JPH06506233A - 病原体から得られる抗原多糖から誘導されたオリゴ糖 - Google Patents

病原体から得られる抗原多糖から誘導されたオリゴ糖

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病原体から得られる抗原多糖から誘導されたオリゴ糖本発明は病原体(path ogenie agent)から得られる抗原多糖(antigenjc po lysaccharide)から誘導されたオリゴ糖、その製造方法、及び、特 に、そのワクチン製剤(vaecinal agent)としての使用に関する 。
バクテリア及び酵母のごときカビ(rungl)はその表面構造中に多糖を含有 している。即ち、大部分のバクテリアは、多かれ少なかれ強固にバクテリアに結 合しているが、厳密にいえば、包膜(envelope)ではない多糖質の滲出 物(exudate)で被覆されている。
この滲出物は莢膜(capsule)又は糖衣(glyeocalyx)と呼ば れている。
更に、グラム陰性バクテリアの外膜(outer membrane)は、特に 、リポ多糖化PS)からなる。最後に、多糖はカビの細胞壁(wall)にも存 在する。これらの多糖は、実際には、感染哺乳動物において免疫応f(1mmu nological response)を誘発する表面抗原(surface  antigen)である。
かかる多糖は、その構成成分と結合か明確に規定されている(derine)、 かつ、各々、考慮しているカビ又はノくクチリア種の特性である反復単位に基づ いて形成されている。これらの反復単位はエピトープ(epitope) 、即 ち、抗原性決定構造体(antigenicity−determinjng  5tructures)を含有している。例示として、莢膜状(eapsula r)多糖又はリポ多糖から得られる種々の形式の反復単位が図1に示されている 。反復単位は、しばしば、例えば、分子の肴洛中又は分岐した位置中に存在する ホスフェート官能基並びに0−アセチル基及びピルビン酸基(pyruvate  group)のごとき非常に移動し易い(Iabl18)官能基を含有してい る。
多糖は、実際には、一つの分子から他の分子へと変動し得る量のグリコシド単位 を含有する重合体分子の組合せからなる。従って、多糖は平均分子量のみによる 分子量によって記載し得る。ホモ多糖の場合にはグリコシド単位は単糖である。
ペテロ多糖の場合にはグリコシド単位は一定の方法で連結された構成成分の鎖を 形成している。
多糖の平均分子量に関して、これはゲル濾過(gel filtraHon)に よって決定し得る。この場合、分子量はGranath等によりJ、Chrom 、(1967) 28 :69に記載の方法に従って、溶離定数(elutio nconstant)(KD)又はデキストラン当量(dextran equ ivalent)(DE)で表される;この方法は以下のごとく要約し、得る。
多糖溶液を、構成成分をその分子量に従って分離する拡散−排除ゲルクロマトグ ラフィ−(exclusion−difTusjon getchrollla tography)カラム上で分析する。この種のゲルは例えばセファデフクス (Sephadex)(Pharmacia) 、バイオ−ゲル(Bio−Ge t) (Bio−Rad)、フラクトゲル(Fractogel)(東洋ソーダ )、セファロース(Sepharose) (Pharmacja)及びセファ クリル(Sephacryl)(Pharmaeia)の商品名で商業的に入手 される。ゲルの分画(rractionation)の領域は、分析すべき分子 母集団(molecularpopu l at ton)内で表される分子量 の範囲に適合させるべきであることは明らかである。例えば、ゲル濾過カラム  セファロース2BCL 。
4BCL及び6BCLは、デキストラン当量で測定して、それぞれ、20.00 0.000〜100.000 : 5.000.000〜20.000及び1. 000.000〜1.0.000の分画の領域を有する。一般的には、塩溶液、 例えば、0.2M塩化ナトリウム溶液が溶離剤として使用される。溶離定数は下 記の式: [式中のVeは、考慮されている溶液(preparat 1on)の溶離容量 (eluHon vj!use)であり、Vtはカラムの全容量であり、Voは カラムの死容量(dead voluse)である〕に基づいて計算される。
例えば、図2a及び2bは、それぞれ、セファロース4BCLカラム上でのサル モネラ チフィ(!1ial■onella typhl)及びストレブトコ力 ス プニュウモニアx(Streptococcus pneuioniae)  1型の多糖の溶離図(elutLon prorlle)を示している。従っ て、S、チフィの多糖はセファロースABCL上では最大分子量を決定し得ない 重合体からなる。同様に、S、ブニニウモニアエl型の多糖は分子量が0〜0, 45I のに、の範囲で変動する重合体から本質的になる。定義により、多糖の 平均溶離定数は溶離図のスロープの接線(tangent)の交差点において; 又は、概略的には、溶離図の頂点において決定される。従って、図2a及び2b において示される多糖の平均溶離定数は、それぞれ、0及び0.04である。
1 デキストランを使用して作成した検量線(calibraHon 5erf es)に基づいて、溶離定数をDE、で表わされる分子量に変換し得る。例えば 、図3は検量線の一例を示す。
病原体、例えば、バクテリア又はカビの表面抗原である多糖は、その抗原性(a nt igenjcity)のために、ワクチン剤として良好な候補1 者であ る。実際に、多糖抽出物からなるワクチンは成人においては効果があることが証 明されている。しかしながら、このことは小児については適用されない。この重 要な問題を排除するために、多糖を蛋白質に共有結合させ、それによって、かく 得られる分子にT−依存特性(T−dependent character) を付与し、その免疫原性(fmunogenjcity)を増大させることが提 案され、成功している。
多糖に基づくワクチンとしては、従来、ネイセリア メニンギチジス(Nefs serla menlngltjdfs) A、C,Y又はw135群、ストレ ブトコカス プニュウモニアエ、ハエモフィルス インフルエンザエ(Haes ophi!us jnfluenzae) B型及びサルモネラ チフィニヨッ テ惹起される感染に対するワクチンがある。
病原体の抗原多糖は免疫原(issunogen)として潜在的に有利なもので あるが、数百刃デキストラン当量という大きさであり得る、その大きな分子量の ために、その使用が困難である。特に、これを複合体(conjugate)の 形、即ち、蛋白質とカップルさせた形で使用することを希望する場合には、解決 することが困難な技術的な問題に遭遇する。カップリング工程中に、ゲル又は凝 集物質が形成され、このことが、複合体を濾過により殺菌することを困難にして いる。
この問題を排除するために、多糖の大きさを減少させ、その取扱いを容易にする ことが既に提案されている。この目的のために種々の開裂(分解)(cleav age)方法が提案されている。即ち、例えば、これらの方法は超音波による断 片化(フラグメント化)(fragmentatlon)又は酸性、塩基性又は 酵素媒体中でのアルカリ性加水分解による断片化である。しかしながら、これら の断片化は全く満足し得ないものである。実際に、これらの方法においては抗原 特異性(antigen 5pecificity)に必要な化学的官能基が失 われることにより、特徴的なエピトープが全体的に或いは部分的に破壊される。
例えば、S、チフィ又はN メニンギチジスA群の莢膜状多糖の酸性又はアルカ リ性加水分解により、多糖の抗原特異性に必要なアセチル基が除去される。更に 、アルカリ性加水分解によって得られた断片の正確な再アセチル化(reace ty+atton)は、不可能ではないにしても、極めて困難である。
更に、アルカリ性加水分解による断片化法については、比較的均一な寸法の断片 を得ることは必ずしも可能ではなく、一方、医薬の製造においては一定なかつ標 準化された均一な製品が要求される。
超音波による断片化においては、例えば、H,インフルエンザより型の多糖の末 端ホスフェート基が超音波処理により失われることが示されている。このことに より、多糖鎖の分岐した位置にあるホスフェート基がかかる処理中に除去される 恐れが生じ得る。
更に、超音波を使用することにより比較的均一な大きさの断片を得ることができ るが、超音波法により十分に小さい寸法の断片を製造するためには非常に長い処 理時間を必要とし、これにより他の不利益、即ち、装置の急速な劣化を生じ得る 。その効率は限定されており、工業的な規模での超音波の適用は回避すべきであ る。
最後に、多糖の酵素解重合の使用は適当な酵素が知られている多糖に限定される 。しかしながら、この重大な不利益は酵素のその基質(substrate)に 対する高度の特異性に固有のもの(inherent)である。
従って、ワクチンの分野においては、重要な技術的なかつ経済的な進歩は、従来 の方法の種々の不利益をもはや生ずるこのない解重合法を提供し得るものでなけ ればならない。換言すれば、特に、有利な性質を組合せて有する、抗原多糖の解 重合法を提供し得ることが必要である:その理由は下記の通りであるニーこの方 法は減少した数のグリコシド単位を有するオリゴ多糖であって、しかも、断片化 されるべき多糖の少なくとも1個のエピトープの必須の構造決定因子(stru ctural determinant)を保存しているオリゴ多糖を得ること を可能にする。
−この方法は意図する任意の抗原多糖構造体に使用し得る。
−この方法は十分に均一な寸法の断片を得ることを可能にする。
−この方法は安価でありかつその使用が極めて簡単である。
驚くべきことに、今般、これらの目的は酸化−還元解重合反応によって達成され ることが見出だされた。
今日まで、英語においては、しばしば、ORDの略号で記載されるこの方法は、 ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン及びDNAを断片化するために、かつ、 本発明によって達成される目的とは全く異なる目的のために使用されていた。そ の目的は例えば生成物の粘度を低下させること、或いは、ヘパリンのごとき線状 分子の場合には異なる抗凝集活性(anticoagulant activi ty)を有することが知られている、寸法のより小さい断片を得ることであった 。勿論、この方法を適用した物質は免疫学的に重要なものではないので、得られ た断片の反復単位の結合性(lntegrity)の研究は行われなかった。
更に、ORD反応はホスフェート基を破壊する(destructive)が又 は炭水化物環の炭素−炭素結合の開裂(c I eavage)により炭水化物 環を破壊すると記載している多数の公知刊行物、例えば、K、Uchfda、  Carbohydrate Re5earch、(198g) 173 : 1 19−99+H,Uchiyama、 Journal ofBiologic al Chemistry、(1990) 265 ニア753−7759 ;  Sjl、Green、The Carbohydrates Chemist ry andPress(1980):1278 ; Kochetkov等、  Radiation Chemistry ofCarbohydrates 、 Pergammon Press、 0xford、<1979>が存在す る〇この分野の従来の状態から受ける全体的な印象は、ORD反応は一般的に破 壊的(destructive)であると認識されていたということである。
従って、所望の目的、即ちエピトープの保存という目的のために、ORD反応は 例えばアルカリ加水分解又は超音波処理を使用する方法より良好であり樗るとい うことを示唆するものは存在しなかった。
従って、本発明以前においては、個体(individual)の免疫防御性( immune defence)を強化することを可能にする活性化剤としてオ リゴ糖を製剤中で使用することを可能にするために、特徴的な反復単位構造が保 存されているオリゴ糖をそれぞれの多糖の酸化−還元断片化により得ることが可 能であることは明らかにされてぃながったことである。
今般、原料多糖の抗原決定基の少なくとも1個が保存されているオリゴ糖を傳る のにORD法を使用し得ることが発見された。
更に、酸化−還元解重合法は、抗原多糖に適用した場合には、ORD反応は多糖 を不規則な方法で開裂せる遊離基生成反応であるという事実にも拘らず、寸法の 均一性の観点から完全に満足し得る断片を好ましい条件下で製造することを可能 にすることが認められた。
従って、本発明によればこ病原体(phathogenic agent)がら 得られた抗原多糖の抗原決定基(antigenlc determinant )の少なくとも1個が保存(preserve)されているオリゴ糖であって、 (f)上記抗原多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、(if)かく得られたオリ ゴ糖を回収し、ついで、所望ならば、(ill)このオリゴ糖を複合体パートナ −(conjugation partner)又は担体(carrier)と カップルさせて、オリゴ糖を複合体(conjugate)形で得るか又は担体 と結合させる工程によって得られたものであることを特徴とするオリゴ糖が提供 される。
“オリゴ糖”は分子の組合せを意味すると理解される;各分子は原料多糖と比較 して、減少した数のグリコシド単位を有しており、例えば、4〜500個のグリ コンド単位を含有している。
オリゴ糖の平均分子量は多糖について前記した規則に従って定義される。一般的 には、本発明のオリゴ糖は0.3〜09、特に、0.4〜0.8、例えば、0. 6〜07の、セファ0−スABCLカラム上での平均溶離定数を有し得る。換言 すれば、かかるオリゴ糖は200,000〜2,000 DE9、特に150. 000〜10.000 DEq、特にeo、ooo〜30,000DE9の平均 分子量を有する。
本発明の好ましい要旨によれば、抗原多糖は、カビ(Fungus)並びに、特 に、スタフィロコカス(Staphylococcus)属、ストレブトコカス (St reptoeoecus)属、クレブシェラ(Klebsiel la )属、サルモネラ(Sa l taone I I a)属、ニジエリシア(E scherichla)属、ネイセリア(Neisseria)属、シゲラ(S h ige I I a)属及びハエモフィルス(Haemophi Ius) 属のグラム陰性又はグラム陽性バクテリアであり得る病原体から得られる表面抗 原である。
バクテリア性病原体(bacterial pathogenjc agent  )は、例えば、ストレプトコ力ス プニュウモニアエ、ネイセリア メニンギ チジス、サルモネラ チフィ又はハエモフィルス インフルエンザエである。
カビ性病原体(fungal pathogenic agent)は酵母、又 は、特に、カンジダ(Cand fda)属、クリプトコカス(Cryptoc occus)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、リポミセス(Lipo syces)属、リンコクラジエラ(Rhincocladiel Ia)属及 びロードトルラ(Rhodotorula)属から選ばれ得る。
本発明の目的のためには、酸化−還元反応は、特に、チオール、例えば、グルタ チオン、システィン;酸素;ヒドロキノン:多価金属のイオン、例えば、鉄及び 銅のイオン:アスコルビン酸、過酸化水素;から選ばれ得る酸化−還元系の少な くとも1種の存在下で行われる;最後の二つが好ましい。
反応の活動性(kinetics)に影響する種々の実験パラメーター(生成物 濃度、pH1温度、反応時間)は、原料多糖の特性、選択された酸化−還元系及 び取得することを希望する断片の平均寸法に従って当業者により容易に決定し得 る。これらの断片が特にワクチンを目的とする場合には、適当な平均寸法を有す る断片、即ち、良好な抗原性を保存しているかつ、適当な場合には、複合体の使 用に適合する寸法を有する断片、例えば、前記で定義した大きさの程度を有する 断片が得られるように種々のパラメーターを調節するために当業者により特に注 意が払われるであろう。一般的には、最適な反応条件は日常試験により決定し得 る。しかしながら、指針として、良好な結果を得ることを可能にする実験値は後 記の実施例において特定されている。
本発明の方法に使用されるべき多糖は既知の方法、特に、アルコール又はセチル トリメチルアンモニウムブロマイドを用いる沈殿又はゲル濾過により抽出17、 精製し得る。これらの方法についの文献と1.では、特に、R,1,Whist ler、 Method in CarbohydrateChe+++1st ry、(1965) I:3−62を参照し得る。
多糖は5mg/mΩの濃度の水溶液の形で調製することが有利である。
有利な濃度は05−・−501T1g/ mD 、特に、05〜10 sg/− の範囲で変動させ得る。かかる水溶液を出発原料として使用1.得る。
」二π己て定義(7た酸化−還元系は全部を一回で、又は、連続的な又は非連続 的な方法で、かつ、酸化−還元系:多糖の最終重量比が001〜10、特に、0 1〜5、例えば、01〜lになる量で、多糖溶液(polysaccharid e preparaf、1on)に添加される。
本発明の方法は3〜85、特に、3〜6.5のpHて使用(、得る。同様に、反 応媒体の温度は臨界的ではない:この温度は4〜60℃、特に、18〜40℃の 間で変動し得る。
多糖の所望の断片化を達成するのに必要な時間は、特別な場合を除いて、一般的 には、30分〜1時間である;例えば、Sチフィの多糖■1については、反応時 間は実質的により長い。反応時間は取得することを希望する断片の寸法に従って 調節し得る。
特別な態様においては、05〜50 egg/ sit 、特に、05〜10m g/nilの濃度を有する多糖の水溶液に、最終製産が0.01〜25mg/a J 、 特に、01〜10 mg/ tnβになるまでの量のアスコルビン酸を 添加する。酸素は反応媒体中に本来溶解している量で十分である;もし不十分な 場合には、反応媒体に酸素を更に吹込むことかできる。
反応を促進させるために、本発明の方法を種々の酸化状態の金属、例えば、鉄又 は銅の可溶性塩の存在下で行い得る。金属塩は1μM〜100 mM、特に、1 〜10 mMの濃度で添加し得る。
上記した態様の更に別の態様によれば、アスコルビン酸を過酸化水素で置換する ことができ、この過酸化水素は、場合により金属塩の存在下、o、i〜100  mM、特に、0.5〜10 iMまでの濃度で添加し5得る。
多糖をORD解重合反応にかけることにより調製されたオリゴ糖は、このオリゴ 糖を断片化により誘導するのに使用された多糖の平均溶離定数より低い平均溶離 定数を有する分子の組合せからなる(この平均溶離定数の比較は明らかに同一の クロマトグラフィーカラ人を使用して行われたものである)。オリゴ糖は慣用の 方法、例えば、適当な沈殿剤、例えば、アヒトン又はアルコールによる沈殿、適 当な分離限界(separation threshold)を有する膜上ての 濾過、排除−拡散又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して単離1−2得る 。ついで、平均溶離定数に等しいか又はこれに近い溶離定数を有する分子を含有 するある種のオリゴ糖フラクシ旦ンた1」を使用するために選択を行い得る。
本発明のオリゴ糖は、特に晴乳動物におけるオリゴ糖の免疫原性を増大させるこ とのできる複合体(conjugate)を形成させるために、場合により、ペ プチド又は蛋白質系の化合物又は他の有機重合体、例えば、ポリアクリレートと 共有結合によりカップルさせ得る。複合体のパートナ−は、特に、バクテリア蛋 白質、例えば、トキシン、対応するアナトキシン又はマルチマー状(s+ult iierie) t・キシンのサブユニット並びに膜蛋白質、マルチマー状膜蛋 白質のサブユニット又は細胞質蛋白質であり傅る。例えば、ペルツシス(Per tussis) トキシン、コレラ(cholera) トキシン、テタナス( Tetanus) l・キシン及びジフテリアトキシンが挙げられる。これらの 蛋白質は元のバクテリアから抽出するか又は組換え法(reco@bjnant  route)により得ることができる。
ワクチンとして使用し得る複合体を得るためのオリゴ糖と複合体パートナ−との 共有結合によるカップリング反応は慣用の方法を使用して行い得る。例えば、複 合体パートナ−の官能基と反応し得る官能基をオリゴ糖上に形成させ得る。二官 能性カップリング剤を第1 リボ糖と反応させ、ついで複合体パートナ−と反応 させるか、又はこの逆のことを行い得る。これらの種々のカップリング方法を検 討するためには、特に、J、M、Cruse、 R,E、Lewis、Jr、編 、Contrib。
MIcrobiol、l5suno1. Ba5el、Karger(1989 ) 10 : 4gに掲載のConjugates Vaccinesと題する V、E、Dick及びM、Beurretの報文が参照される。更に、酸化−還 元断片化法においては、特に、S、ブニュウモニアエ6B型及び19F型、H, インフルエンザエ及びN、メニンキチジスA群の多糖から誘導されたオリゴ糠中 に還元性基が導入される。従って、このことは、還元的アミノ化複合技術を使用 することを可能にする。
本発明のオリゴ糖の免疫原性は担体リポソームを使用し、これにオリゴ糖を共有 結合させることによっても増大させ得る。免疫原性は例えばシクロデキストリン 、リポソーム及びISOOMSのごとき、イオン力又は疎水性力(hydrop hobicforce)による組込み(incorporat4on)によりオ リゴ糖を保持するベクターによっても増大させ得る。
従って、本発明は種々の形、特に、複合体の形、担体リポソームとカップルさせ た形又はベクター中に組込まれた形で提供されるオリゴ糖に関する。本発明の好 ましい要旨によれば、オリゴ糖は複合体の形である。
本発明のオリゴ糖は、例えば、病原体によって誘発される感染、例えば、バクテ リア感染又は真菌症(mycosis)の影響を排除又は減少させるために、哺 乳動物、特に、ヒトの個体(individual)の免疫防御性(Ianun e defence)を強化させるのに特に有用である。種々の抗原多糖から誘 導される本発明のオリゴ糖の混合物並びに本発明のオリゴ糖と、本発明のオリゴ 糖以外の活性成分との混合物も有用である。かかる混合物は多価ワクチン(po lyvalent vaccine)を調製するのに適当である。
従って、本発明によれば、更に、 一本発明のオリゴ糖の少なくとも1種を活性成分として含有する医薬組成物。こ の医薬組成物は特にワクチンである;一本発明のオリゴ糖の治療における使用; −個体の免疫防御性を強化させる方法、例えば、予防接種方法(vaccina tion)であって、本発明のオリゴ糖の少なくともlNをかかる処置、例えば 予防接種を必要とする対象者(subject)に治療の観点から十分な量投与 することからなる、個体の免疫防御性の強化方法; 一個体の免疫防御性を強化させるための医薬組成物中における活性成分としての 本発明のオリゴ糖の使用;−(1)原料多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、( it)所望ならば、得られたオリゴ糖を複合体パートナ−又はリポソームとカッ プルさせるか、又は、上記のオリゴ糖をリポソーム、lSC0M5又はシクロデ キストリン中に組込み、ついで、([ii)得られた生成物を適当な医薬の形に する、前記医薬組成物の製造方法;が提供される。
好ましい医薬組成物は少なくとも1種のオリゴ糖を複合体の形で含有している。
本発明の医薬組成物は慣用の方法で調製し得る。特に、本発明のオリゴ糖を薬学 的に許容される稀釈剤又は担体、例えば、発熱物質を含有していない(+)yr ogen(ree)生理的食塩溶液と組合せる。更に、本発明の医薬組成物は緩 衝液、保存剤又は安定化剤、補助薬及び適当な場合には凍結乾”燥賦形剤のごと き慣用の成分を含有し得る。本発明のオリゴ糖は稀釈剤、担体又は前記したごと き成分の存在下で保存される、別法として、稀釈剤、担体又は成分は使用直前に 添加し得る。
従って、本発明によれば、更に、 a)活性成分としての本発明のオリゴ糖の少なくとも1種から本質的になる医薬 組成物: b)M学的に許容される稀釈剤又は担体、緩衝力(bufferjng pow er)を有する化合物、保存剤又は安定化剤及び補助薬から選ばれた少なくとも 1種の成分からなる組成物; C)上記a)及びb)の組成物の、例えば混合物の形での同時的投与(conc ositant administration)のための取扱説明書(ins tructions) ; を含有するキット(kIt)が提供される。
本発明の医薬組成物は任意の慣用の経路、特に、例えば注射可能な懸濁液の形で 、皮下、筋肉内又は静脈内に投与するか又は経口投与し得る。投与は単一投与に より、又は、ある時間間隔の後に一回又は数回反復して行い得る。適当な投与量 は種々のパラメーター、例えば処置を受ける個体又は投与方法によって変動する 。しかしながら、良好な結果は1〜200μgのオリゴ糖を約0.5−の容量で 単位投与することにより得られ得る。
本発明を以下の実施例によりかつ図1〜4を参照して詳細に示す。
図1はS、ブニュウモニアエ14型(a)、l型(b)、S、チフィ(C)、S ブニュウモニアエ6B型(d)、H,インフルエンザ二B型(e)、S。
ブニュウモニアエ19F型(f)、N、メニンギチジスA群(g)、S、ブニュ ウモニアエ18C型(h)、23F型(i)、クレブシェラ オザエナエ(Kl ebsjella ozaenae)血清型(selotype) K4 (j ) 、シゲラ フレクスネリ(Shlgella rIexner+>血清型1 b (k)及びクリブトコカスネオフォルマンス(Cryptococcus  neoformans)菌株98 (1)の莢膜状(capsular)多糖の 反復単位の式を表わす。(a)は中性多糖に相当すること、(b)及び(C)は 多糖鎖中にウロン酸を含有する多糖に相当すること、(d) 〜(i)はリン酸 化(phosphorylated)多糖に相当すること、(j)及び(k)は 、それぞれ、アニオン性又は中性のリボ多糖に相当すること及び(1)はアニオ ン性カビ多糖に相当することが観察され得る。
図2a及び2bはセファロースABCLカラム上でのS、チフィ(2a)及びS 、プニュウモニアエl型(2b)の溶離図を表わす。クロマトグラフィーの条件 は下記の通りである:51g/−の多糖溶液r 2elを、予め0.2 M N aC(lを用いて平衡化したセファロースカラム上に負荷する。溶離は0.2  M NaCNを用いて42 sj! /hの速度で行われる。光学濃度を208 nmで測定することにより溶離図を自動的に分析する。図2a及び2bにおいて カラムの死容量は76.56sj7であり、全容量は201.84 mf)であ る。
図3はデキストランについての500,000〜20.000の検量線である。
図4aおよび4bはS、チフィ (4a)及びS、ブニュウモニアエl型(4b )の酸化−還元断片化により得られたオリゴ糖の、セファロースABCLカラム 上での溶離図である。クロマトグラフィーの条件は図2について述べたものと同 一である。
実施例 1: アスコルビン酸の存在下でのS、チフィの多糖Vlの断片化。
Prog、IasunoMol、5tandard、(1972) 5 : 4 85に記載のGotsch I ich等の方法に従って得られた多糖Vtの乾 燥粉末を、発熱物質を含まない水(pyrogen−f’ree water) に1mg/g1の量で溶解させた。この多糖の平均分子量(MY)はセファロー スABCLカラム上での零のKDに相当する。
37℃に予熱したこの溶液5001に、100箇Mのアスコルビン酸、10 i MのCu5Oおよび10 dのFeSO4を含有する水溶液12.5dlを2時 間にに亘って、連続的にゆっくり添加した;最終アスコルビン酸濃度は0.44 −g/mNに相当する。かく得られた反応溶液のpHは約pH4であった。穏や かに攪拌しながら37℃で約3時間(反応剤の添加時間を含む)反応を行った。
ついで反応混合物を3に限外濾過膜(カットオッフ=3キロダルトン)上で濾過 した。残留物(retentate)を0.5 M NaCg溶液で一回洗浄し ついで水で2回洗浄した。残留物を約100−gの水に溶解しついで凍結乾燥し て保存した。
開裂(cleavage)の水準は、セファロース4BCLゲル上での濾過によ って得られた曲線(図4a)の積算(1ntegratjon)により計算して 、95%程度である。更に、かく得られるオリゴ糖の平均MVをGran8th 等の方法(前記参照)により決定した。平均溶離定数として表される平均MWは 0.6程度であり、これは60.0000E9の暇と等量である(デキストラン を参照として使用)。
NMR(核磁気共鳴)スペクトル分析によるオリゴ糖の分析は、多糖の反復単位 に特有の構造は断片化後においても保持されていることを明らかに示した。特に 、分岐した官能基、又は、糖(sugar)は多糖骨格から失われていなかった 。
多糖vlの反復単位に特有の化学的官能基は比色分析法(colorisetr lc assay)により分析した。分岐した位置の0−アセチル基はBiol 、Chem、(1949) 188 : 249に記載のHe5trinの方法 により検定し、線状構造体のポリ酸(polyacid)はCl1n、J、Mi crobiol 。
(19118) 28 : 719に記載の5tone等の方法により検定した 。検定は非断片化多糖v1と形成されたオリゴ糖とについて平行的に行った。
多糖とオリゴ糖とについて測定した[0−アセチル]/[ポリ酸]比は同一であ った。このことは多糖の断片化法が移動し易い0−アセチル基の全てを保存する ことを可能にしていることを示している。
過酸化水素(H2O2)の存在下でのS、チフィの多糖Vtの断片化。
Gotschl lch 等の方法(前記参照)に従って得られた多糖Viの乾 燥粉末を、0.2Mリン酸塩緩衝液pH7,5ニ0.4 mg/eDeD量で溶 解させた。この多糖の聞はセファロースJBCLカラム上で測定して、零のKD に相当する。
37℃に予熱したこの溶液100 dに、0.3 mghIのH2O2を含有す る水溶液 llll1g及び2.6 mg/ ml (7)CuSO4溶液11  tan G穏やかに攪拌しながらゆっくり添加した。穏やかに攪拌しながら3 7℃で約1時間反応を行った。
反応時間を1時間の代わりに2時間としたこと以外、同一の条件下で実験を繰返 した。
両者の場合に、かく得られたオリゴ糖を回収し、実施例1と同様に精製した。
同様に、かく得られたオリゴ糖の特性を実施例1に記載の方法で測定した。その 結果は下記の通りであるニー両者の場合において、多糖Vtの開裂の水準は10 0%である。
−1時間および2時間後に形成されたオリゴ糖の平均MYは、それぞれ、0.7 及び0.8 ノKDj::相当する;これは、30.000及び10.000  DE と等量である。
一両者の場合において、反復単位の構造に変化は認められなかった。
実施例 3: N、メニンギチジスA群の多糖の断片化。
Gotschllch 等の方法(前記参照)に従って得られたN、メニンギチ ジスA群の多糖の乾燥粉末を、0.2 Mリン酸塩緩衝液pH7,5にI I1 g/−の量又は5mg/dの量で溶解させた。この多糖の平均MWはセファロー スABCLカラム上で測定して、0.15のKDに相当する。
lIg/lIg及び5 I1g/lapの溶液を37℃に予熱した。
3a) l mg/igの溶液100−に、100 mMのアスコルビン酸、1 0 sMのCLISO4及び10 mHのFeSO4を含有する反応溶液0.7 5m、17を添加した。攪拌しながら37℃で1時間30分反応を行った。つい で、上記反応溶液0.751.1?を再び添加した;かくして、0.26 mg /−の最終アスコルビン酸濃度が得られた。反応を同一の条件下で更に1時間3 0分行った。
3b) 5 D/−の溶液100 mlに、100 mMのアスコルビン酸、1 0 sMのCLISO4及び10 dのFeSO4を含有する反応溶液1.5  rapを添加した;最終アスコルビン駿濃度は(1,28mg/1nflに等し かった。
攪拌しながら37℃で1時間30分反応を行った。
3a)及び3b)で得られたオリゴ糖を実施例1に記載したごとき方法で回収し 、精製した。同様に、実施例1に記載したごとき方法で分析を行った。両方の場 合に、開裂の水準は100%であり、NMRにより分析した場合に、反復単位の 構造の劣化は認められなかった。
3a)で得られたオリゴ糖の平均MVは0.7のKD(30,000DE9と等 量)に相当し、3b)で得られたオリゴ糖の平均M1は0.4のKD(110, 000DE9と等量)に相当した。
これらの結果は、全体として、実験条件(多糖及び反応性酸化−還元剤濃度並び に反応剤の添加方法及び反応時間)を変化させることにより、実質的に異なる平 均間を有するオリゴ糖が得られるが、100%の開裂水準は保持されることを示 している。
最後に、この実施例と実施例2は、この断片化は中性に近いpHテ行ワしている ので、断片化は酸化−還元によるものであって、酸又はアルカリ加水分解による ものではないことを実際に示している。
実施例 4: S、フ:ユウモニアエ1型及び19F型の多糖及びH,インフルエンザ二B型の 多糖の緩衝媒体中での断片化。
1982年6月18日発行のフランス特許出願FR2,495,939号に記載 の方法で得られたS、プニュウモニアエ1型及び19F型の多糖及びGotsc h I ich 等の方法(前記参照)に従って得られたH、インフルエンザ二 B型の多糖を使用して、実施例3(3a及び3b)を繰返した:その結果は下記 の通りである: ND+ 測定せず □ 川 (核磁気共鳴)スペクトル分析による芽すゴ糖の分析は、多糖の反復単位に 特有の構造は断片化後においても保存されていることを明らかに示していた。
実施例 5: N、メニンギチジスA群の多糖及びS、ブニュウモニアエl型、14型、L8C 型、19F型及び23P型の多糖の非緩衝媒体中での断片化。
(1) 5 mg/−gの濃度の多糖溶液を発熱物質を含まない水中で調製した こと、(il)反応溶液の全てを2.5−ghりの最終濃度になるまで一回で添 加したこと及び(11i)反応を1時間だけ行ったこと以外、実施例3及び4に 記載の方法で多糖溶液の調製と反応を行った。
得られたオリゴ糖を実施例1に記載の方法で回収し、精製した。
その特性を実施例1に記載の方法で調べた。多糖の各々につ0ての開裂水準は1 00%であり、反復単位の構造の劣化は認めれらな力)つた。この最後の点は比 色分析によっても示された二ヘキ゛ノースの分Gatt等の方法により、ラムノ ースの分析はJ、Biol 、Che−、(194g)より行った。S、プニュ ウモニアエ14型の多糖と、断片化1こよりこれから誘導されるオリゴ糖の場合 には、[ヘキソース]/[ヘキ゛ノースアミン]比は実質的に同一であった。こ のことは、S、プニュウモニアエ18c型及び23F型の場合における、それぞ れ、[ラムノース〕l[ヘキソース]比及び[ホスフェ−トコl[ヘキソース] 比についてもあてはまった。
オリゴ糖のNMRスペクトル分析によっては反復単位の不均一性を示す(言号は 検出されず、オリゴ糖は変化していな’−X(intact)反復単位からなる ことを示していた。
最後に、オリゴ糖の平均MYに関しては、その結果は下記の通りである: S、チフィのオリゴ糖Vi/コレラトキシンのBサブユニ・ノド複合体の調製。
6a)オリゴ糖Vi中へのN13基の導入実施例1で得られたオリゴ糖Vtの凍 結乾燥生成物をリン酸塩緩衝液pH8に10 g/mj7の量で溶解した。この 溶液にジアミノヘキサンとNaCNB)I、、とを、各々、最終濃度が12.5 −g/■gになるまでを溶解して添加した。室温で6日間反応を行った。ついで 、反応溶液を水に対して透析し、凍結乾燥させた。^na1.Bioches、 (1975) 64二284に記載の5hnyder等の方法に従って分析を行 って、N13基が実際に導入されたことを確認した。同様に、)lestrin の分析方法により0−アセチル基が依然として保存されていることが示された。
Bb)反応性官能基の導入 8a)で得られた凍結乾燥生成物を40 mg/−の量で溶解させた。
この溶液20−に、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のジスクシンイミジル スベレート(disuccinimydyl 5uberate) (DSS) の4hg/muの溶液l1lO−を添加した。室温で1時間反応を行つt、−0 つ(1て、生成物を開So/ジオキサン混合物中で沈殿させた。
Bc)復^ 61〕)で得られた沈殿を0.5 HNa(J)溶液中に40 mg/mΩの量 で溶解させた。これと羽行的に′、042Mリン酸塩緩衝液pH6,5中の、ニ ー7レラトキ=ン】・のBサブユニ・月の1hH/m、lJの溶液を調製した( Tayot等、lミur1.Biochem、(1981) 113: 249 参照)。
かく調製したニ一つの溶液を混合1−7た。オリゴ糖/蛋白質重量比は約1であ った。室温で15時間反応を行った。
6d)精製 ついて、混合物を分離限7i (separat、 io口↑hreshold )か5°104り′ルト一の膜を取付けた隔夕)a過ミニカー トリ・ソジ(M illipore)lf濾過]2で、カップル1.ていない蛋白質たオリゴ糖を 除去した。残留物を0.3MNaCβで洗浄し2ついて、滅菌濾過を行った後、 NaCj71/lot’lO、メルチオレーt−(merthiolatp)  l/10.11100中に200gg /mΩの魚で、4℃で保存した。
実施例 7 オリゴ糖/テ々ナス アカトキシン複合体の調製実施例5におい’US、ブニコ ウ玉ニアエ14c型及び23F型の多糖から得たオリゴ糖及び実施例1において S チフィの多糖■1から得たオリゴ糖を複合させた。操作は実施例6に述べた 方法と同様(こ行い、コレラトキシンのlブユニットの代わりに、J、BaCt 、 (1954)67: 671に記載のMuelle+及びMillerの方 法に従って調製したテタナス アナトキシンを使用した。
S ブニュウモニアエから得られた複合体を250gg /lanの量で複合体 の免疫原性の例証 OFIマウス(IFFA Credo)を8個のバッチに分割した。バッチから の各マウスに実施例6及び7て調製した溶液の一つを0.5 ta(lを投与す るか、又は、これと平行して、対応する天然多糖0.5−を投与した。注射は皮 下に行った。これらの注射を14後に繰返した。これと平行して、対照には生理 的食塩水だけを投与した。
最初の注射から14日及び28日後に、第1の血液試料を採取し抗多糖抗体(a nti−polysaccharide antibody) 1gGをELI SA法によって滴定した(滴定プレートには非断片化多糖を被覆した)。14B 及び28日後の抗、体水準は複合体か免疫原性(imsunogeniC)であ ることを示した。上記複合体の各々において、抗体水準は対応する天然多糖によ って誘発されるものより高かった。更に、T−依存性抗原の特徴である反発効果 (rebound efTeet)も認められた。
実施例 9 活性成分と1.て複合体を含有するワクチン製剤組成物。
実施例7て得られたS、チフィのオリゴ糖Vi/テタナス アカトキシン複合体 を、ヒトの皮下に注射するための、0.5 −のワクチン投与剤に製剤した。単 位投与剤当りの組成は下記の通りである。
−8チフィのオリゴ糖v1 の複合体 10μg −リン酸塩緩衝液 pH7475μg (P04イオンとして) −NaCD425Dμg −メルチオレー1− 0.05μg −注射用水 全体が0.5 −に なる量 b> −[−〉j)−Q−5u−1−>4@羽輛1−〉3トーx呻A<1÷0F igur@ l (continuation)a・にda 鳴 −一 々噛 m− −1中−−−1−11−m−神1−1−一φ−鴫や一一中−−昏4神争−■や− 一φ81uτe2&

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.病原体から得られた抗原多糖の抗原決定基の少なくとも1個が保存されてい るオリゴ糖であって、(i)上記抗原多糖を酸化一還元解重合反応にかけ、(i i)かく得られたオリゴ糖を回収し、ついで、所望ならは、(iii)このオリ ゴ糖を複合体パートナー又は担体とカップルさせて、オリゴ糖を複合体の形で得 るか又は担体と結合させる工程によって得られたものであることを特徴とするオ リゴ糖。
  2. 2.セファロース4BCLカラム上で測定して、0.1〜2の平均溶離定数を有 する、請求項1に記載のオリゴ糖。
  3. 3.セファロース4BCLカラム上で測定して、0.4〜0.8の平均溶離定数 を有する、請求項2に記載のオリゴ糖。
  4. 4.セファロース4BCLカラム上で測定して、0.6〜0.7の平均溶離定数 を有する、請求項3に記載のオリゴ糖。
  5. 5.病原体から得られた抗原多糖は、病原体バクテリアから得られた莢膜状多糖 である、請求項1〜4のいずれかに記載のオリゴ糖。
  6. 6.病原体バクテリアは、スタフィロコカス属、ストレプトコカス属、クレブシ エラ属、サルモネラ属、エシエリシア属、ネイセリア属及びハエモフィルス属か ら選ばれる、請求項5に記載のオリゴ糖。
  7. 7.病原体バクテリアは、S.チフィ、S.プニュウモニアエ、N.メニンギチ ジス及びH.インフルエンザエから選ばれる、請求項6に記載のオリゴ糖。
  8. 8.複合体の形で提供される、請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴ糖。
  9. 9.複合体パートナーは、ペプチド、蛋白質及び有機重合体から選ばれる、請求 項8に記載のオリゴ糖。
  10. 10.複合体パートナーは、ペルツシストキシン、コレラトキシン、テタナスト キシン及びジフテリアトキシンから選ばれる、請求項9に記載のオリゴ糖。
  11. 11.哺乳動物の免疫原性を増大させることのできるベクター中に組込まれてい る、請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴ糖。
  12. 12.リポソーム中に組込まれている、請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴ 糖。
  13. 13.病原体から得られた抗原多糖の抗原決定基の少なくとも1個が保存されて いるオリゴ糖を製造する方法であって、(i)上記抗原多糖を酸化一還元解重合 反応にかけ、(ii)かく得られたオリゴ糖を回収し、ついで、所望ならば、( iii)このオリゴ糖を複合体パートナー又は担体とカップルさせて、オリゴ糖 を複合体の形で得るか又は担体と結合させることを特徴とするオリゴ糖の製造方 法。
  14. 14.酸化一還元解重合反応をアスコルビン酸又は過酸化水素であある酸化一還 元剤の存在下で行う、請求項13に記載の方法。
  15. 15.酸化一還元解重合反応をアスコルビン酸又は過酸化水素であある酸化一還 元剤の存在下及び鉄又は銅塩の存在下で行う、請求項14に記載の方法。
  16. 16.請求項1〜12のいずれかに記載のオリゴ糖の少なくとも1種を活性成分 として含有する医薬組成物。
  17. 17.ワクチン組成物を構成する、請求項16に記載の組成物。
  18. 18.個体の免疫防御性を強化するための、特に予防接種を行うための医薬組成 物の調製における、活性成分としての、請求項1〜12のいずれかに記載のオリ ゴ糖の使用。
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