JP2002539294A

JP2002539294A - 多糖の還元的アミノ化法

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Publication number: JP2002539294A
Application number: JP2000605636A
Authority: JP
Inventors: モニク・モロー
Original assignee: AVENTIS PASTEUR
Current assignee: AVENTIS PASTEUR
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-11-19
Also published as: CA2364617A1; NO20014199D0; HUP0200406A2; NO20014199L; EP1163273A1; EP1035137A1; US6596861B1; AU765210B2; CA2364617C; WO2000055210A1; NZ514134A; AU3432500A

Abstract

(57)【要約】本発明は、多糖をアミノ化するのに十分な時間、多糖、アミノ化合物および還元剤を含む反応混合物をマイクロ波照射に付すことを含む多糖の還元的アミノ化法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、（ｉ）特に、多糖をポリペプチドに結合させる方法において有用な
、多糖の還元的アミノ化法、ならびに（ｉｉ）製法により生成された多糖−ポリ
ペプチドコンジュゲートおよび医薬組成物、例えば、ワクチンにおけるその使用
に関する。

【０００２】近年、多糖およびポリペプチド分子のコンジュゲートおよびかかるコンジュゲ
ートの調製方法にかなり関心が寄せられている。ワクチン開発の分野において、
例えば、精製した細菌莢膜多糖をタンパク質分子に共有結合させてタンパク質−
多糖コンジュゲートワクチンが生成された。ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ha
emophilus influenzae）ｂ型由来の精製した莢膜多糖を多くのタンパク質分子、
例えば、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドタンパク質に共有結合さ
せており、これらのコンジュゲートは、乳児群においてＴ細胞依存性免疫応答を
引き起こすことが知られている。この特徴により、細菌ヘモフィルス・インフル
エンゼ型により引き起こされる疾患に対して効果的なワクチンが開発され認可さ
れた。このコンジュゲートワクチンの調製法は、また、他の莢膜多糖、例えば、
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseriae meningitidis）およびストレプ
トコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）から精製された莢膜多
糖にまで及んだ。

【０００３】多糖は、通常、既往性（記憶）応答を生起することができないＴ非依存性抗原
である。さらに、それらは、乳児において全くまたはあまり免疫原性ではない。
かかる欠点は、多糖を担体タンパク質に結合させることにより克服することがで
きることがよく知られている。

【０００４】多糖は、種々の方法に従って、ポリペプチドに直接、またはスペーサー／リン
カー分子を介して結合させることができる。それらのいくつかは、全ての多糖に
存在する還元性末端を利用する。確かに、この末端は、アミノ基のような官能基
と容易に反応できる。特に、適当な還元剤の存在下、穏和な条件下で、すなわち
、低温で（通常、約５０℃で）、還元的アミノ化に付すことができる。還元的ア
ミノ化は、カルボニルおよびアミノ基の古典的反応であり、２つの逐次反応の結
果である：イミンの形成：Ｒ−ＣＨＯ＋Ｈ_２Ｎ−Ｒ' → Ｒ−ＣＨ＝ＮＨ−Ｒ' 還元剤の存在下での二重結合の還元：Ｒ−ＣＨ＝ＮＨ−Ｒ' → Ｒ−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｒ' ［式中、Ｒは、多糖であり、Ｒ'は、アミノ供与体である］。イミン形成は、通
常、平衡状態に向かって進行し、したがって、最終生成物は、部分アミノ化され
る（いくつかの分子は、アミノ化されないままである）。

【０００５】最も簡単な方法は、還元剤の存在下、多糖の末端還元性糖をポリペプチドのア
ミノ基（例えば、リシン残基の側鎖アミノ基）と反応させることを含む。結果と
して、多糖は、直接共有結合によりポリペプチドに結合する。

【０００６】より高度に複雑な方法は、還元剤の存在下、多糖の末端還元性糖を、少なくと
も１個のアミノ基を有するリンカーまたはスペーサー分子と反応させて、種々の
慣用的な結合法に従ってポリペプチドにさらに結合することができる活性化多糖
を得ることを含む。

【０００７】多糖末端還元性糖は、還元的アミノ化に付すことができる唯一の多糖官能基で
はない。アミノ基の結合に利用可能な官能基としては、例えば、糖鎖全体に存在
するカルボニル、例えば、アルデヒドおよびケトンなどが挙げられる。また、そ
れらは、化学的処理により故意に作製することさえできる。

【０００８】上記のとおり、還元的アミノ化は、多糖結合法において広範囲に使用される化
学反応である。しかしながら、この反応は、時間を浪費し、実施するのにおよそ
数日かかる。イミン形成は、全体的な還元的アミノ化反応の律速段階を構成する
非常に遅い反応であると考えられる。

【０００９】また、アミノ化多糖の最終収率は、経時的な望ましくない二次反応生成物の形
成により低下し得る。望ましくない二次反応事象としては、例えば、多糖の非還
元形への逆転、およびさらに重要には、分解生成物の形成が挙げられる。イミン
結合を還元するのに使用できる還元剤は、また、多糖の末端アルデヒド官能基を
還元することが可能である。確かに、シアノボロハイドライド以外の水素化物は
、アルデヒドおよびイミン結合を同等に還元することができる。シアノボロハイ
ドライドは、優先的にイミン結合を還元する。

【００１０】一般に、化学反応が加熱により促進され得ることはよく知られている。確かに
、多糖の還元的アミノ化は、反応混合物を湯浴中に置いて約１５〜５０℃の温度
で慣用的に行なわれる。さらに高温（例えば、１００℃を超える）は、多糖が分
解または変性する可能性があるので適当ではない。

【００１１】さらに一般的には、有機合成のようなある種の反応を促進するための電子オー
ブンの使用自体は開示されている。本発明者らの知る限りでは、Loupy, et al., Tetrahedron Letters (1996) 37:8177 は、還元的アミノ化法におけるマイクロ
波照射の使用を開示する唯一の文書である。しかしながら、Loupy らにより使用
された反応は、低分子量カルボニル化合物に適しているだけであり、多糖につい
てはそうではない、非常に特殊な還元的アミノ化（すなわち、ロイカルト反応）
である。詳しくは、ロイカルト反応は、厳しい反応条件、例えば、高温（最高反
応温度は、１００℃をかなり超える）により特徴付けられる。ロイカルト反応は
、また、還元的アミノ化が脱炭酸により行なわれる（Loupy et al. の第8180頁
の反応スキームを参照のこと）点で穏和な条件下での還元的アミノ化とは異なる
。還元的アミノ化が穏和な条件下で行なわれた場合、かかる脱炭酸は生じない。

【００１２】意外なことに、このたび、反応混合物をマイクロ波照射に付して、多糖の還元
的アミノ化に必要な時間を劇的に減少させることができることを見出した。マイ
クロ波照射は、イミン形成および還元的アミノ化の両方の工程を促進することが
できると考えられる。特に、シアノボロハイドライドのような穏和な還元剤を使
用する還元的アミノ化は、慣用的なプラクティスにしたがって行なった場合には
遅い反応であり、マイクロ波照射下で劇的に促進することができる。

【００１３】また、この方法が比較的穏和な条件下で目的の多糖を急速に還元的アミノ化さ
せて多糖内の必須の抗原決定基が保持されるという研究結果は、意外であった。
確かに、このことは、構成物質、例えば、多糖およびタンパク質の構造およびコ
ンホメーションを出来る限り多く保持するようにコンジュゲートワクチンを調製
しなければならないという点で非常に重要なことである。重要な抗原決定基は、
しばしば、かかる分子の構造および／またはコンホメーションの一部で構成され
、かかる決定基が保持されない場合、得られたコンジュゲートワクチンは、所望
の免疫応答を誘発する能力がないであろう。例えば、多糖上のＯ−アセチルまた
はリン酸基は、重要な抗原決定基であり、かなり不安定であり得る。意外にも、
これらの重要な決定基は、本発明のマイクロ波増強性還元的アミノ化法による影
響を受けない。

【００１４】古典的還元的アミノ化法と対照的に、望ましくない二次反応生成物の形成が慣
用的な還元的アミノ化法にて得られるものと比較して制限されるという研究結果
は、さらに意外であった。この最後の研究結果の意味はかなり重要である。確か
に、さらなる反応サイクルを行なって多糖のアミノ化度を増大させることができ
る。次に、このことは、より多くの多糖を同一量のポリペプチドに付加してコン
ジュゲート収率を改良するコンジュゲートの調製手段を提供する。

【００１５】すなわち、本発明は、還元的アミノ化についての全反応時間を劇的に減少させ
る手段を提供すると同時に、例えば、マイクロ波において還元的アミノ化を複数
回行なうことにより、目的生成物（アミノ化多糖）の収率を有意に増加させる手
段を提供する。

【００１６】したがって、本発明は、多糖の還元的アミノ化方法であって、（ｉ）多糖をアミノ化するのに十分な時間、多糖、アミノ化合物および還元剤
を含む反応混合物をマイクロ波照射に付すか；（ｉｉ）（ａ）イミン化合物の形成に十分な時間、多糖およびアミノ化合物を
含む反応混合物をマイクロ波照射に付し、（ｂ）（ａ）において得られた反応混
合物に還元剤を添加して多糖をアミノ化するか；（ｉｉｉ）（ａ）多糖にアミノ化合物を添加してイミン化合物を形成させ、（
ｂ）（ａ）において得られた反応混合物に還元剤を添加し、（ｃ）多糖をアミノ
化するのに十分な時間、（ｂ）において得られた反応混合物をマイクロ波照射に
付すか；または（ｉｖ）（ａ）イミン化合物の形成に十分な時間、多糖およびアミノ化合物を
含む反応混合物をマイクロ波照射に付し、（ｂ）（ａ）において得られた反応混
合物に還元剤を添加し、（ｃ）多糖をアミノ化するのに十分な時間、（ｂ）にお
いて得られた反応混合物をマイクロ波照射に付すことを含む方法を提供する。

【００１７】マイクロ波照射の使用を除いて、還元的アミノ化は、慣用手段にて行なうこと
ができる。例えば、多糖は、Borch et al., J. Amer. Chem. Soc. (1971) 93:28
97 または Gray et al., Arch. Biochem. Biophys (1974) 163:426 にしたがっ
て、穏和な条件下でアミノ化することができる。反応されるべき生成物の適当な
量を決定するのは当業者の技術範囲内である。しかしながら、一般的に、アミノ
化合物は、特に、アミノ供与体がホモ二官能性分子である場合、多糖に関して大
モル過剰にて添加するのが有利であることが指摘されている。

【００１８】すでに上記に記載したとおり、一群の多糖分子の間での還元的アミノ化度は、
通常、不十分である；いくつかの分子は、アミノ化されないままである。それら
のうちのいくつかは、また、部分アミノ化（全てではない官能基の還元）されて
いてもよい。要するに、したがって、「アミノ化多糖」なる用語は、部分アミノ
化多糖分子、ならびに、アミノ化および未アミノ化分子の混成群を包含すると解
釈される。

【００１９】反応混合物は、有利には、水性媒体中にある。例えば、還元剤の選択に依存し
て、有機溶媒中にあってもよい。例えば、還元剤がピリジンボランである場合、
有機溶媒を使用するのが適当である。最も好ましい実施態様においては、多糖、
アミノ化合物および還元剤は、ｐＨ変動を避けるために緩衝液中にある。一般的
には、還元的アミノ化は、５〜１０、有利には、６〜８のｐＨ範囲にわたって行
なうことができる；好ましくは、約ｐＨ７である。

【００２０】また、特に、多糖が中性多糖である場合、緩衝液を使用することが推奨される
。確かに、マイクロ波照射により利益を得るために、多糖が全双極子モーメント
を有することが必要であり、これにより、該分子が別のマイクロ波領域において
移動し、その結果、より反応性になる。荷電多糖は、自然に、多かれ少なかれこ
の基準を満たしている。中性多糖について還元的アミノ化を行なうためには、そ
れらを何らかの方法で処理して正味の電荷または双極子を導入することが好まし
い。緩衝液の使用をこの目的に供することができる。さらに詳しくは、ホウ酸、
モリブデン酸、タングステン酸、スズ酸および亜ヒ酸緩衝液などの電解質緩衝液
が適当である。この方法は、デキストランについても立証され得る。デキストラ
ン溶液は、リン酸またはホウ酸緩衝液中で調製することができる。ホウ酸塩は、
デキストラン内の糖残基のヒドロキシル基に結合して、安定な陰性荷電複合体を
生じる。上記実施例１に記載したと同様の還元的アミノ化条件に付したデキスト
ランのホウ酸塩中溶液は、マイクロ波装置中では、湯浴中で得られたもの（また
はいずれかのインキュベーション条件下でリン酸緩衝液中で得られたもの）と比
較して急速に還元的アミノ化される。マイクロ波にてデキストラン−ホウ酸塩溶
液を１時間インキュベートすることにより得られるアミノ化度は、湯浴中での４
８時間インキュベーションの後に得られたものに匹敵する（表２）。

【００２１】荷電多糖については、ホウ酸塩以外の緩衝液および等価物が通常好ましい。例
えば、リン酸緩衝液が適当である。

【００２２】還元的アミノ化を最適化するために、所定の多糖について最も適当な緩衝液の
選択は、経験的に容易に行なうことができる。多糖がリン酸緩衝液中で許容され
るレベルのアミノ化生成物を生じない場合、該反応をホウ酸緩衝液中で繰り返す
。

【００２３】本発明の目的のために、慣用の電子オーブンを使用することができるが、それ
らは、好ましくない。実際、かかるオーブンにおいては、温度が、通常、１００
℃に上昇し（特に、少量に関して作業する場合）、１００℃以下に保持するよう
に温度制御を維持するのが困難である。炭水化物化学分野の当業者は、不安定な
抗原エピトープを有する多糖を用いて高温で作業するのに固有の制限を容易に理
解するであろう。さらに、１００℃を超えると、かかる物質は、作業するのが不
可能ではないが困難であり得る粘性シロップを形成する。慣用のマイクロ波の別
の制限は、マイクロ波照射の個々のビームが装置の内部全体にランダムに散乱す
るという事実である。かくして、実際、実験試料の照射の程度を制御するのは、
特に、かかる試料が比較的少量（例えば、１０ｍｌ以下）からなる場合、困難で
あり得る。

【００２４】これらの障害のうちのあるものは、装置内の特定位置でマイクロ波照射の集中
または局在化ビームを提供することが可能なマイクロ波装置の開発により克服さ
れた。反応混合物は、好都合には、かかる位置に置くことができ、かかる反応混
合物は、マイクロ波照射に確実に曝露される。かかるマイクロ波装置の１つは、
フランス国フォントネー−スー−ボアのプロラボ（Prolabo）により製造および
販売されているＳＹＮＴＨＥＷＡＶＥ^ＴＭ４２０装置であり、その使用は、本
発明の目的のために好ましい。この装置は、反射手段を使用して、反応管が置か
れている経路を横切ってマイクロ波を集中させる。ＳＹＮＴＨＥＷＡＶＥ^ＴＭ
４２０装置はまた、赤外線検出によりマイクロ波照射により生じた反応の温度を
測定し、温度を一定に維持するためにマイクロ波処理の程度を調節する。このよ
うに、試料を１００℃以下の温度範囲にすることが可能である。

【００２５】もちろん、当業者は、他のタイプのマイクロ波装置を、本発明の趣旨を逸脱す
ることなく本発明において使用できるように設計または変更できることは認める
であろう。例えば、反応容量が十分に大きい、例えば、１００ｍｌ以上である場
合、手動でまたはプロラボにより設計された装置について記載した温度検出およ
び調節手段と共同してマイクロ波処理の程度を制御しながら慣用のマイクロ波に
て反応を行なうことが可能である。

【００２６】電磁スペクトルにおいて、マイクロ波は、１ｃｍと１ｍとの間に含まれる波長
値に位置する。

【００２７】上記で説明したとおり、反応温度は、制御下に維持されるべき重要なパラメー
タである。有利には、該反応は、１００℃を超えない温度、好ましくは、６０℃
、さらに好ましくは、５０℃で行なわれる。

【００２８】アミノ化の達成度を微調整する他の実験パラメータとしては、とりわけ、上記
で説明した反応混合物において使用される緩衝液の選択、および反応時間の長さ
が挙げられる。所望のアミノ化度を得るための条件を限定することは、緩衝組成
物の選択およびインキュベーション時間の限定を包含する比較的直接的なプロセ
スである。

【００２９】還元的アミノ化反応の動力学は、典型的には、プラトーを有する曲線の形を取
り、反応時間は、プラトーに達するのに必要な時間と定義される。研究した全て
の多糖は、慣用的な５０℃の湯浴におけるよりもマイクロ波における方がより急
速な還元的アミノ化を受けるが、ある種の多糖は、他の多糖よりも容易に還元的
アミノ化することができる。例えば、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi
）由来のＶｉ多糖は、１５分程度で還元的アミノ化することができるが、デキス
トランを用いて行なう場合には１時間のインキュベーションが好ましい。したが
って、１５分〜４時間の反応時間が一般に適当であることが示され、上記で説明
したとおり、これは、従来技術と比べて有意な改良を表す。

【００３０】上記で説明したとおり、還元的アミノ化は、二段反応である。本発明の記載に
示されるとおり、両方の段階を別々に行なうこと、すなわち、まず、多糖および
アミノ化合物を反応させてイミン結合を形成し、次いで、還元剤を添加して、イ
ミン結合を還元することが可能である。ボロハイドライドのような強い還元剤を
使用した場合、第二段階は、慣用条件下でかなり急速に行なわれ、したがって、
少なくとも反応時間に関する限りは、マイクロ波照射下でそれを行なうことはあ
まり有利ではない。シアノボロハイドライドのような穏和な還元剤を使用した場
合、反応を促進するために、および所望の還元形態を選択的に得るために、マイ
クロ波照射下で第二段階を行なうのが好ましい。

【００３１】プラトーに達した場合、これは、多糖分子上にあるカルボニル基の全てが還元
的アミノ化されたことを意味しない；これらのカルボニル基の多くは、特に、還
元剤としてシアノボロハイドライドを使用した場合、還元されないままである。
これらの環境下では、本発明の方法により得られた生成物はアミノ化および未ア
ミノ化多糖分子を含有すると考えるのが適当である。さらにまた、多糖分子種が
１個より多いのカルボニル基を含有する場合、分子は、部分的にアミノ化される
だけである。包括的には、本発明の方法により得られた生成物は、本明細書にお
いてすでに上記したとおり、部分的にアミノ化されるということができる。該試
薬が完全には消費されずにプラトーに達したという事実は、おそらく、阻害性副
生物の形成によるものである。

【００３２】アミノ基：多糖比（重量：重量）であるアミノ化度を測定すると同時に、反応
効率を評価することができる。還元性末端基の数は、さらに、Park & Johnson,
J. Biol. Chem. (1949) 181:149 の方法を使用して決定することができる。

【００３３】望ましい場合には、１回目にプラトーに達した後にさらなる還元的アミノ化に
利用可能なカルボニル基が十分に残っている場合、還元的アミノ化を連続して複
数回行なうことによりアミノ化度を実質的に増大させることができる。基本的に
は、初回の還元的アミノ化の生成物を回収し、試薬を含む反応媒体から精製する
ことができる；次いで、該アミノ化合物および還元剤を新しく添加することがで
き、該反応を前と同様に行なうことができる。該反応をさらに１回以上繰り返す
ことができる。マイクロ波照射の使用により反応時間が劇的に減少するので、か
かる手法は、工業規模でさえ可能である。このことは、過ヨウ素酸酸化のような
化学反応により得られる還元性基を有する多糖上に担体ポリペプチドと反応可能
なより多くの部位を提供することにより、ポリペプチド−多糖コンジュゲートの
調製について新しい道を切り開いた。シアノボロハイドライドのような還元剤を
最初に使用した場合、還元的アミノ化を連続して複数回行なうのが特に適当であ
る。

【００３４】還元剤の選択は、当業者により慣用的に行なうことができる。本発明の方法に
有用な還元剤としては、触媒の存在下での水素が挙げられる；ボロハイドライド
（ＢＨ_４）、ＬiＡlＨ_４、ピリジンボラン（ＰyＢＨ_３）またはＮaＣＮＢＨ_３の
ようなシアノボロハイドライドなどの水素化物。水性媒体中での反応を可能にす
るボロハイドライドおよびシアノボロハイドライドが特に好ましい。

【００３５】本発明の方法は、いずれの種類の多糖にも、特に、真菌または細菌多糖に適用
できる。細菌多糖は、莢膜多糖、または２−デオキシ−ケト−オクツロソン酸（
ＫＤＯ）を含む細胞壁リポ多糖（ＬＰＳ）のＯ抗原部分（Ｏ特異的側鎖ともいう
）であり得る。例えば、本発明にて使用するための細菌多糖は、ストレプトッカ
ス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（特に、血清型１、３、４、５
、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのもの）、ヘモフィル
ス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）、ナイセリア・メニンジティデ
ィス（Neisseria meningitidis）（特に、グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および
Ｙのもの）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ・ティフィ
（Salmonella typhi）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuri
um）、クラミジア・ネオフォルマンス（Chlamydia neoformans）、クレブシエラ
・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、スタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Psedomona
s aeruginosa）の多糖（例えば、莢膜多糖）であり得る。細菌多糖は、また、モ
ラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、分類不可能なヘモフィル
ス（Haemophilus）、ボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）、ヘ
リコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、サルモネラ・ティフィ（Salmo
nella typhi）、サルモネラ・パラティフィ（Salmonella paratyphi）、シゲラ
（Shigella）またはクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）のＬＰ
ＳのＯ抗原部分であり得る。細胞壁真菌多糖は、例えば、カンジダ（Candida）
、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）またはハ
ンゼヌラ（Hansenula）由来のものであってもよい。

【００３６】当業者は、本発明に従った方法の利用性が多糖の化学構造に依存しないことを
容易に認識するであろう：非常に多数の構造的および化学的に異なる多糖をアミ
ノ化できる。これは、中性多糖（例えば、デキストラン）、陽性荷電多糖（例え
ば、多糖Ｖｉおよびポリガラクツロン酸）、Ｎ−アセチル基を有する中性多糖（
例えば、ニューモ（pneumo）１４型）、リン酸基を有する中性多糖（例えば、ニ
ューモ１８Ｃ型）、ならびにＯ−アセチル基および誘導体化側鎖を有する中性多
糖（例えば、ニューモ７Ｆ型）が挙げられる。

【００３７】すでに上記で説明したとおり、多糖は、還元性末端を示す。これに加えて、い
くつかの多糖は、糖鎖の全体にわたって還元的アミノ化に利用可能なカルボニル
のような官能基を示す。ＬＰＳのＯ抗原部分のＫＤＯ末端に存在するケトン基も
同様に利用可能である。所望の場合、還元的アミノ化の前に、多糖鎖上に還元性
基を導入することもできる。例えば、多糖鎖の全体にわたって過ヨウ素酸酸化に
より還元性基を作製することができる（ただし、ヘモフィルス・インフルエンゼ
多糖を使用する場合は、該多糖鎖の開裂により還元性基が作製される）ことは、
よく知られている。

【００３８】本発明の目的多糖は、多くの可能性のある供給源のいずれかから得ることがで
きる。いくつかのかかる多糖、例えば、肺炎球菌多糖６Ａ、１４、１９Ｆおよび
２３Ｆ型は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）から入手可能である。それらは、微生物から直接抽出およ
び精製することができる。多糖は、慣用技法を用いて、細菌の莢膜多糖から、ま
たは、リポ多糖から調製することができる。例えば、調製方法の検討については
Porro の米国特許第5,153,312号およびEP 0 477 508 を参照のこと。

【００３９】これまでのところ、本発明は、主に、細菌多糖について記載しているが、他の
供給源からの多糖にも同等に適当可能である。本発明を支持して提供される例と
しては、例えば、デキストランおよびポリガラクツロン酸が挙げられ、それらは
共に植物から得られる。

【００４０】一般的に、「多糖」とは、鎖長に関係なく、すなわち、反復単位の量に関係な
く、糖鎖を意味する。したがって、この用語は、また、オリゴ糖を包含する。糖
鎖は、また、ＫＤＯのような他の要素に結合することができる。

【００４１】容易に理解できるとおり、多糖鎖の分子量は、（ｉ）反復単位の分子量および
（ｉｉ）鎖を構成する反復単位の量に依存する。また、「多糖」なる用語は、種
々の長さを有する一群の多糖鎖を示し、したがって、所定の多糖サイズは、通常
、平均値に相当する。

【００４２】好都合な多糖サイズは、例えば、４反復単位〜２,０００反復単位の範囲であ
り得ることが示される。該サイズは、有利には、８、好ましくは、１２、より好
ましくは、２０、最も好ましくは、３０反復単位から、有利には、１,０００、
好ましくは、８００、最も好ましくは、５００反復単位までである。

【００４３】一般的には、多糖鎖のサイズは、還元的アミノ化を行なうための決定的なパラ
メーターではない。しかしながら、アミノ化多糖のさらなる使用に依存して、中
程度のサイズを有する多糖を使用するのがより適当である。特に、細菌から抽出
された莢膜多糖は、非常に大きいサイズを示し、場合によっては、還元的アミノ
化前に解重合により平均サイズ値を減少させるのが望ましい。解重合またはフラ
グメント化（両方の用語は、互換性をもって使用される）は、慣用的には、化学
的または機械的手段により行なうことができ、例えば、WO 93/7178 には、還元
的酸化（ＯＲＤ）によるフラグメント化法が記載されている。かかる方法のいく
かは、Porro の米国特許第5,153,312号によって詳述されている。

【００４４】本発明の目的のためには、天然多糖、オリゴ糖、部分解重合もしくはフラグメ
ント化多糖または糖を互換性をもって使用する。還元的アミノ化は、抗原決定基
の保持を条件としていずれものかかる多糖について行なうことができる。

【００４５】本発明における使用のために、アミノ化合物は、本明細書に記載した条件下で
アミノ基を提供する能力を有するいずれもの分子または試薬であり得る。

【００４６】一の実施態様において、それは、ポリペプチドであり得る。この場合、還元的
アミノ化により直接得られる生成物は、ポリペプチドの還元性末端がポリペプチ
ドの側鎖アミノ基に結合されている多糖−ポリペプチドコンジュゲートである。

【００４７】「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾に関係なく、アミノ酸の鎖を意
味する。典型的には、ポリペプチドは、例えば、６アミノ酸以上からなっていて
よい。第１の実施態様にしたがって、ポリペプチドは、免疫応答増強特性を示し
、担体ポリペプチドとして使用される。例としては、ナイセリア・メニンジティ
ディスのＯＭＰ１もしくはＯＭＰ２／３のような細菌外膜、またはジフテリアト
キソイドもしくは破傷風トキソイドのような細菌トキソイドが挙げられる。別の
実施態様によると、ポリペプチドは、生物学的応答調節剤および／または成長因
子である。

【００４８】アミノ化合物は、また、還元的アミノ化が上記したとおりに選択され得るポリ
ペプチドへのさらなる結合のための活性化多糖を生成するようなリンカーまたは
スペーサーとして有用な化学分子であり得る。以下、「アミノ化多糖」および「
活性化多糖」なる用語は互換性をもって使用される。

【００４９】リンカーまたはスペーサーとして有用な化学分子は、式Ｉ：Ｒ１−Ａ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、アミノ基またはアミノ基を有する化学分子、例えば、ヒドラジ
ド基（すなわち、ＮＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−）であり；Ａは、置換されているかまた
はされていない、芳香鎖、または、好ましくは、脂肪鎖であり、例えば、（ｉ）
炭素鎖、有利には、Ｃ_１−１２、好ましくは、Ｃ_２−８、より好ましくは、Ｃ_２ _−６アルキルまたはアルキレン、または（ｉｉ）ジチオアルキルであり；Ｒ２は
、ポリペプチドの官能基と反応できる官能基、例えば、アミノ、チオールもしく
はカルボキシル基または他の反応性基、例えば、スクシンイミジルまたはマレイ
ミド基である］で示される二価の分子である。したがって、Ｒ２は、Ｒ１とは独
立して、アミノ基またはアミノ基を有する化学分子、例えば、ヒドラジド基（す
なわち、ＮＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−）であってもよい。それは、チオール、スクシン
イミジルもしくはカルボキシル基、または、リンカーと反応できるいずれかの他
の基であってもよい。

【００５０】リンカーが還元的アミノ化により多糖上にグラフトされるとすぐに、ポリペプ
チドのチオール、アミノまたはカルボキシルを使用して、活性化多糖をポリペプ
チド自体（上記のとおり選択された）に結合させることができる。一の実施態様
において、該リンカーは、ヒドラジド、例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤ
Ｈ）、４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジド
・ＨＣl・１／２ジオキサン（Ｍ_２Ｃ_２Ｈ）、４−(４−Ｎ−マレイミドフェニル
)酪酸ヒドラジド・ＨＣl（ＭＰＢＨ）および３−(２−ピリジルジチオ)プロピオ
ニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）である。例えば、ＡＤＨを使用した場合、活性化多
糖は、慣用的に、１−エチル１−３−(３−ジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミド）（ＥＤＡＣ）のようなカルボジイミドの存在下、ポリペプチドのカルボキ
シル基にカップリングすることができる。

【００５１】リンカーまたはスペーサーとして有用な化学分子としては、例えば、（ｉ）ジ
ヒドラジドアルキル；（ｉｉ）アミン、例えば、アミノ−チオールアルキル、例
えば、システインまたはシステアミン；または（ｉｉｉ）ジアミン、例えば、ジ
アミノ−チオールアルキル、例えば、シスタミン、または置換されているかまた
はされていないジアミノアルキルもしくはアルキレン（ここで、アルキルまたは
アルキレンは、Ｃ_１−１２、好ましくは、Ｃ_１−８、より好ましくは、Ｃ_１−６アルキルもしくはアルキレンである）が挙げられる。（スペーサーとしてＡＤＨ
を使用することもできるが、これは、好ましくない）。したがって、かかる分子
がリンカーとしての使用を意図される場合、活性化多糖は、多糖自体の適当な官
能基に結合される。例えば、リンカーとしてシスタミンを使用する場合、結合前
に内部ジスルフィド結合を還元し、次いで、該活性化多糖をポリペプチドのシス
テイン残基のチオール官能基にカップリングさせる。別の実施態様において、そ
れを、慣用的に、ＥＤＡＣの存在下、ポリペプチドのカルボキシル基とカップリ
ングさせる。

【００５２】別法として、これらの分子は、スペーサーとして使用を意図する。スペーサー
を多糖上にグラフトさせるとすぐに、該活性化多糖を、（ｉ）リンカーで誘導体
化し、次いで、活性化／誘導体化多糖をポリペプチド自体に結合させるか；また
は（ｉｉ）予めリンカーで誘導体化されたポリペプチドに結合させることができ
る。この場合、リンカーの選択は、スペーサー分子の性質に依存する。

【００５３】例えば、スペーサーとしてアミノチオールを使用する場合（例えば、システイ
ン、システアミンまたはシスタミン）、式ＩＩ：Ｒ３−Ｂ−Ｒ４［式中、Ｒ３
は、チオール官能基と反応することができる官能基であり；Ｂは、芳香鎖、また
は、好ましくは、脂肪鎖、例えば、置換されているかまたはされていない炭素鎖
であり；Ｒ４は、ポリペプチドのチオール、カルボキシルまたはアミノ基と反応
できる官能基である］で示されるリンカーを使用するのが適当である。

【００５４】したがって、Ｒ３は、チオール基；α,β−不飽和カルボニルまたはイミジル
基、特に、マレイミジル基；アシルハロゲンまたはアルキルハライド（ここで、
ハロゲン原子は、Ｂr、ＣlまたはＩである）であってもよい。Ｒ４は、ポリペプ
チドへの連結のために提供されたリンカーの官能基である。該リンカーがアミノ
基と反応すべきである場合、Ｒ４は、好ましくは、カルボキシル、またはスクシ
ンイミジル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、またはスルホスクシン
イミジル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルである。架橋剤がチ
オール基と反応すべきである場合、Ｒ４は、マレイミド基であってよい。鎖Ｂは
、炭素原子１〜１２個、好ましくは、３〜８個を含んでおり、より好ましくは、
Ｃ_２−８アルキレン、フェニレン、Ｃ_７−１２アラルキレン、Ｃ_２−８アルキル
、フェニル、Ｃ_７−１２アラルキル、Ｃ_１−６アルカノイルオキシおよびベンジ
ルカルボニルオキシ（ここで、アルキル、フェニル、アルキレンおよびフェニレ
ンは、置換されていてもよいし、または置換されていなくてもよい）から選択さ
れる。

【００５５】有利には、式ＩＩで示される化合物は、スクシンイミジル−マレイミドアルキ
ル化合物であり、マレイミド部分は、スペーサーのチオール官能基と反応し、ス
クシンイミジル部分は、ポリペプチド上に存在するアミノ基と反応する。かかる
スクシンイミジル−マレイミドアルキル化合物としては、Ｎ−(γ−マレイミド
ブチリルオキシ)スクシンイミドエステルまたはスルホスクシンイミドエステル
（ＧＭＢＳまたはスルホ−ＧＭＢＳ）、マレイミド−カプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（ＭＣＳ）、スクシンイミジル−４−(ｐ−マレイミ
ドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、スルホ−ＳＭＰＢ、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、マレイミド−ベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、
スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキ
シレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣが挙げられる。

【００５６】スペーサーとしてジアミノアルキルを使用する場合、該リンカーは、好適には
、スクシンイミジル化合物、例えば、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）
、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート（ＢＳ３）、ジスクシンイミジルグ
ルタレート（ＤＳＧ）、アジピン酸のスクシンイミジルジエステル（ＳＩＤＥＡ
）、スクシン酸のスクシンイミジルジエステル（ＳＩＤＥＳ）である。この場合
、該リンカーは、ポリペプチドのアミノ基と反応する。上記スクシンイミジル−
マレイミドアルキル化合物もまた使用することができる：この場合、該リンカー
は、多糖のチオール基と反応する。

【００５７】したがって、本発明は、また、本発明の還元的アミノ化を行なって、活性化多
糖を得、次いで、上記方法の１つに従って、該活性化多糖をポリペプチドと反応
させて多糖−ポリペプチドコンジュゲートを得ることを含む結合方法を提供する
。

【００５８】さらに、本明細書において提供された、すなわち、詳細には、多糖および目的
タンパク質、アミノ化剤、還元剤、緩衝条件および適当な反応時間に関する一般
的なガイドラインを所与のものとすれば、本発明を行なうのに適当な反応条件を
本発明の趣旨の範囲から逸脱することなく選択することは、十分に当業者の理解
の範囲内である。

【００５９】本発明は、（ｉ）本発明の結合法により得られる多糖−ポリペプチドコンジュゲートおよび
所望により医薬上または獣医学上許容される担体または希釈剤を含む治療または
予防用医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）、（ｉｉ）病原体に対する免疫方法であって、かかる処置を必要とする哺乳動物に
、かかる哺乳動物において病原体に対する免疫応答を誘発するのに十分な量の、
本発明の結合法により調製された多糖−ポリペプチドコンジュゲート（ここで、
多糖は、病原体に対して特異的である）を投与することを含む方法を提供する。

【００６０】さらに一般的には、本発明の組成物は、医薬または獣医学分野における当業者
によく知られている標準的な技法に従って調製することができる。適当な担体ま
たは希釈剤は、保存剤を伴うかまたは伴わない水または緩衝生理食塩水であり得
る。該コンジュゲートは、投与時の再懸濁のために凍結乾燥されてもよく、また
は、溶液であってもよい。本発明の組成物は、典型的には、アジュバントを含有
することができる。ヒト用途においては、アルミニウム（リン酸アルミニウムま
たは水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。サポニンおよびその
精製成分ＱｕｉｌＡ、フロイント完全アジュバントおよび他の研究および獣医
学的用途において使用されるアジュバントが挙げられる。

【００６１】かかる組成物は、個々の患者の血統または種、年齢、性別、体重、遺伝学およ
び健康状態、ならびに投与経路などの因子を考慮して、医薬または獣医学分野の
当業者によく知られている、慣用的な経路、投与量および技法により投与するこ
とができる。

【００６２】実例として記載される以下の非限定実施例から本発明およびその多くの長所が
良好に理解されるであろう。

【００６３】実施例１酸性（陰性荷電）多糖の還元的アミノ化サルモネラ・ティフィ由来のＶｉ多糖は、以下の一般的な構造：

【化１】を有する正味の陰電荷を有する多糖である。実質的に Gotschlich et al., Prog
. Immunobiol. Standard (1972) 5: 485 の記載に従って、サルモネラ・ティフ
ィからこの多糖を抽出し、WO 93/7178 に記載された方法に従って解重合して平
均分子量７０,０００とした。乾燥粉末をリン酸緩衝液（０.０２Ｍ、ｐＨ７.５
）で希釈して最終濃度を１２ｍｇ／ｍｌとした。反応試料を以下のとおり調製し
た：多糖溶液３.２ｍｌに、リン酸緩衝液（０.０２Ｍ、ｐＨ７.５）中１００ｍ
ｇ／ｍｌのジアミノヘキサン溶液４００μｌおよびリン酸緩衝液（０.０２Ｍ、
ｐＨ７.５）中１０ｍｇ／ｍｌのシアノボロハイドライドの溶液４００μｌを添
加した。

【００６４】該試料を、（ｉ）５０℃の湯浴中または（ｉｉ）マイクロ波照射（照射能：１
５Ｗ）に伴う最大温度を５０℃に設定したＳＹＮＴＨＥＷＡＶＥ^ＴＭ４０２マ
イクロ波装置中で、１５、３０もしくは６０分間または４８時間インキュベート
した。

【００６５】次いで、８０％アルコール沈澱、次いで、ＢｉｏｇｅｌＰ６上でサイズ排除
クロマトグラフィーを用いることにより多糖を精製した：すなわち、反応媒体に
５ＭＮaＣl ４４０μｌおよびエタノール１８ｍｌを添加し、該溶液を遠心分離
し；ペレットを回収し、０.０５ＭＮaＣl １０ｍｌに溶解し；該溶液をＰ６カ
ラムに負荷し；糖含有フラクションを回収し、プールした。

【００６６】精製調製物を以下のとおり分析した：すなわち、アミノ基の多糖上での結合率
を測定すると同時に還元的アミノ化の効率を評価した。このために、Dubois et
al., Anal. Chem. (1956) 3:350 に従って全糖を測定し、Saifer et al., Clin.
Chim. Acta (1960) 5:131 に従ってアミノ基を測定した。還元的アミノ化は、
所望のアミノ化形に加えて、原未還元生成物および重要なことには分解生成物を
含む他の生成物を生じることが知られている反応である。分解生成物の量を評価
するために、Park & Johnson, J. Biol. Chem. (1949) 181:149 に従って残留還
元性糖のパーセンテージを測定した。結果を表１に示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】これらのデータは、マイクロ波照射下で行なわれた還元的アミノ化が１５分以
内にプラトーに到達し、湯浴中で４８時間後に得られた結果に匹敵するアミノ化
多糖生成物を生成したことを示している。さらに、それらは、還元的アミノ化が
マイクロ波照射下で行なわれた場合に残留還元性糖のパーセンテージが非常に高
いままであることを示しており、このことは、二次経路の化合物が慣用的な湯浴
中で生じたものと比較してこれらの条件下ではあまり形成されないことを示して
いる。

【００６９】該反応生成物における別の著しい差異は、残留還元性糖残基が反応の最後に残
存する程度である。湯浴中で長時間インキュベートした後には非常に僅かな残留
還元性糖しか残留しない、というのは、おそらく、この反応が経時的に望ましく
ない分解の発生まで進行するからである。これとは著しく対照的に、マイクロ波
においては、実質的な割合の残留還元糖が残存し、かくして、還元的アミノ化を
連続して複数回行なうのに利用可能であるという結果が得られる。マイクロ波処理の間に、解重合が生じず、さらなる還元糖が形成されないこと
も確認された。

【００７０】実施例２逐次（sequential または successive）反応法による多糖の還元的
アミノ化ポリガラクツロン酸は、以下の一般的な構造：

【化２】を有する。シグマ（Sigma）から入手したポリガラクツロン酸（平均分子量５０,
０００等価デキストラン）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８.５）に溶解して最
終濃度を１２ｍｇ／ｍｌとした。ジアミノヘキサン（０.０５Ｍホウ酸緩衝液中
１００ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８.５）４００μｌおよびシアノボロハイドライド（０.
０５Ｍホウ酸緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８.５）４００μｌを添加し、該混
合物を、実施例１または２に記載したとおりマイクロ波装置中で１５または３０
分間、または、５０℃の湯浴中でインキュベートした。次いで、実施例１に記載
したとおり、マイクロ波照射下の還元的アミノ化に付した多糖を試薬から精製し
、精製した多糖を、上記したとおり、再度、還元的アミノ化に付した。

【００７１】別法として、多糖にジアミノヘキサンを添加し、該混合物をマイクロ波装置中
で３０分間インキュベートし、次いで、シアノボロハイドライドを添加し、該混
合物をさらに１５分間インキュベートした。

【００７２】各実験おいて、実施例１に記載したとおり多糖を精製し、分析した。結果を下
記表２に示す。

【００７３】

【表２】

【００７４】これらのデータは、多糖の還元的アミノ化を連続して数回行なうことにより、
または２つの反応段階を別々に行なうことにより、簡単に、アミノ化度を増加さ
せることが可能であるということを示している。

【００７５】実施例３中性多糖の還元的アミノ化に対するマイクロ波照射の効果デキストランは、以下の一般的な構造：

【化３】を有する中性多糖である。平均分子量２６４,０００を有するデキストラン種（
シグマ）をリン酸緩衝液（０.０２Ｍ、ｐＨ７.５）またはホウ酸緩衝液（０.０
５Ｍ、ｐＨ８.２）に溶解して濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。反応混合物を以下
のとおり調製した：この溶液３.２ｍｌにジアミノヘキサン（リン酸緩衝液また
はホウ酸緩衝液中１００ｍｇ／ｍｌ）４００μｌおよびシアノ水素化ホウ素ナト
リウム（リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ）４００μｌを添加
した。試料を、湯浴中またはＳＹＮＴＨＥＷＡＶＥ^ＴＭ４０２マイクロ波装置
中、５０℃で、下記表３に示した時間の間、インキュベートした。マイクロ波装
置においては、マイクロ波照射（照射能：１５Ｗ）に伴う最大温度を５０℃に設
定する。

【００７６】次いで、実施例１に記載したとおり、多糖を精製し、分析した。結果を表３に
示す。

【表３】

【００７７】１時間までに、マイクロ波照射下で達成されたアミノ化度（多糖類１ｍｇ当た
りのＮＨ_２（μｍｏｌ）で表した）は、ホウ酸緩衝液を使用した場合、さらに高
かった。対照的に、湯浴中で達成されたアミノ化度は、いずれの緩衝液を使用し
た場合も類似していた。重要なことに、マイクロ波は、ホウ酸緩衝液中でのデキ
ストランの還元的アミノ化を促進する。

【００７８】実施例４Ｎ−アセチル基を含有するが正味の電荷を有しない非イオン性多糖肺炎球菌多糖１４型は、Ｎ−アセチル基を有する中性多糖である。Gotschlich
ら（上掲）の方法に従ってストレプトコッカス・ニューモニエ１４型からそれを
調製し、WO 93/7178 に従って解重合して平均分子量を６０,０００等価デキスト
ランとした。乾燥粉末をホウ酸緩衝液（０.０２Ｍ、ｐＨ８.５）またはリン酸緩
衝液（０.０２Ｍ、ｐＨ８）に溶解して最終濃度１２ｍｇ／ｍｌとした。次いで
、上記実施例１に記載したとおりに行なった。結果を下記表４に示す。

【００７９】

【表４】

【００８０】これは、リン酸緩衝液は、マイクロ波照射下での還元的アミノ化に有利である
が、一方、ホウ酸緩衝液は、湯浴中で還元的アミノ化を行なうのに好ましいとい
うことを示している。したがって、緩衝液の選択は、当該反応を最適化するのに
重要である。リン酸緩衝液中、マイクロ波において３０〜６０分後、最高度の還
元的アミノ化が得られた。

【００８１】マイクロ波照射下で非イオン性多糖が非常に効率的に反応することができると
いう事実は、イオン電荷だけではなく、該分子のコンホメーションまたは特定の
化学基の存在が全双極子モーメントを与えることができることを示唆している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA06 BA03 BA34 CA59 NA14 4C085 AA03 CC32 CC33 DD51 EE06 FF02 4C090 AA05 AA09 BA49 BA50 BA79 BB53 BB55 BB62 BB63 CA34 DA09 DA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多糖の還元的アミノ化法であって、（ｉ）多糖をアミノ化するのに十分な時間、多糖、アミノ化合物および還元剤
を含む反応混合物をマイクロ波照射に付すか；（ｉｉ）（ａ）イミン化合物の形成に十分な時間、多糖およびアミノ化合物を
含む反応混合物をマイクロ波照射に付し、（ｂ）（ａ）において得られた反応混
合物に還元剤を添加して多糖をアミノ化するか；（ｉｉｉ）（ａ）多糖にアミノ化合物を添加してイミン化合物を形成させ、（
ｂ）（ａ）において得られた反応混合物に還元剤を添加し、（ｃ）多糖をアミノ
化するのに十分な時間、（ｂ）において得られた反応混合物をマイクロ波照射に
付すか；または（ｉｖ）（ａ）イミン化合物の形成に十分な時間、多糖およびアミノ化合物を
含む反応混合物をマイクロ波照射に付し、（ｂ）（ａ）において得られた反応混
合物に還元剤を添加し、（ｃ）多糖をアミノ化するのに十分な時間、（ｂ）にお
いて得られた反応混合物をマイクロ波照射に付すことを含む方法。
【請求項２】マイクロ波照射が集中法または局在法で反応混合物に適用さ
れる請求項１記載の方法。
【請求項３】時間が１０分〜４時間である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】反応混合物が緩衝液中にある請求項１、２または３記載の方
法。
【請求項５】多糖が部分的にアミノ化される請求項１〜４いずれか１項記
載の方法。
【請求項６】部分アミノ化多糖を精製し、精製した部分アミノ化多糖を請
求項１〜５いずれか１項記載の方法に付して該多糖をさらにアミノ化することを
含む請求項５記載の方法。
【請求項７】多糖が細菌または真菌多糖である請求項１〜６いずれか１項
記載の方法。
【請求項８】細菌多糖が莢膜多糖またはリポ多糖のＯ抗原部分である請求
項７記載の方法。
【請求項９】多糖がストレプトコッカス・ニューモニエ（S. pneumoniae
）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（H. influenzae）、ナイセリア・メニンジ
ティディス（N. meningitidis）、イー・コリ（E. coli）、サルモネラ・ティフ
ィ（S. typhi）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）、サルモネ
ラ・ティフィムリウム（S. typhimurium）、クラミジア・ネオフォルマンス（C.
neoformans）、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（S. aureus）、およびシュードモナス・エルジノーサ（P.
aeruginosa）からなる群から調製される請求項８記載の方法。
【請求項１０】還元剤がシアノボロハイドライド、ボロハイドライド、Ｌ
iＡlＨ_４またはピリジンボランである請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】アミノ化合物がポリペプチドであり、還元的アミノ化反応
により多糖−ポリペプチドコンジュゲートが形成される請求項１〜１０いずれか
１項記載の方法。
【請求項１２】アミノ化合物がヒドラジドのようなリンカーであり、還元
的アミノ化反応により活性化多糖が形成される請求項１〜１１いずれか１項記載
の方法。
【請求項１３】活性化多糖をポリペプチドと反応させることを含み、多糖
−ポリペプチドコンジュゲートが得られる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】アミノ化合物がアミノ−チオールアルキルまたはジアミン
のようなスペーサーであり、還元的アミノ化反応により活性化多糖が形成される
請求項１〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】活性化多糖を誘導体化ポリペプチドと反応させることを含
み、多糖−ポリペプチドコンジュゲートが得られる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】請求項１１、１３または１５にて得られた多糖−ポリペプ
チドコンジュゲートを含む医薬組成物。