JP5286089B2 - ポリサッカライドを精製する方法 - Google Patents
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- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
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Description
本発明により精製されるポリサッカライドのソースは、多様である。ソースとしては、細菌、古細菌、及び真核生物が挙げられる。多細胞生物においては、そのソースは全有機体の一部であり得る(例えば、癌細胞又は癌性細胞)。
本発明によれば、ポリサッカライドは、ストックを第1の試薬の酸試薬又は塩基試薬と接触させることによって抽出する。理論に縛られるものではないが、共有結合が、ポリサッカライドと細胞壁などの細胞成分(この細胞成分は、それ自体、例えばポリサッカライド、タンパク質、又は脂質であり得る)の間(又はポリサッカライドとポリサッカライドを細胞成分に連結している中間分子の間)で破壊されるものと考えられる。その他のタイプの結合としては、以下に限定はされないが、イオン結合及びファンデルワールス力によって形成される結合が挙げられる。ポリサッカライドと細胞壁成分を連結している結合は、ポリサッカライドと細胞壁成分の間の「直接」結合、又はポリサッカライドの細胞壁成分への付着をもたらす「介在する」又は「間接的」結合であり得る。その結合の破壊をもたらす化学反応は、塩基又は酸のいずれかによる加水分解反応である。
いくつかの実施形態において、第1の試薬は、いろいろな塩基の1つ又は複数を含む。本発明に従って使用することができる塩基の非限定の例は、NaOH、KOH、LiOH、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3、KCN、Et3N、NH3、H2N2H2、NaH、NaOMe、NaOEt及びKOtBuから選択される化合物を含む。いくつかの実施形態において、NaOH、KOH、LiOH、NaH、NaOMe又はKOtBuなどの塩基は、0.5N〜10Nの範囲(例えば、0.5N〜5N、0.5N〜2N、又は0.8〜1.5N)で使用することができる。いくつかの実施形態において、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3及びKCNなどの塩基は、それらの溶解性が許容する高さの濃度で使用することができる。いくつかの実施形態において、トリエチルアミン(Et3N)などの有機塩基は、水又はアルコールなどの加水分解を生じる作用物質が存在する限り、中濃度から高濃度、例えば、1Nから7N(例えば2N〜4N)の範囲で使用することができる。アンモニア(NH3)又はヒドラジン(H2NNH2)などの塩基は、100%を含む殆んどどんな濃度でも使用することができる。溶媒、例えば、水、アルコール類(好ましくはC1−C4)、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、又はこれら及びその他の有機溶媒の混合物などを使用することができる。水を含む加水分解用の塩基溶液も使用することができる。
いくつかの実施形態において、ストックは、第1の試薬1リットル当り0.1〜300gの細胞ペーストであることができる。例えば、そのストックは、第1の試薬1リットル当り0.5〜200gの細胞ペーストであることができる。例えば、そのストックは、第1の試薬1リットル当り1〜100gの細胞ペーストであることができる。例えば、そのストックは、第1の試薬1リットル当り5〜150gの細胞ペーストであることができる。例えば、そのストックは、第1の試薬1リットル当り20〜100gの細胞ペーストであることができる。いくつかの実施形態において、そのストックは、濃縮した上澄みであるか又は濃縮した第1の試薬(例えば、10NのNaOH)が、濃縮度のより低い混合物を得るために添加される(例えばその混合物のpHによって決定されるか又はその混合物中の第1の試薬の成分の濃度によって決定され、例えば、10NのNaOHが1NのNaOHに希釈される)条件培地である。
別段の記述がない限り、この第1ステップの分離の項に以下で示されている本発明の態様は、本発明のすべてのその他の分離及び精製ステップに全面的に適用する。
第1ステップの分離に由来するポリサッカライドは、第2の試薬、塩基試薬と接触させて第2の混合物を形成する。理論に縛られるものではないが、この第2ステップの加水分解は、(1)ポリサッカライドの自然の構造又は天然の抗原性を維持しながら、ポリサッカライドに付着して残留している細胞成分、特に細胞壁成分を引き離すこと、及び(2)その他の細胞成分混入物質(例えば、タンパク質及び核酸など)を分解すること、の少なくとも1つに対して有用であり得る。いくつかの実施形態において、この第2ステップの加水分解は、実質的に純粋なポリサッカライドを得るための複雑なクロマトグラフ法に対する必要性を取り除くことができる。
第2の試薬は、いろいろな塩基の1つ又は複数を含む。本発明に従って使用することができる塩基の非限定の例は、NaOH、KOH、LiOH、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3、KCN、Et3N、NH3、H2N2H2、NaH、NaOMe、NaOEt及びKOtBuから選択される化合物を含む。いくつかの実施形態において、NaOH、KOH、LiOH、NaH、NaOMe又はKOtBuなどの塩基は、1N〜10Nの範囲(例えば、1N〜6N、又は2〜5N)で使用することができる。いくつかの実施形態において、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3及びKCNなどの塩基は、それらの溶解性が許容する高さの濃度で使用することができる。いくつかの実施形態において、トリエチルアミン(Et3N)などの有機塩基は、水又はアルコールなどの加水分解を生じる作用物質が存在する限り、中濃度から高濃度、例えば、1Nから7N(例えば2N〜4N)の範囲で使用することができる。アンモニア(NH3)又はヒドラジン(H2NNH2)などの塩基は、100%を含む殆んどどんな濃度でも使用することができる。溶媒、例えば、水、アルコール類(好ましくはC1−C4)、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、又はこれら及びその他の有機溶媒の混合物などを使用することができる。水を含む加水分解用の塩基溶液も使用することができる。
加水分解は、20℃〜100℃の温度、例えば、30℃〜100℃、37℃〜100℃、40℃〜100℃、50℃〜95℃、60℃〜90℃、70℃〜90℃、又は80℃で達成することができる。いくつかの実施形態において、混合物は、反応が起こることを可能にするために3〜72時間にわたってインキュベートする。例えば、そのインキュベーションは、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、24、36、48、60、若しくは72時間又はその間の任意の時間続けることができる。いくつかの実施形態において、その混合物はインキュベーションの間は、かき混ぜる。いくつかの実施形態において、その混合物はインキュベーションの間は、かき混ぜない。
第2ステップの加水分解に由来する抽出ポリサッカライドは、細胞成分に由来する不純物からの第1ステップの分離と同じように、以下に限定はされないが、クロマトグラフィー及び膜濾過などの分離技術によって分離することができる。クロマトグラフ分離法の非限定の例は、イオン交換(カチオン又はアニオン)、親水性相互作用、疎水性相互作用、又はゲル浸透クロマトグラフィーである。典型的な方法は、限外濾過膜を用いる接線流濾過である。
ポリサッカライドを他の細胞成分から最終的に分離した後、加水分解手段によりポリサッカライドを脱アセチル化することができるので、生来のアセチル基が除去されている可能性のある遊離のアミノ基を再アシル化することができる。アシル化試薬及び反応条件を変化させることによって、その実行者は、アミノ基が再アシル化される度合いを制御することができる。そのアシル化試薬及びそれらの崩壊産物は、再アシル化されたポリサッカライドと比較して大きさが小さく、従って、サイズ排除法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー又は膜濾過によってポリサッカライドから分離することができる。別法では、極性又は電荷の違いを、クロマトグラフィーに生かしてポリサッカライドを精製することができる。
いくつかの実施形態において、再アシル化したポリサッカライドは、クロマトグラフ精製又は膜濾過を用いて精製することができる。例えば、イオン交換(カチオン又はアニオン)、疎水性相互作用、親水性相互作用、ゲル浸透クロマトグラフィー、ダイレクトフロー濾過、又は接線流濾過は、すべて、再アシル化ポリサッカライドの反応成分からの分離を達成するために使用することができる。典型的な方法は、スーパーデックス(Superdex)(架橋したアガロース及びデキストラン)に基づくゲル浸透クロマトグラフィー又は残留混入物質を除去し、精製ポリサッカライドを提供する限外濾過膜による接線流濾過のいずれかを利用する。Superdexに基づくゲル浸透クロマトグラフィーを利用するいくつかの実施形態において、そのクロマトグラフィーは、溶離剤としてPBSを用いて、0.1mL/分〜10mL/分であり得る流速で、デキストランに対して1,000〜100,000分別範囲(MW)を有するSuperdex 200PGを使用することができる。接線流濾過を利用するいくつかの実施形態において、限外濾過膜は、例えば、5kDa〜100kDa(例えば、5kDa〜50kDa、又は5kDa〜30kDa)のMWCOを有するものを使用することができる。
精製したポリサッカライドの純度の程度は、修正マイクロスケールオルシノールアッセイ(非特許文献35)により評価された乾燥組成物中のシアル酸の重量百分率によって測定される。いくつかの実施形態において、精製ポリサッカライドの純度は、80%〜100%である。典型的な純度としては、85%〜100%、90%〜100%、94%〜100%、95%〜100%、及び99%以上が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリサッカライドは、グラム陰性及びグラム陽性細菌を含む様々な微生物に対する抗体応答を、個体中で、単独、又は別の免疫原性分子、例えばポリペプチド又は複数の担体タンパク質、単数の担体タンパク質に結合している場合のいずれかで引き出すために使用することができる。ポリサッカライドのポリペプチドへの結合は、一般的にはT細胞非依存性ポリサッカライドに対する免疫応答をT細胞依存性ポリサッカライドに転化する。従って、ポリペプチドの大きさは、T細胞非依存性からT細胞依存性への応答の転化を引き起こすのに十分なものが好ましい。第2の免疫原を提供するためには小さめのポリペプチドを使用することが役立つ。
いくつかの実施形態において、ポリサッカライドワクチンを製造することができる。そのポリサッカライドは上記の方法によって精製することができる。これらのポリサッカライドは、ポリサッカライドに対して反応性であり従ってそのポリサッカライドが単離された有機体に対して反応性である抗体を発生する抗原として使用することができる。より具体的には、これらの実施形態は、例えば、ヒト又は動物を、一般的には当該ポリサッカライドが単離された、細菌、酵母菌、又は原虫の菌株による感染に対して保護することができる、単独での又はポリペプチドに結合したポリサッカライドワクチンの製品を提供する。ある場合には、本発明で使用されるポリサッカライドは、他の病原性微生物と交差反応性である抗体の産生を誘発することができ、それによってこれらの他の微生物による感染に対する保護を生み出す。ある場合には、本発明によるポリサッカライドの使用は、癌の治療又は予防に役立ち得る。
上に記載したポリサッカライドの加水分解及び分離の技術は、本発明の単離したポリサッカライドの大量生産を提供する。これは、ポリサッカライドに対して反応性の抗体の発生を促進する。本発明の1つの実施形態は、抗体の産生を引き出すことができる実質的に純粋な又は単離されたポリサッカライドを産生するための方法を提供する。使用するポリサッカライドに応じて、得られる抗体は、殺菌性、静菌性、殺真菌性、又は殺原虫性であり、抗体応答を引き出すために用いたポリサッカライドと交差反応性である抗体を含有する微生物による感染に対して動物を保護するものであり得る。
本発明の医薬品組成物は、ポリサッカライド又はポリサッカライドと薬理学的に許容される担体、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどを含む結合分子を含むことができる。別の実施形態において、前記医薬品組成物は、別の免疫原性部分、例えば、ペプチドなど、又は本発明のポリサッカライドの1つによって誘発される抗体を含む組成物を含む。前記医薬品組成物は、また、レシピエントの免疫応答を高めるアジュバントを含むこともできる。かかるアジュバントは、ミョウバン等のアルミニウム系又はステアリルチロシン等の長鎖アルキルアジュバントであり得る(1990年9月17日出願の米国特許第5773007号、欧州特許第0549617131号、Moloneyらの米国特許第4258029号参照)。Jenningsら(米国特許第5683699号)及びPaolettiらの(非特許文献58)も参照されたい。これらの医薬品組成物は、ワクチンとして特に有用である。
別の実施形態において、本発明のポリサッカライド、それらの誘導体、又はフラグメントは、ニューモリシン毒素等の毒素は受け入れないが、グラム陰性又はグラム陽性細菌、或いはその他の微生物に対して向けられた抗体の存在を依然として示すことができるより安全な診断キットを産生するために使用することができる。かかる抗体の存在により、病原体にさらす前に示すことができ、感染に抵抗力があり得る個体を予測することができる。この診断キットは、少なくとも1つの本発明のポリサッカライド、それらの誘導体、又はフラグメント、及び変性したポリサッカライド、それらの誘導体、又はフラグメントが、グラム陰性又はグラム陽性細菌、又はその他の微生物に対して向けられた抗体を含有する試料と混合されるときの抗体反応の検知のための適当な試薬を含むことができる。抗体反応は、以下に限定されないが、ELISA、蛍光発光、比色分析、化学発光、又は電気化学発光アッセイを含む技術的に記載されている任意の方法によって同定することができる。かかる知見は重要であり、例えば、不必要なワクチン接種を避けることができる。
以下の実施例は本発明を説明するために提供するが、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。多くの変更及び置換えを、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができることを、当業者であれば認識するであろう。
Ib型B群連鎖球菌菌株H36b(ATCC12401)を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ロックビル、メリーランド州)から入手した。使用したその他の菌株、090(Ia型)、18RS21(II型)、M781(III型)、及びCJ11(V型)は、ハーバード・メディカル・スクール(Harvard Medical School)のD.L. Kasperにより、快く提供された。髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)B、C、Y及びW135型は、FDA生物製剤評価センター(CBER, FDA)でCarl Fraschにより快く提供され、大腸菌(Escherichia coli)KIは、FDA生物製剤評価センターでWillie Vannにより快く提供された。
ポリサッカライドの絶対モル質量分布は、インライン多角度レーザー光散乱光度計及び示差屈折による検出を備えた分析用ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC−MALLS/RI)により測定した。この方法は、Jasco社製PU−980HPLCポンプ(イーストン、メリーランド州)、Rheodyne社製モデル7125噴射弁(Cotati、カリフォルニア州)、及びPBSと平衡しており、0.5mL/分の流速のSuperose 6HR 10/30カラムからなる液体クロマトグラフィーシステムに基づいて実施した。移動相は、超純水(Stephens Scientific社製、リバデール、ニュージャージー州)中で調製し、MilliporeタイプGVの0.22mm膜を装着した直径25mmのインラインフィルター(Millipore社製)を通して濾過した。ポリサッカライドの試料(1〜2mg)は、移動相中に10mg/mLの濃度で溶解し、得られた溶液を微小遠心分離機中14,000rpmで2〜3分間にわたり遠心分離して注入前に粒子状物質を除去した。カラム流出液は、Hewlett-Packard社製モデル1047A示差屈折計に連結しているインラインのDawn E eighteen角光散乱光度計(Wyatt Technology Corp.社製、サンタバーバラ、カリフォルニア州)により直接分析した。その屈折計のアナログ信号出力を補助入力チャネルを介してそのDOWN Eと接続した。光散乱データを獲得し、Wyatt's ASTRA 4.73.40ソフトウェアにより処理した。ピーク面積を、そのWyattソフトウェアにより、ピークの全範囲にわたって、200〜300の台形部分、又は「スライス」の面積の合計として計算した。従って得られたその面積から、所与のピークで溶離するポリサッカライドの重量平均及び数平均モル質量(それぞれ、Mw及びMn)を計算した。比屈折率増分(dn/dc)を0.141mL/gであるすべてのポリサッカライドについてオンラインHP 1047A屈折計を用いて測定した。この値は、他のポリサッカライドについて以前に得られた値(非特許文献7、8、40)と肩を並べた。
D2O(Aldrich社製)中のポリサッカライド試料(4〜5mg/mL)の一次元1H NMRスペクトルを、Bruker Instruments社製AMX 500スペクトロメーター(ビルリカ、マサチューセッツ州)により500MHzで記録した。スペクトルデータは、50℃で取得し、化学シフトは、D2O中の外部の3−トリメチルシリルプロピオネートスルホン酸(Aldrich社製)を参照する。
ステップの収量及び最終の精製試料の内容は、シアル酸定量分析に対する改良されたレゾルシノールアッセイ(非特許文献59)によって測定した。簡潔に記せば、5〜50μgのN−アセチルノイラミン酸(NeuAc)標準又は50μg/mLの莢膜ポリサッカライドを含有する1mLの試料又は対照に、1mLのレゾルシノール試薬(2%レゾルシノール溶液、0.25mLの0.1M CuSO4溶液、10mLの脱イオン水、濃HClで100mLの量にする)を加えた。試料をよく混合し、加熱ブロック(VWR)中110℃で25分間加熱した。試料を氷水中で5分間冷却した後、各試料に2mLの加水分解溶液(酢酸ブチルブタノール[85/15(v/v)])を加えた。各試料の有機相からの1mL部分を、石英のキュベットに移し、Shimadzu社製のUV160U、UV−可視記録分光光度計の580nmのところを読み取った。最終のポリサッカライド製剤の純度は、以下の式量:末端NeuAc残基に対しては309g/モル、GBSのIa、Ib型、又はIII型CPSの繰返し単位に対しては1004g/モル、GBSのII型又はV型CPSの繰り返し単位に対しては1328g/モルを用いてシアル酸含量から算出した。
(B群連鎖球菌(GBS)莢膜ポリサッカライドの加水分解及び単離)
図1は、この実施例で使用される本発明の実施形態の実験概略図を示す。
750mLの1N NaOHを、前に述べた遠心分離ステップの直後の75gのGBS細胞ペーストに加え、細胞懸濁液を形成した。内容物を、2Lのビンに移し、100mgの水素化ホウ素ナトリウムをその細胞懸濁液に任意的に加えた。その反応混合物を37℃で16時間125rpmで震盪した。
一晩置いた細胞溶解物を、脱イオン(DI)水で10倍に希釈し、0.1Nの最終NaOH濃度とした。その希釈した細胞溶解物を、表面積が2000cm2の0.1gmのポリエーテルスルホン中空繊維フィルターモジュールを用いる精密濾過によって透明にした。その精密濾過モジュールをDI水を流して洗浄して残った貯蔵溶液を除去し、次いで、浸透ラインを閉じて希釈された細胞溶解物を10分間再循環させることにより平衡させた。その精密濾過は、一定の供給速度及び浸透速度で実施した。浸透液(出発容積の約90%)の収集に続いて、フィルターを2回1Lの生理食塩水で洗浄し、未透過液中のポリサッカライドを回収した。
30kDaの未透過液に5NのNaOHを加え、2N NaOHの最終濃度を達成した。ポリサッカライドを80℃で16〜18時間さらに抽出した後、その混合物を50℃未満まで冷却し、10LのDI水中に注いだ。
水酸化ナトリウム並びに小さい分子量の不純物を、30kDa MWCOのポリエーテルスルホン(Biomax社製)膜による一定容積のダイアフィルトレーションにより、5Lの1M NaCl及び20LのDI水によって除去し、次に、30kDa MWCOのBiomax膜を装着した実験室規模のTFF装置により約70mLの最小容積まで濃縮した。
先に記した加水分解条件にポリサッカライドをさらすことにより、ポリサッカライドからN−アセチル基が放出されるために、無水酢酸(Aldrich Chemical Co.社製、ミルウォーキー、ウィスコンシン州)を、そのプールした部分に0.8Mの最終濃度まで滴下して加えることにより、そのポリサッカライドを再N−アセチル化した。この反応混合物を室温で1時間撹拌し、5NのNaOHを添加してpH9を維持した。その反応物のpHを次に13まで上げ、反応をさらに90分間続けた。その反応物のpHを、次に6Nの塩酸によりpH8に調整した。
再N−アセチル化した莢膜ポリサッカライドを含有するその溶液を、30kDa MWCOのBiomax限外濾過膜を装着した実験室規模のTFF装置により、5Lの0.9%NaClに対してほぼ70mLの最小容積までダイアフィルターにかけた。その精製した莢膜ポリサッカライドを、次に−70℃で冷凍保存するか、又は、下流部門の用途、例えば、抗体、医薬品組成物、診断キット、結合分子、及びワクチンの産生のために利用した。
1.精製莢膜ポリサッカライドの収量
表1は、実施例1の方法又はMichonらの米国特許第6248570号に記載の「1ステップの加水分解法」のいずれかを用いて得られた様々なBGS血清型の莢膜ポリサッカライド収量の比較を示す。すべての血清型について、莢膜ポリサッカライドは細胞ペレットから精製した。1ステップ法と比較して、本発明の方法は、試験した5個の血清型の4個の血清型に対してより大きい収量を生じた。
検討したB群連鎖球菌血清型のそれぞれについて、260nmにおける直接のUV測光によって検出した核酸濃度は、0.5質量%を超えなかったが、Bradford法(非特許文献9)によってアッセイしたタンパク質は、<1質量%であった(表2)。すべてのポリサッカライドの純度は、改良レゾルシノールアッセイ(非特許文献36)により推定したそれらのシアル酸含量から計算して、約100%であった。本発明の方法及び1ステップの加水分解法の両方によって得られたすべてのポリサッカライド製剤に対して、測光データは、両方の方法ともタンパク質又は核酸による汚染が最小限の高純度の莢膜ポリサッカライドを産生することを示す。
別々の分析において、ポリサッカライドの絶対モル質量分布を、GPC−MALLS/RIにより測定した。この方法は、流速及び保持容量のようなクロマトグラフのパラメーターとは関係なく、且つ流体力学的性質が興味のある検体から大きく異なり得る二次標準物質を必要とすることなく、巨大分子のモル質量を直接推測することを可能にする。キャラクタリゼーション法としてのGPC−MALLS/RIの有用性は、医薬品として興味のあるポリサッカライドに対して十分に確立されている(非特許文献7、8、10、17、25)。モル質量分布は、重量平均モル質量(Mw)として通常は示される(表2)。
(Y群髄膜炎菌莢膜ポリサッカライドの加水分解及び単離)
図2は、この実施例で使用される本発明の実施形態の実験概略図を示す。
750mLの1N NaOHを、細胞をペレット化した遠心分離ステップの直後の75gのGYM細胞ペーストに加えた。内容物を、2Lのビンに移し、100mgの水素化ホウ素ナトリウムをその細胞懸濁液に加えた。その反応混合物を37℃で16時間〜18時間125rpmで震盪した。
一晩置いた細胞溶解物を、脱イオン(DI)水で10倍に希釈し、約0.1Nの最終NaOH濃度とした。その希釈した細胞溶解物を、表面積が2000cm2の0.1μmのポリエーテルスルホン中空繊維フィルターモジュールを用いる精密濾過によって透明にした。その精密濾過モジュールをDI水を流して洗浄して残った貯蔵溶液を除去し、次いで、浸透ラインを閉じて希釈された細胞溶解物を10分間再循環させることにより平衡させた。その精密濾過は、一定の供給速度及び浸透速度で実施した。浸透液(出発容積の約90%)の収集に続いて、フィルターを2回1Lの生理食塩水で洗浄し、未透過液中のポリサッカライドを回収した。
100kDaの未透過液に5NのNaOHを加え、2N NaOHの最終濃度を達成した。ポリサッカライドを80℃で48時間さらに抽出した後、その混合物を50℃未満まで冷却し、10LのDI水中に注いだ。
GYMPの精製については、いくらかの大きいタンパク質(300kDaを超える大きさ)が、加水分解ステップによる分解に対して耐性を示すことが分かった。これらのタンパク質を除去するために、第2の加水分解ステップからの混合物を、Millipore Pellicon限外濾過装置(UF)の300kDa MWCOの膜にかけた。その透過液を、次にMillipore Pellicon限外濾過装置(UF)の5kDa MWCOの膜により約1Lに濃縮した。その膜組成は、ポリエーテルスルホン(Biomax社製)である。一定容積を、最初に5Lの1M NaCl及び次に20LのDI水によりダイアフィルターにかけた。濃縮及びダイアフィルトレーションステップの後、その限外濾過未透過液を、5kDa MWCOのBiomax膜を装着した実験室規模の接線流濾過(TFF)装置(Millipore社製)により約70mLに濃縮した。
先に記した加水分解条件にポリサッカライドをさらすことにより、ポリサッカライドからN−アセチル基が放出されるために、無水酢酸(Aldrich Chemical Co.社製、ミルウォーキー、ウィスコンシン州)を、そのプールした部分に0.8Mの最終濃度まで滴下して加えることにより、そのポリサッカライドを再N−アセチル化した。この反応混合物を室温で1時間撹拌し、5NのNaOHを添加してpH9を維持した。その反応物のpHを次に13まで上げ、反応をさらに90分間続けた。その反応物のpHを、次に6Nの塩酸によりpH8に調整した。
再N−アセチル化した莢膜ポリサッカライドを含有するその溶液を、5kDa MWCOのBiomax限外濾過膜を装着した実験室規模のTFF装置により、5Lの0.9%NaClに対してほぼ70mLの最小容積までダイアフィルターにかけた。その精製した莢膜ポリサッカライドを、次に−70℃で冷凍保存したが、或いは、下流部門の用途、例えば、抗体、医薬品組成物、診断キット、結合分子、及びワクチンの産生のために利用することもできる。
1.Y群髄膜炎菌莢膜ポリサッカライドの収量
上記の方法を用いる精製Y群髄膜炎菌莢膜ポリサッカライドのおおよその収量は、1リットルの細菌培養液当り12mgであった。
精製GYM莢膜ポリサッカライドの一次元1H NMR分光分析は、非常に低い水準の汚染を示した。図4は、D2O中50℃で記録された精製GYM莢膜ポリサッカライドのNMRスペクトル(500MHz)を示す。直接の260nmでのUV測光により検出された核酸のレベルは、2.46質量%であり、一方Bradford法(非特許文献9)によりアッセイしたタンパク質は、このアッセイの検出の下限(1μg/mL)の上の検出できるものではなかった。最終精製物の純度は、改良型マイクロスケールオルシノールアッセイ(非特許文献35)により推測されるシアル酸含量により計算し、94%であった。従って、スペクトル及び測光データは、本発明の加水分解及び単離の方法が、タンパク質又は核酸による汚染が最低限である高純度のGYM莢膜ポリサッカライドを可能にすることを示す。
(W−135群髄膜炎菌莢膜ポリサッカライドの加水分解及び単離)
図3は、この実施例で使用される本発明の実施形態の実験概略図を示す。
750mLの1N NaOHを、細胞をペレット化した遠心分離ステップの直後の75gのW−135群髄膜炎菌(GWM)細胞ペーストに加えた。内容物を、2本の2Lのビンに移し、100mgの水素化ホウ素ナトリウムをその細胞懸濁液に加えた。その反応混合物を37℃で16時間〜18時間150rpmで震盪した。
一晩置いた細胞溶解物を、脱イオン(DI)水で10倍に希釈し、約0.1Nの最終NaOH濃度とした。その希釈した細胞溶解物を、表面積が2000cm2の0.2μmのポリエーテルスルホン中空繊維フィルターモジュールを用いる精密濾過によって透明にした。その精密濾過モジュールをDI水を流して洗浄して残った貯蔵溶液を除去し、次いで、浸透ラインを閉じて希釈された細胞溶解物を10分間再循環させることにより平衡させた。その精密濾過は、一定の供給速度及び浸透速度で実施した。浸透液(出発容積の約90%)の収集に続いて、フィルターを2回1Lの生理食塩水で洗浄し、未透過液中のポリサッカライドを回収した。
100kDaの未透過液に5NのNaOHを加え、2N NaOHの最終濃度を達成した。ポリサッカライドを80℃で一晩さらに抽出した後、その混合物を50℃未満まで冷却し、10LのDI水中に注いだ。
W−135群髄膜炎菌ポリサッカライド(GWMP)の精製については、いくらかの大きいタンパク質(300kDaを超える大きさ)が、加水分解ステップによる分解に対して耐性を示した。これらのタンパク質を除去するために、第2の加水分解ステップからの混合物を、Millipore Pellicon限外濾過装置(UF)の300kDa MWCOの膜にかけた。その透過液を、次にMillipore Pellicon限外濾過装置(UF)の30kDa MWCOのポリエーテルスルホン(Biomax社製)膜により約1Lに濃縮した。一定容積を、最初に5Lの1M NaCl及び次に20LのDI水によりダイアフィルターにかけた。濃縮及びダイアフィルトレーションステップの後、その限外濾過未透過液を、30kDa MWCOのBiomax膜を装着した実験室規模の接線流濾過(TFF)装置(Millipore社製)により約70mLに濃縮した。
先に記した加水分解条件にポリサッカライドをさらすことにより、ポリサッカライドからN−アセチル基が放出されるために、無水酢酸(Aldrich Chemical Co.社製、ミルウォーキー、ウィスコンシン州)を、そのプールした部分に0.8Mの最終濃度まで滴下して加えることにより、そのポリサッカライドを再N−アセチル化した。この反応混合物を室温で1時間撹拌し、5NのNaOHを添加してpH9を維持した。その反応物のpHを次に13まで上げ、反応をさらに90分間続けた。その反応物のpHを、次に6Nの塩酸によりpH8に調整した。
再N−アセチル化した莢膜ポリサッカライドを含有するその溶液を、30kDa MWCOのBiomax限外濾過膜を装着した実験室規模のTFF装置により、5Lの0.9%NaClに対してほぼ70mLの最小容積までダイアフィルターにかけた。その精製した莢膜ポリサッカライドを、次に−70℃で冷凍保存したが、或いは、下流部門の用途、例えば、抗体、医薬品組成物、診断キット、結合分子、及びワクチンの産生のために利用することもできる。
1.W−135群髄膜炎菌莢膜ポリサッカライドの収量
上記の方法を用いる精製W−134群髄膜炎菌莢膜ポリサッカライドのおおよその収量は、1リットルの細菌培養液当り25.4mgであった。
直接の260nmでのUV測光により検出された核酸のレベルは、0.40質量%であり、一方Bradford法(非特許文献9)によりアッセイしたタンパク質は、このアッセイの検出の下限(1μg/mL)の上の検出できるものではなかった。最終精製物の純度は、改良型マイクロスケールオルシノールアッセイ(非特許文献35)により推測されるシアル酸含量により計算し、95%であった。従って、上記測光データは、本発明の加水分解及び単離の方法が、タンパク質又は核酸による汚染が最低限である高純度のGWM莢膜ポリサッカライドを可能にすることを示す。
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Claims (52)
- ポリサッカライド及び細胞成分を含むストックから前記ポリサッカライドを精製する方法であって、
前記ストックを第1の試薬と接触させて第1の混合物を形成するステップ(前記第1の試薬は、塩基であり、前記第1の混合物のpHは、9〜15の範囲である)と、
前記ポリサッカライドを前記細胞成分の少なくとも一部から分離して前記ポリサッカライドと前記細胞成分の残量とを含む分離された組成物を形成するステップと、
前記分離された組成物を第2の試薬と接触させて第2の混合物を形成するステップ(前記第2の試薬は塩基であり、前記第2の混合物のpHは、9〜15の範囲である)と、
前記細胞成分の前記残量の少なくとも一部から前記ポリサッカライドを精製して、精製した組成物を形成するステップと
を含む方法。 - 精製ステップの前にさらなる接触ステップ及び分離ステップが実施される、請求項1に記載の方法。
- ポリサッカライドが、N−アセチル基を含有し、これらのN−アセチル基の少なくとも一部が第2の試薬による処理によって加水分解される、請求項1又は2に記載の方法。
- 加水分解されたポリサッカライド上に存在する一定割合のN−アセチル基が、未変性ポリサッカライドの免疫特性を維持するためにそのとき十分に再アシル化される、請求項3に記載の方法。
- 精製したポリサッカライドをアシル化試薬と接触させるステップと、前記アシル化ポリサッカライドを精製するステップとをさらに含む、請求項3又は4に記載の方法。
- アシル化試薬が、無水酢酸、塩化アセチル、ペンタフルオロフェニル酢酸又は4−ニトロフェニル酢酸である、請求項5に記載の方法。
- 第1の試薬及び第2の試薬の少なくとも1つが有機塩基を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 第1の試薬及び第2の試薬の少なくとも1つが無機塩基を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 無機塩基が、NaOH、KOH又はLiOHを含む、請求項8に記載の方法。
- 第1の試薬が、還元剤を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 還元剤が、NaBH4、NaCNBH3、リチウムトリ−sec−ブチルボロヒドリド、NaBH(OCOCH3)3、リチウムアルミニウムヒドリド、ジチオスレイトール、及びβ−メルカプトエタノールから選択される、請求項10に記載の方法。
- 第1の混合物のpHが、約9から約13である、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 第2の混合物のpHが、約11から約14である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 第1の試薬が、約1NのNaOH及びNaBH4を含み、第2の試薬が、約2NのNaOHを含む、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 細胞成分が、タンパク質及び核酸を含み、前記細胞成分の起源は微生物であり、第1の混合物が、ポリサッカライドの前記細胞成分との直接又は間接の付着を提供する1つ又は複数の結合を加水分解し、第2の混合物が、タンパク質及び核酸を分解する、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドの分離が、クロマトグラフィーによるものである、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドの分離が、膜濾過によるものである、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドの精製が、クロマトグラフィーによるものである、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドの精製が、膜濾過によるものである、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドが、リポポリサッカライドである、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドが、莢膜ポリサッカライド、被膜下ポリサッカライド、又はエキソポリサッカライドである、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライドが、連鎖球菌属のいずれかの細菌に由来する、請求項21に記載の方法。
- ポリサッカライドが、B群連鎖球菌莢膜ポリサッカライドである、請求項22に記載の方法。
- B群連鎖球菌莢膜ポリサッカライドが、B群連鎖球菌Ia型、Ib型、II型、III型、V型、VI型、又はVIII型に由来する、請求項23に記載の方法。
- ポリサッカライドが、A群連鎖球菌又はC群連鎖球菌被膜下ポリサッカライドである、請求項21に記載の方法。
- ポリサッカライドが、ナイセリア属のいずれかの細菌に由来する、請求項21に記載の方法。
- ポリサッカライドが、髄膜炎菌B型、C型、Y型又はW−135型に由来する莢膜ポリサッカライドである、請求項26に記載の方法。
- 莢膜ポリサッカライドが、髄膜炎菌Y型に由来する、請求項27に記載の方法。
- 莢膜ポリサッカライドが、髄膜炎菌W−135型に由来する、請求項27に記載の方法。
- ポリサッカライドが、肺炎球菌に由来する莢膜ポリサッカライドである、請求項21に記載の方法。
- 莢膜ポリサッカライドが、肺炎球菌3型又は14型に由来する、請求項30に記載の方法。
- ポリサッカライドが、大腸菌属のいずれかの細菌に由来する莢膜ポリサッカライドである、請求項21に記載の方法。
- 莢膜ポリサッカライドが、大腸菌K1に由来する、請求項32に記載の方法。
- 精製したポリサッカライドをアシル化試薬と接触させるステップと、前記アシル化したポリサッカライドを精製するステップとをさらに含み、
第1の試薬が、還元剤及び塩基を含み、前記塩基が、NaOH、KOH、及びLiOHから選択され、
第2の試薬が、NaOH、KOH、及びLiOHから選択される塩基を含み、
ポリサッカライドを分離するステップが、限外濾過膜による接線流濾過の使用を含む膜濾過によるものであり、
ポリサッカライドを精製するステップが、限外濾過膜による接線流濾過の使用を含む膜濾過によるものであり、
前記アシル化試薬が、無水酢酸である、
請求項4に記載の方法。 - 精製したポリサッカライドが、約5質量%未満の核酸及び約5質量%未満のタンパク質を含有する、請求項1〜34のいずれかに記載の方法。
- 精製したポリサッカライドが、約1質量%未満の核酸及び約1質量%未満のタンパク質を含有し、精製したポリサッカライドの純度が、80%〜100%である、請求項35に記載の方法。
- 精製したポリサッカライドの純度が、90%〜100%である、請求項36に記載の方法。
- 分離された組成物を第2の試薬と接触させる間の最高温度が、ストックを第1の試薬と接触させる間の最高温度より30℃〜90℃高い、請求項1〜37のいずれかに記載の方法。
- ポリサッカライド及び細胞成分を含むストックから前記ポリサッカライドを精製する方法であって、
前記ストックを第1の試薬と接触させて第1の混合物を形成するステップ(前記第1の試薬は、塩基及び還元剤を含み、前記第1の混合物のpHは、9〜15の範囲である)と、
前記ポリサッカライドを前記細胞成分の少なくとも一部から分離して前記ポリサッカライドと前記細胞成分の残量とを含む分離された組成物を形成するステップと、
前記分離された組成物を第2の試薬と接触させて第2の混合物を形成するステップ(前記第2の試薬は塩基であり、前記第2の混合物のpHは、9〜15の範囲である)と、
前記細胞成分の前記残量の少なくとも一部からポリサッカライドを精製して、精製した組成物を形成するステップと、
前記精製したポリサッカライドを回収するステップと
を含む方法。 - 還元剤が、NaBH4、NaCNBH3、リチウムトリ−sec−ブチルボロヒドリド、NaBH(OCOCH3)3、リチウムアルミニウムヒドリド、ジチオスレイトール、及びβ−メルカプトエタノールから選択される、請求項39に記載の方法。
- ポリサッカライドの分離が、膜濾過によるものである、請求項39又は40に記載の方法。
- 膜濾過が、限外濾過膜による接線流濾過の使用を含む、請求項41に記載の方法。
- ポリサッカライド結合型ワクチンを製造する方法であって、
請求項1〜38のいずれかに記載の方法の使用によって精製したポリサッカライドを得るステップと、
前記精製したポリサッカライドをポリペプチドに結合し、それによってポリサッカライド結合型ワクチンを製造するステップと
を含む方法。 - ポリサッカライド結合型ワクチンを製造する方法であって、
請求項39〜42のいずれかに記載の方法の使用によって精製したポリサッカライドを得るステップと、
前記精製したポリサッカライドをポリペプチドに結合し、それによってポリサッカライド結合型ワクチンを製造するステップと
を含む方法。 - 結合が、還元的アミノ化によって達成される、請求項43又は44に記載の方法。
- ポリペプチドが、担体タンパク質、スカシガイヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)、ウサギ血清アルブミン(RSA)、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ニューモリソイド、外膜タンパク質、ウイルス糖タンパク質、並びにそれらのフラグメント、変異体、及び模倣体から選択される、請求項43〜45のいずれかに記載の方法。
- ポリペプチドが破傷風毒素フラグメントC(TTc)である、請求項46に記載の方法。
- ポリペプチドが組換え型破傷風毒素のフラグメントC(rTTc)である、請求項46に記載の方法。
- アジュバントを添加するステップをさらに含む、請求項43〜48のいずれかに記載の方法。
- アジュバントが、ミョウバン、水酸化アルミニウム、ステアリルチロシン、フロイント、OS21、MPL、MF59、トール様受容体アゴニスト、及びCD14受容体アゴニストから選択される、請求項49に記載の方法。
- 精製したプロテアーゼを含む試薬を使用しないで行われる、請求項1〜50のいずれかに記載の方法。
- 精製したヌクレアーゼを含む試薬を使用しないで行われる、請求項1〜51のいずれかに記載の方法。
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