TW201544119A - 組合物及製備金黃色葡萄球菌血清型５及８莢膜多醣結合物之免疫原性組合物之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含金黃色葡萄球菌(S.aureus)血清型5及8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物，及其製備及使用方法。製造本發明之免疫原性結合物的方法包括使用涉及1,1-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼(PDPH)之結合化學法，使莢膜多醣與載體蛋白質共價結合。

Description

組合物及製備金黃色葡萄球菌血清型5及8莢膜多醣結合物之免疫原性組合物之方法
本發明大體上係關於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)血清型5及8莢膜多醣結合物免疫原性組合物以及其製備及使用方法。
相關申請案之交叉引用
本案主張2009年6月22日申請之美國臨時專利申請案第61/219,143號及第61/219,151號之優先權權益，該等申請案之全部揭示內容各自以全文引用的方式併入本文中。
人類為革蘭氏陽性(Gram-positive)金黃色葡萄球菌之天然儲庫。舉例而言，金黃色葡萄球菌可永久性或暫時性定殖於皮膚、鼻孔及咽喉中而不致病。金黃色葡萄球菌感染範圍為輕度皮膚感染至心內膜炎、骨髓炎、菌血症及敗血症。金黃色葡萄球菌亦造成大部分院內感染，且其日益盛行於社區起始型感染中。此外，2005年，每100,000名個體中感染抗二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)者估計為31.8，包括2005年美國16,650人死亡(Klevens等人，(2007)J.Am.Med.Assoc.298：1763-1771)。當個體由於免疫屏障破壞而變得免疫功能不 全時，諸如在手術、置放留置導管或其他裝置、外傷或創傷期間，疾病隨之發生。
金黃色葡萄球菌產生大量細胞外抗原及細胞內抗原，包括許多毒素及酵素。本文特別感興趣的是金黃色葡萄球菌之莢膜多醣血清型(參看Karakawa及Vann,「Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus」，Weinstein及Fields編。Seminars in Infectious Disease.IV.Bacterial Vaccines.(New York,NY；Thieme Stratton；1982.第285-293頁)，尤其血清型5及8莢膜多醣。對自個體分離之大量金黃色葡萄球菌菌株的流行病學研究顯示，70%至80%為血清型5或8莢膜多醣(Arbeit等人，(1984)Diagn.Microbiol.Infect.Dis.2：85-91)。令人遺憾的是，莢膜多醣本身為不良免疫原。
隨著血管內裝置及侵襲性程序之使用，葡萄球菌感染及疾病在最近20年中顯著增加。發病率上升由於抗生素抗性之並行上升而更加麻煩，因此，迫切需要可預防葡萄球菌感染及疾病的免疫原性組合物。
本發明係關於包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物，及製造該等結合物之方法。金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣可使用熟習此項技術者已知的分離程序直接獲自該細菌，可使用合成方案產生，或可使用熟習此項技術者亦已知的基因工程程序重組產生。此外，本發明提供誘導針對葡萄球菌之免疫反應的方法、預防葡萄球菌所致之疾病的方法，及降低由葡萄球菌感染所致之疾病的至少一種症狀之嚴重程度的方法。
在一個實施例中，本發明包含免疫原性多醣-蛋白質結合物，其包含分離金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質之結合，其中多醣之分子量為20kDa至1000kDa。在一些實施例中，免疫原性 結合物之分子量為200kDa至5000kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之多醣部分的分子量範圍為70kDa至300kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之分子量範圍為500kDa至2500kDa。
在一個實施例中，血清型5或8莢膜多醣之O-乙醯化度為10%至100%。在一個實施例中，O-乙醯化度為50%至100%。在一個實施例中，O-乙醯化度為75%至100%。在一個實施例中，免疫原性結合物產生功能性抗體，如在動物效力模型中或經由調理吞噬細胞性殺死分析(opsonophagocytic killing assay)、依據殺死細菌所量測。
在一個實施例中，免疫原性結合物載體蛋白質包含CRM197。在一個實施例中，CRM197係經由胺基甲酸酯鍵、醯胺鍵或二者共價連接至多醣。在一個實施例中，結合離胺酸與CRM197之莫耳比可為約10：1至約25：1。在一個實施例中，對於多醣之至少每5至10個醣重複單元，結合物包含一個介於CRM197與多醣之間的共價鍵。在一個實施例中，介於載體蛋白質與多醣之間的鍵在多醣之每5個重複單元中出現一次。
在一個實施例中，包含CRM197之免疫原性結合物包含5至22個離胺酸或8至15個離胺酸共價連接至多醣。在一個實施例中，包含CRM197之免疫原性結合物包含5至23個離胺酸或8至12個離胺酸共價連接至多醣。
在一個實施例中，免疫原性結合物包含10%至100% O-乙醯化之5或8型多醣。在一個實施例中，免疫原性結合物包含50%至100% O-乙醯化之5或8型多醣。在一個實施例中，免疫原性結合物包含75%至100% O-乙醯化之5或8型多醣。在一些實施例中，免疫原性組合物可用於在動物效力模型或調理吞噬細胞性殺死分析中產生功能性抗體。
在一個實施例中，以5或8型多醣之總量計，免疫原性結合物包含小於約30%之游離5或8型多醣。
在一個實施例中，以5或8型多醣之總量計，免疫原性結合物包含小於約20%之游離5或8型多醣。
在一個實施例中，本發明包含一種免疫原性組合物，其包含如本文所述之免疫原性結合物及至少一種佐劑、稀釋劑或載劑。
佐劑可為基於鋁之佐劑，諸如磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁中之一或多者。在一個實施例中，佐劑包含磷酸鋁。
在一個實施例中，以5或8型多醣之總量計，免疫原性組合物包含小於約30%之游離5或8型多醣。
在一個實施例中，以5或8型多醣之總量計，免疫原性組合物包含小於約20%之游離5或8型多醣。
在一個實施例中，本發明包含一種誘導個體產生針對金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣結合物之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與免疫有效量的如本文所述之免疫原性組合物。
在一個實施例中，本發明包含一種產生免疫原性多醣-蛋白質結合物的方法，該結合物包含分離金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質之結合，該方法包含如下步驟：使分離金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與1,1-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)在有機溶劑中反應，產生活化血清型5或8多醣；及使活化血清型5或8多醣與載體蛋白質在有機溶劑中反應，產生血清型5或8多醣：載體蛋白質結合物。
在一個實施例中，活化金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣之方法進一步包含凍乾分離血清型5或8多醣及將凍乾之多醣再懸浮於有機溶劑中。在一個實施例中，活化再懸浮之多醣，接著直接與載體蛋白質反應。在一個實施例中，將活化之分離血清型5或8多醣分離後與載體蛋白質反應。在一個實施例中，凍乾分離之活化之分離血清型5或8多醣以產生凍乾之活化之分離血清型5或8多醣，隨後使該多醣與載體蛋白質反應。在一個實施例中，產生分離多醣-載體蛋白質結合 物之方法包含凍乾載體蛋白質以產生經凍乾之載體蛋白質、隨後使該載體蛋白質與多醣反應的步驟。在一個實施例中，產生分離多醣-載體蛋白質結合物之方法包含將凍乾之活化之分離血清型5或8多醣及經凍乾之載體蛋白質再懸浮於有機溶劑中之步驟作為活化之分離血清型5或8多醣與載體蛋白質反應的一部分。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法包含稀釋活化之多醣與載體蛋白質之反應混合物並在約20℃至約26℃下維持約8.8至約9.2之pH值至少4小時的步驟。
在一個實施例中，活化金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣與載體蛋白質之反應混合物在約23℃下、在約9.0之pH值下維持至少4小時。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣-載體蛋白質的方法包含在產生分離血清型5或8多醣-蛋白質結合物後將其分離的步驟。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物的方法中所使用之有機溶劑為極性非質子性溶劑。在一個實施例中，極性非質子性溶劑係選自由二甲亞碸(DMSO)組成之群。在一個實施例中，產生分離多醣-載體蛋白質結合物之方法中的有機溶劑為DMSO。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5型莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法包含將含有5型莢膜多醣及CDT於有機溶劑中之反應混合物的水濃度調節至約0.1%至0.3%的步驟。在一個實施例中，包含5型莢膜多醣及CDT於有機溶劑中之反應混合物的水濃度係調節至約0.2%。
在一個實施例中，使分離金黃色葡萄球菌5型莢膜多醣活化之步驟包含使多醣與CDT反應，其中CDT的用量約比包含5型莢膜多醣及 CDT於有機溶劑中之反應混合物中所存在之多醣之量過量20莫耳。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌8型莢膜多醣：載體蛋白質結合物之方法包含測定包含8型莢膜多醣之反應混合物之水濃度的步驟。在一個實施例中，添加至反應混合物中以活化多醣之CDT的量係依照與包含8型莢膜多醣及CDT於有機溶劑中之反應混合物中之水含量約等莫耳的CDT量提供。
在一個實施例中，添加至反應混合物中以活化多醣之CDT的量係依照與包含8型莢膜多醣及CDT於有機溶劑中之反應混合物中之水含量莫耳比為約0.5：1的CDT之量提供。在一個實施例中，添加至反應混合物中以活化多醣之CDT的量係依照與包含8型莢膜多醣及CDT於有機溶劑中之反應混合物中之水含量莫耳比約為0.75：1的CDT之量提供。
在一個實施例中，包含分離活化之多醣之步驟的方法包含透析過濾步驟。
在一個實施例中，該方法包含凍乾載體蛋白質，凍乾前，相對於NaCl透析過濾載體蛋白質且將NaCl/載體蛋白質之重量比(w/w)調節至約0.5至約1.5。在一個實施例中，NaCl與載體蛋白質之比率為約1。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物的方法中所使用之載體蛋白質包含CRM197。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物的方法中所使用之CRM197與活化血清型5或8多醣以約1：1之重量比反應。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法包含將5或8型莢膜多醣與咪唑或三唑混合後再與CDT混合於有機溶劑中之步驟。
在一個實施例中，產生分離金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣：載體蛋白質結合物的方法包含水解血清型5或8多醣-載體蛋白質結合物以移除未反應之活性基團的步驟。
在一個實施例中，本發明提供一種產生免疫原性結合物的方法，該結合物包含分離金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質之結合，該方法包含如下步驟：使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼(PDPH)及碳化二亞胺在有機溶劑中反應，產生PDPH連接之多醣；使PDPH連接之多醣與還原劑反應，產生活化多醣；分離活化之血清型5或8多醣，產生分離之活化血清型5或8多醣；提供活化載體蛋白質；使分離之活化血清型5或8多醣與活化載體蛋白質反應，產生血清型5或8多醣-載體蛋白質結合物；藉此產生包含分離金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物。在一個實施例中，分離活化載體蛋白質後，使該活化載體蛋白質與活化多醣反應。
在一個實施例中，分離活化載體蛋白質之步驟進一步包含凍乾分離之活化血清型5或8多醣，產生凍乾之活化血清型5或8多醣。
在一個實施例中，溴乙酸為溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)。
在一個實施例中，利用PDPH產生血清型8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法包含使用有機溶劑，該有機溶劑為極性非質子性溶劑。在一個實施例中，極性非質子性溶劑係選自由二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮及六甲基磷醯胺(HMPA)組成之群。在一個實施例中，有機溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
在一個實施例中，利用PDPH產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法中所使用之碳化二亞胺為1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙 基)-碳化二亞胺(EDAC)。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法包含使血清型5或8莢膜多醣與PDPH及EDAC以約1：5：3之多醣：PDPH：EDAC重量比於有機溶劑中反應的步驟。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法中所使用之還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
在一個實施例中，在利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物的方法中活化載體蛋白質包含使載體蛋白質與溴乙酸反應。
在一個實施例中，在利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物的方法中分離活化血清型5或8多醣之步驟包含透析過濾。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法包含水解血清型5或8多醣-載體蛋白質結合物以移除未反應之活性基團的步驟。在一個實施例中，水解血清型5或8多醣-載體蛋白質結合物之步驟包含添加半胱胺鹽酸鹽。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法進一步包含分離含有分離金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物。
在一個實施例中，分離血清型5或8多醣-載體蛋白質結合物包含透析過濾。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物的方法中所使用之載體蛋白質包含CRM197。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-CRM197結合物之方法中的CRM197係以約1：1 CRM197：莢膜多醣分子之 重量比添加。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法中所使用之活化5或8型莢膜多醣的分子量為約50kd至約500kd。
在一個實施例中，利用PDPH及EDAC產生血清型5或8莢膜多醣-載體蛋白質結合物之方法中所產生之免疫原性結合物的分子量為約400kd至約5000kd。
在一個實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含藉由本文所述之任何方法產生的5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物。
在一個實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含藉由本文所述之任何方法所產生之5或8型莢膜多醣-載體蛋白質結合物及至少一種佐劑、稀釋劑或載劑。在一個實施例中，免疫原性組合物包含可選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群的基於鋁之佐劑。在一個實施例中，本文所述之免疫原性組合物包含佐劑磷酸鋁。
以5或8型多醣之總量計，本文所述之免疫原性組合物可包含小於30%及小於20%之游離5或8型多醣。本文所述之免疫原性組合物可於水或低離子強度中性pH值緩衝液中儲存。
在一個實施例中，本發明提供一種減輕或預防個體之葡萄球菌感染、與葡萄球菌相關之疾病或病狀的方法，該方法包含向該個體投與治療或預防量之如本文所述之免疫原性組合物的步驟。在一個實施例中，該感染、疾病或病狀係選自由侵襲性金黃色葡萄球菌、敗血症及帶原者組成之群。
在一個實施例中，本發明提供一種減輕或預防經歷外科程序之個體之葡萄球菌感染的方法，該方法包含在該外科程序前向該個體投與預防有效量之如本文所述之免疫原性組合物的步驟。
在一個實施例中，本發明之方法包含以CDI替代CDT。
在一個實施例中，本發明提供具有50kDa至800kDa分子量之金黃色葡萄球菌5或8型莢膜多醣與載體蛋白質之共價結合物；其中該多醣與載體蛋白質之共價結合物之組合分子量為約400kDa至5000kDa。
在一個實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物包含分子量範圍為70kDa至300kDa的多醣部分。在一個實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物之分子量範圍為500kDa至2500kDa。
在一個實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物中的載體蛋白質部分包含CRM197。在一個實施例中，CRM197係經由胺基甲酸酯鍵、醯胺鍵或二者共價連接至多醣。在一些實施例中，結合離胺酸與CRM197之莫耳比為約10：1至約25：1。在一些實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物在多醣之至少每5至10個醣重複單元處包含至少一個介於CRM197與多醣之間的共價鍵。在一些實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物在多醣之每5個醣重複單元處包含至少一個介於CRM197與多醣之間的鍵。在一些實施例中，多醣與CRM197之共價結合物中的CRM197部分包含5至22個共價連接至多醣之離胺酸。在一些實施例中，多醣與CRM197之共價結合物中的CRM197部分包含5至23個共價連接至多醣之離胺酸。在一些實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物中的CRM197部分包含8至15個共價連接至多醣之離胺酸。在一些實施例中，多醣與載體蛋白質之共價結合物中的CRM197部分包含8至12個共價連接至多醣之離胺酸。
在一個實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含如本文所述之金黃色葡萄球菌5或8型多醣與載體蛋白質之共價結合物及至少一種佐劑、稀釋劑或載劑。
在一個實施例中，本發明提供一種向個體投與包含如本文所述之金黃色葡萄球菌5或8型多醣與載體蛋白質之共價結合物的免疫原性 組合物以產生如本文所述之免疫反應的方法。
在一個實施例中，本發明提供一種分離分子量為20kDa至1000kDa之多醣的方法。
在一個實施例中，本發明提供一種藉由本發明之莢膜多醣、免疫原性結合物或免疫原性組合物產生的抗體。
圖1展示金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣之重複多醣結構(N-乙醯基胺基甘露醇醛酸為ManNAcA，N-乙醯基L-岩藻糖胺為L-FucNAc，且N-乙醯基D-岩藻糖胺為D-FucNAc)；圖2A展示對金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣(O-乙醯基分析)及磷壁酸(磷酸鹽分析)之離子交換層析(Q-瓊脂糖)之溶離份的分析；圖2B展示藉由雙向免疫擴散分析分析金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣之離子交換層析(Q-瓊脂糖)之溶離份；圖3A展示在95℃下、在熱處理期間pH值(3.5、4或5)對降低金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣分子量的影響；圖3B展示在pH 3.5下、在熱處理期間溫度(55℃、75℃或95℃)對降低金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣分子量的影響；圖4展示純化金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣相較於血清型5莢膜多醣在熱處理期間、分別在pH 3.5及pH 4.5下及在95℃下隨時間變化之分子量；圖5展示相較於經AlPO4處理之對照組(圓形)，接受血清型8莢膜多醣-CRM197結合物之小鼠(菱形)的存活率增加；圖6展示金黃色葡萄球菌血清型5多醣之重複多醣結構(N-乙醯基胺基甘露醇醛酸為ManNAcA，N-乙醯基L-岩藻糖胺為L-FucNAc，且 N-乙醯基D-岩藻糖胺為D-FucNAcA)；圖7A展示對金黃色葡萄球菌血清型5多醣(O-乙醯基分析)及磷壁酸(磷酸鹽分析)之離子交換層析(Q-瓊脂糖)之溶離份的分析；圖7B展示藉由雙向免疫擴散分析分析金黃色葡萄球菌血清型5多醣之離子交換層析(Q-瓊脂糖)的溶離份；圖8A展示在95℃下、在熱處理期間pH值(3.5、4或5)對降低金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣分子量的影響；圖8B展示在pH 3.5下、在熱處理期間溫度(55℃、75℃或95℃)對降低金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣分子量的影響；圖9展示相較於經PBS處理之對照組，接受血清型5多醣-CRM197結合物之小鼠的腎盂腎炎減輕(陰影區域為經處理之小鼠)；圖10展示在接種高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM或PP5-CRM對照物之小鼠中以金黃色葡萄球菌PFESA0266攻毒後腎中之復原群落形成單位(CFU)；及圖11展示自接種多醣結合物(高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM)之不同調配物之小鼠獲得之血清的OPA效價(幾何平均值)之比較。各組由5至9隻小鼠組成。
考量本發明之[實施方式]時，將更透徹地理解本發明，且除上文所述以外的特徵、態樣及優勢將變得顯而易見。此[實施方式]係參考下文圖式。
概述
本發明係關於包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合之免疫原性結合物以及其製備及使用方法。本發明之免疫原性結合物的新穎特徵包括多醣及所得結合物之分子量分佈、每個CRM197載體蛋白質中之結合離胺酸之比率及共價連接至多醣之離胺 酸之數目、載體蛋白質與多醣之間共價鍵的數目與多醣之重複單元的關係，及游離多醣以總多醣計之相對量。如本文中所使用之術語「游離多醣」意謂未與載體蛋白質結合、但仍然存在於結合物組合物中的多醣。
用於製造本發明之免疫原性結合物的方法包括使用結合化學法使莢膜多醣與載體蛋白質共價結合，結合化學法包括CDI(1,1-羰基二咪唑)、CDT(1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)。CDI僅特定用於CP8結合。使用CDI/CDT在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生單碳或零碳連接子，而使用PDPH在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生共價硫醚鍵。
用於使-SH(硫醇化CP)與-NH2鍵聯之其他交聯劑包括(但不限於)：sulfo-LC-SMPT；sulfo-LC-SMPT(6-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸4-磺基丁二醯亞胺酯)；sulfo-KMUS(N-[k-順丁烯二醯亞胺基十一醯基氧基]磺基丁二醯亞胺酯)；sulfo-LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸磺基丁二醯亞胺酯)，其可被硫醇分解；sulfo-SMPB(4-[對-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸磺基丁二醯亞胺酯)；sulfo-SIAB([4-碘乙醯基]胺基苯甲酸N-磺基丁二醯亞胺酯)；sulfo-EMCS([N-e-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基]磺基丁二醯亞胺酯)；EMCA(N-e-順丁烯二醯亞胺基己酸)；sulfo-SMCC(4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯)；sulfo-MBS(間-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基丁二醯亞胺酯)；sulfo-GMBS(N-[g-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基]磺基丁二醯亞胺酯)；BMPA(N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸)；2-亞胺基硫烷鹽酸鹽；3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯；3-順丁烯二醯亞胺基丙酸N-丁二醯亞胺酯；4-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-丁二醯亞胺酯；SMPT(4-丁二醯亞胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫基]甲苯)；LC-SMCC(4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲 基]環己烷-1-羧基-[6-醯胺基己酸丁二醯亞胺酯])；KMUA(N-k-順丁烯二醯亞胺基十一酸)；LC-SPDP(6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯)；SMPH(6-[β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]己酸丁二醯亞胺酯)；SMPB(4-[對-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸丁二醯亞胺酯)；SIAB([4-碘乙醯基]胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯)；EMCS(N-e-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基]丁二醯亞胺酯)；SMCC(4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯)；MBS(間-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)；SBAP(3-[溴乙醯胺基]丙酸丁二醯亞胺酯)；BMPS(N-[β-順丁烯二醯亞胺基丙氧基]丁二醯亞胺酯)；AMAS(N-(a-順丁烯二醯亞胺基乙醯氧基)丁二醯亞胺酯)；SIA(碘乙酸N-丁二醯亞胺酯)；及(4-碘乙醯基)-胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯。
該等試劑亦可使用用於-SH與-OH基團連接之交聯劑交聯。該等交聯劑包括(但不限於)PMPI(N-[對-順丁烯二醯亞胺基苯基]異氰酸酯)。
本文所述之組合物及方法適用於各種應用。舉例而言，結合物可用於產生結合物免疫原性組合物以保護接受者免遭金黃色葡萄球菌感染。或者，各種結合物可用於產生針對細菌莢膜多醣之抗體，該等抗體隨後可用於研究及臨床實驗室分析，諸如細菌偵測及血清型分類。該等抗體亦可用於賦予個體被動免疫性。在一些實施例中，所產生之針對細菌多醣之抗體在動物效力模型或調理吞噬細胞性殺死分析中具有功能性。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。雖然類似或等效於本文中所述者之任何方法及材料均可用於本發明之實施或測試中，但本文中所述方法及材料較佳。在描述實施例及主張本發明時，某些術語將根據下文所述之定義使用。
如本文中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數個指代物，除非上下文另外明確規定。因而，例如，提及「該方法」包括一或多種方法及/或本文所述類型之步驟及/或一般技術者閱讀本發明後將顯而易知者，等等。
如本文中所使用，「約」意謂在統計上有意義的值範圍內，諸如所述濃度範圍、時間範圍、分子量、溫度或pH值。該範圍可在一個數量級內，通常在給定值或範圍之20%以內，更通常在10%以內，且更通常在5%以內。術語「約」所涵蓋之容許偏差將視所研究之特定系統而定，且可被一般技術者容易瞭解。當在本案內敍述範圍時，該範圍內之每個整數亦視作本發明之一實施例。
應注意，在本發明中，諸如「包含」、「含有」及其類似術語之術語可具有美國專利法中賦予其之含義；例如其可意謂「包括」及其類似術語。該等術語係指包括一種特定成分或一組成分而不排除任何其他成分。諸如「基本上由...組成」之術語具有美國專利法中賦予其之含義，例如，其允許包括不減損本發明之新穎或基本特徵的其他成分或步驟，亦即，其排除會減損本發明之新穎或基本特徵的其他未敍述成分或步驟，且其排除先前技術之成分或步驟，諸如本文中引用或以引用方式併入本文中的此項技術中之文獻，尤其當本文件之目標為定義可取得專利(例如與先前技術相比具有新穎性、不明顯性、創造性，例如與本文中引用或以引用方式併入本文中的文獻相比)之實施例時。又，術語「由...組成」具有美國專利法中賦予其之含義；即此等術語為封閉式的。因此，此等術語係指包括一種特定成分或一組成分且排除所有其他成分。
免疫原性結合物
如上文所述，本發明係關於包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物。本發明之一個實施例 提供包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體分子或蛋白質相結合的免疫原性結合物，其具有一或多個以下特徵：多醣具有50kDa至700kDa之分子量；免疫原性結合物具有500kDa至2500kDa之分子量；且結合物包含相對於總多醣小於約30%之游離多醣。在一些實施例中，多醣具有20kDa至1000kDa之分子量。在一些實施例中，免疫原性結合物具有200kDa至5000kDa之分子量。在其他實施例中，結合物包含相對於總多醣小於約25%、約20%、約15%、約10%或約5%的游離多醣。
如本文中所使用之「結合物」包含通常具有所要分子量範圍之莢膜多醣及載體蛋白質，其中莢膜多醣結合至載體蛋白質。結合物可能含有或不含有一定量的游離莢膜多醣。如本文中所使用，「游離莢膜多醣」係指與莢膜多醣：載體蛋白質結合物非共價締合(亦即非共價結合、吸附或截留)的莢膜多醣。術語「游離莢膜多醣」、「游離多醣」及「游離醣」可互換使用且意欲表達相同含義。
不考慮載體分子之性質，其可直接或經由連接子結合至莢膜多醣。如本文中所使用，「結合」係指細菌莢膜多醣藉以共價連接至載體分子的過程。結合增強細菌莢膜多醣之免疫原性。結合可根據下文所述之方法或藉由此項技術已知之其他方法進行。
用於免疫原性組合物中時，需考慮金黃色葡萄球菌莢膜多醣之分子量。高分子量莢膜多醣由於抗原表面上所存在之抗原決定基的價數較高而能夠誘導某些抗體免疫反應。分離「高分子量莢膜多醣」預期可用於本發明之組合物及方法中。在本發明之一實施例中，可分離並純化分子量在20kDa至1000kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。在本發明之一實施例中，可分離並純化分子量在50kDa至700kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。在本發明之一實施例中，可分離並純化分子量在50kDa至300kDa範圍內的高分子量血清 型5或8莢膜多醣。在一實施例中，可分離並純化分子量在70kDa至300kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。在一實施例中，可分離並純化分子量在90kDa至250kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。在一實施例中，可分離並純化分子量在90kDa至150kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。在一實施例中，可分離並純化分子量在90kDa至120kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。在一實施例中，可分離並純化分子量在80kDa至120kDa範圍內的高分子量血清型5或8莢膜多醣。可藉由本發明方法分離並純化的高分子量血清型5或8莢膜多醣之其他範圍包括分子量為70kDa至100kDa；分子量為70kDa至110kDa；；分子量為70kDa至120kDa；分子量為70kDa至130kDa；分子量為70kDa至140kDa；分子量為70kDa至150kDa；分子量為70kDa至160kDa；分子量為80kDa至110kDa；分子量為80kDa至120kDa；分子量為80kDa至130kDa；分子量為80kDa至140kDa；分子量為80kDa至150kDa；分子量為80kDa至160kDa；分子量為90kDa至110kDa；分子量為90kDa至120kDa；分子量為90kDa至130kDa；分子量為90kDa至140kDa；分子量為90kDa至150kDa；分子量為90kDa至160kDa；分子量為100kDa至120kDa；分子量為100kDa至130kDa；分子量為100kDa至140kDa；分子量為100kDa至150kDa；分子量為100kDa至160kDa；及類似所要分子量範圍。任何上述範圍內之任何整數均視作本發明之實施例。
在一個實施例中，結合物之分子量為約50kDa至約5000kDa。在一個實施例中，結合物之分子量為約200kDa至約5000kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之分子量為約500kDa至約2500kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之分子量為約500kDa至約2500kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之分子量為約600kDa至約2800kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之分子量為約700kDa 至約2700kDa。在一個實施例中，免疫原性結合物之分子量為約1000kDa至約2000kDa；約1800kDa至約2500kDa；約1100kDa至約2200kDa；約1900kDa至約2700kDa；約1200kDa至約2400kDa；約1700kDa至約2600kDa；約1300kDa至約2600kDa；約1600kDa至約3000kDa。任何上述範圍內之任何整數均視作本發明之實施例。
如本文中所使用，「免疫原性」意謂抗原(或抗原之抗原決定基)(諸如細菌莢膜多醣)或包含抗原之結合免疫原性組合物在諸如哺乳動物之宿主中引發體液或細胞介導或兩者介導之免疫反應的能力。因此，如本文中所使用之「免疫原性結合物」或「結合物」意謂含有結合至載體分子之可用於引發免疫反應之細菌莢膜多醣抗原或抗原決定子(亦即抗原決定基)的任何免疫原性結合物。免疫原性結合物可用於藉由在細胞表面呈現與MHC分子結合之抗原而使宿主敏感。此外，可產生抗原特異性T細胞或抗體以進一步保護經免疫之宿主。因而，免疫原性結合物可保護宿主免患一或多種與細菌感染相關之症狀，或者可保護宿主以免因感染與莢膜多醣相關之細菌而死亡。免疫原性結合物亦可用於產生多株或單株抗體，該等抗體可用於賦予個體被動免疫性。免疫原性結合物亦可用於產生功能性抗體，如在動物效力模型中或經由調理吞噬細胞性殺死分析、依據殺死細菌所量測。
「抗體」為一種免疫球蛋白分子，其能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中的抗原識別位點特異結合標靶，諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等。如本文中所使用，除非上下文另外指明，否則希望該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且涵蓋工程改造之抗體(例如效應功能、穩定性及其他生物活性改變的嵌合抗體、人類化抗體及/或衍生抗體)及其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)及域抗體(包括鯊魚及駱駝科抗體)，及包含抗體部分之融合蛋白、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異抗體，只要其展 現所要生物活性)及如本文所述之抗體片段，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾構型。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且抗體不必屬於任何特定類別。視抗體重鏈恆定域的胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同類別。有五種主要類別免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中多者可進一步分成子類(同型)，例如人類中之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應不同類別免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維構型已熟知。
「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留當存在於完整抗體中時在正常情況下與該部分相關之功能中的至少一者、較佳大部分或全部。
術語「抗原」一般係指可在動物中刺激產生抗體或T細胞反應或二者的生物分子，通常為免疫原性組合物或免疫原性物質(包括注射或吸收至動物中的組合物)中之蛋白質、肽、多醣或結合物。免疫反應可針對完整分子或分子之不同部分(例如抗原決定基或半抗原)產生。該術語可用於指抗原分子之個別分子或指抗原分子之同源或異源群體。抗原可被抗體、T細胞受體或具有特異體液及/或細胞免疫性之其他元件識別。「抗原」亦包括所有相關之抗原性抗原決定基。指定抗原之抗原決定基可使用此項技術熟知之抗原決定基定位技術來鑑別。參看例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press,Totowa,N.J。舉例而言，線性抗原決定基可如下測定：例如在固體擔體上同時合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子之各部分；及在該等肽仍連接於擔體的同時，使該等肽與抗體反應。該等技術在此項技術中已知者，且描述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen等人，(1986)Molec. Immunol.23：709-715中；各文獻以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般。同樣，構形抗原決定基可藉由例如X射線結晶學及二維核磁共振測定胺基酸之空間構形來鑑別。參看例如Epitope Mapping Protocols，上文。此外，出於本發明之目的，「抗原」亦可用於指包括對天然序列之修飾(諸如缺失、添加及取代(本質上一般具保守性，但其可能具非保守性))的蛋白質，只要蛋白質仍能夠引發免疫反應即可。此等修飾可能為有意的，如藉由定點突變誘發，或藉由特定合成程序，或藉由基因工程方法進行修飾，或者可能為偶然的，諸如藉由產生抗原之宿主之突變。此外，抗原可來源於、獲自或分離自微生物，例如細菌，或者可為完整生物體。同樣，該定義中亦包括表現抗原之寡核苷酸或聚核苷酸，諸如在核酸免疫應用中。亦包括合成抗原，例如多抗原決定基、側接抗原決定基及其他來源於重組或合成之抗原(Bergmann等人，(1993)Eur.J.Immunol.23：2777 2781；Bergmann等人，(1996)J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier(1997)Immunol.Cell Biol.75：402 408；Gardner等人，(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日至7月3日)。
「保護性」免疫反應係指免疫原性組合物引發體液或細胞介導或二者介導之免疫反應用於保護個體免遭感染的能力。所提供之保護不必為絕對的，亦即，若相較於對照個體群體(例如未投與疫苗或免疫原性組合物之已感染動物)存在統計上顯著之改善，則不必完全預防或根除感染。保護可能侷限於減輕感染症狀之嚴重程度或發作速度。一般而言，「保護性免疫反應」將包括在至少50%個體中誘導對特定抗原具特異性之抗體的含量增加，包括功能性抗體對各種抗原之某些可量測反應程度。在特定情況下，「保護性免疫反應」可包括在至少50%個體中誘導對特定抗原具特異性之抗體的含量增加兩倍或四倍，包括功能性抗體對各種抗原之某些可量測反應程度。在某些實施 例中，調理素化抗體(opsonising antibody)與保護性免疫反應有關。因而，保護性免疫反應可藉由在調理吞噬細胞性分析中量測細菌數之下降百分比加以分析，例如下文所述者。細菌數下降至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上較佳。組合物中之特定結合物的「免疫原性量」一般係基於該結合物之結合及未結合之總多醣而定量。舉例而言，在100mcg劑量中，含20%游離多醣之血清型5或8莢膜多醣結合物將具有約80mcg結合多醣及約20mcg未結合多醣。在計算結合物劑量時，通常不考慮結合物中之蛋白質比例。結合物之量可視葡萄球菌血清型而變。一般而言，各劑量將包含0.1至100mcg多醣，尤其0.1至10mcg多醣，且更尤其1至10mcg多醣。
術語「個體」係指哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或任何其他動物。術語「個體」亦包括人類。術語「個體」亦包括家養寵物。家養寵物之非限制性實例包括：狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠(gerbil)、倉鼠、天竺鼠、雪貂、鳥、蛇、蜥蜴、魚、龜及蛙。術語「個體」亦包括牲畜。牲畜之非限制性實例包括：羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、駱馬、騾、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、犛牛、雞、鵝及火雞。
如圖1中所示，金黃色葡萄球菌血清型5及8莢膜多醣具有以下結構：血清型5[→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-3-O-Ac-α-L-FucNAc-(1→3)-β-DFucNAc-(1→] n 及血清型8[→3)-4-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-DFucNAc-(1→] n 。參看Jones(2005)Carbohydr.Res.340：1097-1106。血清型8莢膜多醣具有與血清型5莢膜多醣相似之三醣重複單元；然而，其在糖鍵及O-乙醯化位點方面不同，由此產生血清學上不同之免疫反應模式(Fournier等人，(1984)Infect.Immun.45：87-93；及Moreau等人，(1990)Carbohydr.Res.201：285-297)。因 此，血清型8及5莢膜多醣為相對複雜之碳水化合物，其具水溶性，通常具酸性且先前被認為具有約25kDa之分子量(Fattom(1990)Infect.Immun.58,2367-2374)。
在一些實施例中，本發明之血清型5及/或8莢膜多醣經O-乙醯化。在一些實施例中，5型莢膜多醣或寡糖之O-乙醯化度為10%至100%、20%至100%、30%至100%、40%至100%、50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%、50%至90%、60%至90%、70%至90%或80%至90%。在一些實施例中，8型莢膜多醣或寡糖之O-乙醯化度為10%至100%、20%至100%、30%至100%、40%至100%、50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%、50%至90%、60%至90%、70%至90%或80%至90%。在一些實施例中，5型及8型莢膜多醣或寡糖之O-乙醯化度為10%至100%、20%至100%、30%至100%、40%至100%、50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%、50%至90%、60%至90%、70%至90%或80%至90%。
多醣或寡糖之O-乙醯化度可藉由此項技術已知之任何方法測定，例如藉由質子NMR測定(Lemercinier及Jones 1996,Carbohydrate Research 296,83-96；Jones及Lemercinier 2002,J Pharmaceutical and Biomedical analysis 30,1233-1247；WO 05/033148或WO 00/56357)。另一常用方法係由Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180,249-261描述。
在一些實施例中，本發明之血清型5及/或8莢膜多醣係用於產生功能性抗體，如在證明抗體殺死細菌之動物效力模型或調理吞噬細胞性殺死分析中依據殺死細菌所量測。單獨使用監測抗體產生之分析無法證明功能性殺死，此分析不能表明O-乙醯化在效力方面的重要性。
諸如血清型5或8之莢膜多醣可使用一般技術者已知的分離程序直接獲自細菌。參看例如Fournier等人，(1984)，上文；Fournier等 人，(1987)Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.138：561-567；美國專利申請公開案第2007/0141077號；及國際專利申請公開案第WO 00/56357號；各文獻以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般。此外，其可使用合成方案產生。此外，血清型5或8莢膜多醣可使用亦為一般技術者已知的基因工程改造程序重組產生(參看Sau等人，(1997)Microbiology 143：2395-2405；及美國專利第6,027,925號；各文獻以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般)。
可用於獲得分離血清型8莢膜多醣的一種金黃色葡萄球菌菌株為金黃色葡萄球菌R2 PFESA0286。此菌株係在改良型夫蘭茲培養液中培育金黃色葡萄球菌PFESA0286(美國菌種保存中心；Manassas,VA；ATCC寄存編號49525)後藉由流動式細胞測量術以兔抗血清型8多醣抗體加以選擇。在流動式細胞測量術期間觀測兩個群體R1及R2。純化R1及R2並進行再培養。R2產生血清型8莢膜多醣。流動式細胞測量分析顯示均勻螢光強度。因而，選擇R2用於產生血清型8莢膜多醣。
可用於獲得分離血清型5莢膜多醣的一種金黃色葡萄球菌菌株為金黃色葡萄球菌PFESA0266。此菌株在生長期間產生血清型5莢膜多醣，且當細胞處於靜止期時產量達到峰值。獲自已建立之保存中心或臨床試樣的其他金黃色葡萄球菌5型或8型菌株可用於製造相應多醣。
本發明免疫原性結合物之另一組分為與細菌莢膜多醣結合之載體分子或蛋白質。術語「蛋白質載體」或「載體蛋白質」係指需要針對抗原(諸如莢膜多醣)之免疫反應時可與該抗原結合的任何蛋白質分子。與載體結合可增強抗原之免疫原性。結合可依據標準程序進行。抗原之較佳蛋白質載體為破傷風、白喉、百日咳、假單胞菌(Pseudomonas)、大腸桿菌、葡萄球菌及鏈球菌(Streptococcus)之毒素、類毒素或毒素之任何突變型交叉反應物質(CRM)。在一個實施例中，尤佳載體為白喉類毒素CRM197，其來源於產生CRM197蛋白質之 白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)菌株C7(β197)。此菌株之ATCC寄存編號為53281。產生CRM197之方法描述於美國專利第5,614,382號中，該專利係以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般。或者，可使用蛋白質載體或其他免疫原性蛋白質之片段或抗原決定基。舉例而言，半抗原性抗原可偶合至細菌毒素、類毒素或CRM之T細胞抗原決定基。參看1988年2月1日申請之名為「Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines」的美國專利申請案第150,688號；該申請案係以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般。其他適合載體蛋白質包括不活化細菌毒素，諸如霍亂類毒素(例如國際專利申請案第WO 2004/083251中所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白，諸如外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白(porin)、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏著蛋白(PsaA)或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。亦可使用其他蛋白質作為載體蛋白質，諸如卵清蛋白、匙孔螺血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)。
因此，在一個實施例中，本發明免疫原性結合物內之載體蛋白質為CRM197，且CRM197經由胺基甲酸酯鍵、醯胺鍵或二者共價連接至莢膜多醣。在一些實施例中，本發明免疫原性結合物內之載體蛋白質為CRM197，且CRM197經由硫醚鍵共價連接至莢膜多醣。載體蛋白質中之可結合至莢膜多醣之離胺酸殘基數目可表徵為所結合離胺酸之範圍。舉例而言，在指定免疫原性組合物中，CRM197在39個離胺酸中可包含5至15個共價連接至莢膜多醣的離胺酸。表達此參數之另一方式為12%至40% CRM197離胺酸共價連接至莢膜多醣。舉例而言，在指定免疫原性組合物中，CRM197可在39個離胺酸中包含18至22個共 價連接至莢膜多醣的離胺酸。表達此參數之另一方式為40%至60% CRM197離胺酸共價連接至莢膜多醣。在一些實施例中，CRM197在39個離胺酸中包含5至15個共價連接至CP8的離胺酸。表達此參數之另一方式為12%至40% CRM197離胺酸共價連接至CP8。在一些實施例中，CRM197在39個離胺酸中包含18至22個共價連接至CP5的離胺酸。表達此參數之另一方式為40%至60% CRM197離胺酸共價連接至CP5。
如上文所述，與莢膜多醣結合之載體蛋白質中之離胺酸殘基數目可表徵為所結合離胺酸之範圍，該範圍可表達為莫耳比。舉例而言，CP8免疫原性結合物中之所結合離胺酸與CRM197之莫耳比可為約18：1至約22：1。在一個實施例中，CP8免疫原性結合物中之所結合離胺酸與CRM197之莫耳比範圍可為約15：1至約25：1。在一個實施例中，CP8免疫原性結合物中之所結合離胺酸與CRM197之莫耳比範圍可為約14：1至約20：1；約12：1至約18：1；約10：1至約16：1；約8：1至約14：1；約6：1至約12：1；約4：1至約10：1；約20：1至約26：1；約22：1至約28：1；約24：1至約30：1；約26：1至約32：1；約28：1至約34：1；約30：1至約36：1；約5：1至約10：1；約5：1至約20：1；約10：1至約20：1；或約10：1至約30：1。又，CP5免疫原性結合物中之所結合離胺酸與CRM197之莫耳比可為約3：1至25：1。在一個實施例中，CP5免疫原性結合物中之所結合離胺酸與CRM197之莫耳比範圍可為約5：1至約20：1。在一個實施例中，CP5免疫原性結合物中之所結合離胺酸與CRM197之莫耳比範圍可為約4：1至約20：1；約6：1至約20：1；約7：1至約20：1；約8：1至約20：1；約10：1至約20：1；約11：1至約20：1；約12：1至約20：1；約13：1至約20：1；約14：1至約20：1；約15：1至約20：1；約16：1至約20：1；約17：1至約20：1；約18：1至約20：1；約5：1至約18：1；約7：1至約16：1；或約9：1至約14：1。
表達與莢膜多醣結合之載體蛋白質中之離胺酸殘基數目的另一 方式可為結合離胺酸之範圍。舉例而言，在指定CP8免疫原性結合物中，CRM197可在39個離胺酸中包含5至15個共價連接至莢膜多醣的離胺酸。或者，此參數可表達為百分比。舉例而言，在指定CP8免疫原性結合物中，所結合離胺酸之百分比可為10%至50%。在一些實施例中，20%至50%離胺酸可共價連接至CP8。或者，30%至50% CRM197離胺酸可共價連接至CP8；10%至40% CRM197離胺酸；10%至30% CRM197離胺酸；20%至40% CRM197離胺酸；25%至40% CRM197離胺酸；30%至40% CRM197離胺酸；10%至30% CRM197離胺酸；15%至30% CRM197離胺酸；20%至30% CRM197離胺酸；25%至30% CRM197離胺酸；10%至15% CRM197離胺酸；或10%至12% CRM197離胺酸共價連接至CP8。又，在指定CP5免疫原性結合物中，CRM197可在39個離胺酸中包含18至22個共價連接至莢膜多醣的離胺酸。或者，此參數可表達為百分比。舉例而言，在指定CP5免疫原性結合物中，所結合離胺酸之百分比可為40%至60%。在一些實施例中，40%至60%離胺酸可共價連接至CP5。或者，30%至50% CRM197離胺酸可共價連接至CP5；20%至40% CRM197離胺酸；10%至30% CRM197離胺酸；50%至70% CRM197離胺酸；35%至65% CRM197離胺酸；30%至60% CRM197離胺酸；25%至55% CRM197離胺酸；20%至50% CRM197離胺酸；15%至45% CRM197離胺酸；10%至40% CRM197離胺酸；40%至70% CRM197離胺酸；或45%至75% CRM197離胺酸共價連接至CP5。
莢膜多醣鏈與載體分子上之離胺酸的連接頻率為表徵莢膜多醣之結合物的另一參數。舉例而言，在一個實施例中，莢膜多醣之至少每5至10個醣重複單元存在至少一個介於CRM197與多醣之間的共價鍵。在另一實施例中，莢膜多醣之每5至10個醣重複單元；每2至7個醣重複單元；每3至8個醣重複單元；每4至9個醣重複單元；每6至11個醣重複單元；每7至12個醣重複單元；每8至13個醣重複單元；每9 至14個醣重複單元；每10至15個醣重複單元；每2至6個醣重複單元；每3至7個醣重複單元；每4至8個醣重複單元；每6至10個醣重複單元；每7至11個醣重複單元；每8至12個醣重複單元；每9至13個醣重複單元；每10至14個醣重複單元；每10至20個醣重複單元；或每5至10個醣重複單元存在至少一個介於CRM197與多醣之間的共價鍵。在另一實施例中，莢膜多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個醣重複單元存在至少一個介於CRM197與莢膜多醣之間的鍵。
本發明之一個實施例提供一種免疫原性組合物，其包含任何含有金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與上述載體蛋白質相結合之免疫原性結合物。
術語「免疫原性組合物」係關於任何含有抗原(例如微生物或其組分)之醫藥組合物，該組合物可用於在個體中引發免疫反應。本發明之免疫原性組合物可用於保護或治療易感染金黃色葡萄球菌的人類(藉助於全身、表皮或黏膜途徑投與免疫原性組合物)，或可用於產生可用於賦予另一個體被動免疫性的多株或單株抗體製劑。此等投藥可包括經由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑注射；或經由黏膜投與口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一個實施例中，使用鼻內投藥治療或預防金黃色葡萄球菌之鼻咽帶原者，從而在其最初期減輕感染。免疫原性組合物亦可用於產生功能性抗體，如在動物效力模型中或經由調理吞噬細胞性殺死分析、依據殺死細菌所量測。
特定免疫原性組合物之組分的最佳量可藉由標準研究確定，包括觀測個體之適當免疫反應。初次接種疫苗後，個體可接受一或數次充分間隔之加強免疫。
本發明之免疫原性組合物亦可包括一或多種以下抗原：ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE MntC/SitC/唾液結合蛋白、IsdB、IsdA、 Opp3a、DltA、HtsA、LtaS、SdrH、SrtA、SpA、SBI、α-溶血素(hla)、β-溶血素、纖維結合蛋白結合蛋白A(fnbA)、凝固酶、map、Panton-Valentine殺白血球素(pvl)、γ毒素(hlg)、ica、免疫顯性ABC轉運體、RAP、自溶素、層黏連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、SasF、SasH、EFB(FIB)、FnbB、Npase、EBP、骨涎結合蛋白II、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶(aureolysin)前驅體(AUR)/Sepp1、Cna、TSST-1、mecA、dPNAG、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2 HBP、玻璃連結蛋白結合蛋白、HarA、腸毒素A、腸毒素B、腸毒素C1及新穎自溶素。
在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物進一步包含佐劑、緩衝劑、低溫保護劑、鹽、二階陽離子、非離子型清潔劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載劑中之至少一者。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物內之佐劑為基於鋁之佐劑。在一個實施例中，佐劑為選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群的基於鋁之佐劑。在一個實施例中，佐劑為磷酸鋁。
佐劑為當與免疫原或抗原一起投與時能增強免疫反應的物質。許多細胞激素或淋巴介質已顯示具有免疫調節活性，且因而可以與佐劑相同或類似之方式使用，包括(但不限於)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參看例如美國專利第5,723,127號)、13、14、15、16、17及18(及其突變形式)；干擾素-α、β及γ；顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)(參看例如美國專利第5,078,996號及ATCC寄存編號39900)；巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)；顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；及腫瘤壞死因子α及β。可與本文所述之免疫原性組合物一起使用之其他佐劑包括趨化因子，包括(而不限於)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES；黏著分子，諸如選擇素，例如L-選擇素、P-選擇素及E-選擇素；黏蛋白樣分子，例如CD34、GlyCAM-1及 MadCAM-1；整合素家族成員，諸如LFA-1、VLA-1、Mac-1及p150.95；免疫球蛋白超家族成員，諸如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2及ICAM-3)、CD2及LFA-3；共刺激分子，諸如B7-1、B7-2、CD40及CD40L；生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、PDGF、BL-1及血管內皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2及DR6；及卡斯蛋白酶(Caspase)，包括ICE。
適用於增強免疫反應之佐劑可進一步包括(而不限於)MPLTM(3-O-脫乙醯化單磷醯基脂質A,Corixa；Hamilton,MT)，其描述於美國專利第4,912,094號中。亦適用作佐劑者為可得自Corixa之合成脂質A類似物或者胺基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或類似物，及美國專利第6,113,918號中所述者。一種此類AGP為2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]乙基2-脫氧-4-O-膦醯基-3-O-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基]-2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基-胺基]-b-D-葡萄哌喃糖苷，其亦稱作529(以前稱作RC529)。此529佐劑係調配成水性形式(AF)或穩定乳液(SE)。
其他佐劑包括胞壁醯肽，諸如N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二(十六醯基)-sn-甘油基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，諸如MF59(美國專利第6,299,884號)(含有5%角鯊烯、0.5%聚山梨醇酯80及0.5% Span 85(視情況含有不同量之MTP-PE)，使用微流體化儀，諸如110Y型微流體化儀(Microfluidics,Newton,MA)調配成亞微米顆粒)及SAF(含有10%角鯊烯、0.4%聚山梨醇酯80、5%氧化異丙烯嵌段共聚物L121及thr-MDP，微流體化成亞微米乳液或經渦旋處理產 生較大粒徑之乳液)；不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant；IFA)；鋁鹽(礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛菲金(Amphigen)；阿夫立定(Avridine)；L121/角鯊烯；D-丙交酯-聚丙交酯/醣苷；氧化異丙烯多元醇類；已殺死之博德氏桿菌(Bordetella)；皂苷，諸如美國專利第5,057,540號中所述之StimulonTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA)、美國專利第5,254,339號中所述之Iscomatrix®(CSL Limited,Parkville,Australia)及免疫刺激複合物(ISCOMS)；結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)；細菌脂多醣；合成聚核苷酸，諸如含CpG基元之寡核苷酸(例如美國專利第6,207,646號)；IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria)，描述於歐洲專利第1,296,713號及第1,326,634號中；百日咳毒素(PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如美國專利第7,285,281號、第7,332,174號、第7,361,355號及第7,384,640號)；或大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或其突變體，尤其LT-K63、LT-R72(例如美國專利第6,149,919號、第7,115,730號及第7,291,588號)。
免疫原性組合物可視情況包含醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂經聯邦管理機構、州政府或其他管理機構批准或者列於美國藥典或其他一般認可之藥典中的供用於動物(包括人類以及非人類哺乳動物)之載劑。術語「載劑」係指隨醫藥組合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。水、生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液可用作液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合醫藥載劑之實例描述於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。調配物應適合投藥模式。
本發明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種其他「免疫調節劑」，該等免疫調節劑為干擾或改變免疫系統的藥劑，從而觀測到體液及/或細胞介導之免疫性上調或下調。在一個實施例中，提供體 液及/或細胞介導之免疫系統分支之上調。某些免疫調節劑之實例包括例如佐劑或細胞激素，或Iscomatrix®(CSL Limited；Parkville,Australia)，尤其美國專利第5,254,339號中所述者。可用於本發明之免疫原性組合物中的佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi Inc.；Hamilton,MT)、礬、礦物凝膠(諸如氫氧化鋁凝膠)、水包油乳液、油包水乳液(諸如完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑)、嵌段共聚物(CytRx；Atlanta,GA)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.；Cambridge,MA)、SAF-M(Chiron；Emeryville,CA)、Amphigen®佐劑、皂苷、Quil A或其他皂苷部分、單磷醯基脂質A及阿夫立定脂質胺佐劑。可用於本發明之免疫原性組合物中的水包油乳液之非限制性實例包括改良型SEAM62及SEAM 1/2調配物。改良型SEAM62為含有5%(v/v)角鯊烯(Sigma)、1%(v/v)Span® 85清潔劑(ICI Surfactants)、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80清潔劑(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200mcg/ml Quil A、100mcg/ml膽固醇及0.5%(v/v)卵磷脂的水包油乳液。改良型SEAM 1/2為包含5%(v/v)角鯊烯、1%(v/v)Span® 85清潔劑、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80清潔劑、2.5%(v/v)乙醇、100mcg/ml Quil A及50mcg/ml膽固醇之水包油乳液。可包括於免疫原性組合物中之其他「免疫調節劑」包括例如一或多種介白素、干擾素或其他已知細胞激素或趨化因子。在一個實施例中，佐劑可能為環糊精衍生物或聚陰離子性聚合物，諸如美國專利第6,165,995號及第6,610,310號中分別所述者。應瞭解，所使用之免疫調節劑及/或佐劑將視免疫原性組合物所投與之個體、注射途徑及注射次數而定。
除複數種葡萄球菌莢膜多醣-蛋白質結合物外，本發明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種防腐劑。FDA要求處於多劑量瓶中之生物製品含有防腐劑，僅有少數例外。含有防腐劑之疫苗製品包括含有苄索氯銨(炭疽)、2-苯氧基乙醇(DTaP、HepA、Lyme、Polio(非經 腸))、苯酚(肺炎、傷寒(非經腸)、牛痘)及硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流感、JE、腦膜炎、肺炎、狂犬病)之疫苗。經批准用於可注射藥物之防腐劑包括例如氯代丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯銨、氯化苯甲烴銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
本發明之調配物可進一步包含以下一或多者：緩衝劑、鹽、二階陽離子、非離子型清潔劑、諸如糖之低溫保護劑及諸如自由基清除劑或螯合劑之抗氧化劑，或其任何多重組合。選擇任一種組分(例如螯合劑)可能決定是否需要另一種組分(例如清除劑)。經調配供投藥之最終組合物應無菌及/或無熱原質。熟習此項技術者可視各種因素(諸如必要之特定儲存及投藥條件)，憑經驗確定在含防腐劑之本發明免疫原性組合物中包括此等及其他組分之何種組合將最佳。
在某些實施例中，可與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種生理學上可接受之緩衝劑，其選自(但不限於)Tris(三甲胺)、磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸及丁二酸鹽。在某些實施例中，調配物係緩衝至約6.0至約9.0、較佳約6.4至約7.4之pH範圍內。
在某些實施例中，可能需要調節本發明之免疫原性組合物或調配物的pH值。本發明調配物之pH值可使用此項技術中之標準技術加以調節。調配物之pH值可調節至3.0至8.0。在某些實施例中，調配物之pH值可為或可調節為3.0至6.0、4.0至6.0，或5.0至8.0。在其他實施例中，調配物之pH值可為或可調節為約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約5.8、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0。在某些實施例中，pH值可為或可調節至4.5至7.5，或4.5至6.5、5.0至5.4、5.4至5.5、5.5至5.6、5.6至5.7、5.7至5.8、5.8至5.9、5.9至6.0、6.0至6.1、6.1至6.2、6.2至6.3、6.3至6.5、6.5至7.0、7.0至7.5或7.5至8.0之 範圍內。在一特定實施例中，調配物之pH值為約5.8。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容的本發明調配物包含一或多種二價陽離子，包括(但不限於)MgCl2、CaCl2及MnCl2，濃度範圍為約0.1mM至約10mM，較佳高達約5mM。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容的本發明調配物包含一或多種鹽，包括(但不限於)氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉及硫酸鉀，該等鹽以非經腸投與個體時生理學上可接受之離子濃度存在且以可產生所選離子強度或容積滲透濃度之最終濃度包括在最終調配物中。調配物之最終離子強度或滲透壓度將由多個組分(例如來自緩衝化合物及其他非緩衝鹽之離子)決定。較佳鹽NaCl係以至多約250mM之範圍存在，鹽濃度經選擇與其他組分(例如糖)互補，使得調配物之最終總容積滲透濃度與非經腸投藥(例如肌肉內或皮下注射)相容，且將促進免疫原性組合物調配物之免疫原性組分在各種溫度範圍下的長期穩定性。無鹽調配物將容許一或多種所選低溫保護劑之範圍增加，以維持所要最終容積滲透濃度水準。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容的本發明調配物包含一或多種低溫保護劑，其選自(但不限於)二醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)及多羥基烴(例如半乳糖醇、甘油、甘露醇及山梨醇)。
在某些實施例中，調配物之容積滲透濃度處於約200mOs/L至約800mOs/L之範圍內，較佳範圍為約250mOs/L至約500mOs/L，或約300mOs/L至約400mOs/L。無鹽調配物可含有例如約5%至約25%蔗糖，且較佳含有約7%至約15%或約10%至約12%蔗糖。或者，無鹽調配物可含有例如約3%至約12%山梨醇，且較佳含有約4%至約7%或約5%至約6%山梨醇。若添加諸如氯化鈉之鹽，則相對降低蔗糖或山梨醇之有效範圍。此等及其他滲透壓度及容積滲透濃度考慮完全處於此項技術之技能範圍內。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容的本發明調配物包含一或多種自由基氧化抑制劑及/或螯合劑。各種自由基清除劑及螯合劑在此項技術中已知且應用於本文所述之調配物及使用方法。實例包括(但不限於)乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘露醇、組胺酸、甘油、檸檬酸鈉、肌醇六磷酸鹽、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、丁二酸/丁二酸鹽、蘋果酸/順丁烯二酸鹽、得斯芬(desferal)、EDDHA及DTPA，及上述兩者或兩者以上之不同組合。在某些實施例中，可以有效增強調配物之長期穩定性的濃度添加至少一種非還原性自由基清除劑。一或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑亦可以不同組合添加，諸如清除劑及二階陽離子。螯合劑之選擇將決定是否需要添加清除劑。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容的本發明調配物包含一或多種非離子型界面活性劑，包括(但不限於)聚氧化乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(Tween 80)、聚山梨醇酯-60(Tween 60)、聚山梨醇酯-40(Tween 40)及聚山梨醇酯-20(Tween 20)；聚氧乙烯烷基醚，包括(但不限於)Brij 58、Brij 35以及其他界面活性劑，諸如Triton X-100；Triton X-114、NP40、Span 85及氧化異丙烯系列非離子型界面活性劑(例如氧化異丙烯121)，較佳組分聚山梨醇酯-80之濃度為約0.001%至約2%(高達約0.25%較佳)或聚山梨醇酯-40之濃度為約0.001%至1%(高達約0.5%較佳)。
在某些實施例中，本發明調配物包含一或多種適合非經腸投藥的其他穩定劑，例如包含至少一個硫醇(-SH)基之還原劑(例如半胱胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、還原麩胱甘肽、硫代乙醇酸鈉、硫代硫酸鹽、單硫代甘油或其混合物)。或者或視情況，本發明之含防腐劑之免疫原性組合物調配物可藉由自避光保存調配物(例如藉由使用褐色玻璃容器)之儲存容器中移除氧來進一步穩定。
本發明之含防腐劑之免疫原性組合物調配物可包含一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，包括自身不誘導免疫反應之任何賦形劑。適合賦形劑包括(但不限於)巨分子，諸如蛋白質、醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、蔗糖(Paoletti等人，2001,Vaccine,19：2118)、海藻糖、乳糖及脂質聚集物(諸如油滴或脂質體)。該等載劑為熟習此項技術者所熟知。醫藥學上可接受之賦形劑論述於例如Gennaro,2000,Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，ISBN：0683306472中。
本發明之組合物可凍乾或呈水性形式，亦即溶液或懸浮液。液體調配物宜自其包裝形式直接投與，且因而用於注射較為理想，不似本發明之凍乾組合物所需般，需要在水性介質中復原。
向個體直接遞送本發明之免疫原性組合物可藉由非經腸投藥(肌肉內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內，或投與組織之胞間隙)；或經直腸、經口、經陰道、局部、經皮、鼻內、眼、耳、肺或其他黏膜投藥來實現。在一較佳實施例中，非經腸投藥係藉由肌肉內注射，例如投與個體之股或上臂。注射可經由針(例如皮下注射針)，但可替代性地使用無針注射。典型肌肉內劑量為0.5mL。本發明組合物可製備成各種形式，例如供注射用之液體溶液或懸浮液。在某些實施例中，組合物可製備成供經肺投與之粉末或噴霧，例如含於吸入器中。在其他實施例中，組合物可能製備成栓劑或子宮托，或供經鼻、耳或眼投與之例如噴霧、滴劑、凝膠或粉末。
各免疫原性組合物劑量中之結合物的量係選擇為可誘導免疫保護反應而無顯著不良反應的量。此量可視葡萄球菌血清型而定。一般而言，各劑量將包含0.1至100μg多醣，尤其0.1至10μg多醣，且更尤其1至5μg多醣。
特定免疫原性組合物之組分的最佳量可藉由標準研究確定，包 括觀測個體之適當免疫反應。初次接種疫苗後，個體可接受一或多次充分間隔之加強免疫。
包裝及劑型
本發明之免疫原性組合物可包裝成單位劑量或多劑量形式(例如2劑、4劑或4劑以上)。對於多劑量形式，小瓶通常但未必優於預填充注射器。適合的多劑量形式包括(但不限於)：2至10劑/容器，0.1至2毫升/劑。在某些實施例中，劑量為0.5mL劑量。參看例如國際專利申請案WO 2007/127668，該申請案係以引用的方式併入本文中。
組合物可存在於小瓶或其他適合儲存容器中，或可存在於預填充遞送裝置中，例如可提供有針或無針的單組分或多組分注射器。注射器通常(但未必)含有單劑量之本發明之含防腐劑之免疫原性組合物，儘管亦可設想多劑量預填充注射器。同樣，小瓶可包括單劑量，但可替代性地包括多劑量。
有效劑量體積可按常規方式確定，但組合物之典型注射劑量為0.5mL體積。在某些實施例中，劑量調配成供投與人類個體。在某些實施例中，劑量調配成供投與成人、青少年、青年、幼兒或嬰兒(亦即不超過1歲)人類個體，且在較佳實施例中可藉由注射投藥。
本發明之液體免疫原性組合物亦適用於復原呈現凍乾形式存在之其他免疫原性組合物。在免疫原性組合物用於此種臨時性復原的情況下，本發明提供具有兩個或兩個以上小瓶、兩個或兩個以上預填充注射器或每一者一或多個之套組，其中注射器內含物係用於在注射前復原小瓶之內含物，或反之亦然。
或者，可凍乾並復原本發明之免疫原性組合物，例如使用此項技術中熟知之許多冷凍乾燥方法之一形成乾燥、形狀規則(例如球形)之粒子，諸如微丸或微球體，其粒子特徵(諸如平均直徑尺寸)可藉由改變其具體製備方法加以選擇及控制。免疫原性組合物可進一步包含 可視情況製備成或含於各別乾燥、形狀規則(例如球形)之粒子(諸如微丸或微球體)中的佐劑。在該等實施例中，本發明進一步提供一種免疫原性組合物套組，其包含：包括穩定化、乾燥免疫原性組合物且視情況進一步包含一或多種本發明之防腐劑的第一組分，及包含用於復原該第一組分之無菌水溶液的第二組分。在某些實施例中，水溶液包含一或多種防腐劑且可視情況包含至少一種佐劑(參看例如WO 2009/109550，該文獻以引用的方式併入本文中)。
在又一實施例中，多劑量形式之容器係選自(但不限於)由以下組成之群的一或多者：一般實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、醱酵器、生物反應器、導管、管路、袋、大口瓶、小瓶、小瓶蓋(例如橡膠塞、旋緊蓋)、安瓿、注射器、雙腔室或多腔室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡膠蓋、塑膠蓋、玻璃蓋、藥筒及拋棄式筆及其類似物。本發明之容器不受製造材料限制，且包括諸如以下之材料：玻璃、金屬(例如鋼、不鏽鋼、鋁等)及聚合物(例如熱塑性聚合物、彈性體、熱塑性彈性體)。在一特定實施例中，此形式之容器為具有丁基膠塞之5mL Schott 1型玻璃瓶。熟習此項技術者將瞭解，上述形式絕非詳盡清單，而是僅為熟習此項技術者提供關於可供本發明利用之各種形式的指導。所涵蓋之可用於本發明之其他形式可見於實驗室設備供應商及製造商之公開目錄中，諸如United States Plastic Corp.(Lima,OH),VWR。
製造免疫原性結合物之方法
本發明亦包括製造本文所述之免疫原性結合物的方法。用於製造本發明之免疫原性結合物的方法包括使用結合化學法使莢膜多醣與載體蛋白共價結合，結合化學法包括CDI(1,1-羰基二咪唑)、CDT(1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)。
因此，本發明之一個實施例提供一種基於CDT的製造免疫原性結 合物之方法，該結合物包含相結合之金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質，該方法包含如下步驟：a)使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與咪唑或三唑化合，產生化合多醣；b)使化合多醣與CDT在有機溶劑及約0.1%至約0.3% w/v水中反應，產生活化之血清型5或8莢膜多醣；c)純化活化之血清型5或8莢膜多醣，產生純化之活化血清型5或8莢膜多醣；d)使純化之活化血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質在有機溶劑中反應，產生血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物；及e)水解血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物，移除未反應之活性基團；藉此產生包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物。在一個實施例中，在步驟(d)之前，使純化之活化血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質化合。
在本發明之一個實施例中，提供另一種基於CDT的製造免疫原性結合物之方法，該結合物包含相結合之金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質，該方法包含如下步驟：a)使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與咪唑或三唑化合，產生化合多醣；b)使化合多醣與CDT在有機溶劑及約0.1%至約0.3% w/v水中反應，產生活化之血清型5或8莢膜多醣；c)使活化之血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質在有機溶劑中反應，產生血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物；及d)水解血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物，移除未反應之活性基團；藉此產生包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物。
在一個實施例中，基於CDT的製造免疫原性結合物之方法內的有機溶劑為極性非質子性溶劑。在一個實施例中，有機溶劑為選自由二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮及六甲基磷醯胺(HMPA)組成之群的極性非質子性溶劑。在一個實施例中，有機溶劑為DMSO。
在一個實施例中，在基於CDT之製造免疫原性結合物之方法中，使化合多醣與CDT反應之步驟包含提供相較於多醣約20倍莫耳過量之CDT。
在一個實施例中，在基於CDT之製造免疫原性結合物之方法中，純化活化之血清型5或8莢膜多醣之步驟包含透析過濾。
在一個實施例中，基於CDT之製造免疫原性結合物之方法內的載體蛋白質為CRM197。在一個實施例中，製造免疫原性結合物之方法內的活化血清型5或8莢膜多醣與CRM197以約1：1之重量比反應。
在一個實施例中，在基於CDT之製造免疫原性結合物之方法中，水解血清型5或8多醣：載體蛋白質結合物以移除未反應之活性基團的步驟包含在緩衝液中稀釋並在約20℃至約26℃下維持約8.8至約9.2之pH值至少4小時。在一個實施例中，水解血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物之步驟包含在緩衝液中稀釋並在約23℃下維持約9.0之pH值至少4小時。
在一個實施例中，純化根據基於CDT之製造免疫原性結合物之方法所產生的血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物。在一個實施例中，純化血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物包含透析過濾。
在一個實施例中，在基於CDT之製造免疫原性結合物之方法中，在使化合多醣與CDT反應前，將化合血清型5或8多醣凍乾並再懸浮。在一個實施例中，在使化合多醣與CDT反應前，將化合多醣與載體蛋白分別凍乾並再懸浮。在一個實施例中，將凍乾之化合多醣及/或凍乾之載體蛋白質再懸浮於有機溶劑中。在一個實施例中，有機溶劑為DMSO。
在一個實施例中，在基於CDT之製造免疫原性結合物之方法中，在使活化血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質化合前，將純化之活化血清型5或8莢膜多醣及載體蛋白質分別凍乾並再懸浮。在一個實施例 中，載體蛋白為CRM197，且在凍乾前相對於NaCI透析過濾CRM197。在一個實施例中，在凍乾前相對於NaCl透析過濾CRM197且將NaCI/CRM之重量比調節至約0.5至約1.5。
本發明之一個實施例提供一種基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法，該結合物包含相結合之金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質，該方法包含如下步驟：a)使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與PDPH及碳化二亞胺在有機溶劑中反應，產生PDPH連接之多醣；b)使PDPH連接之多醣與還原劑反應，產生活化之多醣；c)純化活化之血清型5或8莢膜多醣，產生純化之活化血清型5或8莢膜多醣；d)使載體蛋白質與溴乙酸在有機溶劑中反應，產生活化之載體蛋白質；e)純化活化之載體蛋白質，產生純化之活化載體蛋白質；f)使純化之活化血清型5或8莢膜多醣與純化之活化載體蛋白質反應，產生血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物；及g)水解血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物，移除未反應之活性基團；藉此產生包含金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多醣與載體蛋白質相結合的免疫原性結合物。
在一個實施例中，基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法內所使用之溴乙酸為溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)。在一個實施例中，本發明之基於PDPH之方法內所使用之載體蛋白質為CRM197且BAANS係以約1：0.1至約1：0.5之CRM197：BAANS重量比添加。
在一個實施例中，基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法內的有機溶劑為極性非質子性溶劑。在一個實施例中，有機溶劑為選自由DMSO、DMF、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮及HMPA組成之群的極性非質子性溶劑。在一個實施例中，有機溶劑為DMSO。
在一個實施例中，基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法內所使用之碳化二亞胺為1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺 (EDAC)。在一個實施例中，使血清型5或8莢膜多醣與PDPH及EDAC於有機溶劑中反應之步驟包含維持多醣：PDPH：EDAC之重量比為約1：5：3。
在一個實施例中，基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法內所使用之還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
在一個實施例中，在基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法中，純化活化之血清型5或8莢膜多醣及純化載體蛋白質之步驟各包含透析過濾。
在一個實施例中，基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法內的載體蛋白質為CRM197。在一個實施例中，在製造免疫原性結合物之方法中，活化血清型5或8莢膜多醣與CRM197以約1：1之重量比反應。
在一個實施例中，在基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法中，水解血清型5或8多醣：載體蛋白質結合物以移除未反應之活性基團的步驟包含添加半胱胺鹽酸鹽。
在一個實施例中，純化根據基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法所產生的血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物。在一個實施例中，純化血清型5或8莢膜多醣：載體蛋白質結合物包含透析過濾。
在一個實施例中，在基於PDPH之製造免疫原性結合物之方法中，在使純化之活化血清型5或8莢膜多醣與純化之活化載體蛋白質反應前，將純化之活化多醣及純化之活化載體蛋白質分別凍乾並再懸浮。在一個實施例中，將凍乾之活化多醣及/或凍乾之活化載體蛋白質再懸浮於有機溶劑中。在一個實施例中，有機溶劑為DMSO。
如本文中所使用，「凍乾」意謂脫水過程，其中在冷凍細菌莢膜多醣的同時、在足夠熱存在下降低周圍壓力以允許冷凍之水直接自固相昇華為氣相。可使用此項技術已知之凍乾多醣之任何方法。參看例如Harris及Angal(1989)「Protein Purification Methods」，Kennedy及 Cabral，編「Recovery Processes for Biological Materials」(John Wiley & Sons；1993)；美國專利第4,134,214號；及國際專利申請公開案第WO 2003/086471號；各文獻係以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般。凍乾期間視情況可包括低溫保護劑，諸如蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、山梨醇或甘露醇。
如本文中所使用，「活化」意謂細菌莢膜多醣或載體蛋白以使其易於結合之方式(亦即，必須使至少一個部分能夠共價結合至載體分子)加以修飾。舉例而言，對於本發明之基於CDT之結合方法，多醣係在低水分環境中(例如於DMSO中)活化，形成具有可用羥基之三唑胺基甲酸酯部分及具有羧酸之醯基三唑部分。活化多醣可接著與CRM197蛋白質反應，使CRM197內之離胺酸殘基對三唑進行親核性置換並且形成胺基甲酸酯鍵(針對活性羥基)及醯胺鍵(針對活性羧酸)。相比之下，對於本發明之基於PDPH之結合方法，載體蛋白質與多醣均在結合前活化：1)CRM197之活化包括藉由胺基與溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯之反應將溴乙醯基引入CRM197蛋白質中；及2)多醣之活化包括使多醣中之N-乙醯基胺基甘露醇醛酸之經碳化二亞胺活化之甲酸酯基與巰基反應性醯肼雜二官能性連接劑PDPH之肼基偶合，接著用DTT還原。活化多醣可接著與活化載體蛋白質反應，使得經PDPH硫醇化之多醣之硫醇與活化載體蛋白質之溴乙醯基反應，從而藉由溴置換形成共價硫醚鍵。
根據本發明之方法，可純化莢膜多醣、載體蛋白質及/或多醣-蛋白質結合物。可使用此項技術已知之用於純化多醣或蛋白質之任何方法，諸如濃縮/透析過濾、沈澱/溶離、柱層析及深度過濾。參看例如Farrés等人，(1996)Biotechnol.Tech.10：375-380；Gonçalves等人，Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology(Antonio Mendez Vilas編。第1版.Badajoz, Espanha：Formatex；2007.第450-457頁)；Tanizaki等人，(1996)J.Microbiol.Methods 27：19-23；及美國專利第6,146,902號；及美國專利申請公開案第2008/0286838號；各文獻係以引用的方式併入本文中，如同其全文陳述一般。
如本文中所使用，術語「分離」或「純化」意謂物質自其原始環境中移除(例如，其天然存在時之天然環境，或其為重組實體時自其宿主生物體移除，或自一個環境移至不同環境)。舉例而言，分離之多醣、肽或蛋白質實質上不含該蛋白質所來源之細胞或組織源之細胞物質或其他污染性蛋白質，或者當化學合成或存在於混合物中作為化學反應之一部分時，實質上不含化學前驅物或其他化學物質。在本發明中，蛋白質或多醣可自細菌細胞或細胞碎屑分離，因此其係以適用於製造免疫原性組合物之形式提供。術語「分離」可包括純化，包括例如如本文所述之純化莢膜多醣之方法。用語「實質上不含細胞物質」包括製備多醣/多肽/蛋白質，其中多醣/多肽/蛋白質係自可分離或重組產生其之細胞的細胞組分分離。因而，實質上不含細胞物質或其他化合物之多肽/蛋白質、多醣或結合物包括製備具有小於約30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(以乾重量計)之污染性蛋白質、多醣或其他化合物的多肽/蛋白質、多醣或結合物。當多肽/蛋白質為重組產生時，其較佳亦實質上不含培養基，亦即，培養基表示小於約20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%之蛋白質製劑體積。當多肽/蛋白質或多醣係藉由化學合成產生時，其較佳實質上不含化學前驅物或其他化學物質，亦即，其與涉及蛋白質或多醣之合成之化學前驅物或其他化學物質分離。因此，除了相關多肽/蛋白質或多醣片段以外，該等多肽/蛋白質或多醣製劑亦具有小於約30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%(以乾重量計)之化學前驅物或化合物。
藉由本文所述之任何方法產生的免疫原性結合物均可在水或低 離子強度中性pH緩衝液中儲存，或者凍乾成乾粉末。
誘導免疫反應及防止金黃色葡萄球菌感染的方法
本發明亦包括使用本文所述之免疫原性組合物之方法。舉例而言，本發明之一個實施例提供一種誘導針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的方法，該方法包含向個體投與免疫原性量之本文所述之任何免疫原性組合物。本發明之一個實施例提供一種防止個體感染金黃色葡萄球菌之方法，或一種預防金黃色葡萄球菌感染之方法，或降低至少一種與金黃色葡萄球菌所致之感染相關之症狀的嚴重程度或延遲其發作的方法，該等方法包含向個體投與免疫原性量之本文所述之任何免疫原性組合物。本發明之一個實施例提供一種治療或預防個體之葡萄球菌感染、與葡萄球菌屬相關之疾病或病狀的方法，該方法包含向該個體投與治療或預防有效量之如本文所述之免疫原性組合物的步驟。在一些實施例中，治療或預防葡萄球菌感染、疾病或病狀之方法包含人類、獸醫學、動物或農業處理。另一實施例提供一種治療或預防個體之葡萄球菌感染、與葡萄球菌屬相關之疾病或病狀的方法，該方法包含自本文所述之免疫原性組合物產生多株或單株抗體製劑並使用該抗體製劑賦予個體被動免疫性。本發明之一個實施例提供一種預防經歷外科程序之個體之葡萄球菌感染的方法，該方法包含在外科程序前向該個體投與預防有效量之本文所述之免疫原性組合物的步驟。
對抗原或免疫原性組合物之「免疫反應」為個體對相關抗原或疫苗組合物中所存在之分子產生體液及/或細胞介導之免疫反應。出於本發明之目的，「體液免疫反應」為抗體介導之免疫反應且包括誘導及產生可識別本發明免疫原性組合物中之抗原並依一定親和力與其結合的抗體，而「細胞介導之免疫反應」為由T細胞及/或其他白血球介導之免疫反應。「細胞介導之免疫反應」係由呈現抗原性抗原決定基與I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)分子、CD1或其他非經典 MHC樣分子之結合而引發。由此活化抗原特異性CD4+ T輔助細胞或CD8+細胞毒性T淋巴細胞(「CTL」)。CTL對與經典或非經典MHC所編碼之蛋白質結合且表現於細胞表面上所呈現的肽抗原具有特異性。CTL有助於誘導並促進細胞內微生物之細胞內破壞或使感染該等微生物之細胞溶解。細胞免疫性之另一態樣包括輔助T細胞之抗原特異性反應。輔助T細胞之作用在於輔助刺激非特異性效應細胞的功能且集中其活性，該等效應細胞針對的細胞可在其表面上呈現與經典或非經典MHC分子結合之肽或其他抗原。「細胞介導之免疫反應」亦指產生細胞激素、趨化因子及由活化T細胞及/或其他白血球所產生之其他該等分子，包括來源於CD4+及CD8+ T-細胞之彼等分子。特定抗原或組合物刺激細胞介導之免疫反應的能力可藉由許多分析法測定，諸如淋巴細胞增殖(淋巴細胞活化)分析、CTL細胞毒性細胞分析、藉由分析致敏個體中之抗原特異性T-淋巴細胞，或藉由量測由T細胞回應於抗原再刺激而產生之細胞激素。該等分析法係此項技術中已熟知。參看例如Erickson等人，(1993)J.Immunol.151：4189-4199；及Doe等人，(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376。
如本文中所使用，「處理(treatment)」(包括其變化形式，例如「treat」或「treated」)意謂以下任一者或多者：(i)預防感染或再感染，如傳統疫苗；(ii)降低症狀之嚴重程度或消除症狀；及(iii)實質上或完全消除所述病原體或病症。因此，處理可依預防方式(感染前)或治療方式(感染後)進行。在本發明中，預防性處理為較佳模式。根據本發明之一特定實施例，提供處理(包括預防性及/或治療性免疫)宿主動物防止微生物感染(例如細菌，諸如葡萄球菌)的組合物及方法。本發明之方法適用於賦予個體預防性及/或治療性免疫性。本發明之方法亦可對用於生物醫學研究應用之個體實施。
如本文中所使用，「哺乳動物」意謂人類或非人類動物。更特定 言之，哺乳動物係指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、馴養動物及農畜，以及動物園動物、競技動物及寵物伴侶動物，諸如家養寵物及其他家畜，包括(但不限於)牛、綿羊、雪貂、豬、馬、兔、山羊、狗、貓及其類似物。較佳伴侶動物為狗及貓。哺乳動物較佳為人類。
本文中可互換使用之「免疫原性量」及「免疫有效量」係指抗原或免疫原性組合物足以引發免疫反應(細胞(T-細胞)或體液(B-細胞或抗體)反應或兩者)的量，如藉由熟習此項技術者已知之標準分析所量測。
組合物中特定結合物之量一般係基於總多醣(該結合物之結合多醣及未結合之多醣)計算。舉例而言，在100mcg CP5多醣劑量中，含20%游離多醣之CP5結合物將具有約80mcg結合CP5多醣及約20mcg未結合CP5多醣。計算結合物劑量時，通常不考慮結合物中蛋白質的比例。結合物之量可視葡萄球菌血清型而變。一般而言，各劑量將包含0.1至100mcg多醣，尤其0.1至10mcg多醣，且更尤其1至10mcg多醣。免疫原性組合物中之不同多醣組分之「免疫原性量」可不同，且各自可包含1mcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、9mcg、10mcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg或約100mcg任何特定多醣抗原。
金黃色葡萄球菌「侵襲性疾病」為自正常情況下無菌之部位分離出細菌，在該部位中存在疾病之相關臨床徵象/症狀。正常情況下無菌之身體部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關節/滑液、骨、內部身體部位(淋巴結、腦、心臟、肝、脾、玻璃狀液、腎、胰臟、卵巢)或其他正常情況下無菌之部位。表徵侵襲性疾病之臨床病狀包括菌血症、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內膜炎、敗血性休克及其他病狀。
抗原作為免疫原之效力可藉由增殖分析、藉由細胞溶解分析(諸如量測T細胞溶解其特異標靶細胞之能力的鉻釋放分析)或藉由量測B細胞活性程度(藉由量測血清中對抗原具特異性之循環抗體之含量)加以量測。免疫反應亦可藉由量測投與抗原後所誘導之抗原特異抗體之血清含量來偵測，更特定而言係藉由量測如此誘導之抗體增強特定白血球之調理吞噬細胞能力的能力，如本文所述。免疫反應之保護程度可藉由已投與之抗原攻毒經免疫之宿主來量測。舉例而言，若需要免疫反應所針對之抗原為細菌，則由免疫原性量之抗原所誘導之保護程度係藉由在細菌細胞攻毒動物後偵測存活率百分比或死亡率百分比來量測。在一個實施例中，保護量可藉由量測至少一種與細菌感染相關之症狀(例如與感染相關之發熱)來量測。多抗原或多組分疫苗或免疫原性組合物中各抗原之量將隨各其他組分而變化，且可藉由熟習此項技術者已知之方法測定。該等方法包括用於量測免疫原性及/或活體內效力之程序。在某些實施例中，術語「約」意謂在20%以內，較佳在10%以內，且更佳在5%以內。
本發明進一步提供特異性地且選擇性地結合本發明之血清型5或8莢膜多醣或免疫原性結合物的抗體及抗體組合物。在一些實施例中，向個體投與本發明之血清型5或8莢膜多醣或免疫原性結合物後產生抗體。在一些實施例中，本發明提供針對本發明之一或多種血清型5或8莢膜多醣或免疫原性結合物的純化及分離抗體。在一些實施例中，本發明之抗體具功能性，如在動物效力模型中或經由調理吞噬細胞性殺死分析、依據殺死細菌所量測。在一些實施例中，本發明之抗體賦予個體被動免疫性。使用熟習此項技術者熟知之技術，本發明進一步提供編碼本發明之抗體或抗體片段的聚核苷酸分子，及產生本發明之抗體或抗體組合物的細胞、細胞株(諸如用於重組產生抗體之融合瘤細胞或其他工程改造細胞株)或轉殖基因動物。
本發明之抗體或抗體組合物可用於治療或預防個體之葡萄球菌感染、與葡萄球菌屬相關之疾病或病狀的方法中，該方法包含產生多株或單株抗體製劑並使用該抗體或抗體組合物賦予個體被動免疫性。本發明之抗體亦可用於診斷性方法中，例如偵測CP5、CP8或其結合物之存在或對其含量進行定量。
此項技術中已知之若干動物模型可用於評估本文所述之任一種免疫原性組合物之效力。例如：被動小鼠敗血症模型：小鼠用免疫IgG或單株抗體腹膜內(i.p.)被動免疫。24小時後以致死量之金黃色葡萄球菌攻毒小鼠。靜脈內(i.v.或i.p.)投與細菌攻毒，確保任何存活率均可歸因於抗體與細菌之特異性活體內相互作用。細菌攻毒劑量確定為使未免疫對照小鼠中約20%達成致命性敗血症所需之劑量。可藉由Kaplan-Meier分析對存活率研究進行統計學評估。
主動免疫及攻毒模型：在此模型中，小鼠在第0、3、6週(或熟習此項技術者已知之類似時程)用標靶抗原皮下(s.c.)進行主動免疫，且在第8週(或熟習此項技術者已知之其他類似時程)藉由靜脈內或腹膜內途徑進行攻毒。校準細菌攻毒劑量以在14天之時段內在對照組中達成約20%存活率。可藉由Kaplan-Meier分析對存活率研究進行統計學評估。
被動感染性心內膜炎模型：先前已使用金黃色葡萄球菌所致之感染性心內膜炎(IE)之被動免疫模型顯示ClfA可誘導保護性免疫。參看Vernachio等人，(2006)Antmicro.Agents & Chemo.50：511-518。在此IE模型中，使用兔或大鼠來模擬臨床感染，包括中樞靜脈導管、菌血症及血行性傳播至末梢器官。向以導管植入無菌主動脈瓣贅生物之兔或大鼠投與對標靶抗原具特異性之單株或多株抗體的單次靜脈內注射液。24小時後，用異源葡萄球菌菌株或MRSA菌株靜脈內攻毒動 物。接著，在攻毒48小時後，收集並培養心臟贅生物、腎及血液。接著量測心瓣贅生物、腎及血液中之葡萄球菌感染頻率。在一項研究中，當用MRSE ATCC 35984或MRSA PFESA0003攻毒動物時，使用針對ClfA之多株抗體製劑或單株抗體均顯示感染速率顯著降低。參看Vernachio等人，上文。
被動感染性心內膜炎模型：該感染性心內膜炎模型亦適合主動免疫研究。兔或大鼠用標靶抗原肌肉內(i.m.)免疫，並在兩週後用金黃色葡萄球菌經由靜脈內途徑攻毒。
腎盂腎炎模型：在腎盂腎炎模型中，小鼠在第0、3及6週(熟習此項技術者已知之類似時程)用標靶抗原免疫。在第8週，藉由例如腹膜內注射例如1.7×108cfu金黃色葡萄球菌PFESA0266來攻毒動物。48小時後，收集並培養腎及/或其他組織。最後，對腎及/或其他組織中之攻毒細菌的群落形成單位進行計數。此模型評估在動物中之全身性傳播。
使用調理吞噬細胞性殺死分析監測功能性抗體
此分析使用分化效應細胞，該等細胞來自根據製造商方案使用LYMPHOLYTE®-poly溶液(Cedarlane laboratories limited,Ontario,Canada)自供體人類血液所分離的細胞株(例如HL60)或多形核細胞(PMN)。將效應細胞以約2×107個細胞/毫升之濃度再懸浮於分析緩衝液(含1%牛血清白蛋白之改良伊格爾氏培養基)中並置於37℃培育箱中直至準備使用。金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266在胰蛋白酶大豆瓊脂板上生長隔夜。刮下細菌細胞，洗滌兩次並再懸浮於含5%甘油之分析緩衝液中直至OD600=1，此值等於約5×108cfu/ml之濃度。冷凍細菌懸浮液之1ml等分試樣並儲存於-40℃下直至準備使用。將冷凍之細菌懸浮液解凍且在分析緩衝液中調節至濃度為106cfu/ml，且置於冰上。使用無菌96深孔1ml聚丙烯板進行該分析。製備抗體樣品之兩倍 連續稀釋液(50μl)，接著向抗體混合物中添加300μl分析緩衝液。向分析板中添加細菌(50μl)並在4℃下於旋轉振盪器上置放30分鐘。進行調理步驟，隨後添加50μl人類補體(最終濃度為1%)。最後，向分析板中添加50μl效應細胞(濃度為107個細胞/毫升)，且藉由重複吸移充分混合懸浮液。懸浮液之50μl等分試樣於無菌1%皂苷溶液中進行10倍連續稀釋，經渦旋處理使細菌凝集最小化，並一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。在使用迴轉烤肉架式振盪器連續混合下，在37℃下培育分析板1小時。培育結束時，懸浮液之50μl等分試樣於無菌1%皂苷溶液中進行10倍連續稀釋，藉由渦旋處理進行混合以使細菌凝集最小化，並一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。藉由在60分鐘時測定具有細菌、抗體、補體及效應細胞之孔中的存活cfu數目與缺乏抗體但含有細菌、補體及效應細胞之管內的存活cfu數目之比率來計算殺死百分比。包括含有細菌、補體及血清之對照以調節因凝集所致的任何cfu減少。
補體吸附
針對金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266、PFESA0286及PFESA0270所吸附之人類供者血清在分析中可用作補體來源。金黃色葡萄球菌菌株在37℃下於TSA板上生長隔夜。自分析板刮下細胞並再懸浮於無菌PBS中。細菌細胞在4℃下以10,000rpm離心10分鐘，且將細胞離心塊再懸浮於人類血清中供吸附。血清與細菌一起在4℃下於旋轉振盪器(nutator)上培育30分鐘。對細胞進行離心，血清轉移至含有細菌的另一個管中，且再重複吸附步驟30分鐘。最後，對細胞進行離心，且使血清通過0.2微米過濾器，接著在液氮中冷凍0.5ml等分試樣。
方法II-OPA，使用HL-60細胞
根據S.Romero-Steiner等人，Clin Diagn Lab Immunol 4(4)(1997)，第415-422頁分化HL-60細胞。將所收集之HL-60細胞以約108 個細胞/毫升再懸浮於分析緩衝液(含1%牛血清白蛋白之改良伊格爾氏培養基)中並置於37℃培育箱中直至準備使用。金黃色葡萄球菌菌株在胰蛋白酶大豆瓊脂板上生長隔夜。刮下細菌細胞，洗滌兩次並再懸浮於含5%甘油之分析緩衝液中直至OD600=1，此值等於約5×108cfu/ml。冷凍細菌懸浮液之1ml等分試樣並儲存於-40℃下直至準備使用。將冷凍之細菌懸浮液解凍且在分析緩衝液中調節至濃度為106cfu/ml，且置於冰上。使用無菌96深孔1ml聚丙烯板進行該分析。製備單株抗體樣品之兩倍連續稀釋液(25μl)，接著向抗體懸浮液中添加150μl分析緩衝液。向分析板中添加細菌(25μl)並在4℃下於旋轉振盪器上置放30分鐘，接著添加25μl人類補體(最終濃度為1%)。最後，向分析板中添加25μl HL-60細胞(107個細胞/毫升)，且藉由重複吸移充分混合懸浮液。懸浮液之25μl等分試樣於無菌1%皂苷溶液中進行10倍連續稀釋，藉由渦旋處理進行混合以使細菌凝集最小化，並一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。在使用迴轉烤肉架式振盪器連續混合下，在37℃下培育分析板1小時。培育結束時，懸浮液之25μl等分試樣於無菌1%皂苷溶液中進行10倍連續稀釋，藉由渦旋處理進行混合並一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。藉由在60分鐘時測定具有細菌、抗體、補體及HL-60細胞之孔中的存活cfu數目與缺乏抗體但含有細菌、補體及HL-60細胞之管內的存活cfu數目之比率來計算殺死百分比。包括含有細菌、補體及mAb之對照以調節因凝集所致的任何cfu減少。
以下實例為說明而非為限制所提供。
實例
實例1：製備金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣
在此實例中，描述各種分子大小範圍之金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣之產生。金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣重複單元之結構 示於圖1中。本文所述之方法可有效產生分子量在約20kDa至700kDa範圍內的血清型8莢膜多醣。藉由適當地選擇條件，可分離並純化分子量在50kDa至700kDa範圍內的高分子量血清型8莢膜多醣。為用於免疫原性組合物中，可分離並純化分子量在70kDa至300kDa及許多所要範圍內的血清型8莢膜多醣。基於生長特徵及所產生之莢膜量，使用菌株PFESA0005或PFESA0286產生血清型8莢膜多醣。自菌株PFESA0005或PFESA0286分離之莢膜顯示相同。
為了產生血清型8莢膜多醣，菌株在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、水解大豆粉作為氮源及痕量金屬組成的複合培養基中生長。菌株在生物反應器中生長2至5天。
在熱壓處理前，移除樣品以測試培養物中之葡萄球菌腸毒素B(SEB)之含量。在0.05%聚山梨醇酯80存在下，SEB於醱酵物中之濃度為15-20ng/ml。先前實驗顯示，熱壓處理培養物1小時使SEB含量降低至小於0.1ng/ml，該值低於TECRA套組之偵測極限。
將已透析過濾之經乙醇分離之多醣裝載於Q-瓊脂糖AEC管柱上，且用如上文所述之NaCl線性梯度溶離。藉由O-乙醯基分析及雙向免疫擴散測試(測試血清型5多醣之存在)及磷酸鹽分析(分析磷壁酸(TA)之存在)分析溶離份。在溶離份35至95中偵測到血清型8多醣之存在(圖2A至2B)。
為了減少磷壁酸污染，彙集溶離份35至75且用偏過碘酸鈉氧化任何殘餘磷壁酸以便藉由相對於重蒸水之3K透析過濾將其移除。
藉由依賴於高溫及低pH值來影響莢膜自細胞釋放並降低多醣之分子量的兩種不同方法純化用於製備結合物之血清型8莢膜多醣。所得分子量視水解步驟之時間、溫度及pH值而定。
使用表1中說明之技術表徵血清型8莢膜多醣。
藉由下述方法產生莢膜多醣可得到蛋白質、核酸、肽聚糖及磷壁酸污染物含量低的經充分表徵之純多醣。
在第一種方法中，莢膜多醣自細胞釋放且分子量降低後，用酵素混合液(例如核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、溶菌酶及蛋白酶)處理製劑以消化雜質。培育後，藉由添加乙醇(最終濃度約25%)使殘餘雜質沈澱。移除殘餘乙醇後，將含莢膜多醣之溶液裝載於陰離子交換柱(Q-瓊脂糖)上且用線性鹽梯度溶離。彙集含莢膜多醣之溶離份且用偏過碘酸鈉處理。此處理導致殘餘磷壁酸污染物被氧化水解，但不影響血清型8莢膜多醣。藉由添加乙二醇淬滅反應。濃縮物質並相對於蒸餾水透析過濾，以移除任何殘餘試劑及副產物。
第二種方法用於產生莢膜多醣而無需使用酵素消化各種來源於細胞之雜質。在此方法中，莢膜多醣自細胞釋放且分子量降低後，藉由微濾、隨後超濾及透析過濾使水解的醱酵培養液澄清。用活性碳處理溶液以移除雜質。碳處理後，用偏過碘酸鈉處理物質以氧化殘餘磷壁酸，接著用丙二醇淬滅。濃縮物質並相對於蒸餾水透析過濾，以移除任何殘餘試劑及副產物。
使用任一種方法產生製劑均得到蛋白質、核酸及磷壁酸污染物 含量低的純莢膜多醣。所述方法藉由改變水解條件可用於產生特定範圍之所要高分子量多醣。可藉由本文所述之方法獲得之莢膜多醣的實例示於下表2中。如依據無磷壁酸(TA)、肽聚醣及低殘餘蛋白質所指示，各批純化血清型8莢膜多醣具有高純度。參看表2。低分子量範圍為20.4kDa至65.1kDa，且純化多醣經高度O-乙醯化(約100%)。核酸污染程度低(0.12-2.45%)。
莢膜多醣之分子量選擇：動力學分析顯示，本文所述之方法可產生分子量範圍較寬的莢膜多醣。首先，由細菌細胞產生較大多醣，隨後選擇所要分子量範圍，接著藉由控制加熱及水解步驟之pH值及加熱條件加以純化。
金黃色葡萄球菌醱酵培養液之熱處理為介於醱酵與莢膜多醣回收之間的處理步驟。此處理步驟使用熱將pH值經調節之培養液處理特定時段。在低pH值下熱處理的目標在於殺死細胞、使腸毒素失活、釋放細胞結合多醣及將分子量降至所要大小。在此等目標中，就此步驟中所需之處理時間而言，降低分子量最慢。因此，在所考慮之處理時間內必然達成其他目標。
熱處理：確定用於選擇莢膜多醣之各種分子量範圍的pH值及溫度條件。此等研究使用15L寶樂菲醱酵器(Biolafitte Fermenter)。藉由蠕動泵將醱酵培養液轉移至醱酵器中。使用約200rpm之攪動速度，用濃硫酸調節培養液pH值。接著，使培養液溫度上升至設定值。一 旦溫度達到設定點，即開始熱處理計時。當達到所要處理時間時，將培養液冷卻至室溫。獲取處理中之樣品，分別藉由HPLC及SEC-MALLS系統測定多醣濃度及分子量。分子量(MW)資料用於動力學分析。在pH 3.5、4.0及5.0下隨時間測定MW分佈。參看圖3A。
使用獲自該處理之純化血清型8莢膜多醣、對多醣之弱酸水解進行動力學分析。用硫酸將純化多醣溶液調節至所要pH值供實驗用。將約1.5mL溶液轉移至各15mL離心管中。將離心管置於裝備精密溫度控制系統之油浴中。每隔預定時間取出離心管，並於冰桶中淬滅。實驗結束時，向樣品中添加1M Tris緩衝液之等分試樣(pH 7.5)以便將pH值調回至約7。藉由SEC-MALLS系統分析樣品。MW資料用於動力學分析。在pH 3.5下隨時間測定溫度對CP8之MW分佈的影響。參看圖3B。
結果
如圖3A中所示，較低pH值在降低多醣分子量方面更有效。可使用pH 5、95℃、歷時15分鐘至120分鐘來產生300kDa至600kDa之分子量。同樣，可使用pH 4、95℃、歷時15分鐘至120分鐘來產生250kDa至450kDa之分子量。此外，可使用pH 3.5、95℃、歷時15分鐘至120分鐘來產生120kDa至450kDa之分子量。
如圖3B中所示，隨時間推移，溫度越高，水解速率越快，且所產生之多醣之分子量範圍越寬。在相同pH值下使用較低溫度55℃(相對於95℃)產生較窄多醣分子量範圍。
此外，圖4顯示純化CP8之分子量與弱酸(pH 3.5，95℃)水解處理時間的相關性。純化多醣為獲自先前詳述之回收處理的最終產物。亦如圖4中所示，延長在pH 3.5下熱處理金黃色葡萄球菌PFESA0005菌株的時間可產生分子量較小之CP8，而縮短pH 3.5下之熱處理時間可產生分子量較高之CP8。視在pH 3.5下之熱處理時間長度而定，血清 型8莢膜多醣之分子大小在約80kDa至約220kDa範圍內。如圖4中所示，低pH值下之熱處理時間與純化CP8之分子大小之間的相關性可用於評估產生具有特定分子量範圍之純化多醣所需的處理時間。
重要的是注意到，如上文所示，可產生、釋放並純化20kDa至超過500kDa之整個分子量範圍的血清型8莢膜多醣。因此，該等方法可用於產生具有特定所要高分子量範圍之莢膜多醣，諸如表3中所示。所產生之分子量範圍相對較窄之多醣(其中峰值分子量在87kDa至108kDa範圍內)表示可藉由本文所述之方法獲得的經充分表徵之分子量範圍。尤其有利之高分子量範圍(在70kDa至300kDa或70kDa至150kDa範圍內)的多醣可藉由使莢膜多醣與載體分子或蛋白質結合而用於製造免疫原性組合物(參看表3)。用於產生分子量範圍為約80至120kDa之CP8莢膜多醣的條件如下：95℃，pH 3.5，歷時300分鐘。
實例2：血清型8莢膜與多醣CRM 197 結合
此實例描述用於產生金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣-CRM197結合物之方法及表徵分析。已研發用於使金黃色葡萄球菌血清型8莢 膜多醣與此載體蛋白質結合的不同結合化學法。舉例而言，使用PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)結合可在CP與載體蛋白質之間產生共價硫醚鍵。或者，使用CDI/CDT(1,1-羰基二咪唑/1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)結合可在CP與載體蛋白質之間產生單碳或零碳連接子。
藉由PDPH結合化學法使血清型8莢膜多醣與CRM197結合。
PDPH結合化學法為一種多步驟方法，包括活化多醣、移除硫醇保護基、純化活化之多醣中間物、活化並純化CRM197蛋白質，及使活化組分結合，接著純化。在向多醣中引入含硫醇基之連接子且向CRM197蛋白質載體中引入鹵乙醯基後，使金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣經由硫醚鍵連接至蛋白質載體。藉由胺基與溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯之反應將溴乙醯基引入CRM197蛋白質中。為了產生硫醇化多醣，使多醣中N-乙醯基胺基甘露醇醛酸之經碳化二亞胺活化之甲酸酯基偶合至巰基反應性醯肼雜二官能性連接劑3-(2-吡啶基二硫)-丙醯肼(PDPH)之醯肼基。藉由DTT還原所產生且在Sephadex G25管柱上藉由SEC純化的經PDPH硫醇化之多醣的硫醇與活化蛋白質的溴乙醯基反應，從而藉由溴置換在多醣與載體蛋白質之間形成共價硫醚鍵。未反應之溴乙醯基用半胱胺鹽酸鹽(2-胺基乙硫醇鹽酸鹽)「封端」。接著濃縮反應混合物並透析過濾。殘餘之未結合溴乙醯基用半胱胺鹽酸鹽封端以確保結合後不存在反應性溴乙醯基。由此在溴置換後、在半胱胺之硫醇端與離胺酸殘基上之乙醯基之間形成共價鍵。
1.用PDPH使金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣硫醇化：首先藉由PDPH硫醇化來活化多醣。將多醣與新製備之PDPH儲備溶液(250mg/mL，含於DMSO中)、EDAC儲備溶液(90mg/mL，含於重蒸水中)及MES緩衝儲備溶液(0.5M，pH 4.85)混合，以使得最終溶液含有0.1M MES、及2及4mg/mL多醣，對於血清型8莢膜多醣同時維持1：0.6：1.25之多醣：PDPH：EDAC重量比。在室溫下培育1小時，接著使用 3500 MWCO透析裝置在4℃至8℃下相對於1000倍體積之蒸餾水透析4次以移除未反應之PDPH。用0.2M DTT產生PDPH連接之多醣，且在室溫下培育3小時或在4℃至8℃培育隔夜。使用Sephadex G25樹脂及蒸餾水作為移動相、藉由SEC自活化醣分離過量DTT及反應副產物。藉由DTDP分析分析溶離份之硫醇基，且彙集溶離於管柱之空隙體積附近的硫醇陽性溶離份。藉由PAHBAH及O-乙醯基分析分析所彙集之溶離份以測定活化度，活化度表達為含硫醇基之重複單元的莫耳百分比(硫醇之莫耳濃度/重複單元之莫耳濃度)。凍乾活化多醣並儲存在-25℃下直至需要結合。
藉由PDPH再現血清型8多醣硫醇化之結果示於表4中。血清型8多醣之活化度在12%至16%範圍內，對應於每10個莢膜多醣重複單元連接約1個連接分子至每5個重複單元連接1個連接分子。
2.載體蛋白質活化：獨立地藉由溴乙醯化來活化載體蛋白質。用10mM經磷酸鹽緩衝之0.9% NaCl(pH 7)(PBS)將CRM197稀釋至5mg/mL，接著使用1M儲備溶液、用0.1M NaHCO3達成pH 7.0。使用20mg/mL DMSO之BAANS儲備溶液，以CRM197：BAANS比率1：0.25(w：w)添加溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)。此反應混合物在4℃至8℃培育1小時，接著在Sephadex G-25上使用SEC純化。藉由洛瑞分析分析純化之活化CRM197以測定蛋白質濃度，接著用PBS稀釋至5mg/mL。添加作為低溫保護劑的蔗糖直至5% wt/vol，且冷凍活化 之蛋白質並在-25℃下儲存直至需要結合。
CRM197離胺酸殘基之溴乙醯化極為連貫，從而使可利用之39個離胺酸中之19至25個離胺酸活化(參看表5)。該反應以高產率產生活化蛋白質。
3.偶合反應：活化莢膜多醣及活化載體蛋白質製備後，即使二者在結合反應中化合。將凍乾且硫醇化之多醣溶解於0.16M硼酸鹽(pH 8.95)中，與解凍之溴乙醯化CRM197及蒸餾水混合，以使得最終溶液含有0.1M硼酸鹽、1：1重量比之CRM197：多醣及1mg/mL多醣。在室溫下培育16小時至24小時。藉由使用溶解於0.1M硼酸鹽(pH 8.95)中之135mg/mL半胱胺儲備溶液，以1：2(wt/wt)之CRM197：半胱胺比率添加半胱胺鹽酸鹽來使蛋白質上未反應之溴乙醯基封端，並在室溫下培育4小時。使用100K聚醚碸超濾器、藉由相對於0.9% NaCl進行50倍透析過濾來純化莢膜多醣-CRM197結合物(結合物)。
藉由PDPH再現血清型8莢膜多醣硫醇化之研究結果顯示，多醣之活化度在12%至16%範圍內，對應於每10個多醣重複單元連接約1個連接分子至每5個重複單元連接1個連接分子。
藉由CDI/CDT結合化學法使血清型8莢膜多醣與CRM197結合。
CDI及CDT提供一步結合法，其中多醣在無水環境(DMSO)中活 化，形成具有可用羥基之咪唑或三唑胺基甲酸酯部分及具有羧酸之醯基咪唑或醯基三唑部分。添加蛋白質載體(含於DMSO中)引起離胺酸親核置換咪唑或三唑及形成胺基甲酸酯鍵(針對活性羥基)及醯胺鍵(針對活性羧酸)。
CDI與CDT結合化學法均產生共價連接至載體蛋白質的血清型8莢膜多醣，此係依據以下指示：尺寸排阻層析之溶離份中醣及蛋白質之存在，及對經乙醇醛封端或經半胱胺鹽酸鹽封端之結合物的胺基酸分析。
製備莢膜血清型8多醣分子大小處於20kDa至40kDa範圍內之多批結合物(藉由PDPH與CDI/CDT化學法製備)之結果總結顯示於下表6中。此兩種結合方法所產生之結合物之游離莢膜多醣、多醣-蛋白質比率及產率無顯著差異。所結合之血清型8莢膜多醣的抗原性不會因結合而改變，如結合物與天然多醣之間的一致沈澱素線(identity precipitin line)所示。
如上文所示，本文所述之方法可用於產生具有特定所要高分子量範圍之莢膜多醣。設法自具有預選定高分子量範圍的可經過濾及純化之血清型8莢膜多醣製備結合物以供用於免疫原性組合物中。表7匯總血清型8莢膜多醣結合物之分析，其中血清型8莢膜多醣之分子量在約80kDa至120kDa範圍內，且利用咪唑結合化學法。所得結合物之分子量在595kDa至1708kDa範圍內。每個CRM197中之結合離胺酸數 目在高值9至低值3範圍內。游離莢膜多醣在高值6%至低值2%範圍內。
兩種結合化學法均產生共價連接至載體蛋白質之血清型8莢膜多醣。游離莢膜多醣、血清型8莢膜多醣：蛋白質比率及藉由此兩種方法所產生之結合物之產率不存在顯著差異。
實例3：一步法(One Pot)相較於複雜CDI/CDT法
如上文所述，用於製造本發明之免疫原性結合物的方法包括使用結合化學法使莢膜多醣與載體蛋白質共價結合，結合化學法包括CDI(1,1-羰基二咪唑)、CDT(1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)。使用CDI/CDT在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生單碳或零碳連接子，而使用PDPH在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生共價硫醚鍵。
基於PDPH之方法為一種多步驟方法，包括活化多醣、移除多醣上之硫醇保護基、純化活化之多醣中間物、活化並純化蛋白質載體，及使活化組分結合，接著純化。在此方法中，金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣與PDPH及碳化二亞胺在諸如0.1M MES之水溶液中反應，產生PDPH連接之多醣。PDPH連接之多醣與還原劑反應，產生活化之多醣，接著純化。載體蛋白質在水溶液中與溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯反應，產生活化之載體蛋白質，接著純化。純化之活化血清型8多醣接著與純化之活化載體蛋白質反應，產生血清型8多醣：載體蛋白 質結合物。
相比之下，基於CDI及CDT之方法為一步或兩步結合方法，其中莢膜多醣在無水環境(亦即，DMSO)中活化，形成具有可用羥基之咪唑或三唑胺基甲酸酯部分及具有羧酸之醯基咪唑或醯基三唑部分。添加蛋白質載體(含於DMSO中)引起離胺酸親核置換咪唑或三唑及形成胺基甲酸酯鍵(針對活性羥基)及醯胺鍵(針對活性羧酸)。因此，開發出兩種基於CDI或CDT之方法：較複雜之方法及較簡單之一步法。在較複雜之方法中，金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣與咪唑或三唑化合，凍乾，接著與CDI或CDT在有機溶劑(諸如DMSO)中反應，產生活化之血清型8多醣。純化活化之血清型8多醣，接著與載體蛋白質在有機溶劑中反應，產生血清型8多醣-載體蛋白質結合物。一步法與複雜方法相似，例外之處在於活化之血清型8多醣在與載體蛋白質反應前未經純化。
CDI/CDT複雜法
活化多醣：血清型8多醣與10公克三唑/公克血清型8混合，並凍乾。所得餅塊以2.0毫克血清型8多醣/毫升溶解於DMSO中。測定水含量。添加新製備之CDT儲備溶液(100mg/mL，含於DMSO中)直至達成CDT之莫耳量與水相等。或者，可調節CDT的添加量以達成較高或較低活化度。在23℃下保持30分鐘。
純化活化之血清型8多醣：將經活化之血清型8(ACP8)之溶液傾入25體積水中以除去過量CDT。在10kDa PES薄膜上以約1mg/cm2濃縮至其原始體積，且相對於至少10體積之水透析過濾。此步驟在小於4小時內完成。經透析過濾之物質與10公克三唑/公克原始血清型8多醣混合且凍乾。
製備凍乾之CRM：CRM在10kDa PES薄膜上以恆定體積相對於至少10體積之0.4% NaCl/5%蔗糖透析過濾。測定蛋白質濃度，且添加 足夠的透析過濾緩衝液以使蛋白質濃度達到5.0g/L，從而獲得NaCl/CRM之重量比=0.8。凍乾CRM。
結合：經活化、透析過濾之血清型8多醣以1mg/mL溶解於DMSO中。添加100mM硼酸鹽溶液直至達到2% v/v。
CRM以2mg/mL再懸浮，且當完全溶解時，與ACP8溶液合併。允許在23℃下反應20小時。
將結合物反應液傾入24體積5mM硼酸鹽(pH 9.0)中且在室溫下攪拌1小時。接著用0.5M磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)調節至pH 7.5。經由5微米過濾器過濾，且在300kDa PES薄膜上以約1mg/cm2之負荷濃縮至原始體積，並相對於至少10體積之水透析過濾。所得濃縮物經由0.22微米過濾器過濾，並在2℃至8℃下儲存。
CDI/CDT一步法
CRM197基質交換：透析過濾CRM197以使約10mM磷酸鹽/80mM NaCl/15%蔗糖之整體基質(pH 7)交換成5mM咪唑/0.72% NaCl/15mM辛基-β-D-糖苷(pH 7)。交換可移除不利於結合且會限定運送至結合中之氯化鈉含量的磷酸鹽及蔗糖。添加辛基-β-D-葡萄哌喃糖苷，防止在無菌過濾後形成粒子。
藉由切向流動式過濾、相對於5mM咪唑/0.72%/15mM辛基-B-D-葡萄哌喃糖苷(pH 7)進行CRM197基質之交換(使用10K MWCO PES薄膜，滯留濃度為約4mg/mL，經由10個透析過濾體積倍數)。典型薄膜限量(membrane challenge)為2g/ft2，且基質中之最終目標CRM197濃度為6mg/mL。CRM197在2℃至8℃下儲存。
活化/結合：金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多醣之活化/結合法由以下步驟組成：1)CRM197之基質交換；2)使多醣化合；3)殼式冷凍及凍乾CRM197及化合之多醣；4)溶解凍乾之多醣及CRM197；5)活化多醣；6)使活化之多醣與CRM197結合；及7)純化結合物(稀釋、透析過 濾、無菌過濾)。
多醣與10公克1,2,4-三唑賦形劑/公克多醣化合。賦形劑以粉末形式添加至多醣中，在環境溫度下混合小於15分鐘後獲得溶液。
化合之多醣及CRM197分別使用-75℃乙醇浴液進行殼式冷凍。每1L瓶子之體積為約500mL。
為了溶解多醣，向含有多醣之個別凍乾瓶中添加DMSO，獲得懸浮液，接著轉移至活化/結合反應容器中以便加熱。添加DMSO直至獲得2g/L之濃度。當懸浮液在混合下達到約45℃時，獲得澄清溶液。接著將溶液冷卻至23℃±2℃。
為了溶解CRM197，向含有CRM197之個別凍乾瓶中添加DMSO，獲得懸浮液，接著轉移至第二容器中供混合。添加DMSO直至獲得2g/L之濃度。通常在小於15分鐘內獲得澄清溶液。
對多醣/DMSO溶液取樣供卡-費分析(Karl Fischer analysis)，以測定水分含量。CDT於DMSO中製備成100mg/mL溶液，且基於所測定之水分含量添加。在23℃±2℃下，在混合下連續添加CDT溶液約5分鐘。反應在23℃±2℃下進行最少30分鐘。對反應物取樣以測定活化度(UV 220/205nm)，接著添加100mM硼酸鈉(pH 9)以獲得1.5%水溶液。接著，在23℃±2℃下攪拌反應溶液最少30分鐘。
為了使活化之多醣與CRM197結合，添加DMSO以獲得0.8mg/mL反應濃度。溶解於DMSO中之CRM197接著在混合下添加至活化之多醣溶液中。反應物在23℃±2℃下攪拌最少4小時。
在混合下，反應溶液藉由添加至5mM四硼酸鈉(pH 9)中稀釋10倍，以水解殘餘活性基團。稀釋之溶液通過5μm過濾器並濃縮至2g/L之目標滯留濃度。使用300K再生纖維素膜、經由20個透析過濾體積倍數、對5mM丁二酸鹽(pH 7)進行切向流動式過濾。典型膜負荷為1g/ft2。純化之結合物通過0.22微米過濾器，並在2℃至8℃下儲存。
實例4：使用一步法及複雜結合方法使血清型8莢膜多醣結合
此實例顯示，在一步法或複雜法中可使用具有預選定分子量範圍之莢膜多醣用於結合。首先由細菌細胞產生較大多醣，且純化之所得分子量範圍可藉由實例1之水解過程的pH值及加熱來控制(如表3中所示)。
在此實例中，選擇血清型8莢膜多醣之分子量在約80kDa至約120kDa範圍內的8批料，且使用活化(對於血清型8莢膜多醣使用1,1-羰基-二-(1,2,4-三唑))進行結合。參看表8。所得結合物之分子量在595kDa至1708kDa範圍內。每個CRM中之結合離胺酸數目在高值13至低值3範圍內。游離糖在高值11%至低值1%範圍內。
實例5：評估鼠類菌血症模型中所結合之原生血清型8莢膜多醣及經鹼處理之血清型8莢膜多醣
評估結合之前原生血清型8莢膜多醣上存在之用於誘導功能性抗體反應之O-乙醯基對於莢膜多醣結合物的重要性。血清型8莢膜多醣在弱鹼性條件下脫除O-乙醯基，且NMR與離子層析(IC)均證實血清型8莢膜多醣de-O-Ac-CRM中不存在O-乙醯化。藉由PDPH化學法使de-O-Ac CP8多醣與CRM結合來製備CP8 de-O-Ac-CRM結合物，如實例2 中所述。
血清型8莢膜多醣結合物意外地顯示，藉由IC法未量測到乙醯基。此可歸因於結構、O-乙醯化位點與其他金黃色葡萄球菌莢膜多醣不同，從而又可在結合期間移除或修飾血清型8莢膜多醣中之乙醯基。
鼠類菌血症模型用於評估原生血清型8莢膜多醣相較於經鹼處理之血清型8莢膜多醣與CRM197結合之效力。各組雌性BALB/c小鼠(15隻/組)在第0、3及6週接種1mcg血清型8莢膜多醣de-O-Ac-CRM或1μg血清型8莢膜多醣O-Ac-CRM。疫苗係以22mcg AlPO4調配。用金黃色葡萄球菌PFESA0003攻毒動物，且在3小時後對血液中之細菌進行計數。資料顯示，以未處理原生血清型8莢膜多醣結合物免疫之動物血液中之復原細菌cfu在統計上顯著(p=0.0362)減少，如學生t檢驗所測定(表9)。在以經鹼處理之血清型8莢膜多醣結合物免疫之動物中，血液中之復原細菌cfu與生理食鹽水對照組相似。
實例6：評估鼠類菌血症模型中所結合之原生血清型8莢膜多醣及經鹼處理之血清型8莢膜多醣
評估血清型8莢膜多醣結合物在腎盂腎炎模型中保護小鼠的能力。與以PBS免疫之對照組相比，腹膜內接受金黃色葡萄球菌攻毒之小鼠血液中之細菌計數顯著降低。
進行兩項研究，在用金黃色葡萄球菌PFESA0268(8型)攻毒後，評估CP8-CRM197結合物在上述鼠類菌血症模型中的效力。第一項研究(圖5)顯示菌血症顯著減輕(p=0.0308)。為進行研究，藉由在第0、2及4週皮下注射均以100μg AlPO4調配之1μg血清型8莢膜多醣-CRM197與生理食鹽水對各組6至8週齡瑞士韋伯斯特小鼠(Swiss Webster mice)(n=30)進行主動免疫，且在第6週藉由靜脈內途徑用金黃色葡萄球菌PFESA0268(8型)攻毒。攻毒前實驗係在小鼠於三次接種後達到之年齡進行以便優化攻毒菌株之劑量。藉由Kaplan-Meier分析對存活率研究進行統計學評估。
實例7：以原生及經化學修飾之血清型8莢膜多醣結合物免疫之小鼠之血清的調理活性
使用PFESA0005菌株，自免疫接種研究選擇血清型8莢膜多醣效價高之小鼠血清(n=5)比較調理活性。OPA結果(表10)顯示，僅藉由結合原生血清型8莢膜多醣所製備之結合物在小鼠中產生調理性抗體。值得注意的是，de-OAc血清型8莢膜多醣結合物在小鼠中具免疫原性，但在此分析中所產生之抗體不具調理性。OPA效價報導為在觀測到40%殺死率時之稀釋度的倒數。
實例8：可藉由添加原生血清型8莢膜多醣來抑制血清型8結合物 抗血清殺死金黃色葡萄球菌菌株
為了證實殺死之特異性，在原生血清型8莢膜多醣或無關之肺炎球菌多醣(Pn 14 poly)存在下進行調理吞噬細胞性分析，基本上如上文所述。
結果(表11)顯示，反應混合物中存在原生血清型8莢膜多醣可抑制對金黃色葡萄球菌PFESA0286(8型)進行之調理吞噬細胞性殺死。此等結果證實，免疫血清之調理吞噬細胞性殺死係由莢膜特異性抗體介導。
總結
所有結合化學法均產生共價連接至載體蛋白質CRM197之血清型8莢膜多醣。游離醣、血清型8莢膜多醣：蛋白質比率及藉由此等方法所產生之結合物的產率不存在顯著差異。
實例9：製備金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣
在此實例中，描述各種分子大小範圍之金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣之產生。金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣重複單元之結構 示於圖6中。本文所述之方法可有效地產生分子量在約20kDa至800kDa範圍內之血清型5莢膜多醣。藉由適當地選擇條件，可分離並純化分子量在50kDa至800kDa範圍內的高分子量血清型5莢膜多醣。為用於免疫原性組合物中，可分離並純化分子量在70kDa至300kDa、70kDa至150kDa及許多其他所要範圍內的血清型5莢膜多醣。基於生長特徵及所產生之莢膜量，選擇菌株PFESA0266來產生血清型5莢膜多醣。
為了產生血清型5莢膜多醣，菌株PFESA0266在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、水解大豆粉作為氮源及痕量金屬組成的複合培養基中生長。菌株在生物反應器中生長2至5天。
如上所詳述進行PFESA0266菌株之醱酵。在收集時，培養物之OD600為7.38。將培養物熱壓處理1小時，且在冷卻後，如上文所述處理培養物以便自上清液物質分離細胞。各回收約1L經過濾及濃縮之上清液及細胞。
熱壓處理前，移除樣品以測試培養物中之葡萄球菌腸毒素B(SEB)之含量。在0.05%聚山梨醇酯80存在下，SEB於醱酵物中之濃度為15-20ng/ml。先前實驗顯示，熱壓處理培養物1小時使SEB含量降至小於0.1ng/ml，該值低於TECRA套組之偵測極限。
將已透析過濾之經乙醇分離之多醣裝載於Q-瓊脂糖AEC管柱上，且用如上文所述之NaCl線性梯度溶離。藉由O-乙醯基分析及雙向免疫擴散測試(測試血清型5多醣之存在)及磷酸鹽分析(分析磷壁酸之存在)來分析溶離份。在溶離份60至105中偵測到血清型5多醣之存在(圖7A至7B)。為了減少磷壁酸污染，彙集溶離份60至85且用偏過碘酸鈉氧化任何殘餘磷壁酸以便相對於蒸餾水進行3K透析過濾將其移除。
藉由依賴高溫及低pH值來影響莢膜自細胞釋放並降低多醣分子量的兩種不同方法純化用於製備結合物之血清型5莢膜多醣。所得分 子量視水解步驟之時間、溫度及pH值而定。
使用上文表1中所說明之技術表徵血清型5莢膜多醣。
藉由下文所述之方法產生莢膜多醣可得到蛋白質、核酸、肽聚醣及磷壁酸污染物含量低的純多醣。
在第一種方法中，莢膜多醣自細胞釋放且分子量降低後，用酵素混合液(例如核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、溶菌酶及蛋白酶)處理製劑以消化雜質。培育後，藉由添加乙醇(最終濃度約25%)使殘餘雜質沈澱。移除殘餘乙醇後，將含莢膜多醣之溶液裝載於陰離子交換柱(Q-瓊脂糖)上且用線性鹽梯度溶離。彙集含莢膜多醣之溶離份且用偏過碘酸鈉處理。此處理導致殘餘磷壁酸污染物被氧化水解，但不影響血清型5莢膜多醣。藉由添加乙二醇淬滅反應。濃縮物物並相對於蒸餾水(dH2O)透析過濾，以移除任何殘餘試劑及副產物。
第二種方法用於產生莢膜多醣而無需使用酵素消化各種來源於細胞之雜質。在此方法中，莢膜多醣自細胞釋放且分子量降低後，藉由微濾、隨後超濾及透析過濾使水解的醱酵培養液變澄清。用活性碳處理該溶液以移除雜質。碳處理後，用偏過碘酸鈉處理物質以氧化殘餘磷壁酸，接著用丙二醇淬滅。濃縮物質並相對於蒸餾水透析過濾，以移除任何殘餘試劑及副產物。
使用任一種方法產生製劑均可得到蛋白質、核酸及磷壁酸污染物含量低的純莢膜多醣。所述方法可藉由控制水解條件用於產生具有特定所要高分子量範圍之多醣。
可藉由本文所述之方法獲得之莢膜多醣的實例示於下表12中。如依據無磷壁酸(TA)、肽聚醣及低殘餘蛋白質所指示，各批純化之血清型5莢膜多醣具有高純度。參看表12及13。分子量範圍為132.7kDa至800kDa，且純化之多醣經高度O-乙醯化(在90%至100%範圍內)且經100% N-乙醯化。
血清型5莢膜多醣純化產率為39%至63%，且純化之血清型5多醣之分子大小為35kDa至65kDa不等(參看表12)。磷壁酸(TA)污染程度為可接受的，且殘餘蛋白質及核酸之含量亦在可接受範圍內。血清型5多醣之NMR譜與文獻中所報導者一致。
ND=未偵測出
莢膜多醣之分子量選擇：動力學分析顯示，本文所述之方法可產生分子量範圍較寬的莢膜多醣。首先，由細菌細胞產生較大多醣，隨後選擇所要分子量範圍，接著藉由控制加熱及水解步驟之pH值及加熱條件加以純化。
金黃色葡萄球菌醱酵培養液之熱處理為介於醱酵與莢膜多醣回收之間的處理步驟。此處理步驟使用熱將pH值經調節之培養液處理特定時段。在低pH值下熱處理的目標在於殺死細胞、使腸毒素失 活、釋放細胞結合多醣及將分子量降至所要大小。在此等目標中，就此步驟中所需之處理時間而言，降低分子量最慢。因此，在所考慮之處理時間內必然達成其他目標。
熱處理：確定用於選擇莢膜多醣之各種分子量範圍的pH值及溫度條件。此等研究中使用15L寶樂菲醱酵器。藉由蠕動泵將醱酵培養液轉移至醱酵器中。使用約200rpm之攪動速度，用濃硫酸調節培養液pH值。接著，使培養液溫度上升至設定值。一旦溫度達到設定點，即開始熱處理計時。當達到所要處理時間時，將培養液冷卻至室溫。獲取處理中之樣品，分別藉由HPLC及SEC-MALLS系統測定多醣濃度及分子量。分子量(MW)資料用於動力學分析。在pH 3.5、4.0及5.0下測定隨時間變化之MW分佈，參看圖8A。
使用獲自該處理之純化血清型8莢膜多醣、對多醣之弱酸水解進行動力學分析。用硫酸將純化之多醣溶液調節至所要pH值供實驗用。將約1.5mL溶液轉移至各15mL離心管中。將離心管置於裝備精密溫度控制系統之油浴中。每隔預定的時間取出離心管，並於冰桶中淬滅。在實驗結束時，向樣品中添加1M Tris緩衝液之等分試樣(pH 7.5)以便將pH值調回至約7。藉由SEC-MALLS系統分析樣品。MW資料用於動力學分析。在pH 4.5下測定溫度隨時間對CP5之MW分佈的影響。參看圖8B。
結果
如圖8A中所示，較低pH值在降低多醣分子量方面更有效。在此實例中，可使用pH 5、95℃、歷時15分鐘至120分鐘來產生約300kDa至約600kDa之分子量範圍。參看圖8A。同樣，選擇pH 4.5、95℃、歷時15分鐘至120分鐘可產生200kDa至400kDa之多醣分子量範圍。此外，選擇pH 4.0、95℃、歷時15分鐘至120分鐘可產生120kDa至300kDa之多醣分子量範圍。
如圖8B中所示，隨時間推移，溫度越高，水解速率越快，且所產生之多醣之分子量範圍越寬。以另一種方式表達，在相同pH值下使用較低溫度55℃(相對於95℃)產生較窄多醣分子量範圍。
此外，圖4顯示純化血清型5莢膜多醣之分子量與弱酸(pH 4.5，95℃)水解處理時間的相關性。純化多醣為獲自先前詳述之回收處理的最終產物。亦如圖4中所示，延長在pH 4.5下熱處理金黃色葡萄球菌PFESA0266菌株的時間可產生分子量較小之血清型8莢膜多醣，而縮短pH 4.5下之熱處理時間可產生分子量較高之血清型5莢膜多醣。視在pH 4.5下之熱處理時間長度而定，血清型5莢膜多醣之分子大小在約90kDa至約220kDa範圍內。如圖4中所示，低pH值下之熱處理時間與純化血清型5莢膜多醣之分子大小之間的相關性可用於評估產生具有特定分子量範圍之純化多醣所需的處理時間。
如上文所示，可產生、釋放並純化20kDa至超過500kDa之整個分子量範圍的血清型5莢膜多醣。所述方法可用於產生具有特定所要高分子量範圍之莢膜多醣，諸如表14中所示。所產生之分子量範圍相對較窄之多醣(其中峰值分子量在63kDa至142kDa範圍內)表示可藉由本文所述之方法獲得的經充分表徵之分子量範圍。具有尤其有利之高分子量範圍(在70kDa至300kDa或70kDa至150kDa範圍內)的多醣適用於藉由使莢膜多醣與載體分子或蛋白質結合來製造免疫原性組合物。用於產生分子量範圍為約100至140kDa之CP5莢膜多醣的條件如下：95℃，pH 4.5，歷時135分鐘。然而，pH值、溫度及時間之不同組合亦將產生分子量範圍為約100kDa至140kDa的CP5分子。
ND=未進行
實例10：血清型5莢膜多醣與CRM 197 結合
此實例描述用於產生金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣-CRM197結合物之方法及表徵分析。已研發用於使金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣與此載體蛋白質結合的不同結合化學技術。舉例而言，使用PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)結合可在CP與載體蛋白質之間產生共價硫醚鍵；而使用CDT(1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)結合可在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生單碳或零碳連接子。
藉由PDPH結合化學法使血清型5莢膜多醣與CRM 197 結合
PDPH結合化學法為一種多步驟方法，包括活化多醣、移除硫醇保護基、純化活化之多醣中間物、活化並純化CRM197蛋白質，及使活化組分結合，接著純化。向多醣中引入含硫醇基之連接子並向CRM197蛋白質載體中引入鹵乙醯基後，使金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣經由硫醚鍵連接至蛋白質載體。藉由胺基與溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯之反應將溴乙醯基引入CRM197蛋白質中。為了產生硫醇化 多醣，使多醣中N-乙醯基胺基甘露醇醛酸之經碳化二亞胺活化之甲酸酯基偶合至巰基反應性醯肼雜二官能性連接劑3-(2-吡啶基二硫)-丙醯肼(PDPH)之醯肼基。藉由DTT還原所產生且在Sephadex G25管柱上藉由SEC純化的經PDPH硫醇化之多醣的硫醇與活化蛋白質的溴乙醯基反應，從而藉由溴置換在多醣與載體蛋白質之間形成共價硫醚鍵。未反應之溴乙醯基用半胱胺鹽酸鹽(2-胺基乙硫醇鹽酸鹽)「封端」。接著濃縮反應混合物並透析過濾。殘餘之未結合溴乙醯基用半胱胺鹽酸鹽封端以確保在結合後不存在反應性溴乙醯基。由此在溴置換後、在半胱胺之硫醇端與離胺酸殘基上之乙醯基之間形成共價鍵。
1.用PDPH使金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣硫醇化：首先藉由PDPH硫醇化來活化多醣。將多醣與新製備之PDPH儲備溶液(250mg/mL，含於DMSO中)、EDAC儲備溶液(90mg/mL，含於重蒸水中)及MES緩衝儲備溶液(0.5M，pH 4.85)混合，使得最終溶液含有0.1M MES、及2mg/mL及4mg/mL莢膜多醣，對於血清型8莢膜多醣同時維持1：5：3之多醣：PDPH：EDAC重量比。在室溫下培育1小時，接著使用3500 MWCO透析裝置在4℃至8℃下相對於1000倍體積之蒸餾水透析4次以移除未反應之PDPH。使用0.2M DTT溶液產生PDPH連接之多醣，且在室溫下培育3小時或在4℃至8℃培育隔夜。使用Sephadex G25樹脂及蒸餾水作為移動相、藉由SEC自活化之醣分離過量DTT以及反應副產物。藉由DTDP分析分析溶離份之硫醇基，且彙集溶離於管柱之空隙體積附近的硫醇陽性溶離份。藉由PAHBAH及O-乙醯基分析分析溶離份彙集物以測定活化度，活化度表達為含硫醇基之重複單元的莫耳百分比(硫醇之莫耳濃度/重複單元之莫耳濃度)。凍乾活化之多醣並儲存在-25℃下直至需要結合。
藉由PDPH再現血清型8多醣硫醇化之結果示於表15中。血清型5多醣之活化度在11%至19%範圍內，對應於每10個莢膜多醣重複單元 連接約1個連接分子至每5個重複單元連接1個連接分子。
2.載體蛋白質活化：獨立地藉由溴乙醯化來活化載體蛋白質。用10mM經磷酸鹽緩衝之0.9% NaCl(pH 7)(PBS)將CRM197稀釋至5mg/mL，接著使用1M儲備溶液、用0.1M NaHCO3達成pH 7.0。使用20mg/mL DMSO之BAANS儲備溶液，以CRM197：BAANS比率1：0.25(w：w)添加溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)。此反應混合物在4℃至8℃下培育1小時，接著在Sephadex G-25上使用SEC純化。藉由洛瑞分析分析純化之活化CRM197以測定蛋白質濃度，接著用PBS稀釋至5mg/mL。添加作為低溫保護劑的蔗糖直至5% wt/vol，且冷凍活化之蛋白質並在-25℃下儲存直至需要結合。
CRM197之離胺酸殘基之溴乙醯化極為連貫，從而使可利用之39個離胺酸中之19至25個離胺酸活化(參看表16)。該反應以高產率產生活化之蛋白質。
3.偶合反應：活化之莢膜多醣及活化之載體蛋白質製備後，即使二者在結合反應中化合。經凍乾及硫醇化之多醣溶解於0.16M硼酸鹽(pH 8.95)中，與解凍之溴乙醯化CRM197及蒸餾水混合，使得最終溶液含有0.1M硼酸鹽、1：1重量比之CRM197：多醣及2mg/mL血清型5莢膜多醣。在室溫下培育16小時至24小時。藉由使用溶解於0.1M硼酸鹽(pH 8.95)中之135mg/mL半胱胺儲備溶液，以1：2(wt/wt)之CRM197：半胱胺比率添加半胱胺鹽酸鹽來使蛋白質上未反應之溴乙醯基封端，並在室溫下培育4小時。使用100K聚醚碸超濾器、藉由相對於0.9% NaCl進行50倍透析過濾來純化莢膜多醣-CRM197結合物(結合物)。
藉由PDPH再現血清型5莢膜多醣硫醇化的研究結果顯示，活化度在11%至19%範圍內，對應於每10個CP重複單元連接約1個連接分子至每5個重複單元連接1個連接分子。
藉由CDT結合化學法使血清型5莢膜多醣與CRM 197 結合
CDT提供一步結合法，其中多醣在無水環境(DMSO)中活化，形成具有可用羥基之三唑胺基甲酸酯部分及具有羧酸之醯基咪唑或醯基三唑部分。添加蛋白質載體(含於DMSO中)引起離胺酸親核置換三唑及形成胺基甲酸酯鍵(針對活性羥基)及醯胺鍵(針對活性羧酸)。反應溶液在水溶液中稀釋10倍，為藉由切向流動式過濾純化作準備。
CDT結合化學法產生共價連接至載體蛋白質的血清型5莢膜多醣，此依據以下指示：尺寸排阻層析之溶離份中醣及蛋白質之存在以及對經乙醇醛封端或經半胱胺鹽酸鹽封端之結合物的胺基酸分析。
製備血清型5莢膜多醣分子大小處於20kDa至40kDa範圍內之多批結合物(藉由PDPH與CDT化學法製備)之結果總結顯示於下表17中。此等結合化學法所產生之結合物之游離莢膜多醣、多醣：蛋白質比率及產率無顯著差異。所結合之血清型5莢膜多醣的抗原性不會因結合而改變，如結合物與原生多醣之間的一致沈澱素線所示。
ND=未偵測出
如上文所示，本文所述之方法可用於產生具有特定所要高分子量範圍之莢膜多醣。設法自具有預選定高分子量範圍的可經過濾及純化之血清型5莢膜多醣製備結合物以供用於免疫原性組合物中。表18匯總血清型5莢膜多醣結合物之分析，其中血清型5莢膜多醣之分子量在約92kDa至約119kDa範圍內，且用三唑活化(CDT)。所得結合物之分子量在1533kDa至2656kDa範圍內。每個CRM197中之結合離胺酸數目在高值22至低值15範圍內。游離莢膜多醣在高值18%至低值11%範圍內。
兩種結合化學法均產生共價連接至載體蛋白質之血清型5莢膜多醣。此兩種方法所產生之結合物之游離莢膜多醣、血清型5莢膜多醣：蛋白質比率及產率不存在顯著差異。
實例11：複雜法相較於一步CDT法
如上文所述，用於製造本發明之免疫原性結合物的方法包括使用結合化學法使莢膜多醣與載體蛋白質共價結合，結合化學法包括CDT(1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)。使用CDT在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生單碳或零碳連接子，而使用PDPH在莢膜多醣與載體蛋白質之間產生含有共價硫醚鍵的五碳連接子。
基於PDPH之方法為一種多步驟方法，包括活化多醣、移除多醣上之硫醇保護基、純化活化之多醣中間物、活化並純化蛋白質載體，及使活化組分結合，接著純化。在此方法中，金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣與PDPH及碳化二亞胺在諸如DMSO之有機溶劑中反應，產生PDPH連接之多醣。PDPH連接之多醣與還原劑反應，產生活化之多醣，接著純化。載體蛋白質在有機溶劑中與溴乙酸反應，產生活化之載體蛋白質，接著純化。純化之活化血清型5多醣接著與純化之活化載體蛋白質反應，產生血清型5多醣：載體蛋白質結合物。
相比之下，基於CDT之方法為一步結合方法，其中莢膜多醣在無水環境(亦即DMSO)中活化，形成具有可用羥基之三唑胺基甲酸酯部分及具有羧酸之醯基咪唑或醯基三唑部分。添加蛋白質載體(含於DMSO中)引起離胺酸親核置換咪唑或三唑及形成胺基甲酸酯鍵(針對活性羥基)及醯胺鍵(針對活性羧酸)，從而允許結合以「一步」形式進行。因此，開發出兩種基於CDT之方法：較複雜之方法及較簡單之一步法。在較複雜之方法中，金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣與咪唑或三唑化合，接著與CDT在有機溶劑(諸如DMSO)及約0.2% w/v水中反應，產生活化之血清型5多醣。純化活化之血清型5多醣，接著與載體蛋白質在有機溶劑中反應，產生血清型5多醣：載體蛋白質結合物。一步法與複雜法相似，例外之處在於活化之血清型5多醣在與載體蛋白質反應前未經純化。
CDT複雜法
活化血清型5莢膜多醣：血清型5莢膜多醣與10公克三唑/公克血清型5莢膜多醣混合並凍乾。所得餅塊以每毫升2.0毫克血清型5莢膜多醣溶解於DMSO中。測定水含量並調節至0.2%。添加新製備之CDT儲備溶液(100mg/mL，含於DMSO中)直至達成CDT之量20倍莫耳過量於CP5之量。或者，可調節CDT的添加量以達成較高或較低活化度。在23℃下保持30分鐘。
純化活化之血清型5莢膜多醣：將活化之血清型5莢膜多醣(ACP5)之溶液傾入25體積水中以除去過量CDT。在10kDa PES薄膜上以約1mg/cm2濃縮至其原始體積，且相對於至少10體積之水透析過濾。此步驟在小於4小時內完成。經透析過濾之物質與10公克三唑/公克原始血清型5多醣混合且凍乾。
製備凍乾之CRM：CRM在10kDa PES薄膜上以恆定體積相對於至少10體積之0.4% NaCl/5%蔗糖透析過濾。測定蛋白質濃度，且添加足夠的透析過濾緩衝液以使蛋白質濃度達到5.0g/L，從而獲得NaCl/CRM之重量比=0.8。凍乾CRM。
結合：活化、透析過濾之血清型5莢膜多醣以1mg/mL溶解於DMSO中。添加100mM硼酸鹽溶液直至達到2% v/v。
CRM以2mg/mL再懸浮，且當完全溶解時，與ACP5溶液合併。允許在4℃下反應20小時。
將結合物反應液傾入24體積之5mM硼酸鹽(pH 9.0)中且在室溫下攪拌1小時。接著用0.5M磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)調節至pH 7.5。經由5微米過濾器過濾，且在300kDa PES薄膜上以約1mg/cm2之負荷濃縮至原始體積，並相對於至少10體積之水透析過濾。所得濃縮物經由0.22微米過濾器過濾，並在2℃至8℃下儲存。
CDT一步法
CRM197基質交換：透析過濾CRM197以便將約10mM磷酸鹽/80mM NaCl/15%蔗糖之整體基質(pH 7)交換成5mM咪唑/0.72% NaCl/15mM辛基-β-D-葡萄哌喃糖苷(pH 7)。交換可移除不利於結合且會限定運送至結合中之氯化鈉含量的磷酸鹽及蔗糖。添加辛基-β-D-葡萄哌喃糖苷，防止在無菌過濾後形成粒子。
藉由切向流動式過濾、相對於5mM咪唑/0.72% NaCl/15mM辛基-β-D-葡萄哌喃糖苷(pH 7)進行CRM197基質之交換(經由10個透析過濾體積倍數，使用10K MWCO PES薄膜，滯留濃度為約4mg/mL，)。典型薄膜限量為2g/ft2，且基質中之最終目標CRM197濃度為6mg/mL。CRM197在2℃至8℃下儲存。
活化/結合：金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多醣之活化/結合法由以下步驟組成：1)使多醣化合；2)殼式冷凍及凍乾CRM197及所化合之多醣；；3)溶解凍乾之多醣及CRM197；4)活化多醣；5)使活化之多醣與CRM197結合；及6)純化結合物(稀釋、透析過濾、無菌過濾)。
多醣與10公克1,2,4-三唑賦形劑/公克多醣化合。賦形劑以粉末形式添加至多醣中，在環境溫度下混合小於15分鐘後獲得溶液。
所化合之多醣及CRM197分別使用-75℃乙醇浴進行殼式冷凍。每1L瓶子之體積為約500mL。
為了溶解多醣，向多醣之個別凍乾瓶中添加DMSO，獲得懸浮液，接著轉移至活化/結合反應容器中以便加熱。添加DMSO直至獲得2g/L之濃度。混合5至10分鐘後獲得澄清溶液。
為了溶解CRM197，向含有CRM197之個別凍乾瓶中添加DMSO，獲得懸浮液，接著轉移至第二容器中供混合。添加DMSO直至獲得2g/L之濃度。通常在小於15分鐘內獲得澄清溶液。
對多醣/DMSO溶液取樣供卡-費分析，以測定水分含量。CDT於DMSO中製備成100mg/mL溶液且以5莫耳過量於5型多醣添加(複雜法 使用20莫耳當量CDT，而一步法使用5莫耳當量CDT：CP5)。在23℃+2℃下，在混合下，歷經約5分鐘連續添加CDT溶液。反應物在23℃±2℃進行最少30分鐘。對反應物取樣以測定活化度(UV 220/205nm)，接著添加100mM硼酸鈉(pH 9)以獲得1.5%水溶液。接著，在23℃+2℃下攪拌反應溶液最少30分鐘。
為了使活化之多醣與CRM197結合，添加DMSO以獲得0.55mg/mL反應濃度。溶解於DMSO中之CRM197接著在混合下添加至活化之多醣溶液中。在23℃+2℃下攪拌反應最少16小時。
反應溶液用5mM四硼酸鈉(pH 8.6)稀釋10倍，獲得最終之稀釋溶液(pH 9±0.2)。在23℃±2℃下攪拌該溶液最少4小時。使稀釋溶液通過5μm過濾器並濃縮至2g/L之目標滯留濃度。使用5mM丁二酸鹽(pH 7)、經由20個透析過濾體積倍數、使用300K再生纖維素薄膜進行切向流動式過濾。典型薄膜限量為1g/ft2。使純化之結合物通過0.22微米過濾器，並在2℃至8℃下儲存。
實例12：使用一步法及複雜結合法使血清型5莢膜多醣結合
此實例顯示，在一步法或複雜法中可使用具有預選定分子量範圍之莢膜多醣結合。首先由細菌細胞產生較大多醣，且可藉由實例9之水解過程的pH值及加熱來控制所得分子量範圍。在此實例中，選擇血清型5莢膜多醣之分子量在約90kDa至約140kDa範圍內的8批料，且在上述一步法或複雜法中使用三唑(CDT)活化進行結合。參看表19。所得結合物之分子量在1125kDa至2656kDa範圍內。每個CRM中之結合離胺酸數目在高值22至低值15範圍內。游離糖在高值23%至低值11%範圍內。
實例13：血清型5莢膜多醣結合物在鼠類腎盂腎炎模型中持續展現保護作用
評估血清型5莢膜多醣結合物在腎盂腎炎模型中保護小鼠的能力。與以PBS免疫之對照組相比，腹膜內接受金黃色葡萄球菌攻毒之小鼠血液中之細菌計數顯著降低。
所有6項個別研究均顯示，免疫動物之腎的cfu/ml顯著減少(圖9)。當彙集此等研究供進行後設分析(meta analysis)時，該等研究之總體顯著性總體上增加至低於0.0001。資料顯示，用莢膜多醣結合物主動接種後，腎菌落形成持續減少。
實例14：藉由不同結合化學法製備之血清型5莢膜多醣結合物保護小鼠不受實驗感染
用藉由PDPH或CDT化學法所製備之血清型5莢膜多醣結合物在鼠類腎盂腎炎模型中進行主動免疫研究。使莢膜多醣與CRM197結合之方法描述於上文中。結果顯示，相較於假免疫動物，兩種結合物均減少小鼠中之群落形成(表20)。
表20：PDPH相較於CDT結合對在腎盂腎炎模型中防止金黃色葡萄球菌攻毒的影響。
實例15：血清型5莢膜多醣結合物之主動免疫在大鼠心內膜炎模型中保護大鼠
用CP5-CRM197 PDPH結合物進行4項研究。用金黃色葡萄球菌PFESA0266攻毒後，在三分之二實驗中，血清型5莢膜多醣結合物使心臟與腎中之復原CFU顯著減少(表21)。在第三項研究中，抗CP5效價之幾何平均效價(GMT)在三項實驗中最低，但僅略低於先前實驗。
實例16：HMW CP5結合物疫苗在小鼠中之免疫原性強於LMW CP5結合物疫苗
進行鼠類腎盂腎炎研究以評估不同CP5結合物調配物之免疫原性及效力。測試兩種調配物：第一種調配物由高分子量(HMW)CP5(約300kD)與CRM197相結合而構成。第二種調配物含有相結合之低分子量(LMW)CP5(約25kD)與CRM197。測試HMW疫苗的3種劑量濃度(1、0.1及0.01mcg)。LMW疫苗以1mcg進行測試。亦包括由多醣結合物疫苗構成之陰性對照組，該疫苗來源於肺炎鏈球菌與CRM197(PP5)之結合物。在第0、3及6週用22mcg AlPO4調配多醣，且在第8週用金黃色葡萄球菌PFESA0266攻毒。在攻毒後48小時收集腎並對細菌群落進行計數。兩種疫苗均可有效地產生免疫反應，且在1μg HMW與LMW疫苗處理組之小鼠的腎中觀測到金黃色葡萄球菌PFESA0266之CFU減少。此減少具劑量依賴性，如依據效力隨疫苗劑量降低而降低所示(圖10)。對於偵測HMW及LMW疫苗之效力差異而言，CFU讀數不夠敏感。因此，藉由OPA測試小鼠血清。OPA效價定義為在OPA分析中殺死40%金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266所需之血清稀釋度。可見HMW疫苗之OPA效價高於LMW調配物(圖11)。
實例17：包含高分子量多醣之莢膜多醣結合物顯示強於包含低分子量多醣之結合物的免疫原性
對非人類靈長類動物(NHP)進行研究以評估不同莢膜結合物調配物之免疫原性。以兩種不同劑量濃度(2μg及20μg)測試兩種調配物。第一種調配物含有相結合之高分子量(HMW)多醣(約130kD)與CRM197。第二種調配物含有相結合之低分子量(LMW)多醣(約25kD)與CRM197。各組5隻靈長類動物以單次劑量之任一種疫苗接種，且在接種前及接種後兩週監測免疫效價。OPA效價定義為在OPA分析中殺死40%金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266所需之血清稀釋度。亦藉由ELISA監測抗體效價。可見HMW疫苗之活性強於LMW調配物(表22)，如依據HMW疫苗之抗體效價為LMW疫苗之10倍所證明。接受 HMW疫苗之NHP的OPA反應率亦更高(80%相較於40%)。
實例18：多醣O-乙醯化對於誘導針對血清型5莢膜多醣結合物之保護性抗體反應具重要意義
為了評估血清型5莢膜多醣之O-乙醯化的重要性，脫除原生莢膜多醣之O-乙醯基(dOAc)並使用上文所論述之PDPH結合化學法結合至CRM197(dOAc-CRM197)。並列比較dOAcCP-CRM197與CP5-CRM197在鼠類腎盂腎炎模型中之效力。
用缺乏O-乙醯基之結合物(dOAc CP5-CRM)免疫未能減少腎中之復原細菌CFU。此等資料(表23)表明，O-乙醯化對於誘導針對CP5之功能性抗體具重要意義。
實例19：使用具有已知特異性之單株抗體藉由OPA證實O-乙醯化作為血清型5莢膜多醣之功能性抗原決定基的重要性
評估對OAc+(CP5-7-1)、OAc+/-(CP5-5-1)及OAc-(CP5-6-1)具特異性之血清型5莢膜多醣單株抗體針對5型菌株PFESA0266之OP殺死活性(表24)。針對血清型8莢膜多醣之單株抗體(對CP8 OAc+具特異性之CP8-3-1)用作陰性對照物。
OAc特異性抗CP5 mAb CP5-7-1介導金黃色葡萄球菌PFESA0266之殺死(表24)。又，可識別CP5 OAc+及CP5 OAc-共用之抗原決定基的單株抗體CP5-5-1介導PFESA0266菌株之殺死。對血清型5 OAc-莢膜多醣上所存在之抗原決定基具特異性的單株抗體不介導PFESA0266菌株之殺死。此等結果表明，血清型5莢膜多醣上之O-乙醯基抗原決定基為誘發血清型5特異性抗體之功能性活性所必需。
抗體需要具有功能性，如在證明抗體殺死細菌之動物效力模型或調理吞噬細胞性殺死分析中依據殺死細胞所量測。功能性殺死作用可不單獨使用監測抗體產生之分析證明，此種分析不能表明O-乙醯化在效力方面的重要性。
實例20：由高分子量多醣構成之CP5結合物在非人類靈長類動物 (NHP)中的免疫原性經觀測強於低分子量多醣
對非人類靈長類動物(NHP)進行研究以評估不同莢膜結合物調配物之免疫原性。以兩種不同劑量濃度(2μg及20μg)測試兩種調配物。第一種調配物由高分子量(HMW)多醣(約130kD)與CRM197相結合而構成。第二種調配物含有相結合之低分子量(LMW)多醣(約25kD)與CRM197。各組5隻靈長類動物以單次劑量之任一種疫苗接種，且在接種前及接種後兩週監測免疫效價。OPA效價定義為在OPA分析中殺死40%金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266所需之血清稀釋度。亦藉由ELISA監測抗體效價。可見HMW疫苗之活性強於LMW調配物(表25)。HMW疫苗之抗體效價為LMW疫苗的3至10倍。接受HMW疫苗之NHP的OPA反應率亦更高(80%相較於40%)。
總結
本文所述之兩種結合化學法均產生共價連接至載體蛋白質CRM197之血清型5莢膜多醣。此兩種方法所產生之結合物之游離醣、血清型5多醣：蛋白質比率及產率不存在顯著差異。
本說明書中提及之所有公開案及專利申請案表明熟習本發明所屬技術者之水準。所有公開案及專利申請案均以引用的方式併入本文中，引用的程度如同特定地且個別地指明各個別公開案或專利申請案 以引用的方式併入本文中一般。
雖然上述本發明為清楚理解之目的已藉由說明及實例加以詳述，但在隨附申請專利範圍之範疇內仍可進行某些變化及改進。

Claims (53)

  1. 一種製造免疫原性多醣-蛋白質結合物的方法，包括如下步驟：a)使金黃色葡萄球菌多醣與3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼(PDPH)及碳化二亞胺於有機溶劑中反應，產生PDPH連接之多醣；b)使PDPH連接之多醣與還原劑反應，產生活化之硫醇化多醣；c)分離該活化之硫醇化多醣，產生分離之活化之硫醇化多醣；d)提供活化之載體蛋白質；e)使該分離之活化之硫醇化多醣與該活化之載體蛋白質反應，產生多醣-載體蛋白質結合物；及f)分離該多醣-載體蛋白質結合物。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟c)進一步包括凍乾該分離之活化之硫醇化多醣，產生凍乾之活化多醣。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該有機溶劑為極性非質子性溶劑。
  4. 如請求項3之方法，其中該極性非質子性溶劑係選自由二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮及六甲基磷醯胺(HMPA)組成之群。
  5. 如請求項4之方法，其中該極性非質子性溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該碳化二亞胺為1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺(EDAC)。
  7. 如請求項6之方法，其中該使血清型莢膜多醣與PDPH及EDAC於有機溶劑中反應之步驟包括維持約1：5：3之多醣：PDPH：EDAC重量比。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
  9. 如請求項1或2之方法，其中該載體蛋白質之活化包括使載體蛋白質與溴乙酸反應。
  10. 如請求項9之方法，其中該溴乙酸包含溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)。
  11. 如請求項1或2之方法，其中該方法進一步包括水解多醣-載體蛋白質結合物以移除未反應之活性基團的步驟。
  12. 如請求項11之方法，其中該水解步驟包括添加半胱胺鹽酸鹽。
  13. 如請求項1或2之方法，其中分離該多醣-載體蛋白質結合物之步驟包括透析過濾。
  14. 如請求項1或2之方法，其中該載體蛋白質為CRM197或肺炎球菌溶血素。
  15. 如請求項14之方法，其中CRM197經由硫醚鍵共價連接至該多醣。
  16. 如請求項14之方法，其中該活化之硫醇化多醣與CRM197依約1：1之重量比反應。
  17. 如請求項1或2之方法，其中莢膜多醣為血清型5或血清型8莢膜多醣。
  18. 如請求項1或2之方法，其中該莢膜多醣之O-乙醯化度為10%至100%。
  19. 如請求項1或2之方法，其中該莢膜多醣之O-乙醯化度為50%至100%。
  20. 如請求項1或2之方法，其中該莢膜多醣之O-乙醯化度為75%至100%。
  21. 如請求項1或2之方法，其中該多醣的分子為70kDa至300kDa。
  22. 如請求項1或2之方法，其中該多醣的分子為70kDa至150kDa。
  23. 如請求項1或2之方法，其中該結合物的分子為約500kDa至約 3000kDa。
  24. 如請求項1或2之方法，其中該結合物的分子為約500kDa至約2500kDa。
  25. 如請求項1或2之方法，其中該結合物的分子為約1600kDa至約3000kDa。
  26. 如請求項1或2之方法，其中該結合物的分子為約1300kDa至約2600kDa。
  27. 一種免疫原性多醣-蛋白質結合物，其包含與載體蛋白質結合之分離之金黃色葡萄球菌莢膜多醣，其中該多醣之分子量為70kDa至300kDa，其中該結合物之分子量為約500kDa至約3000kDa，且其中該結合物在該莢膜多醣與該載體蛋白質之間包含共價硫醚鍵。
  28. 如請求項27之免疫原性結合物，其中該載體蛋白質為CRM197或肺炎球菌溶血素。
  29. 如請求項28之免疫原性結合物，其中在該多醣之至少每5至10個醣重複單元中存在至少一個介於CRM197與多醣之間的共價鍵。
  30. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中在該多醣之至少每5個醣重複單元中存在至少一個介於CRM197與多醣之間的共價鍵。
  31. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該CRM197包含5至25個共價連接至該多醣的離胺酸。
  32. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該CRM197包含5至15個共價連接至該多醣的離胺酸。
  33. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該CRM197包含18至22個共價連接至該多醣的離胺酸。
  34. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該多醣的分子為70kDa至150kDa。
  35. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該結合物的分子為約500kDa至約2500kDa。
  36. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該結合物的分子為約1600kDa至約3000kDa。
  37. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該結合物的分子為約1300kDa至約2600kDa。
  38. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中莢膜多醣為血清型5或血清型8莢膜多醣。
  39. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該莢膜多醣之O-乙醯化度為10%至100%。
  40. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該莢膜多醣之O-乙醯化度為50%至100%。
  41. 如請求項28或29之免疫原性結合物，其中該莢膜多醣之O-乙醯化度為75%至100%。
  42. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項28至41中任一項之免疫原性結合物及至少一種佐劑、稀釋劑或載劑。
  43. 如請求項42之免疫原性組合物，其中該佐劑為基於鋁之佐劑。
  44. 如請求項43之免疫原性組合物，其中該基於鋁之佐劑係選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群。
  45. 如請求項44之免疫原性組合物，其中該佐劑為磷酸鋁。
  46. 如請求項42至45中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含一或多種額外抗原。
  47. 如請求項46之免疫原性組合物，其中該一或多種額外抗原係來自金黃色葡萄球菌之蛋白質。
  48. 如請求項47之免疫原性組合物，其中該蛋白質抗原係選自於由以下組成之群：ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE MntC/SitC/唾 液結合蛋白、IsdB、IsdA、Opp3a、DltA、HtsA、LtaS、SdrH、SrtA、SpA、SBI、α-溶血素(hla)、β-溶血素、纖維結合蛋白結合蛋白A(fnbA)、凝固酶、map、Panton-Valentine殺白血球素(pvl)、γ毒素(hlg)、ica、免疫顯性ABC轉運體、RAP、自溶素、層黏連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、SasF、SasH、EFB(FIB)、FnbB、Npase、EBP、骨涎結合蛋白II、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶(aureolysin)前驅體(AUR)/Sepp1、Cna、TSST-1、mecA、dPNAG、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2 HBP、玻璃連結蛋白結合蛋白、HarA、腸毒素A、腸毒素B、腸毒素C1及新穎自溶素。
  49. 如請求項48之免疫原性組合物，其中該蛋白質抗原為ClfA。
  50. 如請求項48之免疫原性組合物，其中該蛋白質抗原為MntC。
  51. 一種如請求項42至50中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製備誘導個體對抗金黃色葡萄球菌之免疫反應。
  52. 一種如請求項42至50中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製備減輕或預防個體之葡萄球菌感染、與葡萄球菌相關之疾病或病狀的藥物。
  53. 如請求項52之用途，其中該感染、疾病或病狀係選自由侵襲性金黃色葡萄球菌疾病、敗血症及帶原者組成之群。
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