KR100249709B1 - 병원체로부터 얻은 항원성 폴리오사카라이드로부터 유도된 올리고사카라이드 - Google Patents

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Abstract

병원체로부터 얻은 항원성 폴리오사이드로부터 유도된 올리고사이드, 그의 제조를 위한 방법, 및 특히 백신제로서의 그의 용도. 이 올리고사이드는 산화-환원 폴리머분해 반응에 의해서 제조된다.

Description

병원체로부터 얻은 항원성 폴리사카라아이드로부터 유도된 올리고사카라이드
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 병원체로부터 얻은 항원성 폴리사카라이드로부터 유도된 올리고사카라이드 및 그 제조방법과 특히 백신제로서의 용도에 관한 것이다.
이스트와 같은 곰팡이 뿐아니라 세균도 폴리사카라이드를 그들의 표면구조로 도입한다. 그러므로 대부분의 세균은 다소 강하게 세균에 결합하지만 엄격히 말해 엔빌로프(envelop)는 아닌 폴리사카라이드 성질을 갖는 삼출물(exudate)로 덮여있다. 이 삼출물은 캡슐 또는 글리코칼릭스(glycocalyx)로 불리워지는 것이다. 또한 그람-음성 세균의 외부 멤브레인(outer membrane)은 특히 리포폴리사카라이드(LPS)로 구성되어 있다. 폴리사카라이드는 곰팡이의 세포벽에도 존재한다. 이들 폴리사카라이드는 사실상 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 표면항원이다.
이러한 폴리사카라이드는 구성 성분과 결합이 정해져있는 반복 단위로 형성되어 있는데 관련된 곰팡이 또는 세균의 종 특성에 따라 달라진다. 이들 반복 단위는 항원성 결정구조인 에피토프(epitope)를 포함한다. 제1도에 캡슐성 폴리사카라이드 또는 리포폴리사카라이드로부터 얻어진 여러가지 유형의 반복 단위가 도시되어 있다. 반복 단위는 예를 들어 0-아세틸, 피루베이트기 뿐 아니라 분자구조 또는 분지위치(branched position)에 존재하는 인산기와 같은 불안정한 작용기를 흔히 포함하고 있다.
실제로 폴리사카라이드는 분자에 따라 다양한 양으로 글리코사이드 단위를 포함하고 있는 폴리머성 분자가 결합되어 있는 것이다. 결론적으로 폴리사카라이드는 평균 분자량에 의한 분자량면에서 설명될 수 있다. 호모폴리사카라이드의 경우에는 글리코사이드 단위가 모노사카라이드이다. 헤테로폴리사카 라이드의 경우에는 글리코사이드 단위가 정해진 방식으로 서로 연결(link)되어 사슬구조를 형성하고 있다.
폴리사카라이드의 평균 분자량은 겔 여과법(gel filtration)에 의해 결정될 수 있다. 이 경우 분자량은 그라나드 등에 의해 제안된 방법(J. Chrom. (1967) 28 : 69)에 따라 용출상수(elution constant : Kd) 또는 덱스트란 당량(DEq)으로 표현되는데, 이것은 다음과 같이 요약될 수 있다. :
폴리사카라이드 용액은 분자량에 따라 성분을 분리시키는 배척-확산(exclusion-diffusion) 겔 크로마토그라피 컬럼에 의해 분석된다. 이런 유형의 겔은 시판되고 있는 것으로서 그 예를 들면 상표명이 세파덱스(파마시아), 바이오-겔(바이오-라드), 프락토겔(토요-소다), 세파로오스(파마시아), 및 세파크릴(파마시아)인 것 등이 있다. 겔의 분획 영역은 반드시 분석되는 분자 시료내에서 대표되는 분자량 범위에 적합해아 한다. 예를 들어, 겔 여과 컬럼 세파로오스 2BCL, 4BCL 및 6BCL은 덱스트란 당량으로 각각 20,000,000-100,000; 5,000,000-20,000 및 1,000,000-10,000 범위의 분획 영역을 가지고 있다. 일반적으로는 예를 들어 0.2M 염화나트륨과 같은 염용액이 용출용매로 사용된다. 용출상수는 다음식에 따라 계산된다. :
여기에서 Ve는 구하고자 하는 조제시료의 용출량이고 Vt는 컬럼의 전체 용적이며 Vo는 컬럼의 사용적(dead volume)이다.
제2a도와 제2b도는 세파로오스 4BCL컬럼을 사용한 경우 살모넬라 티피(Salmonella typhi)와 스트렙토코커스 뉴모니아에 타입 1(Streptococcus pneumoniae type 1)의 폴리사카라이드의 용출 프로파일을 각각 나타낸다. 그러므로 살모넬라 티피의 폴리사카라이드는 최고 분자량이 세파로오스 4BCL 상에서 분리될 수 없는 폴리머로 구성되어 있다. 마찬가지로 스트렙토코커스 뉴모니아에는 분자량이 Kd 값으로 0-0.45인 폴리머로 구성되어 있다. 정의에 의하면 폴리사카라이드의 평균 용출상수는 용출 프로파일의 슬로우프상에서 그린 접선들의 교점 또는 간단히 용출 프로파일의 정점에서 구해질 수 있다. 그러므로 제2a도와 제2b도에 나타나 있는 폴리사카라이드의 용출상수는 각각 0 및 0.04이다.
덱스트란을 사용하여 작성한 보정그래프를 기초로 하여 용출상수가 DEq로 표현되는 분자량 값으로 전환될 수 있다. 제3도가 그 예로 보정그래프를 나타낸다.
세균이나 곰팡이와 같은 병원체의 표면항원으로서의 항원성으로 인해 폴리사카라이드는 백신제로서 좋은 재료가 된다. 폴리사카라이드 추출물을 포함하고 있는 백신은 성인에게 효과가 있는 것으로 입증되었다. 그러나 어린이들의 경우에는 그러하지 않다. 이러한 문제를 해결하기 위해 폴리사카라이드를 단백질에 공유결합시키고 이어서 T-의존성을 부여함으로써 면역성을 증가시키는 방법이 성공적으로 제안되었다.
폴리사카라이드를 기초로 하는 백신중에는 현재까지 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)그룹 A,C,Y 또는 W135, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)타입 B 및 살모넬라 티피에 의해 유발되는 감염증을 치료하는 백신등이 있다.
병원체의 항원성 폴리사카라이드가 면역원으로서 작용할 수 있는 장점이 있다 하더라도 수백만 DEq 정도의 높은 평균 분자량으로 인해 그 이용이 어렵다. 특히, 폴리사카라이드를 콘쥬게이트(conjugate)의 형태로 사용하는 것이 바람직한 경우에는 해결하기 어려운 기술적인 문데에 직면하게 된다. 커플링 과정에서 겔 또는 응집물질이 형성되어 콘쥬게이트를 여과법으로 멸균하기가 곤란해질 수 있기 때문이다.
이 문제를 해결하기 위해 취급이 보다 용이하도록 폴리사카라이드의 크기를 줄이는 방법이 이미 제안된 바 있다. 이를 위해 여러가지 분해방법들이 제안되어 왔다. 예를 들면, 초음파에 의한 분쇄 또는 산성이나 염기성 용액에서의 알칼리 가수분해 또는 효소용액을 이용한 분쇄방법과 같이 잘 정립된 분해방법들이 있다. 그러나, 이들 방법들은 결코 만족스럽지 못하다. 실제로 면역특이성에 필수적인 화학 작용기들이 소실됨으로써 에피토프가 전체적 또는 부분적으로 파괴되는 일이 너무나도 빈번히 일어난다.
그러므로, S. 티피 또는 N. 메닌지티디스 그룹 A의 캡슐성 폴리사카라이드를 산 또는 알칼리 가수분해 하면 폴리 사카라이드의 항원특이성에 필요한 아세틸기가 제거된다. 또한 알칼리 가수분해에 의해 얻은 단편들을 정확하게 다시 아세틸화 시키는 것도 불가능하지는 않으나 매우 어렵다.
게다가 알칼리 가수분해에 의한 분해방법으로는 비교적 동일한 크기의 단편들을 얻기가 어려운데, 약제학적으로는 일정하고 표준품질을 가진 균일 생성물이 필요하다.
초음파에 의한 분해방법의 경우에는 H. 인플루엔자에 타입 B의 폴리사카라이드의 말단 인산기가 초음파 처리에 의해 소실되는 것으로 나타났다. 마찬가지로 이 처리과정에서 폴리사카라이드 사슬의 분지점에 있는 인산기가 소실될 수 있다.
또한 초음파에 의해 비교적 균일한 크기의 단편들이 얻어질 수 있다해도 아주 작은 크기의 단편을 만들기 위해서는 매우 오랫동안 처리해야하는데, 이 경우 무엇보다도 좋지 않은 것은 장비가 빠르게 손상되는 것이다. 이와 같이 그 효율이 제한되어 있으므로 산업적인 규모로 초음파 방법을 적용하는 것은 배제되어야 한다.
마지막으로 효소를 이용해 폴리사카라이드를 분해하는 것은 적절한 효소가 알려져 있는 경우만으로 제한된다. 그러나 이 방법의 주된 단점은 그 기질에 대해 효소가 원래 매우 큰 특이성을 가진다는데 있다.
그러므로 백신 분야를 위해서는 종래기술에 따른 방법이 지닌 여러가지 단점들이 더 이상 나타나지 않으면서 폴리머 분해가 가능하도록 매우 기술적이고도 경제적인 방법상의 진보가 이루어져야 할것이다. 즉, 특히 다음과 같은 이유때문에 여러가지 장점이 결합되어 있는 항원성 폴리사카라이드의 분해 방법이 필요한 것이다 :
- 폴리사카라이드에서 필수적인 구조적 결정기인 적어도 하나의 에피토프가 단편화되도록 하면서 글리코사이드 숫자가 감소된 올리고사카라이드를 얻을 수 있어야 한다.
- 예상될 수 있는 어떠한 항원성 폴리사카라이드에 대해서도 이용할 수 있어야 한다.
- 충분히 균일한 크기의 단편들을 얻을 수 있어야 한다.
- 비용이 저렴하고 취급이 극히 용이해야 한다.
놀랍게도 이제 산화-환원 폴리머 분해방법(oxidation-reduction depolymerisation)에 의해 상기 목적들이 달성되는 것으로 밝혀졌다.
지금까지 흔히 영어 약자 ORD로 지칭되었던 이 방법은, 헤파린, 히알루론산, 덱스트란 및 DNA와 같은 폴리사카라이드를 분해시키는데 이용되었는데, 이것은 본출원의 목적과는 완전히 다른 목적이었던 것이다. 그 목적은 예를 들면 생성물의 점도를 줄이거나 또는 헤파린과 같이 선형 분자인 경우에는 다른 항원 응집 작용을 갖는 것으로 알려진 작은 크기를 갖는 단편을 얻는 것이었다. 물론 이 방법이 적용되는 생성물은 면역학적으로 중요하지 않았고 얻어진 단편들의 반복 단위의 완전성에 대한 연구도 수행되지 않았다.
또한 환의 탄소-탄소 결합을 분해함으로써 인산기 또는 탄수화물 환을 파괴하는 방법으로서 ORD반응을 설명하고 있는 종전의 간행물들은 다음과 같이 많이 있다:
K. Uchida, Carbohydrate Researh, (1988) 173: 89-99; H. Uchiyama, Journal of Biological Chemistry, (1990) 265 : 7753-7759; S. W. Green, The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB; Academic Press (1980) : 1132; A. Herp, The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB; Academin Press (1980) : 1276; Kochetkov eet al, Radiation Chemistry of Carbohydrates, Pergammon Press, Oxford, (1979).
종전 기술로부터 도출되는 전체적인 인상은 ORD 반응이 일반적으로 파괴적인 반응으로 인식된다는 것이다. 그러므로 원하는 목적, 즉 에피토프의 보존을 위해서는 ORD 반응방법이 알칼리 가수분해나 초음파를 이용한 방법보다 좋다고 할 수가 없었다.
따라서, 본 발명 이전에는 개체의 면역적 방어작용을 강화시킬 수 있게 하는 약제에서 활성제로 이용될 수 있도록, 해당 폴리사카라이드를 산화-환원 분해방법에 의해 분해하여 특징적인 반복단위 구조를 보존시킨 채로 올리고사카라이드를 얻을 수 있다는 것에 대해서 전혀 증명되지 않았었다.
그러나 이제 출발 폴리사카라이드에서 적어도 하나의 항원성 결정기를 보존하고 있는 올리고사카라이드를 얻는데 있어서 ORD 방법을 이용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
또한 항원성 폴리사카라이드에 적용될 때는, ORD 반응이 폴리사카라이드를 무작위하게 분해하는 자유 라디칼을 만들어 내는 반응으로 알려져 있음에도 불구하고, 적절한 조건 하에서 크기의 균일성면에서 완전히 만족할만한 단편들을 얻을 수 있게 해 주는 것으로도 밝혀졌다.
결과적으로 본 발명은 병원체로부터 얻어진 항원성 폴리사카라이드의 적어도 하나의 항원성 결정기를 보존하고 있는 올리고사카라이드를 제공해주고 있으며, 이 올리고사카라이드는 (i) 상기 폴리사카라이드를 산화-환원 폴리머 분해 반응으로 분해시키고, (ii) 이렇게 하여 얻어진 올리고사카라이드를 회수하고, (iii) 이것을 다시 콘쥬게이트 또는 담체(carrier)에 결합된 형태로 얻기 위해 콘쥬게이트 파트너 또는 담체와 커플링시키는 과정으로 이루어지는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하고 있다.
"올리고사카라이드"란 분자들이 결합되어 있는 것을 의미한다; 각각의 분자들은 출발 폴리사카라이드에 비해 글리코사이드 단위 숫자가 줄어들어 있는데 예를 들면 4 내지 500 정도의 글리코사이드 단위를 포함하고 있다.
올리고사카라이드의 평균 분자량은 폴리사카라이드에 대해 상기 설명한 규칙에 따라 정의된다. 일반적으로 본 발명에 따른 올리고사카라이드는 세파로스 4BLC 컬럼상에서의 평균 용출상수가 0.3 내지 0.9, 특히 0.4 내지 0.8, 예를 들어 0.6 내지 0.7이다. 즉, 이러한 올리고사카라이드는 평균 분자량이 200,000 내지 2,000 DEq, 특히 150,000 내지 10,000 DEq, 보다 특히 60,000 내지 30,000 DEq이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 항원성 폴리사카라이드는 그람-음성 또는 그람-양성 세균 뿐아니라 곰팡이 일 수도 있는 병원체로부터 얻어지는 표면항원인데, 그 예로는 특히 스타필로코커스 속, 스트렙토코커스 속, 클레브시엘라 속, 살모넬라 속, 에스케리치아 속, 네이세리아 속, 시겔라 속, 헤모필루스 속등이 있다.
세균성 병원체로는 예를 들면 스트렙토코커스 뉴모니아에, 네이세리아 메닌지티디스, 살모넬라 티피, 또는 헤모필루스 인플루엔자에가 있다.
곰팡이 병원체로는 이스트, 특히 칸디다, 크립토코커스, 한세눌라, 리포마이세스, 리노클라디엘라 및 로도토룰라를 예로 들 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서는, 산화-환원 반응이 글루타치온, 시스테인과 같은 티올; 산소; 하이드로퀴논; 철 및 구리와 같은 다가 금속 이온; 아스코르빈산, 과산화 수소 중에서 특별히 선택될 수 있는 적어도 하나의 산화-환원 시스템의 존재하에서 이루어 지는데, 이들중에서도 마지막에 기재된 두가지가 바람직하다.
반응의 동력학에 영향을 줄 수 있는 여러가지 다른 실험상의 변수(생성물 농도, pH, 온도, 반응시간)들은 출발 폴리 사카라이드의 특성, 선택된 산화-환원 시스템 및 얻고자 하는 단편들의 평균 크기에 따라 본 기술이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람들에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 이러한 단편들을 특히 백신 제조에 이용하고자 하는 경우에는, 적절한 평균 크기를 갖는 단편들을 얻기 위해 상기 통상의 지식을 지닌 사람들은 다른 변수들을 조정하는데 특히 신경을 쓸 것이다. 즉, 항원성을 양호한 상태로 유지하고, 필요하다면 콘쥬게이트를 이용하기에 적합한, 예를 들어 상기 정해진 크기 범위의 단편들을 얻으려 할 것이다. 일반적으로 최적 반응 조건은 일상적인 테스트에 의해 결정될 수 있다. 그러나 좋은 결과를 얻을 수 있도록 해주는 실험들이 가이드로서 하기 실시예에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용할 폴리사카라이드를 추출하고 공지의 방법으로 정제하는데 있어서, 특히 알콜 또는 세틸트리메틸 암모늄브로마이드로 침전시키거나 겔 여과법을 이용한다. 이들 방법들에 대해서는 특히 참고문헌(R. I. Whistler, in Methods in Cargohydrate Chemistry, (1965) I : 3-62)을 참고로 한다.
폴리사카라이드는 5mg/ml 농도의 수용액으로 준비하는 것이 유리하다. 바람직한 농도는 0.5 내지 50mg/ml, 특히 0.5 내지 10mg/ml로 변화될 수 있다. 이러한 수용액이 출발물질로 이용될 수 있다.
상기 정의된 산화-환원 시스템이 폴리사카라이드 제조에 첨가되는데, 그 방법은 전부를 한번에 또는 연속 혹은 불연속적으로 첨가하여 산화-환원 시스템 : 폴리사카라이드의 최종적인 중량비가 0.01 내지 10, 특히 0.1 내지 5, 예를 들어 0.1 내지 1로 변화 될 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 방법은 pH 3 내지 8.5, 특히 3 내지 6.5에서 이용될 수 있다. 마찬가지로 반응 용액의 온도도 중요하지 않다 ; 즉 4 내지 60℃, 특히 18 내지 60℃ 범위에서 변화가 가능하다.
폴리사카라이드를 단편화시키는데 필요한 시간은 일반적으로 특별한 경우를 제외하고는 30분 내지 1시간이다; 예를 들어 S. 티피의 폴리사카라이드 Vi의 경우에는 반응시간이 더 길어진다. 반응시간은 얻고자하는 단편의 크기와 함수관계가 있다.
구체적인 실시예에 따르면 농도가 0.5 내지 50mg/ml, 특히 0.5 내지 10mg/ml인 폴리사카라이드 수용액에 아스코르빈산이 최종 농도가 0.01 내지 25mg/ml, 특히 0.1 내지 10mg/ml이 될때까지 첨가된다. 산소는 반응용액에 자연적으로 용해되는 정도도 일반적으로 충분하다; 그러나 충분하지 않다면 더 많은 양이 반응용액에 주입될 수 있다. 반응을 가속화시키기 위해 철 또는 구리와 같은 여러가지 산화상태를 갖는 용해 가능한 금속염의 존재하에서 반응을 시키는 것이 바람직하다. 금속염은 1μM 내지 100mM, 특히 1 내지 10mM 농도로 첨가될 수 있다.
상기 설명된 것과 또다른 실시예에 따르면, 아스코르빈산이 과산화수소 대신 이용되어 선택적으로 금속염의 존재하에서 0.1 내지 100mM, 특히 0.5 내지 10mM 농도까지 첨가될 수 있다.
폴리사카라이드를 ORD 반응시킴으로써 제조되는 올리고사카라이드는 평균 용출상수가 출발물질이었던 폴리사카라이드의 평균 용출상수보다 작다(비교는 동일한 크로마토그라피 컬럼을 이용하여 확실하게 이루어졌다).이 올리고사카라이드는 예를 들어 아세톤 또는 알콜등의 적절한 침전제에 의한 침전법, 적절한 분리 역치(threshold)를 가지고 있는 막을 이용한 여과법, 배척-확산 또는 이온교환 크로마토그라피법과 같은 종래의 방법에 의해 분리될 수 있다. 이어서 용출상수가 평균 용출상수와 같거나 근접한 분자들을 포함하고 있는 올리고 사카라이드만을 이용하기 위해 다른 선택적인 방법이 이용될 수 있다.
또한, 선택적으로 본 발명에 따른 올리고사카라이드는 공유 결합을 통해 펩티드 또는 단백질 성질을 갖는 화합물 또는 폴리아크릴레이트와 같은 또다른 유기 폴리머와 커플링됨으로써 특히 포유류에 있어 올리고사카라이드의 면역성을 증진시키는 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 콘쥬게이션을 위한 파트너로는 멤브레인 단백질, 복합성 멤브레인 단백질의 써브 유니트 또는 세포질성 단백질 뿐 아니라 톡신(toxin), 상응하는 아나톡신(anatoxin) 또는 복합성 톡신의 써브 유니트가 있다. 예로서는 백일해 톡신, 콜레라 톡신, 파상풍 톡신 및 디프테리아 톡신이 있다. 이들 단백질은 원래의 세균으로부터 추출되거나 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
백신으로서 이용될 수 있는 콘쥬게이트를 얻기 위해 공유결합을 통해 올리고사카라이드와 콘쥬게이션 파트너를 커플링 시키는 반응은 종래의 방법에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들어 콘쥬게이션 파트너의 작용기와 반응할 수 있는 작용기가 올리고 사카라이드에 만들어질수 있다. 이중 작용성 커플링제가 올리고 사카라이드와 반응한 다음 콘쥬게이션 파트너와 반응하거나 그 역도 가능하다. 이러한 여러가지 커플링 방법에 대해서는 특히 참고문헌(W. E. Dick and M. Beurret in Conjugates Vaccines, J. M. Cruse, R. e. Lewis Jr Eds, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger (1989) 10 : 48)을 참고로 한다. 또한 산화-환원 단편화 방법은 S. 뉴모니아네타입 6B 및 19F, H, 인플루엔자에 및 N. 메닌지티디스 그룹 A의 폴리사카라이드로부터 유도된 올리고사카라이드에 환원기를 도입시킨다. 그러므로 환원성 아미노화 콘쥬게이션 방법을 이용할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 올리고사카라이드의 면역성은 올리고사카라이드가 공유적으로 결합하는 담체 리포좀을 이용함으로써도 역시 증진될 수 있다. 면역성은 또한 이온력 또는 소수성 힘에 의해, 예를 들어 사이클로덱스트린, 리포좀 및 ISCOMS에 도입되는 올리고사카라이드를 보유하는 벡타(vector)들에 의해 증진될 수도 있다.
그러므로 본 발명은 상기 정의된대로 여러가지 형태, 특히 콘쥬게이트 형태 또는 담체 리포좀과 커플링되어 있거나 벡타에 도입된 형태로 제공되는 올리고사카라이드에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 올리고사카라이드는 콘쥬게이트의 형태로 제공되는 것이다.
본 발명에 따른 올리고사카라이드는 개체 특히 포유류, 특히 사람에 있어 면역 방어작용을 강화시키는데 유용한데, 예를 들어 세균 감염 또는 사상균 감염 등 병원체에 의해 유발되는 감염을 예방하거나 감염효과를 약화시키는데 효과적이다. 서로 다른 항원성 폴리사카라이드로부터 유도된 본 발명에 따른 올리고사카라이드 혼합물과 마찬가지로 본 발명에 따른 올리고 사카라이드 자체는 아니지만 활성 성분과 혼합되어 있는 혼합물도 또한 효과적이다. 이러한 혼합물이 다가 백신의 제조에도 적합하다.
결론적으로 본 발명은 다음과 같은 것들을 제공하고 있다:
- 본 발명에 따른 올리고사카라이드를 적어도 하나 활성성분으로서 포함하고 있는 약제학적 조성물; 이 조성물은 특히 백신이다.
- 본 발명에 따른 올리고사카라이드의 치료제로서의 용도;
- 본 발명에 따른 적어도 하나의 올리고사카라이드를, 치료학적 관점에서 충분한 양만큼 백신 처리를 필요로 하는 개체에 투여하는 작업을 포함하는, 개체의 면역 방어작용을 강화시키기 위한 백신화등의 방법;
- 개체의 면역 방어작용을 강화시키기 위해 약제학적 조성물을 제조할때 본 발명에 따른 올리고사카라이드를 활성 성분으로서 사용하는 용도;
- 상기 약제학적 조성물의 제조방법에 있어서, (i) 출발 폴리사카라이드를 산화-환원 방법으로 분해시키고, (ii) 필요하다면, 얻어진 올리고사카라이드와 콘쥬게이션 파트너 또는 리포좀과 커플링시키거나 리포좀, ISCOMS 또는 사이클로덱스트린에 도입시키고, (iii) 이렇게 하여 얻어진 생성물을 적절한 약제 형태로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
바람직한 약제학적 조성물은 적어도 하나의 올리고사카라이드를 콘쥬게이트의 형태로 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 종래의 방법으로 제조될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 올리고사카라이드는 예를 들어 파이로젠이 없는 생리식염수 용액과 같은 약제학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체와 결합된다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 완충용액, 보존제 또는 안정화제, 보조제 및 필요하다면 동결건조부형제와 같은 통상의 성분들을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 올리고사카라이든는 희석제, 담체 또는 상기 언급된 성분의 존재하에서 보존될 수 있다. 다른 방법으로는 사용하기 직전에 희석제, 담체 또는 상기 성분이 첨가될 수도 있다.
따라서 본 발명은 다음과 같은 것을 포함하고 있는 키트를 제공한다:
a) 활성 성분으로서 본 발명에 따른 올리고사카라이드의 적어도 하나를 필수 구성성분으로 하는 약제학적 조성물;
b) 약제학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체, 완충력이 있는 화합물, 보존제 또는 안정화제 및 보조제 중에서 적어도 한가지를 포함하는 조성물;
c) 예를 들어 a) 및 b)에 기재된 조성물 또는 그 혼합물 형태로 투여하기 위한 지시 설명서.
본 발명에 따른 조성물은 종래의 방법으로 투여될 수 있는데 특히 주사가능한 현탁액의 형태로 피하주사, 근육주사 또는 정맥주사 또는 경구용 형태로 투여될 수 있다. 투여는 1회 투여 또는 1회 추가투여 또는 일정한 시간 간격에 따라 여러번 이루어질 수 있다. 적정 투여량은 예를 들어 투여 객체나 투여방식 등의 여러가지 변수에 따라 변화한다. 그러나 0.5ml정도의 양에 올리고사카라이드를 1 내지 200μg 사용할 경우 좋은 결과를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 하기 실시예와 제1도 내지 제4도를 참고로 하여 보다 상세히 설명된다.
제1도는 S. 뉴모니아에 타입 14 (a), 타입 1 (b), S. 티피 (c), S. 뉴모니아에 타입 6B (d), H. 인플루엔자에 타입 B (e), S. 뉴모니아에 타입 19F (f), N. 메닌지티디스 그룹 A (g), S. 뉴모니아에 타입 18C (h), 타입 23F(i), 클레브시엘라 오재내 혈청형 K4 (j), 시겔라 플렉스네리 혈청형 1b (k) 및 크립토코커스 네오포르만스 스트레인 98 (1)의 캡슐성 폴리사카라이드의 반복 단위에 대한 구조식을 나타낸다. 여기에서 (a)는 중성 폴리사카라이드와, (b)와 (c)는 폴리사카라이드 사슬에 우론산(uronic aids)을 포함하고 있는 폴리사카라이드와, (d) 내지 (i)는 인산화된 폴리사카라이드와, (j) 및 (k)는 각각 음이온성 및 중성의 리포폴리사카라이드와, (1)은 음이온성의 곰팡이 폴리사카라이드와 각각 대응한다.
제2a도와 제2b도는 세파로오스 4BCL 컬럼을 이용한 경우 S. 티피 (2a)와 S. 뉴모니아에 타입 1 (2b)의 단편화되지 않은 폴리사카라이드의 용출 프로파일을 나타낸다. 크로마토그라피의 조건은 다음과 같다: 5mg/ml 농도의 폴리사카라이드 용액 2ml을 0.2M NaCl로 미리 평형화된 세파로오스 컬럼에 부하한다. 용출은 0.2M NaCl을 42ml/h의 속도로 하여 이루어진다. 용출 프로파일은 206nm에서의 광학밀도 (optical density)를 자동적으로 측정함으로써 분석된다. 2a와 2b에서의 컬럼의 전체 용적은 201.84ml인 반면 사용적은 76.56ml이다.
제3도는 500,000 내지 20,000 범위의 덱스트란에 대한 캘리브레이션 계열을 나타낸다.
제4a도와 제4b도는 세파로오스 4BCL컬럼을 이용한 경우 S. 티피 (4a)와 S. 뉴모니아에 타입 1 (4b)의 폴리사카라이드를 산화-환원 방법으로 분해하여 얻은 올리고사카라이드의 용출 프로파일을 나타낸다. 크로마토그라피에 대한 조건은 제2도에 대한 설명에 기재되어 있는 바와 같다.
[실시예 1]
아스코르빈산의 존재하에서 S. 티피의 폴리사카라이드 Vi의 분해.
Gotschlich외 다수에 의한 방법(Prog. Immunobiol. Standard. (1972) 5: 485)에 따라 얻어진 폴리사카라이드 Vi의 건조 파우더를 1mg/ml의 양으로 파이로젠이 없는 물에 취한다. 이 폴리사카라이드의 평균 분자량 (MW)은 세파로오스 4BCL 컬럼상에서 Kd가 0인 것에 해당한다.
이 용액 500ml을 37℃로 미리 가열하여 여기에 100mM 아스코르빈산, 10mM CuSO4, 10mM FeSO4를 포함하고 있으며 최종의 아스코르빈산 농도가 0.44mg/ml인 수용액 12.5ml를 2시간동안 계속해서 서서히 첨가한다. 이렇게 하여 얻어진 반응 용액의 pH는 약 4이다. 약하게 교반하면서 37℃에서 3시간 (시약 첨가 시간 포함)동안 반응을 계속시킨다.
이어서 반응 혼합물을 3K 한외여과막(컷오프: 3킬로달톤)을 이용해 여과한다. 잔류물을 0.5M NaCl수용액으로 한번 세척한 후 물로 세척한다. 다시 잔류물을 약 100ml의 물에 취한 다음 보존을 위해 동결건조시킨다.
분해도는 세파로오스 4BCL컬럼을 이용해 얻은 그래프(제4a도)를 적분하여 계산한 값으로 95%이다. 또한 이렇게 하여 얻어진 올리고사카라이드의 평균 MW는 그라나드 외 다수의 방법(상기 참조)에 의해 측정된다. 평균 용출상수로 표현되는 후자는 0.6인데, 이것은 MW가 60,000DEq(덱스트란을 표준물질로 이용)에 해당하는 것이다.
NMR(핵자기 공명)스펙트로미터에 의해 올리고사카라이드를 분석하면 폴리사카라이드의 특징적인 반복 단위가 분해반응 후에도 보존되고 있음이 분명하게 나타난다. 특히 폴리사카라이드 사슬에서 분지점의 작용기나 당은 전혀 손실되지 않았다.
폴리사카라이드 Vi의 반복 단위의 특징인 화학적 작용기는 비색계 (colorimeter)에 의한 분석법에 의해 분석된다. 분지점에 있는 0-아세틸기는 헤스트린(Biol. Chem. (1949) 188: 249) 방법에 의해, 선형 구조의 폴리산 (polyacids)은 스톤 외 다수의 방법(Clin. J. Microbiol. (1988) 28: 719)에 따라 분석된다. 이 분석 방법들은 분해되지 않은 폴리사카라이드와 생성된 올리고사카라이드에 대해 똑같이 적용된다.
폴리사카라이드와 올리고사카라이드에 대해 측정된 [0-아세틸] / [폴리산]의 비는 동일하다. 이것은 바로 폴리사카라이드의 분해방법이 모든 불안정한 0-아세틸기를 보존할 수 있게 해 주는 방법이라는 것을 보여주는 것이다.
[실시예 2]
과산화수소의 존재하에서 S. 티피의 폴리사카라이드 Vi의 분해.
상기 Gotschlich 외 다수의 방법에 따라 얻은 폴리사카라이드의 건조 파우더를 0.4mg/ml의 양으로 pH7.5인 0.2M 인산 완충용액에 취한다. 이 폴리사카라이드의 MW는 세파로오스 4BLC 컬럼상에서 Kd값으로 0에 해당한다.
이 용액 100ml을 37℃로 미리 가열하여 여기에 0.34mg/ml의 H202와 1.1ml의 CuSO4(2.6mg/ml농도)를 포함하고 있는 수용액 11ml을 약하에 교반하면서 천천히 혼합한다. 37℃에서 약하게 교반하면서 1시간동안 반응을 계속시킨다.
반응시간을 1시간 대신 2시간으로 하는 것을 제외하고는 같은 조건으로 실험을 반복한다.
두 경우에 각각 얻어진 올리고사카라이드를 회수한 다음 실시예 1에 기재되어 있는 대로 정제한다.
마찬가지로, 이렇게 하여 얻어진 올리고사카라이드의 특성을 실시예 1에 언급된 방법에 따라 측정한다. 그 결과는 다음과 같다:
- 두 경우 모두 폴리사카라이드 Vi의 분해도는 100%이다.
- 1시간과 2시간 후에 형성된 올리고사카라이드의 평균 MW는 각각 Kd 값으로 0.7과 0.8이며; 이것은 각각 30,000과 10,000DEq에 해당한다.
- 두 경우 모두 반복 단위의 구조에 변화가 없다.
[실시예 3]
N. 메닌지티디스 그룹 A의 폴리사카라이드의 분해.
상기 Gotschlich외 다수의 방법에 따라 얻어진 N. 메닌지티디스 그룹 A의 폴리사카라이드의 건조 파우더를 pH7.5인 0.2M 인산완충용액에 1mg/ml과 5mg/ml의 양으로 취한다. 이 폴리사카라이드의 평균 MW는 세파로오스 4BCL 컬럼상에서 Kd값이 0.15에 해당한다.
상기 두 용액을 37℃로 미리 가열한다.
3a) 1mg/ml농도인 용액 100ml에 100mM 아스코르빈산, 10mM CuSO4, 10mMFeSO4를 포함하고 있는 0.75ml의 반응용액을 첨가한다. 37℃에서 1실간 30분 동안 교반하면서 계속 반응시킨다. 0.75ml의 반응 용액을 다시 첨가한다; 이렇게 하여 아스코르빈산의 최종농도가 0.26mg/ml이 된다. 같은 조건하에서 다시 1시간 30분 동안 계속 반응시킨다.
3b) 5mg/ml 농도인 용액 100ml에 100mM 아스코르빈산, 10mM CuSO4 및 10mM FeSO4를 포함하고 있는 1.5ml의 반응 용액을 첨가하면 아스코르빈산의 최종 농도가 0.26mg/ml이 된다. 37℃에서 1시간 30분 동안 교반하면서 계속 반응시킨다.
3a)와 3b)에서 얻은 올리고사카라이드를 회수하고 실시예 1에 기재되어 있는대로 정제한다. 마찬가지로 실시예 1에 기재되어 있는대로 분석한다. 두 경우 모두 NMR에 의해 분석되었을때 반복 단위의 파괴 없이 분해도가 100%이다. 3a)에서 얻은 올리고사카라이드의 평균 MW는 Kd로 0.7(30,000 DEq에 해당)이고, 3b)에서 얻은 올리고사카라이드의 평균 MW는 Kd로 0.4(110,000DEq에 해당)이다.
이러한 결과들은 모두 실험 조건들(반응제의 첨가방식 및 반응시간뿐만아니라 폴리사카라이드 및 산화-환원제의 농도)을 변화시킴으로써 100%의 분해도를 유지하면서도 실질적으로 다른 평균 MW를 갖는 올리고사카라이드가 얻어질 수 있다는 것을 보여주고 있다.
마지막으로, 실시예 2와 마찬가지로 본 실시예도 진실로 본 분해반응이 중성 pH 가까이에서 이루어질 수 있으므로 분해가 산이나 알칼리에 의한 가수분해가 아닌 산화-환원에 의한다는 것을 보여주고 있다.
[실시예 4]
완충용액에서 S. 뉴모니아에 타입 1 및 19F 와 H. 인플루엔자에 타입 B의 폴리사카라이드의 분해.
1982년 6월 18일자로 공개된 프랑스 특허출원 FR 2,495,939호에 기재된 방법에 따라 얻은 S. 뉴모니아에 타입 1과 19F의 폴리사카라이드와 상기 Gotschlich 외 다수의 방법에 따라 얻은 H. 인플루엔자에 타입 B의 폴리사카라이드를 이용하여 실시예 3(3a, 3b)을 반복한다;
그 결과는 다음과 같다;
ND : 측정안함
NMR 분석법에 의해 올리고사카라이드를 분석한 결과는 폴리사카라이드의 특징적인 반복 단위의 구조가 분해반응 후에도 보존되고 있음을 명확히 보여준다.
[실시예 5]
비완충용액에서의 N. 메닌지티디스 그룹 A와 S. 뉴모니아에 타입 1, 14, 19C, 19F 및 23F의 폴리사카라이드의 분해.
다음과 같은 사항을 제외하고는 반응 뿐아니라 폴리사카라이드에 대한 실험도 실시예 3에 기재된 방법에 따라 실시한다;
(i) 폴리사카라이드 용액을 5mg/ml의 농도로 파이로젠이 없는 물을 이용하여 제조한다. (ii) 반응 용액을 한꺼번에 첨가하여 최종 농도가 2.5mg/ml이 되도록 한다. (iii) 반응을 단 1시간 동안만 계속시킨다.
이렇게 하여 얻어진 올리고사카라이드를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 회수하고 정제한다. 그들의 특성들에 대해서도 실시예 1에 기재되어 있는 방법에 따라 측정한다. 각각의 폴리사카라이드에 대한 분해도는 반복 단위의 파괴 없이 100%이다. 이 마지막 사항은 비색 분석법(colorimetric assay)에 의해서도 역시 밝혀진다: 헥소오스는 스코트 등의 방법(Scott et al., Anal. Chem. (1953) 25: 1650), 헥소사민(hexosamines)은 가트 등의 방법(Gatt et al., Anal. Biochem. (1965) 15: 167), 람노오스는 디셰 등의 방법(Dische et al., J. Biol. Chem. (1948) 175: 595), 포스페이트는 첸등의 방법(Chen et al., Anal. Chem. (1956) 28: 1756)에 의해 각각 분석한다. S. 뉴모니아에 타입 14와 이로부터 유도된 올리고사카라이드의 경우에는 [헥소오스] / [헥소사민] 비율이 실질적으로 동일하다. [람노오스] / [헥소오스] 및 [포스페이트] / [헥소오스] 비율도 S. 뉴모니아에 타입 18C 및 23F의 경우에 대해 각각 알아본 결과 마찬가지이다.
NMR 스펙트로미터에 의해 올리고사카라이드를 분석해 보면 반복 단위에 비동일성을 나타내는 시그날이 감지되지 않는데 이것은 올리고사카라이드가 본래대로의 완전한 반복 단위로 구성되어 있음을 나타내는 것이다.
마지막으로 올리고사카라이드의 평균 MW에 대해 측정한 결과는 다음과 같다:
[실시예 6]
(S. 티피의 올리고사카라이드 Vi/콜레라 톡신의 B 써브 유니트) 콘쥬게이트의 제조.
6a) 올리고사카라이드 Vi으로의 NH2기 도입.
실시예 1에서 얻어진 올리고사카라이드 Vi의 동결건조물을 pH 8의 인산 완충용액에 10mg/ml의 양으로 취한다. 이 용액에 디아미노헥산과 NaCNBH2각각의 최종농도가 12.5mg/ml이 되도록 한다. 실온에서 6일동안 반응을 계속시킨다. 이어서, 물을 사용해 투석하고 동결건조시킨다.
스나이더 등의 방법(Shnyder et al., Anal. Biochem. (1975) 64: 284)으로 분석하면 NH2기가 도입되는 것으로 나타난다. 이와 마찬가지로 헤스트린 분석법에 의하면 0-아세틸기가 여전히 보존되고 있음이 나타난다.
6b) 반응성 작용기의 도입.
6a)에서 얻어진 동결건조물을 40mg/ml의 양으로 수용액에 취한다. 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 디숙신이미딜 수버레이트 (DSS)가 40mg/ml의 농도로 존재하는 용액 80ml을 상기 수용액 20ml에 첨가한다. 실온에서 1시간동안 반응을 계속시킨다. 이어서 DMSO/디옥산 혼합물을 이용해 침전시킨다.
6c) 콘쥬게이션.
6b)에서 얻어진 침전물을 0.5M NaCl 용액에 40mg/ml의 양으로 취한다. 이와 함께 콜레라 톡신의 B 써브 유니트 용액을 pH 6.5인 0.2M 인산 완충용액에 10mg/ml의 양으로 취한다. (Tayor et al., Eur. J. Biochem. (1981) 113: 249)
이렇게 하여 만들어진 두 용액을 함께 혼합한다. 올리고사카라이드/단백질의 중량비는 약 1이다. 실온에서 15시간동안 반응을 계속시킨다.
6d) 정제.
커플링되지 않은 단백질과 올리고사카라이드를 제거하기 위해서 상기 혼합물을 분리 역치가 50,000인 막이 정착된 한외여과 미니카트리지 (밀리포어)를 이용해서 여과한다. 잔류물을 0.3M NaCl로 세척하고 멸균여과시킨 후 NaCl 8/1000, 머티올레이트(merthiolate) 1/10,000로 하여 200μg/ml의 양으로 보존한다.
[실시예 7]
(올리고사카라이드/파상풍 아나톡신) 콘쥬게이트의 제조.
실시예 5에서 S. 뉴모니아에 타입 14와 23F의 폴리사카라이드로부터 얻어진 올리고사카라이드와 실시예 1에서 S. 티피의 폴리사카라이드 Vi로부터 얻어진 올리고사카라이드를 콘쥬게이션시키는데 있어서, 콜레라 톡신의 B 써브 유니트 대신 뮬러와 밀러의 방법(Mueller and Miller, J. Bact. (1954) 67: 671)에 따라 만들어진 파상풍 아나톡신을 사용하여 실시예 6에 기재되어 있는 방법에 따라 실시한다.
S. 뉴모니아에의 올리고사카라이드로부터 얻어진 콘쥬게이트는 250μg/ml의 농도로 보존된다.
[실시예 8]
콘쥬게이트의 면역성의 예시.
OF1 마우스 (IFFA Credo)를 8개군으로 분리한다. 군의 각 마우스는 실시예 6 및 7에서 제조된 용액의 하나를 0.5ml 받거나, 또는 병행하여 대등하는 천연의 폴리사카라이드를 0.5ml 받는다. 주사는 피하로 수행된다. 이 주사는 14일 반복된다. 병행하여, 대조군은 단지 생리식염수만을 받는다.
첫번째 주사 14 및 28일 후, 첫번째 혈액 샘플을 수집하고 항-폴리사카라이드 항체 IgG를 ELISA 분석에 의하여 측정하였다(측정 플레이트는 비단편화된 폴리사카라이드로 코팅된다). 14 및 28일 후 항체 수준은 콘쥬게이트가 면역원성 임을 보여준다. 각 경우에 있어서 항체 수준은 대응하는 천연의 폴리사카라이드에 의하여 유도된 것보다 높다. 게다가, T-의존성 항원의 특성인 반동성 효과가 관찰된다.
[실시예 9]
활성성분으로서 콘쥬게이트를 포함하고 있는 백신성 약제학적 조성물.
실시예 7에서 얻어진 (살모넬라 티피의 올리고사카라이드 Vi / 파상풍 아나톡신) 콘쥬게이트를 사람에게 피하주사를 이용해 투여하기 위해 백신 투여량 0.5ml으로 제형화한다. 1회 투여량에 대한 조성은 다음과 같다. :
- S. 티피의 올리고사카라이드 Vi 콘쥬게이트 10μg.
- pH 7인 인산 완충액 475μg(PO4이온으로서).
- NaCl 4250μg.
- 머티올레이트 0.05μg.
- 주사용 물 적량을 가하여 0.5ml로 한다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1 내지 화학식 12 중에서 선택된 하나 이상의 반복 단위를 포함하는 항원성 폴리사카라이드의 산화-환원 해중합 산물로서, 4-500개의 글리코사이드 반복 단위를 가지며, 상기 폴리사카라이드의 반복 단위의 구조 및 불안정한 작용기를 포함하는 항원성 결정기를 보존하고 있는 올리고사카라이드.
    [화학식 1]
    [화학식 2]
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  2. 제1항에 있어서, 세파로오스 4BCL 컬럼상에서의 평균 용출 상수가 0.2 내지 1인 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  3. 제2항에 있어서, 세파로오스 4BCL 컬럼상에서의 평균 용출 상수가 0.4 내지 0.8인 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  4. 제3항에 있어서, 세파로오스 4BCL 컬럼상에서의 평균 용출 상수가 0.6 내지 0.7인 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  5. 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서, 항원성 폴리사카라이드가 병원성 세균으로부터 얻어진 캡슐성 폴리사카라이드인 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  6. 제5항에 있어서, 병원성 세균이 스타필로코커스 속, 스트렙토코커스 속, 클레브시엘라 속, 살모넬라 속, 에스케리치아 속, 네이세리아 속 및 헤모필루스 속으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  7. 제6항에 있어서, 병원성 세균이 S. 티피, S. 뉴모니아에, N. 메닌지티디스 및 H. 인플루엔자에로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  8. 제1항에 있어서, 콘쥬 게이트의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  9. 제8항에 있어서, 콘쥬게이션 파트너가 펩티드, 단백질 및 유기 폴리머로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  10. 제9항에 있어서, 콘쥬게이션 파트너가 백일해 톡신, 콜레라 톡신, 파상풍 톡신 및 디프테리아 톡신으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  11. 제1항에 있어서, 포유류에서 면역성을 증가시킬 수 있는 벡터에 도입되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  12. 제1항에 있어서, 리포좀에 도입되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드.
  13. 반복 단위에 불안정한 작용기를 포함하는 항원성 폴리사카라이드를 해중합하여 올리고사카라이드를 제조하는 방법에 있어서, (i) 병원체로부터 얻은 표면 항원인 항원성 폴리사카라이드를 산화-환원제를 함유하는 수용성 용액에서 산화-환원 폴리머분해 반응시키고 ; (ii) 이렇게 하여 얻어진 올리고사카라이드를 회수하는 단계를 포함하여; 상기 불안정한 작용기와 반복 단위의 구조를 보존하고 있는 올리고사카라이드의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 산화-환원 폴리머분해 반응이 아스코르빈산 또는 과산화수소와 같은 산화-환원제의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 산화-환원 폴리머분해 반응이 아스코르빈산 또는 과산화수소와 같은 산화-환원제의 존재하 및 철 또는 구리 염의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드의 제조방법.
  16. 제1항의 올리고사카라이드의 적어도 하나를 활성성분으로서 포함하고 있는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 백신 조성물을 구성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 산화-환원 폴리머분해 반응이 pH 3-8.5에서 수행되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서, 산화-환원 폴리머분해 반응이 4℃-60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드의 제조방법.
  20. 제13항에 있어서, 산화-환원 폴리머분해 반응이 0.01-25mg/ml의 아스코르빈산 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 올리고사카라이드의 제조방법.
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