein Homolog von zwei Neisseria-Genen, nämlich lgtA und lgtD, die GlcNAc beziehungsweise GalNAc zu N. gonorrhoeae-LPS addieren (Gotschlich, E. C. (1994) J. Exp. Med. 180: 2181-2190). Es wurde gezeigt, dass es sich bei dem lgtA-Genprodukt um eine Glykosyltransferase in N. meningitidis handelt (Wakarchuk, W., Martin, A., Jennings, M. P., Moxon, E. R. und Richards, J. C. (1996) J. Biol. Chem. 271: 1916-1917). Es liegt eine signifikante Homologie vor zwischen den Neisseria-lgtA- und -lgtD-Genen, und die beste Datenbankübereinstimmung von RM118-HI1578 liegt mit dem lgtD-Gen aus N. gonorrhoeae vor. Enzymassays mit Extrakten von RM118 und der RM118lgtD-Mutante bestätigten das Vorhandensein von β-D-GalpNAc-Transferaseaktivität. Der Elternstamm RM118, der ein funktionelles lgtD-Gen enthält, ist in der Lage, die komplette Globotetraoseeinheit hervorzubringen, die bezeichnend für dessen Rolle beim Addieren des terminalen β-D-GalpNAc ist. Das lgtD-Gen wurde bereits zuvor untersucht (in 6 lgtA genannt) und es wurde gefunden, dass es in den Typ-b-Stämmen RM153 und RM7004 nicht vorhanden ist. Entsprechend enthält das von dem Stamm RM153 hervorgebrachte LPS keinen GalNAc-Rest (Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A., Krajcarski, D. und Richards, J. C. (1996) Biochem. 36: 2091-2103). Es wurde gefunden, dass viele NTHi-Stämme das LgtD-Gen enthalten und es wurde gefunden, dass die LPS-Oligosaccharidseitenketten dieser Stämme einen GalNAc-Rest enthalten.
Es ist zu beachten, dass während die Glykosyltransferaseaktivitäten, die durch die Gene kodiert werden, die die Addition der distalen Reste der Globotetraose-(lgtD) und der Globosid-(lgtC)-Oligosaccharidseitenketten bedingen, in einem enzymatischen Assay mit dem geeigneten synthetischen Akzeptor bestätigt werden konnten, Experimente zur Untersuchung der Transferaseaktivität der Gene, die an der Synthese des Laktoserests (lic2A und lpsA) beteiligt sind, erfolglos waren. Es ist wahrscheinlich, dass die beiden letzteren Enzyme stringentere Spezifitäten aufweisen, die erfordern, dass der Akzeptorzucker mit den Heptoseresten des inneren Kerns verbunden wird, und dadurch die Erkennung des einfachen synthetischen FCHASE-Glykosidakzeptors ausschließen.
Eine Charakterisierung des anfänglichen Gensatzes und der mutierten Stämme, die für die Untersuchung der Biosynthese von RM118-LPS verfügbar waren, führte zu keinem offensichtlichen Kandidaten, der für die Addition der β-D-Glcp-Einheit an HepI verantwortlich ist. Es wurden weitere in Frage kommende LPS-Gene untersucht, indem man die Genomsequenz des Rd-Stamms auf wenig homologe Übereinstimmungen zu Genen durchsuchte, welche in den LPS von anderen Organismen Hexosezucker zu Heptoseresten addieren. Die Suchsequenzen beinhalteten die rfaK- und lgtF-Gene von Neisseria, Gene, welche an der Addition von Hexoseresten zu Heptose beteiligt sind (Kahler, C. M., Carlson, R. W., Rahman, M. M., Martin, L. E. und Stephens, D. S. (1996) J. Bacteriol. 178: 6677-6684). In Stamm RM118 wurde ein lgtF-Homolog identifiziert und die Analyse des LPS aus dem Stamm, der in diesem Gen mutiert war, war bezeichnend für die Rolle von LgtF bei der Kettenverlängerung ab HepI. Die ESI-MS zeigte molekulare Ionen, die einem Gemisch von Glykoformen mit Kettenverlängerungen ab HepIII eines Triheptosylrests im inneren Kern entsprechen, dem PCho→6-β-D-Glcp an der HepI fehlt (5).
Die lgtF- und lpsA-Gene sind entscheidend für die Hexoseverlängerungen ab der Heptose, die eine Einheit des inneren Kerns von RM118-LPS enthält, und kodieren die Glykosyltransferaseenzyme, die für die Addition der ersten Glykose an HepI bzw. HepIII verantwortlich sind. Die Vorgänge der Kettenverlängerung sowohl ab HepI als auch ab HepIII scheinen im LPS von Stamm RM118 zum größten Teil unabhängig zu sein. Der mutierte Stamm RM118lpsA produziert LPS, welches den β-D-Glcp-Rest aus HepI einschließt. Stamm RM118lgtF produziert ein heterogenes LPS, das Oligosaccharidverlängerungen ab HepIII enthält, die Laktose- und Globotetraoseketten einschließen. In Stamm RM153 spielt lpsA offensichtlich eine geringfügig andere Rolle und ist verantwortlich für die Addition von Galaktose als der einzigen Verlängerung ab der dritten Heptose (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). Es wurde überraschenderweise bestimmt, dass lpsA in gewissen nicht-typisierbaren Stämmen entweder Glukose oder Galaktose an die O-3-Position anstatt an die O-2-Position addieren kann.
Die Heterogenität der Struktur von LPS aus H. influenzae muss teilweise durch intrinsische Variation in der Biosynthese einer solchen komplexen Struktur bedingt sein, wodurch nicht jedes Molekül vollständig synthetisiert wird. Es scheint jedoch, dass die Mehrzahl der beobachteten Variationen durch spezifische Gene der LPS-Biosynthese bedingt ist, welche zur variablen Expression (Phasenvariation) befähigt sind. Eine Strukturanalyse des von Wildtyp- und mutierten RM118-Stämmen abgeleiteten LPS gestattete es uns zum ersten Mal, die Gene zu bestätigen, die an der Synthese eines bedeutenden phasenvariablen Epitops von H. influenzae-LPS, nämlich dem Digalaktosid, beteiligt sind. Im Stamm RM118 addiert Lic2A das proximale β-D-Galp und LgtC das terminale α-D-Galp zu dem Digalaktosid (α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp) als Teil der Oligosaccharidverlängerung ab HepIII, wohingegen das gleiche Epitop wie die terminale Verlängerung ab der zweiten Heptose, in dem Typ-b-Stamm RM153 exprimiert wird (Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A., Krajcarski, D. und Richards, J. C., (1996) Biochem. 36: 2091-2103). Sowohl bei lic2A als auch bei lgtC handelt es sich um phasenvariable Gene, die die Expression des Epitops hoch variabel innerhalb und zwischen Organismen machen. Das Digalaktosidepitop wird sowohl in den LPS von vielen in der vorliegenden Erfindung offenbarten NTHi-Stämmen exprimiert, als auch in verwandten Bakterien, einschließlich Neisseria (Virji, M., Weiser, J. N., Lindberg, A. A., und Moxon, E. R. (1990) Microb. Pathogen. 9:441-450). Das Epitop ist potentiell immundominant und ist von Interesse bei der Pathogenese, da seine Anwesenheit das Potential zur molekularen Mimikry von Wirtsstrukturen bietet und das Überleben von Haemophilus influenzae innerhalb experimenteller Systeme beeinflussen kann (Weiser, J. N. und Pan, N. (1998) Mol. Microbiol 30: 767-775; Hood, D. W., Deadman, M. E., Jennings, M. P., Bisceric, M., Fleischmann, R. D., Venter, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11121-11125).
Bei der Sialylierung von Oligosacchariden handelt es sich um eine Modifikation, von der angenommen wird, dass sie die Mimikry von humanen Gewebestrukturen verbessert, da sialylierte Oligosaccharide häufig im Gewebe von Säugern zu finden sind. Wie in den Beispielen beschrieben, identifizierte der Anmelder sialylierte LPS in den NTHi-Stämmen 375, 486 und im Stamm RD, was eine Rolle von lic3A bei der LPS-Synthese erläutert (D. W. Hood et al., Mol. Microbiol. 39: 341-350, 2001). Eine für die Verschiedenartigkeit der Spezies repräsentative Übersicht über 25 NTHi-Stämme, identifizierte sialylierte LPS-Oligosaccharid-Kettenverlängerungen in allen Stämmen außer einem. Es wurde gezeigt, dass die Mutation von lic3A in einigen NTHi-Stämmen, wie NTHi 486, einen bedeutenden Einfluß auf die Resistenz gegen die tötende Wirkung von normalem humanem Serum hat. Ein Vergleich der Strukturen von LPS aus NTHi 486 und seiner lic3A-Mutante zeigte die Anwesenheit von sialylierten Glykoformen (Sialyl-Laktose) nur im Elternstamm, was auf die Wichtigkeit von Lic3A für die Serumresistenz in diesem Stamm hinweist. Die Addition eines geladenen Sialsäurerests zu LPS in Haemophilus influenzae scheint die antigene Mimikry von LPS-Epitopen zu modulieren.
Zusätzlich zu der Rangfolge und der Stereochemie der Zuckerreste, aus denen sich der Oligosaccharidanteil der LPS-Moleküle zusammensetzt, können die Lage, Typ und Häufigkeit von Substituenten, wie P, PEtn und PCho eine tiefgreifende Wirkung auf die Struktur und biologische Funktion von LPS haben. Es wurde gezeigt, dass der lic1-Locus essentiell für die phasenvariable Addition von PCho zum LPS-Molekül aus H. influenzae ist (Weiser, J. N., Shchepetov, M. und Chong, S. T. H. (1997) Infect. Immun. 65: 943-950; Lysenko, E., Richards, J. C., Cox, A. D., Stewart, A., Martin, A., Kapoor, M. und Weiser, J. N. (2000) Mol. Microbiol. 35: 234-245). Es wurde gezeigt, dass PCho zur Resistenz von H. influenzae gegen angeborene humorale Immunität beiträgt (Weiser, J. N. und Pan, N. (1998) Mol. Microbiol. 30: 767-775; Lysenko, E., Richards, J. C., Cox, A. D., Stewart, A., Martin, A., Kapoor, M. und Weiser, J. N. (2000) Mol. Microbiol. 35: 234-245). Das Gen, das eine Kdo-Kinase kodiert, kdkA, verantwortlich für die Phosphorylierung von Kdo ist, wurde bereits identifiziert (White, K. A., Lin, S., Cotter, R. J. und Raetz, C. R. H. (1999) J. Biol. Chem. 274: 31391-31400). Dieses Gen wurde zuvor vom Anmelder als orfZ untersucht und es wurde gezeigt, dass es, wenn es mutiert war, das Überleben von Bakterien in einem Rattenkleinkindmodell zur Infektion veränderte (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). Die einzigen verbleibenden Substituenten in dem Kernoligosaccharid, deren genetische Kontrolle bisher noch unbekannt ist, sind daher die PEtn-Reste, die stöchiometrisch an der 6-Position des HepII-Restes und manchmal an der Phosphatgruppe auf Kdo angeheftet sind.
Zusammenfassend wurden die genetische Blaupause für die komplette Synthese der hauptsächlichen Oligosaccharid-Kettenverlängerungen von Haemophilus influenzae aufgeklärt.
Der Anmelder untersuchte mehr als 25 Stämme, die repräsentativ für die bekannte Vielfältigkeit von H. influenzae sind. Der Anmelder bestätigte, dass der Triheptosylrest im inneren Kern von LPS (markiert HepI-HepIII) in allen getesteten Stämmen konserviert ist. Diese Bestimmung gestattet die Synthese von geeigneten Oligosacchariden aus dem Rest des inneren Kerns von LPS zur Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffen, die einen Breitspektrumschutz gegen Haemophilus influenzae, einschließlich NTHi, bieten. Sie gestattet ebenfalls die Selektion und Modifikation von Stämmen von Haemophilus influenzae, die geeignete Oligosaccharide von dem Rest des inneren Kerns von LPS synthetisieren, zur Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffen.
Tabelle 1 fasst die Gene zusammen, die an der Biosynthese der hauptsächlichen Globotetraose-enthaltenden Oligosaccharide von LPS in H. influenzae-Rd beteiligt sind, die bereits identifiziert wurden. Der Anmelder identifizierte die Gene, die für die Kettenverlängerung ab HepI (lgtF) und HepIII (lpsA) verantwortlich sind. Des Weiteren bringen einige Stämme von Haemophilus influenzae (z. B. Eagan und RM7004) LPS hervor, das eine Kettenverlängerung ab HepII aufweisen kann. Der Anmelder hat gezeigt, dass ein Gen im lic2-Locus (orf3) die Kettenverlängerung ab HepII initiiert. Eine differentielle Expression dieser Gene kann zu einer Mannigfaltigkeit von variablen Oligosaccharidepitopen führen, die aus dem konservierten Triheptosylrest des inneren Kerns hervorgehen. Durch definierte Mutationen in diesen Genen kann der Anmelder nicht nur den Grad der Komplexität kontrollieren, den ein bestimmter Haemophilus influenzae-Stamm exprimiert, sondern auch die verfügbaren Epitope auf der daraus resultierenden Kernregion des LPS. Daher stellte LPS aus H. influenzae-Stämmen mit definierten Mutationen in ihrer biosynthetischen Maschinerie geeignete Kandidaten bereit für die Entwicklung eines auf LPS basierenden Breitspektrumimpfstoffs. Der Anmelder bestimmte, dass diese Strategie nützlich für das Design von Impfstoffen ist, da sie eine Kreuzreaktivität gegen eine Vielfalt von pathogenen Stämmen von Haemophilus influenzae bereitstellt, einschließlich nicht-typisierbare Stämme, die bisher eine derartige Vielfalt an LPS aufwiesen, dass sie von der Entwicklung von Impfstoffen abschreckten.
Eine Variation in den Substitutionsmustern bei HepII und HepIII im inneren Triheptosylkern des LPS führt zu wechselnden Oligosaccharidepitopen im inneren Kern. Die nachfolgenden Beispiele sind Beispiele für nützliche Substitutionen und Modifikationen der inneren Kernregion von LPS aus Haemophilus influenzae, die die Erfindung veranschaulichen. Diese Beispiele sind nicht als einschränkend zu verstehen und der Fachmann wird erkennen, dass im Rahmen der Lehre der Erfindung andere Substitutionen und Modifikationen möglich sind.
Basierend auf der genomischen und phänotypischen Analyse von LPS aus einer Sammlung von NTHi-Stämmen identifizierte der Anmelder zum ersten Mal Haemophilus influenzae-Stämme, die LPS mit einer wechselnden inneren Kernstruktur exprimieren, in welchen eine Kettenverlängerung ab O-3 statt O-2 von HepIII stattfindet. Homologe lpsA-Gene vermitteln die spezifische Addition von β-D-Gal oder β-D-Glc an die O-2- oder O-3-Position, von HepIII in Abhängigkeit vom Stamm. Des Weiteren exprimieren manche Haemophilus influenzae-Stämme LPS, in dem HepIII nicht durch Oligosaccharidketten substituiert ist. Diese Erkenntnisse werden in den Beispielen detailliert ausgeführt.
Die Ergebnisse aus den Beispielen bestätigen das Vorhandensein eines konservierten inneren Kernelements in NTHi. Diese Ergebnisse stellen ebenfalls zum ersten Mal einen Beweis für ein neues Strukturmotiv bereit, nämlich eine wechselnde Substitutionsstelle auf HepIII. Es wurde bereits zuvor gefunden, dass HepIII durch Hexosereste an der O-2-Position substituiert wird, und es wurde gefunden, dass dies in NTHi der Fall ist, zum Beispiel in den Stämmen 285 und 1158. In anderen NTHi-Stämmen, zum Beispiel 176 und 486, wird dieses Substitutionsmuster nicht beobachtet. Stattdessen findet die Substitution an der O-3-Position von HepIII statt. Es wurde überraschenderweise gezeigt, dass das lpsA-Gen in der Lage ist, in manchen Stämmen (Stamm RD, 7) ein β-D-Glcp, oder ein β-D-Galp in anderen (Typ b, z. B. der Stamm Eagan), in einer 1,2-Verbindung zu addieren, um die Kettenverlängerung ab HepIII zu initiieren. Der Anmelder fand, dass ein Homolog von lpsA für die Addition eines β-D-Glcp-Restes oder eines β-D-Galp-Restes in einer 1,3-Verbindung an HepIII verantwortlich ist.
Eine weitere nützliche Modifikation der inneren Kernregion betrifft das PCho-Epitop. Dies ist ein verbreitetes Merkmal auf Oberflächenstrukturen von Pathogenen, die sich im humanen Respirationstrakt befinden, einschließlich H. influenzae. In dem H. influenzae-Stamm Rd ist PCho an O-6 eines terminalen β-D-Glcp-Restes an HepI befestigt (Struktur 1; R₁ = PCho→6-β-D-Glcp; 7). In anderen H. influenzae-Stämmen, zum Beispiel in dem Typ-b-Stamm Eagan, ist PCho an O-6 eines terminalen β-D-Galp-Restes an HepIII befestigt. (Struktur 1; R₃ = PCho→6-β-D-Galp) (E. K. H. Schweda et al., Eur. J. Biochem. 267 (2000) 3902-3913). Beide dieser Substitutionsmuster wurden in NTHi-Stämmen gefunden. Des Weiteren wurde PCho auf dem terminalen α-D-Glcp-Rest gefunden. (Struktur 1, R₂ = PCho→6-α-D-Glcp). Die Expression und die Phasenvariation des PCho-Epitops auf dem LPS von H. influenzae benötigen die vier Gene des lic1-Locus (J. N. Weiser et al., Infec. Immun., 65 (1997) 943-950). Diese Gene wurden auf jedem untersuchten NTHi-Stamm gefunden. Der Anmelder bestimmte, dass ein Polymorphismus im licD-Gen die Stelle beeinträchtigt, an der das PCho addiert wird.
Die Natur des Substitutionsmusters an dem Triheptosylrest des inneren Kerns ist relevant für die Art und Weise, in der die Epitope des inneren Kerns dem Immunsystem präsentiert und durch monoklonale Antikörper erkannt werden. Der Anmelder fand zum Beispiel, dass ein muriner IgG2a monoklonaler Antikörper (L6A9) ein LPS-Oligosaccharidepitop des inneren Kerns in Stämmen erkennt, die einen β-D-Galp-Rest an O-2 von HepIII enthalten, jedoch nicht, wenn der β-D-Galp-Rest fehlt oder an der O-3-Position befestigt ist. Die strukturelle Verifikation der Form mit hohem Molekulargewicht ist in B gezeigt.
Wie zuvor festgestellt, wurden entscheidende Gene identifiziert, die an der Expression von LPS in H. influenzae beteiligt sind. Dies versetzte den Anmelder in die Lage, mutante Stämme von H. influenzae zu gestalten, die den konservierten Rest des inneren Kerns umfassen, nicht jedoch Oligosaccharidverlängerungen, die die humanen Gewebestrukturen nachahmen. Die Beispiele stellen die Ergebnisse dieses Verfahrens dar.
Der Anmelder fand, dass Oligosaccharide, die den konservierten Triheptosylrest des inneren Kerns von H. influenzae-LPS enthalten, immunogen sind, wenn sie z. B. als Proteinkonjugate formuliert sind, unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind (Gu-Patent, supra). Der Anmelder hat zum Beispiel gezeigt, dass die Immunisierung von Mäusen mit einem Oligosaccharid-Proteinkonjugat, das sich aus mit bovinem Serum Albumin (BSA) konjugiertem O-deacyliertem LPS aus dem Hi-Stamm Rdlic1lpsA zusammensetzt, ein Immunserum produziert, das kreuzreaktiv ist mit einer Mehrzahl von LPS-Proben aus einem genetisch diversen Satz von NTHi-Stämmen (Tabelle 7). Eine O-Deacylierung des LPS wird mittels Verwendung von wasserfreiem Hydrazin erreicht. Dies hat die Wirkung, dass das LPS-Oligosaccharid für die nachfolgende Konjugationsreaktion mit Protein löslich gemacht wird und führt zu signifikanter Detoxifikation der Lipid A-Komponente (Gu-Patent, supra). Das O-deacylierte LPS wird gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren über die Carboxylgruppe des Kdo-Restes konjugiert (Gu-Patent, supra). Mäusen wurde ein finaler intraperitonealer Boost mit O-deacyliertem LPS aus dem Hi-Stamm 1003lic1lpsA verabreicht (siehe Beispiele). Maus-Immunseren aus diesem Experiment reagierten mit LPS aus NTHi-Stämmen, die multiple Kettenverlängerungen ab dem inneren Kern aufweisen.
Rdlic1lpsA-LPS bringt LPS hervor, das repräsentativ für den konservierten Triheptosylrest des inneren Kerns ist, und enthält geringfügig Glykoformen mit Lakto-N-Neotetraose (LNnT)-enthaltenden Oligosaccharid-Kettenverlängerungen. Dies geht aus der Reaktivität mit mAb LLA5 hervor (Tabelle 8). Das O-deacylierte Rdlic1lpsA-LPS-BSA-Konjugat zeigte ebenfalls Reaktivität mit dem mAb LLA5 sowie mit dem mAb des inneren Kerns, LLA4. Der NTHi-Stamm 1003 bringt kein LPS mit LNnT-enthaltenden Oligosaccharidketten hervor. Dies wurde vom Anmelder mittels strukturellen, genetischen sowie immunchemischen Analysen bestimmt. LPS aus diesem Stamm reagiert nicht mit LLA5 und enthält nicht den genetischen rfb-Locus (Derek Hood, supra). Die Doppelmutante 1003lic1lpsA exprimiert LPS mit dem konservierten Rest des inneren Kerns ohne Kettenverlängerungen. Es wird von dem mAb LLA4 erkannt.
Aus dem obigen geht hervor, dass der konservierte Rest des inneren Kerns von H. influenzae-LPS (der zum Beispiel in Rdlic1lpsA vorhanden ist) eine Immunantwort hervorrufen kann, die kreuzreaktiv mit LPS aus Stämmen ist, die repräsentativ für die Vielfältigkeit des Bakteriums sind. Laktose, LNnT und deren sialylierte Analoga sind Oligosaccharidstrukturen, die in humanen Geweben zu finden sind. Um einen auf LPS basierenden Impfstoff zu entwickeln, ist es daher bevorzugt sicherzustellen, dass diese Oligosaccharidverlängerungen nicht in der Impfstoffformulierung vorhanden sind. Die obigen Experimente liefern den Beweis dafür, dass diese Oligosaccharidverlängerungen durch die H. influenzae-Stämme verbreitet sind und dass der Anmelder die Vorgehensweise dazu lehrte, um diese zu identifizieren und Stämme ohne sie hervorzubringen.
Mit den gleichen Mitteln können andere mutante Stämme von Hi mit Substitutionen oder Modifikationen des konservierten Triheptosylrestes des innern Kerns konstruiert werden, die Epitope ergeben, die eine Bretispektrumimmunantwort auf Hi, einschließlich NTHi, hervorrufen und/oder die aufgrund von Mimikry von bzw. aufgrund der Vermeidung von Mimikry von Tiergeweben eine verbesserte Immunantwort hervorrufen.
Impfungsverfahren zum Behandeln oder Vermeiden einer Infektion in einem Säuger umfassen die Verwendung einer Impfstoffformulierung der Erfindung zur Verabreichung auf jedem üblichen Weg, insbesondere an eine mukosale (z. B. okulare, intranasale, orale, gastrische, pulmonale, intestinale, rektale, vaginale oder Harnwegs-) Oberfläche oder über den parenteralen (z. B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Verabreichungsweg. Bevorzugte Verabreichungswege hängen von der Auswahl der Impfstoffformulierung ab. Die Behandlung kann in Form einer einzelnen Dosis oder wiederholt in Intervallen erfolgen. Die geeignete Dosis hängt von verschiedenen Parametern ab, die von Fachleuten verstanden werden, wie die Impfstoffformulierung selbst, der Weg der Verabreichung oder der Zustand des zu impfenden Säugers (Gewicht, Alter und dergleichen).
Bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Lipopolysaccharid-Therapeutika werden Standardlabortechniken zur Herstellung und Reinigung von Lipopolysacchariden angewandt. Für eine Verwendung als Impfstoff wird ein Lipopolysaccharid der Erfindung gemäß verschiedener nachfolgend umschriebener Verfahren formuliert.
Da die Lipid A-Komponente von LPS dieses toxisch machen kann, wird das LPS-Immunogen vorzugsweise detoxifiziert. Obwohl die Verwendung von Hydrazin zur Detoxifikation von LPS aus NTHi hierin beschrieben ist, liegt die Verwendung eines beliebigen Reagens oder Enzyms, in der Lage, estergebundene Fettsäuren von Lipid A zu entfernen, gleichermaßen im Umfang der Erfindung. Getrocknetes LPS aus dem ausgewählten Stamm von NTHi wird in flüssigem Hydrazinanhydrid bei einer Temperatur von zwischen 1°C und 100°C; vorzugsweise zwischen 25°C und 75°C; stärker bevorzugt bei etwa 37°C für einen Zeitraum zwischen 1 Stunde und 24 Stunden, am stärksten bevorzugt für einen Zeitraum von etwa 2 bis 3 Stunden suspendiert. Nach der Entfernung der estergebundenen Fettsäuren wird dLPS vor der Konjugation an die immunogenen Trägerproteine TT- oder NTHi-HMPs an den Linker Adipinsäuredihydrazid (ADH) konjugiert. Obwohl ADH den bevorzugten Linker darstellt, ist die Verwendung eines beliebigen Linkers, der in der Lage ist, dLPS stabil und effizient an ein immunogenes Trägerprotein zu konjugieren, in Betracht zu ziehen. Die Verwendung von Linkern ist auf dem Gebiet der konjugierten Impfstoffe wohl bekannt (siehe Dick et al., Conjugate Vaccines, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr., Hrsg., Karger, New York, USA, pp. 48-114).
dLPS kann direkt kovalent an den Träger gebunden werden. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass man das vernetzende Reagens Glutaraldehyd verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform sind jedoch dLPS und der Träger durch einen Linker voneinander getrennt. Die Anwesenheit eines Linkers fördert die optimale Immunogenität des Konjugats und eine effizientere Kopplung des dLPS an den Träger. Linker trennen die beiden antigenen Komponenten durch Ketten, deren Länge und Flexibilität wie gewünscht angepasst werden kann. Zwischen den bifunktionalen Stellen können die Ketten eine Vielzahl von Strukturmerkmalen enthalten, einschließlich Heteroatome und Spaltstellen. Linker gestatten ebenfalls entsprechende Anstiege in translationalen und rotationalen Charakteristika der Antigene und verbessern den Zugang der Bindungsstellen zu löslichen Antikörpern. Neben ADH schließen geeignete Linker zum Beispiel ein: heterodifunktionale Linker wie Epsilon, Aminohexansäure, Chlorhexanoldimethylacetal, D-Glucuronolaceton und p-Nitrophenylamin. Kopplungsreagenzien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, schliessen Hydroxysuccinimide und Carbodiimide ein. Viele andere Linker und Kopplungsreagenzien, die dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls zur Verwendung in der Erfindung geeignet. Solche Verbindungen werden im Detail diskutiert von Dick et al., supra.
Die Anwesenheit eines Trägers erhöht die Immunogenität des Polysaccharids. Zusätzlich sind gegen den Träger gerichtete Antikörper medizinisch vorteilhaft. Polymere immunogene Träger können ein natürliches oder synthetisches Material sein, das eine primäre und/oder eine sekundäre Aminogruppe, eine Azidogruppe oder eine Carboxylgruppe enthält. Der Träger kann wasserlöslich oder -unlöslich sein.
In dem Konjugatimpfstoff der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges aus einer Vielzahl von immunogenen Trägerproteinen verwendet werden. Solche Klassen von Proteinen schließen ein: Pili, Proteine der äußeren Membran und von pathogenen Bakterien abgesonderte Toxine, nicht-toxische oder "toxoide" Formeln solcher abgesonderten Toxine, nicht-toxische Proteine, die hinsichtlich ihrer Antigenität bakteriellen Toxinen ähnlich sind (kreuzreagierende Materialien oder CRMs) und andere Proteine. Nicht einschränkende Beispiele für bakterielle Toxoide, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen ein: Tetanustoxin/-toxoid, Diphtherietoxin/-toxoid, detoxifiziertes P. aeruginosa-Toxin A, Choleratoxin/-toxoid, Pertussistoxin/-toxoid und Clostridium perfringens-Exotoxine/-toxoid. Die Toxoidformen dieser bakteriellen Toxine sind bevorzugt. Ebenfalls in Betracht gezogen wird die Verwendung von viralen Proteinen (d.h. Hepatitis B-Oberflächen-/Kernantigene; Rotavirus VP 7-Protein und F- und G-Proteinen des Respiratory-Syncytial-Virus.
CRMs schließen ein: CRM.sub.197, hinsichtlich der Antigenität dem Diphtherietoxin äquivalent (Pappenheimer et al., Immunochem. 9:891-906, 1972) und CRM3201, eine genetisch manipulierte Variante des Pertussistoxins (Black et al., Science, 240:656-659, 1988). Die Verwendung immunogener Trägerproteine aus nicht-Säuger-Quellen, einschließlich Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Pfeilschwanzkrebs-Hämocyanin und pflanzliches Edestin liegt ebenfalls im Umfang der Erfindung.
Es gibt viele Kopplungsverfahren, die für dLPS-Proteinkonjugate in Betracht gezogen werden können. dLPS kann selektiv aktiviert werden, über durch 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC)-vermittelte ADH-Derivatisierung der terminalen 3-Desoxy-D-Manno-2-Octulosonsäure (Kdo)-Gruppe von dLPS, gefolgt von EDC-vermittelter Kopplung an TT. Alternativ dazu beinhaltet ein weiteres Verfahren zur Herstellung des vorliegenden Konjugats die Cystaminderivatisierung von dLPS, zum Beispiel durch EDC-vermittelte Derivatisierung, gefolgt von Disulfidkonjugation an N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithiol)-Propionat-derivatisiertes Protein. Weitere im Stand der Technik wohl bekannte Verfahren zur Bewerkstelligung der Konjugation von Oligosacchariden an immunogene Trägerproteine liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung. Solche Verfahren sind zum Beispiel beschrieben in den US-Patenten 5,153,312 und 5,204,098; EP 0 497 525 ; und EP 0 245 045 .
Das molare Verhältnis von ADH zu dLPS im Reaktionsgemisch liegt typischerweise zwischen etwa 10:1 und etwa 250:1. Es wird ein molarer Überschuss von ADH verwendet, um eine effizientere Kopplung zu gewährleisten und die dLPS-dLPS-Kopplung zu begrenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das molare Verhältnis zwischen etwa 50:1 und etwa 150:1; in einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform liegt das molare Verhältnis bei etwa 100:1. Es werden ebenfalls ähnliche Verhältnisse von AH-dLPS zu sowohl TT als auch HMP im Reaktionsgemisch in Betracht gezogen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist pro dLPS ein ADH im AH-dLPS-Konjugat vorhanden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt in dem finalen dLPS-Trägerproteinkonjugat das molare Verhältnis von dLPS zu Träger zwischen etwa 15 und etwa 75, vorzugsweise zwischen etwa 25 und etwa 50.
Die Immunogenität der Konjugate wird sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen durch die Verwendung von Monophosphyl-Lipid A plus Trehalosedimycolat (Ribi-700^TM; Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont.) als ein Adjuvans verstärkt. Obwohl dieses Adjuvans nicht zur Anwendung am Menschen zugelassen ist, so wird der Fachmann doch erkennen, dass andere wohl bekannte Standardadjuvantien in der Erfindung verwendet werden können, einschließlich Aluminiumverbindungen (d.h. Alum), chemisch modifizierte Lipopolysaccharide, Suspensionen von getöteten Bordetella pertussis, N-Acetylmuramyl-L-Alanyl-D-Glutamin und andere dem durchschnittlichen Fachmann bekannte Adjuvantien. Die Verwendung von Aluminiumverbindungen ist besonders bevorzugt. Solche Adjuvantien sind von Warren et al., (Ann. Rev. Biochem., 4:369-388, 1986) beschrieben.
Die dLPS-Trägerproteinkonjugate zur parenteralen Verabreichung können in Form eines sterilen injizierbaren Präparats vorliegen, wie einer sterilen injizierbaren wässrigen oder öligen Suspension. Diese Suspension kann gemäß im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren unter Verwendung von geeigneten Dispergier- oder Feuchthaltemitteln und Suspensionsmitteln formuliert werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension sein, in einem parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, wie eine Lösung in 1,3-Butandiol. Geeignete Verdünnungsmittel schließen zum Beispiel ein: Wasser, Ringersche Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich können sterile feste Öle üblicherweise als ein Lösungs- oder Suspensionsmedium verwendet werden. Zu diesem Zweck kann jedes beliebige farblose feste Öl verwendet werden, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich können bei der Herstellung von injizierbaren Präparaten ebenfalls Fettsäuren wie Ölsäure verwendet werden.
Der Konjugatimpfstoff der Erfindung kann in löslicher Form oder in Form von Mikropartikeln vorliegen, oder kann in Mikrokügelchen oder Mikrovesikel, einschließlich Liposomen, integriert werden. Obwohl verschiedene Wege der Impfstoffverabreichung in Betracht gezogen werden, einschließlich zum Beispiel intramuskulär, subkutan, intraperitoneal und intraarteriell, ist der bevorzugte Weg die intramuskuläre Verabreichung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Dosierung des verabreichten Konjugats in einem Bereich von etwa 10 μg bis etwa 50 μg liegen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die verabreichte Menge zwischen etwa 20 μg und etwa 40 μg liegen. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform, beträgt die verabreichte Menge etwa 25 μg. In Abhängigkeit vom Körpergewicht können auch höhere Dosen verabreicht werden. Die exakte Dosierung kann mittels dem durchschnittlichen Fachmann bekannter routinemäßiger Dosis-Antwort-Protokolle bestimmt werden.
Der Impfstoff der Erfindung kann an warmblütige Säuger jeden Alters verabreicht werden und wird so angepasst, dass er eine aktive Immunisierung induziert in jungen Säugern, insbesondere Menschen, gegen durch NTHi verursachte Otitis media und Atemwegsinfektionen. Als Kinderimpfstoff wird das Konjugat im Alter von etwa 2 bis 4 Monaten verabreicht. Typischerweise werden zwei Boosterinjektionen von zwischen etwa 10 μg und etwa 25 μg verabreicht, etwa 2 Monate und nochmals etwa 13 Monate nach der ersten Injektion. Alternativ dazu werden drei Boosterinjektionen gegeben, 2, 4 und 16 Monate nach der ersten Injektion.
Die durch die systemische Verabreichung des Konjugatimpfstoffs hervorgerufenen IgG-Antikörper werden sich in die lokale Schleimhaut verlagern und NTHi-Inoculum auf mukosalen Oberflächen (d.h. Nasenwegen) inaktivieren. Sekretorisches IgA wird bei der mukosalen Immunität ebenfalls eine Rolle spielen, wenn der Konjugatimpfstoff an die Schleimhaut (d.h. intranasal) verabreicht wird. Daher wird der Konjugatimpfstoff lokale so wie systemische NTHi-Infektion verhindern.
Die Beispiele beschreiben Konjugatimpfstoffe unter Verwendung von NTHi-Rdlic1lpsA. Impfstoffe aus anderen NTHi-Stämmen liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung und werden unter Verwendung der gleichen Techniken hergestellt. NTHi-Stamm Rdlic1lpsA. Andere klinisch relevante NTHi-Stämme, die als Quellen von dLPS für die Erzeugung eines dLPS-Träger-Konjugatimpfstoffs in Betracht gezogen werden, schließen ein: die Stämme 9274, 2019, 1479, 5657 und 7502 (Typ III, II, I, IV beziehungsweise V) so wie Stämme aus der Finnischen Sammlung, auf die hierin Bezug genommen wird. Diese Stämme, ebenso wie der Stamm 2019, sind beschrieben von Campagnari et al., (Infect. Immun. 55:882-887, 1987) und Patrick et al., (Infect. Immun., 55:2902-2911, 1987) und Hood, Mol. Microbiol. 33:679-692, 1999, und sind im Allgemeinen von der Forschungsgemeinschaft erhältlich.
Ein multivalenter Impfstoff umfassend ein Gemisch aus Konjugaten, von denen jedes ein dLPS aus einem unterschiedlichen NTHi-Stamm aufweist, liegt ebenfalls im Umfang der Erfindung. Ein durchschnittlicher Fachmann wird erkennen, dass LPS aus diesen anderen klinisch relevanten Stämmen durch die Entfernung von Fettsäuren davon, wie zum Beispiel beschrieben in Gu et al. (US-Patent Nr. 6,207,157), detoxifiziert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die so erhaltenen dLPS-Reste mindestens um das 5.000-fache weniger toxisch als LPS selbst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die dLPSs mindestens etwa um das 10.000-fache weniger toxisch als dLPS. Die Bestimmung der Toxizität kann zum Beispiel wie in Gu et al. (US-Patent Nr. 6,207,157) beschrieben durchgeführt werden.
Im Stand der Technik erhältliche Lebendimpfstoffe schließen virale Vektoren wie Adenoviren, Alphaviren und Pockenviren ebenso ein wie bakterielle Vektoren, z. B. Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille bilié de Calmette-Guérin (BCG) und Streptococcus.
Abgeschwächte Salmonella typhimurium-Stämme, genetisch verändert zur rekombinanten Expression von heterologen Antigenen oder auch nicht, sowie deren Verwendung als orale Impfstoffe sind in WO 92/11361 beschrieben. Bevorzugte Verabreichungswege schließen alle mukosalen Wege ein; am stärksten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
Andere als Impfstoffe verwendete Bakterienstämme sind beschrieben für Shigella flexneri in High et al., EMBO (1992) 11:1991 und Sizemore et al., Science (1995) 270:299; für Streptococcus gordonii in Medaglini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:6868; und für Bacille Calmette Guerin in Flynn, J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (Anhang; I):31, WO 88/06626, WO 90/00594, WO 91/13157, WO 92/01796 und WO 92/21376.
Eine alternative Formulierung verwendet den Impfstoff in Verbindung mit Agenzien, die die zelluläre Aufnahme unterstützen. Beispiele solcher Agenzien sind (i) Chemikalien, die die zelluläre Permeabilität modifizieren, wie Bupivacain (siehe z. B. WO 94/16737), (ii) Liposomen für die Einkapselung des Lipopolysaccharids, des Impfstoffes oder des partiell deacylierten LPS, oder (iii) kationische Lipide oder Mikropartikel aus Siliziumdioxid, Gold oder Wolfram, die sich mit den Lipopolysacchariden verbinden.
Anionische und neutrale Liposome sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL Press (1990) für eine detaillierte Beschreibung von Verfahren zur Herstellung von Liposomen) und sich nützlich für die Lieferung eines breiten Spektrums von Produkten, einschließlich auf Lipopolysacchariden basierenden Impfstoffen. Zur Verwendung in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird in einer Ausführungsform ein auf Lipopolysaccharid basierender Impfstoff oder Derivat davon in oder mit Liposomen formuliert, vorzugsweise neutrale oder anionische Liposomen, Mikrokügelchen, ISCOMS oder virusähnliche Partikel (VLPs), um die Beförderung zu vereinfachen und/oder Immunantwort zu verstärken.
Im Stand der Technik sind auch kationische Lipide bekannt. Solche Lipide schließen ein: Lipofectin^TM, auch bekannt als DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)Propyl]-N,N,N-Trimethylammoniumchlorid), DOTAP (1,2-Bis(Oleyloxy)-3-(Trimethylammonium)-Propan), DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DOGS (Dioctadecylamidologlycylspermin) und Cholesterinderivate wie DC-Cho1 (3-β-(N-(N'-Dimethylaminomethan)-Carbamoyl)Cholesterin). Eine Beschreibung dieser kationischen Lipide ist zu finden in EP 187,702 , WO 90/11092, US-Patent Nr. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 und US-Patent Nr. 5,527,928.
Bei dem Verabreichungsweg handelt es sich um jeden beliebigen auf dem Impfstoffgebiet angewandten Weg. Als allgemeine Richtlinie wird ein auf Lipopolysaccharid basierender Impfstoff gemäß der Erfindung über eine mukosale Oberfläche verabreicht, z. B. eine okulare, intranasale, pulmonale, orale, intestinale, rektale, vaginale oder Harntraktoberfläche; oder über einen parenteralen Weg, zum Beispiel über einen intravenösen, subkutanen, intraperitonealen, intradermalen, intraepidermalen oder intramuskulären Weg. Die Auswahl des Verabreichungswegs hängt ab von einer Anzahl von Parametern, wie die ausgewählte Formulierung, und von dem Adjuvans, assoziiert mit dem Lipopolysaccharid. Ein in Assoziation mit Bupivacain formulierter auf Lipopolysaccharid basierender Impfstoff kann vorteilhafterweise in Muskeln verabreicht werden. Wird ein neutrales oder anionisches Liposom oder ein kationisches Lipid wie DOTMA oder DC-Cho1 verwendet, kann die Formulierung vorteilhafterweise über intravenöse, intranasale (Aerosolierung), intramuskuläre, intradermale und subkutane Wege injiziert werden. Ein Lipopolysaccharid in einer nackten Form kann vorteilhafterweise über die intramuskulären, intradermalen oder subkutanen Wege verabreicht werden. Wird ein mukosales Adjuvans verwendet, ist der intranasale oder orale Weg bevorzugt. Wird eine Lipidformulierung oder eine Aluminiumverbindung verwendet, ist der parenterale Weg bevorzugt, wobei der subkutane oder intramuskuläre Weg am stärksten bevorzugt ist. Die Auswahl ist ebenfalls abhängig von der Natur des Impfstoffwirkstoffs.
Die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit einer Impfstoffformulierung der Erfindung kann wie nachfolgend beschrieben evaluiert werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt bereit: (i) eine Zusammensetzung, umfassend einen auf Lipopolysaccharid basierenden Impfstoff der Erfindung zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger; genauer gesagt (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines auf Lipopolysaccharid basierenden Impfstoffs der Erfindung; (iii) ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen Haemophilus influenzae in einem Säuger durch Verabreichen einer immunogen wirksamen Menge eines Lipopolysaccharids der Erfindung an den Säuger, um eine schützende Immunantwort gegen Haemophilus influenzae hervorzurufen; und insbesondere (iv) ein Verfahren zum Vorbeugen und/oder Behandeln einer Haemophilus influenzae-Infektion durch Verabreichen einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge eines Lipopolysaccharids der Erfindung an ein infiziertes Individuum. Zusätzlich umfasst die Erfindung die Verwendung eines auf Lipopolysaccharid basierenden Impfstoffs der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Vorbeugen und/oder Behandeln einer Haemophilus influenzae-Infektion.
Wie hierin verwendet enthält die Zusammensetzung der Erfindung eines oder mehrere erfindungsgemäße Lipopolysaccharide oder Derivate davon. Gegebenenfalls enthält die Zusammensetzung mindestens ein zusätzliches Haemophilus influenzae-Antigen oder eine Untereinheit, Fragment, Homolog, Mutante oder Derivat davon.
In einer Ausführungsform weist der auf Lipopolysaccharid basierende Impfstoff, Zusammensetzung oder Behandlung kein Adjuvans auf, insbesondere keine Adjuvantien, welche für gewöhnlich oder speziell in Nagern verwendet werden. Der auf Lipopolysaccharid basierende Impfstoff, Zusammensetzung oder Behandlung kann zum Behandeln von Störungen verwendet werden, deren Symptome mindestens zum Teil durch eine Haemophilus influenzae-Infektion verursacht oder verschlimmert werden, und schließt solche Störungen wie Otitis media, Atemwegsinfektion, Meningitis oder Pneumonie ein. Bevorzugte Lipopolysaccharidzusammensetzungen schließen diejenigen ein, die für in vivo-Verabreichung an ein Tier, vorzugsweise einen Menschen, formuliert werden, um Schutz oder Behandlung gegen durch Haemophilus influenzae verursachte Krankheiten zu verleihen. Ebenfalls bevorzugt sind Zusammensetzungen, die als Mikropartikel, Kapsel oder Liposom formuliert werden.
Alternativ dazu kann die Impfstoffformulierung weiter ein Adjuvans enthalten, vorzugsweise ein zur Verwendung in der Human- wie in der Tiermedizin geeignetes Adjuvans, und welches vorzugsweise keine nagerspezifische Adjuvantien umfasst. In dem Fall ist ein systemisches Adjuvans, das keine gleichzeitige Verabreichung erfordert, um eine förderliche Wirkung zu zeigen, wie z. B. QS21 zu bevorzugen, welches im US-Patent Nr. 5,057,546 beschrieben ist.
Dem Fachmann sind eine Reihe von Adjuvantien bekannt. Bevorzugte Adjuvantien werden wie nachfolgend dargelegt ausgewählt.
In einer Ausführungsform werden auch andere Adjuvantien als Liposomen und dergleichen verwendet und sind im Stand der Technik bekannt. Adjuvantien können das Antigen vor schneller Verteilung bewahren, dadurch, dass sie es in ein lokales Depot absondern, oder sie können Substanzen enthalten, die den Wirt dazu anregen, Faktoren zu sekretieren, die chemotaktisch für Makrophagen und andere Komponenten des Immunsystems sind. Für gewöhnlich kann eine geeignete Selektion vom Fachmann vorgenommen werden, zum Beispiel aus den hierin Beschriebenen.
Die Behandlung erfolgt in einer Einzeldosis oder, wenn erforderlich, wiederholt in Intervallen, wie vom Fachmann leicht bestimmt werden kann. Beispielsweise wird eine Anfangsdosis von drei Boosterdosen in wöchentlichen oder monatlichen Intervallen gefolgt. Eine geeignete Dosis hängt von einer Reihe von Parametern ab, einschließlich dem Empfänger (z. B. Erwachsener oder Kind), dem spezifischen Impfstoffantigen, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung, der An- oder Abwesenheit oder Art des Adjuvans, und der gewünschten Wirkung (z. B. Schutz und/oder Behandlung) wie vom Fachmann bestimmt werden kann. Im Allgemeinen wird ein Impfstoffantigen der Erfindung über einen mukosalen Weg verabreicht in einer Menge von etwa 10 μg bis etwa 500 mg, vorzugsweise von etwa 1 mg bis etwa 200 mg. Für den parenteralen Verabreichungsweg liegt die Dosis für gewöhnlich nicht höher als etwa 1 mg, vorzugsweise etwa 100 μg.
Im Folgenden werden Adjuvantien genannt, die in einer beliebigen der zuvor beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen nützlich sind. Adjuvantien zur parenteralen Verabreichung schließen ein: Aluminiumverbindungen wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxyphosphat. Das Antigen wird nach Standardprotokollen mit der Aluminiumverbindung oder an diese adsorbiert präzipitiert. Andere Adjuvantien, wie RIBI (Immunochem, Hamilton, MT) werden bei parenteraler Verabreichung verwendet.
Adjuvantien zur mukosalen Verabreichung schließen ein: bakterielle Toxine, z. B. das Choleratoxin (CT), das hitzelabile E. coli-Toxin (LT), das Clostridium difficile-Toxin A und das Pertussistoxin (PT), oder Kombinationen, Untereinheiten, Toxoide oder Mutanten davon wie ein aufgereinigtes Präparat der Untereinheit B des nativen Choleratoxins (CTB). Fragmente, Homologe, Derivate und Fusionen an jedes beliebige von diesen Toxinen sind ebenfalls geeignet, vorausgesetzt dass sie Adjuvans-Aktivität beibehalten. Vorzugsweise wird eine Mutante mit reduzierter Toxizität verwendet. Geeignete Mutanten sind z. B. beschrieben in WO 95/17211 (Arg-7-Lys-CT-Mutante), WO 96106627 (Arg-192-Gly-LT-Mutante) und WO 95/34323 (Arg-9-Lys- und Glu-129-Gly-PT-Mutante). Zusätzliche LT-Mutanten, die in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden, schließen z. B. ein: Ser-63-Lys-, Ala-69-Gly-, Glu-110-Asp- sowie Glu-112-Asp-Mutanten. Andere Adjuvantien, wie bakterielles Monophosphyl-Lipid A (MPLA), aus z. B. E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium oder Shigella flexneri; Saponine oder Polylaktidglykolid (PLGA)-Mikrokügelchen können ebenfalls bei der mukosalen Verabreichung verwendet werden.
Adjuvantien, die sowohl bei der mukosalen als auch der parenteralen Verabreichung nützlich sind schließen ein: Polyphosphazen (WO 95/02415), DC-Chol (3-β-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)-Carbamoyl)Cholesterin; US-Patent Nr. 5,283,185 und WO 96/14831) und QS-21 (WO 88(09336).
Jede beliebige pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung, die ein erfindungsgemäßes Lipopolysaccharid oder erfindungsgemäßen Antikörper enthält, wird auf eine übliche Art hergestellt. Insbesondere wird sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger, z. B. Wasser oder einer Kochsalzlösung wie Phosphatpuffersaline, formuliert. Im Allgemeinen wird ein Verdünnungsmittel oder Träger auf Basis der Verabreichungsart und des -wegs und standardgemäßer pharmazeutischer Praxis ausgewählt. Geeignete pharmazeutische Träger oder Verdünnungsmittel sowie pharmazeutische Notwendigkeiten für deren Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben, einem Standardreferenztext auf diesem Gebiet und in der USP/NF.
Es werden dort ebenfalls Verfahren beschrieben, bei denen Haemophilus influenzae-Infektionen mittels oraler Verabreichung eines erfindungsgemäßen Lipopolysaccharids aus Haemophilus influenzae und eines mukosalen Adjuvans in Kombination mit einem Antibiotikum, einem Antazidum, Sucralfat oder einer Kombination davon behandelt werden. Beispiele für solche Verbindungen, die mit dem Impfstoffantigen und dem Adjuvans verabreicht werden können, sind Antibiotika, einschließend z. B. Makrolide, Tetrazykline und Derivate davon (spezifische Beispiele für Antibiotika, die verwendet werden können, schließen Azithromycin oder Doxicyclin oder Immunmodulatoren wie Zytokine oder Steroide ein). Zusätzlich werden Verbindungen verwendet, die mehr als eine der zuvor aufgelisteten Komponenten aneinander gekoppelt enthalten. Die Erfindung schließt ebenfalls Zusammensetzungen zur Durchführung dieser Verfahren ein, d.h. Zusammensetzungen, die ein Haemophilus influenzae-Antigen (oder Antigene) der Erfindung, ein Adjuvans und eine oder mehrere der zuvor aufgelisteten Verbindungen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten.
Die Mengen der zuvor aufgelisteten Verbindungen, die in den hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, werden vom Fachmann auf einfache Art und Weise bestimmt. Behandlung/Immunisierungspläne sind ebenfalls bekannt und vom Fachmann einfach erstellt. So können z. B. die nicht-Impfstoff-Komponenten an den Tagen 1-14 und das Impfstoffantigen + Adjuvans an den Tagen 7, 14, 21 und 28 verabreicht werden.
BIOLOGISCHE HINTERLEGUNGEN
Gewisse Stämme von Haemophilus influenzae, die hierin beschrieben und auf die Bezug genommen wurde, wurden bei der International Depository Authority of Canada (IDAC), im Bureau of Microbiology, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2, hinterlegt. Die Hinterlegungen wurden gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags erstellt. Die Hingerlegungs-Informationen lauten: Haemophilus influenzae-Stamm Rd lic1 lpsA wurde am 25. August 2001 unter der Zugangsnummer IDAC 250801-1 hinterlegt.
Haemophilus influenzae-Stamm 1003 lic1 lpsA wurde am 25. August 2001 unter der Zugangsnummer IDAC 250801-2 hinterlegt.
Der Umfang der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung wird durch die hinterlegten biologischen Materialien nicht beschränkt und das hinterlegte biologische Material soll lediglich der Veranschaulichung von Ausführungsformen der Erfindung dienen.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen bevorzugte Ausführungsform von Aspekten der Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken.
Beispiel 1
Hi-LPS-Mutantenstämme
Bakterienstämme und Kulturbedingungen.
Der H. influenzae-Stamm Rd wurde ursprünglich von Alexander and Leidy (Alexander, H. E., und Leidy, G. (1951) J. Exp. Med. 93: 345-359) von Herriot erhalten. Er wurde an H. O. Smith übergeben, der den Stamm KW-20 nannte und ihn in dem Genomsequenzierungsprojekt verwendete (Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A. Kirkness, E. F., Kerlavage, A. R., Butt, C. J., Tomb, J.-F., Dougherty, B. A., Merrick, J. M., Mc Kenney, K., Sutton, G., Fitz Hugh, W., Fields, C., Gocayne, J. D., Scott, J., Shirley, R., Liu, L.-I., Glodek, A., Kelley, J. M., Weidman, J. F., Phillips, C. A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D., Utterback, T. R., Hanna, M. C., Nguyen, D. T., Saudek, D. M., Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritchman, J. L., Fuhrmann, J. L., Geoghagen, N. S. M., Gnehm, C. L., McDonald, L. A., Small, K. V., Fraser, C. M., Smith, H. O. und Venter, J. C. (1995) Science 269: 496-512). Dieser selbe aus dem Labor von Smith erhaltene Stamm (RM118) wurde vom Anmelder verwendet. Die Genotypen von aus diesem Stamm abgeleiteten Mutanten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es wurden H. influenzae-Stämme bei 37°C in Brain-Heart-Infusion (BHI)-Bouillon gezüchtet, die mit Haemin (10 μg/mL) und NAD (2 μg/mL) ergänzt wurde. Zur Selektion nach der Transformation wurde Kanamycin (10 μg/mL) zum Wachstumsmedium hinzugegeben.
Der Escherichia coli-Stamm DHSα wurde verwendet, um klonierte PCR-Produkte und Genkonstrukte zu vermehren, und wurde bei 37°C in Luria-Bertani (LB)-Bouillon gezüchtet, ergänzt mit Ampicillin (100 μg/mL) oder Kanamycin (50 μg/mL), je nach Erforderlichkeit (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; A laboratory manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Identifizierung von mit LPS verwandten Genen aus der H. influenzae-Genomsequenz. Mutmaßliche LPS-Biosynthesegene wurden bereits zuvor durch eine in silico-Suche der H. influenzae-Genomsequenz mit heterologen Sequenzen von LPS-Biosynthesegenen aus einem breiten Spektrum an Organismen identifiziert, die von öffentlich zugänglichen Datenbanken erhalten wurden (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R. Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965. Der RM118lgtF-Locus (HI0653) wurde identifiziert durch Suchen in der Datenbank für H. influenzae-Stamm-Rd-Sequenz des Institutes for Genomic Research (TIGR)
www.tigr.org/tdb/CMR/ghi/htmls/SplashPage.html
nach Übereinstimmungen mit der LgtF-Proteinsequenz von N. meningitidis (GenBank Zugangsnr. U58765).
Rekombinante DNA-Methodologie, -Klonierung und -Mutation
Restriktionsendonukleasen und DNA-modifizierende Enzyme wurden von Boehringer Mannheim bezogen und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Die Herstellung von Plasmid-DNA, Southern Blotting und Hybridisierungsanalyse wurden durchgeführt wie von Sambrook et al. beschrieben (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; A laboratory manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Chromosomale DNA wurde mittels des anderswo beschriebenen Verfahrens (High, N. J., Deadman, M. E. und Moxon, E. R. (1993) Mol. Microbiol. 9: 1275-1282) aus Haemophilus präpariert.
Abgesehen von lgtF, wurden mutmaßliche H. influenzae-LPS-Biosynthesegene kloniert und mutiert wie zuvor berichtet (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R. Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). Für den lgtF-Locus wurden die Oligonukleotidprimer

lgtFa (5'-TGGTGGTGGGCAAGACGC-3')
und lgtFb (5'-AGCCTGAATTCGACAGCC-3')

Konstruktion von Mutantenstämmen
Es wurden 2-3 μg linearisiertes Plasmid, enthaltend mutierte LPS-Biosynthesegene, verwendet, um den H. influenzae-Stamm RM118 mittels des MIV-Verfahrens zu transformieren (Herriot, R. M., Meyer, E. M. und Vogt, M. J. (1970) J. Bacteriol 101: 517-524) und die Transformanten wurden auf Kanamycin selektiert. Um den Stamm RM118lic1 zu konstruieren, wurde RM118 mit 5 μg gescherter chromosomaler DNA transformiert, die aus der entsprechenden RM153-Mutante isoliert war. Der Stamm RM118lic2A wurde konstruiert durch Transformation von RM118 mit 1 μg eines PCR-Produkts einschließlich lic2A und des benachbarten Gens ksgA amplifiziert aus dem Stamm RM153lic2A. In der PCR wurden die Primer

L2A 5'-CTCCATATTACATAAT-3'
und L2D 5'-AAACACTTAGGCCATACG-3'

lpsAlic1-Mutante. Der lic1-Locus wurde identifiziert, durch Transfer einer Bank von DNA-Fragmenten, die aus dem Stamm RM7004 kloniert waren, der LPS-Epitope exprimiert, die von den monoklonalen Antikörpern (mAb) 4C4, 6A2 und 12D9 erkannt werden, in den Stamm RM118, der in seinem LPS von Natur aus keines dieser Epitope exprimiert. Es wurde ein kloniertes 4,4 kb-Fragment von DNA, das den mAbs 6A2 und 12D9 Reaktivität verleiht, sequenziert und es wurden 4 offene Leserahmen (ORFs) identifiziert. Diese 4 ORFs wurden zusammen ausgeknockt, durch Deletion eines 2,7 kb-ClaI/EcoRV-Fragments aus der klonierten DNA und Ersetzen mit einer Tetrazyklin-Resistenzkassette aus dem Plasmid pHVT1. Dieses Konstrukt wurde verwendet, mittels homologer Rekombination nach der Transformation eine lic1-Mutation im Stamm RM7004 und dann in Stamm RM118 zu bilden.
Das lpsA-Gen wurde aus der Genomsequenz des Stamms Rd als ein Homolog eines Gens identifiziert, das eine Glykosyltransferase in Pasteurella haemolytica kodiert. Das Gen wurde über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche aus der Rd-Genomsequenz designt waren. Das PCR-Produkt wurde in das Plasmid pT7 Blue kloniert und anschließend wurde das Gen durch Verdauung mit NsiI und Insertion einer Kanamycin-Resistenzkassette, die durch Verdauung von pUC4kan mit PstI erhalten wurde, zerstört. Das resultierende Plasmid wurde linearisiert und anschließend dazu verwendet, die Stämme RM118 und NTHi1003 zu transformieren. Die Transformanten wurden mittels PCR überprüft, um Mutanten zu bestätigen.
Die Doppelmutantenstämme RM118lpsAlic1 (synonym bezeichnet als RdlpsAlic1 oder Rdlic1lpsA) und 1003lpsAlic1 (synonym bezeichnet als 1003lic1lpsA) wurden konstruiert, durch Transformieren von jeder der RM118- und 1003lpsA-Mutanten mit chromosomaler DNA, die von dem RM118lic1-Mutantenstamm stammte. Die Doppelmutantenstämme wurden durch PCR-Analyse der relevanten Loci bestätigt und der Hintergrund der Stämme wurde durch Restriktionsenzym-Verdauung und Vergleich der Muster der DNA-Fragmente auf Gelen mit den relevanten Wildtypstämmen bestätigt.
Anschließend wurden die Stämme unter Verwendung einer Reihe von mAbs überprüft, von denen ein jeder spezifisch für bestimmte LPS-Epitope ist. In jedem Fall hatten die RM118- und 1003 lpsAlic1-Doppelmutantenstämme die Reaktivität gegenüber dem mAb TEPC-15 verloren, einem Antikörper, der im Vergleich zum Wildtyp spezifisch für Phosphocholin ist. Der Einbau von Phosphocholin in H. influenzae-LPS ist abhängig vom lic1-Locus. Das von den Mutantenstämmen stammende LPS wurde ebenfalls auf Polyacrylamidgelen fraktioniert und mit dem relevanten Wildtyp-LPS verglichen. In jedem Fall wies der Doppelmutantenstamm LPS auf, das im Vergleich zu dem aus Wildtypstämmen verkürzt war.
Analyse von Lipopolysacchariden durch Immunblotting
Die Reaktivität der Wildtyp- und Mutantenstämme des H. influenzae-Stamms RM118 gegenüber LPS-spezifischen monoklonalen Antikörpern wurde wie von Roche et al. beschrieben analysiert (Roche, R. J., High, N. J. und Moxon, E. R. (1994) FEMS Microbiol Lett. 120:279-284).
Analyse von Lipopolysaccharid durch Elektrophorese
Die Muster von aus Wildtyp- und Mutantenstämmen isoliertem LPS wurden nach der Fraktionierung durch Tricin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (T-SDS-PAGE) bestimmt (Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E. und Apicella, M. A. (1990) J. Immunolog. Methods 126: 109-117) wie zuvor beschrieben (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22:951-965).
Strukturelles Fingerprinting von Lipopolysacchariden
Es wurden Zellen aus 10 L Batchkulturen (10 Teile eines Liters) nach Wachstum über Nacht geerntet, LPS wurde mittels des heißen Phenol-Wasser-Verfahrens (Westphal, O. und Jann, K. (1965) Meth. Carbohydr. Chem. 5:83-91) extrahiert, gefolgt von Ethanolpräzipitation, wie von Thibault und Richards beschrieben (Thibault, P. und Richards, J. C. (2000)). Das LPS wurde mittels wiederholter Ultrazentrifugation (105.000 g, 4°C, 2 × 5 h) gereinigt und es wurden Proben als deren O-deacylierte Derivate (LPS-OH) analysiert. Die O-Deacylierung wurde erreicht durch Mischen des LPS (1-10 mg) mit wasserfreiem Hydrazin (0,2-1,0 mL) bei 37°C für 1 h, wie zuvor beschrieben (Holst, O., Broer, W., Thomas-Oates, J. E., Mamat, U. und Brade, H. (1993) Eur. J. Biochem. 214:703-710). Zucker wurden durch Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (GLC-MS) als deren Alditolacetate identifiziert, wie zuvor beschrieben (Jarosik, G. P. und Hansen, E. J. (1994) Infect. Immun. 62:4861-4867). Die Bindungsanalyse erfolgte im Anschluss an die Acetylierung der Oligosaccharide mit Essigsäureanhydrid (0,5 mL) und 4-Dimethylaminopyridin (0,5 mg) bei Raumtemperatur für 24 h. Dann wurde peracetyliertes Material mit Methyliodid in Dimethylsulfoxid in der Anwesenheit von Lithiummethylsufinylmethanid behandelt, um die methylierten Oligosaccharide hervorzubringen, welche unter Verwendung einer SepPak^TM-C18-Kartusche gewonnen und einer Zuckeranalyse unterworfen wurden (Blakeney, A. B. und Stone, B. A. (1985) Carbohydr. Res. 140:319-324). Die relativen Anteile der verschiedenen Alditolacetate und teilweise methylierten Alditolacetate, die in Zucker- und Methylierungsanalysen erhalten wurden, wurden von der Detektorantwort der GLC-MS gemessen uns sind nicht korrigiert. Die GLC-MS wurde durchgeführt mit einem Delsi Di200^TM Chromatographen, ausgestattet mit einem NERMAG R10-10H^TM Quadrupol-Massenspektrometer oder mit einem Varian Iontrap^TM-System unter Verwendung einer DB-5 eingegossenen Siliziumdioxidkapillarsäule (25 m × 0,25 mm × 0,25 μm) und einem Temperaturgradienten von 160°C (1 min) → 250°C bei 3°C/min. Es wurde eine Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) in einem VG Quattro^TM Massenspektrometer (Micromass, Manchester, UK) im Negativionenmodus durchgeführt. Proben wurden in Wasser gelöst und anschließend im Verhältnis 1:1 mit 50% wässrigem Acetonitril, enthaltend 1 % Essigsäure, gemischt. Probenlösungen wurden über eine Spritzenpumpe in ein fließendes Lösungsmittel aus H₂O:CH₃CN (1:1) bei einer Durchflussrate von 5 μL/min injiziert. Es wurden nach einigen Lyophilisierungen mit D₂O eindimensionale (1D) ¹H-NMR-Spektren bei 500 MHz für Lösungen in Deuteriumoxid bei 22°C auf einem Bruker AMX 500^TM-Spektrometer aufgenommen. Um die spektrale Auflösung zu verstärken wurden Perdeutero-EDTA (2 mM) und Perdeutero-SDS (10 mg/mL) zu den D₂O-Lösungen hinzugegeben (Risberg, A., Schweda, E. K. H. und Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243:701-707). Chemische Verschiebungen werden auf die Methylprotonenresonanz (δ; 2,225 ppm) von internem Aceton bezogen.
Analyse der enzymatischen Aktivität von LgtC und LgtD
Das durch lgtD kodierte Enzym wurde mit dem synthetischen Akzeptor FCHASE-P^K unter Verwendung von Kapillarelektrophorese zur Detektion des Produkts untersucht. Die Kapillarelektrophorese wurde im Wesentlichen wie bereits früher beschrieben durchgeführt (Wakarchuk, W., Martin, A., Jennings, M. P., Moxon, E. R. und Richards, J. C. (1996) J. Biol. Chem. 271: 19166-1917). FCHASE-P^K wurde aus FCHASE-Lac unter Verwendung des LgtC-Enzyms aus Neisseria meningitidis synthetisiert, wie bereits beschrieben (Wakarchuk, W. W., et al., Protein Eng. 11: 295-302, 1998). Die Reaktionsbedingungen waren 0,5 mM Akzeptor, 1 mM UDP-GalNAc, 50 mM HEPES-NaOH pH 7,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂. Der Extrakt wurde durch Sonifikation der Zellen und nachfolgendes Sammeln der Membranfraktion mittels Zentrifugation bei 100.000 × g für 30 Minuten hergestellt. Sowohl RM118 als auch die Mutante RM118:lgtD wurden analysiert. Die kleine Menge an Produkt wurde mittels TLC isoliert, wie bereits beschrieben (Wakarchuk, W., Martin, A., Jennings, M. P., Moxon, E. R. und Richards, J. C. (1996) J. Biol. Chem. 271: 19166-1917). Da die Umwandlung in Produkt nur gering war, wurde ebenfalls einiges des Ausgangsmaterials mit isoliert. Das gewonnene Gemisch wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt und anschließend mit β-Hexosaminidase behandelt, wie vom Enzymhersteller (NEB) empfohlen. Es wurde gezeigt, dass das Produkt der LgtD-Reaktion eine β-anomere Spezifität durch Verdauung mit β-Hexosaminidase aufweist.
Die Aktivität für LgtC lag unterhalb des Limits der Detektion in Extrakten von RM118, daher wurde das Gen in einen Expressionsvektor kloniert und die Aktivität wurde in E. coli untersucht. Das Gen wurde mittels PCR amplifiziert (wie zuvor beschrieben), unter Verwendung der Primer

lgtCa 5' GGG GGG CAT ATG GGA CGG ACT GTC AGT CAG ACA ATG
und lgtCb 5' GGG GGG GTC GAC TCA TTA ATT ATC TTT TAT TCT CTT TCT TAATC.

Das Gen wurde dann an den NdeI- un SalI-Stellen in pCWori plus insertiert, ähnlich wie es für lgtC aus N. meningitidis beschrieben wurde (Wakarchuk, W. W., et al., Protein Eng. 11:295-302, 1998). Sonifizierte Rohextrakte des rekombinanten Klons wurden mit 1 mM FCHASE-Lac, 1 mM UDP-Gal, 10 mM MnCl₂, 5 mM DTT, 50 mM HEPES pH 7,5 untersucht. Es wurde gezeigt, dass das Enzym in E. coli instabil war und innerhalb weniger Stunden nach der Herstellung der Extrakte untersucht werden musste (Daten nicht gezeigt). Das Produkt der Enzymreaktion wurde mittels spezifischer Glykosidaseverdauung, Massenspektrometrie und Co-Chromatographie mit authentischem FCHASE-P^K analysiert (Daten nicht gezeigt).
Konstruktion und Screening von Mutantenstämmen
Der wie zuvor beschrieben hergestellte Mutantensatz wurde dazu verwendet, die genetische Basis der Biosynthese des Oligosaccharidanteils von LPS aus dem H. influenzae-Stamm RM 118, dem Indexstamm, von dem die komplette Genomsequenz abgeleitet wurde, im Detail zu untersuchen. In Tabelle 1 sind die von uns untersuchten Gene aufgelistet. Von den DNA-Konstrukten, die dazu verwendet wurden, die Mehrzahl dieser Gene zu mutieren, wurde bereits berichtet (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). Jedes Konstrukt bestand aus einem Plasmidvektor, in den ein mutmaßliches LPS-Gen mit einem Kanamycin-Resistenzgen, insertiert innerhalb des 5'-Endes (erstes Drittel) des vorhergesagten Leserahmens, kloniert wurde. Es gab kein offensichtliches Kandidaten-Gen, das für das Addieren der Glukose an die erste Heptose (HepI) verantwortlich wäre. Das Durchsuchen der Rd-Genomsequenz-Datenbank mit der lgtF-Sequenz aus Neisseria ergab eine Übereinstimmung (31% Identifikation über 247 Aminosäuren) mit dem Leserahmen HI0653. lgtF wurde mittels PCR aus chromosomaler DNA der Stämme RM118 und RM153 amplifiziert. Das klonierte Produkt aus dem Stamm RM118 wurde durch Insertion einer Kanamycinkassette inaktiviert, um das Plasmid pDQ1 zu bilden, und dann zur Transformation von H. influenzae-Stämmen verwendet. Bei lic1 und lic2A handelt es sich um phasenvariable LPS-Biosynthese-Loci (High, N. J., Deadman, M. E. und Moxon, E. R. (1993) Mol. Microbiol. 9:1275-1282; Weiser, J. N., Love, J. M. und Moxon, E. R. (1989) Cell 59: 657-665). Es wurde gezeigt, dass lic1 an der Addition von PCho-Gruppen an H. influenzae-LPS beteiligt ist (Weiser, J. N., Shchepetov, M. und Chong, S. T. H. (1997) Infect. Immun. 65: 943-950). Für jeden Locus wurde der Stamm RM118 unter Verwendung der mutierten Genkonstrukte (10-10⁵ Transformanten μg Input DNA) transformiert. Für die meisten Loci war RM118 die Quelle der DNA, die kloniert worden war, doch in einigen Fällen wurde von dem Stamm RM153 abgeleitete DNA als Donor verwendet, ohne Veränderung der Transformationseffizienz. Es wurden Gene, verantwortlich für die Synthese des ersten Zuckers Kdo (kdsA, kdsB), der zu Lipid A addiert wird, sowie die Kdo-Transferase (kdtA) aus der Genomsequenz identifiziert (Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F., Kerlavage, A. R., Butt, C. J., Tomb, J.-F., Dougherty, B. A., Merrick, J. M., Mc Kenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fields, C., Gocayne, J. D., Scott, J., Shirley, R., Liu, L.-I., Glodek, A., Kelley, J. M., Weidman, J. F., Phillips, C. A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D., Utterback, T. R., Hanna, M. C., Nguyen, D. T., Saudek, D. M., Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritchman, J. L., Fuhrmann, J. L., Geoghagen, N. S. M., Gnehm, C. L., McDonald, L. A., Small, K. V., Fraser, C. M., Smith, H. O. und Venter, J. C. (1995) Science 269:496-512). Versuche, Stämme zu konstruieren, die in dem kdtA-Gen mutiert waren, unter Verwendung einer Reihe von Plasmidkonstrukten, brachten keinerlei Transformanten hervor. Dies ist ähnlich zu den Ergebnissen mit Typ-b-Stämmen (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22:951-965) und es wird angenommen, dass es an der fehlenden Lebensfähigkeit dieser Mutante liegt. Es wurde aus RM118 und den isogenen Mutantenstämmen isoliertes LPS mittels T-SDS-PAGE analysiert (Daten nicht gezeigt). Es wurden Stämme, die in Genen mutiert waren, die höchstwahrscheinlich Glykosyltransferasen für die RM118-Oligosaccharidsynthese kodieren, und die im Vergleich zum Wildtyp bei T-SDS-PAGE ein verändertes Muster von LPS-Banden aufwiesen (1), für eine detaillierte Strukturanalyse ihres LPS ausgewählt, wie nachfolgend beschrieben. Es wurde ebenfalls eine Mutante untersucht, in der der lic1-Locus inaktiviert ist.
Strukturelle Charakterisierung von LPS
Eine Analyse von LPS aus dem Stamm RM118 durch T-SDS-PAGE zeigte ein heterogenes Muster von Banden, das hinsichtlich der elektrophoretischen Mobilität Populationen mit LPS niedriger molekularer Masse entsprach, die sich aus Lipid A und Oligosaccharidkomponenten zusammensetzen, die sich in der Anzahl von angehefteten Zuckerresten unterscheiden (1). Der Anmelder zeigte bereits, dass der Stamm RM118, gezüchtet unter ähnlichen Bedingungen, Populationen von LPS exprimiert, die drei bis fünf an einem gemeinsamen inneren Kernelement angeheftete Glykosereste enthalten (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem., 261: 171-180). LPS aus den Stämmen mit Mutationen in lic1, lgtF und lgtD zeigten ähnliche komplexe Bandenmuster, während die aus den Stämmen mit Mutationen in lgtC, lic2A, lpsA, orfH, rfaF und opsX weniger komplexe Bandenmuster ergaben, die Banden umfassten, die konsekutiv höhere Mobilitäten aufwiesen, übereinstimmend mit den sukzessiven Zuckerdeletionen. Eine Identifikation der Natur und der Position der Zuckerdeletionen in den LPS-Proben aus Mutantenstämmen wurde mittels komparativer Strukturanalyse erreicht. Nach dem Wachstum in Flüssigkultur wurde LPS aus isogenen Mutanten des Stamms RM118 extrahiert. Es erfolgte unter Verwendung von EST-MS und 1D ¹H-NMR-Analyse von O-deacylierten LPS (LPS-OH)-Proben ein strukturelles Fingerprinting, gefolgt von einer Behandlung mit wasserfreiem Hydrazin. Zusätzlich wurden Glykose- und Bindungsanalysen mit intakten LPS-Proben durchgeführt. Ein Vergleich der Daten, die von Mutantenstämmen erhalten wurden, die spezifisch inaktivierte mutmaßliche Glykosyltransferasegene enthalten, mit denen aus dem Strukturmodell für die Globotetraose, die RM118 LPS enthält (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem., 261:171-180) etablierte die ausschlaggebenden Strukturmerkmale der veränderten LPS-Glykoformen. ESI-MS stellt ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der strukturellen Zusammensetzung von LPS mit niedriger molekularer Masse dar (Gibson, B. W., Melaugh, W. Phillips, N. J., Apicella, M. A., Campagnari, A. A. und Griffiss, J. M. (1993) J. Bacteriol 175: 2702-2712; Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A., Krajcarski, D. und Richards, J. C. (1996) Biochem. 36: 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180; Risberg, A., Schweda, E. K. H. und Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243: 701-707; Phillips, N. J., McLaughlin, R., Miller, T. J., Apicella, M. A. und Gibson, B. W. (1996) Biochem. 35: 5937-5947). Die ESI-MS-Daten, die im Negativionenmodus auf den O-deacylierten LPS Proben erhalten wurden, sind in Tabelle 2 dargestellt. Die LPS-OH-Proben aus den Mutantenstämmen lieferten Daten, die der Anwesenheit von Oligosacchariden entsprechen, die über Kdo-4-Phosphat mit einem gemeinsamen O-deacylierten Lipid A-Rest verbunden sind, unterschiedlich bezüglich der Anzahl von Heptose-, Hexose- und Phosphat-enthaltenden Substituenten (Phillips, N. J., Apicella, M. A., Griffiss, J. M. und Gibson, B. W. (1992) Biochem. 31: 4515-4526; Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A, Krajcarski, D. und Richards, J. C. (1996) Biochem. 36: 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261:171-180; Schweda, E. K. H., Hegedus, O. E., Borrelli, S., Lindberg, A. A., Weiser, J. W., Maskell, D. J. und Moxon, E. R. (1993) Carbohydr. Res. 246:319-330; Schweda, E. K. H., Jansson, P.-E., Moxon, E. R. und Lindberg, A. A. (1995) Carbohydr. Res. 272: 213-224; Risberg, A., Schweda, E. K. H. und Jansson, P.-E. (1997) Eur. J. Biochem. 243: 701-707; Phillips, N. J., McLaughlin, R., Miller, T. J., Apicella, M. A. und Gibson, B. W. (1996) Biochem. 35: 5937-5947).
opsX-Mutante. Die Inaktivierung von opsX führte zur Bildung von Deep-Rough-LPS, das keine Heptose- oder Hexosereste enthielt, sondern lediglich ein phosphoryliertes Kdo, angeheftet am Lipid A-Rest (Tabelle 2). Wir haben bereits zuvor gezeigt, dass eine Mutation im opsX-Gen des H. influenzae-Typ-b-Stamms RM153 zu einer Verkürzung des LPS zwischen HepI und Kdo führt (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. und Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22: 951-965). Eine MS-MS-Analyse dieser LPS-OH-Probe durch kollisionale Niedrigenergieaktivierung des doppelt geladenen molekularen Ions (m/z 625) ergab ein großes Fragmention bei m/z 951 (Lipid A-OH), das aus der Spaltung der Kdo-β-D-Glukosamidbindung entstand (Daten nicht gezeigt). Die Masse dieses Fragmentions entspricht der für H. influenzae-Lipid A-OH erwarteten. (Helander, I. M., Lindner, B., Brade, H., Altmann, K., Lindberg, K. K., Rietschel, E. T. und Zahringer, U. (1988) Eur. J. Biochem. 177: 483-492). Es ist offensichtlich, dass opsX-Mutanten von RM118 und RM153 LPS exprimieren, das dem aus dem bereits zuvor charakterisierten Mutantenstamm Rdisn (I69) ähnlich ist (Helander, I. M., Lindner, B., Brade, H., Altmann, K., Lindberg, K. K., Rietschel, E. T. und Zahringer, U. (1988) Eur. J. Biochem. 177: 483-492; Preston, A., Maskell, D., Johnson, A. und Moxon, E. R. (1996) J. Bacteriol 178: 396-402). Der I69-LPS-Phänotyp ergibt sich aus einer Mutation im Heptose-Biosynthesegen gmhA (Brook, J. S. und Valvano, M. A. (1996) J. Bacteriol. 178: 3339-3341), was den Mutantenstamm außer Stande versetzt, Heptose an sein LPS zu addieren.
rfaF-Mutante. ¹H-NMR-Analyse von LPS-OH aus RM1118rfaF zeigte, zusätzlich zu der erwarteten ¹H-Resonanz von dem α-gebundenen Glukosaminrest von Lipid A, eine anomere Protonenresonanz (5,19 ppm) im Lowfield-Bereich von einer einzelnen Heptoseeinheit. Eine Zuckeranalyse bestätigte, dass der Hep-Rest L-Glycero-D-Manno-Heptose ist. Dementsprechend wurde das ESI-MS-Spektrum von einem einzelnen im Überfluss vorhandenen doppelt geladenen Ion bei m/z 721,6 dominiert, was der Struktur Hep₁-Kdo-Lipid A-OH entsprach (Tabelle 2).
orfH-Mutante.Organismen, in denen das orfH-Gen inaktiviert ist, ergaben ein Gemisch von LPS-Glykoformen, von denen jede zwei Hep-Reste enthielt, wie durch die ESI-MS-Daten belegt (Tabelle 2). Zusätzlich zu der hauptsächlichen Population von Glykoformen, die einen zusätzlichen Hep-Rest enthalten, d.h. Hep₂·PEtn_0-2Kdo-Lipid A-OH, im Vergleich zu RM118rfaF-LPS, waren Spezies, die eine Hex-PCho-Einheit enthalten. Eine Zuckeranalyse zeigte die Anwesenheit von D-Glukose an und die PCho-Methylprotonen lieferten ein intensives Signal in der ¹H-NMR bei 3,24 ppm. Wie erwartet reagierte LPS aus diesem Stamm mit TEPC-15, einem für PCho spezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) (Weiser, J. N., Shchepetov, M. und Chon, S. T. H. (1997) Infect. Immun. 65:943-950), in Immunblot-Experimenten. Eine Bindungsanalyse offenbarte die Anwesenheit von terminalen Hep-, 3-substituierten Hep- und 3,4-disubstituierten Hep-Resten (Tabelle 3). Auf der Basis der Struktur des Elternstamms entsprechen diese Daten der Tatsache, dass RM118orfH die Fähigkeit aufweist, LPS hervorzubringen, das die beiden hauptsächlichen Glykoformstrukturen 1 und 2 exprimiert (PEtn weist eine partielle Substitution auf).
Das Vorkommen von zwei Banden für das LPS aus RM118orfH bei der Analyse mittels T-SDS-PAGE (1) entspricht dieser Schlussfolgerung.
lpsA-Mutante. Eine ESI-MS-Analyse von LPS-OH aus RM118lpsA zeigte an, dass dieses Glykoformen enthält, die im Vergleich zu RM118orfH einen zusätzlichen Hep-Rest aufweisen (Tabelle 2), wobei die Phosphocholin-enthaltende Hex1-Glykoform die hauptsächliche LPS-Spezies ist (2). Eine Bindungsanalyse war in Übereinstimmung mit der sequentiellen Addition der Heptose an die terminale Hep in Struktur 2 (Tabelle 3). Dementsprechend zeigte das ¹H-NMR-Spektrum dieser O-deacylierten Probe das charakteristische Muster im Lowfield-Bereich (5,0-6,0 ppm) für das innere Kernelement der LPS-Tri-Heptose (HepII, 5,76 ppm; HepI/HepIII, 5,16/5,15 ppm) aus H. influenzae (3) (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261:171-180). Diese Daten stimmen damit überein, dass das von RM118lpsA abgeleitete LPS die Struktur 3 aufweist (2, Tabelle 4).
lic2A-Mutante. Eine ESI-MS-Analyse der O-deacylierten LPS-Proben aus dem Stamm RM118lic2A offenbarte die Anwesenheit von Hex2-Glykoformen als die hauptsächlichen LPS-Spezies (Tabelle 2). Eine Zusammensetzungsanalyse der LPS aus RM118lic2A zeigte an, die Anwesenheit von D-Glukose als der einzigen neutralen Hexose, die durch Bindungsanalyse als ein terminaler Rest bestimmt wurde (Tabelle 3). Ein signifikanter Anteil von 2-gebundenen Heptoseresten wurde ebenfalls durch Bindungsanalyse offenbart. Es ist bemerkenswert, dass keine 2-substituierten Heptosereste in der LPS-Probe aus der lpsA-Mutante detektiert wurden, aufgrund der Substitution dieses Rests durch PEtn-Gruppen (vgl. Struktur 3), die unter den im Bindungsanalyseverfahren angewandten Hydrolysebedingungen nicht einfach zu spalten sind. In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass sich LPS aus der lic2A-Mutante dahingehend von dem aus der lpsA-Mutante unterscheidet, dass es an der 2-Position von HepIII einen Glukoserest trägt, wie in Struktur 4 gezeigt ist (Tabelle 4). Das Vorhandensein eines zusätzlichen ¹H-NMR-Signals bei 4,65 ppm zeigte an, dass das terminale D-Glcp die β-Konfiguration aufweist, wobei der ins obere Feld verschobene Wert der Resonanz für HepII (5,58 ppm) im Vergleich zu dem des unsubstituierten Analogs (5,76 ppm) auf die 1,2-Bindung an HepIII hindeutet (Struktur 4) (Masoud, H., Moxon, E. R., Martin, A., Krajcarski, D. und Richards, J. C. (1996) Biochem. 36: 2091-2103; Schweda, E. K. H., Hegedus, O. E., Borrelli, S., Lindberg, A. A., Weiser, J. W., Maskell, D. J. und Moxon, E. R. (1993) Carbohydr. Res. 246, 319-330; Schweda, E. K. H., Jansson, P.-E., Moxon, E. R. und Lindberg, A. A. (1995) Carbohydr. Res. 272: 213-224).
lic3A-Mutante. In ähnlicher Weise wurde eine Mutante erzeugt, die die Untersuchung von sialylierten Glykoformen gestattet. Diese Studien bestätigten den Verlust von Sialsäure in der relevanten lic3A-Mutante. Die Erzeugung der Mutante ist in Hood et al., Mol. Microbiol. 39:341-350, 2001, beschrieben. Es wurde gefunden, dass die sialylierte Glykoform in Stämmen, die eine Zerstörung des lic3A-Gens aufweisen, nicht vorhanden ist. Es wurde gezeigt, dass lic3A eine Sialyltransferaseaktivität aufweist, die durch die Wirkung einer anderen phasenvariablen Glykosyltransferase, LgtC, modifiziert wird, die um den gleichen Laktosylakzeptorrest konkurriert.
lgtC-Mutante. In der RM118lgtC-Mutante offenbarte eine ESI-MS-Analyse der O-deacylierten LPS-Probe die Anwesenheit von Hex3-Glykoformen. Eine Zuckeranalyse zeigte an, dass LPS aus der lgtC-Mutante D-Galaktose enthält, von der mittels Bindungsanalyse gefunden wurde, dass sie als ein terminaler Rest vorhanden ist (Tabelle 3). Die Bindungsanalyse offenbarte ebenfalls 4-gebundene D-Glcp-Reste, was damit übereinstimmt, dass die hauptsächliche Hex3-Glykoform (Tabelle 3) bei HepIII durch einen Laktoserest substituiert wird (Struktur 5). Das ¹H-NMR-Spektrum des LPS-OH ist identisch mit dem, von dem wir bereits zuvor berichteten (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180), für die Laktose, die eine Hex3-LPS-Glykoform enthält, die in dem Elternstamm vorhanden ist. In N. meningitidis wurde gezeigt, dass das lgtC-Gen eine 1,4-α-Galaktosyltransferase kodiert (Wakarchuk, W. W., Cunningham, A. M., Watson, D. C. und Young, N. M. 1998. Role of paired basic residues in the expression of active recombinant galactosyltransferases from the bacterial pathogen Neisseria meningitidis. Protein Eng. 11: 295-302). Eine ähnliche Funktion wurde für lgtC aus RM118 gezeigt, durch Untersuchung der Transferaseaktivität des rekombinanten Enzyms und durch die Analyse des LPS aus der RM118lgtC-Mutante.
lgtD-Mutante. Es wurden von H. influenzae-RM118 eine Mischung aus Hex3- und Hex4-LPS-Glykoformen hervorgebracht, in denen das lgtD-Gen inaktiviert ist (Tabelle 2). Dem entsprechend wurden bei der T-SDS-PAGE-Analyse des LPS zwei Banden beobachtet, von denen die eine hinsichtlich der elektrophoretischen Mobilität der der lgtC-Mutante entsprach und eine andere eine langsamer migrierende Bande war (1). LPS aus diesem Mutantenstamm enthielt terminale und 4-gebundene D-Galp-Reste (Tabelle 3). Ein Vergleich der 1D-¹H-NMR-Spektren mit denen des Elternstamms und seiner lgtC-Mutante deutete auf das Vorhandensein einer α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-Einheit in der Hex4-Glykoform hin, wobei ein Signal bei 5,01 ppm den terminalen α-D-Galp-Rest anzeigt (Struktur 6) (Tabelle 4). Das lgtD-Genprodukt wurde mit dem synthetischen Akzeptor FCHASE-P^K auf Glykosyltransferaseaktivität hin untersucht. Ein Vergleich des Elternstamms RM118 mit den lgtD-Mutantenstämmen im CE-Assay zeigte den Verlust der β-GalpNAc-Transferaseaktivität in der Mutante (4).
lgtF-Mutante. Die Mutation des lgtF--Gens in H. influenzae ergab einen Stamm, dessen LPS weder mit dem mAb TEPC-15 reagierte (Daten nicht gezeigt) noch das charakteristische PCho-Methylprotonensignal (3,24 ppm) in seinem ¹H-NMR-Spektrum zeigte. Eine Bindungsanalyse zeigte an, dass dem LPS der terminale β-D-Glcp-Rest fehlte, der nur mono-3-substituierte HepI-Reste enthält (Tabelle 3). Es wurde eine ähnliche Verteilung von Glykoformen wie sie in dem LPS des Elternstamms gefunden wurde, die sich in der Länge der Oligosaccharidkette ab HepIII unterscheiden, für LPS-OH aus der lgtF-Mutante in deren ESI-MS beobachtet (Tabelle 2). Es ist bemerkenswert, dass die volle Ausdehnung der Globotetraoseeinheit von HepIII sowohl in der Abwesenheit als auch in der Anwesenheit des β-D-Glcp-Restes an HepI auftreten kann (5). Der Anmelder hat gezeigt, dass der Elternstamm, gemischte Populationen von LPS-Glykoformen hervorbringen kann, in denen die Galabioseeinheit durch die Addition eines terminalen β-D-GalpNAc-Restes verlängert ist, was die Globotraoseeinheiten β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp ergibt (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180).
lic1-Mutante. Die ESI-MS-Analyse von O-deacyliertem LPS aus der lic1-Mutante ergab ein ähnlich heterogenes Gemisch von Glykoformen (Tabelle 2) wie das im Elternstamm beobachtete (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180); es waren jedoch keine PCho-Substituenten vorhanden. Es wurde gezeigt, dass der lic1-Locus Gene enthält, die für die Expression von PCho-Substituenten an der 6-Position des an der 3,4-disubstituierten Heptose (HepI) befestigten β-D-Glcp in RM 118 verantwortlich sind (Risberg, A., Masoud, H., Martin, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. und Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261: 171-180; Weiser, J. N., Shchepetov, M. und Chong, S. T. H. (1997) Infect. Immun. 65: 943-950). Eine Untersuchung des ¹H-NMR-Spektrums von O-deacyliertem LPS aus RM118lic1 offenbarte die Abwesenheit des charakteristischen PCho-Methylprotonensignals bei 3,24 ppm. Zusätzlich reagierte das LPS aus dieser lic1-Mutante wie erwartet (34) nicht mit dem mAb TEPC-15 (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 2
Substitutionen und Modifikationen des inneren Kernrests
Im NTHi-Stamm 2019 ist HepI durch Laktose substituiert (R₁ = β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp; R₂/R₃ = H) (N. J. Phillips et al., Biochemistry, 31 (1992) 4515-4526). Im NTHi-Stamm 375 ist HepIII durch sialylierte Laktose in einer kleineren Glykoformpopulation substituiert (R₁ = β-D-Glcp, R₂ = H, R₃ = Neu5Ac-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→2)) (D. W. Hood et al., Mol. Micro., 33 (1999) 679-692). Dieses Beispiel fasst unter Verwendung von Methylierungsanalyse, Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) und NMR die Ergebnisse von Strukturuntersuchungen von LPS aus 4 NTHi-Stämmen zusammen.
Die nicht typisierbaren H. influenzae-Stämme 486, 176, 285 und 1159 wurden aus der Stammsammlung von Prof. Eskola (siehe Hood, supra) als Teil der Finnish Otitis Media Cohort Studie erhalten und sind aus dem Innenohr erhaltene Isolate. Bakterien wurden in Brain-Heart-Infusion (BHI)-Bouillon (Difco^TM) (3,7 % w/v), das Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) (2 μg/mL), Haemin (10 μg/mL) und Neuraminsäure (NeuAc; 50 μg/mL) enthält, bei 37°C gezüchtet. LPS wurde aus lyophilisierten Bakterien unter Verwendung der Phenol-Chloroform-Petroleum-Ether-Methode, gefolgt von Ultrazentrifugation, erhalten (A. Risberg et al., Eur. J. Biochem., 261 (1999) 171-180). Es wurden unter Verwendung von auf MS basierenden Verfahren und Hochfeld-NMR-Techniken detaillierte Struktursstudien an Oligosaccharidproben durchgeführt, die entweder durch O-Deacylierung mit wasserfreiem Hydrazin (37°C, 1 h) oder Spaltung der ketosidischen Kdo-Bindung mit verdünnter wässriger Essigsäure (100°C, 2h) von LPS-Proben erhalten wurden.
Kompositionelle Zuckeranalysen von LPS aus den NTHi-Stämmen 486, 176, 285 und 1158 zeigten alle D-Glukose (Glc), 2-Amino-2-Desoxy-D-Glukose (GlcN) sowie L-Glycero-D-Manno-Heptose (Hep) als Hauptkomponenten an, identifiziert durch GLC-MS ihrer entsprechenden Alditolacetate und 2-Butyl-Glykosidderivate. Zusätzlich wurde in den Stämmen 486, 176 und 1158 D-Galaktose (Gal) identifiziert. Außerdem wurde gefunden, dass D-Glycero-D-Manno-Heptose eine Hauptkomponente im Stamm 1158 darstellt. Dieser Zucker wurde vor kurzem zum ersten Mal als eine Komponente in H. influenzae-LPS in dem NTHi-Stamm 9274 identifiziert (M. M. Rahman et al., Glycobiology, 9 (1999) 1371-1380). Die Behandlung von O-deacyliertem LPS (LPS-OH) mit Neuraminidase, gefolgt von Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie und ESI-MS zeigte an, dass Sialsäure (NeuAc) eine Hauptkomponente in dem NTHi-Stamm 486 ist. In den NTHi-Stämmen 176, 285 und 1158 wurden geringere Mengen detektiert.
Eine ESI-MS von LPS-OH-Proben zeigte heterogene Gemische von Glykoformen in allen Stämmen an. Ein Teil des ESI-MS-Spektrums von LPS-OH aus NTHi 486 ist in 8 gezeigt. Vorgeschlagene Zusammensetzungen für die hauptsächlichen LPS-Glykoformen der NTHi-Stämme sind in Tabelle 5 gezeigt. Alle Glykoformen enthalten den konservierten PEtn-substituierten Triheptosylrest des inneren Kerns, welcher über einen phosphorylierten Kdo-Linker an dem mutmaßlichen O-deacylierten Lipid A (Lipid A-OH) befestigt ist.
PCho ist in allen Stämmen als eine Hauptkomponente vorhanden. Die Anwesenheit von zwei PCho in einer Hex2-Glykoform ist für den Stamm 1158 angezeigt. Die kürzeste Glykoform (Hex1) wird für den Stamm 285 beobachtet.
Die Daten der Methylierungsanalysen der LPS-Proben sind in Tabelle 6 angegeben. Es ist bemerkenswert, dass in den Stämmen 176 und 486 nur Spuren von 2-substituiertem Hep, einer integralen Komponente von zuvor bereits veröffentlichten H. influenzae-Strukturen, detektierbar waren. Stattdessen wurden signifikante Mengen von 3-substituiertem Hep detektiert, was auf ein neues Substitutionsmuster im üblichen L-α-D-Hepp-(1→2)-L-α-D-Hepp-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→4)-]-L-α-D-Hepp-(1→5)-α-Kdop inneren Kernelement von H. influenzae-LPS hindeutet. Die kompletten Strukturen für die hauptsächlichen Glykoformen in den Stämmen 176 und 486 wurden mittels NMR bestimmt und die Ergebnisse sind nachfolgend zusammengefasst. Eine Methylierungsanalyse des Stamms 285 offenbarte, inter alia, große Mengen an terminaler L,D-Hep zusätzlich zu 3,4-disubstituierter Hep, was auf eine Abwesenheit der Substitution des inneren Triheptosyl-Kernrests (d.h. R₂ und R₃ = H) an HepII und HepIII hindeutet. Die komplette Struktur der Hex1-Glykoform in diesem Stamm (9) wurde mittels NMR an LPS-OH bestimmt (Daten nicht gezeigt). Eine Methylierungsanalyse des Stammes 1158 zeigte, inter alia, 6-substituierte D-Glc und terminale D,D-Hep, welche dem strukturellen Element D-α-D-Hepp-(1→6)-β-D-Glcp-(1→4)-L-α-D-Hepp zugeordnet werden könnten, was durch NMR gezeigt wurde (Daten nicht gezeigt). Es wurde gefunden, dass die hauptsächliche LPS-Glykoform an HepII (R2 = α-D-Glcp) und HepIII (R3 = PCho-6-β-D-Glcp) substituiert war. Eine provisorische Struktur der Hauptglykoform in NTHi 1158 ist in 10 dargestellt.
Strukturelle Details von NTHi 176. Eine partielle Säurehydrolyse von LPS mit verdünnter Essigsäure führte zu einem unlöslichen Lipid A und zu Oligosaccharid-Kernfraktionen, die mittels GPC getrennt wurden (11), was Fr. 1, Fr. 2 und Fr. 3 ergab. Die Daten der Methylierungsanalyse für diese Fraktionen sind in Tabelle 6 dargestellt. Die Anwesenheit von 3- und 6-substituierter Gal und 4-substituierter GlcN in Fr. 1 wies auf das Vorhandensein neuer struktureller Merkmale für dieses Oligosaccharid hin. Eine CE-ESI-MS von Fr. 1 offenbarte, inter alia, ein bedeutendes doppelt geladenes Ion bei m/z 1214,0, was auf eine Glykoform mit wesentlich größerem Molekulargewicht (HMG) in dieser Fraktion hindeutet, als in Fr. 2 und Fr. 3 beobachtet wurde. Eine ähnliche Beobachtung wurde für NTHi 285 gemacht (siehe unten). Das ESI-MS-Spektrum von Fr. 2 (Daten nicht gezeigt) zeigte an, dass die hauptsächlichen Glykoformen die Zusammensetzungen PCho1·Hex₂·Hep₃·PEtn·AnKdo-ol und PCho₁·Hex₃·Hep₃·PEtn·AnKdo-ol aufweisen. Die ESI-MS für Fr. 3 (Daten nicht gezeigt) zeigte hauptsächliche Glykoformen mit den jeweiligen Zusammensetzungen Hex₃·Hep₃·PEtn·AnKdo-ol und Hex₄Hep₃·PEtn·AnKdo-ol.
Die Struktur der Hex3-Glykoform in Fr.2 konnte mittels detaillierte ¹H-NMR-Analyse bestimmt werden. Das ¹H-NMR-Spektrum von Fr.2 ist in 12 dargestellt. Das charakteristische Signal für die Methylgruppen von PCho wurde bei δ 3,24 beobachtet. Anomere Resonanzen von HepI-HepIII wurden jeweils bei 5,03-5,13, 5,83 bzw. 5,26 identifiziert. Die Unterspektren, die Glc I, Glc II und Gal entsprechen, wurden in 2 D-COSY- und TOCSY-Spektren bei δ 4,56, 4,62 bzw. 4,64 identifiziert. In Übereinstimmung mit den Methylierungsanalysen deuten die Daten der chemischen Verschiebung darauf hin, dass Glc II und Gal terminale Reste sind. Der feldabwärts verschobene Wert für H-6,6' von Glc I bei δ 4,3 deutete darauf hin, dass dieser Rest an dieser Position mit PCho substituiert wird. Die interresidualen NOE-Konnektivitäten zwischen den Protonenpaaren Glc II H-1/Glc I H-4, Glc I H-1/Hep I H-4, 6 (13) etablierten die Sequenz einer Disaccharideinheit und deren Befestigungspunkt an HepI als β-D-Glcp-(1→4)-[PCho→6]-β-D-Glcp-(1→4)-L-α-D-Hepp-(1→. Der interresiduale NOE zwischen H-1 von Gal und H-3/H-2 von HepIII bestätigte die eine β-D-Galp-(1→3)-L-α-D-Hepp-(1→-Einheit. Aus den kombinierte Daten konnte daher die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die PCho-substituierte Hex3-Glykoform die Struktur 2 aufweist (14). Die Methylierungsanalyse von Fr. 2 zeigte eine beträchtliche Menge an terminaler Hep und es konnte die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die in den ESI-MS-Spektren beobachtete PCho-substituierte Hex2-Glykoform die Struktur 3 aufweist (14).
Das ¹H-NMR-Spektrum von Fr. 3 ist in 12 dargestellt. In Übereinstimmung mit den ESI-MS-Daten ist es offensichtlich, dass PCho nicht in dem gleichen hohen Maß wie in Fr. 2 exprimiert wird, da das Signal für Methylprotonen von PCho von geringer Intensität ist. Die Signale für anomere Protonen von HepI-HepIII schwingen bei annähernd identischen chemischen Verschiebungen wie die Entsprechenden in Fr. 2. Bei δ 5,26 wird die anomere Resonanz eines α-gebundenen terminalen Glc-Restes (Glc III) beobachtet. Die anomere Region für β-gebundene Hexosen erwies sich als heterogener als in Fr. 2. In 2D-Spektren wurden Spin-Systeme für terminale Glc-Reste bei δ 4,50 und 4,45 beobachtet. Eine 4-substituierte Glc und zwei terminale Gal-Reste wurden bei δ 4,56, 4,61 und 4,54 identifiziert. Die NOE-Daten bestätigten die Anwesenheit des strukturellen Elements Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-L-α-D-Hepp-(1→ wie an HepIII gebundene Gal.
Zusätzlich bestätigten die NOE-Konnektivitäten, dass die α-gebundene Glc an der 3-Position von HepII befestigt ist. Die kombinierten Fakten führen zu der wie in Tabelle 4 gezeigten Struktur der Hex4-Glykoform (8). In Übereinstimmung mit der Methylierungsanalyse, die 2-substituierte Hep und terminale Hep zeigt, wird die Schlussfolgerung gezogen, dass die Hex3-Glykoformen die Strukturen 5 und 6 aufweisen (14).
Strukturelle Details von NTHi 486. Die Struktur des hauptsächlichen LPS von Glykoform NTHi 486 wurde nach umfangreicher Anwendung von ESI-MS, NMR und Methylierungsanalyse an LPS-OH- und Oligosaccharidmaterial (OS-1) etabliert, das nach milder Säurehydrolyse erhalten wurde (15). Wie für Stamm 176, ist HepIII an der O-3-Position substituiert, jedoch in diesem Fall durch einen Glukoserest. NTHi 486-LPS ist in höchstem Maße mit an die terminale β-Galaktose eines Laktoserests gebundener Neu5Ac sialyliert.
Im ¹H-NMR-Spektrum von LPS-OH wurden fünf diskrete Signale von annähernd gleicher Fläche zwischen δ 5,8 und 5,0 beobachtet. Drei von diesen Signalen entsprachen den H-1-Signalen der drei Heptosereste (HepI-HepIII) in der inneren Kernregion. Das anomere Signal eines α-gebundenen Glukoserests (Glc I) wurde bei δ 5,28 (J 3,8 Hz) identifiziert, anomere Signale, die den β-gebundenen Hexosen entsprachen, wurden zwischen δ 4,52 und 4,42 identifiziert. Im ¹H-NMR-Spektrum von OS-1 wurden anomere Resonanzen der Heptosen so wie eine Acetylierungsstelle bei δ 5,83-5,75 (1H, nicht aufgelöst) und δ 5,14-5,04 (3H, nicht aufgelöst) beobachtet. Ein intensives Signal, das den Methylprotonen von einer O-Acetylgruppe entspricht, wurde bei δ 2,17 beobachtet, was mit einem ¹³C-Signal bei δ 21,0 im HSQC-Spektrum korrelierte. Die Sequenz der Glykosen innerhalb der inneren Kernregion wurde aus transglykosidischen NOE-Konnektivitäten etabliert, die anomere und aglykonische Protonen auf benachbarten Resten zueinander in Bezug setzen. Die Signale für die Methylprotonen von PCho wurden bei δ 3,21 (LPS-OH) und δ 3,23 (OS-1) beobachtet und die Spin-Systeme für Ethylenprotonen von diesem Rest und von PEtn waren ähnlich den zuvor beobachteten (A. Risberg et al., Eur. J. Biochem., 261 (1999) 171-180). ¹H-³¹P-NMR-Korrelationsstudien von LPS-OH und OS-1 zeigten, dass PCho und PEtn an Glc I- bzw. HepII-Reste gebunden sind. Charakteristische Signale der H-3-Methylenprotonen von Sialsäure wurden bei δ 1,79 (H-3_ax, J_3ax, 3_eq = 12,3 Hz) und bei δ 2,73 (H-3_eq, J_3eq, 4 = 4,3 Hz) im ¹H-NMR-Spektrum von LPS-OH beobachtet. Der interresiduale NOE zwischen H-3_ax von Neu5Ac und H-3 eines Gal-Restes bestätigte, dass die Sialsäure 2,3-gebunden an Galaktose ist, wie durch die Methylierungsanalysen angedeutet, α-D-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Galp-(1→. Einige Werte der chemischen Verschiebung für eine Anzahl von Nuklei in HepIII von OS-1 unterschieden sich erheblich von den entsprechenden chemischen Verschiebungen in LPS-OH. Verschiebungen ins untere Feld wurden für H-2 (+0,99 ppm), H-1 (+0,03 ppm), H-3 (+0,22 ppm) und C-2 (+1,2 ppm) von HepIII in OS-1 erhalten, während C-1 (-3,3 ppm) und C-3 (-2,5 ppm) ins obere Feld verschoben waren. Es war daher angezeigt, dass HepIII an der O-2-Position acetyliert war. Die Acetylierungsstelle wurde durch das HMBC-Experiment weiter bestätigt, wo eine Korrelation zwischen dem Carbonylkohlenstoff (δ 174,0) und H-2 von HepIII zu sehen war. Zusätzlich wurde ein Crosspeak zwischen dem Carbonylkohlenstoff und den Methylprotonen der O-Acetylgruppe beobachtet, wodurch die Identität des Substituenten festgestellt wurde.
ESI-MS und Methylierungsanalyse von LPS aus der lpsA-Mutante von NTHi 486 zeigten das Fehlen einer Kettenverlängerung ab HepIII an. Die Methylierungsanalyse von O-deacyliertem Material zeigte terminale Glc, terminale Hep, 3,4-disubstituierte Hep, 2,3-disubstituierte Hep und 6-substituierte GlcN im relativen Verhältnis 34:39:20:3:4. Im ESI-MS-Spektrum von LPS-OH konnten zwei hauptsächliche dreifach geladene Ionen bei m/z 812,9/853,9 gesehen werden, was PCho·Hex₂·Hep₃·PEtn_1-2·P₁·Kdo₁·Lipid A-OH entsprach.
Glykoformen mit hohem Molekulargewicht in NTHi 176 und 285. Nach milder Säure-Hydrolyse von LPS aus NTHi 285 zeigte eine Gelfiltration eine kleinere Fraktion, die eine Glykoform mit höherem Molekulargewicht enthielt, zusammen mit einer Hauptfraktion, die die in 9 gezeigte Glykoform enthielt. Eine Zuckeranalyse dieser Fraktion mit hohem Molekulargewicht (HMW-Fraktion) zeigte D-Glc, D-Gal, D-GlcNAc und L,D-Hep an und eine Methylierungsanalyse ergab terminale Gal, 3-substituierte Gal, 6-substituierte Gal, 4-substituierte GlcNAc, terminale Hep und 3,4-disubstituierte Hep. Eine CE-ESI-MS zeigte, inter alia, ein hauptsächliches doppelt geladenes Ion bei m/z 1052. MS/MS dieses Ions ergab ein ähnliches Fragmentierungsmuster wie m/z 1214, beobachtet für HMW von NTHi 176 (siehe oben). Insbesondere wurde ein Tochterion bei m/z 692 beobachtet, was einer Zusammensetzung PChoHex-Hex-HexNAc entspricht.
Beispiel 3
Erzeugung monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen die Haemophilus influenzae-Rd lic1lpsA-Doppelmutante
Es wurden weibliche, 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse intraperitoneal mit durch Formalin getöteten ganzen Rd lic1lpsA-Zellen immunisiert. Pro Injektion erhielt jede Maus 10⁸ Zellen in 0,5 mL PBS. Die Mäuse wurden an Tag 14 und 35 geboostet und an Tag 45 wurde ihnen eine Blutprobe entnommen. Den beiden Mäusen, die den höchsten Antikörpertiter gegen das homologe LPS aufwiesen, wurden an Tag 56 zwei finale Injektionen verabreicht, eine i.p.-Injektion wie bereits zuvor und eine intravenöse Injektion in 0,1 mL PBS. Die Fusion erfolgte drei Tage nach der letzten Injektion. Es wurden stimulierte Milzzellen der beiden immunisierten Mäuse mit SP2/O-Ag14-Myelomzellen in einem Verhältnis von 10:1 in 33% PEG 1450 fusioniert. Mutmaßliche Hybride, die die Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin (HAT)-Selektionierung überlebten, wurden mittels ELISA auf homologes Rd lic1lpsA-LPS und heterologes Rd LPS gescreent. Es wurden Hybridome, die den relevanten Antikörper produzierten, zweimal unter Verwendung einer limitierenden Verdünnung kloniert, um Stabilität und Klonalität zu gewährleisten. Unter Verwendung eines EIA-Maus-mAb-Isotypisierungs-Kits (Amersham Canada, Oakville, ON) wurde die Ig-Subklasse im verbrauchten Überstand bestimmt. Es wurden 10-14 Tage nach der i.p.-Behandlung mit 0,5 mL 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristan) Klone als Aszitesflüssigkeit mittels intraperitonealer Injektion von 10⁶ Hybridomzellen in BALB/c-Mäusen vermehrt. Aszitesflüssigkeit wurde 7-14 Tage nach der Injektion entnommen.
Indirekter ELISA. Es wurden Kulturüberstand und Aszitesflüssigkeit in 96-Well Nunc Maxisorp EIA-Platten auf aufgereinigtes LPS untersucht. Die Wells wurden für 3 h bei 37°C mit 1,0 μg LPS in 100 μl 0,05 M Karbonatpuffer (pH 9,8), der 0,02 M MgCl₂ enthält, beschichtet und dann mit 200 μl 1% BSA-PBS für 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Nach Waschen mit PBS-7 (0,05% Tween 20) wurden Proben des Kulturüberstands oder Aszites, seriell verdünnt in 1% BSA-PBS, zugegeben und für 1-3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und es wurde mit alkalischer Phosphatase markiertes Ziege-anti-Maus-IgG (Cedarlane Laboratories, Hornby, ON), 1:3.000 in 1% BSA-PBS verdünnt, für 1 h bei Raumtemperatur zugegeben. Die Platten wurden mit dem p-NPP Phosphat Substrat System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersberg, MD) entwickelt. Nach 30-60 Minuten wurden die Platten bei 410 nm in einem Dynatech EIA Plattenlesegerät gescannt.
Ergebnisse. Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit in Formalin getöteten ganzen Zellen aus Rd lic1lpsA, Fusion, und das initiale ELISA-Screening auf das homologe LPS und das heterologe Rd-LPS, resultierten in der Bestimmung von 12 Hybridomen. Nach dem Testen der 12 mAbs gegen ein Panel von Rd-Mutanten-LPS, wurden zwei mAbs, LLA5, IgG_2a und LLA4, IgG_2b, für weiteres Testen ausgewählt. Es wurde gefunden, dass LLA5 mit 14 von 25 LPS aus nicht-typisierbaren Stämmen kreuzreagiert, während LLA4 das homologe LPS erkannte. Eine Strukturanalyse zeigte, dass LLA5 die Glykoformen mit hohem Molekulargewicht detektierte, während LLA4 an ein in dem homologen Stamm vorhandenes Epitop des inneren Kerns band.
Beispiel 4
Herstellung des Hi-Rdlic1lpsA-LPS-OH-BSA-Konjugats
LPS aus dem H. influenzae-Doppelmutantenstamm Rdlic1lpsA wurde gemäß dem Phenol-Wasser-Extraktionsprotokoll isoliert und gereinigt und mittels Behandlung mit wasserfreiem Hydrazin gemäß den zuvor bereits beschriebenen Verfahren, O-deacyliert. Eine Zuckeranalyse zeigte an, dass der Oligosaccharidanteil des LPS-OH L-Glycero-D-Manno-Heptose und Glukose als die einzigen detektierbaren Aldosen enthielt. Eine ESI-MS des LPS-OH offenbarte ein doppelt geladenes Ion bei m/z 1056,5, was einer molekularen Masse von 2114,9 Da entspricht, was mit der erwarteten Zusammensetzung von Glc (HepIII·PEtn·Kdo·P-Lipid A-OH (1) übereinstimmt. ¹H-NMR zeigte deutlich wohl definierte anomere Signale der Heptosereste bei 5,16 (HepI), 5,15 (HepIII) und 5,76 ppm (HepII) für den konservierten Triheptosylrest, ähnlich dem von LPS-OH, beobachtet für die RdlpsA-Einzelmutante (Beispiel 1). In der ¹H-NMR war kein durch PCho-Methylresonanzen hervorgerufenes Signal detektierbar (Risberg et al., Eur. J. Biochem. 261:171-180, 1999).
Beispiel 5
Immunisierung mit Kohlenhydrat (CHO)-BSA-Konjugat, gefolgt von nicht konjugiertem CHO.
Das LPS-OH aus dem vorangegangenen Beispiel kann gemäß dem in Gu et al., Infect. Immun. 64:4047-4053, 1996, beschriebenen Verfahren an BSA konjugiert werden. Alternativ dazu kann es über die Kdo-Carboxylgruppe mit M₂C₂H(4(4-N-Maleimidomethyl) Cyclohexan 1-Carboxylhydrazid.1/2-Dioxan) gemäß der von Wei Zou vom National Research Council of Canada entwickelten Methode an BSA konjugiert werden, wie in C beschrieben. Zusammenfassend wurde LPS-OH über selektive Aktivierung der Kdo-Carboxylgruppe mit EDC und die Verwendung der im obigen Schema dargestellten Linkerstrategie an BSA konjugiert.
Es wurden weibliche 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse intraperitoneal mit Rd lic1lpsA odA LPS-BSA-Konjugat immunisiert. Jede Maus erhielt per Injektion 2 μg Kohlenhydrat in 0,2 mL komplettem Ribis-Adjuvans (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, ON). An Tag 21 und 42 wurden die Mäuse mit einer äquivalenten Menge an konjugiertem Impfstoff geboostet. An Tag 137 erhielten die Mäuse eine finale i.p.-Injektion, die 10 μg 1003 lic1lpsA odA LPS in Ribi enthielt, und an Tag 147 wurde Serum entnommen.
Beispiel 6
Erzeugung der monoklonalen Antikörper LLA4 und LLA5 gegen Haemophilus influenzae-Stämme
Stämme mit definierten Mutationen in der LPS-Biosynthesemaschinerie können dazu verwendet werden, monoklonale Antikörper (mAbs) gegen definierte LPS-Oligosaccharidstrukturen zu produzieren. Es wurden murine mAbs gegen H. influenzae-Mutantenstämme erzeugt, die den konservierten Rest des inneren Kerns enthielten. Es wurden z. B. BALB/c-Mäuse mit in Formalin getöteten ganzen Zellen aus Rd lic1lpsA immunisiert. Ein initiales ELISA-Screening auf das homologe LPS und heterologe Rd LPS resultierte in der Bestimmung von 12 Hybridomen. Nach dem Testen der 12 mAbs gegen ein Panel mutierter Rd LPS wurden zwei mAbs, LLA5, IgG_2a und LLA4, IgG_2b, für weiteres Testen ausgewählt.
Es wurde gefunden, dass LLA4 ein in dem homologen Stamm vorhandenes Epitop des inneren Kerns erkennt. Bei ELISA-Tests zeigte LLA5 eine Kreuzreaktivität mit gereinigtem LPS aus einem Mehrheitsstamm aus einer genetisch vielfältigen Kultursammlung (LPS aus 14 von 25 nicht typisierbaren Stämmen) (Tabelle 1). Das von dem mAb LLA5 erkannte Epitop war in der RdlpsA-Einzelmutante und in der stärker verkürzten Rdlic1 orfH-Doppelmutante, der der HepIII-Rest fehlt, vorhanden (Tabelle 2). Das LLA5-Epitop ist in LPS aus der Einzelmutante RdlgtF nicht vorhanden. Wie bereits zuvor erwähnt, ist das lgtF-Gen zur Addition des β-D-Glc-Rests an die 4-Position von HepI erforderlich.
Überraschenderweise zeigte ein Vergleich des LPS aus den 25 Stämmen, der mittels im Stand der Technik bekannten Strukturanalysetechniken durchgeführt wurde, dass der mAb LLA5 ein Lacto-N-Neotetraose (LNnT)-enthaltendes Oligosaccharidepitop detektiert, das aus der Kettenverlängerung ab der HepI-Einheit des Rests des inneren Kerns entsteht. Die Stämme, die nicht von dem mAb LLA5 erkannt wurden, wurden durch die Abwesenheit der LNnT-enthaltenden Kettenverlängerungen charakterisiert. H. influenzae-Stämme, die die LNnT-enthaltende Kettenverlängerung exprimieren, exprimieren diese unter Standard-Laborbedingungen nur in einem geringen Ausmaß. Aufgrund niedriger Expressionslevels wurde sie in dem Stamm Rd zuvor nicht identifiziert (Risberg et al., Eur. J. Biochem. 261:717-180, 1999). Sie wurde nunmehr isoliert und charakterisiert, durch Freisetzen des Kernoligosaccharids der LPS aus dem Stamm Rd (RM118) durch milde Säurehydrolyse und der Auftrennung durch Gelpermeationschromatographie auf Biogel P-4 (11), Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind. Die LNnT-enthaltende Kernoligosaccharidfraktion eluiert als eine kleinere Komponente mit hohem Molekulargewicht und wird als "HMW-Fraktion" bezeichnet. Im Vergleich zu dem höheren Peak (zentriert bei 400), der die hauptsächlichen Glykoformen umfasste, die für den Stamm Rd identifiziert wurden (Risberg et al., 1999, siehe oben), handelt es sich hierbei um eine geringere Komponente. Das HMW-Kernoligosaccharid aus dem Stamm Rd wurde mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Techniken dahingehend charakterisiert, dass es LNnT-enthaltende Kettenverlängerungen ab HepI aufweist (Thibault und Richards, In methods in Molecular Biology, Bd. 145,: Bacterial toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Hrsg.) pp 327-344, Humana Press, 1999, und darin enthaltenen Referenzen). Das Fragmentierungsmuster in der ESI-MS/MS zeigte die Anwesenheit der LNnT-Oligosaccharid-Kettenverlängerung an, die die Sequenz Gal-GlcNAc-Gal-Glc aufweist und durch die terminale Zuckereinheit PEtn-GalNAc geschützt wird (B).
Wird der Stamm Rd in Sialsäure-enthaltendem Medium gezüchtet, so werden LPS-Glykoformen exprimiert, die die sialylierten Oligosaccharide enthalten. Der Anmelder fand, dass Sialyl-Laktose die Struktur α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glc aufweist, die als eine Oligosaccharidverlängerung ab HepIII angeheftet ist. Des weiteren wurde diese Oligosaccharidverlängerung in einigen NTHi-Stämmen identifiziert. Das phasenvariable Gen lic3A kodiert die Sialyltransferase, die CMP-Neu5Ac an den Laktoseakzeptor addiert. Sialylierte Analoga von LNnT-Kettenverlängerungen sind im LPS in Stamm Rd detektierbar, wenn der Organismus unter den beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird. Sialylierte LNnT-Oligosaccharid-Kettenverlängerungen vom LPS des inneren Kerns mit der Struktur α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp sind in der RdlgtClic3A-Doppelmutante leicht durch ES-MS von O-deacyliertem LPS zu detektieren. Unter Verwendung von MS/MS-Techniken, nuklearen Hochfeld-Magnetresonanztechniken und Methylierungsanalyse, die alles Verfahren zur Strukturanalyse und dem Fachmann bekannt sind, bestätigten wir, dass die Struktur von LPS im konservierten inneren Kern sialylierte LNnT-enthaltende Kettenverlängerungen aufweist. Wir fanden, dass H. influenzae zum Addieren der LNnT-enthaltenden Oligosaccharid-Kettenverlängerungen von einem Blockierungsmechanismus Gebrauch macht, an welchem Gene des rfb-Locus beteiligt sind. Es liegt eine absolute Korrelation zwischen der Anwesenheit des rfb-Gens und der LNnT-Bildung in allen untersuchten Hi-Stämmen vor.
LPS aus den NTHi-Stämmen, die reaktiv mit dem mAb LLA5 sind, weisen nach milder Säurehydrolyse in den Gelpermeationschromatogrammen ebenfalls eine Fraktion mit hohem Molekulargewicht (HMW) auf. So weist z. B. LPS aus dem NTHi-Stamm 285 die kleinere HMW-Fraktion auf, für die das Vorhandensein von LNnT-enthaltenden Kettenverlängerungen, ebenfalls geschützt durch eine PEtn-GalNAc-Einheit, aus dem MS/MS-Fragmentierungsmuster charakterisiert sind (B). Weitere Bestätigung für diese LNnT-enthaltende Oligosaccharid-Kettenverlängerung wurde aus einem MS/MS/MS- Experiment erhalten. In den milden Säurehydrolysaten der LLA5-unreaktiven Stämme, z. B. im NTHi-Stamm 1247, ist keine detektierbare HMW-Fraktion zu finden (Tabelle 7).

Tabelle 1. Mit LPS in Beziehung stehende Gene, die in dieser Studie im Stamm RM118 untersucht wurden. HI-Zahlen sind die ORF-Bezeichnungen, die vom TIGR für die Gensequenzdatenbank von dem H. influenzae vergeben wurden. Die in Fettdruck angegebenen Gene sind jenel, die für detaillierte vergleichende Analyse der exprimierten LPS-Glykoforme ausgewählt wurden.

6. Hood, D.W., Deadman, M.E., Allen, T., Masoud, H., Martin, A., Brisson, J.R, Fleischmann, R., Venter, J.C., Richards, J.C., und Moxon, E.R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965
7. Weiser, J.N., Maskell, D.J., Butler, P.D., Lindberg, A.A., und Moxon, E.R. (1990) J. Bacteriol. 172, 3304-3309.
9. High, N.J., Deadman, M.E., und Moxon, E.R (1993) Mol. Microbiol. 9,1275-1282

Tabelle 4. Strukturen der überwiegenden LPS-Glykoforme mit zunehmender Oligosaccharid-Kettenlänge von HepIII in mutierten Stämmen von H. influenzae RM118.
Tabelle 5. Negativionen-ESI-MS-Daten und vorgeschlagene Zusammensetzungen für die überwiegenden Glykoforme in O-deacylierten LPS von NTHi Stämmen 176, 486, 285 und 1158. Ein Stern (*) zeigt vorherrschende Ionen an
Tabelle 6 Bindungsanalysedaten für LPS von NTHi-Stämmen 176, 486, 1158, 285 und von NTHi 176 LPS erhaltenen Oligosacchariden.
Tabelle 7 Rd lic1lpsA odA-BSA plus 1003 lic1lpsA odA LPS Tag 147 Seren & LLA5 MAb vs Haemophilus-Mutant & LPS von nicht typisierbarem Stamm

Claims

Isolierter Lipopolysaccharidrest bestehend aus einem Triheptosyl-inneren Kernrest, der die Struktur II hat:
wobei, R¹ Wasserstoff, β-D-Glcp (1→4), oder PCho→6)-β-D-Glcp (1→4) ist; R² Phosphat (P) oder Pyrophosphorethanolamin (P-PEtn) ist; R³ Wasserstoff, β-D-Glcp oder β-D-Galp ist, und wenn R¹ Wasserstoff oder β-D-Glcp (1→4) ist, dann R³ auch β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp, α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp, β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp, oder α-NeuAc (2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→3) sein kann, wobei R³ entweder an der O-3 oder O-2 Position von HepIII angefügt ist; und Kdo 3-Deoxy-D-Manno-2-Oktulosonsäure ist; und Lipid A detoxifixiert ist.
Arzneimittel umfassend den Lipopolysaccharidrest nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger immunogen ist.
Antikörper der spezifisch an den Lipopolysaccharidrest nach Anspruch 1 bindet.
Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines kreuzreaktiven Antikörpers gegen Haemophilus influenzae das umfasst: (a) Generierung von Antikörpern gegen den Lipopolysaccharidrest nach Anspruch 1; (b) Testen solcher Antikörper gegen eine Vielzahl von Haemophilus influenza Stämmen; und (c) Auswahl der Antikörper, die kreuzreaktiv sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Haemophilus influenzae ein nicht-typisierbares Haemophilus influenzae ist.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit die durch Infektion mit Haemophilus influenzae verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Haemophilus influenzae ein nicht-typisierbares Haemophilus influenzae ist.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Otitis media, Pneumonie, und Infektion des Respirationstrakts.
Haemophilus influenzae Stamm Rd lic1lpsA Zugangsnummer ISAC 250801-1.
Haemophilus influenzae Stamm 1003 lic1lpsA Zugangsnummer ISAC 250801-2.
Verfahren zur Herstellung eines Lipopolysaccharidrests bestehend aus einem konservierten Triheptosyl-inneren Kernrests, der die Struktur II hat:
wobei, R¹ Wasserstoff, β-D-Glcp(1→4), oder PCho→6)-β-D-Glcp(1→4) ist; R² Phosphat (P) oder Pyrophosphorethanolamin (P-PEtn) ist; R³ Wasserstoff, β-D-Glcp, β-D-Galp, β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp, α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp ist und wenn R¹ Wasserstoff oder β-D-Glcp(1→4) ist, dann R³ auch β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp, oder α-NeuAc (2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→3) sein kann, wobei R³ entweder an der O-3- oder O-2-Position von HepIII angefügt ist; und Kdo 3-Deoxy-D-Manno-2-Oktulosonsäure ist; das Verfahren umfassend: – Transformation eines Empfänger Haemophilus influenzae bakteriellen Stamms mit einem oder mehreren inaktivierten Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lpsA, lic1, lic2, lic2A, lic2orf3, lic2B, lic3A, lgtC, lgtD, und gtF; – Kultivierung des transformierten Haemophilus influenzae bakteriellen Stammes unter Bedingungen die zur Expression des Lipopolysaccharidrests geeignet sind; – Isolierung des Lipopolysaccharidrests; und – Detoxifizierung des Lipid A Teils des Lipopolysaccharidrests.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Haemophilus influenzae ein nicht-typisierbares Haemophilus influenzae ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist der mit dem konservierten Triheptosyl-inneren Kernrest, wie in Anspruch 1 definiert, bindet.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, weiterhin umfassend Identifizierung des Lipopolysaccharidrests mit einem monoklonalen Antikörper der spezifisch für ein Epitop ist, das nach Inaktivierung von einem oder mehreren Genen exprimiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lpsA, lic1, lic2, lic2A, lic2orf3, lic2B, lic3A, lgtC, lgtD, lgtF, rfa1 und orfH.
Verfahren nach Anspruch 15, umfassend den monoklonalen Antikörper, hergestellt gemäß Anspruch 14.
Glykokonjugat umfassend: den Lipopolysaccharidrest gemäß Anspruch 1 und einen immunogenen Träger der an den Lipopolysaccharidrest kreuzverbunden ist.
Glykokonjugat gemäß Anspruch 17, wobei der Lipopolysaccharidrest und der immunogene Träger mit einem Linkermolekül kreuzverbunden sind.
Glykokonjugat nach Anspruch 18, wobei das Linkermolekül ausgewällt ist aus der Gruppe bestehend aus Adipinsäure-Dihydrazit, Epsilon-Aminohexansäure, Chlorhexanol-Dimethylacetal, D-Glucoronolacton und p-Nitrophenylamin.
Glykokonjugat nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei der Träger TT oder NTHi HMP ist.
Vakzinzusammensetzung umfassend einen oder mehrere Glykokonjugate nach einem der Ansprüche 17 bis 20 und ein Adjuvans.
Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die Vakzine als Liposom formuliert ist.