KR100233805B1 - 올리고머의 제조공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Hi 감염에 대한 백신들에 있어서, PRP-접합물들내에서 또는 단독으로도 유용한 면역원적 합성 펩티드를 제공한다. 본 발명의 범위내에서 수정들이 가능하다.

Description

올리고머의 제조공정{process for the production of an oligimer}

[기술분야]

본 발명은 헤모필루스 인플렌쟈(Hi)감염에 대한 백신에 관한 것이다. 특별히 본 발명은 Hi의 외부막 단백질들(OMPs)인 P1, P2, P3의 잠재적인 T-보조 세포결정인자들(THDs)와 B-세포 에피토프들(BEs)을 폴리라이보실리비톨 포스페이트(sPRP)의 반복적 단위를 가진 합성 올리고사카라이드에 공유적으로 연결하여 포유동물에 있어서 많은 양의 항-PRP와 항-OMP을 유도할 수 있는 면역원적 합성 PRP-펩티드 접합 백신들을 형성하는 것에 관한 것이다.

[배경기술]

헤모필루스 인플렌쟈 타입 b(Hib)는 5세 미만의 어린이에 있어서 박테리아성뇌막염의 주요한 원인이다(참고문헌 1,2). 이 박테리아는 폴리라이보실리비톨 포스페이트(PRP)의 반복되는 중합체인 폴리사카라이드 캡슐에 의해 식작용(phagocytosis)으로부터 보호된다. 유기체의 캡슐의 폴리사카라이드에 대하여 유도된 항체들은 보호적이다(참고문헌 3). 그 안에서 PRP가 디프테리아 톡소이드 (PRP-D), 파상풍 톡소이드(PRP-T), CRM 197 (HbOC), 수막염균의 외부막 단백질과 같은 다른 캐리어 단백질에 연결된 효과적인 접합 백신들이 개발되어오고 있다(참고문헌 4, 5). 그러나, 이러한 접합 백신들은 다른 침입적인, 캡슐이 있는 H. 인플렌쟈 타입 a와 c 계통들과 더욱 중요하게는, 백신이 없는 중이염의 일반적인 원인중에 하나인 캡슐이 없고 타입이 정해져 있지 않은 H. 인플렌쟈 계통들에 대해서는 보호적이지 못하다. 따라서, 현재의 Hib 백신에 선택된-캡슐이 없는 H. 인플렌쟈 면역원들을 포함시키는 것이 보편적인 Hi 백신을 개발하는데 필요하다.

그랜오프와 문손(Granoff & Munson, 참고문헌 6)은 Hib 외부막 단백질들(OMPs) P1, P2, P6에 대하여 유도된 항체들은 균혈증(bacteremia)의 어린쥐 모델에서 보호적이라는 사실을 보고했다. 따라서, 보호적 기능이 증강된 보편적인 H. 인플렌쟈 백신을 디자인하는데 있어서 전도 유망한 전략은 정제된 OMPs나 그들의 보호적인 에피토프를 부가적인 면역원들로 그리고 PRP의 캐리어들로 사용하는것이다. P1를 코딩하는 유전자가 몇가지의 다른 Hib 서브타입으로부터 크로닝되었다(참고문헌 7, 9). 이러한 Hib 분리물로부터의 P1 단백질 서열들의 비교분석에 의하여 세 개의 과변이성 부분의 존재가 밝혀졌다. 더우기, 한센(Hansen) 그룹에 의해 보고된 P1-특이성 MAbs는 시험된 Hib 분리물들의 50%만을 인식한다(참고문헌 7,9). P2 단백질의 경우는, 두개의 다른 Hib 서브타입들(1H와 3L)으로부터 분리된 P2유전자의 뉴클레오타이드 서열이 동일한 것으로 알려졌음에도 불구하고(참고문헌10, 11), 몇개의 아미노산 변이가 두개의 다른 Hib 서브타입들(2L 과 6U)의 P2 서열들 사이에서 알려져있다(참고문헌 11). 반면에 항원적 결정인자의 분석, 유전자 서열들, 제한된 조각 길이의 다혈성 실험에 의하면 P6 단백질이 Hi의 모든 계통들 중 가장 보존적인 것을 알 수 있다(참고문헌 12).

근래의 연구에 의하면 쥐의 P1-특이성 모노크로날 항체(MAb 7C8)과 타입이 있는 또는 타입이 없는 H. 인플렌쟈 계통들로부터의 정제된 P1에 대하여 길러진 토끼의 항혈청들은 동물 모델들에서 보호적인 것으로 알려졌다(참고문헌 9, 13, l4). 머피와 바르토스(Murphy & Bartos, 참고문헌 15)도 타입이 없는 H. 인플렌쟈 P2 단백질의 표면에 노출된 에피토프를 인식하는 모노크로날 항체가 생체밖에서 살균적활성이 있다는 사실을 보고하였다. 항-P1과 항-P2 모노크로날 항체들은 H. 인플렌쟈의 타입이 있는 그리고 타입이 없는 계통들과 교차반응을 하는 것이 알려져있다(참고문헌 16-18). 그러나, 아직도 전체의 자연적인 Hib OMPs을 타입이 있는 그리고 타입이 없는 Hi에 대한 효과적인 보편적 백신으로 사용하는데 대해 중요한 관심들이 있다. 첫째로, 타입이 없는 Hi에 의해 야기된 중이염으로부터 회복된 어린이들은 일반적으로 P2나 리포올리고사카라이드와 같은 여러가지 항원에 대한 살균적 항체들을 발생시킨다. 두번째로, 상기의 P1과 P2 교차-보호적인 에피토프들은 아직까지 확인되지 않았다. 세째로, 항-P6 살균적 항체들에 의해 인식되는 에피토프(들)는 박테리아 표면에서 소량으로 발현되고 따라서 재감염이 가능하다고 보고되었다(참고문헌 12). 네??로, OMPs에 대한 세포적 면역 반응들의 역활이 거의 알려져 있지 않다. Hi OMPs의 면역우성의 T-보조 세포 에피토프들의 특성이 아직 파악되지 않았다. 그러므로 P1, P2, P6 단백질들의 기능적 T-보조 세포 에피토프들과 보존되고 표면에 노출된 및/또는 보호적인 B-세포 에피트프들의 인지(identification)가 어떠한 에피토프가 Hi에 대한 면역 반응들을 유도해내는가를 결정하는데 있어서 필요하다.

질병에 대하여 면역을 유도해내는 방법들이 계속적으로 개선되고 있고 작고 잘 정의된 항원을 사용하는 것이 요즘의 추세이다. 그 목적은 어떠한 자연적 면역원들의 면역원성과 질병에 대한 보호 능력은 보존하는 반면 그들의 잠재적인 부-효과들을 제거하는 것이다. 최근의 연구에 의하면, 실험적 동물들을 바이러스성 또는박테리아성 단백질의 특정 부위들을 나타내는 합성 펩티드들로 면역시키면 모단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고 그들의 생물학적 기능들을 중화시킨다는 것이 밝혀졌다(참고문헌 19-22). 그러므로 합성페티드들은 감염성 질병들에 대한 저렴하고 안전한 백신들을 만들기 위한 가능성 있는 후보인 것이다. 기초 면역학에서의 근래의 발전에 의하면, 좋은 효과적인 면역원들은 두개의 별개의 기능적인 항원적 결정인자들(에피토프들)을 가져야한다고 밝혀졌다. 하나의 에피토프(T-세포 에피토프)는 면역 시스템에 연관된 적절한 MHC 부류 II 항체에 제공되도록 디자인되어 T-보조 세포 활성을 유도한다. 또 다른 에피토프(B-세포 에피토프)는 항체 형성을 위해서 동족의 B-세포 항원 받게에 의해 인식되어야한다(참고문헌 23-26). 그러므로 강력하고 효가적인 합성 백신을 생성하기 의해서는 두개의 기능적인 T-보조와 B-세포 에피토프들이 합성 구조에 포함되어야한다.

합성 PRP 이합체, 삼합체, 사합체는 합성되어 정제되고 동물의 면역원성 실험을 위해 캐리어 단백질들에 접합되었다(참고문헌 27, 28). 이러한 연구에 의하면, 완벽한 프런드의 면역 보강제(CFA)와 같은 강한 면역 보강 물질의 존재하에 합성 PRP 삼합체-단백질 접합물들이 실험동물들에서 항-PRP 항체 반응들을 유도할 수있다는 것이 알려졌다.

통상의 이종의 캐리어 단백질을 사용하는 대신에, 우리의 전략은 Hi OMPs로부터의 면역우성의 에피토프들을 가진 합성 펩티드들을 첨가적 항원들과 PRP의 캐리어로 사용하여 보호적 기능이 증강되고 자가이식한 T-세포 프라이밍을 가진 순전히 합성의 PRP-펩티드 접합 백신들의 첫번째 세대를 생성하는 것이다. 이러한 백신들은 그안에 PRP가 외부의 단백질(디프테리아 톡소이드(PRP-D), 파상풍톡소이드(PRP-T), CRM197 (HbOC), 수막염균의 OMP)에 접합되어 있는, 이미 존재하는 백신들에 대해 다른 잠재적인 잇점을 가지고 있다. 첫째로, 합성 Hi 백신의 사용은 미래의 다가의 결합된 어떠한 백신들안에서 D또는 T의 양을 줄이는데 도움을주고 따라서 이러한 캐리어 단백질에 대한 과면역화의 잠재적인 위험을 최소화할수 있다. 둘째로, PRP는 보존된 보호적인 에피토프에 결합되어 침입적인 Hi 질병과 중이염 둘다에 대한 백신을 생성할 수 있다.

약자들과 정의들

CRM₁₉₇디프테리아 톡신과 항원적으로 교차 반응하는 독성이 없는 단백질

Hi 헤모필루스 인플렌쟈

Hib 헤모필루스 인플렌쟈 타입 B

MAP 다중 항원 펩티드

OMP 외부막 단백질

PEG 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르

PRP 폴리라이보스리비톨 포스페이트

[발명의 상세한 설명]

발명의 견지들

본 발명의 한 견지는 합성 PRP 올리고머들과 Hi 외부막 단백질의 항원적 결정인자들을 포함하는 면역원적 합성 접합 백신들을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 견지는 정의된 길이의 합성 PRP 올리고머들을 포함하는 합성 PRP-펩티드 접합 백신의 제공에 관한 것이다.

발명의 또 다른 견지는 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(PEG)을 고체 지지물로 사용하여, Hi 외부막 단백질들과 부분-지시된 접합을 하게하는 화학적으로반응성이 있는 작용기를 가진 합성 PRP을 효율적으로 생산하는 화학적 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 견지는 T-세포 에피토프에 대하여 당 부분의 올바른 오리엠테이션을 선택하여, 합성 PRP-펩티드 접합물들의 면역원성을 최적화하는데 사용될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 부가적인 견지는 합성 PRP-펩티드 접합물에서 탄수화물 부분의 밀도를 증가시키기 위해서 캐리어로 Hib의 항원적 결정인자을 가진 다가의 항원 펩티드 시스템 (MAPs)을 사용함으로써, 탄수화물들의 면역원성을 증강시킬 수 있는 화학적 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 부가적인 견지는 면역원적인 합성 PRP-펩티드 접합물들과 교차-보호적인 Hi 항원들을 포함하는 보편적인 Hi 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 더욱 다른 측면은 면역원적인 합성 PRP-페티드 접합물을 포함하는 다가의 백신들의 새로운 세대과, DTP-폴리오, 수막염균 항원형 A, B, C, abd W, S.폐렴 항원형 6B, 14, 19F, 23F와 같은 다른 백신들과 결합된 Hi 항원들을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 예를 들어, 항-PRP와 항-OMP 항체들과 같은 항-Hib 항체들의 존재를 알아낼 수 있는 진료적인 이뮤노 검정에 사용 될 수 있는 PRP-펩티드 접합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 시료에서 타입미 있는 또는 타입이 없는 Hi 계통들의 존재를 알아내는 진료적인 이뮤노 검정 도구의 성분으로서, PRP-특이성 과 OMP-특이성 항체들의 혼합물을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 Hib의 외부막 단백질들(P1, P2, P6)의 여러가지 항원적 결정인자(T-보조 세포와 B-세포 에피토프)의 아미노산 서열을 가진 면역원들과 후보 백신의 제공에 관한 것이다. 자유로운 펩티드들로 주입될 수 있거나, 합성 당접합물 백신들로서 합성 PRP 올리고머들에 공유적으로 연결된 및/또는 그들의 면역원성 증대를 위해 지질 부분에 연결된 하나 또는 그 이상의 이러한 펩티드들을 포함하는 합성 백신들이 공개된다.

본 발명의 한 견지에서, 헤모필루스 인플렌쟈의 최소한 한 단백질의, 바람직하게는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b의 외부막 단백질의, 적어도 하나의 항원적 결정인자에 해당하는 아미노산 서열을 가진 합성 펩티드가 제공된다.

한 구체화로, 본 발명은 Hi P1 단백질의 보존된 항원적 걸정인자에 해당하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 본질적으로 순수한 형태의 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 생체밖에서 Hi을 인식할 수 있는 포유동물에서 폴리크로날 항체들을 유도할 수 있다. 이러한 P1-특이성 항체들은 생물학적 시료내에 Hi의 존재를 인지하기 위한 시험도구의 성분으로 사용 될 수 있다. 이 펩티드들은 예를들어,아래의 표1에 제시된 바와 같이, Hib MinnA계통의 성숙한 P1 단백질의 1-29, 39-64, 103-137, 165-193, 189-218, 226-253, 248-283, 307-331, 400-437, 179-218 아미노산에 해당하는 아미노산 서열(각각의 서열번호: 1, 12, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 13이나 14, 15)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P2 단백질의 보존된 항원적 결정인자에 해당하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 본질적으로 순수한 형태의 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 생체밖에서 Hi을 인식할 수 있는 포유동물에서 폴리크로날 항체들을 유도할 수 있다. 이러한 P2-특이성 항체들은 생물학적 시료내에 Hi의존재를 인지하기 위한 시험도구의 성분으로 사용 될 수 있다. 이 펩티드들은 예를들어, 아래의 표2에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P2 단백질의 1-14, 125-150, 241-265, 263-289, 285-306, 302-319, 314-341 아미노산에 해당하는 아미노산 서열(각각의 서열번호:16, 23, 28, 29, 30, 31, 32)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P6 단백질의 보존된 항원적 걸정인자에 해당하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 본질적으로 순수한 형태의 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 생체밖에서 Hi을 인식할 수 있는 포유동물에서 폴리크로날 항체들을 유도할 수 있다. 이러한 P6-특이성 항체들은 생물학적 시료내에 Hi의존재를 인지하기 위한 시험도구의 성분으로 사용 될 수 있다. 이 펩티드들은 예를들어, 아래의 표3에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P6 단백질의 1-22, 19-41, 35-58, 54-77, 73-96, 90-114, 109-134 아미노산에 해당하는 아미노산서열(각각의 서열번호: 35에서 41)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P1 단백질의 면역우성의 선형 B-세포 에피토프에 해당하는 적어도 하나의 아미노산를 가지는 적어도 하나의 P1 펩티드를 포함한다. 이러한 에피토프들은 항-Hi 항체들, 예를 들어 보호적인 항체들의 존재를 인지할 수 있는 진료적 도구에서 타겟 항원들로 사용될 수 있다. 이 펩티드들은 예를들어. 아래의 표1에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P1 단백질의 39-64, l03-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400-437, 179-218 아미노산 서열(각각의 서열번호: 12, 3, 4, 7, 9, 13이나 14, 15)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P2 단백질의 면역우성의 선형 B-세포 에피토프에 해당하는 적어도 하나의 아미노산를 가지는 적어도 하나의 P2 펩티드를 포함한다. 이러한 에피토프들은 항-Hi 항체들, 예를 들어 보호적인 항체들의 존재를 인지할 수 있는 진료적 도구에서 타겟 항원들로 사용될 수 있다. 이 펩티드들은 예를들어, 아래의 표2에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P2 단백질의 53-81, 148-174, 241-265, 314-342 아미노산 서열(각각의 서열번호: 20, 24, 28, 32)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P6 단백질의 면역우성의 선형 B-세포 에피토프에 해당하는 적어도 하나의 아미노산를 가지는 적어도 하나의 P6 펩티드를 포함한다. 이러한 에피토프들은 항-Hi 항체들, 예를 들어 보호적인 항체들의 존재를 인지할 수 있는 진료적 도구에서 타겟 항원들로 사용될 수 있다. 이 펩티드는 예를들어, 아래의 표3에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P6 단백질의 73-96, 90-1l4, 109-l34 아미노산 서열(각각의 서열번호: 39, 40, 41)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P2의 면역우성의 T-세포 에피토프로서 인지되어왔던 펩티드들을 포함한다. 이러한 펩티드들은 PRP의 자가이식의 캐리어로서 사용되거나, 자가이식 그리고 이종의 B-세포 에피토프의 캐리어로서 사용될 수 있다.이 펩티드는 예를들어, 이래의 표1에 제시된 바와 같이, Hib MinnA계통의 성숙한 P1 단백질의 39-64, 226-253, 339-370, 400-437 아미노산 서열(각각의 서열번호: 12, 6, 10, 13이나 14)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P2의 면역우성의 T-세포 에피토프로서 인지되어왔던 펩티드들을 포함한다. 이러한 펩티드들은 PRP의 자가이식의 캐리어로서 사용되거나, 자가이식 그리고 이종의 B-세포 에피토프의 캐리어로서 사용될 수 있다.이 펩티드는 예를들어, 아래의 표2에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P2 단백질의 125-150, 193-219, 219-244, 241-265 아미노산 서열(각각의 서열번호: 26, 27, 28)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 P6의 면역우성의 T-세포 에피토프로서 인지되어왔던 펩티드들을 포함한다. 이러한 펩티드들은 PRP의 자가이식의 캐리어로서 사용되거나, 자가이식 그리고 이종의 B-세포 에피토프의 캐리어로서 사용될 수 있다.이 펩티드는 예를들어, 아래의 표3에 제시된 바와 같이, Hib MinnA계통의 성숙한 P6 단백질의 19-41, 35-58, 73-96, 109-134 아미노산 서열(각각의 서열번호: 36, 37, 39, 41)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

그러므로, 다른 견지에서 본 발명은 적어도 하나의 헤모필루스 인플렌쟈 단백질의 적어도 하나의 면역우성의 T-세포 에피토프에 해당하는 아미노산 서열을 가지고 적어도 하나의 합성 B-세포 에피토프에 연결된 합성 펩티드로 이루어진 면역원적 접합물을 제공한다.

또 다른 견지에서 본 발명은 합성 PRP 올리고머들을 만드는 매우 효율적인 화학적 합성 공정을 제공한다. 이러한 공정은 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸에테르(PEG)을 고체 지지물로 사용하는 고체/액체-상 합성을 조합한 것이다. 이 고체 지지물는, 제어된 구멍 글래스와 같은 통상의 지지물에서의, 반응성이 있는 작용기가 30에서 35μmol/g 인 것과 비교하였을 때, 약 200에서 500μmol/g에 이르는 많은 수의 화학적으로 반응성이 있는 작용기들을 가진다. 통상의 고체-상 합성에서의 5내지 10배몰의 과다와 비교되었을 때, 이 공정에서는 각 커플링 사이클에서 합성 PRP 반복 단위의 단지 화학양론적 양만이 필요하다. 뿐만아니라, 용액-상의 합성이 노력이 많이 들고, 비싸며, 시간이 많이 걸리는 것에 비하여, 본 신규의 공정은 신속하고, 비용이 적게 들며, 상업적 응용을 위한 규모-증가(scale-up)가 간단하다.

본 발명의 이 공정의 생산물은 다음 화학식으로 나타내어지는 화학적으로 반응성 있는 합성 PRP 올리고사카라이드를 포함한다.

여기서 n은 정수이며, 바람직하게는 3에서 20이고, R은 -CH₂-(CH₂)m-X( 여기서 m은 정수이며, 바람직하게는 3에서 5이고, X는 -CH₂NH₂-,-CH₂SH-와 같은 화학적 반응성이 있는 작용기 또는, 할로겐이나, 메탄술폰닐, 트리플로로메탄술폰닐, 톨루엔술폰닐 등등과 같은 아미노-반응성 기 또는, 페닐 아자이드, 니트로페닐, 벤질페닐 등등과 같은 광활성이 가능한 기이다)로 정의된 연결 조각이다.

또 다른 견지에서 본 발명은 적어도 하나의 합성 T-세포 에피토프에 연결된합성 탄수화물 항원을 포함하는 면역원적 접합물을 제공한다. 탄수화물 항원은 박테리아성 물질, 특별히 합성 리보스리비톨 포스페이트(PRP) 올리고머, 로부터 유도될 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 포유동물에서 많은 양의 항-PRP 항체들을 유도할 수 있는 면역원적 합성 PRP-펩티드 접합 백신을 제공한다. 이 합성 PRP-캐리어접합 백신은 다음 화학식의 분자를 포함한다:

여기서 n과 m은 상기에서 정의된 바와 같으며 R'은 예를 들어, HIV-1 gag 단백질 p24로부터의 아미노산 서열 GPKEPFRDYVDRFYK(서열번호 50)을 가진 사람의 T-세포 에피토프, 또는 Hi OMP로부터의 T-세포 에피토프인 T-보조 세포 에피토프를 적어도 하나 가지는 합성 펩티드이다. 캐리어는 T-보조와 B-세포 에피토프들을 둘다 가지는 펩티드일 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 길이가 정의된 합성 PRP 올리고머와 T- 및/또는 T-B 에피토프들을 가지는 Hib P1 펩티드의 면역원적 합성 당접합물을 포함한다.합성 PRP 올리고머의 크기는 최소한 3 PRP 반복 단위이지만, 바람직하게는 6 PRP 반복 단위가 좋다. 이 펩티드들은 예를들어, 아래의 표1에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 P1 단백질의 39-64, 165-193, 189-218, 226-253, 339-370, 400-437, 아미노산에 해당하는 아미노산 서열(각각의 서열번호:12, 4, 6, 10, 13이나 14)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 길이가 정의된 합성 PRP 올리고머와 T- 및/또는 T-B 에피토프들을 가지는 P2 펩티드의 면역원적 합성 당접합물을 포함한다. 합성 PRP 올리고머의 크기는 최소한 3 PRP 반복 단위이지만, 바람직하게는 6 PRP 반복 단위가 좋다. 이 펩티드들은 예를들어, 아래의 표2에 제시된 바와 같이, Hib MinnA 계통의 성숙한 P2 단백질의 125-150, 193-219, 219-244, 241-265 아미노산에 해당하는 아미노산 서열(각각의 서열번호:23, 26, 27, 28)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 길이가 정의된 합성 PRP 올리고머와 T- 및/또는 T-B 에피토프들가지는 P6 펩티드의 면역원적 합성 당접합물을 포함한다. 합성PRP 올리고머의 크기는 최소한 3 PRP 반복 단위이지만 바람직하게는 6 PRP 반복 단위가 좋다. 이 펩티드들은 예를들어, 아래의 표3에 제시된 바와 같이, Hib MinnA계통의 성숙한 P6 단백질의 19-41, 35-58, 73-96, 109-134 아미노산에 해당하는 아미노산 서열(각각의 서열번호:36, 37, 39, 41)이나, 면역원성이 유지된 그들의 어느 부분 또는 변형을 가질 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 예를 들어 합성 PRP와 같은 탄수화물 항원의 면역원성이, 합성 글리코펩티드 접합물안에 탄수화물의 밀도를 높이기 위해서 캐리어로서 기능적인 T-보조 세포 에피토프를 가지는 다가의 항원 펩티드 시스템(MAPs)을 사용하여 증대될 수 있다는 개념을 제공하는 것이다. 이 MAPs(제 1도)은 예를들어, Hib MinnA 계통의 P2 단백질의 193-219 아미노산에 해당하는 서열 DIVAKIAYGRTNYKNESDEHKQQLNG(서열번호 26)이나 그들의 어떠한 부분을 포함 할 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 포유 동물에서 Hi에 대한 세포-매개의, 그리고체액의 면역 반응들을 유도할 수 있는 합성 PRP-지펩티드 (또는 합성 PRP-지펩티드들 혼합물) 접합물을 포함한다. 이 지펩티드들은 예를 들어, Hib MinnA 계통의 P1 단백질의 165-193 아미노산에 해당되는 서열 트리팔미 틸-CSSYAKAQVERNAGLIADSVKDNQITSALSTQC(서열번호 43)이나 그들의 어떠한 부분을 포함할 수 있다.

또 다른 구체화로, 본 발명은 Hib P1이나 P2나 P6의 알려진 T-B 에피토프들로 구성되고, Hi 감염에 대하여 포유동물을 면역시키는 데 사용될 수 있는 면역원적 키메릭 펩티드 백신들을 포함한다. 이 펩티드들은 예를 들어, 서열들

VKTIGDKRTLTLNTCARTRTTETGKGVKTEKEKSVGVGLRVYF (서열번호 42), VKTIGDKNTLTLNTFGDGFYAQGYLETRFVTKASENGSNFGDC (서열번호 42), VKTIGDKNTLTLNTCGANYLLAQKREGAKGENKRPNDKAGEV (서열번호 44), VKTIGDKRTLTLNTDIVAKIAYGRTNYKYNESDEHKQQLNGC (서열번호 45), VKTIGDKRTLTLNTYAKTKNYKIKHEKRYFVSPGFQYELC (서열번호 46), GYLETRFVTKASENGSDFKEVKTIGDKRTLTLNTTANYTSQAHANLYGLNLNYSF (서열번호 47), AKGENKRPNDKAGEVFKEVKTIGDKRTLTLNTTANYTSQAHANLYGLNLNYSF (서열번호 48), ARTRTTETGKGVKTEKFKEVKTIGDKRTLTLNTTANYTSQAHANLYGLNLNYSF(서열번호 49)나 면역원성이 유지되는 그들의 어떠한 부분 또는 변형을 가질 수 있다. 본 발명의 펩티드들은 MinnA가 아닌Hi 분리물의 유사한 부분에 해당하는 서열을 또한 가질수 있다.

이 신규의 합성 펩티드들과 여기에 제공된 접합물들은 여기에 설명된 바와같이, 적어도 하나의 합성 펩티드 및/또는 적어도 하나의 합성 접합물을 포함하는, 병원균, 특별히 헤모필루스 인플렌쟈에 의해 발생한 질병에 대한 백신으로 형식화 될 수 있다. 이 백신은 숙주에게 효과적인 양을 주입함으로써 병원균적 질병에 대 해서 숙주를 면역화시키는데 사용될 수 있다.

이 백신은 적어도 하나의 다른 면역원적 및/또는 면역자극적인 분자를 더 포함할 수도 있다. 본 발명은 또한 숙주에게 효과적인 양의 백신을 주입함으로써 숙주를 면역시키는 방법도 포함한다.

본 발명에서 설명된 펩티드들은 지질에 의해 지펩티드들로 수정되거나, 합성지글리코펩티드 접합물로서 합성 PRP에 연결(및/또는 중합됨)되어 다른 백신들을 생성하기도 한다.

이 백신들은 포유동물에서 예를 들어, 근육내나, 비경구적으로 또는 미세입자들, 캡슐들, 리포좀들, 독소들이나 항체들과 같은 타겟 분자들을 사용하여 점막표면에 전달되었을 때, Hi 감염에 대한 면역화에 사용될 수도 있다.

본 발명은 또한 여기서 제공된 어떠한 합성 펩티드들의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 가지는 항원 전달을 위한 생 벡터를 제공한다. 생 벡터는 폭스바이러스성, 아데노바이러스성, 폴리오바이러스성, 레테로바이로스성의 바이러스성 벡터일 수 있다. 생 벡터는 살모넬라와 미코박테리아와 같은 박테리아성 벡터일 수 있다. 이 생 벡터는 생리적으로-받아들여질 수 있는 캐리어를 포함하는 벡신으로 만들어질 수 있다.

상기에서 이미 언급한 바와 같이, 여기에 제공된 합성 펩티드들은 헤모필루스 인플렌쟈들에 의한 감염을 인지하는 방법에 있어서 진료적 시료로 사용될 수 있다. 여기서 설??된 어떠한 합성 펩티드나 접합물들에 대하여 길러진 항체들은 본발명의 범주에 속한다.

본 발명은 Hib OMPs의 면역원적 에피토프들의 인지와 신규의 PRP-펩티드 접합물들, 그리고 그들로 부터의 백신에 관한 것이다. 이러한 신규의 면역원저 항원들은 Hib OMPs P1, P2. P6의 항원적인 결정인자를 가지는 화학적으로 합성된 펩티드들에 의해 제공된다. 이 펩티드들과 지펩티드들은 독립적으로 또는 백신들로서합성 PRP 올리고머에 연결되어 사용될 수 있다. 그들은 또한 또 다른 백신을 만들기 위해서 중합될 수도 있다. 이 백신들은 포유동물에서 예를 들어, 근육내나, 비경구적으로 또는 미세입자들, 캡슐들, 리포좀들, 독소들이나 항체들과 같은 타겟분자들을 사용하여 점막 표면에 전달되었을 때, Hi 감염에 대한 면역화에 사용될수도 있다.

참고문헌들이 상세히 기재되어 다음의 실시예와 함께 발명의 원리를 설명하는데 도움을 줄 것이다. 재한하기 위한 것이 아니라, 발명의 명확성을 위해서 발명의 상세한 설명은 다음의 구획으로 나누어져 있다:

(i) 에피토프 예측과 펩티드 합성;

(ii) 합성 펩티드들을 이용한 Hi OMPs P1, P2, P6의 면역우성의 B-세포 에피토프의 인지와 특성 파악;

(iii) 합성 펩티드들을 이용한 Hi OMPs P1, P2, P6의 면역우성의 T-세포 에피토프의 인지와 특성 파악;

(iv) Hib OMPs 펩티드들의 면역원성;

(v) PEG를 지지물로 사용하는 PRP 올리고머들의 고체-상 탄수화물 합성;

(vi) 합성 PRP 올리고머들과 Hib OMP 펩티드들의 접합과 당접합물들의 면역 화학적인 특성파악;

(vii) Hi 합성 PRP펩티드 접합 백신들의 유용성.

에피토프 예측과 펩티드 합성

Hi OMPs의 면역우성의 T-세포나 B-세포 에피토프들을 맵핑하기위해서, P1, P2, P6 단백질의 대부분을 커버하는 13, 17, 7 겹치는 합성 펩티드들(표 1, 2, 3)이, 아래의 실시예 12에서 상세히 설명되는 바와 같이 t-Boc 고체-상 펩티드 합성을 사용하여 각각 합성된다. 이 펩티드들의 길이는 통상적인 알고리즘에 따른 2차구조 예측 분석에 의한 소수성 β-턴의 높은 지수에 기초하여 선택되어진다(참고문헌 29 에서 31)(제 2, 3, 4 도). 이러한 펩티드들은 항원적이고 표면에 노출되기 쉽다. 판 레겐모르텔의 업적에 의해 제안된 바와 같이 자연적인 에피토프를 더 잘모방하기 위해서 길이가 25 잔기 이상의 펩티드들이 선택되어 졌다(참고문헌 32).때때로 부가적인 시스테인 잔기가 부위-특이성 접합을 의해서 펩티드들의 N-말단이나, C-말단에 첨가되기도한다.

합성 펩티드를 사용한 Hi OMPs P1, P2, P6의 면역우성의 에피토프들의 인지와 특성 파악

Hib OMPs의 면역우성의 B-세포 에피노프들을 인지하기 위해서, 다른 단상형(H-2^a, H-2^b, H-2^d,. H-2^k, H-2^q, H-2^s)의 토끼들, 기니어피그들, 쥐들이 프런드의 면역 보강물의 존재하에 정제된 P1나 P2, 또는 P6로 면역되있다. 1차와 2차 면역화후에 모든 동물들이 P1-, P2-, P6- 특이성 ELISA와 이뮤노블랏 분석에 의해 판단되는 강력하고 특이성 있는 항-OMP 항체 반응을 보였다(표 4,5,6). 그랜오프와 문선(Granoff & Munson)에 의해 보고된 바와 같이, 토끼 항-P1,-P2 -P6 항혈청들은 살아있는 HIb의 도전에 대하여, 변함없이 어린 쥐들을 보호했다(참고문헌 6). 기니어피그 항-P2 항혈청들도 또한 이 모델에서 보호적이있다.

Hib OMPs의 선형 B-세포 에피토프들을 맵핑하기 위해서, 아래의 실시예 17에서 설명된 바와 같이, P1, P2, P6의 대부분의 서열을 커버하는 겹치는 합성 펩티드들이 각자 ELISA 플레이트들위로 코팅되고 여러 종류의 항-P1, 항-P2, 항-P6 항혈청으로 검침되었다. 그 결과는 표 5,6,7에 요약되어 있다. P1의 면역우성의 선형 B-세포 에피토프들이 Hib MinnA 계통의 성숙한 P1 단백질의 39-64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400-437, 179-218 아미노산에 해당하는 아미노산서일(표1)내에 위치하고 있다는 것이 밝혀졌다. 면역우성의 B-세포 에피토프들을가지는 P2 펩티드들은 Hib MinnA 계통의 성숙한 P2 단백질의 53-81, 148-174, 241-265, 314-342 잔기들(표2)로 밝혀졌다. 유사하게, 면역우성의 B-세포 에피토프들을 가지는 P6 펩티드들은 Hib MinnA계통의 성숙한 P6 단백질의 73-96, 90-114, 109-134 잔기들(표3)이다(제 8도). 흥미롭게도, 세개의 사람의 회복기의 혈청들도 또한 상기의 P1과 P2의 면역우성의 에피토프들과 강하게 반응한다(제 9, 10도). 뿐만 아니라, 계통-특이성 P1 보호적인 B-세포 에피토프가 P1 단백질의 165-193 잔기들에 해당하는 부분에 맵핑되있다. 이러한 결과에 의하면, 상기의 B-세포 에피토프들이 생물학적 유동체내에서 항-Hi 항체들의 존재를 알아낼 수 있는 진료적 도구에서 타겟 항원으로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.

합성 펩티드를 사용한 Hi OMPs P1, P2, P6의 면역우성의 T-세포 에피토프들의 인지와 특성파악

Hib OMPs-특이성 T-세포 에피토프들은 P1, P2, P6을 사용하여 결정되었고 T-세포 라인들이 자연적인 OMPs로 면역화된 쥐의 다른 계통들의 패널로부터 얻어졌다. 겹치는 P1 펩티드들(13 펩티드들), P2 펩티드들(17 펩티드들), P6 펩티드들(7펩티드들)에 대한 0MP-특이성 T-세포 라인들의 임파구 증식 반응들이 실시예 19에서 설명된 바와 같이 통상적인 증식 검정에 의해서 결정되었다. 이 결과(제 11,12도, 표7)에 의하면, 어떠한 합성 펩티드들은 단지 증식 반응만은 유도하고, T-세포에피트프들의 인식은 MHC-제한적이라는 것을 알 수 있다. P1의 39-64, 226-253, 339-370, 400-437 잔기들; P2의 125-150, 193-219, 219-244, 241-264 잔기들; P6의19-41, 35-58, 73-96, 109-134 잔기들에 해당하는 합성 펩티드들은 적절한 쥐의MHC 배경상황에 놓였을 때 그들의 해당되는 OMP-특이성 쥐의 T-세포 라인들을 위해 매우 자극적인 것을 알 수 있다. 그러므로, 이러한 면역우성의 T-세포 에피토프들은 그들의 면역원성을 증대시키기 위하여, PRP 및/또는 OMP B-세포 에피토프들을 위한 자가이식의 캐리어로서 사용될 수 있다.

Hib OMPs 펩티드들의 면역원성

합성 OMP 펩티드들이 가능한 백신 후보들이 될 수 있는가를 결정하기 위해서, 자유로운 펩티드들과 펩티드-KLH 접합물들에 대해 각각 그들의 면역원성이 검정되었다. 토끼의 항-펩티드 항혈청들에 대하여, 면역시키는 펩티드들과 그들의 모 단백질들과의 반응성이 ELISA와 이뮤노블랏에 의해 시험되었다. 표 8에서 보는 바와 같이, HIBP1-8이나 HIBP1-8-KLH 접합물에 대하여 길러진 항-P1 펩티드 항혈청을 제외한 모든 항-P1 펩티드 항혈청이 그들 각각의 면역화시킨 펩티드들에 대해 특이성이 있음이 ELISA에 의하여 밝혀졌다. 자유로운 펩티드들에 의하여 펩티드-특이성IgG 항체들이 많이 유도된다는 사실은 펩티드가 기능적인 T-보조 결정인자와 B-세포 에피토프(들)를 둘다 가진다는 것을 말한다. 뿐만 아니라, 항-HIBP1-4, 항-HIBP1-5, 항-HIBP1-7, 항-HIBP1-9, 항-HIBP1-10, 항-HIBP1-11, 항-HIBP1-14 항혈청들이 사용된 모든 검정에서 P1를 인식하였으며, 이 사실은 이러한 부분이 항원적이며 항체들과 서로 작용하는데 있어서 자유롭다는 사실을 말해준다. 이러한 펩티드들은 유력한 T-보조 결정인자와 펩티드-KLH 접합물들을 가지고 토끼들에서 강한IgG 항체 반응들을 유도한다는 것이 밝혀졌으므로, 그들이 백신 제조에 있어서 항원으로서 작용하는 것은 명백하다.

Hib P1 펩티드-특이성 항혈청들이 H. 인플렌쟈들의 타입이 정해져 있지 않은 계통들로부터의 자연적인 P1과 교차 반응을 하는지를 결정하는 것은 흥미롭다. 합성 펩티드 HIBP1-1, HIBP1-3, HIBP1-5, HIBP1-6, HIBP1-7, HIBP1-7, HIBP1-9, HIBP1-12, HIBP1-13에 대하여 길러진 토끼의 항혈청들은 타입이 있는 그리고 타입이 없는 분리물 둘다로부터의 P1 단백질을 인식했다. 이러한 결과들은 성숙한 P1 단백질의 1-29, 39-64, 103-137, 189-218, 226-253, 248-283, 307-331, 400-437 잔기들에 해당하는 펩티드들이 H. 인플렌쟈의 타입이 있는 그리고 타입이 없는 계통들 사이에 강하게 보존된 에피토프들을 가진다는 것을 암시한다.

P2 펩티드-KLH 접합물들에 대하여 길러진 토끼의 항혈청들에 대하여 P2-특이성 ELISAs내에서 그리고 이뮤노블랏 분석에 의해 자연적인 P2에 대한 반응성이 검정되었다. HIBP2-26-KLH와 0MP2-13-KLH 접합물에 대하여 길러진 항혈청들을 제외한모든 펩티드-특이성 항혈청들이 이뮤노블랏에서 P2를 인식함에도 불구하고, 단지 Porin-1, OMP2-5, -7, -8, -10, -12, CHIBP2 펩티드-KLH 접합물들만이 P2-특이성ELISA에서 자연적인 P2와 교차 반응을 할 수 있는 항체들을 유도할 수 있다고 밝혀졌다(표 9). Porin-1와 HIBP2-26을 제외한 완벽한 프런드의 면역보강물질내에 에멀션화된 모든 접합되지 않은 펩티드들은 이뮤노블랏에서 P2에 대하여 항체 반응들을 유도했다(표 9). 뿐만 아니라, 접합되지 않은 펩티드들 OMP2-4, -8, -10, 11, -12, -13에 대하여 길러진 항혈청들은 P2-특이성 ELISA에서 자연적인 P2와 강하게 반응한다. 이러한 자료에 의하면, 이리한 펩티드들이 유력한 기능적인 T-보조 세포에 피토프들과 면역원적 B-세포 에피토프들을 가진다는 사실을 알 수 있다. 더우기, 세가지의 다른 타입이 없는 분리물, SB30, SB32, SB33 으로부터 정제된 P2는 이뮤노블랏에서 타겟 항원으로 사용될 수 있다. 토끼의 항-Porin-1, OMP2-5, -8, -10, -11, -12, -13 항혈청들이 세가지 타입이 없는 분리물로부터의 P2와 강하게 반응했다. 이러한 결과는 성숙한 P2의 1-19, 125-150, 183-219, 241-265, 263-289, 285-306, 302-319 잔기에 해당하는 펩티드들이 H. 인플렌쟈의 타입이 있는 그리고 타입이 없는 계통들 사이에 보존된 에피토프들을 가진다는 것을 암시한다.

P6 쳅티드들에 대하여 길러진 토끼의 항혈청들이 P6-특이성 ELISA내에서 그리고 이뮤노블랏에서 P6에 대한 반응성이 검정되었다. P6-4에 대하여 길러진 것을제외한 모든 펩티드-특이성 항혈청들은 P6-ELISA에서 자연적인 P6을 인식하고, 이 뮤노블랏에서 타입이 있는 것과 타입이 없는 P6 둘다와 교차 반응을 하는 것으로 밝혀졌다(표10). 이러한 자료에 의하면 P6 펩티드들이 유력한 T-보조 세포 에피토프들과 면역원적 B-세포 에피토프들을 가진다는 사실을 알 수 있다. 더우기, 이러한 결과들은 P6 단백질이 H 인플렌쟈의 타입이 있는 것과 타입이 없는 계통 사이에서 강하게 보존된다는 사실을 확신시켜준다. 그러므로, 이러한 보존되는 P1, P2, P6의 에피토프들은 (Hi의 타입이 있는 것과 타입이 없는 계통들과) 교차 반응하는 합성 백신을 제공하기 위해서 개개로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기의 펩티드들은 중합되거나, 지질에 의하여 지펩티드로 수정되거나, 합성 PRP에 연결되어 합성 당펩티드가 되거나, 지당펩티드 접합물이 되어 대체 가능한 다른 백신들을 생성할 수 있다. 이러한 백신들은 포유동물에서 예를 들어, 근육내나, 비경구적으로 또는 미세입자들, 캡슐들, 리포좀들, 독소들이나 항체들과 같은 타겟 분자들을 사용하여 점막 표면에 전달되었을 때, Hi 감염에 대한 면역화에 사용될 수도 있다.

인지된 면역우성의 T-와 B-세포 에피토프들을 포함하는 합성 펩티드들이 Hi감염에 대하여 강한 보호적 항원을 유도할 수 있는가를 결정하기 의해서 한층 더한 실험이 행해졌다. 아미노산 서열들 을 가지는 펩티드들이 합성되고 정제되어 알럼이나 CFA의 존재하에서 토끼를 면역시키는데 사용되었다. 모든 항-펩티드 항혈청이 각각의 면역시킨 펩티드들과 강하게 반응하였으나, 모든 키메릭 단백질들이 자연적인 OMPs에 대하여 항체들을 유도하지는 않았다. 가징 좋은 면역원들은 1P13-2P8과 2P6-1P13 펩티드들이있다. 이들은 알럼의 존재하에 주입되었을 때, 자연적인 P1과 P2 단백질 둘다를 인식하는 항체들을 얻을 수 있다. 이러한 펩티드들은 Hi 계통들 사이에 보존되는 에피토프들을 가지고 있기 때문에, 부가적인 항원으로 사용되거나, 지펩티들로 수정되거나. 벡신으로서 합성 PRP 올리고머들에 연결될 수도있다. 이러한 백신들은 포유동물에서 예를 들어, 근육내나, 비경구적으로 또는 미세입자들, 캡슐들, 리포좀들, 독소들이나 항체들과 같은 타겟 분자들을 사용하여 점막 표면에 전달되었을 때, Hi 감염에 대한 면역화에 사용될 수도 있다.

PEG를 사용한 PRP 올리고사카라이드의 합성

합성 PRP는 제 13, 14도에 표시된대로 고체/액체-상 합성의 조합과 매우 효율적인 포스포아미디트 방법예 의해 제공되었다. 이것은 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(PEG)를 고체 지지물로 사용하는 신규의 공정이다. 이 고체상 지지물은 제어된 구멍 글래스와 같은 통상의 지지물에서의, 반응성이 있는 작용기가 30에서 35μmol/g 인 것과 비교하였을 때, 약 200에서 500μmol/g에 이르는 많은 수의 화학적으로 반응성이 있는 작용기들을 가진다. 통상의 고체-상 합성에서의 5내지 10배몰의 과다와 비교되었을 때, 이 공정은 각 커플링 사이클에서 합성 PRP 반복 단위의 단지 화학양론적 양만이 필요하다. 더우기, PEG가 반응 용매에 용해하여 커플링 효율이 각 사이클마다 약 95% 내지 98%에 이른다. 사이클의 끝에, PEG-결합 합성 PRP 가 부산물들을 없애기 위해 에테르에 의해서 침전화된다. 합성 PRP 육합체의 경우 최종 수확률이 70%에 이른다. 따라서, 용액-상의 합성이 노력이 많이 들고, 비싸며, 시간이 많이 걸리는 것에 비하여, 본 신규의 공정은 신속하고, 비용이 적게 들며, 상업적 응용을 위한 규모-증가(scale-up)가 간단하다.

다음은 합성 공정을 더 상세히 설명하는 단락들이다. 올리고머 초기화를 위한 PRP 반복 단위는 다음의 화학식으로 표시되는 화합물이다.

여기서 Bn과 DMT는 각각 벤질과 디메톡시트리틸 기들이다. 이 반복 단위는 실시예 10에서 설명된 대로 PEG와 결합하고, 트리클로로아세트산(TCA)으로 디트리틸레이트된 다음 사슬 연장을 위해 다음 화학식에 의해 나타내어지는 다른 PRP 반복 단위와 결합한다.

그런 다음, 결과적인 화합물은 TCA로 디트리틸레이트된다. 각 사이클에서, 사슬 연장은 촉매, 바람직하게는 테트라졸 존재하에 디트리틸레이트된 사슬의 커플링으로 수행된다. 각 커플링 단계 후에 인의 산화가 산화제, 바람직하게는 t-부틸 하이드로퍼옥사이드를 사용하여 수행된다. 합성 사이클(디트리틸레이션, 커플링, 산화)이 원하는 길이의 올리고머가 얻어질 때까지 반복된다. PRP 올리고머는 다음화학식으로 표시되는 사슬 터미네이터와의 반응에 의해 마무리된다.

여기서 m은 정수이며, 바람직하게는 4 내지 6이고, MMT는 모노메톡시트리틸이다. 사슬 종결후에 결과적인 PEG에 의해 지지된 올리고머들은 고체의 지지대로부터 분리되며, 바람직하게는 아미놀리시스(amiinolysis)에의한 분리로 된다. 이것은 본 발명의 한 견지이기도 하다, 회수된 물질은 다음의 화학식으로 표시된다.

여기서 n은 정수이고, 바람직하게는 3 내지 20이며 m은 정수이고, 바람직하게는 4 내지 6이며 Bn과 MMT는 각각 벤질과 모노메톡시트리틸이다. 이 화합물은 카운터 이온과 연합되어 있으며, 바람직하게는 표시된 바와 같이 암모늄이나, 치환된 암모늄이 좋다.

곁가지 보호 기들은 실시예 10에서 설명된 바와 같이 물/아세트산/t-부틸 알코올의 존재하에 챠콜(charcoal)위에서 팔라듐으로 수소화함으로써 제거된다. 결과적인 올리고머는 표준 기술에 의해, 바람직하게는 겔과 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

이미 설명한 바와 같이, 사슬-종결전의 마지막 단게에서 X6 화합물(제 14도)을 커플링하여, 합성 PRP 올리고머가 다음 화학식으로 표시되는, 화학적으로 반응성이 있는 작용기를 포함하도록 하기가 용이해진다.

여기서 n은 정수이며, 바람직하게는 3에서 20이고, R은 -CH₂-(CH₂)m-X(여기서 m은 정수이며, 바람직하게는 3에서 5이고, X는 -CH₂NH₂-,-CH₂SH-와 같은 화학적반응성이 있는 작용기 또는, 할로겐이나, 메탄술폰닐, 트리플로로메탄술폰닐, 툴루엔술폰닐 등등과 같은 아미노-반응성 기 또는, 폐닐 아자이드, 니트로페닐, 벤질페닐 등등과 같은 광활성이 가능한 기이다)로 정의된 연결 조각이다.

작용기를 가진 화합물은 본 발명의 대부분의 바람직한 구체화에서 접합물로 형태화될 수 있다. 그 접합물은 다음의 화학식으로 표시될 수 있다.

여기서 n은 정수이며, 바람직하게는 3 내지 20이고, m은 정수이고, 바람직하게는 3 내지 5이고, R'은 -(CH₂-Y-캐리어), 여기서 Y는 m-말레이미디벤조일-N-하이드록시써시니미드이고 캐리어는 Hi 펩티드 또는 그들의 MAP시스템이다. 접합물은 카운터 이온과 연합될 수 있으며, 바람직하게는 표시된 바와 같이 Na⁺이다.

합성 PRP를 제조하는데는 많은 방법이 있음이 명백하다. 본 발명과 관련하여사용될 수 있는 기술들 뿐만 아니라, 예를 들어, 유럽 특허 공고 0 320 942 (참고문헌 28)과 유럽 특허 공고 0 276 516 (참고문헌 27)과 같이 이 기술 분야에서 잘알려진 것을 포함하는 기술이 본 발명의 범위에 속한다.

T-보조 세포 에피토프(들)를 가진 펩티드들에 접합된 합성 PRP 올리고사카라이드의 면역헉적 특성

본 발명에 따라 사용되어 질 수 있는 펩티드들은 어린 포유 동물에 주입되었을 때 안전하고, 예를 들어 P24E, HIV-1 gag 단백질 p24로부터의 사람의 T-세포 에피토프와 같은 면역학적으로 효과적인 T-세포 에피토프로 작용 할 수 있는 어떠한펩티드를 포함한다(제 1도). 특별한 구체화로, Hib의 외부막 단백질로부터의 펩티드들이 사용되었고 접합 기술은 실시예 11과 실시예 13에 설명되어있다. 항-PRP IgG 항체 반응을 유도할 수 있는 최소의 반복 단위를 결정하기 위해서, 합성 PRP 올리고머들(이합체와 삼합체)이 파상풍 톡소이드와 결합되고 당접합물들이 알럼 존재하에 토끼들에게 주입되있다. 제 15도에 표시되어있는 그결과에 의하면, 면역원젖이 되려면 합성 PRP 올리고머들은 적어도 세개의 반복 단위가 필요하다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따르면, 순전히 합성에 의한 합성PRP-펩티드 접합 백신 후보들은합성 PRP 올리고머들을 특성이 잘 파악된 Hib OMPs의 T-세포 에피토프들에게 펩티드들(예를 들어 Hib 계통-특이성 보호적인 B-세포 에피토프와 적어도 하나의 기능적인 T-보조 세포 에피토프를 포함한다고 알려져온 HIBP1-4펩티드 (P1 단백질의 165-193 잔기)의 C-말단이나 N-말단에 첨가된 시스테인 잔기를 통해 커플링함으로써 얻어졌다. 효과적인 합성 PRP-펩티드 접합 백신을 제조하기 위해서는, 탄수화물 항원의 면역원성에 영향을 미치는 여러가지 인자들을 신중하게 검토하여야 한다. 이러한 요인들은 다음과 같다. (i) 올리고사카라이드의 사슬 길이; (ii) T-세포 에피토프에 관하여 당 부분의 접합 부위; (iii) 펩티드위에 탄수화물 항원의 밀도; (iv) 당접합의 안정성에 영향을 미치는 접합 방법; (v) 적당한 항원 제시와 프로세싱을 위한 탄수화물 부분들간의 연결자들과 공간들의 필요성. 이러한 목적을 위해, 단지 첨가된 시스테인 잔기만이 다른, C-말단(HIBP1-4 서열번호 51)과 N-말단(CHIBP1-4 서열번호 52) 두개의 펩티드들 HIBP1-4 CHIBP1-4(제 1도)가 각각 합성되고 정제되어, 면역원의 구조상에 T-세포 에피토프에 관한 당 부분의 오리앤테이션의 영향을 알아보기 위해서, T-세포 에피토프 캐리어로 사용되었다. 합성 PRP 삼합체가 탄수화물 항원으로 사용되었다. 두 PRP-펩티드 접합물들(PRP-CHIBP1-4와 HIBP1-4-PRP)이 만들어지고 알럼 존재하에 토끼에게 주입되었다. 세번의 면역화후에, 토끼의 항혈청들에 대해 항-PRP와 항-펩티드 IgG 항체 양이 검정되었다. 두 접합물들은 모두강한 항-펩티드와 항-P1 항체 반응들을 유도하였으나, 단지 합성 HIBP1-4-PRP만이 항-PRP IgG 항체 반응을 유도했다. 이러한 결과들은 T-세포 에피토프에 대한 당 부분의 오리엔테이션이 탄수화물 항원에 대한 숙주의 면역 반응에 중요하게 영향을 미친다는 것을 암시한다.

기능적인 T-세포 에피토프(들)를 가진 모든 펩티드들이 면역 시스템에서 합성 PRP 올리고머들을 효과적으로 제공하는지의 여부를 결정하기 위해서, 기능적인 T-세포 에피토프(들)를 가진 것으로 알려진 두개의 펩티드(COMP2-8, 서열번호 53; P24EC, 서열번호 56)들이 합성 PRP 삼합체에 접합되었다. 당펩티드 접합물들은 알럼에 횹수되었고 토끼를 면역시키는데 사용되었다. 그 결과는 표 12에 요약되어있다. 두 당펩티드 접합물들(COMP2-8-PRP와 P24EC-PRP)이 둘다 항-PRP IgG 항체 반응들을 유도했다.

합성 당펩티드 접합 백신의 면역원성에 대한 탄수화물의 밀도의 영향을 결정하기 위해, 합성 PRP 삼합체가 여덟개의 가지가 있는 OMP2-8 펩티드들( P2 단백질의 193-219 잔기)(제 1도 서열번호 54)을 가진 다가의 항원 펩티드 시스템(MAPs)에 접합되있다. 아홉개의 시스테인 잔기들이 접합을 위해 사용될 수 있음에도 불구하고, 단지 다섯의 PRP 삼합체 분자들만이 하나의 MAPs 시스템에 커플링되는 것으로밝혀졌다. 그럼에도 불구하고,50μg의 합성 당펩티드 접합물을 알럼 존재하에 세차레 주입하였더니, 두 토끼에서 모두 강한 항-PRP IgG 항체 반응을 나타내었다. 항-PRP IgG 항체의 양은 선형 펩티드-PRP 접합물(표 12)로 얻어진 것에 비해 약 네 배가 많았다. 더우기, 항-펩티드와 항-P2 항체 반응들은 선형 펩티드-PRP 접합물로 얻어지는 것들보다 10배 내지 100배 정도 높았다. 제 16도에 표시된 바와 같은, 그결과들에 대한 그이상의 분석에 의하면 합성 PRP 올리고머에 접합된 Hib MAPs들이 디프테리아 톡소이드나 P1또는 P2 단백질들에 커플링된 자연적인 PRP로 얻어진 것들에 비교해보았을 때, 많은 양의 항-PRP IgG 항체들을 유도할 수 있다는 사실을 알 수 있다.

탄수화물 반복단위의 길이가 당접합물에서의 탄수화물 항원의 면역원성에 영향을 미치는 가를 결정하기 위해서, 합성 PRP 이합체, 삼합체, 오합체, 육합체, 자연적인 PRP(분자량이 30kD)들이 선형 펩티드 HIBP1-4와 OMP2-8 MAP에 각각 커플링되었다. 놀랍게도, 자연적인 PRP에 접합된 두 펩티드들은 항-PRP IgG 반응들을 유도해내지 못했다. 반면에, 선형 펩티드 HIBP1-4에 접합된 PRP 오합체와 육합체는 강하고 지속적인 항-PRP IgG 항체 반응들을 유도했다(제 17도). 합성 PRP 육합체에접합된 OMP2-8 MAP도 또한 매우 면역원적이다. 합성 PRP 이합체는 면역원적이지 못하고 상기의 결과와 모순되지 않는다.

합성 당펩티드 접합 기술의 이용

본 발명의 바람직한 구체화에서, 당접합물 기술이 병원균의 피포성(encapsulated) 박테리아에 대한 접합 백신들을 만드는데 일반적으로 사용될수 있다. 그러므로, 본 발명의 당접합 기술은 잠재적인 폴리사카라이드 항원들(헤파피루스 인플렌쟈, 폐렴연쇄상구균, 대장균, 수막염균, 장티푸스균, 스트렙토콕쿠스 뮤탄스, 크렙토콕쿠스 네오포르만스, 폐렴간균, 황색포도상구균, 녹농균 등을 포함함)을 표현하는 어떠한 박테리아에 의한 감염에 대한 보호를 부여하는 백신화에 적용될 수 있다.

특별한 구체화에서, 합성 당접합 기술은 단백질이나 올리고사카라이드에 대한 항체들을 유도하는 백신들을 생성하는데 사용될 수 있다. 그러한 백신은 예를 들어 종양 세포에 대한 면역을 유도하거나, 화학요법의 또는 생활성(bioactive)의 시료에 접합될 수 있는 항-종양 항체들을 생성하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법학적 응용은 당해 분야에서 보통의 기술을 가진 자들의 능력 범위내에 있다. 본 발며의 생산물들과 그들의 제조와 사용에관한 공정들의 예는 다음의 실시예에 나타나 있다.

상기의 펩티드들의 어떠한 변형과 기능적으로 동일한 변형들은 본 발명의 범위내에 속한다. 여기서 '변형'이나 '기능적으로 동일한 변형'이라는 용어는, 펩티드가 수정이나, 제거, 또는 하나 또는 그이상의 아미노산의 파생에 의해서도 어떠한 헤모필루스 인플렌쟈 분리물의 p1, p2, p6 펩티드들과 유사한 양식으로 작용하는 것을 말하는 것이고, 그런 경우 본 발명의 범주에 속한다.

이러한 펩디드들과 유사한 펩티드들의 주어진 아미노산 서열은, Applied Biosystem Model 430A와 같은 상업적으로 이용할 수 있는 펩티드 합성기를 이용하여 쉽게 합성하거나, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산 할 수 있다.

상기의 명세서는 본 발명을 일반적으로 설명하였다. 다음의 구체적인 실시예를 참고하면 더욱 완벽한 이해를 할 수 있을 것이다. 이러한 실시예는 설명을 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 형태의 변화와 균등물의 치환은 정황상 암시될 수 있는 것으로 생각되어진다. 여기에 특정 용어가 사용되더라도 그것은 설명을 위한 것이지 제한하기 위한 것은 아니다. 이 명세서에 직접 설명되지 아니한 면역학적 방법들은 본 발명의 기술분야에서 잘 알려진 방법의 범주에속한다.

[실시예]

실시예 1

2, 3, 4-Tri-O-벤질-1-O-[2, 5,-디-O-벤질-β-D-리보퓨라노실]-5-O-(4, 4'-디메톡시트리틸)-D-리비톨(제 14도 화합물 14)의 제조.

상온에서, 4, 4'-디메톡시트리틸 클로라이드(6.2 g)가, 이미 설명한 바와 같이(참고문헌 33 에서 36) 12개의 중간 생성물을 거쳐서 D-리보스로부터 얻어지는 2,5,-디-O-벤질-β-D-리보퓨라노실 2, 3, 4-Tri-O-벤질-D-리비톨(제 14도 화합물13) 10.2g과 피리딘(3.4mL), 4-메톡실아미노피리딘(860mg)를 가진 디콜로로메탄용액 200mL에 첨가되었다. 18 내지 24 시간 동안 저은 후에 반응 혼합물은 나트륨 탄산수소염 포화용액에 부어졌다. 수용액층을 디클로로메탄으로 추출하고, 말리고 용매는 즘발시켰다. 생성물은 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제되고 그것의 구조는 NMR에 의해 확인되있다.

실시예 2

2, 3, 4-Tri-O-벤질-1-0[2, 5,-디 -O-벤질-3-O-숙신-β-D-리보퓨라노실] -5-0-(4, 4'-디메톡시트리틸)-D-리비톨(제 13도 화합물 16)의 제조.

건조한 피리딘(4.5mL)내의 실시예 1로부터의 생산물 1.34g의 용액에 숙신닉 무수물(390 mg)과 4-메톡실아미노피리딘(240mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물들을 50내지 80℃의 수조에서 3 내지 10 시간동안 저었다. 물(2.0mL) 첨가한 후에 반응 혼합물은 로터리 증발기에서 농축되었다. 디클로로메탄:메탄올:트리에틸아민이 95;5:2.5 (V:V:V)의 비율로 사용된 혼합물의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 NMR에 의해 구조가 확인된 트리에틸암모늄 염이 생성물로서 얻어진다.

실시예 3

라이보실리비톨 포스포아미디트의 제조

화합물 16의 용액(5mL의 건조한 디옥산에 1.2g)에 N, N-디이소포로필에틸아민 (1.4 mL)와 2-시아노에틸 N, N-디이소프로필클로로포스포아미디트 (640μL)가 첨가되었다. 1 내지 3 시간 저은 후에 부가적인 N, N-디이소포로필에틸아민(430μL)와 2-시아노에틸 N, N-디이소프로필클로로포스포아미디트 (250μL)가 첨가 되었다. 반응 혼합물은 디클로로메탄으로 3배 희석되고 같은 부피의 1M 트리에틸암모늄바이카바네이트 용액과 염수 용액으로 추출되고 나트륨 설페이트 무수물로 건조되었다. 생성물은 실리카겔위에서 정제되었고 그 구조는 NMR에 의해 확인되있다.

실시예 4

1-t-부틸디메틸시릴옥시-6-시아노-헥산(제 14도 화합물 X2)의 제조

디메틸설폭사이드에 용해된 나트륨 시아나이드(1.2g)이 90℃에서 30분간 가열되었다. 고체 1-t-부틸디메틸시릴옥시-6-브로모헥산(5.8g, 화합물 X1)이 상기에서 설명된 방법(참고문헌 37)에 의해서 제조된후 나트륨 시아나이드 용액에 첨가되었다. 120 내지 130℃에서 20 내지 180분동안 가열된후 반응혼합물이 얼음으로 차가워진 물에 부어지고 수용액층은 에테르로 추출되고 염수로 씻어지고 건조되어 농축된다. 생성물은 0.5 Torr , 107℃에서 증류되어 무색의 오일이 된다. C12 H24 ON Si을 위한 고 해상력 질량 분석기: 계산된 값 226.1627, 구해진 값 226.1624.

실시예 5

7-아미노-1-t-부틸디메틸시릴옥시-헵탄(화합물 X3, 제 14도)의 제조

에테르(50 mL)내의 리튬 알미늄 하이드라이드의 용액(600 mg, Aldrich)에 에테르(50 mL)내에 실시예 4의 생성물(3.8g)을 한 방울씩 첨가한다. 1 내지 3 시간후에, 혼합물이 물에 부어지고 30분동안 저어진다. 용해되지 않은 알루미늄 하이드록사이드는 Celite pad를 통하여 걸러지고, 수용액층은 에테르로 세번 추출된다. 에테르 추출물은 염수 용액으로 세척되고, 건조되어 농축된다. 초기 생성물은 0.25Torr, 82℃에서 증류된다, C13 H31 O N Si을 위한 고 해상력 질량 분석기: 계산된 값 245.2175, 구해진 값 245.2159.

실시예 6

(N-모노메톡시트리틸)-7-아미노-1-t-부틸디메틸시릴옥시-헵탄(화합물 X4, 제14도)의 제조

모노메톡시트리틸 클로라이드 (3.7 g, Aldrich)가 디클로로메탄(40 mL)내에 실시예 5의 생성물(2.3 g) 용액에 첨가된다. 상온에서 10 내지 24 시간 저어진 후용액은 나트륨 탄산수소염 포화 용액에 부어진다. 수용액층은 디클로로메탄으로 추출된다. 디클로로메탄 추출액은 염수용액으로 세척되고 건조된다. 용매는 증발되고 생성물은 실리카겔 크로마토그래피위에서 정제된다. 정제된 X4 화합물은 고 해상력질량 분석기에 의해 분석되었다. C33 H47 02 N Si: 계산된 값 517.3376, 구해진 값 517.3355.

실시예 7

N-모노메톡시트리틸-7-아미노헵탄올(화합물 X5, 제 14도)의 합성

테트라부틸암모늄 플로라이드 1 M 용액(25.8mL)이 테트라하이드로퓨란(46mL)내의 X4 화합물(4.3g)의 용액에 서서히 첨가되었다. 상온에서 4 내지 18시간동안 저은후, 용액이 100mL의 물에 부어지고 다시 30분동안 저어졌다. 유기층이 염수 용액으로 추출되고 건조되었다. 그런 다음 초기의 생성물이 실리카겔위에서 정제되었다. 정제된 생성물은 고 해상력 질량 분석기에 의해 분석되었다. C27 H33 O2 N: 계산된 값 403.2511, 구해진 값 403.2514.

실시예 8

N-모노메톡시트리틸-7-아미노헵틸(2-시아노에틸)-N, N-디에틸포스포아미디트(화합물 X6, 제 4도)의 제조

디옥산(10mL)내의 화합물 X5(240mL)의 용액에 디이소프로필에틸아민(840μL)과 2-시아노에틸-N, N-디이소프로필클로로포스포아디트(270μL)가 첨가되었다. 한시간 동안 저은 후에 반응 혼합물은 디클로로메탄으로 희석되고 트리에틸암모늄 탄산수소염 IM 용액으로 세척되고 최종적으로 염수 용액으로 세척된다. 건조되고 농축된후에 잔여물들은 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제된다. 생성물은 고 해상력 질량 분석기에 의해 분석되었다. C36 H50 N3 03 P: 계산된 값 603.3620, 구해진 값 603.3620. 생성물의 구조는 NMR에 의해 확인되었다.

실시예 9

숙신 라이보실리비톨-PEG(제 14도)의 제조

디클로로메탄내(18 mL)의 화합물 16(1.8 g)의 용액에 N-하이드록시벤조트리아졸(295 mg)과 디클로로헥실카보디이미드(450mg)이 첨가되었다. 반응 혼합물이 상온에서 저어진다. 2 내지 8 시간후에, 디클로로헥실우레아가 거름에 의해 제거되었다. 여과액, N-메틸이미다졸(522μL)와 디이소프로필에틸렌아민(600μL)가 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르, PEG (평균 분자량, 5000: 2.1g, Fluka)에 첨가되었다.혼합물은 아르곤하에서 상온에서 밤새도록 저어졌다. 기능이 부여된 PEG응 차가운 에테르로 침전되고 걸러졌다. 부하(loading) 능력은 가이트 등(Gait et al)의 방법(참고문헌 36)에 따라 분광측광법적으로(spectrophotometrically) 결정되고 약 200μmol/g인 것으로 밝혀졌다. 자유로운 여분의 하이드록시 기들은 디클로로메탄내에 20% 아세틱 무수물/피리딘 혼합물에 의해 상온에서 1 내지 3 시간동안 캡이 씌워졌다. 그런 다음, 지지물은 차가운 에테르로 침전화되고, 걸러지고 차가운 에테르로 세척되었다.

실시예 10

용해성-중합 지지물을 이용한 합성 PRP의 제조(제 13도)

1g의 PEG-PRP-DMT(실시예 9의 생성물)를 피리딘으로 두번 증발시키고 아르곤존재하에 아세토니트릴에 녹였다. PRP 올리고사카라이드는 네 단계의 사이클내에서길이가 길어지고, 각 단계전에는 부산물을 제거하기 위해서 기능화된 PEG를 차가운, 에테르로 침전시키고 디클로로메탄/에테르로부터 결정화(crystalization)시켰다. 합성의 첫번째 단계는 클로로포름/메탄올 산 내의 3% 톨루엔 술폰산을 이용하여 디메톡시트리틸기를 제거하는 공정을 포함하고, 그런 다음, 테트라졸 존재하에서 실시예 3으로부터의 라이보실리비톨 포스포아미디트 생성물과 커플링 된다(180분). 커플링 효율은 95% 였다. 산화(제 3단계)는 70%의 t-부틸 하이드록사이드 용액을 사용하여 행해졌다(120분), 그리고 최종적으로 디클로로메탄내의 20% 아세틱 무수물/피리딘을 사용하여 캡핑(capping)되었다(제 4단계)(60분). 합성의 사이클이 두번 행해지고, 실시예 8로부터의 스페이서 포스포아미디트 생성물과 커플링된다. 그런 다음 레진이 수용액성 농축 암모니아 테트라하이드로퓨란으로 50 내지 100℃에서 17 내지 24 시간동안 가열되었다. 혼합물은 PEG을 제거하기 위해서 걸러지고, 세척되고 용매는 증발되었다. 40 psi 에서 중간 압력 수소화 기구를 사용한, t-부틸 알코올/물/아세트산(4:3:1)내의 10% Pd/챠콜의 존재하에 생성물을 가수소분해 시키고 거르면 균일한 생성물이 얻어진다. 생성물은 얼림건조되고 0.01M 트리에틸암모늄 탄산수소염 pH 7안의 Sephadex G-25 칼럼에서 겔 거름과, 물을 사용한 Sephadex C-25 위에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 적당한 비율들의 얼림 건조에 의하여 NMR에 의해 그 구조가 분석된 고체 생성물이 얻어진다. 라이보실리비톨 포스페이트 삼합체의 스펙트럼은 후거하웃트 등(Hoogerhout et al.)에 의해 보고된 것(J. Carbohydr. Chem. 7, 399, 1988)과 유사하다는 것이 밝혀졌다.

실시예 11

m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드를 사용한 합성(PRP)₃의 수정 테 트라하이드로퓨란(1mL)내의 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드(20mg; 63.6μmol) 용액이 0.1 M 포스페이트 버퍼 용액 (1mL)내의 합성 (PRP)₃(5.2 mg; 4.3 μmol) 용액에 첨가되었다. 아르곤 존재하에 상온에서 30분동안 용액을 저은후에 반응 혼합물은 에테르(4 × 5mL)로 추출되고 결과적인 수용액층은 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 버퍼, pH 7.2로 평형화된 Sephadex G-25 (Pharmacia) 칼럼 (2 × 30 cm)에 적용되고, 같은 버퍼로 용출되었다. 용출액은 254 nm에서 분광측광법적으로 조사되었다. 첫번째 용출된 피크는 풀되고(pooled) 냉동건조 되었다. (PRP)₃내에 포함되는 말레이미드 기의 양은 수정된 엘만(Ellman)의 방법을 사용하여 결정되어 90%가 포함되는 것으로 밝혀졌다.

실시예 12

펩티드 합성

OMP P1, P2, P6(표 1에서 3)으로부터의 펩티드들이 제작자에 의해 설명된 바와 같이, ABI 430A 펩티드 합성기와 최적의 t-Boc chemistry를 사용하여 합성되고하이드로플로릭 산(HF)에 의해 레진으로부터 분리되었다. 펩티드들은 Vydac C4 반-제조적 칼럼(1 × 30cm)위에서 0.1% 트리플로릴 아세트산(TFA)내의 15% 내지 55%의아세트릴 그레디엔트을 사용한 역-상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 40분동안 2mL/분의 유속으로 정제되었다. 생화학적인 그리고 면역학적인 연구에 사용되는 합성 펩티드들(표 1에서 3)은 분석적 HPLC에 의해 95% 이상의 순수도를 가지는 것으로 판단되었다. Waters Pico-Tag 시스템위에서 행해진 아미노산 성분 분석들은 이론적인 성분들과 잘 일치하고 있다. 합성 MAP(OMP2-8)₈은 Tam et al에 의해 이미 설명된 방법(참고문헌 40)에 따라 t-Boc 고체-상 펩티드 합성 화학을 사용하여 수동적으로 제조되었다. PRP-접합 목적을 위해, 시스테인 잔기들이 펩티드의 N-말단과 C-말단에 첨가되었다. MAP펩티드는 이미 설명한 바와 같이 RP-HPLC에 의해 정제되었다.

실시예 13

완전한 합성 펩티드-(PRP)₃접합물들의 제조

각각의 합성 펩티드들 (OMP2-8)₈,1 내지 2 mg과 HIBP1-4가 0.5mL의 기체가 잘 제거된 물에 녹여지고, 기체가 잘 제거된 물안에 있는 0.8mL의 MBS-(PRP)₃(1.6mg)이 첨가되었다. 결과적 혼합물은 아르곤 존재하에 상온에서 밤새도록 저어졌다. 비용해성 침전은 원심분리에 의해 제거되고, 부유물은 과다한 MBS-(PRP)₃을 제거하기 위해서, 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 버퍼, pH 7.2로 평형화된 Sephadex G-50 칼럼 (2 × 30 cm)위의 겔 거름 크로마토그래피에 적용되었다. 함성 펩티드-(PRP)₃접합물들은 수집되어 역 상 HPLC, Orcinol 시험법, 아미노산 분석에 의해 분석되었다. PRP에 대한 펩티드의 비율은 약 1:1이고 HIBP1-4와 MAP 펩티드 접합물에서는 1:5이다. 그런 다음, 합성 펩티드-PRP 접합물들은 면역원성 분석을 위해 알럼(alum)위로 흡수되었다.

실시예 14

자연적인 PRP-BSA 접합물의 제조

자연적인 PRP를 수용액성 페리오딕 산(4)로 처리하여 얻어진, 0.5mL의 페리오데이트-산화된(periodate-oxidized) PRP(1mL의 0.1M 나트륨 포스페이트 버퍼, pH 6.0 내에 25mg)를 0.5mL의 0.2M 나트륨 포스페이트 버퍼 ,pH 8.0내의 소의 혈청 알부민(BSA)(1.32 mg;0.02 μmol)에 첨가하고, 나트륨시아노보로하이드라이드(14 μg;0.22μmol;BSA당 10 당량)를 첨가한다. 37℃에서 5일간 배양된후에, 반응 혼합물은 0.1M 포스페니트 버퍼(4 × 1 L), pH 7.5에 대하여 투석되고 결과적인 용액은 0.2 M 나트륨 포스페이트 버퍼, pH 7.2로 평형화된 분석적 수퍼로스 12 칼럼(15× 300 mm, Pharmacia) 위에 적용되고, 같은 버퍼로 용출된다. 부분들에 대해 230nm에서 흡광도가 조사되었다.. 주요한 피크는 풀되고Centriprep 30(Pierce)내에 2.2 ml로 집중되었다. 단백질의 양은 Bio Rad 단백질 검정을 사용하여 결정되었고 그 값은 300 μg/ml이다. PRP의 유도는 Orcinol 시험에 의해 확인 되었다.

실시예 15

항-펩티드 항-OMP 항혈청의 생산

토끼들, 쥐들(Balb/C)과 기니어피그들이 완벽한 프런드의 면역보강제안에 에멀션화된 자연적인 P1, P2, P6 또는 각 펩티드들(5 내지 100 μg)로 근육내에 면역화(im)되고, 2 주 간격으로 두번 더 주입(불완전한 프런드의 면역보강제안에 같은 면역원의 절반의 양)하였다. 항혈청들은 수집되고 이미 설명한 바와 같이 저장되었다.

실시예 16

항-PRP 항혈청의 생산

토끼들이 1mL당 3mg AlPO₄와 혼합된 각 PRP-캐리어 접합물 (5 내지 50 μg PRP 당량)로 근육내로 면역화되고, 첫번째 면역화후에 매 2 주 간격으로 두번 더 주입(같은 면역원의 절반의 양)하고 30분동안 56℃에서 가열-배양하고 -20℃에서 저장되었다.

실시예 17

P1-, P2-, P6-와 펩티드-특이성 ELISA들

마이크로타이터 플레이트 웰들(Nunc-Immunoplate, Nunc, Denmark)이 200ng의 정제된 OMP들이나 5OμL의 코팅 버퍼(15mM Na₂CO₃, 35mM NaHCO₃, pH 9.6)내의 500ng의 각 펩티드들로 상온에서 16 시간동안 코팅되었다. 플레이트들은 포스페이트 버퍼 식염수(PBS)내의 0.1% ( w/v) BSA로 상온에서 30분동안 차단되었다. 연속적으로 희석된 항혈청들이 웰들에 첨가되고 상온에서 1 시간동안 배양되었다. 항혈청을 제거한 후에, 플레이트들은 0.1% (w/v) Tween-20과 0.1% (w/v) BSA를 가진 PBS로 다섯 번 세척되었다.서양고추냉이 퍼옥시다아제(Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA)와 접합된 염소의 항-토끼, 기니어피그, 쥐, 또는 사람 IgG 항체들로부터의 F(ab')₂가 세척 버퍼로 희석되고(1/8000) 마이크로타이터 플레이트들위에 첨가되었다. 상온에서 1 시간동안 배양한 후에, 플레이트들을 세척 버퍼로 다섯번 세척하였다. 플레이트들은 H₂O₂내의 테트라메틸벤지딘 (TMB)(ADI, Toroto)을 기질로 사용하여 전개되었다. 반응은 1N H₂SO₄로 중지되고 광학밀도가 Titretek Multiskan II (Flow Labs. Virginia)를 사용하여 450nm에서 측정되었다. 두개의 관련이 없는 백일해 독소 펩티드들 NAD-S1 (19 잔기들)과 S3 (123-154)(32잔기들)가 펩티드-특이성 ELISAs에서 부제어들로 포함되었다. 검정들은 삼중으로 행해졌고 항혈청의 반응량은 얻어진 선-면역 혈청들에 대한 O.D.값이 일관적으로 두배 증가된 희석으로 정의되었다.

실시예 18

항-PRP 항체 측정

마이크로타이터 플레이트 웰들 (Nunc-Immunoplate, Nunc, Denmark)이 200μL의 코팅 버퍼(15mM Na₂CO₃, 35mL NaHCO₃, pH 9.6)내의 2OO ng의 정제된 PRP-BSA로 상온에서 16 시간동안 코팅되었다. 플레이트들은 포스페이트 버퍼 식염수(PBS)내의 0.1% ( w/v) BSA로 상온에서 30분동안 차단되었다. 연속적으로 희석된 PRP-캐리어접합물들에 대한 항혈청들에 웰들에 첨가되고 상온에서 1 시간동안 배양되었다. 항혈청을 제거한 후에, 플레이트들은 0.1% (w/v) Tween-20과 0.1% (w/v) BSA를 가진 PBS로 다섯번 세척되었다.서양고추냉이 퍼옥시다아제(Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA)와 접합된 염소의 항-토끼 IgG 항체들로부터의 F(ab')₂가 세척 버퍼로 희석되고(1/8000) 마이크로타이터 플레이트들위에 첨가되었다. 상온에서 1 시간동안 배양한 후에, 플레이트들을 세척 버퍼로 다섯번 세척하였다. 플레이트들은 H₂O₂내의 테트라메틸벤지딘 (TMB) (ADI, Toroto)을 기질로 사용하여 전개되었다. 반응은 1N H₂SO₄로 중지되고 광학밀도가 Titretek Multiskan II (Flow Labs., Virginia)를 사용하여 450nm에서 측정되었다. 표준 항-PRP 항혈청이 정제어로 포함되었다. 검정들은 삼중으로 행해졌고 항혈청의 반응량은 얻어진 선-면역 혈청들에 대한 O.D.값이일관적으로 두배 증가된 희석으로 정의되었다.

실시예 19

합성 T-세포 에피토프들의 증식 검정

T-세포 에피토프 맵핑이 프라이밍 Balb/c, C57B1/6, A/J 쥐에 의해 5μg의 개개의 OMP들(P1, P2, P6)을 가지고 행해졌다. 3 주후에, 지라들이 제거되고 10%가열-비활성화된 태아 송아지 혈청 (Gibco), 2 Mm L-글루타민 (Flow Lab), 100U/mL 페니실린 (Flow Lab), 100 μg/mL, 스트렙토마이신 (Flow Lab), 10단위/mL rIL-2, 50 μM 2-머캅토에탄올 (sigma)이 보충된 RPMI 1640(Flow Lab) 내에서 비장세포들이 5 내지 7일동안 배양되었다. OMP 펩티드들의 패널에 대한 프라임된 비장세포들의 증식 반응들이 표준 생체외의 검정에서 결정되었다(참고문헌 41). 간결하게 말하면, 10⁶비장세포들이 96-웰 마이크로타이터 플레이트내에서 증가하는 몰 농도(IL-2가 없는 배양 매개물에 녹아있는 0.03 내지 3μM의 펩티드) 존재하에 항원제시 세포(APC)들로 사용된 5×10⁵빛이 쪼인 (1700 Rad) 신선한 공통유전자의 비장 세포들과 함께 배양되었다. 배양물들은 37℃의 습도조절된 5% CO₂/공기 인큐베이터에 40 시간동안 유지되었다. 배양의 최후 16 시간 동안, 0.5 μCi의 [³H]-Tdr (5 Ci/mmol, NEN)이 각 웰들에 첨가되었다. 그런 다음 세포들은 유리 섬유 거름들위에서 수확되고,³H-티미딘의 세포 DNA내의 합체는 섬광 β-카운터(Beckman)내에서 측정되었다. 결과들은 각 펩티드 농도에 대해 행해진 삼중 결정의 평균으로 표현되었다. 표준 편차는 항상 15% 미만이있다. 증식 반응들은³H-티미딘 합체가 관련니 없는 펩티드들이나 배양 매개물로 얻어진 값보다 3 배 이상일때 양성인 것으로 여겨졌다.

실시예 20

이뮤노블랏 분석

펩티드와 PRP-캐리어 접합물들에 대해 길러진 항혈청들의 면역특이성이 이미설명한 이뮤노블랏 분석에 의해 결정되었다(참고문헌 42)

참고문헌들

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발명이 이루고자 하는 기술적 과제 누락

제 1도는 여기서 보고된 합성 PRP-펩티드 접합물들에 사용된 펩티드 캐리어의 아미노산 서열들을 보여준다. 이 도면에 대하여, 거기에서 인지된 합성 펩티드들은 다음과 같은 서열

펩티드 서열번호:

HIBP1-4 51

CHIBP1-4 52

COMP2-8 53

MAP(COMP2-8) 54

CP6-6 55

PZ4EC 56

제 2a 및 2b도는 통상의 구조 분석 알고리즘에 의한 OMP P1의 예상되는 구조이다. 소수성 도면들은 호프(Hopp)에 의해 예측된 것이다(참고문헌 30). 이 값들은헤파펩티드 윈도우들의 평균으로부터 얻어지고 각 부분의 중간에 나타내어졌다.

제 3a, 3b도와 제 4도는 각각 통상의 구조 분석 알고리즘에 의한 OMP P2와 P6의 예상되는 구조이다. 위쪽의 패널은 쵸우와 파스만(Chou & Fasman)에 따른(참고문헌 29) α-헬릭스와 β-턴 포텐셜의 부분 평균의 2차 구조 분석이다. 아래쪽패널은 호프와 우즈(Hopp & Woods)에 의해 예측된(참고문헌 30) 소수성 도표들이다. 이 값들은 헤파펩티드 윈도우들의 평균으로부터 얻어지고 각 부분의 중간에 나타내어졌다.

제 5도는 Hib OMP P1의 면역우성의 B-와 T-세포 에피토프들의 도식적인 표시를 포함한다.

제 6도는 Hib OMP P2의 면역우성의 B-와 T-세포 에피토프들의 도식적인 표시를 포함한다.

제 7도는 Hib OMP P6의 면역우성의 B-와 T-세포 에피토프들의 도식적인 표시를 포함한다.

제 8a, 8b, 8c도는 기니어피그, 쥐, 토끼의 항-P6 항혈청과 P6 펩티드들 ELISA 반응성을 보여주는 것이다.

제 9도는 세개의 사람의 회복기의 혈청들과 P1 펩티드들 ELISA 반응성을 보여주는 것이다.

제 10도는 세개의 사람의 회복기의 힐청들과 P2 펩티드들 ELISA 반응성을 보여주는 것이다.

제 11a, 11b, 11c도는 P1-특이성 쥐의 면역우성의 T-세포 에피토프들을 가진P1 펩티드들에 대한 T-세포 라인들의 증식 반응을 나타내는 것이다.

제 12a, 12b, 12c도는 P2-특이성 쥐의 면역우성의 T-세포 에피토프들을 가진 P2 펩티드들에 대한 T-세포 라인들의 증식 반응을 나타내는 것이다.

제 13a, 13b도는 PEG를 고체 지지물로 사용한 PRP 합성의 풀로우차트를 포함한다.

제 14a, 14b, 14c도는 PRP 중간 생성물 합성의 플로우차트를 포함한다. Bz,벤질; Ac, 아세틸; ETS, 에틸치오; Me, 메틸; Allyl, 아릴; DMT, 4, 4'-디메톡실트리틸; NCE, 시아노에틸; MNT, 4-메톡시트리틸;

제 15도는 파상풍톡소이드에 접합된 합성 PRP 이합체와 삼합체에 대한 토끼의 면역 반응을 보여주는 것이다.

제 16도는 다른 타입의 PRP-캐리어 접합물에 대한 토끼의 면역 반응을 보여주는 것이다.

제 17도는 HibP1-4와 OMP의 MAP에 접합된 다른 타입의 합성 오합체와 육합체에 대한 토끼의 면역 반응을 보여주는 것이다.

발명의 구성 및 작용 누락

발명의 효과 누락

Claims (9)

1. 올리고머를 제조하는 공정에 있어서,

   다음 화학식:

   의 화합물의 커플링단계로서, 상기에서 고체 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(PEG)지지물에 대해 R₁은 제 1보호기이고 R₂는 제 2보호기인 단계,

   상기 제 1보호기를 제거하는 단계,

   결과적인 화합물과 다음 화학식:

   을 가지는 사슬연장을 위한 반복 단위와의 커플링단계,

   인 원자들로부터 보호기를 제거하는 단계,

   올리고머에 원하는 수의 반복단위가 회합될때까지 상기 제 1보호기를 제거하고 상기 반복단위와 커플링하는 상기 단계들을 반복하는 단계,

   다음 화학식:

   의 사슬종결분자로 상기 올리고머를 종결하는 단계로서, 상기에서 m은 정수이고 R₃는 PEG-결합 보호된 올리고머를 생성하는 제 3보호기인 단계를 포함하는 올리고머의 제조공정.
2. 제 1항에 있어서, 상기 PEG-결합 보호된 올리고머가 상기의 지지물로부터 분리되어 다음:

   화학식의 화합물을 제공하며, 상기에서 n은 정수이고 X'는 카운터 이온이며,제 2보호기와 제 3보호기를 제거하는 것을 특징으로 하는 공정.
3. 제 2항에 있어서, 상기의 n이 3 내지 20이고 m이 4 내지 6인 공정.
4. 제 3항에 있어서, 상기 R₂가 벤질이고 R₁이 디메톡시트리틸이고 R₃가 모노메톡시트리틸인 것임을 특징으로 하는 공정.
5. 제 4항에 있어서, 상기 카운터 이온이 암모늄인 것임을 특징으로 하는 공정.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 결과적인 올리고머가 다음 화학식:

   의 화학적 반응성 있는 작용기를 포함하는 합성 PRP올리고머로 전환하는 것을 포함하며, 상기에서 R은 연결조각인 공정.
7. 제 6항에 있어서, 상기의 연결조각이 화학식 -CH₂(CH₂)_m-X을 가지며, 상기에서 m은 정수이고 X는 화학적 반응성 있는 작용기, 아미노 반응기, 또는 광활성 가능한 기인 공정.
8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 부하용량이 약 200 내지 500μmol/지지물(g)을 가지는 공정.
9. 다음 화학식:

   을 가지며, 상기에서 R₂와 R₃는 보호기이고 m은 정수인, 고체 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(PEG)-결합된 보호된 폴리사카라이드.