NO322265B1

NO322265B1 - Antigen baerer, fremgangsmate for dens fremstilling, dens anvendelse, konjugat samt vaksine.

Info

Publication number: NO322265B1
Application number: NO19984365A
Authority: NO
Inventors: Monique Moreau; Mark Achtman
Original assignee: Max Planck Gesellschaft; Pasteur Merieux Serums Vacc
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2006-09-04
Also published as: NO984365L; US20040203108A1; ATE283914T1; JP2000507274A; US7235242B2; KR20000064740A; AU6211698A; EP0895537B1; DE69827880D1; CA2249409A1; NO984365D0; WO1998031791A1; PT895537E; CA2249409C; ES2234095T3; NZ331968A; DE69827880T2; DK0895537T3; EP0895537A1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny antigen bærer som består av et peptid. Oppfinnelsen vedrører også dens anvendelse som en bærer for et konjugat, særlig i kombinasjon med

et polysakkarid.' Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en antigen bærer, en.vaksine omfattende det nevnte konjugat, og vedrører også konjugatet som sådan.

Polysakkarider er tilstede i kapsler i gram-positive og gram-negative bakterier og som en bestanddel i celleveggen til bakterier og sopp. Forskjellige arter av slektene Neisseria, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Shigella og

Haemophilus er patogene og er ansvarlige for forskjellige sykdommer i mennesker, f.eks. epidemisk meningitt, otitt, pneumoni og diaré. Disse sykdommer representerer et alvorlig globalt offentlig helseproblem hos barn og det er derfor viktig å ha en profylakse overfor disse sykdommer.

Polysakkarid-makromolekylene omfattes av sakkaridenheter som kan mediere immunogenitet. Bakterie-polysakkarider eller deler derav er derfor blitt anvendt for immunisering av mennesker. Skjønt disse vaksiner er immunogene i barn og voksne og kan indusere beskyttende antistoffer, er de ikke egnet til å beskytte spedbarn på grunn av at de kun utløser en T-celle uavhengig immunrespons. Kontakten med kapsel-polysakkarider induserer således ikke en minne-respons og resulterer ikke i en vedvarende beskyttelse. Det er dessuten ikke mulig å ut-løse en immunrespons i spedbarn.

For å overvinne problemet med en T-celle uavhengig immunrespons, har en kovalent konjugering av polysakkarider som T-uavhengige antigener til proteinbaerere som T-avhengige antigener blitt anvendt og funnet til å være vellykket for å overvinne denne mangel. Immunisering med slike konjugater utløser en T-celle avhengig antistoffrespons. Valg av bærer-proteiner som er anvendbare for mennesker er imidlertid svært begrenset, og i de fleste tilfeller er polysakkarider blitt koblet til tetanus toksoid, kolera toksoid eller difteri toksoid. Den ubegrensede eller omfattende bruk av disse toksoider som bærere menes å undertrykke senere responser på et polysakkarid koblet til denne type bærer. Denne under-trykking av immunrespons ved pre-eksisterende antistoffer overfor bæreren forventes å bli et problem i fremtiden.

Et videre' problem som begrenset valg av et nytt bærerprotein med hensyn til denne type konjugat er at proteinet må være ikke-tpksisk eller detoksifisert.

Videre lider kjente peptid-polysakkaridkonjugater av ufordel-aktigheten med at det er nødvendig å anvende en adjuvans for å øke immunresponsen. En rekke kjente adjuvanser er imidlertid ikke anvendbare for mennesker på grunn av at de utløser en inflammatorisk respons. Inntil i dag er kun ett adjuvans tillatt for mennesker: aluminiumgel.

Det var derfor et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye bæremolekyler som er svært immunogene, som kan utløse én T-celle avhengig immunrespons, resultere.i et lengre-virkende minne i pattedyr og hvor man eventuelt kan unngå bruk av adjuvanser. Dette og andre formål vil frem-komme klart fra den etterfølgende beskrivelse og er oppnådd ved anvendelse av et nytt peptid med minst 40 aminosyrer.

I henhold til det første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det derfor tilveiebragt en antigen bærer som består av et peptid som har fra '40 til 200 aminosyrerester og som omfatter minst 40 aminosyrer med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO 1, begynnende med aminosyren i hvilken som helst av posisjoner 1 til 5 og som slutter med en aminosyre i hvilken som helst av posisjonene 40 til 104 eller en sekvens som er minst 80% identisk dermed.

I et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse anvendes den antigene bærer som bærer for et konjugat.

Det er overraskende blitt funnet at et peptid omfattende

minst 4 0 N-terminale aminosyrer av en av SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 eller 5, som er del av en IgAl protease fra Neisseria eller - en homolog sekvens, kan anvendes som bærer for et antigen til

å utløse en T-cellé avhengig immunrespons med lang varighet selv uten bruk av adjuvans. Det kunne ikke forutsees at et slikt lite peptid kunne anvendes som en bærer for et immuno-gent konjugat.

Anvendelsen av dette lille peptid har en rekke fordeler sam-menlignet med dé bærere som til nå anvendes. Ved å være kun et lite peptid kan det produseres syntetisk, det kan konju-geres til alle typer forbindelser som anvendes som immuno-gener, slik som polysakkarider, og det er særlig anvendbart i kombinasjon med et polysakkarid fra Neisseria, særlig fra N. meningitidis, eller Haemophilus, særlig H. influenzae. Det er derfor anvendbart for fremstilling av vaksiner for spedbarn såvel som for småbarn og voksne.

Peptidet i henhold til den foreliggende oppfinnelse er del av en IgAl protease fremstilt ved patogene bakterier av slekten Neisseria. IgAl protease er et enzym som nedbryter IgAl antistoffer fremstilt av verten som beskyttelse mot bakterier. Skjønt det var kjent at IgAl proteaser kan utløse en immunrespons, har bruk av en slik protease som bærer ikke vært overveid på grunn av at den på den ene side er et stort molekyl og på den annen side har den en negativ innvirkning på immunsystemet i det mennesket som skal immuniseres. I motsetning til dette har peptidet ikke denne enzymatiske effekt.

Peptidet i henhold til oppfinnelsen omfatter minst 40 aminosyrer, foretrukket minst 50 aminosyrer, mere foretrukket minst 70 aminosyrer og mest foretrukket alle 104 aminosyrer i en av sekvensene SEQ ID NO l, 2, 3, 4 eller 5 eller en sekvens som er 80% identisk dermed. Mest foretrukket er peptidet 104meren av SEQ ID NO 1.

Peptidet kan også ha mere enn 104 aminosyrer. Sekvensen illustrert i SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 og 5 kan forlenges med ytterligere aminosyrer som ikke interfererer med andre aminosyrer, påvirker T-epitopeh eller endrer strukturen til de første 40 N-terminale aminosyrer i peptidet. Sekvensen kan forlenges på N-terminalen såvel som på karboksy-terminalen. Peptidet.må ha minst 40 aminosyrer og høyst 200 aminosyrer. Dersom peptidet har mindre enn 40 aminosyrer, er det ikke egnet som bærer og en vedvarende immunisering vil sannsynlig-vis ikke forekomme med peptidet som bærer. ' På den annen side, er et peptid med mer enn 200 aminosyrer vanskelig å syntetisere. Man har funnet at et peptid med mer enn 70 aminosyrer har forbedret antigenisitet, og mest foretrukket er et peptid med 104 aminosyrer med sekvensen SEQ ID NO 1. Den nevnte sekvens er del av en IgAl protease fra Neisseria meningitidis, serogruppe A, subgruppe III, stamme Z3906 og er identisk med en sekvens med GenBank aksesjonsnr. X82474.

Peptidet i henhold til oppfinnelsen er foretrukket identisk med eller minst 80% identisk med et peptid med aminosyresekvensen i en av SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 eller 5. Peptidet er foretrukket minst 85% identisk med en -av de ovennevnte aminosyre sekvenser, mere foretrukket er det 90% identisk og særlig foretrukket er det 95% identisk med de ovennevnte aminosyre-sek<y>enser. I den mest foretrukne utførelsesform er peptidet 100% identisk med de ovennevnte aminosyresekvenser, særlig

med SEQ ID NO 1.

SEQ ID NO 2 er en sekvens fra N. meningitidis, serogruppe C, ET-37 kompleks, stamme Z4400. SEQ ID NO 3 er en sekvens fra N. meningitides, serogruppe A, subgruppe III, stamme Z3524. SEQ ID NO 4 er avledet fra sekvens S09386 fra SwissProt. SEQ ID NO 5 er en sekvens fra N. gonorrhoeae, stamme MSll, publi-sert' i EP-A 254090 og identisk med GenBank aksesjonsnr. A02796.

Betegnelsen "homolog" som anvendt heri refererer til en sekvens som er minst 8 0% identisk med den respektive sekvens. Homologien for et peptid måles typisk ved anvendelse av sekvensanalyse-programvare {f.eks. sekvensånalyse-program-varepakken fra the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI, 53705). Liknende aminosyresékvenser er sammen-' stilt for å oppnå, den maksimale grad av homologi. For dette formål kan det være nødvendig å kunstig innføre gap i sekvensen. Når optimal sammenstilling er blitt satt opp, etableres graden av homologi ved å måle alle posisjoner hvor aminosyrene i begge sekvenser er identiske i forhold til det totale antall posisjoner.

Analoger av peptidet i henhold til oppfinnelsen er følgelig også innenfor rammen for den foreliggende oppfinnelsen. Et "analogt" peptid er en alternativ form av et peptid som er kjennetegnet til å ha en substitusjon, en delesjon eller adhesjon av en eller flere aminosyrer som ikke endrer poly-peptidets biologiske funksjon. Den biologiske funksjon til peptidet i henhold til oppfinnelsen er å utløse en T-avhengig immunrespons ved anvendelse som bærer sammen med et antigen.

I en foretrukket utføreIsesform omfatter peptidet i henhold til oppfinnelsen ytterligere en cysteinrest. Cysteinresten

kan enten være lokalisert i karboksyterminalen, i N-terminalen eller i aminosyrekjeden ved å erstatte en av aminosyrene i sekvensen med en cysteinrest. Denne substitusjon kan utføres alle steder med den betingelse at den T-avhengige epitop ikke ødelegges eller påvirkes. Cysteinet adderes foretrukket i en av endene. Da peptidet med en sekvens i henhold til en av

SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 eller 5 ikke inneholder noe cystein,. er innføringen av et cystein særlig anvendbart, fordi det ikke ødelegger eller interfererer med peptidets struktur. Cysteinet innføres for en stabil kobling med et linkermolekyl. Det er også mulig å koble peptidet via andre funksjonelle grupper, f.eks. aminogruppen i en lysinrest eller karboksyl-syregruppen i en glutaminsyre- eller asparaginsyregruppe.

Peptidet i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av mikrobiologiske metoder såvel som ved organiske synteser. I en foretrukket utføreIsesform dannes peptidet enten ved anvendelse av rekombinante teknikker eller ved syntese. For den rekombinante fremstilling av peptidet tilveiebringes et polynukleotid på grunnlag av aminosyresekvensen gitt i en av SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 eller 5 og peptidet dannes i henhold til vel kjente teknikker innen genmanipulering.

Den andre foretrukne metode for fremstilling av peptidet i henhold til oppfinnelsen er via en organisk syntese. Peptidet kan syntetiseres ved metoder som er vel kjente for fagkyndige på området. Enkelte mindre fragmenter kan f.eks. dannes med kobling av de passende aminosyrer. Det fullstendige peptid oppnås deretter ved å koble disse fragmenter.

Et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelse er derfor en fremgangsmåte for fremstilling av peptidet ved anvendelse av en organisk syntese. I en foretrukket utførel-sesform dannes hele peptidet ved en fast-fase syntese, foretrukket ved anvendelse av Fmoc eller Boe kjemi. Det er særlig foretrukket å gjennomføre syntesen med en automatisert peptidsyntetisator og ved å anvende FastMoc kjemi.

I en særlig foretrukket utførelsesform blir 104meren av SEQ ID NO 1, hvis sekvens er angitt over, syntetisert ved anvendelse av en automatisert peptidsyntetisator og FastMoc kjemi hvori den faste fase er TentaGel S RAM Spezial, hvori aminosyrene FMoc beskyttes og sidegruppene beskyttes foretrukket som følger: karboksyl- eller hydroksylgruppen i henholdsvis asparaginsyre, glutaminsyre, serin, treonin og. tyrosin beskyttes med O-t-butyl; amino- eller iminogruppen i henholdsvis histidin, aspargin og glutamin beskyttes med trityl; aminogruppen i lysin beskyttes med t-butyloksykarbonyl, og iminogruppen i arginin beskyttes med PMC. Ved sykluser 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 og 104-105 bør doble koblinger utføres og frie aminosyrer blok-keres ved acetylering med eddiksyreanhydrid. Aktivering og kobling gjennomføres foretrukket i nærvær av HBTU/diisopro-pyletylamin. Etter piperidin-avbeskyttelse blir sluttproduktet N-terminalt acetylert ved anvendelse av eddiksyreanhydrid .

Den ovennevnte angitte prosess kan selvfølgelig også anvendes dersom peptidet i henhold til oppfinnelsen har mindre enn 104 aminosyrer eller mere enn 104 aminosyrer. I det førstnevnte tilfellet varieres fremgangsmåten ved å utelate noen av de første sykluser mens i det sistnevnte tilfellet, varieres fremgangsmåten ved å tilsette noen ytterligere sykluser for å innføre ytterligere aminosyrer. Dersom peptidet er et homolog t peptid eller har en sekvens som identifisert i en av SEQ ID NO 2, 3, 4 eller 5 eller er homolog med en av disse sekvenser, med enkelte ulike aminosyrer, kan fremgangsmåten følgelig tilpasses ved å anvende den passende aminosyre i beskyttet form for den respektive syklus.

Peptidet i henhold til oppfinnelsen er anvendbart som bærer for immunreaktive molekyler slik som polysakkarider. Peptidet tilveiebringer T-celle epitoper som er nødvendige for å danne et immunologisk "minne" og kan derfor generelt anvendes som bærer for alle kjente immunreaktive molekyler for å danne konjugater som kan anvendes som effektive vaksiner.

I en foretrukket utføreIsesform av den foreliggende oppfinnelse anvendes peptidet som bærer for et polysakkarid for å utløse immunrespons. Polysakkaridet kan være et hvilket som helst polysakkarid som er kjent til å være immunogenisk i pattedyr, særlig mennesker. Betegnelsen "polysakkarid" omfatter også mindre polysakkarider som er immunogeniske og som enkelte ganger omtales som oligosakkarider. Polysakkarider som kan anvendes som en del av konjugatet er kapselpolysakkarider, lipopolysakkarider, O-antigener, bakterie- eller soppmembran-polysakkarider eller depolymeriserte deler derav, f.eks. polysakkarid C fra Neisseria meningitidis. Polysakkaridet kan ha en molekylvekt i området fra 10.000 til 500.000. Naturlig forekommende polysakkarider har normalt en molekylvekt innen området fra 100.000 til 500.000 mens depolymeriserte former derav kan ha en lavere molekylvekt helt ned til 10.000.

Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er et konjugat omfattende et peptid som beskrevet over og et immunreaktivt molekyl. I en foretrukket utføreIsesform er det immunreaktive molekyl koblet til peptidet via en linker. Linkeren tilveiebringer funksjonelle grupper i begge ender som sørger for bindingen til henholdsvis peptidet og det antigeniske molekyl. Begge funksjonelle grupper er forbundet med en bro, hvis lengde er valgt slik at begge deler frem-vises for immunsystemet på optimal måte. Broen bør ikke være for kort da sterisk hindring ellers vil forekomme. På den annen side bør den ikke være for lang for ikke å interferere med strukturen til begge deler. Det er foretrukket at lengd-en av broen mellom begge funksjonelle grupper er fra 2 til 2 0 atomer valgt fra C, N, O og S. Mere foretrukket er broen valgt fra C2-C8 alkylen, fenylen, C7-C12-<a>ralkylen, C2-C6 alkan-oyloksy og benzylkarbonyloksy.

De funksjonelle grupper som anvendes for koblingen til peptidet og polysakkaridet er de funksjonelle grupper som er vanlig anvendt innen dette området. En oversikt over kob-lingsmetoder finner man i W.E. Dick og M. Beurret i Conjugates Vaccines, J.M. Cruse, R.E. Lewis Jr Eds, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger (1989) 10:48. Peptidet bindes til linkeren via en funksjonell gruppe tilveiebragt ved en av aminosyrene, f.eks. en amino-, en karboksy- eller hydroksygruppe. I en foretrukket utførelsesform bindes peptidet til linkeren via tiolgruppen tilveiebragt ved en cysteinrest. Det immunreaktive molekyl kan være bundet til spaceren via funksjonelle grupper som er tilgjengelige. I en foretrukket utførelsesform, når det anvendes et polysakkarid som immunreaktivt molekyl, blir hydroksy-, amino- eller karboksygruppene som er tilsetede eller som er blitt innført i sakkaridenhetene anvendt for koblingen. Linkeren bindes foretrukket til hydroksygruppen i polysakkaridet via en eter-, ester-, amid- eller karbamat-binding, til aminogruppene. via en N-^OH-succinimidyl-binding og/eller til karboksyl-gruppene via en esterbinding. Konjugatet i henhold til oppfinnelsen kan dannes ved anvendelse av metoder som er kjent for den fagkyndige.

Immunresponsen som utløses ved hjelp av konjugatet i henhold til oppfinnelsen er avhengig av antallet og tilgjengeligheten av T-celle avhengige og B-celle avhengige epitoper og deres forhold. I konjugatet i henhold til oppfinnelsen er de T-celle avhengige epitoper tilveiebragt ved peptidet mens B-celle avhengige epitoper skriver seg fra polysakkaridet. Forholdet mellom begge deler av konjugater er derfor et essensielt trekk. Forholdet mellom begge komponenter bør således justeres slik at det ikke er tilstede for lite av hver molekylsort. I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse har man funnet at gode resultater kan oppnås dersom omtrent 1 mol peptid er tilstede pr. l til 50 mol, foretrukket 3 til 3 0 mol og mest foretrukket 5 til.20 mol repeterende enheter av polysakkaridet. Dersom mindre enn 1 mol.peptid pr. 50 mol repeterende enheter er tilstede, kan ingen immunrespons detekteres for der ikke er nok peptidmolekyler til å indusere en vedvarende immunrespons. På den annen side, dersom mere enn 1 mol peptid pr. mol repeterende enheter er tilstede, er heller ikke resultatene tilfredsstillende fordi alt for mye av polysakkaridet er sterisk hindret til å utløse en immunrespons. Betegnelsen ."repeterende enheter" refererer til enheter i polysakkaridene som består av fra 1 til 7 forskjellige sakkarider og som avviker med hensyn til sakkaridets natur, bindingsposisjon og sakkaridets anomeriske konfi-gurasjon.

I et ytterligere aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse en vaksine som omfatter et konjugat i henhold til den foreliggende oppfinnelse sammen med konvensjonelle bærere, eksipienser og/eller fortynningsmidler. Konjugatet blandes med eller fortynnes i eller oppløses i en konvensjonell bærer, eksipiens eller fortynningsmiddel som er kjent innen dette området i en effektiv mengde. Denne vaksine kan anvendes til

å immunisere spedbarn, barn og voksne. Den er særlig anvend-bar for å regulere epidemisk forekommende sykdommer som for-årsakes av Neisseria meningitidis eller andre bakterier som bærer kapselpolysakkarider. Anvendelsen av vaksinen i henhold til oppfinnelsen resulterer i høye antistofftitere.

Eksempel l

Fremstilling av et syntetisk 105mer peptid med følgende sekvens {SEQ ID NO 1 + N-terminalt cystein): Cys Leu Tyr Tyr Lys Asn Tyr Arg Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser Gly Gly Ser Val Asn Ala Pro Met Pro Glu Asn Gly.Gin Thr Glu Asn Asn Asp Trp Ile Leu Met Gly Ser Thr Gin Glu Glu Ala Lys Lys Asn Ala Met Asn His Lys Asn Asn Gin Arg Ile Ser Gly Phe Ser Gly Phe Phe Gly Glu Glu Asn Gly Lys Gly His Asn Gly Ala Leu Asn Leu Asn Phe Asn Gly Lys Ser Ala Gin Asn Arg Phe Leu Leu Thr Gly Gly Thr Asn Leu Asn Gly Lys Ile Ser Val Thr Gin Gly

Peptidet ble syntetisert ved anvendelse av FastMoc kjemi med en automatisert peptidsyntetisator (modell 43IA, Applied Biosystems). Den faste fase var en Rinkharpiks (0,13 mM TentaGel S RAM Spezial, 0,15 mM g"<1>, Rapp Polymere, Tiibingen, Tyskland) som gir et C-terminalt amid-dekket peptid. Aminogruppene i aminosyrene som' anvendes for syntesen ble beskyttet med 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) grupper og sidegruppen ble beskyttet med følgende grupper: for karboksyl- og hydroksylgruppen i henholdsvis asparaginsyre, glutaminsyre, serin, treonin og tyrosin:

O-t-butylgruppen,

for amino- eller iminogruppen i henholdsvis histidin, asparagin og glutamin: tritylgruppen,

for aminogruppen i lysin: t-butyloksykarbonylgruppen,

og for iminogruppen i arginin: PMC gruppen.

Aktiveringen og koblingen ble utført i nærvær av 2-(lH-benzo-triazol-l-yl)-1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HBTU)/- diisopropyletylamin. I sykluser 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 og 104-105"ble dobbel-kobling utført og frie aminogrupper ble blokkert ved acetylering med eddiksyreanhydrid. Etter den siste syklus ble peptidet av-beskyttet med piperidin og'sluttproduktet ble N-terminal-acetylert ved anvendelse av eddiksyreanhydrid.

Sidekjede-avbeskyttelse og spalting fra harpiksbæreren ble utført med 2,1% (volum/volum) 1,2-etahditiol, 4,2% (volum/- volum) tioanisol, 4,2% (volum/volum) vann, 6,2% fenol (volum/- volum) og 83% (volum/volum) trifluoreddiksyré (TFA) i 3 timer ved romtemperatur. Harpiksen ble fjernet ved filtrering og trietylsilan ble tilsatt dråpevis inntil oppløsningen var fargeløs. Løsningen ble deretter inkubert i ytterligere 3 timer ved romtemperatur. 360 mg ubehandlet peptid ble-utvunnet etter presipitering med t-butyImetyleter etterfulgt av sentri-fugering og frysetørking. 130 mg av det ubehandlede peptid ble oppløst i 40 ml 50 mM etylmorfolin, pH 8,3 inneholdende 50 mM ditiotreitol og inkubert over natten ved romtemperatur. pH ble justert til 3,5 med 10% TFA,og peptidet ble renset ved revers-fase HPLC (Pep-S, C2/C18, 100 Å porestørrelse, 12 fim 22,5 mm x 25 cm, Pharmacia) ved anvendelse av en gradient (25 til 45%

(volum/volum) ) av acetonitril, 0,1% TPA (10 ml min"<1>, 0,33% min"<1> gradient). Peptidet eluerte som en topp ved omtrent 25% acetonitril og toppen ble frysetørket (73 mg) før videre bruk. En analyse ved HPLC og massespektrometri viste at over 65% av sluttproduktet svarte til den ønskede sekvens. N-terminal-sekvensen ble bekreftet ved N-terminal Edman-sekvensering av prøven fjernet før N-terminal acetylering.

Eksempel 2

Fremstilling av et polysakkarid-peptid-kqnjugat

Et tørt pulver av kapselpolysakkarid fra Neisseria. meningitidis serogruppe C, omtalt som polysakkarid C i det etterfølgende, ble oppnådd ved en ekstraksjqnsprosess som beskrevet av E. Gotschlich et al. i J. Exp. Med., No 129 "(1969), s. 1349-1365. 100 mg polysakkarid C ble oppløst i 0,2 M NaCl til en sluttkonsentrasjon på 11,1 mg/ml (oppløsning A). Parallelt ble en oppløsning av 0,2 M adipinsyredihydrazid (ADH) i 0,2 M NaCl fremstilt (oppløsning B). En 0,5 M oppløsning av etyldimetyl-aminopropylkarbodiimid (EDAC) i 0,2 m NaCl ble også fremstilt (oppløsning C). 9 ml av oppløsning A, 10 ml av oppløsning B og l ml av oppløsning C blandes sammen til å gi et preparat som inneholder 5 mg/ml polysakkarid C, 0,125 M ADH og 0,025 M EDAC. 0,1 M HCl ble tilsatt for å justere pH til 6,5, og denne pH ble opprettholdt under hele reaksjonsperioden på 45 min. Temperaturen var omtrent 2 0°C.

Reaksjonen ble stanset ved hjelp av 40 /il 0,1 N NaOH som økte pH til 7,1. Reaksjonsblåndingen ble dialysert overfor 0,5 M NaCl, 10 mM fosfat og deretter vann og deretter frysetørket. Størrelsen på det derivatiserte polysakkarid C ble kontrollert på en HPLC ekskluderingskolonne TSK 4000 {produsent Tosohaas). Resultatene viste at ingen depolymerisering hadde forekommet under derivatiseringen.

Under derivatiseringen ble omtrent 3,4% av repeterende enheter derivatisert med en NH2 gruppe.

Det frysetørkede produkt ble oppløst i 0,02 M fosfatbuffer, pH 7, til en konsentrasjon på 6,25 mg/ml og avgasset. Succini-midylmaleiimidbutyrat (GMBS) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) under nitrogen med en konsentrasjon på 25 mg/ml og deretter tilsatt til det derivatiserte polysakkarid C i lik mengde. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 90 min. ved romtemperatur under nitrogen. Det aktiverte polysakkarid C ble renset ved sephadex G50 ekskluderings-kolonnekromatografi. Den ekskluderte fraksjon ble utvunnet og konsentrert til omtrent 7,5 mg/ml ved ultrafiltrering (30K Amicon membran). Den konsentrerte oppløsning ble avgasset. 20 mg av peptidet som var oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i vann i en konsentrasjon på 10 mg/ml under nitrogen. 1,5 ml av peptidoppløsningen ble tilsatt til 1,2 ml av preparatet som inneholdt det aktiverte polysakkarid C, slik at forholdet (maleiimidrester)/(tiolrester) var lik 2. Reaksjonsblandingene ble holdt over natten med omrøring ved romtemperatur. Deretter ble ureagerte maleiimidrester inaktivert ved tilsetning av 0,010 ml merkaptoetanol.

Det konjugerte produkt ble renset på en 4BCL Sepharosekolonne. De eluérte fraksjoner ble analysert for tilstedeværelse av sakkarider (sialinsyre) og peptider. Fraksjoner som responderte positivt i begge analyser ble samlet.

Mengden av sialinsyrerester ble bestemt i henhold til doser-ings met oden beskrevet i Svennerholm L., Biochim. Biophys. Acta

(1957) 24:604, og mengden peptid ble bestemt i henhold til metoden etter Lowry et al, J. Biol. Chem. (1951) 193:265. Det ble vist åt forholdet (peptid)/(repeterende enheter av polysakkarid C) mol/mol var 1:18 (svarende til et vekt/vekt forhold på 1,8:1).

Eksempel 3

Et tørt pulver av kapselpolysakkarid fra Streptococcus pneumoniae type 4, omtalt som polysakkarid Pneumo 4 i det etterfølgende, oppnås ved en ekstråksjonsprosess som beskrevet i patent WO-A 82/01 995 "Procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins å base de polyosides ainsi purifiés". 100 mg polysakkarid Pneumo 4 ble oppløst i 0,2 M NaCl til en sluttkonsentrasjon på 11,1 mg/ml (oppløsning A) . Parallelt ble en oppløsning av adipinsyredihydrazin (ADH) i 0,2 M NaCl fremstilt i en konsentrasjon på 0,25 M (oppløsning B) . En oppløsning av etyldimetylaminbpropylkarbodiimid (EDAC) i 0,2 M NaCl ble også fremstilt i en konsentrasjon på 0,5 M (oppløsning-C). 9 ml av en oppløsning A, 10 ml av oppløsning B og 1 ml av oppløsning C ble blandet sammen til å gi et preparat som inneholdt 5 mg/ml polysakkarid Pneumo 4, 0,125 M ADH og 0,025 M EDAC. 1 N HC1 ble tilsatt til en pH lik 4,9, og denne pH ble opprettholdt under hele reaksjonsperioden på 30 min. Temperaturen var omtrent 25°C.

Reaksjonen ble stanset med 0,28 ml N NaOH. pH ble økt til 7,5. Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 0,5 M NaCl og deretter vann og deretter frysetørket.

Størrelsen av det derivatiserte polysakkarid Pneumo 4 ble kontrollert på en HLPC ekskluderingskolonne TSK 4000 (produsent Tosohaas). Ingen depolymerisering forekom under derivatiseringen.

Under derivatiseringen ble omtrent 8,2% av repeterende enheter i polysakkarid Pneumo 4 derivatisert med en -NH2 gruppe.

Det frysetørkede produkt ble oppløst i 0,05 M NaCl ved en konsentrasjon på 2,76 mg/ml og avgasset. Succinimidylmalei-imidbutyrat (GMBS) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) under nitrogen i en konsentrasjon på 25 mg/ml. 1,75 ml av GMBS oppløsningen ble tilsatt til 16 ml av polysakkaridoppløsningen under nitrogen. Reaksjonsblandingen fikk stå med omrøring i 5 timer ved romtemperatur under nitrogen. Det aktiverte polysakkarid Pneumo 4 ble renset på en ekskluderingskolonne Sephadex 65.0. Den ekskluderte fraksjon ble utvunnet og konsentrert til omtrent 7 mg/ml på en 3OK membran (Amicon). Den konsentrerte oppløsning ble avgasset. 20 mg av peptidet som oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i 0,1 M NaCl, 0,01 M fosfatbuffer pH 7,5, i en konsentrasjon på 4,6 mg/ml under nitrogen. På den annen side ble 2,2 ml av peptid-oppløsningen tilsatt til 1,25 ml av preparatet som inneholdt det aktiverte polysakkarid Pneumo 4, slik at forholdet (maleiimidylrester)/(tiolgrupper) var lik 1 (Pneumo 4-peptid-l konjugat). Reaksjonsblandingene ble holdt i 6 timer med omrøring ved romtemperatur og under nitrogen, deretter over natten ved +4°C. Deretter ble ureagerte maleiimidylrester inaktivert ved tilsetning av 0,005 ml merkaptoetanol til hver reaksjonsblanding.

Konjugatene ble renset på en Sepharose 4BCL kolonne. De eluerte fraksjoner ble analysert for tilstedeværelsen av sukkere og peptider. Fraksjoner som responderte positivt i begge analyser ble samlet.

Mengden av sukker ble bestemt i henhold til doseringsmetoden beskrevet Dubois et al. Anal. Chem. (1956) 3:350, og mengden peptid ble bestemt i henhold til metoden etter Lowry et al, J. Biol. Chem. (1951) 193:265. Forholdet av repeterende enheter av peptid/polysakkarid mol/mol er 1:30 for Pn 4-peptid-l konjugatet (svarende til et vekt/vekt forhold på 0,4:1).

Eksempel 4

Et tørt pulver av kapselpolysakkarid fra Neisseria meningitidis serogruppe A, omtalt som polysakkarid A i det etterfølgende, oppnås ved en ekstraksjonsprosess som beskrevet av E. Gotschlich et al. i J. Exp. Med., No 129 (1969), s. 1349-1365. 100 mg polysakkarid A ble oppløst i vann til en sluttkonsentrasjon på 5 mg/ml (oppløsning A). Parallelt ble en oppløsning av cyanogenbromid (CNBr) i vann fremstilt i en . konsentrasjon på 67 mg/ml (oppløsning B). En oppløsning av adipinsyredihydrazid (ADH) i 0,5 M NaHC03 ble også fremstilt i en konsentrasjon på 150 mg/ml (oppløsning C). 20 ml av opp-løsning A og 0,75 ml av oppløsning C ble blandet sammen til å

gi et preparat med et polysakkarid/CNBr vekt/vekt forhold som er lik 1. 0,1 N NaOH ble tilsatt til en pH lik 10,8, og denne pH ble opprettholdt under hele reaksjonsperioden på 60 min. Temperaturen var omtrent 2 0°C.

Deretter ble pH nedsatt til 8,5 ved tilsetning av 0,15 ml 0,1 N HC1. 1,17 ml av oppløsning C ble tilsatt slik at ADH/polysakkarid vekt/vekt forholdet var lik 3,5. pH ble opprettholdt i 15 min. Deretter fikk reaksjonsblandingen stå over natten under omrøring ved +4°C. 0,1 ml 1 N HC1 ble tilsatt for å øke pH til 7. Reaksjonsblandingen ble dialysert mot 0,5 M NaCl og deretter vann og deretter frysetørket.

Størrelsen av det derivatiserte polysakkarid A ble kontrollert på en HLPC ekskluderingskolonne TSK 4000 (produsent Tosohaas). Ingen depolymerisering forekom under derivatiseringen.

Under derivatiseringen ble omtrent 2,5% av repeterende enheter

i polysakkarid A derivatisert med en -NH2 gruppe.

Deretter ble de samme prosedyrer som i eksempel 2 anvendt for å aktivere det derivatiserte polysakkarid A og for å konjugere det aktiverte polysakkarid A til peptidet som oppnådd i eksempel 1.

Eksempel 5 Sammenligning av konjugatet oppnådd i eksempel 2 med andre produkter.

Anvendbarheten av peptidet i eksémpel 1 som en bærer i et poly-sakkaridkonjugat er vist som følger:

Seks-uker gamle NMRI mus mottok via den subkutane rute, en av

de følgende blandinger i et volum på 0,5 ml (hver injeksjon) og

via den intraperitonale rute i det tilfellet hvor et adjuvans ble anvendt: (a) 5 fig polysakkarid C {uten peptid) på dag 1, 15 og 29, i

fravær av adjuvans,

(b) 5 jig polysakkarid C (uten peptid) sammen med Freund's fullstendige adjuvans på dag l, og sammen med Freund's

ufullstendige adjuvans på dag 15 og 29,

(c) . 5 fig polysakkarid C og 9 fig peptid sammen med Freund's fullstendige adjuvans på dag 1, og med Freund's ufullstendige adjuvans på dag 15 og 29, (d) konjugatet oppnådd i eksempel l inneholdende 1 fig polysakkarid C og l fig peptid på dag l, 15 og 29 i fravær av

adjuvans,

{e) konjugatet oppnådd i eksempel 2 inneholdende 5 fig polysakkarid C og 9 fig peptid på dag 1, 15 og 29 i fravær av adjuvans,

(f) konjugatet-oppnådd i eksempel 2 inneholdende 5 fig polysakkarid og 9 fig .peptid sammen med Freund's fullstendige adjuvans på dag 1, og konjugatet oppnådd i eksempel 2 sammen med Freund's ufullstendige adjuvans på dag 15 og 29, og

{g) et konjugat av '5 jig polysakkarid C sammen med difteri-anatoksin.

På dag 15, 2 9 og 43 {beregnet fra dagen for den første immunisering) , ble en blodprøve samlet og antipolysakkarid C antistoffer titreres ved hjelp av ELISA.

Resultatene er oppsummert i den etterfølgende tabell.

Antistoff-responsen på ikke-konjugert polysakkarid C er ekstremt svak i hvert tilfelle, mens responsen på polysakkarid C konjugert til enten DT eller peptidet er tilfredsstillende. Med konjugatet i henhold til oppfinnelsen oppnås en booster-effekt etter den andre injeksjon, som er en indikasjon på en immunrespons. Responsen av konjugatet polysakkarid C-peptid er ekvivalent med responsen oppnådd med konjugatet av polysakkarid

C-DT.

Eksempel 6 Konjugatet fremstilt i eksempel 3 med et forhold (vekt/vekt) av peptid til polysakkarid på 0,4:1 (svarende til et forhold av mol peptid pr. mol repeterende enheter på 1:30) ble testet i mus ved anvendelse av den samme prosedyre som i eksempel 5. Det var immunogenisk i mus i nærvær av adjuvans og ga en booster-effekt etter den andre injeksjon. Resultatene kan ses fra den etterfølgende tabell 2.

Claims

1. Antigen bærer, karakterisert ved at den består av et peptid som har fra 40 til 200 aminosyrerester og som omfatter minst 40 aminosyrer med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO i, begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 1 til 5 og som slutter med en aminosyrerest i hvilken som helst av posisjoner 40 til 104 eller en sekvens som er minst 80% identisk dermed.

2. Antigen bærer som angitt i krav 1, som omfatter en aminosyre sekvens som er identisk eller minst 8 0% identisk med en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene: SEQ ID NO 2, begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjonene 1 til 5 og som slutter med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 40 til 104, SEQ ID NO 3, begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner l til 5 bg som slutter med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 40 til 104, SEQ ID NO 4, begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst . av posisjoner 1 til 5 og som slutter med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 4 0 til 104, og SEQ ID NO 5, begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 1 til 5 og som slutter med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 40 til 104.

3. Antigen bærer som angitt i krav 1 eller 2, som omfatter minst 40 aminosyrer med en aminosyresekvens som er minst 8 5% identisk med hvilken som helst av aminosyresekvensene SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 og SEQ ID NO 5.

4. Antigen bærer som angitt i ett eller flere av de foregående krav, som omfatter minst 70 aminosyrerester■med en aminosyresekvens som er identisk eller minst 80% identisk med. en aminosyresekvens SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 eller SEQ ID NO 5 begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst av .posisjoner 1 til 5 og som slutter med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 70 til 104.

5. Antigen bærer som angitt i ett eller flere av de foregående krav, som omfatter minst 100 aminosyrerester med en aminosyresekvens som er identisk eller minst 80% identisk med en aminosyresekvens SEQ- ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 eller SEQ ID NO 5 begynnende med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 1 til 5 og som' slutter med aminosyreresten i hvilken som helst av posisjoner 100 til 104.

6. Antigen bærer som angitt i krav 1, som har aminosyresekvensen SEQ ID NO 1.

7. Antigen bærer som angitt i krav 1, som omfatter en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med aminosyresekvensen SEQ ID NO 1.

8. Antigen bærer som angitt i ett eller flere av de foregående krav, som ytterligere omfatter en cysteinrest.

9. Antigen bærer som angitt i krav 8, hvori cysteinresten er lokalisert i en ende av peptidsekvensen.

10. Fremgangsmåte for. fremstilling av en antigen bærer som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en organisk syntese.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, hvori syntesen gjennomføres ved anvendelse av Fmoc eller Boe kjemi og en automatisert peptidsyntetisator.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11, hvori FastMoc kjemi anvendes.

13. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 10 til 12, hvori aminogruppene i aminosyrene beskyttes med 9- fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) grupper og sidégruppene -beskyttes med følgende grupper: karboksyl- eller hydroksylgruppene i henholdsvis asparaginsyre, glutaminsyre, serin, treonin og tyrosin beskyttes med 0-t-butyl; amino- eller iminogruppene i henholdsvis histidin, asparagin og glutamin beskyttes med trityl; aminogruppen i lysin beskyttes med t-butyloksykarbonyi; og iminogruppen i arginin beskyttes med PMC, og hvori aktivering og kobling gjennomføres i nærvær av HBTU/diisopropyletylamin, og hvor peptidet avbeskyttes med piperidin og sluttproduktet acetyleres i N-terminalen ved anvendelse av eddiksyreanhydrid.

14. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 10 til 13, hvori doble koblinger og acetylering med eddiksyreanhydrid anvendes i sykluser 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 og 104-105.

15. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 10 til 14, hvori faste fase er TentaGel S RAM Spezial.

16. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 10 til 15, hvori cysteinenheten adderes til peptidet i N-terminalen og/eller C-terminalen.

17. Anvendelse av en antigen bærer som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9 som bærer for et konjugat.

18. Anvendelse av en antigen bærer som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9 som bærer for et polysakkarid valgt fra lipopolysakkarider, O-antigener eller bakterie-, kapsel-eller soppmembran-polysakkarider.

19. Anvendelse av en antigen bærer som angitt i ett eller flere.av kravene 1 til 9 som bærer for polysakkarid C av Neisseria meningitidis.

20. Konjugat, karakterisert ved at det omfatter et peptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9 og et immunreaktivt molekyl.

21. Konjugat som angitt i krav 20, hvori det immunreaktive molekyl er et polysakkarid.

22. Konjugat som.angitt i krav 20 eller 21, som omfatter peptidet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 9 med en ytterligere cysteinrest, en bifunksjonell linker og et polysakkarid, hvor peptidet er bundet til linkeren via tiolgruppen i cysteinet og polysakkaridet er bundet til den andre funksjonelle gruppe i linkeren via en hydroksy-, karboksy-eller aminogruppe.

23. Konjugat som angitt i ett eller flere av kravene 20 til 22, hvori polysakkaridet er polysakkarid C av Neisseria meningitidis.

24. Konjugat som angitt i ett eller flere av kravene 20 til 23, hvori 1 mol peptid per 50 til 1 mol repeterende enheter av polysakkaridet er tilstede.

25. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter konjugatet som angitt i ett eller flere av kravene 2 0 til 24 sammen med konvensjonelle bærere, eksipienser og/eller fortynningsmidler.