DE69827880T2

DE69827880T2 - Iga1-protease fragment als trägerpeptid

Info

Publication number: DE69827880T2
Application number: DE69827880T
Authority: DE
Inventors: Mark Achtman; Monique Moreau
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Aventis Pasteur SA
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2018-01-21
Also published as: NO984365L; US20040203108A1; ATE283914T1; JP2000507274A; US7235242B2; NO322265B1; KR20000064740A; AU6211698A; EP0895537B1; DE69827880D1; CA2249409A1; NO984365D0; WO1998031791A1; PT895537E; CA2249409C; ES2234095T3; NZ331968A; DK0895537T3; EP0895537A1

Description

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einem neuen Peptid, seiner Verwendung als Träger für ein Konjugat, insbesondere in Kombination mit einem Polysaccharid und einem Verfahren zur Herstellung des Peptids sowie Impfstoffe, die das Peptid umfassen.
Polysaccharide liegen vor als Kapseln in gram-positiven und gram-negativen Bakterien und als Bestandteil der Zellwand von Bakterien und Pilzen. Verschiedene Spezies der Gattungen Neisseria, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Shigella und Haemophilus sind pathogen und verantwortlich für verschiedene menschliche Krankheiten, zum Beispiel epidemische Meningitis, Otitis, Pneumonia und Diarrhöe. Diese Krankheiten stellen ein schwerwiegendes öffentliches Gesundheitsproblem weltweit bei Kindern dar und daher ist es wichtig eine Prophylaxe gegen diese Krankheiten zu haben.
Die Polysaccharidmakromoleküle umfassen Saccharideinheiten, die Immunogenität vermitteln können. Daher wurden bakterielle oder Bakterienpolysaccharide oder Teile davon verwendet für die Immunisierung von Menschen. Obwohl diese Impfstoffe immunogen sind bei Kindern und Erwachsenen und schützende Antiköper induzieren können, sind sie nicht geeignet, um Säuglinge oder Kleinkinder zu schützen, da sie nur eine T-Zellen unabhängige Immunantwort hervorrufen. Daher induziert der Kontakt mit Kapselpolysacchariden keine „Memory"-Antwort oder Antwort mir „Memory"-Funktion und führt nicht zu einem anhaltenden Schutz. Außerdem ist es nicht möglich eine Immunantwort bei Säuglingen oder Kleinkindern hervorzurufen.
Um das Problem einer T-Zellen unabhängigen Immunantwort zu überwinden, wurde eine kovalente Konjugation von Polysacchariden als T-unabhängige Antigene an Proteinträger als T-abhängige Antigene verwendet, und man fand, dass dies erfolgreich war bei der Überwindung dieses Mangels. Eine Immunisierung mit solchen Konjugaten ruft eine T-Zellen abhängige Antikörperantwort hervor. Jedoch die Auswahl an Trägerproteinen, die geeignet sind für Menschen, ist sehr beschränkt, und in den meisten Fällen wurden Polysaccharide gekoppelt an ein Tetanustoxoid, Choleratoxoid oder Diphtherietoxoid. Die unbeschränkte oder exzessive Verwendung von diesen Toxoiden als Träger ist gedacht, um nachfolgende Antworten auf ein Polysaccharid, das an diesen Typ von Träger gekoppelt ist zu unterdrücken. Es wird erwartet, dass diese Unterdrückung der Immunantwort durch vorher existierende Antikörper zu dem Träger in Zukunft ein Problem wird.
Ein weiteres Problem, das die Auswahl eines neuen Trägerproteins beschränkte in Bezug auf diesen Typ von Konjugat ist, dass das Protein nicht toxisch sein muss oder detoxifiziert.
Außerdem leiden bekannte Peptid-Polysaccharidkonjugate unter dem Nachteil, dass es notwendig ist einen Hilfsstoff zu verwenden, um die Immunantwort zu steigern. Viele bekannte Hilfsstoffe sind jedoch nicht anwendbar auf Menschen, weil sie eine inflammatorische Antwort hervorrufen können. Bis jetzt ist nur ein Hilfsmittel für Menschen erlaubt: Aluminiumgel.
Die WO 90/11367 A1 offenbart das Klonen des Gens, das die IgA1 Protease von Haemophilus influenzae kodiert und lehrt die Verwendung von IgA1 Protease in einem Impfstoff gegen Meningitis.
Daher war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Trägermoleküle bereitzustellen, die hoch immunogen sind, eine T-Zellen abhängige Immunantwort hervorrufen können, zu einem lang andauernden „Memory"-Effekt bei Säugern führen und möglicherweise die Verwendung von Hilfsstoffen vermeiden. Diese Aufgabe und weitere Aufgaben, die sich aus der folgenden Beschreibung ableiten lassen, werden erreicht durch die Verwendung eines neuen Peptids, das mindestens 40 Aminosäuren aufweist.
Daher stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Gesichtspunkt ein Peptid bereit, das 40 bis 200 Aminosäurereste aufweist, das mindestens 40 Aminosäuren umfasst von einer Aminosäuresequenz, wie sie gezeigt ist in SEQ ID NO 1, beginnend mit der Aminosäure in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit einer Aminosäure in einer der Positionen 40 bis 104 oder einer homologen Sequenz.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden diese neuen Peptide als Träger für ein Konjugat verwendet.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein Peptid, das mindestens 40 N-terminale Aminosäuren umfasst von einer der SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 oder 5, die Teil sind einer IgA1 Protease von Neisseria oder einer homologen Sequenz, verwendet werden konnten als Träger für ein Antigen, um eine T-Zellen abhängige Immunantwort hervorzurufen mit langer Beständigkeit, sogar ohne die Verwendung von einem Hilfsstoff. Es war nicht vorhersehbar, dass ein solch kleines Peptid brauchbar sein könnte als ein Träger für ein immunogenes Konjugat.
Die Verwendung von diesem kleinen Peptid weist viele Vorteile auf in Bezug auf solche Träger, die bisher verwendet wurden. Da es nur ein kleines Peptid ist, kann es synthetisch hergestellt werden, kann konjugiert werden mit allen Typen von Verbindungen, die verwendet werden als Immunogene, wie Polysaccharide, und ist besonders geeignet in Kombination mit einem Polysaccharid von Neisseria, insbesondere von N. meningitidis, oder Haemophilus, insbesondere H. influenzae. Daher ist es geeignet zur Herstellung von Impfstoffen für Säuglinge oder Kleinkinder sowie für kleine Kinder und Erwachsene.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist Teil einer IgA1 Protease, die hergestellt wird durch pathogene Bakterien von dem Stamm Neisseria. Die IgA1 Protease ist ein Enzym, das IgA1 Antikörper abbaut, die hergestellt werden von dem Wirt als Schutz gegen die Bakterien. Obwohl es bekannt war, dass IgA1 Proteasen eine Immunantwort hervorrufen können, wurde die Verwendung von einer solchen Protease als Träger nicht in Betracht gezogen, das es einerseits ein großes Molekül ist, und andererseits einen negativen Einfluss hat auf das Immunsystem von dem Menschen, der immunisiert wird. Im Gegensatz dazu weist das Peptid diesen enzymatischen Effekt nicht auf.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens 40 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 70 Aminosäuren und am allermeisten bevorzugt alle 104 Aminosäuren von einer der Sequenzen von SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 oder 5 oder einer homologen Sequenz davon. Am meisten bevorzugt ist das Peptid das 104 mer von SEQ ID NO 1.
Das Peptid kann auch mehr als 104 Aminosäuren aufweisen. Die Sequenzen, die veranschaulicht sind in SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 und 5, können erweitert sein durch weitere Aminosäuren, die nicht störend einwirken auf andere Aminosäuren, das T-Epitop beeinflussen oder die Struktur der ersten 40 N-terminalen Aminosäuren des Peptids verändern. Die Sequenz kann erweitert sein an dem N-Terminus sowie an dem Carboxy-Terminus. Das Peptid muss mindestens 40 Aminosäuren aufweisen und nicht mehr als etwa 200 Aminosäuren. Wenn das Peptid weniger als 40 Aminosäuren aufweist, ist es nicht geeignet als Träger, und es ist unwahrscheinlich, dass eine andauernde Immunisierung auftritt, wenn es als Träger verwendet wird. Andererseits ist ein Peptid, das mehr als 200 Aminosäuren aufweist, schwierig zu synthetisieren. Es wurde gefunden, dass ein Peptid, das mehr als 70 Aminosäuren aufweist, verbesserte Antigenizität aufweist, und am meisten bevorzugt ist ein Peptid, das 104 Aminosäuren aufweist mit der Sequenz von SEQ ID NO 1. Die genannte Sequenz ist Teil einer IgA1 Protease von Neisseria menin gitidis, Serogruppe A, Subgruppe III, Stamm Z3906 und ist identisch zu einer Sequenz mit der Genbankhinterlegungsnummer X82474.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise identisch oder homolog zu einem Peptid, das die Aminosäuresequenz von einer von SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 oder 5 aufweist. Vorzugsweise ist das Peptid mindestens 85 % identisch zu einem der oben genannten Aminosäuresequenzen, besonders bevorzugt ist es 90 % identisch und ganz besonders bevorzugt ist es 95 % identisch zu den oben genannten Aminosäuresequenzen. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid 100 % identisch zu den oben genannten Aminosäuresequenzen, insbesondere zu SEQ ID NO 1.
Ein Peptid, das eine Sequenz aufweist, die homolog ist zu einer der Sequenzen, wie sie gezeigt sind in SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 oder 5, ist auch innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. SEQ ID NO 2 ist eine Sequenz von N. meningitidis, Serogruppe C, ET-37 Komplex, Stamm Z4400. SEQ ID NO 3 ist eine Sequenz von N. meningitidis, Serogruppe A, Subgruppe III, Stamm Z3524. SEQ ID NO 4 stammt von der Sequenz S09386 von SwissProt. SEQ ID NO 5 ist eine Sequenz von N. gonorrhoeae, Stamm MS11, veröffentlicht in EP 0 254 090 A und ist identisch zu der Genbankhinterlegungsnummer A02796.
Der Begriff oder die Bezeichnung „homolog", wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf eine Sequenz, die mindestens 80 % identisch ist zu der jeweiligen Sequenz. Die Homologie eines Peptids wird typischerweise gemessen unter Verwendung einer Sequenzanalysesoftware (z.B. dem Sequenzanalysesoftwarepaket von der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI, 53705). Ähnliche Aminosäuresequenzen werden abgeglichen, um den maximalen Grad an Homologie zu erreichen. Zu diesem Zweck kann es notwendig sein, künstlich Lücken in die Sequenz einzufügen. Sobald eine optimale Abgleichung oder Ausrichtung aufgestellt worden ist, wird der Grad der Homologie festgestellt durch Aufzeichnen oder Feststellen aller Positionen, in denen die Aminosäuren von beiden Sequenzen identisch sind bezogen auf die Gesamtzahl der Positionen.
Analoga des Peptids der vorliegenden Erfindung fallen demzufolge auch innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Ein „analoges" Peptid ist eine weitere Ausführungsform eines Peptids, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Substitution, Deletion oder Addition von ein oder mehr Aminosäuren aufweist, die die biologische Funktion des Polypeptids nicht verändern. Die biologische Funktion des Peptids der vorliegenden Erfindung besteht darin eine T-abhängige Immunantwort hervorzurufen, wenn es verwendet wird als Träger zusammen mit einem Antigen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid der vorliegenden Erfindung zusätzlich einen Cysteinrest. Der Cysteinrest kann entweder an dem Carboxy-Terminus, an dem N-Terminus oder innerhalb der Aminosäurekette angeordnet sein durch Substitution einer der Aminosäuren in der Sequenz durch einen Cysteinrest. Die Substitution kann durchgeführt an allen Stellen, unter der Bedingung, dass das T-abhängige Epitop nicht zerstört oder beeinflusst wird. Vorzugsweise wird das Cystein an eines der Termini addiert. Da das Peptid, das eine Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 oder 5 aufweist, kein Cystein enthält, ist die Einführung eines Cysteins besonders geeignet, da es die Struktur des Peptids nicht zerstört oder störend beeinflusst. Das Cystein wird eingeführt für eine stabile Kupplung mit einem Linkermolekül. Es ist auch möglich, das Peptid über andere funktionelle Gruppen zu koppeln, zum Beispiel der Aminogruppe eines Lysinrests oder der Carboxylgruppe einer Glutamin- oder Asparaginsäure.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch mikrobiologische Verfahren sowie durch organische Synthese. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid hergestellt entweder unter Verwendung rekombinanter Techniken oder durch Synthese. Für die rekombinante Reproduktion des Peptids wird ein Polynucleotid bereit gestellt an der Basis der Aminosäuresequenz, die angegeben ist in einer der SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 oder 5, und das Peptid wird hergestellt gemäß den gut bekannten Techniken der Gentechnologie oder des Genetic Engineering.
Das weitere bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Peptids der vorliegenden Erfindung verläuft über eine organische Synthese. Das Peptid kann synthetisiert werden durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind. Zum Beispiel können einige kleinere Fragmente hergestellt werden durch Kupplung der geeigneten Aminosäuren. Das vollständige Peptid wird dann erhalten durch Kupplung dieser Fragmente.
Daher ist ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Peptids unter Verwendung einer organischen Synthese. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das vollständige Peptid hergestellt durch eine Festphasensynthese, vorzugsweise unter Verwendung der Fmoc- oder Boc-Chemie. Es ist besonders bevorzugt, die Synthese auszuführen mit einem automatischen Peptid-Synthesizer und die FastMoc-Chemie zu verwenden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das 104mer der SEQ ID NO 1, die Sequenz, die oben hervorgehoben ist, synthetisiert unter Verwendung eines automatischen Peptid-Synthesizers und der FastMoc-Chemie, wobei die Festphase TentaGel S RAM Spezial ist, wobei die Aminosäuren durch FMoc geschützt sind, und die Seitengruppen vorzugsweise wie folgt geschützt sind: die Carboxyl- bzw. Hydroxylgruppe der Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin und Tyrosin mit O-tert.-Butyl; die Amino- bzw. Iminogruppe von Histidin, Asparagin und Glutamin mit Trityl; die Aminogruppe von Lysin mit tert.-Butyloxycarbonyl; und die Iminogruppe von Arginin mit PMC. Bei den Zyklen 1 bis 2, 4, 10 bis 13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75 bis 78, 84 bis 85, 88, 96 bis 97 und 104 bis 105 sollten Doppelkupplungen durchgeführt werden und freie Aminogruppen blockiert werden durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid. Die Aktivierung und Kupplung wird vorzugsweise durchgeführt in Gegenwart von HBTU/Diisopropylethylamin. Nach einer Abspaltung einer Schutzgruppe mit Piperidin wird das Endprodukt N-terminal acetyliert unter Verwendung von Essigsäureanhydrid.
Das oben hervorgehobene Verfahren kann natürlich auch eingesetzt werden, wenn das Peptid der vorliegenden Erfindung weniger als 104 Aminosäuren oder mehr als 104 Aminosäuren aufweist. In dem ersten Fall wird das Verfahren verändert durch Auslassen von einigen der ersten Zyklen, wohingegen in dem letzt genannten Fall das Verfahren verändert wird durch Hinzufügen einiger weiterer Zyklen, um weitere Aminosäuren einzuführen. Wenn das Peptid ein homologes Peptid ist oder eine Sequenz aufweist, wie sie in einer der SEQ ID NO 2, 3, 4 oder 5 angegeben ist oder homolog ist zu einer dieser Sequenzen, die einige verschiedene Aminosäuren aufweisen, kann das Verfahren entsprechend angepasst werden unter Verwendung der entsprechenden Aminosäure in geschützter Form für den jeweiligen Zyklus.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist ein geeigneter Träger für immunreaktive Moleküle, wie Polysaccharide. Das Peptid stellt T-Zellen Epitope bereit, die notwendig sind zur Erzeugung eines immu nologischen „Gedächtnisses" oder „Memory" und können daher im Allgemeinen als Träger verwendet werden für alle bekannten immunreaktiven Moleküle, um Konjugate herzustellen, die verwendet werden können als wirksame Impfstoffe.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Peptid als Träger verwendet für ein Polysaccharid, um eine Immunantwort hervorzurufen. Das Polysaccharid kann irgendein Polysaccharid sein, von dem bekannt ist, dass es immunogen ist. bei Säugern, insbesondere Menschen. Der Begriff oder die Bezeichnung „Polysaccharid" umfasst auch kleinere Polysaccharide, die immunogen sind und die manchmal als Oligosaccharide bezeichnet werden. Polysaccharide, die verwendet werden können als Teil des Konjugats, sind Kapselpolysaccharide, Lipopolysaccharide, O-Antigene, bakterielle oder Bakterien- oder Fungus- oder Pilzmembranpolysaccharide oder depolymerisierte Teile davon, zum Beispiel Polysaccharid C von Neisseria meningitidis. Das Polysaccharid kann ein Molekulargewicht aufweisen in dem Bereich von 10.000 bis 500,000. Natürlich auftretende Polysaccharide weisen normalerweise ein Molekulargewicht in dem Bereich von 100.000 bis 500.000 auf, wohingegen depolymerisierte Formen davon ein niedrigeres Molekulargewicht aufweisen können, so niedrig wie 10.000.
Eine weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Konjugat, umfassend das Peptid, wie es oben beschrieben ist, und ein immunreaktives Molekül. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das immunreaktive Molekül gekoppelt an das Peptid über einen Linker. Der Linker stellt funktionelle Gruppen bereit an beiden Enden, die für die Bindung an das Peptid beziehungsweise das antigene Molekül sorgen. Beide funktionelle Gruppen sind verbunden mit einer Brücke, deren Länge so ausgewählt ist, dass beide Teile dem Immunsystem in einer optimalen Art und Weise präsentiert werden. Die Brücke sollte nicht zu kurz sein, da ansonsten sterische Hinderung auftreten könnte. Andererseits sollte sie nicht zu lang sein, um nicht störend auf die Struktur und Teile davon einzuwirken. Es ist bevorzugt, dass die Länge der Brücke zwischen beiden funktionellen Gruppen 2 bis 20 Atome beträgt, ausgewählt aus C, N, O und S. Besonders bevorzugt ist die Brücke ausgewählt aus C₂-C₈-Alkylen, Phenylen, C₇-C₁₂-Aralkylen, C₂-C₆-Alkanoyloxy und Benzylcarbonyloxy.
Die funktionellen Gruppen, die verwendet werden für die Kupplung an das Peptid und das Polysaccharid sind solche funktionellen Gruppen, die üblicherweise verwendet werden auf diesem Gebiet. Eine Übersicht über Kupplungsverfahren wird gefunden in W. E. Dick und M. Beurret in Conjugates Vaccines, J. M. Cruse, R. E. Lewis Jr., Hrsg., Contrib. Microbiol. Immunol., Basel, Karger (1989), 10:48. Das Peptid ist an den Linker gebunden über eine funktionelle Gruppe, die bereitgestellt wird durch eine der Aminosäuren, zum Beispiel eine Amino-, eine Carboxy- oder Hydroxygruppe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid an den Linker gebunden über die Thiolgruppe, die bereitgestellt wird durch einen Cysteinrest. Das immunreaktive Molekül kann gebunden sein an den Spacer oder Abstandhalter über funktionelle Gruppen, die verfügbar sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform, wenn ein Polysaccharid als immunreaktives Molekül verwendet wird, werden Hydroxy-, Amino- oder Carboxygruppen, die vorliegen oder eingeführt worden sind in die Saccharideinheiten, für die Kupplung verwendet. Vorzugsweise ist der Linker an die Hydroxygruppen des Polysaccharids gebunden über eine Ether-, Ester-, Amid- oder Carbamatbindung, an die Aminogruppen über eine N-OH-Succinimidylbindung und/oder an die Carboxylgruppen über eine Esterbindung. Das Konjugat der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Immunantwort, die hervorgerufen wird durch das Konjugat der vorliegenden Erfindung, ist abhängig von der Zahl und Verfügbarkeit von T-Zellen abhängigen und B-Zellen abhängigen Epitopen und ihrem Verhältnis. Bei dem Konjugat der vorliegenden Erfindung werden die T-Zellen abhängigen Epitope bereitgestellt durch das Peptid, wohingegen die B-Zellen abhängigen Epitope zur Verfügung gestellt werden durch das Polysaccharid. Daher ist das Verhältnis von beiden Teilen des Konjugats ein wesentlicher Sachverhalt. Deshalb sollte das Verhältnis von beiden Bestandteilen eingestellt werden, so dass es nicht zu klein ist von beiden Sorten von Molekül, das vorliegt. Es wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden, dass gute Ergebnisse erzielt werden können, wenn etwa 1 Mol an Peptid vorliegt pro 1 bis 50 Mol, vorzugsweise 3 bis 30 Mol, und ganz besonders bevorzugt 5 bis 20 Mol, an Wiederholungseinheiten des Polysaccharids. Wenn weniger als 1 Mol an Peptid pro 50 Mol an Wiederholungseinheiten vorliegt, kann keine Immunantwort nachgewiesen werden, weil es nicht genug Peptidmoleküle gibt, um eine andauernde Immunantwort zu induzieren. Wenn andererseits mehr als 1 Mol an Peptid pro Mol an Wiederholungseinheiten vorliegt, sind die Ergebnisse auch nicht zufriedenstellend, da zu viele der Polysaccharide sterisch gehindert sind, um eine Immunantwort hervorzurufen. Der Begriff oder die Bezeichnung „Wiederholungseinheiten" bezieht sich auf Einheiten innerhalb der Polysaccharide, die zusammengesetzt sind aus 1 bis 7 verschiedenen Sacchariden und sich unterscheiden hinsichtlich der Natur oder der Herkunft des Saccharids, Verknüpfungsposition und der anomeren Konfiguration des Saccharids.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, der ein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, zusammen mit herkömmlichen Trägern, Hilfsstoffen und Verdünnungsmitteln. Das Konjugat wird gemischt mit oder verdünnt in oder gelöst in einem herkömmlichen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel, wie es auf diesem Gebiet bekannt ist in einer wirksamen Menge. Dieser Impfstoff kann verwendet werden, um Säuglinge oder Kleinkinder, Kinder und Erwachsene zu immunisieren. Er ist besonders geeignet für die Bekämpfung oder Kontrolle von epidemisch auftretenden Krankheiten, die verursacht werden durch Neisseria meningitidis oder andere Bakterien, die Kapselpolysaccharide tragen. Die Verwendung des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung führt zu hohen Titern an Antikörpern.
Beispiel 1
Herstellung eines synthetischen 105mer Peptids, das die folgende Sequenz aufweist (SEQ ID NO 1 + N-terminales Cystein):
Das Peptid wurde synthetisiert unter Verwendung der FastMoc-Chemie mit einem automatischen Peptid-Synthesizer (Modell 431A, Applied Biosystems). Die Festphase war ein Rinkharz (0,13 mM TentaGel S RAM Spezial, 0,15 mM g^–1, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland), das ein C-terminales mit Amid-Kappen (amide capped) versehenes Peptid ergibt. Die Aminogruppe der Aminosäuren, die verwendet werden für die Synthese wurden geschützt mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Gruppen, und die Seitengruppen wurden geschützt mit den folgenden Gruppen:
für die Carboxyl- bzw. Hydroxylgruppe von Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin und Tyrosin: die O-tert.-Butylgruppe;
für die Amino- bzw. Iminogruppe von Histidin, Asparagin und Glutamin: die Tritylgruppe;
für die Aminogruppe von Lysin: die tert.-Butyloxycarbonylgruppe;
und für die Iminogruppe von Arginin: die PMC-Gruppe.
Die Aktivierung und Kupplung wurde ausgeführt in Gegenwart von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU)/Diisopropylethylamin. Bei den Zyklen 1 bis 2, 4, 10 bis 13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75 bis 78, 84 bis 85, 88, 96 bis 97 and 104 bis 105 wurde eine Doppelkupplung durchgeführt, und freie Aminogruppen wurden blockiert durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid. Nach dem letzten Zyklus wurde das Peptid von der Schutzgruppe befreit mit Piperidin, und das Endprodukt wurde N-terminal acetyliert unter Verwendung von Essigsäureanhydrid.
Die Seitengruppen-Schutzgruppenabspaltung und Spaltung von dem Trägerharz wurde durchgeführt mit 2,1 % (v/v) 1,2-Ethandithiol, 4,2 % (v/v) Thioanisol, 4,2 % (v/v) Wasser, 6,2 % Phenol (v/v) und 83 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) über einen Zeitraum von 3 Stunden bei Raumtemperatur. Das Harz wurde entfernt durch Filtration, und Triethylsilan wurde in tropfenweiser Art und Weise zugegeben bis die Lösung farblos war. Die Lösung wurde dann 3 weitere Stunden inkubiert bei Raumtemperatur. 360 mg rohes Peptid wurden wiedergewonnen nach Präzipitation oder Kristallisation mit tert.-Butylmethylether, gefolgt von einer Zentrifugation und Lyophilisation. 130 mg des rohen Peptids wurden gelöst in 40 ml 50 mM Ethylmorpholine, pH 8,3, enthaltend 50 mM Dithiothreitol und über Nacht inkubiert bei Raumtemperatur. Der pH wurde eingestellt auf 3,5 mit 10 % TFA, und das Peptid wurde gereinigt durch Umkehrphasen HPLC (Pep-S, C2/C18, 100 Å Porengröße, 12 μm 22,5 mm × 25 cm, Pharmacia) unter Verwendung eines Gradienten (25 bis 45 % (v/v)) von Acetonitril, 0,1 % TFA (10 ml min^–1, Gradient von 0,33 % min^–1). Das Peptid eluierte als eine Bande (Peak) bei etwa 25 % Acetonitril, und die Bande wurde lyophilisiert (73 mg) bevor der weiteren Verwendung. Eine Analyse durch HPLC und Massenspektrometrie zeigte, dass über 65 % des Endprodukts der gewünschten Sequenz entsprachen. Die N-terminale Sequenz wurde bestätigt durch N-terminales Edman-Sequenzieren der Probe, die entfernt wurde vor der N-terminalen Acetylierung.
Beispiel 2
Herstellung eines Polysaccharidpeptidkonjugats
Ein trockenes Pulver von Kapselpolysaccharid von Neisseria meningitidis Serogruppe C, das im Folgenden als Polysaccharid C bezeichnet wird, wurde erhalten durch ein Extraktionsverfahren wie es beschrieben ist von E. Gotschlich et al. in J. Exp. Med., Nr. 129 (1969), Seiten 1349 bis 1365. 100 mg des Polysaccharids C wurden gelöst in 0,2 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 11,1 mg/ml (Lösung A). Parallel dazu wurde eine Lösung hergestellt von 0,2 M Adipinsäuredihydrazid (ADH) in 0,2 M NaCl (Lösung B). Eine 0,5 M Lösung von Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDAC) in 0,2 M NaCl wurde auch hergestellt (Lösung C). 9 ml der Lösung A, 10 ml der Lösung B und 1 ml der Lösung C wurden zusammengemischt, um eine Zubereitung zu ergeben, die 5 mg/ml von Polysaccharid C, 0,125 M ADH und 0,025 M EDAC enthielt. 0,1 M HCl wurde zugegeben, um den pH einzustellen auf 6,5; dieser pH wurde beibehalten während des gesamten Reaktionszeitraums von 45 Minuten. Die Temperatur betrug etwa 20°C.
Die Reaktion wurde gestoppt durch 40 μl 0,1 N NaOH, das den pH erhöhte auf 7,1. Die Reaktionsmischung wurde dialysiert gegen 0,5 M NaCl, 10 mM Phosphat und dann Wasser und nachfolgend lyophilisiert.
Die Größe des derivatisierten Polysaccharids C wurde kontrolliert auf einer HPLC Ausschlusssäule TSK 4000 (Hersteller Tosohaas). Die Ergebnisse zeigten, dass keine Depolymerisation stattgefunden hatte im Verlauf der Derivatisierung.
Während der Derivatisierung wurden etwa 3,4 % der Wiederholungseinheiten derivatisiert mit einer -NH₂ Gruppe.
Das lyophilisierte Produkt wurde gelöst in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 7, bis zu einer Konzentration von 6,25 mg/ml und entgast. Succinimidylmaleimidobutyrat (GMBS) wurde gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) unter Stickstoff bei einer Konzentration von 25 mg/ml, und dann zugegeben zu derivatisiertem Polysaccharid C in gleicher Menge. Die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das aktivierte Polysaccharid C wurde gereinigt durch Sephadex G50 Ausschlusssäulenchromatographie. Die ausgeschlossene Fraktion wurde wiedergewonnen und konzentriert auf etwa 7,5 mg/ml durch Ultrafiltration (30 K Amiconmembran). Die konzentrierte Lösung wurde entgast.
20 mg des Peptids, wie in Beispiel 1 erhalten, wurden in Wasser gelöst mit einer Konzentration von 10 mg/ml unter Stickstoff. 1,5 ml der Peptidlösung wurden zugegeben zu 1,2 ml der Zubereitung, die das aktivierte Polysaccharid C enthielt, so dass das Verhältnis (Maleimidoreste)/(Thiolreste) 2 betrug. Die Reaktionsmischungen wurden über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Dann wurden die nicht umgesetzten Maleimidoreste inaktiviert durch Zugabe von 0,010 ml Mercaptoethanol.
Das konjugierte Produkt wurde gereinigt auf einer 4BCL Sepharosesäule. Die eluierten Fraktionen wurden untersucht hinsichtlich der Gegenwart von Sacchariden (Sialinsäure) und Peptiden. Fraktionen, die positiv auf beide Essays oder Untersuchungen antworteten, wurden zusammengegeben.
Die Menge an Sialinsäureresten wurde bestimmt gemäß dem Dosierungsverfahren, das beschrieben ist in Svennerholm L., Biochim. Biophys. Acta (1957) 24: 604, und die Menge des Peptids wurde bestimmt gemäß dem Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. Es wurde gezeigt, dass das Verhältnis (Peptid)/(Wiederholungseinheiten von Polysaccarid C) Mol/Mol 1:18 betrug (entsprechend einem Verhältnis Gewicht/Gewicht von 1,8:1).
Beispiel 3
Ein trockenes Pulver des Kapselpolysaccharids von Streptococcus pneumoniae Typ 4, das im Folgenden als Polysaccharid Pneumo 4 bezeichnet wird, wird erhalten durch ein Extraktionsverfahren, wie es beschrieben ist in der Patentanmeldung WO 82/01995 A „Procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins à base de polyosides ainsi purifiés". 100 mg des Polysaccharids Pneumo 4 wurden gelöst in 0,2 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 11,1 mg/ml (Lösung A). Parallel dazu wurde eine Lösung hergestellt von Adipinsäuredihydrazid (ADH) in 0,2 M NaCl in einer Konzentration von 0,25 M (Lösung B). Eine Lösung von Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDAC) in 0,2 M NaCl wurde auch hergestellt in einer Konzentration von 0,5 M (Lösung C). 9 ml der Lösung A, 10 ml der Lösung B und 1 ml der Lösung C wurden zusammengemischt, um eine Zubereitung zu ergeben, die 5 mg/ml von Polysaccharid Pneumo 4, 0,125 M ADH und 0,025 M EDAC enthielt. 1 N NCl wurde zugegeben, bis zu einem pH von 4,9; dieser pH wurde beibehalten während des gesamten Reaktionszeitraums von 30 Minuten. Die Temperatur betrug etwa 25°C.
Die Reaktion wurde gestoppt durch 0,28 ml N NaOH. Der pH wurde erhöht auf 7,5. Die Reaktionsmischung wurde dialysiert gegen 0,5 M und dann Wasser und nachfolgend lyophilisiert.
Die Größe des derivatisierten Polysaccharids Pneumo 4 wurde kontrolliert auf einer HPLC Ausschlusssäule TSK 4000 (Hersteller Tosohaas). Keine Depolymerisation trat im Verlauf der Derivatisierung auf.
Während der Derivatisierung wurden etwa 8,2 % der Wiederholungseinheiten des Polysaccharids Pneumo 4 mit einer -NH₂ Gruppe derivatisiert.
Das lyophilisierte Produkt wurde gelöst in 0,05 M NaCl bei einer Konzentration von 2,76 mg/ml und entgast. Succinimidylmaleimidobutyrat (GMBS) wurde gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) unter Stickstoff bei einer Konzentration von 25 mg/ml. 1,75 ml der GMBS-Lösung wurden zugegeben zu 16 ml der Polysaccharidlösung unter Stickstoff. Das Reaktionsgemisch lies man 5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff rühren. Das aktivierte Polysaccharid Pneumo 4 wurde auf einer Ausschlusssäule Sephadex G50 gereinigt. Die ausgeschlossene Fraktion wurde wiedergewonnen und konzentriert auf etwa 7 mg/ml auf einer 30K Membran (Amicon). Die konzentrierte Lösung wurde entgast.
20 mg des Peptids, wie in Beispiel 1 erhalten, wurden gelöst in 0,1 M NaCl, 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,5, bei einer Konzentration von 4,6 mg/ml unter Stickstoff. Andererseits wurden 2,2 ml der Peptidlösung zugegeben zu 1,25 ml der Zubereitung, die das aktivierte Polysaccharid Pneumo 4 enthielt, so dass das Verhältnis (Maleimidoreste)/(Thiolgruppen) 1 betrug (Pneumo 4-Peptid-1 Konjugat). Die Reaktionsgemische wurden 6 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstoff gehalten, dann über Nacht bei +4°C. Dann wurden die nicht umgesetzten Maleimidoreste inaktiviert durch Zugabe von 0,005 ml Mercaptoethanol zu jedem Reaktionsgemisch.
Die Konjugate wurden gereinigt auf einer Sepharose 4BCL Säule. Die eluierten Fraktionen wurden untersucht hinsichtlich des Vorliegens von Zuckern und Peptiden. Fraktionen, die positiv auf beide Untersuchungen antworteten, wurden zusammengegeben.
Die Menge an Zucker wurde bestimmt gemäß dem Dosierungsverfahren, das beschrieben ist in Dubois et al., Anal. Chem. (1956) 3: 350, und die Menge an Peptid wurde bestimmt gemäß dem Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193: 265. Das Verhältnis von Wiederholungseinheiten von Peptid/Polysaccarid Mol/Mol beträgt 1:30 für das Pn 4-Peptid-1 Konjugat (entsprechend einem Verhältnis w/w von 0,4:1).
Beispiel 4
Ein trockenes Pulver des Kapselpolysaccharids von Neisseria meningitidis Serogruppe A, das im Folgenden als Polysaccharid A bezeichnet wird, wird erhalten durch ein Extraktionsverfahren, wie es beschrieben ist von E. Gotschlich et al. in J. Exp. Med., Nr. 129 (1969), Seiten 1349 bis 1365. 100 mg des Polysaccharids A wurden gelöst in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 5 mg/ml (Lösung A). Parallel dazu wurde eine Lösung von Cyanogenbromid (CNBr) in Wasser hergestellt in einer Konzentration von 67 mg/ml (Lösung B). Eine Lösung von Adipinsäuredihydrazid (ADH) in 0,5 M NaHCO₃ wurde ebenso zubereitet bei einer Konzentration von 150 mg/ml (Lösung C). 20 ml der Lösung A und 0,75 ml der Lösung C wurden zusammengemischt, um eine Zubereitung zu ergeben mit einem Verhältnis von Polysaccharid/CNBr Gewicht/Gewicht, das 1 betrug. 0,1 N NaOH wurde zugegeben bis zu einem pH von 10,8; dieser pH wurde beibehalten während des gesamten Reaktionszeitraums von 60 Minuten. Die Temperatur betrug etwa 20°C.
Dann wurde der pH gesenkt auf 8,5 durch Zugabe von 0,15 ml 0,1 N HCL. 1,17 ml der Lösung C wurden zugegeben, so dass das Verhältnis ADH/Polysaccharid Gewicht/Gewicht gleich 3,5 war. Der pH wurde während 15 Minuten beibehalten. Dann wurde die Reaktionsmischung über Nacht stehen gelassen unter Rühren bei +4°C. 0,1 ml 1 N HCl wurden zugegeben, um den pH auf 7 zu senken. Das Reaktionsgemisch wurde dialysiert gegen 0,5 M NaCl und dann Wasser und nachfolgend lyophilisiert.
Die Größe des derivatisierten Polysaccharids A wurde kontrolliert auf einer HPLC Ausschlusssäule TSK 4000 (Hersteller Tosohaas). Keine Depolymerisation fand im Verlauf der Derivatisierung statt.
Während der Derivatisierung wurden etwa 2,5 % der Wiederholungseinheiten des Polysaccharids A mit einer -NH₂ Gruppe derivatisiert.
Dann wurden die gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 verwendet, um das derivatisierte Polysaccharid A zu aktivieren und das aktivierte Polysaccharid A an das Peptid, wie es in Beispiel 1 erhalten wurde, zu konjugieren.
Beispiel 5
Vergleich des Konjugats, das erhalten wurde im Beispiel 2 mit anderen Produkten
Verwendbarkeit des Peptids aus Beispiel 1 als Träger in einem Polysaccharidkonjugat wird wie folgt gezeigt:
Sechs Wochen alte NMRI Mäuse erhielten über den subkutanen Weg eine der folgenden Zusammensetzungen in einem Volumen von 0,5 ml (jede Injektion) und über den intraperitonealen Weg, im Fall, dass ein Hilfsstoff verwendet wurde:

(a) 5 μg Polysaccharid C (ohne Peptid) an den Tagen 1, 15 und 29 in Abwesenheit eines Adjuvans;
(b) 5 μg Polysaccharid C (ohne Peptid) zusammen mit dem vollständigen Adjuvans von Freund am Tag 1, und an den Tagen 15 und 29 zusammen mit dem unvollständigen Adjuvans von Freund;
(c) 5 μg Polysaccharid C und 9 μg Peptid zusammen mit den vollständigen Adjuvans von Freund am Tag 1, und an den Tagen 15 und 29 zusammen mit dem unvollständigen Adjuvans von Freund;
(d) das Konjugat, das im Beispiel 2 erhalten wurde, das 1 μg Polysaccharid C und 1,8 μg Peptid enthielt, an den Tagen 1, 15 und 29 in Abwesenheit von einem Adjuvans;
(e) das Konjugat, das im Beispiel 2 erhalten wurde, das 5 μg Polysaccharid C und 9 μg Peptid enthielt, an den Tagen 1, 15 und 29 in Abwesenheit von einem Adjuvans;
(f) das Konjugat, das im Beispiel 2 erhalten wurde, das 5 μg Polysaccharid und 9 μg Peptid enthielt, zusammen mit dem vollständigen Adjuvans von Freund am Tag 1, und an den Tagen 15 und 29 das Konjugat, das in Beispiel 2 erhalten wurde, zusammen mit dem unvollständigen Adjuvans von Freund; und
(g) Ein Konjugat von 5 μg Polysaccharid C zusammen mit Diphtherie Anatoxin.

An den Tagen 15, 29 und 43 (berechnet von dem Tag der ersten Immunisierung) wird eine Probe von Blut gesammelt, und die Antipolysaccharid C Antikörper werden titriert nach ELISA.
Die Ergebnisse sind zusammengefasst in der folgenden Tabelle. Tabelle 1
Die Antikörperantwort auf nicht-konjugiertes Polysaccharid C ist in jedem Fall ziemlich schwach, wohingegen die Antwort auf Polysaccharid C, das entweder an DT oder das Peptid konjugiert ist, zufriedenstellend ist. Mit dem Konjugat der vorliegenden Erfindung wird ein Booster Effekt erhalten nach der zweiten Injektion, was ein Anzeichen für eine Immunantwort ist. Die Antwort des Konjugats Polysaccharid C-Peptid ist äquivalent zu der Antwort, die erhalten wird mit dem Konjugat von Polysaccharid C-DT.
Beispiel 6
Das in Beispiel 3 hergestellte Konjugat mit einem Verhältnis (w/w) von Peptid zu Polysaccharid von 0,4:1 (entspricht einem Verhältnis von Mol Peptid pro Mol Wiederholungseinheiten von 1:30) wurde an Mäusen getestet unter Verwendung des gleichen Protokolls wie in Beispiel 5. Es war in Mäusen immunogen in Gegenwart eines Adjuvans oder Zusatzmittels und führte zu einem Booster Effekt nach der zweiten Injektion. Die Ergebnisse können der folgenden Tabelle 2 entnommen werden.
Tabelle 2
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antigenträger, bestehend aus einem Peptid, das 40 bis 200 Aminosäurereste aufweist und mindestens 40 Aminosäuren umfasst von einer Aminosäuresequenz, wie sie gezeigt ist in SEQ ID NO 1, beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit einem Aminosäurerest in einer der Positionen 40 bis 104 oder einer Sequenz, die mindestens 80 % identisch dazu ist.
Antigenträger gemäß Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, die identisch ist oder mindestens 80 % identisch ist zu einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäuresequenzen: von SEQ ID NO 2, beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 40 bis 104; von SEQ ID NO 3, beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 40 bis 104; von SEQ ID NO 4, beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 40 bis 104; und von SEQ ID NO 5, beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 40 bis 104.
Antigenträger nach Anspruch 1 oder 2, umfassend mindestens 40 Aminosäuren, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 85 % identisch ist zu einer der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 und SEQ ID NO 5.
Antigenträger nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend mindestens 70 Aminosäurereste, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die identisch oder mindestens 80 % identisch ist zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 oder SEQ ID NO 5 beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 70 bis 104.
Antigenträger nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend mindestens 100 Aminosäurereste, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die identisch oder mindestens 80 % identisch ist zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 oder SEQ ID NO 5 beginnend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 1 bis 5 und endend mit dem Aminosäurerest in einer der Positionen 100 bis 104.
Antigenträger nach Anspruch 1, der die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 1 aufweist.
Antigenträger nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85 % identisch ist zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 1.
Antigenträger nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend zusätzlich einen Cysteinrest.
Antigenträger nach Anspruch 8, wobei der Cysteinrest an einem Terminus der Peptidsequenz angeordnet ist.
Verfahren zur Herstellung eines Antigenträgers gemäß Anspruch 1, wobei eine organische Synthese verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Synthese ausgeführt wird unter Verwendung der Fmoc- oder Boc-Chemie und einem automatischen Peptidsynthesizer.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die FastMoc-Chemie verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Aminogruppen der Aminosäuren geschützt werden mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Gruppen und Seitengruppen geschützt werden mit den folgenden Gruppen: die Carboxyl- bzw. Hydroxylgruppe von Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin und Tyrosin mit O-tert.-Butyl; die Amino- bzw. Iminogruppe von Histidin, Asparagin und Glutamin mit Trityl; die Aminogruppe von Lysin mit tert.-Butyloxycarbonyl; und die Iminogruppe von Arginin mit PMC, und wobei die Aktivierung und Kupplung ausgeführt wird in Gegenwart von HBTU/Diisopropylethylamin, und wobei das Peptid von der Schutzgruppe befreit wird mit Piperidin, und das Endprodukt N-terminal acetyliert wird unter Verwendung von Essigsäureanhydrid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 13, wobei Doppelkupplungen und Acetylierung mit Essigsäure-Anhydrid verwendet werden bei den Zyklen 1 bis 2, 4, 10 bis 13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75 bis 78, 84 bis 85, 88, 96 bis 97 und 104 bis 105.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Festphase TentaGel S RAM Spezial ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei eine Cysteineinheit an das Peptid an den N-Terminus und/oder den C-Terminus addiert wird.
Verwendung von einem Antigenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Träger für ein Konjugat.
Verwendung von einem Antigenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Träger für ein Polysaccharid, ausgewählt aus Lipopolysacchariden, O-Antigenen oder Bakterien-, Kapsel- oder Pilzmembranpolysacchariden.
Verwendung von einem Antigenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Träger für Polysaccharid C von Neisseria meningitidis.
Konjugat umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und ein immunreaktives Molekül.
Konjugat nach Anspruch 20, wobei das immunreaktive Molekül für ein Polysaccharid steht.
Konjugat nach Anspruch 20 oder 21, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem zusätzlichen Cysteinrest, einen bifunktionellen Linker und ein Polysaccharid, wobei das Peptid an den Linker gebunden ist über die Thiolgruppe des Cysteins und das Polysaccharid an die andere funktionelle Gruppe des Linkers gebunden ist über eine Hydroxy-, Carboxy- oder Aminogruppe.
Konjugat nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Polysaccharid für Polysaccharid C von Neisseria meningitidis steht.
Konjugat nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei ein Mol an Peptid pro 50 bis 1 Mol an Wiederholungseinheiten des Polysaccharids vorliegt.
Impfstoff, umfassend das Konjugat nach einem der Ansprüche 20 bis 24 zusammen mit herkömmlichen Trägern, Hilfsstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.