HU219672B

HU219672B - Eljárás egy patogén ágensből nyert antigén poliszacharidból származó oligoszacharid előállítására

Info

Publication number: HU219672B
Application number: HU9301682A
Authority: HU
Inventors: Monique Moreau
Original assignee: Pasteur Merieux Serums Et Vaccins S.A.
Priority date: 1991-10-10
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 2001-06-28
Also published as: JPH06506233A; HUT70298A; FI932626A0; CA2098105C; NO932102L; ES2174839T3; DE69232585D1; AU2946992A; ATE217015T1; NO306905B1; CA2098105A1; FI932626A; DE69232585T2; FI110164B; AU661071B2; KR930703362A; US6045805A; FR2682388B1; KR100249709B1; DK0562107T3

Abstract

A találmány tárgya eljárás oligoszacharid előállítására egy patogénágensből nyert antigén poliszacharidnak depolimerizációjával, ahol azantigén poliszacharid ismétlődő egységei legalább egy labilis kémiaifunkciós csoportot tartalmaznak, és ahol az eljárás során az ismétlődőegység szerkezete a labilis kémiai funkciós csoporttal együttmegmarad, ahol a funkciós csoport jellemzője, hogy amennyibenultrahangos, savas vagy bázisos depolimerizálásnak vetik alá apoliszacharidot, akkor az olyan változásokat szenved, melynek hatásáraaz antigénjelleg elveszik oly módon, hogy (i) az említettpoliszacharidot oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciónak vetikalá, (ii) az így kapott oligoszacharidot kinyerik, és (iii) kívántesetben a) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy konjugációspartnerrel vagy hordozóval kapcsolják, és így az oligoszacharidotkonjugátumként vagy hordozóhoz kovalens kötéssel kapcsolt formábankapják, vagy b) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy vektorbaépítik be. A találmány tárgya továbbá gyógyászati készítmény, melylegalább egy, a fentiek szerint előállított oligoszacha- ridottartalmaz. ŕ

Description

KIVONAT

A találmány tárgya eljárás oligoszacharid előállítására egy patogén ágensből nyert antigén poliszacharidnak depolimerizációjával, ahol az antigén poliszacharid ismétlődő egységei legalább egy labilis kémiai funkciós csoportot tartalmaznak, és ahol az eljárás során az ismétlődő egység szerkezete a labilis kémiai funkciós csoporttal együtt megmarad, ahol a funkciós csoportjellemzője, hogy amennyiben ultrahangos, savas vagy bázisos depolimerizálásnak vetik alá a poliszacharidot, akkor az olyan változásokat szenved, melynek hatására az antigénjelleg elveszik oly módon, hogy (i) az említett poliszacharidot oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciónak vetik alá, (ii) az így kapott oligoszacharidot kinyerik, és (iii) kívánt esetben

a) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy konjugációs partnerrel vagy hordozóval kapcsolják, és így az oligoszacharidot konjugátumként vagy hordozóhoz kovalens kötéssel kapcsolt formában kapják, vagy

b) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy vektorba építik be.

A találmány tárgya továbbá gyógyászati készítmény, mely legalább egy, a fentiek szerint előállított oligoszacharidot tartalmaz.

HU 219 672 B

A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 6 lap ábra)

HU 219 672 Β

A jelen találmány tárgya egy patogén ágensből származó antigén poliszacharidból származó oligoszacharid, eljárás az oligoszacharid előállítására, valamint az oligoszacharid alkalmazása, főleg vakcinálóágensként.

A baktériumok, csakúgy mint a gombák, poliszacharidokat építenek be a felszíni struktúrájukba. Ezért a baktériumok legnagyobb részét egy természetes poliszacharidköpeny borítja, amely többé-kevésbé erősen kötődik a baktériumhoz, de amelyről nem mondhatjuk, hogy egy burok lenne. Ezt a kapszulát nevezik kapszulának vagy glikokalixnak. Emellett a Gram-negatív baktériumok külső membránja többek között lipopoliszacharidokat (LPS) is tartalmaz. Végezetül a poliszacharidok a gombák sejtfalában is előfordulhatnak. Ezek a poliszacharidok valójában felületi antigének, amelyek egy fertőzött állatban immunológiai választ indukálnak.

Ezek a poliszacharidok ismétlődő egységekből állnak, amelyekben az összetevők és a kötések definiálva vannak, és amelyek mindegyike jellemző a vizsgált gomba- vagy baktériumfajokra. Ezek az ismétlődő egységek epitópokat tartalmaznak, amelyek az antigenitást meghatározó struktúrák. Az illusztrálás céljából az 1. ábrán kapszuláris poliszacharidokból vagy lipopoliszacharidokból kapott, különböző típusú ismétlődő egységeket mutatunk be. Az ismétlődő egységek gyakran nagyon labilis fúnkciós csoportokat tartalmaznak, például foszfát fúnkciós csoportokat, amelyek a molekula vázában találhatók, vagy egy elágazó pozícióban, lehetnek például O-acetil- vagy piruvátcsoportok.

Egy poliszacharid valójában glikozidegységekből álló polimermolekulák kombinációja, amelyben a glikozidegységek mennyisége egyik molekuláról a másikra változik. Ennek következtében egy poliszacharidot a molekulatömeg szempontjából csak egy átlagos molekulatömeggel lehet leírni. Egy homopoliszacharid esetében a glikozidegységek monoszacharidok. Egy heteropoliszacharid esetében a glikozidegységek az alkotóelemek láncából állnak, amelyek előre meghatározott módon kapcsolódnak egymáshoz.

Ami egy poliszacharid átlagos molekulatömegét illeti, ezt gélszűréssel becsülhetjük meg. Ebben az esetben a molekulatömeget elúciós konstansban (K_D) vagy dextránekvivalensben (DEq) fejezhetjük ki, a Granath és munkatársai által közölt módszer szerint [J. Chrom., 28, 69 (1967)], amit az alábbiakban foglalhatunk össze.

Egy poliszacharidoldatot egy exklúziós-diffúziós gélkromatográfiás oszlopon elemzünk, amely az egyes elemeket a molekulatömegük alapján választja el. Ez a géltípus kereskedelmi forgalomban hozzáférhető, például Sephadex (Pharmacia), Biologia-Gel (Bio-Rad), Fractogel (Toyo-Soda), Sepharose (Pharmacia) és Sephacryl (Pharmacia) márkaneveken. A gél frakcionálási zónáját természetesen úgy kell beállítani, hogy illeszkedjen a vizsgálandó populációban található molekulatömegtartományhoz. Például azt állíthatjuk, hogy a Sepharose 2BCL, 4BCL és 6BCL gélszűrő oszlopok frakcionálási zónája, dextránekvivalensekben meghatározva a következő: 20 000 000-100 000, 5 000 000-20 000 és 1 000 000-10 000. Általában sóoldatot, például

0,2 mol/1 nátrium-kloridot használnak eluálószerként. Az elúciós konstanst az alábbi képlet alapján határozzuk meg:

Ve-Vo

Vt-Vo, ahol is

Ve jelentése a vizsgált preparátum elúciós térfogata; Vt jelentése az oszlop össztérfogata; Vo jelentése az oszlop holttérfogata.

Csak példaként említjük meg, hogy a 2a. és 2b. ábrák a Salmonella typhi és a Streptococcus pneumoniae 1-es típus poliszacharidjainak megfelelő elúciós profilokat láthatjuk Sepharose 4BCL oszlopon. A Salmonella typhi poliszacharidja ennélfogva olyan polimerekből áll, amelyekben a legmagasabb molekulatömegek nem becsülhetők meg Sepharose 4BCL oszlopon. Hasonlóképpen, az 1-es típusú Streptococcus pneumoniae poliszacharidja lényegében olyan polimerekből áll, amelyeknek a molekulatömege a nulla K_D-értéktől 0,45-ig változik. Definíció szerint, a poliszacharid átlagos elúciós konstansát azon az alapon becsüljük meg, hogy az elúciós profil iránytangenseinek a metszéspontja hol található; illetve durván az elúciós profil csúcsán. Tehát a 2a. és 2b. ábrákon bemutatott poliszacharidok átlagos elúciós konstansa nulla, illetve 0,04.

A dextrán felhasználásával készített kalibrációs sorozat felhasználásával egy elúciós konstans konvertálható DEq-ban kifejezett molekulasúllyá. Például a 3. ábrán egy kalibrációs sorozat eredményei láthatók.

Az antigéntulajdonságuk miatt a poliszacharidok, amelyek patogén ágensek, például baktériumok vagy gombák felszíni antigénjei, alkalmas jelölteknek látszanak vakcinaágensnek. Egy poliszacharidkivonatot tartalmazó vakcinák valóban hatékonyaknak bizonyultak felnőttekben. Ez azonban nem igaz fiatal gyerekekben. Abból a célból, hogy ezt a fő problémát leküzdjék, ezt követően azt javasolták, hogy a poliszacharidokat fehérjékhez kell kovalens kötésekkel kapcsolni, ezáltal az így kapott molekuláknak T-fúggő jellemzőt lehet biztosítani, és növelni lehet az immunogén tulajdonságait.

A poliszacharidalapú vakcinák között eddig megtalálhatók azok a vakcinák, amelyek a Neisseria meningitidis A, C, Y vagy W135 típusa, a Streptococcus pneumoniae, a Haemophilus influenzáé B típusa és a Salmonella typhi által okozott fertőzések ellen hatnak.

Jóllehet a patogén ágensek antigén poliszacharidjai potenciálisan előnyös immunogének, alkalmazásuk mégis nehéz, mert nagy az átlagos molekulatömegük, amely elérheti a több millió dextránekvivalens értéket is. Pontosabban, ha arra van szükség, hogy a poliszacharidokat konjugátum formájában használjuk, azaz egy fehéqéhez kapcsoljuk, olyan technikai problémákkal lehet találkozni, amelyeket nagyon nehéz megoldani. A kapcsolási folyamat során egy gél vagy egy összecsapzódott anyag keletkezhet, ezáltal a konjugátumot nagyon nehezen lehet szűréssel sterilezni.

Ennek az akadálynak a leküzdésére azt javasolták, hogy csökkenteni kell a poliszacharid méretét abból a célból, hogy könnyebb lehessen kezelni. Erre a célra különböző hasítási módszereket javasoltak. Ezek tehát jól ismert módszerek, például az ultrahangos tördelés,

HU 219 672 Β vagy a lúgos hidrolízis savas, bázikus vagy enzimatikus közegben. Azonban ezek a ffagmentálási módszerek távolról sem tökéletesek. Valójában túl gyakran okozzák a jellemző epitópok teljes vagy részleges tönkremenetelét, azáltal hogy elvesznek az antigénspecifitáshoz szükséges kémiai csoportok.

Azaz a Salmonella typhi vagy Neisseria meningitidis A csoport kapszuláris poliszacharid savas vagy alkalikus hidrolízise eltávolítja az acetilcsoportokat, amelyek a poliszacharid antigénspecifításához szükségesek. Továbbá az alkalikus hidrolízissel kapott fragmentek helyes reacetilezése nagyon nehéz, ha éppen nem lehetetlen.

Továbbá az alkalikus hidrolízissel végzett ffagmentációs módszerrel nem mindig lehetséges viszonylag homológ méretű fragmenteket előállítani, viszont a gyógyszer-előállítás gyakorlatában homogén, konstans és standardizált minőségű termékekre van szükség.

Az ultrahanggal végzett ffagmentálás esetében például azt mutatták ki, hogy a B típusú Haemophilus influenzáé poliszacharidjának terminális foszfátcsoportjai elvesznek az ultrahangos kezelés hatására. Ez vezethet ahhoz a félelemhez, hogy a poliszacharidláncok elágazó pozícióiban található foszfátcsoportok hasonlóképpen elvesznek az ilyen kezelés során.

Továbbá, jóllehet ultrahang alkalmazásával viszonylag homogén méretű fragmentek állíthatók elő, az elegendően kisméretű fragmentek előállítása az ultrahangos módszerrel nagyon hosszú kezelési időt igényel, ami egyéb hátrányok mellett, a berendezés gyors tönkremenetelét okozhatja. Ennek hatékonysága korlátozott, az ultrahang ipari méretekben való alkalmazását ki lehet zárni.

Végezetül a poliszacharidok enzimatikus depolimerizációjának alkalmazása olyan poliszacharidokra korlátozódik, amelyekhez a megfelelő enzimek ismertek. Ez a fő hátrány azonban az enzimeknek a szubsztrátjaikkal szemben mutatott erős specifitásának az egyenes következménye.

A vakcinális területen egy jelentős technikai és gazdasági előrelépéssel tehát ki lehetne fejleszteni egy depolimerizációs eljárást, amely már nem rendelkezik a jelenleg ismert eljárások különböző hátrányaival. Más szóval, az antigén poliszacharidok depolimerizációjához olyan eljárásra van szükség, amely az előnyös jellemzők kombinációjával rendelkezik, mivel:

- lehetővé teszi, hogy olyan oligoszacharidokat állítsunk elő, amelyek csökkentett számú glikozidegységet tartalmaznak, miközben megőrzik a ffagmentálandó poliszacharid legalább egy epitópjának lényeges szerkezeti determinánsait;

- lehetséges bármely elképzelhető antigénszerkezet előállításához használni;

- lehetővé teszi, hogy megfelelő mértékig homológ fragmenteket kapjunk, és

- költségei alacsonyak, és rendkívül egyszerű az alkalmazása.

Meglepő módon azt találtuk, hogy ezek a célok egy oxidációs-redukciós depolimerizációs reakcióval elérhetők.

Egészen mostanáig egy ilyen módszert, amelyet az angolban gyakran ORD-nek rövidítenek, használtak az olyan poliszacharidok, mint például a heparin, a hialuronsav, dextrán és a DNS ffagmentálására, ezáltal a jelen találmány céljaitól jelentős mértékben eltérő célokra használták. A cél az volt például, hogy csökkentsék a termék viszkozitását, vagy egy lineáris molekula, például a heparin esetében csökkentett méretű fragmenteket kapjanak, amelyekről ismert volt, hogy eltérő antikoaguláns aktivitással rendelkeznek. Természetesen, mivel ennek az eljárásnak a termékeinél nem volt fontos az immunogén tulajdonság, a kapott fragmentek ismétlődő egységeinek az integritásvizsgálatát nem végezték el.

Emellett számos korábbi publikáció ismert [K. Uchida, Carbohydrate Research, 173, 89-99 (1988); H. Uchiyama, Journal of Biological Chemistry, 265, 7753-7759 (1990); S. W. Green, The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry, IB, 1276 (1980); Kochetkov et al., Radiation Chemistry of Carbohydrates, Pergamon Press, Oxford (1979)], amelyekben az ORDreakciót úgy írják le, mint amely vagy a foszfátcsoportokat teszi tönkre, vagy a szénhidrátgyűrűket, azáltal, hogy a gyűrűk szén-szén kötéseit elhasítja.

Az az összbenyomás, amely a tudomány korábbi állásáról kialakult azt mutatja, hogy az ORD-reakciót általában roncsolóhatásúnak ismerik.

Ennélfogva semmi nem igazolta azt az elvárást, hogy az ORD jobb lenne, mint például a lúgos hidrolízist vagy ultrahangos kezelést alkalmazó eljárás, a megjelölt célok elérésére, azaz az epitópok megőrzésére.

Ennek megfelelően, a jelen találmány előtt soha nem igazolták, hogy lehetséges olyan oligoszacharidokat előállítani, amelyeknek a jellegzetes ismétlődő egységekből álló szerkezete megőrződött, a megfelelő poliszacharidok oxidációs-redukciós fragmentálásával, és ennek következtében használhatók olyan készítményekben aktív adalékanyagokként, amelyek az egyén immunrendszerének megerősödését képesek előidézni.

Azt mostanában fedezték fel, hogy lehetséges az ORD-módszert arra használni, hogy olyan oligoszacharidokat kapjanak, amelyek a kiindulási poliszacharidnak legalább egy antigén determinánsát megőrizték.

Azt is megfigyelték, hogy ha az oxidációs-redukciós depolimerizációs módszert antigén poliszacharidokra alkalmazták, akkor lehetséges volt, előnyös körülmények között, olyan fragmenteket előállítani, amelyek teljesen kielégítik a mérethomogenitással szemben támasztott követelményeket, annak ellenére, hogy az ismert, hogy az ORD-reakció egy szabad gyököket képző reakció, amely a poliszacharidot véletlenszerűen hasítja el.

Ennek következtében a találmány tárgya eljárás oligoszacharid előállítására egy patogén ágensből nyert antigén poliszacharidnak depolimerizációjával, ahol az antigén poliszacharid ismétlődő egységei legalább egy labilis kémiai funkciós csoportot tartalmaznak, és ahol az eljárás során az ismétlődő egység szerkezete a labilis kémiai funkciós csoporttal együtt megmarad, ahol a funkciós csoportjellemzője, hogy amennyiben ultrahan3

HU 219 672 Β gos, savas vagy bázisos depolimerizálásnak vetik alá a poliszacharidot, akkor az olyan változásokat szenved, melynek hatására az antigén jelleg elveszik, azzal jellemezve, hogy (i) az említett poliszacharidot oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciónak vetjük alá, (ii) az így kapott oligoszacharidot kinyerjük, és (iii) kívánt esetben

a) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy konjugációs partnerrel vagy hordozóval kapcsoljuk, és így az oligoszacharidot konjugátumként vagy hordozóhoz kovalens kötéssel kapcsolt formában kapjuk, vagy

b) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy vektorba építjük be.

A találmány szerinti eljárással előállított oligoszacharidot a továbbiakban „találmány szerinti oligoszacharidként” említjük.

Az „oligoszacharid” szakkifejezés alatt molekulák kombinációját értjük; mindegyik molekulában csökkent számú glikozidegység található a kiindulási poliszacharidhoz viszonyítva, és például 4-500 glikozidegységet tartalmaz.

Egy oligoszacharid átlagos molekulatömegét az előzőkben a poliszacharidokra leírt módon határozzuk meg. Általában egy, a találmány szerinti oligoszacharid átlagos elúciós konstansa Sepharose 4BCL oszlopon 0,2-1,0 közötti, előnyösen 0,3-0,9 között lehet, még előnyösebben 0,4-0,8 között, például 0,6-0,7 között. Más szóval, egy ilyen oligoszacharid átlagos molekulatömege 200 000 és 2000 DEq között van, illetve 150 000 és 10 000 között, pontosabban 60 000 és 30 000 DEq között.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az antigén poliszacharid egy felszíni antigén, amelyet egy patogén ágensből lehet előállítani, amely lehet gomba, illetve Gram-negatív vagy Gram-pozitív baktérium, főleg a Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia coli, Neisseria, Shigella vagy Haemophilus fajba tartozó.

A bakteriális patogén ágens lehet például Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi vagy Haemophilus influenzáé.

A gomba patogén ágens lehet élesztő, pontosabban a Candida, Cryptococcus, Hansenula, Lipomyces, Rhinocladiella és Rhodotorula fajokba tartozó.

A jelen találmány céljából egy oxidációs-redukciós reakciót hajtunk végre legalább egy oxidációs-redukciós rendszer jelenlétében, amelyet választhatunk például a tiolok közül, azaz lehet glutation, cisztein; lehet oxigén; hidrokinon, többértékű fémek ionjai, például vas és réz; aszkorbinsav, hidrogén-peroxid; ez utóbbi kettő a legelőnyösebb.

A különböző kísérleti paramétereket, amelyek befolyásolhatják a reakció kinetikáját (termékkoncentráció, pH, hőmérséklet, reakcióidő) a szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhatja a kiindulási poliszacharid jellemzői, a választott oxidációs-redukciós rendszer és a ffagmentek választott átlagos mérete alapján. Ha ezeket a fragmenteket főleg vakcinálási célra alkalmazzák, akkor a szakterületen jártas szakember különösen nagy figyelmet fordít arra, hogy a különböző paramétereket beállítsa, hogy ezzel a megfelelő átlagos méretű fragmenteket kapjon, azaz olyanokat, amelyek megőrzik a jó antigénhatást, és amelyek ha szükséges, akkor adaptálódnak a konjugátumok használatához; például az előzőkben leírt módon egy nagyságrenden belül marad a fragmentek mérete. Általánosságban, az optimális reakciókörülményeket rutinvizsgálatokkal lehet meghatározni. Vezérfonalként, azokat a kísérleti körülményeket, amelyek lehetővé teszik, hogy jó eredményeket kapjunk, az alábbi példákban specifikáljuk.

Azt a poliszacharidot, amelyet egy, a találmány szerinti eljárásnak akarunk alávetni, az ismert módszerekkel izolálhatjuk és tisztíthatjuk, pontosabban alkohollal vagy cetil-trimetil-ammónium-bromiddal kicsapva vagy gélszűréssel tisztítva. Ezeknek a módszereknek az összefoglalását megtalálhatjuk R. I. Whistler összefoglaló cikkében [Methods in Carbohydrate Chemistry, 1, 3-62 (1965)].

A poliszacharidot előnyösen 5 mg/ml-es koncentrációjú vizes oldatban állíthatjuk elő. Jelezzük, hogy az előnyös koncentráció értéke változhat 0,5-50 mg/ml, pontosabban 0,5-10 mg/ml között. Egy ilyen vizes oldatot használhatunk kiindulási anyagként.

Egy, a fentiek szerint meghatározott oxidációs-redukciós rendszert adunk a poliszacharidkészítményhez, vagy egyszerre az egészet vagy folyamatos, illetve szakaszos módon úgy, hogy a végleges oxidációs-redukciós rendszer:poliszacharid súlyarány 0,01-10, pontosabban 0,1-5, például 0,1-1 között változzon.

Egy, a jelen találmány szerinti eljárást pH=3-8,5, pontosabban 3-6,5 között használhatunk. Hasonlóképpen, a reakcióközeg hőmérséklete nem kritikus: 4 °C és 60 °C között lehet, pontosabban 18 °C és 40 °C között.

Az idő, amire ahhoz van szükség, hogy a poliszacharid kívánt fragmentációját eléljük, általában 30 perc és 1 óra között változik, speciális esetek kivételével: például a Salmonella typhi Vi poliszacharidja esetében a reakcióidő lényegesen hosszabb. A reakcióidőt a kívánt fragmentméret függvényében határozhatjuk meg.

Egy specifikus megvalósítási mód szerint, egy 0,5-50 mg/ml, pontosabban 0,5-10 mg/ml koncentrációjú vizes poliszacharidkészítményhez aszkorbinsavat adunk 0,01-25 mg/ml végkoncentrációban, pontosabban 0,1-10 mg/ml végkoncentrációban. A reakcióelegyben természetesen oldódó oxigén mennyisége általában elegendő; ha ez nem igaz, akkor a hiányt a közegbe lehet injektálni. Ahhoz, hogy a reakciót felgyorsítsuk, az eljárást előnyösen többértékű fém, például vas vagy réz oldható fémsójának jelenlétében hajtjuk végre. A fémsó(ka)t 1 pmol/l-100 mmol/1 koncentrációban alkalmazhatjuk, pontosabban 1-10 mmol/1 koncentrációban.

Egy, az előzőkben leírtaktól eltérő megvalósítási mód szerint az aszkorbinsavat hidrogén-peroxiddal helyettesítjük, amit 0,1-100 mmol/1 koncentrációban adhatunk a reakcióelegyhez, pontosabban 0,5-10 mmol/1 koncentrációban, adott esetben egy fémsó jelenlétében.

Egy oligoszacharid, amelyet úgy állítunk elő, hogy egy poliszacharidot egy ORD depolimerizációs reak4

HU 219 672 Β ciónak vetünk alá, olyan molekulák kombinációja, amelyeknek átlagos elúciós konstansa kisebb, mint azé a poliszacharidé, amelyből fragmentálással származik (az összehasonlítást teljesen egyértelműen ugyanazon kromatográfiás oszlop felhasználásával végezzük). Az oligoszacharidot szokványos technikával izolálhatjuk, például egy megfelelő kicsapószer alkalmazásával, ami lehet aceton vagy alkohol; szűréssel, megfelelő elválasztási értékkel rendelkező membránon keresztül. Ezt követően megválaszthatjuk, hogy mely oligoszacharidfrakciókat használjuk, amelyek az átlagos elúciós konstanssal egyenlő, vagy annak közelében levő átlagos elúciós konstanssal rendelkeznek.

Adott esetben, a találmány szerinti oligoszacharidot kovalens kötéssel kapcsolhatjuk egy peptid vagy fehérje természetű vegyülethez, vagy más szerves polimerhez, például poliakriláthoz, abból a célból, hogy egy olyan konjugátum jöjjön létre, amely képes az oligoszacharid immunogén tulajdonságait fokozni, különösen emlősökben. A konjugációhoz partner lehet egy bakteriális fehérje, például egy toxin, a megfelelő anatoxin vagy egy multimer toxin egyik alegysége, valamint egy membránfehétje, egy multimer membránfehéije egy alegysége, vagy egy citoplazmatikus fehérje. Példaként megemlíthetjük a Pertussis-toxint, a koleratoxint, a tetanusztoxint és a diftériatoxint. Ezeket a fehérjéket kivonhatjuk az eredeti baktériumokból, illetve alternatív módszerrel, rekombináns DNS-technikával állíthatjuk elő.

Egy vakcinaként használható konjugátum előállításához egy kovalens kötésen alapuló reakciót és egy oligoszacharidot egy konjugációs partnerrel használhatunk a szokványos módon. Például egy olyan funkciós csoportot hozhatunk létre az oligoszacharidon, amely képes a konjugációs partner funkciós csoportjával reagálni. Egy bifunkciós kapcsolóágens is képes az oligoszachariddal reagálni, majd egy konjugációs partnerrel, vagy fordítva. Ezeknek a különböző kapcsolási módszereknek az összefoglalását már publikálták [W. E. Dick and M. Beurett in Conjugates Vaccines, J, M. Cruse, R. E. Lewis Jr. Eds, Contrib. Microbiol. Immunoi. Basel, Karger 10, 48 (1989)]. Továbbá az oxidációs-redukciós fragmentációs eljárás redukálócsoportokat juttat be, különösen a Streptococcus pneumoniae 6B és 19F típus, a Haemophilus influenzáé és a Neisseria meningitidis A csoport poliszacharidjaiból származó oligoszacharidokba. Ez lehetővé teszi, hogy a reduktív aminációs konjugációs technikát használjuk.

Egy, a találmány szerinti oligoszacharid immunogenitását egy fokozó liposzómával lehet erősíteni, amelyhez kovalensen hozzákötöttük az oligoszacharidokat. Az immunogenitást olyan hordozókkal is lehet fokozni, amelyek inkorporációval visszatartják az oligoszacharidot, ionos vagy hidrofób erők alkalmazásával, ilyenek például a ciklodextrinek, liposzómák és az ISCOMS.

A találmány szerinti oligoszacharid különböző formákban, főleg egy konjugátum formájában, illetve egy hordozóliposzómához hozzákapcsolva, illetve egy hordozóba beépítve létezhet. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az oligoszacharid konjugátum formájában van előállítva.

Egy, a találmány szerinti oligoszacharid különösen hasznos egy egyed immunvédelmének a megerősítésében, emlősökben, főleg emberekben, például egy patogén ágens, mondjuk baktériumfertőzés vagy mikózis által indukált fertőzés hatásainak megelőzésében vagy csökkentésében. A találmány szerinti oligoszacharidok keveréke, amelyek különböző antigén poliszacharidokból származnak, valamint a találmány szerinti oligoszacharid keverékei aktív adalékanyagokkal, amelyek nem azonosak a találmány szerinti oligoszacharidokkal, szintén hasznosak. Az ilyen keverékek alkalmasak polivalens vakcinák előállítására.

Ennek következtében a találmány tárgyát képezi továbbá olyan gyógyászati készítmény, amely aktív adalékanyagként legalább egy, a találmány szerinti oligoszacharidot tartalmaz; a készítmény előnyösen vakcina formájú.

Egy előnyös gyógyászati készítmény legalább egy oligoszacharidot tartalmaz egy konjugátum formájában.

A találmány szerinti gyógyászati készítményt szokványos módon állíthatjuk elő. Pontosabban egy, a találmány szerinti oligoszacharidot egy gyógyászatilag elfogadható hígítóval vagy hordozóval kombináljuk, például egy pirogénmentes fiziológiás sóoldattal. Emellett, egy, a találmány szerinti készítmény tartalmazhatja a szokványos adalékanyagokat, úgymint egy puffért, egy tartósítószert vagy stabilizálót, egy adjuvánst és adott esetben egy liofilizációs segédanyagot.

A találmány szerinti oligoszacharid, illetve -készítmény képezheti részét egy megfelelő kitnek is.

Egy találmány szerinti készítményt bármely szokványos módon beadhatunk, de főleg szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásán, például egy injekciózható szuszpenzió formájában vagy orálisan. A beadást végezhetjük egyetlen dózisban, vagy egy bizonyos időintervallum után egyszer vagy többször megismételve. A megfelelő dózis nagysága különböző paraméterektől függően változik, például függ a kezelt egyedtől vagy a beadás módjától. Az azonban várható, hogy jó eredmények kaphatók 1-200 pg oligoszacharidot tartalmazó egységdózis körülbelül 0,5 ml térfogatban való alkalmazásával.

A találmányt részletesebben az alábbi példákon keresztül és az 1-4. példákra való hivatkozással mutatjuk be.

Az 1. ábrán a Streptococcus pneumoniae 14-es típusú (a), 1-es típusú (b), a Salmonella typhi (c), a Streptococcus pneumoniae 6B típusú (d), a Haemophilus influenzáé B típusú (e), a Streptococcus pneumoniae 19F típusú (f), a Neisseria meningitidis A csoport (g), a Streptococcus pneumoniae 18C típusú (h), 23F típusú (i), a Klebsiella ozaenae K4 szerotípusú (j), a Shigella flexneri lb szerotípusú (k) és a Cryptococcus neoformans 98-as törzs (1) kapszuláris poliszacharidja ismétlődő egységének szerkezetét láthatjuk. Az figyelhető meg, hogy (a) semleges poliszacharidnak felel meg, (b) és (c) a poliszacharidláncban uronsavakat tartalmazó poliszacharidoknak felel meg, (d) és (i) foszforilezett poliszacharidoknak felel meg, (j) és (k) lipopoliszacharidoknak felel meg, amelyek anionosak, illetve

HU 219 672 Β semlegesek, és (1) anionos íungális poliszacharidnak felel meg.

A 2a. és 2b. ábrákon a Salmonella typhi (2a) és a Streptococcus pneumoniae 1-es típus (2b) fregmentálatlan poliszacharidjának elúciós profilja látható Sepharose 4BCL oszlopon. A kromatográfiás körülmények az alábbiak: 2 ml, 5 mg/ml koncentrációjú poliszacharidoldatot viszünk fel a Sepharose-oszlopra, amelyet előzőleg 0,2 mol/1 NaCl-dal hoztunk egyensúlyba. Az eluálást 0,2 mol/1 NaCl-dal végezzük 42 ml/óra sebességgel. Az elúciós profilt automatikusan elemezzük, az optikai sűrűség 206 nm-en való mérésével. A 2a. és 2b. ábrákon az oszlop holttérfogata 75,56 ml, míg az össztérfogata 201,84 ml.

A 3. ábrán kalibrációs sorozat látható, 500 000estől 20 000-esig terjedő molekulatömegű dextrán felhasználásával.

A 4a. és 4b. ábrákon a Salmonella typhi (4a) és a Streptococcus pneumoniae 1-es típus (4b) poliszacharidjainak oxidációs-redukciós fragmentálásával kapott oligoszacharidok elúciós profilja látható, 4BCL-oszlopon. A kromatográfiás körülmények azonosak azzal, amit a 2. ábránál ismertettünk.

1. példa

A Salmonella typhi Vi poliszacharidjának fragmentálása aszkorbinsav jelenlétében A Vi poliszacharid száraz porát [előállítása Gotschlich és munkatársai módszerével, Prog. Immunobioi. Standard, 5, 485 (1972)] pirogénmentes vízben vesszük fel 1 mg/ml koncentrációban. A poliszacharid átlagos molekulatömege (Mt) nulla K_d-értéknek felel meg Sepharose 4BCL oszlopon.

Ebből a készítményből 500 ml-hez (37 °C-ra előmelegítve), 2 óra alatt 12,5 ml vizes oldatot adunk, amely 100 mmol/1 aszkorbinsavat, 10 mmol/1 CuSO₄ot és 10 mmol/1 FeSO₄-ot tartalmaz, az aszkorbinsavvégkoncentráció 0,44 mg/ml-nek felel meg. Az így kapott reakcióelegy pH-ja körülbelül 4. A reakciót körülbelül három óra hosszat folytatjuk (beleértve a reagens hozzáadásának idejét is) enyhe kevertetés közben, 37 °C-on.

A reakcióelegyet azután 3K-s ultraszűrő membránon szűrjük (vágási érték: 3 kD). A visszatartott oldatot egyszer mossuk 0,5 mol/1 NaCl-oldattal, majd másodszor vízzel. A visszamaradt oldatot körülbelül 100 ml vízben vesszük fel, és tárolás céljából fagyasztva szárítjuk.

A hasítás mértéke 95% körül van, a Sepharose 4BCL gélen végzett szűréssel kapott görbék integrálása alapján számítva (4a. ábra). Emellett az így kapott oligoszacharid átlagos Mt-értékét Granath és munkatársai (im.) módszerével becsüljük meg. Az utóbbi, átlagos elúciós konstansban kifejezve 0,6 körül van, ami megfelel 60 000 DEq Mt-nek (referenciaként dextránt használva).

Az oligoszacharid NMR-spektrometriával (mágneses magrezonancia) végzett elemzése világosan mutatja, hogy a poliszacharidra jellemző ismétlődő egység szerkezete megőrződött a fragmentáció után. Pontosabban, nincs veszteség az elágazó funkcionális csoportokban, illetve a poliszacharidvázból származó cukrokban.

A Vi poliszacharid ismétlődő egységeire jellemző kémiai funkciós csoportot kolorimetriás vizsgálattal elemezzük. Az elágazó pozícióban levő O-acetil-csoportot Hestrin módszerével elemezzük [Bioi. Chem., 188, 149 (1949)], míg a lineáris struktúra polisavát Stone és munkatársai módszerével elemezzük [Clin. J. Microbiol., 28, 719 (1988)]. A vizsgálatokat párhuzamosan végezzük a fragmentálatlan Vi poliszacharidon és a keletkező oligoszacharidon.

A mért (O-acetil)/(polisav) arány azonos a poliszacharidnál és az oligoszacharidnál. Ez valóban azt mutatja, hogy a poliszacharid fragmentálási módszere lehetővé tette, hogy megőrizzük az összes labilis O-acetilcsoportot.

2. példa

A Salmonella typhi Vi poliszacharid fragmentálása hidrogén-peroxid (H₂O₂) jelenlétében A Vi poliszacharid száraz porát [előállítása Gotschlich és munkatársai módszerével, Prog. Immunobioi. Standard, 5, 485 (1972)] 0,2 mol/1 foszfátpufferben vesszük fel (pH=7,5), 0,4 mg/ml koncentrációban. A poliszacharid átlagos molekulatömege (Mt) nulla Kjértéknek felel meg Sepharose 4BCL oszlopon.

Ebből a készítményből 100 ml-hez (37 °C-ra előmelegítve), 11 ml vizes oldatot adunk, amely 0,3 mg/ml H₂O₂-ot és 1,1 ml CuSO₄-ot tartalmaz, 2,6 mg/ml koncentráció mellett. A reakciót körülbelül 1 óra hosszat folytatjuk 37 °C-on enyhe kevertetés közben.

A kísérletet azonos körülmények között megismételjük, azzal a különbséggel, hogy a reakcióidő egy 1 helyett 2 óra.

Mindkét esetben a kapott oligoszacharidot az 1. példában leírtak alapján nyerjük ki és tisztítjuk.

Hasonlóképpen, az így kapott oligoszacharidok jellemzőit az 1. példában leírt módszerekkel határozzuk meg. Az eredmények az alábbiak:

- mindkét esetben a Vi poliszacharid hasítási szintje 100% körül van;

- az 1 vagy 2 óra után keletkező oligoszacharidok átlagos Mt-értéke 0,7, illetve 0,8; ez 30 000, illetve 10 000 DEq-értéknek felel meg;

- egyik esetben sem figyelhető meg az ismétlődő egység szerkezetének módosítása.

3. példa

A Neisseria meningitidis A csoport poliszacharidjának fragmentálása

A Neisseria meningitidis A csoport poliszacharidja száraz porát [előállítása Gotschlich és munkatársai módszerével, Prog. Immunobioi. Standard, 5, 485 (1972)] 0,2 mol/1 foszfátpufferben vesszük fel (pH=7,5) mg/ml, illetve 5 mg/ml koncentrációban. A poliszacharid átlagos Mt-értéke Sepharose 4BCL oszlopon mérve 0,15-ös IQ-nek felel meg.

Az 1 és 5 mg/ml-es készítményeket 37 °C-ra előmelegítjük.

HU 219 672 Β

3.a) Az 1 mg/ml-es készítmény 100 ml-éhez 0,75 ml reakcióelegyet adunk, amely 100 mmol/1 aszkorbinsavat, 10 mmol/1 CuSO₄-ot és 10 mmol/1 FeSO₄-ot tartalmaz. A reakciót 1 óra hosszat folytatjuk kevertetéssel, 37 °C-on. Ezután ismét hozzáadunk 0,75 ml reakcióelegyet; az aszkorbinsav végkoncentrációja 0,26 mg/ml ily módon. A reakciót ismét 1,5 óra hosszat folytatjuk, azonos körülmények között.

3.b) Az 5 mg/ml-es készítmény 100 ml-éhez 1,5 ml reakcióelegyet adunk, amely 100 mmol/1 aszkorbinsavat, 10 mmol/1 CuSO₄-ot és 10 mmol/1 FeSO₄-ot tartalmaz, ez megfelel 0,26 mg/ml aszkorbinsav-végkoncentrációnak. A reakciót 1,5 óra hosszat folytatjuk 37 °C-on kevertetve.

A 3.a) és 3.b) pontokban kapott oligoszacharidokat az 1. példában leírtak alapján kinyerjük és tisztítjuk. Hasonlóképpen, az elemzéseket az 1. példában leírtak alapján végezzük. Mindkét esetben 100%-os hasítási szint figyelhető meg anélkül, hogy az ismétlődő egység szerkezete tönkremenne, az NMR-es vizsgálat szerint. A 3.a) pontban kapott oligoszacharid átlagos molekulatömege 0,7-es K_D-nek felel meg (ez egyenértékű 30 000 DEq-val), míg a 3.b) pontban kapott oligoszacharid 0,4-es K_D-nek felel meg (ami egyenértékű 110 000 DEq-val).

Ezek az eredmények összességükben azt igazolják, hogy a kísérleti körülmények (azaz a poliszacharid és a reaktív oxidációs-redukciós ágens koncentrációja, valamint a reaktív ágens hozzáadásának módja és a reakcióidő) variálásával lényegesen eltérő átlagos molekulatömegű oligoszacharidok állíthatók elő, miközben megmarad a 100%-os hasítási szint.

Végezetül ez a példa, valamint a 2. példa valóban azt mutatja, hogy a ffagmentáció oxidációs-redukciós módon játszódik le és nem savas vagy alkalikus hidrolízis hatására, mivel ezt a íragmentációt közel semleges pH-η lehet végezni.

4. példa

A Streptococcus pneumoniae 1-es és 19F-es típus, valamint a Haemophilus influenzáé B típus poliszacharidjának ffagmentálása puffereit közegben A 3. példát [3.a) és 3.b)] ismételjük meg, az 1-es és

19F-es típusú Streptococcus pneumoniae poliszacharidokat alkalmazva, amelyeket az 1982. június 18-án publikált FR 2,495,939 számú francia szabadalmi bejelentésben közölt leírás alapján állítunk elő, valamint a Haemophilus influenzáé B típus poliszacharidját alkalmazva, amelyet Gotschlich és munkatársai módszerével [Prog. Immunobioi. Standard, 5, 485 (1972)] állítunk elő.

Az eredményeket az alábbiakban foglalhatjuk össze:

Törzs	a) eljárás	b) eljárás
A poliszacharid átlagos Mt-értéke (K_D-ben kifejezve)	Az oligoszacharid átlagos MT-értéke	Hasítási szint	Az oligoszacharid átlagos MT-értéke	Hasítási szint
S. pneumoniae 1	0,04	0,84	100	0,35	100
S. pneumoniae 19F	0,04	0,80	100	0,38	100
H. influenzáé	0,1	0,75	100	ND	ND

ND: nincs meghatározva.

Az oligoszacharidokat NMR- (mágneses magrezonancia) spektrometriával elemezve világosan látszik, hogy a poliszacharidokra jellemző ismétlődő egységek szerkezete megőrződik a fragmentálás után.

5. példa

A Neisseria meningitidis A csoport és a Streptococcus pneumoniae 1-es, 14-es, 18C, 19F és 23F csoportja poliszacharidjainak ffagmentálása pufferolatlan közegben

A poliszacharidok előállítását, valamint a reakció- 50 kát a 3. és 4. példában leírtak alapján végezzük, az alábbi eltérések alkalmazásával:

(i) a poliszacharidkészítményeket 5 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk pirogénmentes vízben, (ii) a reakcióelegyet egyszerre adjuk az oldathoz 2,5 mg/ml végkoncentrációban, és (iii) a reakciót egy óra hosszat végezzük.

A kapott oligoszacharidokat kinyerjük, majd az 1.

példában leírtak alapján tisztítjuk. Jellemzőiket az 1.

példában leírtak alapján értékeljük. A poliszacharidok 60 hasítási szintje 100%, anélkül hogy az ismétlődő egységek szerkezete tönkremenne. Ezt az utolsó megjegyzést kolorimetriás vizsgálattal igazoljuk: a hexózokat Scott és munkatársai módszerével elemezzük [Anal. Chem., 25, 1650 (1953)], a hexóz-aminokat Gatt és munkatár45 sai módszerével elemezzük [Analytical Biochemistry, 15, 167 (1965)], a ramnózt Dische és munkatársai módszerével elemezzük [Journal of Biological Chemistry, 175, 595 (1948)], a foszfátot pedig Chen és munkatársai módszerével elemezzük [Anal. Chem., 28, 1756 (1956)]. A Streptococcus pneumoniae 14-es típusa esetében, valamint az ebből származó oligoszacharid esetében a [hexóz]/[hexóz-amin] arány lényegében azonos. Ugyanez igaz a [ramnóz]/[hexóz] és a [foszfát]/[hexóz] arányokra is, a Streptococcus pneumoniae 18C és 23F esetében.

Az oligoszacharidok NMR-spektrometriával végzett elemzése nem mutat ki olyan jeleket, amelyek heterogenitást jeleznének az ismétlődő egységekben, és ezáltal azt mutatják, hogy az oligoszacharidok érintetlen ismétlődő egységekből állnak.

HU 219 672 Β

Végezetül, ami az oligoszacharidok átlagos Mtértékét illeti, az eredmények az alábbiak:

Törzs	A poliszacharid átlagos Mt-értéke (K_D-ben kifejezve)	A poliszacharid átlagos Mt-értéke (K_D-ben kifejezve)
N. meningitidis A	0,15	0,66
S. pneumoniae 1	0,04	0,72
S. pneumoniae 14	0,01	0,72
S. pneumoniae 18C	0,03	0,75
S. pneumoniae 19F	0,04	0,67
S. pneumoniae 23F	0,07	0,57

6. példa

A Salmonella typhi/B Vi oligoszacharid-alegység és a koleratoxin konjugátumának előállítása 6.a) Egy NH₂ csoport bejuttatása a Vi oligoszacharidba

A Vi oligoszacharid egy fagyasztva szárított termékét, amelyet az 1. példa alapján állítunk elő, foszfátpufferben vesszük fel, 10 mg/ml koncentrációban. Ehhez a preparátumhoz diamino-hexánt és NaCNBH₂-t adunk oldatban; mindegyiknek 12,5 mg/ml a végkoncentrációja. A reakciót 6 napig végezzük szobahőmérsékleten. A preparátumot azután vízzel szemben dializáljuk és fagyasztva szárítjuk

Shnyder és munkatársai módszerével [Analytical Biochemistry, 64, 284 (1975)] ellenőrizzük, hogy az NH₂-csoportokat valóban sikerült-e bejuttatni. Hasonlóképpen azt is igazoljuk Hestrin módszerével [Bioi. Chem., 188, 149 (1949)], hogy az O-acetil-csoportokat sikerült megőrizni.

6.b) Egy reaktív funkciós csoport beépítése

A 6.a) pontban kapott fagyasztva szárított terméket 40 mg/ml-es oldatban vesszük fel. Ennek a preparátumnak 20 ml-éhez 80 ml, 40 mg/ml-es diszukcinimidilszuberát- (DSS-) oldatot adunk dimetil-szulfoxidban (DMSO). A reakciót további 1 óra hosszat folytatjuk szobahőmérsékleten. A preparátumot azután DMSO/dioxán eleggyel csapjuk ki.

6.c) Konjugáció

A 6.b) pontban kapott csapadékot 0,5 mol/1 NaCloldatban vesszük fel 40 mg/ml mennyiségben. Ezzel párhuzamosan a koleratoxin B alegységének oldatát is elkészítjük [Tayot et al., European Journal of Biochemistry, 113, 249 (1981)] 0,2 mol/1 foszfátpufferben (pH=6,5), 10 mg/ml koncentrációban.

Az így előállított két oldatot összekeverjük. Az oligoszacharid/fehéije arány körülbelül 1. A reakciót szobahőmérsékleten végezzük 15 óra hosszat.

6.d) Tisztítás

Az elegyet ezután egy ultraszűrő minipatronon (Millipore) szűrjük, amelyben a membrán elválasztási határértéke 5 χ 10⁴ D, hogy a nem kapcsolódott fehérjét és oligoszacharidot eltávolítsuk. A visszatartott oldatot 0,3 mol/1 NaCl-dal mossuk, majd konzerváljuk

200 pg/ml koncentrációban NaCl 8/1000-ben, merthiolát 1/10 000-ben 4 °C-on, sterilre szűrés után.

7. példa

Oligoszacharid/tetanusz anatoxin készítése

Az 5. példában Streptococcus pneumoniae 14-es és 23F típusának poliszacharidjaiból előállított oligoszacharidokat, valamint az 1. példában a Salmonella typhi Vi poliszacharidjából kapott oligoszacharidokat konjugáltatjuk, az eljárás hasonló ahhoz, mint amelyet a 6. példában mutattunk be, a koleratoxin B alegységét a tetanuszanatoxinnal helyettesítjük, amelyet Mueller és Miller módszerével állítunk elő [Journal of Bacteriology, 67, 671 (1954)].

A Streptococcus pneumoniaeből kapott konjugátumokat 250 pg/ml koncentrációban őrizzük meg.

8. példa

A konjugátumok immunogén hatásának igazolása

OF1 egereket (IFFA Credo) 8-as csoportokba osztunk. Egy csoportban mindegyik egér 0,5 ml-t kap a 6. és 7. példákban készített oldatokból, illetve ezzel párhuzamosan, 0,5 ml-t a megfelelő természetes poliszacharidokból. Az injekciókat szubkután adjuk be. Ezeket az injekciókat 14 nappal később megismételjük. Ezzel párhuzamosan, egy kontrollcsoport fiziológiás sóoldatot kap.

Az első injekció után 14 és 28 nappal vesszük az első vérmintát, és az antipoliszacharid-IgG-antitesteket ELISA-vizsgálattal titráljuk (a titrálólemezeket fragmentálatlan poliszachariddal borítjuk). 14 és 28 nap elteltével az antitestszint azt mutatja, hogy a konjugátumok immunogén hatásúak. Mindegyik esetben az antitestszint magasabb, mint amit a megfelelő természetes poliszacharid indukál. Továbbá, egy visszakötődési hatás is megfigyelhető, ami a T-dependens antigénre jellemző.

9. példa

Vakcinális gyógyászati készítmények, amelyek hatóanyagként konjugátumokat tartalmaznak A Salmonella typhi Vi oligoszacharid/tetanusz anatoxinkonjugátumokat, amelyeket a 7. példában leírtak alapján állítunk elő, 0,5 ml-es vakcinálási dózisban formulázzuk, amelyekkel az a célunk, hogy embereknek adjuk be szubkután. A dózisonkénti összetétel az alábbi:

- Salmonella typhi oligoszacharidkonjugátumok 10 pg

- Foszfátpuffer (pH=7) (foszfátionként számítva) 475 pg

- NaCl 4250 pg

- Merthiolát 0,05 pg

- Víz az injekciókhoz 0,5 ml-re.

Claims

1. Eljárás oligoszacharid előállítására egy patogén ágensből nyert antigén poliszacharidnak depolimerizációjával, ahol az antigén poliszacharid ismétlődő egységei legalább egy labilis kémiai funkciós csoportot tartalmaznak, és ahol az eljárás során az ismétlődő egység

HU 219 672 Β szerkezete a labilis kémiai funkciós csoporttal együtt megmarad, ahol a funkciós csoport jellemzője, hogy amennyiben ultrahangos, savas vagy bázisos depolimerizálásnak vetik alá a poliszacharidot, akkor az olyan változásokat szenved, melynek hatására az antigénjelleg elveszik, azzal jellemezve, hogy (i) az említett poliszacharidot oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciónak vetjük alá, (ii) az így kapott oligoszacharidot kinyerjük, és (iii) kívánt esetben

b) az (ii) lépésben kapott oligoszacharidot egy vektorba építjük be.

2. Az 1. igénypont szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciót egy oxidációs-redukciós ágens jelenlétében hajtjuk végre, amelyet az aszkorbinsav és hidrogén-peroxid közül választunk.

3. A 2. igénypont szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciót vas- vagy rézsók közül választott fémsók jelenlétében hajtjuk végre.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciót 0,5-50 mg/ml poliszacharidot tartalmazó oldatban hajtjuk végre.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy a 0,5-10 mg/ml poliszacharidot tartalmazó oldatot alkalmazunk.

6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy 3-8,5 pH-értékű oldatot alkalmazunk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy 3-6,5 pH-értékű oldatot alkalmazunk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációs-redukciós depolimerizációs reakciót 4-60 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy reakció-hőmérsékletként 18-40 °C hőmérsékletet alkalmazunk.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy oxidációs-redukciós ágensként aszkorbinsavat alkalmazunk 0,01-25 mg/ml koncentrációban.

11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az aszkorbinsavat 0,1-10 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk.

12. A 3-11. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy a fémsót 1 μΜ-tól 100 mM-ig terjedő koncentrációban alkalmazzuk.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy a fémsót 1-10 mM koncentrációban alkalmazzuk.

14. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy oxidációs-redukciós ágensként hidrogén-peroxidot alkalmazunk 0,1-100 mM koncentrációban.

15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrogén-peroxidot 0,5-10 mM koncentrációban alkalmazzuk.

16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a labilis kémiai csoportot a következők közül választjuk: foszfát-, Ο-acetil-, és piruvátcsoportok.

17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti előállítási eljárás, azzal jellemezve, hogy antigén poliszacharidként patogén baktériumból nyert kapszuláris poliszacharidot alkalmazunk.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a patogén baktériumot a következők közül választjuk: Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia, Neisseria és Haemophilus.

19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a patogén baktériumot a következők közül választjuk: S. typhi, S. pneumoniae, N. meningitidis és H. influenzáé.

20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kötelezően tartalmazza az (iii) lépést.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a konjugációs partnert a következők közül választjuk: peptid, fehérje és szerves polimer.

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy konjugációs partnerként bakteriális fehérjét alkalmazunk.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakteriális fehérjét a következők közül választjuk: toxin, anatoxin, multimer toxin alegysége, membránfehérje és egy multimer membránfehérje alegysége.

24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozóként liposzómát alkalmazunk.

25. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektort a következők közül választjuk: ciklodextrinek, liposzómák és ISCOMS.

26. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy, az 1-25. igénypontok bármelyike szerint előállított oligoszacharidot tartalmaz.

27. A 26. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy egyed immunrendszerének erősítését szolgáló készítményként van kiszerelve.

28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy vakcinális készítményként van kiszerelve.

HU 219 672 Β

Int. Cl.⁷: C 08 B 37/00

a)

-> 4)-β-ΕΜ31φ-{ 1- > 6)-S-D-Glg?NAc-<l- > 3)-β-ΕΜ3φ-{μ 4 · β-D-GaJp

b)

c)

-> 3)-a-Sugp-(l- > 4}-a-D-Ga]pA-{l- > 3>a-D-Ga]pA-(l4J n r> 4)-eD-GaINacA- OAc

d) —

->2)-a-D-Gal- (l->3) -a-D-Glc-(l->3) -a-L-Rha-(l->4) -D-ribitol-(5-0-r-0 i c

«In

e)

O

I >3) -B-D-Ri±>£-<l-> l)-D-ribitol-<5-0-P-0OH

f)

g)

Ο Ί