KR20010033494A - 백신용도이거나 복합백신으로서 단백질에 결합되는 세균성캡슐형 폴리사카라이드의 추출 및 분리방법 - Google Patents
백신용도이거나 복합백신으로서 단백질에 결합되는 세균성캡슐형 폴리사카라이드의 추출 및 분리방법 Download PDFInfo
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Abstract
염기 추출법을 이용하여 배양 상층액과 그람음성 및 그람양성 세균 세포로부터 대량의 캡슐형 폴리사카라이드(CPS)를 분리하는 방법이 개시되어있다. 이 과정은 간단하고, 빠르고, 재현가능하며 다양한 세균종에 응용할 수 있다. 이 방법으로 외부 펩티도글라이칸에 공유결합이 없는 새로운 CPS를 수득할 수 있다. 본 발명의 과정에서 수득된 CPS를 사용하여 세균감염에 대해 면역화하는 방법과 백신도 개시되어 있다.
Description
연쇄상구균, 스타필로코코스, 엔터로코코스, 바실러스, 코리네박테리움, 리스테리아, 에리시펠로스릭스, 클로스트리디움과 같은 그람 양성 세균과 해모필러스, 시젤라, 비브리오 콜레라, 네이서리아에 의해 야기된 세균 감염과 특정 대장균은 전세계에 걸쳐 질병을 일으킨다. 항생제에 대한 세균의 저항성의 출현과 함께 이러한 사실은 세균성 백신을 개발할 필요를 제시한다. 예를 들어, 연쇄상구균는 항원성과 세포벽 폴리사카라이드(26,27)의 구조에 근거하여 여러 집단으로 분류되는 그람 양성 세균의 크고 다양한 속이다. 이러한 집단중의 두가지는 심각한 인간의 질병과 관련된다. 집단 A 연쇄상구균는 "스트렙 스로트", 류마티스성 열, 연쇄상구균성 농가진, 패혈증 등을 포함하여 다양한 감염성 질병을 유발한다.
집단 B 연쇄상구균는 1970년 초에 의학 교과서에서 인간의 병원체로 알려지기 시작했다. 그 시기 이후로, 집단 B 연쇄상구균는 미국과 개발 도상국에서 중요한 분만 시의 병원체임이 알려졌다(37). 초기 두 달 동안의 집단 B 연쇄상구균 전신 감염은 1000명 중 3명의 출생에 영향을 주어서(12) 미국에서 연간 11,000건이 발생한다. 이러한 감염은 선천성 뇌염, 패혈증, 수막염의 증상을 일으킨다. 수많은 이러한 유아가 죽거나 영구 신경성 속발증의 증상을 보인다. 게다가, 집단 B 연쇄상구균성 감염은 연간 50,000명의 여자에게 발생하는 임신과 관련된 사망율에 관련되어 있다. 집단 B 연쇄상구균 감염으로 위험한 다른 사람들은 선천적으로, 화학요법적으로 또는 다른 수단에 의해 면역 반응이 변화된 사람들이다.
집단 B 연쇄상구균는 세균의 캡슐형 폴리사카라이드에 근거하여 여러 다른 형태로 더 분류될 수 있다. Ⅰa, Ⅰb, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ 형은 집단 B 감염에 따른 병원성의 대부분을 이루고, 집단 B 연쇄상구균 Ⅰa, Ⅰb, Ⅱ, Ⅲ, Ⅴ는 보고된 경우의 90 %를 나타낸다. 각각의 다양한 형태의 폴리사카라이드의 구조의 특성이 규명되었다(19-22, 44). 사람의 세균성 병원균을 가지고 발견한 것과 비슷하게 백신에 사용되었을 때 집단 B 연쇄상구균의 캡슐형 폴리사카라이드는 이러한 세균의 감염에 대항해 효과적으로 보호한다(참조: 4, 6, 24, 29, 30, 42, 43, 45)
그람 음성 세균도 중요한 병의 원인이다. 해모필러스 인플루엔자 타입 b 세균(Hib)에 대항한 폴리사카라이드-단백질 백신을 최근에 발전시키고 사용하기까지, Hib 세균 감염으로 유아의 정신적 퇴보가 발생한다. N. menigitidis 와 대장균 K1 감염으로 신출생 수막염이 발생한다. 그람 음성 세균, 대장균의 균주은 대장균으로 감염된 고기를 먹어서 사망한 것을 포함하여 심각한 병과 관련된다.
캡슐형 폴리사카라이드 백신과 캡슐형 폴리사카라이드 복합백신을 대량 생산하기 위해서는 정제된 캡슐형 폴리사카라이드의 적절한 공급이 필요하다. 세균 세포로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 분리하는 선행 기술의 방법에서는 세포를 효소 뮤타노라이신으로 처리한다. 뮤타노라이신은 세포구성분을 방출하는 세포벽을 분열시킨다. 이 과정은 세포 라이세이트를 추가적인 효소로 처리하여 단백질과 핵산을 제거하고 우선침전법과 크로마토그래피로 분리하는 것이다. 정제된 캡슐형 폴리사카라이드을 수득하기 위한 더 효과적이고 고수율 및 단순한 방법이 바람직하다.
본 발명은 그람 음성과 그람 양성 세균의 세포구성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드(CPS)를 추출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 세균 상층액이나 세균 세포로부터, CPS와 다른 세포 성분을 연결하는 염기 같은 결합을 가수분해하여 CPS를 추출할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 추출 공정의 장점은 추출된 CPS가 온전하다는 점이다.
본 발명의 다른 실시예는 다른 세포구성분으로부터 CPS의 분리를 촉진하기 위해서 염기 추출동안 CPS의 N-아세틸기를 탈아세틸화 반응하여 정제된 캡슐형 폴리사카라이드를 수득하는 방법을 제공한다. 본래의 폴리사카라이드로서 N-아세틸기에 관해서 같은 반복 단위 구조를 가지는 정제된 CPS를 제공하기 위해서 일정량의 아세틸기를 재도입할 수 있거나 변형된 알킬기로 아실레이션은 변형된 CPS를 수득하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, CPS는 그룹 B 연쇄상구균로부터 추출될 수 있다. 가장 바람직한 실시예에서, CPS는 GBS 형 Ⅰa, Ⅰb, Ⅱ, Ⅲ, Ⅴ, Ⅷ으로부터 추출된다.
다른 바람직한 실시예에서, CPS는 S. 뉴모니아에서 분리된다. 가장 바람직한 실시예에서, CPS는 S. 뉴모니아 형 Ⅲ, Ⅳ, ⅩⅣ에서 추출된다.
다른 바람직한 실시예에서, CPS는 네이세리아 또는 대장균으로부터 추출된다. 가장 바람직한 실시예에서, CPS는 네이세리아 메닝지티디스 형 B, C, Y 또는 W135 또는 대장균 K1로부터 분리된다.
세균 상층액 또는 세균 세포로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 정제하는 것은 다른 방법에 비해 다음의 잇점을 갖는다: (a) 단순성(최소의 단계), (b) 효율성(고수확과 고순도), (c) 안전성(가연성 유기 용매의 사용을 감소 또는 제거), (d) 모든 그람 음성, 그람 양성 세균에 일반적인 응용성.
본 발명에 따른 방법은 농축된 추출물 및/또는 분리된 세균 세포를 염기 용액으로 처리하는 것을 포함한다. CPS를 추출하는 것뿐만 아니라, 염기 추출은 N-아세틸기의 탈아세틸화 반응을 일으킨다. 탈아세틸화 반응의 크기는 반응 조건을 조정하면 변화될 수 있다. 크로마토그래피 분리로 CPS를 바람직하게 수득하기 위해서 추출된 CPS는 세포 성분으로부터 분리될 수 있다. 아세틸기의 일부 또는 대부분은 CPS나 변형된 CPS를 수득하기 위해서 재도입된다. CPS의 마지막 정제는 젤투과 크로마토그래피에 의해 달성된다. 또다른 실시예에서, 본 발명은 백신이나 복합백신으로 사용하기에 적합한 것으로서, 염기성 추출 조건에서 수득한 신규하고 선택적으로 변형된 CPS를 제공한다.
본 발명의 한 실시예에서는 포유동물 내에서 살균성 및 감염에 대해 동물을 보호하는 항체의 생성을 유도할 수 있는 순수한 CPS를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또다른 실시예는 CPS가 분리된 세균의 균주에 의한 감염에 대해 인간이나 동물을 보호하기 위해서 백신에 상기 CPS를 단독 또는 폴리펩티드에 결합된 상태로 이용하는 것이다. 특별한 경우, 본 발명에 사용된 폴리사카라이드는 다른 병원성 세균과 교차반응성인 항체의 생산을 유도하여 다른 세균에 의한 감염에 대해 보호하는 것이다.
본 발명의 목적은 그람 음성 혹은 그람 양성 세균 상층액이나 그람 음성 혹은 그람 양성 세균 세포에 저장된 그람 음성 및 그람 양성 세포 성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 캡슐형 폴리사카라이드는 백신으로 사용되거나 폴리펩타이드에 결합되어 백신으로 사용되는 결합 분자를 형성한다.
본 발명은 그람 음성, 그람 양성 세균으로부터 캡슐형 폴리사카라이드(CPS)를 추출하고 분리하는 방법에 관한 것이다. 추출된 폴리사카라이드는 폴리사카라이드 단독 또는 단백질에 결합된 폴리사카라이드를 포함하는 백신을 생산하는 데 유용하다.
도 1은 50℃에서 D20에 기록된 집단 B 연쇄상구균 타입 Ia으로부터 수득한 캡슐형 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼(500 MHz),
도 2는 50℃에서 D20에 기록된 집단 B 연쇄상구균 타입 Ib으로부터 수득한 캡슐형 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼(500 MHz),
도 3은 50℃에서 D20에 기록된 집단 B 연쇄상구균 타입 Ⅱ으로부터 수득한 캡슐형 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼(500 MHz),
도 4는 50℃에서 D20에 기록된 집단 B 연쇄상구균 타입 Ⅲ으로부터 수득한 캡슐형 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼(500 MHz),
도 5는 50℃에서 D20에 기록된 집단 B 연쇄상구균 타입 Ⅴ으로부터 수득한 캡슐형 폴리사카라이드의 NMR 스펙트럼(500 MHz),
도 6는 GBSPⅠa-HSA 코트된 플레이트에서 토끼 항GBSPⅠa 항혈청의 억제력을 도시하는 그래프이고,
도 7는 GBSPⅠb-HSA 코트된 플레이트에서 토끼 항GBSPⅠb 항혈청의 억제력을 도시하는 그래프이고,
도 8는 GBSPⅡ-HSA 코트된 플레이트에서 토끼 항GBSPⅡ 항혈청의 억제력을 도시하는 그래프이고,
도 9는 GBSPⅢ-HSA 코트된 플레이트에서 토끼 항GBSPⅢ 항혈청의 억제력을 도시하는 그래프이고,
도 10는 GBSPⅤ-HSA 코트된 플레이트에서 토끼 항GBSPⅤ-TT 항혈청의 억제력을 도시하는 그래프이고,
도 11는 집단 서브캡슐형 항원(폴리램노즈) 및 캡슐형 폴리사카라이드와 함께 펩티도글라이칸을 도시한 GBS 구조 배열체(Michon et al., Biochemistry 1988, 27:5341-5351). X와 Y는 각각 N-아세틸글루코사민과 N-아세틸뮤라믹산의 잔여물을 나타낸다. 백색 화살표는 캡슐형 폴리사카라이드와 폴리램노즈를 펩티도글라이칸에 결합시키는 포스포디에스테르 결합띠의 가수분해에 의한 리소자임(A), 뮤타노라이신 (B), 리소스타핀(C) 또는 염기 등의 예상되는 분할위치를 나타낸다
도 12는 집단 서브캡슐형 항원(폴리램노즈) 및 캡슐형 폴리사카라이드와 함께 펩티도글라이칸을 도시한 GBS 구조 배열체(Michon et al., Biochemistry 1988, 27:5341-5351). X와 Y는 각각 N-아세틸글루코사민과 N-아세틸뮤라믹산의 잔여물을 나타낸다. 백색화살표는 캡슐형 폴리사카라이드를 펩티도글라이칸에 결합시키는 포스포디에스테르 결합띠의 가수분해 혹은 폴리램노즈를 펩티도글라이칸에 결합시키는 포스포디에스테르 결합띠의 가수분해에 의한 리소자임(A), 뮤타노라이신(B), 리소스타핀(C) 또는 염기 등의 예상되는 분할위치를 나타낸다.
본 발명은 CPS를 세포 성분에 부착시키는 염기-불안정 결합띠의 염기성 가수분해에 의해 그람 음성과 그람 양성 세균으로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 세균 또는 세균 단편을 포함하는 용액과 염기를 접촉시켜 그람 양성, 그람 음성 세균으로부터 CPS를 추출하는 것을 포함한다. CPS는 다양한 방법으로 염기로부터 회수된다. 본 발명에 따른 그람 양성 세균의 예는 연쇄상구균, 스타필로코코스, 엔터로코코스, 바실러스, 코리테박테리움, 리스테리아, 에리시펠로스릭스와 클로스트리디움 등이다. 특별히, 연쇄상구균의 사용은 바람직하고 집단 B 연쇄상구균 형 Ⅰa, Ⅰb, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명에서 사용중인 그람 음성 세균의 예는 해모필러스 인플루엔자, 네이세리아 메닝지티스, 대장균을 포함한다. 특별히, 해모필러스 인플루엔자 타입 b, 네이세리아 메닝지티스 타입 B,C,Y, W135, 대장균 K1이 더 바람직하다.
본 발명에 따르면 수용성 또는 유기 용매에서 염기성 결합을 가수분해하기 위해 다양한 조건이 사용될 수 있다. 탄수화물의 N-아세틸 결합이 가수분해되는 정도는 반응 조건에 의해 조정될 수 있다. 나머지 세포 성분에 비해서 N-아세틸 결합이 분해되는 정도가 더 클수록 CPS는 더 친수성으로 되기 때문에 N-아세틸기의 가수분해는 CPS를 다른 세포 성분으로부터 분리하는 데 이롭다. 극성의 차이는 효과적인 크로마토그래프 분리에 영향을 준다. 극성의 차이에 근거한 혼합물의 두가지 이상의 조성분의 분리는 당업자에게 잘 알려져 있다.
예를 들어, 소수성-상호작용 크로마토그래피를 사용하면 상대적으로 소수성이 큰 화합물은 친수성이 큰 화합물보다 칼럼에 더 오래동안 머무른다. 반대로, 친수성-상호작용 크로마토그래피를 사용하면 친수성이 큰 화합물이 소수성인 화합물보다 칼럼에 더 오래동안 머무른다. 두가지 방법을 사용하면 관심의 대상인 화합물에 상대적으로 덜 극성이고 더 극성인 불순물을 제거할 수 있다.
대안적으로, CPS에 존재하는 유리 아미노기나 카르복시기는 효과적인 크로마토그래피 분리를 촉진하는 데 사용될 수 있다. 전하의 차이에 근거한 혼합물의 두가지 이상의 조성물을 분리하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 양이온 치환 크로마토그래피를 사용하면, 프로톤화된 아민과 같은 양성으로 전하된 기를 포함하는 화합물은 전하가 없어서 칼럼을 상대적으로 빨리 통과하는 화합물보다 칼럼에 오래 머무른다. 반대로, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하면 카르복시산과 같은 음성으로 전하된 화합물은 칼럼에 유지되고 반면에 전하가 없는 화합물은 칼럼을 상대적으로 빠르게 통과한다.
다른 세포 성분으로부터 탈아세틸화된 CPS를 분리한 후에, 유리 아미노기를 다시 아세틸레이트될 수 있다. 아세틸화 반응시약과 반응조건을 변화시켜서 실험자가 아미노기가 다시 아세틸화 반응정도를 조정할 수 있다. 아실화 반응 단계에 도입된 불순물은 다시 아실화 반응한 CPS와 비교해서 크기가 작기 때문에 젤투과 크로마토그래피로 CPS로부터 분리할 수 있다.
예를 들어, 젤 투과 크로마토그래피는 상대적으로 큰 CPS를 효과적으로 분리할 수 있다. 대안적으로, CPS를 남아 있는 불순물로부터 정제하기 위해서 극성이나 전하의 차이가 사용될 수 있다.
A. 캡슐형 폴리사카라이드의 준비
본 발명에 의햐면 세포 성분으로부터 세균성 폴리사카라이드를 분리하고 정제하는 것은 네 단계로 달성될 수 있다: 염기 추출, 크로마토그래피 분리, N-아실레이션, 크로마토그래피 정제.
1. 출발 물질
균질화된 세균 세포나 조정된 배지로부터 농축된 세균 상층액으로부터 CPS를 추출하기 위한 물질을 수득할 수 있다. 세포는 원심분리기나 마이크로필트레이션과 농축된 상층물에 의해 10-15배 분리된다. 바람직하게 세균 상층액과 조정된 배지는 농축되어서 CPS는 5-20 mg/mg의 농도로 존재한다. 추가적으로, 펠릿된 세포는 직접 추출될 수 있다.
2. 염기 추출
농축된 세균 상층액이나 조정된 배지는 CPS를 추출하기 위해서 다양한 염기와 접할 수 있다. 대안적으로, 분리된 세균 세포는 CPS를 추출하기 위해서 다양한 염기와 더 접할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 염기의 비제한적인 예는 NaOH, KOH, LiOH, NaHCO3, Na2CO3, K2CO3, KCN, Et3N, NH3, H2N2H2, NaH, NaOMe, NaOEt 또는 KOtBU 등이 있다. NaOH, KOH, LiOH, NaH, NaOMe 또는 KOtBU는 0.5 N-5.0 N의 범위에서 가장 효과적으로 사용된다. NaHCO3, Na2CO3, K2CO3, KCN 과 같은 염기는 용해도 한계만큼 높은 농도에서 사용될 수 있다. Et3N과 같은 유기 염기도 가수분해에 영향을 주는 물이나 알콜과 같은 매체가 있으면 (50-100%) 의 높은 농도까지 배지에서 사용될 수 있다. NH3또는 H2N2H2와 같은 염기도 100%를 포함하여 모든 농도에서 사용될 수 있다. 물, 알콜(바람직하게 C1-C4), 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아마이드 또는 이것들의 혼합물과 다른 유기용매가 사용될 수 있다. 물을 포함하는 염기 추출 용액이 가장 바람직하다.
세포 성분으로부터 CPS를 추출하는 가장 효과적인 pH 범위는 9에서 14까지이며 적정 pH는 약 12이다. 추출은 약 4℃부터의 온도에서 할 수 있지만, 40에서 100 ℃ 사이로 온도를 올리거나 반응 혼합물을 교반시키면 수확량이 증가한다. 약 1-20 g의 세포 페이스트를 약 1 리터의 염기 시약에 사용하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 농축된 상층액은 10N NaOH로 반응 혼합물에서 2N NaOH의 최종농도까지 희석된다.
3. 크로마토그래피적 분리
염기 추출 시료에 존재하는 추출 CPS는 크로마토그래피에 의해서 세포구성분으로부터 생기는 불순물로부터 분리될 수 있다. 크로마토그래피 분리 방법의 제한 없는 예로는 이온 교환(양이온 또는 음이온), 친수성 상호작용, 소수성 상호작용 또는 젤투과 크로마토그래피 등이 있다. 바람직한 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)이다. 더 바람직한 방법은 페닐 세파로스 위에서 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 방법으로 염기 추출물로부터 고분자량의 uv에 활성인 오염물질을 제거하는 방법이다. 캡슐형 폴리사카라이드는 고 pH의 초기(pH 10에서 pH 8), 고염(2N에서 1N) 용출에서 용출할 것이고 반면에 더 소수성인 단백질과 핵산이 수득될 것이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법의 제한없는 예는 바람직한 수지가 존재하고 페닐 세파로스 HP를 가진 알킬 아가로스 또는 세파로스 수지이다(파마시아 바이오테크; 피스카타웨이, NJ). 칼럼은 0.5-5.0 N NaHCO3로 예비적으로 균형을 맞출 수 있고, 흐름 비율 0.5-50 ml/mim로 칼럼 부피로 용출될 수 있다. NaHCO3의 한 칼럼 부피로 용출한 후, 1에서 10 칼럼 부피의 물을 컬럼을 용출시키는 데 사용할 수 있다. 단편은 당업자에게 알려진 수단에 의해서 폴리사카라이드에 대해 검사될 수 있다. 시알릭산을 포함하는 폴리사카라이드의 검출의 바람직한 방법은 실시예에 묘사된 마이크로스케일 오시놀 에세이이다.
4. N-아세틸화 반응
염기성 조건에서 추출된 캡슐형 폴리사카라이드의 분리는 시알릭산과 염기에 안정한 캡슐형 폴리사카라이드의 아미노당류 잔여체로부터 N-아세틸기를 추출하는 동안 제거하는 것이 도움이 된다.
선택적으로 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 HIC 부분은 다양한 아세틸화 반응 시료를 사용하여 바람직한 정도까지 다시 아세틸레이트된다. 아세틸화 반응 약품의 제한없는 예로는 아세틱 안하이드리드, 아세틸 클로라이드, 펜타플루오로페닐 아세테이트, 4-니트로페닐 아세테이트 등이 있다(참조: Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntheses, 2nd Ed. (1991). 바람직한 방법은 캡슐형 폴리사카라이드의 유리 아미노기를 다시 아세틸레이트하기 위해서 0.5 M에서 2M의 농도에서, 바람직하게는 0.7 M 에서 1M의 농도로 아세틱 안하이드리드와 섞어서 원래의 폴리사카라이드 구조를 재생시킨다.
5. 크로마토그래피 정제
항원과 백신과 같은 면역학적 시료를 준비할 때 사용되는 CPS를 생산하기 위해서 다시 아세틸레이트된 CPS를 수행할 수 있다. 크로마토그래피 정제의 다양한 예가 본 발명의 사용에 적절하다. 예를 들어, 이온 교환(양이온 또는 음이온), 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 또는 젤 투과 크로마토그래피가 반응 조성물로부터 다시 아세틸레이트된 CPS를 분리하는 데 영향을 줄 수 있다. 바람직한 방법은 슈퍼덱스(상호 연결된 아가로스와 덱스트란)에서 잔여 오염물을 제거하고 정제된 CPS를 수용할 수 있는 젤투과 크로마토그래피를 사용하는 것이다. 특별히 바람직한 예는 덱스트란에 대한 단편 범위(MW)가 1,000-100,000인 슈퍼덱스 200 PG이다. PBS를 용출제로 사용하면 용출 속도는 0.1에서 10 ml/mim이다.
본 발명의 염기 용출 방법에 의해 생산되는 캡슐형 폴리사카라이드는 신규하고(참조 도 11과 12) 원래 구조에서 특이항원결정부위를 유지할 수 있다(도 5-10). 따라서, 본 발명에 따라 제조된 CPS는 원래 CPS와 교차 반응성인 항체와 이들을 발현하는 세균의 생산을 유발한다. 본 발명에 따른 방법에 의해서 CPS를 수득하는 것은 (a) 본 발명이 수행되는 방법의 상대적인 용이성, (b) 분리의 증가된 수득 (c) 접합에 대한 증가된 수득이라는 점에서 선행 기술의 방법보다 우월하다. 게다가, 세균성 DNA와 RNA는 염기성 추출 단계에서 분해되고 본 발명에 따라 생산된 최종 산물에서 상당한 양으로 존재하지 않는다.
B. 추출된 CPS의 구조
본 발명의 방법에 의해 추출된 캡슐형 폴리사카라이드는 선행 방법에 의해 추출된 CPS와 비교해 독특한 구조를 가진다. 캡슐형 폴리사카라이드와 폴리람니노스를 연결하는 포스포디에스테르 결합의 염기 분해된 가수분해와 폴리람니노스와 펩티도글라이칸을 결합시키는 포스포디에스테르결합의 염기 분해성 가수분해에 의해서 CPS를 수득할 수 있다(참조 도 11). 세균 세포벽 구조의 대안적 모델에 의하면, 캡슐형 폴리사카라이드와 펩티도글라이칸을 연결하는 포스포디에스테르 결합의 염기 분해성 가수분해와 폴리람니노스를 펩티도글라이칸에 연결하는 포스포디에스테르 결합의 염기 분해성 가수분해에 의해 구조적으로 특이한 CPS를 수득할 수 있다(참조 도12). 선행기술문의 방법은 다른 결합을 절단하기 위해서 효소를 사용한다. 예를 들어서, N-아세틸글루코스아민/N-아세틸뮤라믹에시드 폴리머를 가수분해하기 위해서 리소자임을 사용한다. N-아세틸글루코스아민/N-아세틸뮤라믹에시드 폴리머와 펩티드 부분의 결합을 가수분해하기 위해서 뮤타노라이신이 사용되고 세균 세포벽의 펩티드 부분을 가수분해하기 위해서 리소스타핀이 사용된다.
낮은 다중분산값(MW/MN)으로 제시된 바와 같이 본 발명의 캡슐형 폴리사카라이드의 절대성 몰 질량 분포는 좁다(참조 표2). 일관되고 효과적인 백신 산물을 생산하는 데 이 단일성은 중요하다.
C. 백신
본 발명은 백신 제조에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 위에서 개시된 분리된 CPS는 CPS에 대해 반응성인 항체를 생성하기 위해서 항원으로 사용되고 CPS가 분리된 유기체에 대해 반응성이다.
본 발명의 백신은 능동 또는 수동 면역을 제공한다. 능동 면역을 제공하는 백신은 본 발명의 정제된 CPS를 포함한다. 바람직하게, 이 백신은 적어도 하나의 항원성 펩티드에 결합된 CPS를 포함한다.
6. 항체
위에서 제시된 CPS 추출과 분리 기법으로 본 발명의 충분한 양의 CPS를 생산할 수 있다. 이것은 CPS에 대해 반응성인 항체의 생산을 촉진한다.
다른 실시예에서, CPS에 대한 항체는 기술문에 잘 알려진 기술에 의해서 생산된다. 한 방법에 의하면, 분리된 CPS 제조나 유도체 또는 단편을 숙주 동물에 주입하여 항체를 생산할 수 있다. 숙주 동물은 쥐, 토끼, 인간이 아닌 영장류, 인간등이 있다. 바람직하게, 숙주는 인간이다. 기술문에 알려진 보조약을 사용하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
CPS에 대한 단일클론 항체는 기술문에 알려진 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 한 방법에 의하면, 하이브리도마 세포주의 배양이 사용된다(Kohler and Milstein(1975) Nature 256: 495-497). CPS에 대한 단일클론 항체는 인간 단일클론항체, 키메라 단일클론 항체 또는 기술문에 알려진 기법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체 등이다. 한 접근 방법에 의하면, 인간 일정 지역과 결합된 인간이 아닌(예:쥐) 항원 결합 지역을 가지는 키메라 단일클론 항체가 생산된다(Takeda et al.(1985) Nature 314:452). Queen 등의 공정, 미국 특허 5,585,089에 의하면 인간 항체가 생산된다.
CPS에 대한 항체는 기술문에 공지된 기술에 의해서 정제되지만 면역 흡착 또는 면역 친화 크로카토그래피 또는 다른 크로마토그래피 방법(HPLC)에 한정되는 것은 아니다. 항체는 혈청, 플라스마 또는 세포 배양 배지로부터 면역글로불린 부분으로 정제된다.
본 발명의 항체 분자는 완전한 면역 글로불린 분자, 실질적으로 완전한 면역글로불린 분자 또는 항체 결합 위치를 포함하는 면역글로불린 분자의 부분, 예를 들어 Fab 단편이다.
기술문에 공지된 기법으로 CPS에 대한 항체의 단편을 생산할 수 있다. (Campbell(1985) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al. (eds.),Elsevier Science Publishers, Amsterdam).
7. 접합 분자
본 발명의 CPS는 독립적으로 또는 폴리펩티드나 단백질과 같은 면역 물질에 접합되어서 개인별로 다양한 그람 음성, 그람 양성 세균에 대한 항체 반응을 야기하는 데 사용된다. CPS를 폴리펩티드에 접합시키면 T-세포 독립적인 CPS에 대한 면역 반응을 T-세포 의존적인 CPS에 대한 면역 반응으로 전환시킨다. 따라서, 폴리펩티드의 크기는 T-세포 독립적에서 T-세포 의존적으로 반응을 전환하기에 충분한 크기이다. 두번째 면역원을 제공하기 위해서 작은 폴리펩티드를 사용하는 것은 유용하다.
CPS 구성분과 펩티드를 접합시키기 위해서 어떤 형태의 접합도 사용될 수 있다. 바람직한 방법으로 인근 디올을 산화성 절단하고 환원성 아미노화에 의해서 알데히드기를 펩티드 아미노기에 결합하여 말단 알데히드기를 폴리사카라이드에 도입하는 방법이 미국 특허 4,356,170에 개시되어 있다.
하지만, 본 발명의 복합 백신이 환원성 아미노화로 생산되는 것에 한정되는 것은 아니다. Schneerson, R. et al. (1980) J. Exp. Med. 1952:361-476와 미국 특허 4,644,059에 기술된 바와 같이 지방 디하이드라자이드 스페이서와 같은 선행 기술문에 알려진 연결 방법 또는 예를 들어 Marburg, S. et al. (1986) J. Am. Chem. Soc.108:5282-5287 에 개시된 이원적 스페이서 기법으로 CPS와 펩티드를 접합하여 백신을 생산할 수 있다.
본 발명은 펩티드가 CPS의 여러 위치를 통해서 CPS에 연결될 때 접합 분자를 생산하는 능력을 제공한다. 따라서, CPS가 복합 단백질을 교차연결하는 반면에 본 발명에 따라 제조된 접합 분자는 단백질 구성성분에 대해서 단량체, 이량체, 삼량체, 더 고도로 교차 결합된 분자들이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 숙주 개체에서 다른 개체로 수동 면역성을 주기 위해서 본 발명의 CPS에 대한 항체는 치료제 또는 예방제에서 약품으로 사용될 수 있다(즉, 그람 음성 또는 그람 양성 세균에 대한 개체의 면역 반응을 증가시키거나 또는 후천성 면역 결핍증 환자를 포함하여 면역 타협된 또는 면역 결핍된 개체에 반응을 제공하기 위해서). 항체의 수동 전이는 기술문에 알려져 있고 알려진 방법으로 달성할 수 있다. 한 방법에 의하면, CPS 또는 본 발명의 접합체에 대한 항체는 면역능력이 있는 숙주("공급자")동물에서 생산되고 숙주 동물에서부터 수확되어 수용 개체로 주입된다. 예를 들어서, 인간 공급자는 CPS 또는 본 발명의 CPS 접합체에 대해 반응성이 있는 항체를 생산하는 데 사용된다. 항체는 치료 또는 예방적으로 효과적인 양이 치료가 필요한 인간 수용자에게 투여되어 폴리사카라이드 구성분에 의해 야기된 항체에 의해 결합된 세균에 대한 수용자에게 저항성을 부여한다. (참조 Grossman, M. and Cohen, S. N., in "Basic and Clinical Immunology", 7th Ed., (Stites, D. P and Terr, A. T, eds., Appleton ＆ Lange 1991) Chapter 58 "Immunization".)
8. 약품 조성분
본 발명의 약품 조성분은 CPS와 식염, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올과 같은 약품학상 수용가능한 보체를 포함하는 CPS 또는 접합된 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 약품 조성분은 펩티드 또는 본 발명의 CPS중 하나에 의해 야기된 항체를 포함하는 조성분과 같은 다른 면역학 성분을 포함한다. 조성분은 수용자의 면역 반응을 향상시키기 위해서 보조약을 포함한다(참조 U.S. Serial No.583,372, filed 9/17/90; European Patent,EP 0 549 617 B1; Moloney et al. U.S. Patent No. 4,258,029). 참조: Jennings, et al. U.S Patent No. 5,683,699 and Paoletti, et al. J. Infectious Diseases 1997; 175: 1237-9). 이러한 약품 조성분은 백신으로서 특히 유용하다.
수동 면역성을 유도하기 위해서, 약품 조성분은 복합클론 항체 또는 단일클론 항체 또는 이들의 유도체 또는 위에서 언급된 단편으로 구성되어 있다. 항체, 단편 또는 유도체의 양은 표준 진료 기법에 의해 결정된 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양이다.
본 발명의 약품 조제는 기술문에서 효과적인 방법으로 개인에게 도입된다. 피내, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비골내로 도입한다.
본 발명의 조성분은 표준 보체, 생리적 식염수나 다른 주입가능한 액체와 같은 약품학상 수용가능한 보체를 포함하는 백신에 적절하고 기술문에 알려진 버퍼나 방부제를 포함한다. 백신에 관례적인 첨가제는 락토스나 소비톨과 같은 안정제와 알루미늄 포스페이트, 하이드록사이드 또는 설페이트, 스테아릴 티로신과 같은 면역 반응을 향상시키기 위한 보조약으로 존재한다. 본 발명에 의해 생산된 백신은 다양한 감염체에 대한 면역 반응을 야기하는 다가성 백신의 조성분으로 사용된다.
본 발명의 백신은 면역 반응의 일부로서 항체 생산을 야기하기에 충분한 양이 투입된다. 투여량은 백신을 공급받는 개인의 크기, 체중 또는 나이에 따라 조정된다. 개인에 있어서 항체 반응은 항체 적정농도 또는 살균성 활성을 검사하여 조정될 수 있고 필요하면 반응을 향상시키기 위해서 증가될 수 있다. 전형적으로, 유아에 대한 단일 투여량은 투여량당 10 ㎍의 접합 백신 또는 0.5 ㎍-20 ㎍/kilogram이다. 성인은 접합 백신의 약 0.5 ㎍- 20 ㎍/kilogram의 투여량을 수신한다. CPS 백신의 경우에는 전형적인 투여량이 투여량당 각 개인 CPS의 약 25g 이다. 즉, 집단 B 연쇄상구균에 대한 백신은 9가지의 혈청타입 당 25g의 각 CPS 형태를 포함할 수 있다.
D. 진단 도구
다른 실시예에서, 본 발명의 CPS 또는 유도체 또는 단편은 뉴모라이신 독소와 같은 독소를 결합하지 않고 그람 음성 또는 그람 양성 세균에 대한 항체의 존재를 나타낼 수 있는 안전한 진단 도구를 생산하는 데 사용된다. 그러한 항체가 존재하면 병원체에 대한 선행 노출이 있음을 나타내고 감염에 저항성인 개인을 예측할 수 있다. 변경된 CPS 또는 유도체 또는 단편이 그람 음성 또는 그람 양성 세균에 대한 항체를 포함하는 표본과 혼합되었을 때 진단 도구는 본 발명의 적어도 하나의 CPS 또는 유도체 또는 단편과 항체 반응의 검출에 적절한 시약을 포함한다. 항체 반응은 ELISA 검출을 포함하여 기술문에 개시된 어떤 반응에 의해서도 검출될 수 있다. 그러한 지식은 중요하며 불필요한 접종을 회피할 수 있다.
대안적으로, 진단 도구는 고체 지지체나 자석 구슬 또는 플라스틱 기질과 본 발명의 CPS의 적어도 하나 또는 유도체 또는 단편을 더 포함한다.
어떤 경우에, CPS 또는 유도체 또는 단편이 라벨되는 것이 바람직하다. 라벨 약품은 기술문에 잘 알려져 있다. 예를 들어서, 라벨 약품은 방사성, 화학루미네센스, 생물루미네센스, 루미네센스 또는 편리한 분석을 위한 다른 확인 "꼬리표" 등을 포함한다. 체액 또는 조직 표본(예: 피, 혈청, 침)을 수집하고 정제한 후 진단 도구에 사용한다. CPS, 유도체 또는 단편은 정제되거나 정제되지 않고 분자의 혼합으로 구성되어 있다.
고체 기질은 기술문에 개시되어 있고 유용하며 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 시험관, 구슬, 미세입자, 담금막대, 플레이트 등을 포함한다. 추가적으로 기질은 막, 96-웰 미세 적정량 플레이트, 시험관, 에펜도르프 튜브를 포함한다. 일반적으로 그러한 기질은 리간드 결합 약품이 결합될 수 있는 표면이나 리간드 부착 위치를 제공하는 표면을 포함한다.
여기에서 언급된 출판물, 특허, 기사는 참조문으로 인용되어 있다. 다음 예는 본 발명을 예시하도록 제시되어 있지만 본 발명의 영역을 한정하도록 해석되는 것은 아니다. 당업자는 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 많은 변화와 치환을 할 수 있다.
A. 세균 균주, 성장 배지와 배양 조건
타입 Ib 집단 B 연쇄상구균 균주 H36b (ATCC 12401)을 미국 타입 배양 수집 (Rockville, MD)에서 수득할 수 있었다. 하바드 의과 대학의 D.L. Kasper이 다른 균주 090 (타입 Ⅰa), 18RS21(타입 Ⅱ), M781(타입 Ⅲ), 1169-NT(타입 Ⅴ) 를 공급해 주었다. CBER, FDA의 Carl Frasch이 네이세리아 메닝지티디스 형 B, C, Y와 W135를 공급해 주었고 CBER, FDA의 Willie Vann이 대장균 K1을 공급해 주었다. 각 집단 B 연쇄상구균 균주는 다이알리세이트(10,000 명목상 분자량 한계(NMWL)막), 6% 글루코스로 보충된 3.5% 콜롬비아 브로스(디프코 실험실, 디트로이트, MI)의 펠리콘 카세트 시스템(밀리포어 코포레이션, 베드포드, MA). 쉐이킹 에를렌마이에르플라스크에서 37℃에서 8시간 동안 배양된 150 ml 씨 배양체는 14리터의 브로스로 채워진 바이오플로 Ⅳ 20 리터 발효기(뉴 브런스윅 과학 회사, 에디슨, NJ)를 접종하는 데 사용된다. 발효 배양체는 37℃에서 유지되고 10N NaOH의 첨가로 pH 7.1로 조정되고 1.5 l/min에서 공기가 주입되었다. 세포는 미니크로스 0.2 ㎛ 구멍, 빈-섬유 카트리지(마이크로곤, 라그나 힐, CA)을 통한 미세거름에 의해 17시간 후에 수확되었다. 배양 상층액은 더 공정될 때까지 4℃에서 멸균상태로 유지되었다. 마지막 세포 펠릿은 분리된 세포를 소발 GSA 회전자(듀퐁 진단 ＆ 도구과, 윌밍턴, DE)에서 50분 동안 9000 rpm에서 원심분리하여 수득하였다.
B. 캡슐형 폴리사카라이드를 생산하는 일반적 방법
1. 추출과 소수성 상호작용 크로마토그래피
세포 페이스트의 그램 습윤 무게를 1 부피로 사용하여 펠릿은 4 부피의 1N NaOH에 용해되었다. 현탁액은 37℃에서 밤새 배양되었다. 세포 잔해를 소발 GSA 로터에서 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 제거하였다. 농축된 HCl로 중화한 후에(J.T. Baker, 필립스버그, NJ), 상층액은 펠리콘 10,000 NMWL막을 사용하여 2N NaHCO3 (pH 9.6)에 대해 걸러졌다. 남은 보유액을 페닐 세파로스 HP로 채워진 파마시아 XK 26/60 칼럼에 주입하고 아래에 제시된 파마시아 준비 크로마토그래피 체계를 사용하여 2N NaOH로 미리 균형이 맞추어졌다. 칼럼은 2N NaHCO3의 한 칼럼 부피로 4ml/min 속도로 용출되고 두 칼럼 부피의 물로 용출되었다. 부분은 폴리사카라이드에 대해 검사되고 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 부분은 혼주되었다.
캡슐형 폴리사카라이드는 배양 상층액으로부터 정제되었다. 세포를 제거한 후에, 브로스는 10-15배 농축되고(펠리콘, 10,000 NMWL 막을 사용하여) 10부피의 물에 대해 투과되었다. 생성된 보유물에 마지막 농도 1M까지 10 NaOH가 추가되었다. 이 용액은 밤새 37℃에서 배양되고 농축된 HCl로 중화되었다. 위에서 개시된 것과 같이 세포 추출에 대한 공정이 계속되었다.
타입 Ⅲ 캡슐형 폴리사카라이드의 한 밧치에 대해서, 세포와 배양 상층액은 다음과 같이 추출되었다. 세포에서 분리된 배양 상층액은 농축되고 투과된 후 위에서 개시된 바와 같이 생성된 보유물은 염기로 처리되었다. 세포 펠릿은 염기 처리된 보유물의 4 부피에 현탁되고 세포 추출을 위해서 위에서 개시된대로 공정되었다.
2. 재 N-아세틸화 반응
폴리사카라이드를 전에 언급된 추출 조건에 노출시키면 폴리사카라이드로부터 N-아세틸기를 방출하기 때문에, 아세트산 무수물(올드리치 화학 회사, 밀와키, WI)를 혼주된 부분에 최종 농도 0.8 M까지 첨가하면 재-N-아세틸화된다. 이 반응 혼합물은 실내 온도에서 1시간동안 교반되고 10N NaOH를 첨가하여 pH 9에서 유지되었다. 반응 pH는 13까지 증가되었고 반응은 30분 동안 더 진행되었다. 재-N-아세틸화된 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 용액은 미니탄 카셋 체계(10,000 NMWL 막, 밀리포어)를 사용하여 물에 대해 걸러지고 보유물은 동결건조되었다. 동결건조물은 PBS(pH 7.4)에서 다시 용해되고 슈퍼덱스 200 PG상에서 젤투과 크로마토그래피로 정제되었다. 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 분획은 혼주되고 물에 대해 걸러지고 정제된 CPS를 생산하기 위해서 보유물은 동결건조되었다.
3. 젤투과 크로마토그래피
분석적 젤투과 크로마토그래피는 파마시아 UV-1 자외선 검출기(280-nm 필터를 가진), 워터스 코포레이션(밀리포스, MA) R401 차별 굴절계, 파마시아 슈퍼로스 6 HR 10/30( 고도로 교차 결합된 구슬 아가로스)칼럼 등이 장착된 파마시아 FPLC 체계에서 수행되었다. 칼럼은 pH 7.4에서 PBS를 가지고 0.5 ml/min의 속도로 용출되었다. 덱스트란(분자량 2×106; 시그마 화학 회사., St. Louis, MO)은 빈 부피(Vo)를 결정하는데 사용되고 아지드나트륨은 전체 베드 부피(Vt)를 결정하는 데 사용되었다. 상대적 용출 부피는 Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)로 표현된다. Ve는 R1도로부터 용출 부피이다. 준비된 GPC는 위에 언급된 검출기, P-50 펌프, FRAC-100 분획 수집기, GP-250 플러스 조정기, 슈퍼덱스 200 PG (파마시아)로 채워진 XK 26/100 칼럼을 구비한 파마시아 시스템에서 행해졌다. 칼럼은 PBS로 1 ml/min의 비율로 용출되었다.
C. 폴리사카라이드의 분석
1. 몰질량의 결정
폴리사카라이드의 절대 몰질량 분포는 인라인 다각 레이저광비산 광도측정기와 차별적 굴절기(GPC-MALLS/RI)와 함께 분석적 GPC에 의해 결정되었다. 이 방법은 Jasco PU-980 HPLC 펌프(이스턴, MD), 리오딘 모델 7125 삽입 모델(Cotati, CA), PBS로 균형이 유지된 슈퍼로스 6 HR 10/30 칼럼으로 구성된 액체 크로마토그래피 체계에서 0.5 ml/mim의 흐름 속도로 수행되었다. 이동상은 고순도의 물에서 제조되었고(Stephens Scientific, Riverdale, NJ) 밀리포어 타입 GV 0.22-mm 막을 구비하고 지름 25 mm의 인라인 필터(밀리포어)를 통해 여과되었다. 폴리사카라이드 표본(1-2 mg)은 이동상에 10 mg/ml의 농도로 용해되었고 생성된 용액은 주입전에 미집자를 제거하기 위해서 14,000 rpm에서 2-3분 동안 마이크로센트리퓨즈에서 원심분리되었다. 칼럼 유출액은 Hewlett-Packard model 1047A 차별적 굴절기에 결합된 in-line miniDAWM 고정된 삼각 레이저 광발산 광도측정기로 분석되었다(Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA). 굴절기의 아날로그 신호 생산품은 보조 주입 채널을 통해서 miniDAWM에 연결되었다. 광발산 데이터를 수득하고 Wyatt's ASTRette와 EASI 소프트웨어로 공정하였다. 정점 지역은 정점의 전범위에 걸쳐 Wyatt 소프트웨어로 200-300 부등사변형 또는 슬라이스 지역의 합계로서 계산되었다. 수득된 영역으로부터, 주어진 정점에서 용출하는 폴리사카라이드의 중량 평균 몰 질량과 수평균 몰 질량(Mw, Mn)이 계산되었다. 구체적 굴절지수 증분(dn/dc)는 모든 폴리사카라이드에 대해서 온라인 HP 1047A 굴절기를 사용하여 0.140 ml/g로 결정되었다. 이 값은 다른 폴리사카라이드에 대해 수득한 값과 비교된다 (7,8,38).
2. NMR 분광기
D2O에 있는 폴리사카라이드 표본의 일차원적1H NMR 스펙트라는 브룬터 도구 AMX 500 분광기(Billerica, MA)상에서 500 MHz에서 기록되었다. 스펙트라 자료는 50℃에서 수득되었고, 화학적 이동은 D2O에서 외부 2,2,3,3-테트라듀테리오-3-(트리메틸실일)프로피오네이트(앨드리치)와 관계한다.
3. 화학적 분석
준비된 칼럼 용출액과 정제된 폴리사카라이드에서 폴리사카라이드의 양은 시알릭산에 대한 Reuter와 Schauer의 미세한 규모의 오르시놀 검사의 변경으로 결정되었다. 간략하게, 1-1.5 ㎍의 NeuAc 표준또는 정제된 캡슐형 폴리사카라이드의 300 ㎍/㎖를 포함하는 100 ㎍의 시료나 대조군은 1.5 ml 마이크로 센트리퓨즈 튜브내의 100 ㎕의 오르시놀 시약에 첨가되었다. 시료는 잘 혼합되고 15분동안 끓는 워터배스에서 가열되었다. 시료가 5분 동안 얼음에서 냉각된 후에, 500 ㎕의 이소아밀 알코올(Fluka 화학 회사, Ronkonkoma, NY)이 각 시료에 첨가되었다. 시료는 충분히 혼합되고 3000 rpm에서 2-3분동안 마이크로센트리퓨즈에서 원심분리되었다. 이 과정은 발색단을 알코올로 확실히 추출하기 위해서 반복되었다. 각 시료의 알코올상으로부터 취한 200㎕를 96웰 평면 저결합형 폴리스티렌 마이크로리터 플레이트(Coming Costar Corp.,Cambridge, MA)로 전이되고 Molecular Devices Emax microplate reader(Menlo Park, CA)에서 560nm에서 측정되었다. 마지막 폴리사카라이드 조제의 순도는 다음 공식 질량을 사용하여 시알산 양으로부터 도출되었다: 말단 NeuAc 잔기에 대한 314.3 g/mol; 타입 Ⅰa, Ⅰb, 또는 Ⅲ CPS의 반복 단위에 대한 1004 g/mol; 타입Ⅱ 또는 Ⅴ CPS의 반복 단위에 대한 1328 g/mol.
단백질양은 표준으로서 Pierce(Rockford, IL) Coomassie Plus 약품과 말 IgG를 사용하여 브래드포드 과정에 의한 PBS에서 ml당 1-2 mg 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 시료로부터 결정되었다. 핵산의 양은 260nm에서 직접 UV 광도측정기로 결정되었다. 이러한 검사에 대한 광도 측정은 Shimadzu model UV 160U 분광광도계로 이루어졌다 (Shimadzu Scientific Inst., Columbia, MD).
D. 수득
다양한 집단 B 연쇄상구균 혈청타입으로부터 수득한 캡슐형 폴리사카라이드의 수득은 표1에 나타났다. 모든 혈청타입에 대해서, 세포 펠릿으로부터 정제된 폴리사카라이드는 타입 Ⅱ에 대한 4배 높은 수득으로부터 타입 Ⅰb에 대한 60배 더 높은 수득에 이르면서 배양 상층액으로부터 수득한 것을 능가한다. 비교를 위해서, 상층액으로부터 얻은 수득과 세포로부터 얻은 수득을 배양 리터 당 밀리그램의 폴리사카라이드로 표1에 표시해 놓았다. 따라서, 14리터의 발효가 고려될 때, 세포로부터 전체 수득은 타입 Ⅰa의 1.1g 에서 타입 Ⅱ의 0.6g에까지 이르고 반면에 상층액으로부터 총수득은 타입 Ⅱ의 150 mg에서 타입 Ⅰb의 14㎎에 이른다. 타입 Ⅲ 발효로부터 세포와 상층액이 같이 공정되면 수득 63 mg/L 또는 전체 0.9 g은 세포 펠릿 단독으로 수득된 것과 유사하다. 세포의 캡슐형 폴리사카라이드의 분리된 수득과 상층액으로부터 분리된 수득의 비율에서 연구된 집단 B 연쇄상구균 균주사이의 변이는 현재 성장 조건에서 캡슐형 폴리사카라이드를 방출하는 경향이 혈청타입사이에 다름을 제시한다. von Hunoistein 등이 보고한 바와 같이 본 접근 방법에 의해 정제된 세포 결합 캡슐형 폴리사카라이드의 양은 세포 결합 시알산의 수준으로부터 추론되고(캡슐형 폴리사카라이드의 마커로 사용되는) 타입 Ⅰa, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ의 집단 B 연쇄상구균 균주의 배치 발효로 수득한 양에 접근한다. 더 강한 추출 조건(즉, 강염기, 고온, 추출혼합물의 교반)은 세포 결합 캡슐형 폴리사카라이드의 수득을 향상시킬 것으로 기대된다.
표 1
| 집단 B 연쇄상구균 캡슐형 폴리사카라이드의 수득 | ||
| 항혈청 | 수득 상층액(mg/L)A | 수득 셀 펠릿(mg/L)A |
| Ⅰa | 4 | 79 |
| Ⅰb | 1 | 64 |
| Ⅱ | 11 | 42 |
| ⅢB | 4 | 65 |
| Ⅴ | 5 | 65 |
A수득은 성장 배양 리터당 최종 정제된 캡슐형 폴리사카라이드의 mg으로 표
시된다.
B브로스와 세포가 같이 공정되었을 때, 타입 Ⅲ 집단 B 연쇄상구균는
63 ㎎/L를 생산한다.
결과
A. 정제된 폴리사카라이드의 분석
연구된 그룹 B 연쇄상구균 혈청타입 각각에 대해서, 양 혈청타입으로부터 폴리사카라이드의 조제의 일차원적1H NMR 분광기로 각 타입 폴리사카라이드에 대해 출판된 스펙트럼의 데이타와 동일함을 확신할 수 있었다. 게다가, 모든 이러한 조제의 NMR 스펙트럼은 오염 수준이 낮다는 것을 예시한다. 다섯 집단 B 연쇄상구균 폴리사카라이드의 대표적 NMR 스펙트럼은 도1-5에 나타나 있다. 260 nm에서 직접 uv 광도측정기에 의해 검출된 핵산의 수준은 질량으로 1%를 능가하지 않은 반면 브래드포드 방법에 의해 검사된 바와 같이 단백질은 이 검사의 하부 검출 한계(1 ug/ml)이상에서는 어느 폴리사카라이드 제법에서도 검출되지 않았다. 변경된 미세규모 오시놀 검사에 의해 예측된 시알산 양으로부터 계산된 폴리사카라이드의 순도는 100% 이상이었다. 위에서 개시된 공정에 의해 수득된 폴리사카라이드 제법에 대해서, 단백질이나 핵산에 의한 오염이 최소이고 스펙트럼, 측광 데이터는 고순도의 캡슐형 폴리사카라이드와 일치한다.
B. 폴리사카라이드의 분자 크기
RI-검출된 GPC 측면도의 정점 최대값으로부터 수득한, 슈퍼로스6에서 정제된 폴리사카라이드의 상대적 용출 부피(KAV)는 표2에 나와 있다.
각 분석에서 폴리사카라이드의 절대 몰질량 분포는 GPC-MALLS/RI로 결정하였다. 이 방법으로 흐름 속도와 보유 부피와 같은 크로마토그래피적 변수에 상관없이 유체역학 성질은 분석물에 따라 변하는 두번째 표준이 필요하지 않고 거대분자의 몰질량을 직접 예측할 수 있었다. 성격 규명 방법으로서 GPC-MALLS/RI의 유용성은 약제 성질의 폴리사카라이드에 대해 잘 설정되어 있다(7,8,10,17,25). 몰질량분포는 무게평균몰질량(M\)과 다분산성(M\/MN)으로 제시되어 있고, 이것은 분포의 폭을 제시한다. 다분산성이 단일성으로 접근함에 따라, 몰질량 분포는 동일성으로 접근한다.
정제된 그룹 B 연쇄상구균 폴리사카라이드에 대한 몰질량 데이터는 표2에 나와 있다. 각 혈청타입에 대해서, 양 혈청타입으로부터 제조된 폴시사카라이드에 대한 몰질량분포는 비슷하다. 이러한 제조물의 무게평균몰질량은 타입Ⅴ으로부터 세포 관련 캡슐형 폴리사카라이드에 대해 92 ㎏/mol에서부터 배양 상층액으로부터 정제된 타입 Ⅰa의 캡슐형 폴리사카라이드에 대해 318 ㎏/mol에까지 이른다. 낮은 저분산성값 (MW/MN1.6)으로 알 수 있듯이 모든 제조물의 분포는 좁다. 이러한 값은 연쇄상구균 뉴모니아와 헤모필러스 인플루엔자 타입 b의 여러 혈청타입의 캡슐형 폴리사카라이드의 비슷한 분석으로 수득한 값과 견줄만하다(7,17).
표 2
| 정제된 집단B 연쇄상구균 캡슐형 폴리사카라이드의 생화학적, 생물리적 성격규명 | |||||
| 혈청타입 | Kav | MW(kg/mol)A | 다분산성 MW/MN | 핵산의 양(%) | 단백질양(%) |
| Ⅰa (S) | 0.005 | 318 | 1.35 | 0.23 | 0.21 |
| Ⅰa (C) | 0.010 | 311 | 1.31 | 0.15 | 0.01 |
| Ⅰb (S) | 0.191 | 170 | 1.20 | 0.95 | 0.01 |
| Ⅰb (C) | 0.150 | 218 | 1.61 | 0.33 | 0.01 |
| Ⅱ(S) | 0.152 | 246 | 1.46 | 0.13 | 0.01 |
| Ⅱ(C) | 0.115 | 289 | 1.46 | 0.12 | 0.01 |
| Ⅲ(S) | 0.343 | ND | ND | 0.58 | 0.01 |
| Ⅲ(C) | 0.268 | 108 | 1.24 | 0.10 | 0.01 |
| Ⅲ(S+C) | 0.272 | 104 | 1.22 | ||
| Ⅴ(S) | 0.257 | 92 | 1.28 | 0.26 | 0.27 |
| Ⅴ(C) | 0.156 | 179 | 1.15 | 0.17 | 0.09 |
| Ⅴ(C) | 0.241 | 99 | 1.20 |
A 몰질량은 GPC-MALLS/RI로 결정되었다
B (S)는 폴리사카라이드가 상층액으로부터 분리되었음을 나타낸다.
C (C)는 폴리사카라이드가 세포 펠릿으로부터 분리되었음을 나타낸다.
NMR 스펙트럼 데이터를 참고하여, 각 혈청타입에 대하여 몰질량분포는 상층액이나 세포 펠릿(타입 Ⅲ에 있어서 결합된 원천에서도)으로부터 정제된 폴리사카라이드사이의 차이점은 중요하지 않음을 나타낸다. 각 혈청타입의 조제물에 대한 NMR 스펙트럼은 이들이 화학적으로 동일함을 나타내기 때문에, 이 조제물의 면역화학적 행동은 동일할 것으로 기대된다. 따라서, 배양 상층액과 추출용 세포를 결합할 것인지의 결정은 상층액으로부터 예상되는 수득에 대한 공헌에 기초한다(표1). 따라서, 타입 Ⅱ의 결합된 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.
면역화학적 분석
A. 경쟁적 방해 ELISA
미세적정 플레이트(NUNC Polysorp)는 37 ℃에서 1시간동안 PBS(50 nM의 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH=7.4)에 용해된 GBSPla-HSA, GBSPlb-HSA, GBSPⅡ-HSA, GBSPⅢ-HSA 또는 GBSPⅤ-HSA(각 웰에 100 uL에 있는 100 ng의 폴리사카라이드)로 수동적으로 코팅되었다. 플레이트가 PBS + 0.05% Tween 20(PBS-Tween, pH=7.4)와 세척된 후, 플레이트는 PBS + 0.1% Bovine Serum Albumin의 150 uL/well로 차단되었다. 후사출후에, 플레이트는 다시 세척되고 사용될 때까지 4℃에서 저장되었다.
GBSPla,GBSPlb,GBSPⅡ,GBSPⅢ에 대한토끼 항-전체 세포 집단 B 연쇄상구균 항혈청은 GBSPla-HSA, GBSPlb-HSA, GBSPⅡ-HSA, GBSPⅢ-HSA으로 코팅된 플레이트에서 개별적으로 적정되었다. 비슷하게, 토끼 GBSPV-TT 항혈청은 GBSPV-HSA로 코팅된 플레이트에서 적정되었다. 최대 신호의 약 50%에 해당하는 희석은 억제 연구에 적합한 것으로 선택되었다.
항혈청은 PBS-Tween에서 희석되었다. 억제제는 희석된 항혈청을 포함하는 버퍼에서 연속적으로 5배로 희석되었다. 다음, 이러한 시료의 100 uL은 쌍으로, 코팅된 마이크로적정 플레이트의 웰에 첨가되고 1시간동안 상온에서 배양되었다. 세척된 후에, 제조자의 지시사항에 따라 PBS-Tween에서 희석된 100 uL의 염소 항-토끼 면역글로불린 고추냉이 접합(Kirkegaard ＆ Perry)은 각 웰에 첨가되었다. 플레이트는 상온에서 배양되었고 다시 세척되었다. TMB 마이크로웰 기질(cat. no. 50-76-04, Kirkegaad ＆ Perry)의 100 uL은 각 웰에 첨가되었다. 100 uL의 단일성분 정지액(cat. no. 50-85-04, Kirkegaard ＆ Perry)을 첨가하여 5분 후에 반응은 정지되었고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 억제도는 억제인자가 없을 때 희석된 항혈청으로 달성된 최대 신호의 비율로 결정되었다.
B. 결과
상동 캡슐형 폴리사카라이드 항원을 가진 각 특이적 GBS 항혈청 Ⅰa, Ⅰb, Ⅱ, Ⅲ, Ⅴ에 대한 결합 억제 곡선은 표 5-10에 각각 나타났다. 이러한 곡선이 제시하듯이, 각 PS 항원은 배양 상층액 또는 브로스에서 추출되든지 비슷한 억제 성질을 가지며 이는 항원적 동등성을 나타낸다. 따라서, 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하기 위해 사용되는 과정은 항원성에 영향을 주지 않는다.
본 발명에 의하면 그람 음성과 그람 양성 세균의 세포구성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드(CPS)를 추출할 수 있다. 즉, 세균 상층액이나 세균세포로부터 CPS와 다른 세포성분을 연결하는 염기 같은 결합띠를 가수분해하여 CPS를 추출할 수 있다. 또한 본 발명은 다른 세포구성분으로부터 CPS의 분리를 촉진하기 위해서 염기추출동안 CPS의 N-아세틸기를 탈아세틸화 반응시켜 정제된 캡슐형 폴리사카라이드를 수득하는 방법을 제공한다.
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Claims (21)
- 그람-음성 및 그람-양성 세균의 세포구성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 추출하는 방법에 있어서, 염기성 조건에서 세포구성분과 염기성 약품을 반응시키고 세포구성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 분리하는 것을 포함하는 것으로된 추출방법.
- 제 1항에 있어서,캡슐형 폴리사카라이드의 면역성을 유지하기 위해서 추출 동안에 가수분해된 캡슐형 폴리사카라이드에 존재하는 일정 비율의 N-아세틸 그룹이 충분히 재아실화 반응되는 것을 특징으로하는 방법.
- 제 1항에 있어서,그람-음성 및 그람-양성 세균의 세포구성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 추출하는 방법은;(a) 다른 세포구성분으로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 크로마토그래피에 의해 선택적으로 분리하는 단계,(b) (b)단계의 캡슐형 폴리사카라이드를 아실화 약품과 반응시키는 단계,(c) (b)단계로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 더 포함하는 것으로된 추출방법.
- 제 3항에 있어서,염기 시약의 pH가 9 내지 14인 것으로된 추출방법
- 제 4항에 있어서,염기 시약의 pH가 약 12인 것으로된 추출방법
- 제 3항에 있어서,세균은 연쇄상구균속 세균인 것으로된 추출방법.
- 제 3항에 있어서,세균은 집단 B 연쇄상구균인 것으로된 추출방법.
- 제 3항에 있어서,세균은 집단 B 연쇄상구균 타입 Ⅰa, Ⅰb, Ⅱ, Ⅲ 또는 Ⅴ인 것으로된 방법.
- 제 3항에 있어서,염기 시약이 유기 염기인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,염기 시약이 무기 염기인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,염기 시약은 NaOH, KOH 또는 LiOH 인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,크로마토그래피 단계에 의한 분리는 소수성 상호작용 크로마토그래피 분리방식인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,아실화 약품은 아세트산 무수물, 아세틸 클로라이드, 펜타플루오르페닐 아세테이트 또는 4-니트로페닐 아세테이트인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,크로마토그래피 단계에 의한 캡슐형 폴리사카라이드의 정제는 젤투과형 크로마토그래피 분리방식인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,염기 시약은 무기 염기이고, 크로마토그래피 단계에 의한 분리는 소수성 크로마토그래피 분리방식이고, 아실화 약품은 아세트산 무수물, 아세틸클로라이드, 펜타플르오르페닐 아세테이트 혹은 4-니트로페닐 아세테이트이며 크로마토그래피 단계에 의한 캡슐형 폴리사카라이드의 정제는 젤투과형 크로마토그래피 분리방식인 것을 특징으로하는 추출방법.
- 제 3항에 있어서,염기 시약은 NaOH이고, 크로마토그래피에 의한 분리는 페닐 세파로스를 수반하고, 아실화약품은 아세트산 무수물이고, 크로마토그래피 단계에 의한 캡슐형 폴리사카라이드의 회수는 슈퍼덱스를 수반하는 것을 특징으로하는 추출방법.
- 그람-음성 또는 그람-양성 세균 세포구성분을 염기가 함유된 약품으로 추출하는 것을 포함하는 공정에 의해 생산되는 변형된 캡슐형 폴리사카라이드.
- 제 17항에 있어서,수득된 캡슐형 폴리사카라이드를 아세트산 무수물로 아실화 반응시키고 캡슐형 폴리사카라이드를 젤투과형 크로마토그래피 분리방식으로 정제하는 것을 특징으로하는 변형된 캡슐형 폴리사카라이드.
- 제 18항에 있어서,추출된 세균 세포구성분은 연쇄상구균속 세균에서 수득되는 것을 특징으로하는 변형된 캡슐형 폴리사카라이드.
- 제 19항에 있어서,추출된 세균 세포구성분은 집단 B 연쇄상구균으로부터 수득되는 것을 특징으로하는 변형된 캡슐형 폴리사카라이드.
- 제 20항에 있어서,타입 Ⅰa CPS는 0.010-0.005 범위의 Kav; 318-311(kg/mol) 범위의 Mw; 1.35-1.31 범위의 MW/Mn;타입 Ⅰb CPS는 0.191-0.150 범위의 Kav; 218-170(kg/mol) 범위의 Mw; 1.61-1.20 범위의 MW/Mn;타입 Ⅱ CPS는 0.152-0.115 범위의 Kav; 289-246(kg/mol) 범위의 Mw; 약 1.46의 MW/Mn;타입 Ⅲ CPS는 0.343-0.268 범위의 Kav; 108-104(kg/mol) 범위의 Mw;1.24- 1.22 범위의 MW/Mn; 또한타입 Ⅴ CPS는 0.257-0.156 범위의 Kav; 179-92(kg/mol) 범위의 Mw; 1.28-1.15 범위의 MW/Mn를 갖는 것을 특징으로하는 변형된 캡슐형 폴리사카라이드.
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