CZ327897A3 - Imunogenní a imunostimulační oligosacharidové kompozice, způsoby jejich přípravy a použití - Google Patents

Description

Popis výše uvedených publikací, patentů a patentových přihlášek je zde začleněn literárním odkazem ve svém celku ve stejném rozsahu, jako kdyby formulace každé jednotlivé publikace, patentu a patentové přihlášky byly zde zahrnuty výslovně a jednotlivé.

Dosavadní stav techniky

Imunologické odpovědi na polysacharidy- >

Heidelberger a Avery (1923) dokázali, že typově specifické antigeny pneumokoků jsou polysacharidy.Bakteriální kapsulární polysacharidy jsou.antigeny buněčného povrchu, složené z identických opakujících se .jednotek,

Jcteré tvoří prodloužené sacharidové řetězce. Polysacharidové struktury jsou přítomny na patogenních bakteriích a byly identifikovány na druzích Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus skupiny A, a. skupiny B, Streptococcus pneumoniae a dalších druzích (Kenne a Lindberg, 1983).

Specifické determinanty krevních skupin a nádorové doprovodné (tumor associated) antigeny jsou příklady karbohydrátů (tímto výrazem se zde budou označovat příslušné cukry) povrchu savčích buněk. Onkogenicky transformované buňky často mají povrchové karbohydráty zřetelně odlišné od povrchových karbohydrátů netransformovaných buněk. Tyto glykany sestávají pouze z několika monosacharidů (Hakomori a Kannagi, 1986). Glykanové struktury samy o sobě jsou obvykle neantigenní, ale vytvářejí hapteny v konjunkci s proteinovými nebo glykoproteinovými matricemi.

Všeobecným rysem sacharidových antigenů je jejich neschopnost .vyvolat signifikantní hladiny protilátek tříd . IgG (IgG isotopů) nebo parnětoyériodpovédi . ..Předpokládá ‘ se, že jde o antigeny nezávislé· na .brzlíku ,(thymus independentní · -TI). Konjunkce polysacharidových.,antigenůvnébo. imunologicky inertních karbohydrátoyýchihaptenů k antigenůmszávislým na brzliku (thymus _;.dependentním -· TD) , .jakp^například , _ř , k proteinům, zvyšuje jejich imunogenicitu. Protein stimuluje přenašeč - specifické T,_-.-pomocné.-k>uňky, které.hrají .úlohu_: ·· *

v indukci syntézy antikarbohydrátových protilátek (Bixler a Pillai, 1989 ) .

Mnoho z naší současné znalosti o TI a TD odpovědích pochází ze studií, které se vztahují k myším modelům (Stein a kol. 1983, Stein 1992, Stein 1994). TI antigeny všeobecně -vy-vo-l-á-vag-í—n-í-z-kou—af-in±tu^—protxlátek“omezené^-^třídy a neprodukují imunologickou paměť. Adjuvans mají malý vliv na odpověd’ na TI antigeny. Na rozdíl od nich, TD antigeny vyvolávají heterogenní a vysokou afinitu protilátek s imunizací a produkují imunologickou paměť. Adjuvans zvyšují odpověď na TD antigeny. Sekundární reakce na TD antigeny ukazují zvýšení poměru IgG ku IgM, zatímco pro TI antigeny sekundární reakce poměru IgG ku IgM je 1:1, podobně jako je tomu u primární reakce (Stein a kol. 1982, Stein 1992, Stein 1994). U myší a lidí TD antigeny vyvolávají predominantně IgG-^ isotopy a dále také určité množství isotopů IgG2 a IgG₃ . TI odpovědi na polysacharidy jsou omezeny na IgG₃ z IgG isotopů (Perlmutter a kol., 1978, Slack a kol., 1980).

Současné pneumokokové vakcíny

Pneumokoky jsou v současné době rozděleni do 84 sérotypů, založených na jejich kapsulárních polysacharidech. Ačkoliv s geografickou polohou existuje určitá variabilita běžně se vyskytujících sérotypů, všeobecné sérotypy 1, 3, 4, 7, 8, a 12 více převládají u dospělé populace. Sérotypy 1, 3, 4, 6, 9, 14, 18, 19 a 23 často způsobují zápal plic u dětí (Mandeli, 1990, Connelly a Starke, 1991, Lee a kol.,1991, Sorensen, 1993, Nielsen a Henricksen, 1993).

V současné době je nejvíce používaná antipneumokoková

- 10 vakcína, složená z purifikovaných kapsulárních polysacharidů z 23 kmenů pneumokoků (Pneumovax^R 23, Měrek Sharp & Dohme). Pneumokokové kapsulární typy, které Pneumovax^R 23 obsahuje, jsou 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, 33F (dánská nomenklatura). O těchto sérotypech se uvádí, že jsou zodpovědné za 90 % vážných pneumokokových nemocí na světě.

O účinnosti vakciny Pneumovax^R 23 se v literatuře vede určitá polemika (Borgano a kol., 1978, Broome a kol., 1980, Sloyer a kol., 1981, Shapiro a Clemens, 1984, Bolan a kol., 1986, Simberkoff a kol., 1986, Forester a kol., 198 -7 ,—Shapiro . 1987 S imsako11988, Simberkof f , 1989, Shapiro, 1991). Pneumokoková vakcína je účinná pro indukci protilátkové odpovědi u zdravých mladých dospělých jedinců (Hilleman a kol., 1981, Mufson a kol., 1985, Bruyan a van Furth, 1991). Bylo prokázáno, že tyto protilátky mají in vitro opsoninovou aktivitu (Chudwin a kol., 1985). Avšak existuje výrazná variabilita v intenzitě odpovědi a v přetrváváni titrů protilátek k různým sérotypům (Hilleman a kol., 1981, Mufson a kol., 1987).

Děti mladší dvou let jsou nejrizikovější skupinou, pokud se týče systémových chorob, zánětu středního ucha a akutního respiračního infekčního onemocnění dolních cest dýchacích způsobených pneumokoky, protože tyto pneumokoky na takovou vakcínu nereagují (Seli a kol., 1981, Hazelwood a kol., 1993, Saunders a kol., 1993). Kromě toho starší a imunosupresovaní jedinci mají oslabené nebo různorodé odpovědi na Pneumovax^R 23 (Siber a kol., 1978, Schildt a kol., 1983, Forester a kol., 1987, Simberkoff, 1989, Shapiro, 1991). Tyto populační skupiny nereagují dobře na polysacharidové antigeny této thymus independentní vakciny.

·· 9 • ♦

Charakteristické pro thymus independentní antigeny je, že třída protilátek změněná z isotopu IgM na isotop IgG není obvykle pozorována ani není anamnestická odpověď na booster imunizaci (Borgano a kol., 1978).

Nedávné výskyty kmenů bakterií rezistentních na ant-řb-řot-ikra—kladou důraz -na--po-třabu_Arvv_inout účinné vakcíny pro prevenci dětských infekcí. Nepochybně jsou třeba nové vakcíny proti pneumokokům, obzvláště pro vysoce rizikové skupiny a pro děti.

Konjugované vakcíny__

Avery a Goebel byli prvními, kteří připravili vakcíny proti bakteriálním infekcím (Avery a Goebel, 1929, Goebel a Avery, 1929). Později bylo vyvinuto několik proteinových nosičů konjugátu, které vyvolávají thymus dependentní odpovědi na velký počet bakteriálních polysacharidů. Doposavad největší pozornosti dosáhl vývoj konjugovaných vakcín na Haemophilus influenzae, typ b (Hib). Schneerson a kol. kovalentně kondenzovali Hib polysacharidy (polyribitol- fosfát) k toxoidu záškrtu. Tato skupina také vyvinula Hib vakcínu derivováním polysacharidů dihydrazidem kyseliny adipové jako vymezovacím činidlem (spacer) a kondenzováním této látky k toxoidu tetanu s karbodiimidem (Schneerson a kol. , 1986). Podobný postup¹ byl použit k přípravě konjugátů, obsahujících toxoid záškrtu jako nosič (Gordon, 1986 a 1987). Bifunkčni spacer byl využit ke spojeni proteinu vnější membrány druhu Neisseria meningitidis skupiny B s Hib polysacharidy (Marburg a kol., 1986, 1987 a 1989). Konečně Anderson (1983 a 1987) vytvořil konjugovanou vakcínu tím, že použil Hib oligosacharidy kondenzované reduktivní aminací k netoxickému zkřížené • ·

reaktivnímu mutantnimu toxinu záškrtu CRM₁₉₇.

Zprávy o účinnosti těchto vakcín se v literatuře liší a mnohé studie stále ještě probíhají. Avšak o oligosacharidových konjugátech (Anderson a kol., 1985a, 1985b, 1986, 1989, Seid a kol., 1989, Madore a kol., 1990, Eby a kol., -1-994Ú—a—po-l-ysachar-idový-ch—ko_njugátech (Barra a kol., 1993) se referuje, že jsou imunogenní u malých dětí a vyvolávají thymus dependentní odpověď. Haptenový obsah je klíčovým faktorem konjugované imunogenity (Anderson a kol., 1989, Eby a kol., 1994 ) .

----Další konjugované vakcíny byly-vyvinuty Jenningsem_______ a kol. (1985 a 1989), který využil aktivaci jodistanu ke kondenzaci polysacharidů druhu Neisseria meningitidis k nosičům toxoidu tetanu nebo záškrtu. Porro (1987) popsal metody kondenzace oligosacharidů esterifikované N. meningitidis k proteinovým přenašečům. Byly vyvinuty konjugované vakcíny, obsahující polysacharidy druhu Pseudomonas aeruginosa, kondenzované jodistanovým postupem k detoxifikovanému proteinu ze stejného organismu (Tsay a Collins, 1987). Cryz a Furer (1988) použili dihydrazid kyseliny adipové jako rameno vymezovacího činidla (spacer arm) k vytvoření konjugovaných vakcín proti P. aeruginosa.

Polysacharidy specifických sérotypů S. pneumoniae byly také kondenzovány k osvědčeným proteinovým nosičům, jako například k toxoidům tetanu a záškrtu (Schneerson a kol., 1984, Fattom a kol., 1988 a 1990, Schneerson a kol., 1992), k membránovým proteinům N. meningitidis (Marburg a kol., 1987, Giebink a kol., 1993) a k pneumolysinovému mutantnimu nosiči (Paton a kol., 1991, Lock a kol., 1992, Lee a kol., 1994). Byla vyvinuta technologie pro kondenzaci

- 13 oligosacharidů S. pneumoniae k proteinu CRM^g-y (Porro, 1990). Tyto konjugované vakcíny mají variabilní či dosud neurčité imunopotentní vlastnosti. Největším problémem v současné době při vývoji účinných glykokonjugovaných vakcín u S. pneumoniae je reprodukovatelnost těchto vazebných technologií s udržením imunogenních epitopů.

___Optimální imunogenní velikost oligosacharidů se jeví být____ různá, závislá na sérotypu, určující konformační aspekt určitých imunogenních epitopů (Eby a kol., 1994, Steinhoff a kol., 1994).

Jsou potřeba nové vakcíny proti DTP, tuberkolóze,

----dě t s ké obr ně, spa 1 nickám,. hepatitiděHaemophilu influenzae________ typu b a zápalu plic, které vyvolají dlouhotrvající ochranu. Aby byla vyvolána ochrana proti S. pneumoniae u dětí, je vyžadován multi-haptenový proteinový konjugát, který obsahuje vysokou hladinu oligosacharidů v optimální imunogenní velikosti pro každý sérotyp.

Mnozí výzkumníci navrhli zvýšení imunogennosti konjugované vakcíny podáváním adjuvans. Například sůl hliníku je pro použiti u lidí schválena. Také karbohydrátové podíly, jako např. β-glukanové částice a nízkomolekulární dextran, mají vlastnosti projevující aktivitu adjuvans, jak bylo referováno. Adjuvax (Alpha-Beta Technology) je kompozice adjuvans, které obsahuje β-glukanové částice. Lees a kol. (1994) referovali o užití konstrukčních prvků na bázi nízkomolekulárního dextranu jako o adjuvans. Penney a kol. (1992) ohlásili sloučeninu s dlouhým alkylovým řetězcem s imunologickou aktivitou.

Přehled obrázků na výkresech ···· ···· (náhradní strana) »

Obr. 1 ilustruje opakující se jednotkové struktury polysacharidů, používané v příkladech tohoto vynálezu.

Obr. 2 ukazuje separační profil kapsulárních polysacharidů sérotypu 8 druhu Streptococcus pneumoniae na koloně BioGel P-10 po kyselé hydrolýze (0,5-M kyselina ^rř-finaoroe^tová-Y—dád-e_±éž_ TFA, teplota 100 °C, doba 20 minut). Výsledkem jsou rozeznatelné oligosacharidy s opakujícími se jednotkami od jedné do osmi.

Obr. 3A až 3D ukazují relativní velikost opakujících se -gedno-tek_kapsulárních polysacharidů hydrolyzovaného sérotypu 8 druhu Streptococcuspneumoniae^u^píku 1 (obr. 3A“)^-; 2~(-obr— 3B), 3 (obr. 3C) a 4 (obr. 3D), měřenou pomocí analýzy HPLC.

Obr. 4 ukazuje HPLC retenční doby glukózových, M-3 maltotriózových, M-7 maltoheptózových a M-10 maltooligosacharidových standardů, použité k určení relativní velikosti různých opakujících se jednotek oligosacharidů.

Obr. 5 je příkladem retenčních dob ribitolu, rhamnózy, galaktózy, fukózy a mannózy jako monosacharidových standardů, použitých k určování obsahu uhlohydrátu hydrolyzovaných opakujících se jednotek.

Obr. 6 ukazuje separační profil polysacharidových hydrolyzátů S. pneumoniae sérotypu 6B v kyselině fluorovodíkové při průchodu kolonou P-10 BioGel.

Obr. 7 ukazuje separační profil polysacharidových hydrolyzátů S. pneumoniae sérotypu 6B v kyselině trifluoroctové při průchodu kolonou P-60 BioGel.

Obr. 8 ukazuje separační profil polysacharidových hydrolyzátů S. pneumóniae sérotypu 14 v kyselině trifluoroctové při průchodu kolonou P-30 BioGel.

Obr. 9 ukazuje separační profil polysacharidových hydrolyzátů S. pneumóniae sérotypu 19F v kyselině octové při průchodu kolonou—R^1O_BíoG£l1_._______________'

Obr. 10 ukazuje separační profil polysacharidových hydrolyzátů S. pneumóniae sérotypu 23F v kyselině trifluoroctové při průchodu kolonou P-10 BioGel.

----Obr. 11 ukazuje separační profi1 polysacharidu S.____ pneumóniae sérotypu 8 štěpeného celulázou při průchodu kolonou P-10 BioGel.

Obr. 12 ukazuje separační profil polysacharidových hydrolyzátů pneumokokové C-substance v kyselině fluorovodíkové při průchodu kolonou P-10 BioGel.

Obr. 13 ukazuje výsledky inhibice ELISA při použití myšího antiséra ke konjugátu proteinový nosič - oligosacharid sérotypu 8 Streptococcus pneumóniae.

Obr. 14 vyobrazuje okyselení oligosacharidů pro karbodiimidovou kondenzaci.

Obr. 15 ukazuje separaci redukované a jodistanové frakce polysacharidu (23-valentní polysacharidová vakcína Pneumovax^R 23, Měrek Sharp & Dohme).

Obr. 16 ukazuje separaci redukované a jodistanové frakce oligosacharidů druhu Streptococcus pneumóniae, • · ·· ····

- 16 sérotypu 6B.

Obr. 17 ukazuje separaci redukované a jodistanové frakce oligosacharidů druhu Streptococcus pneumoniae, sérotypu 19F.

_____Obr-_LR-zobrazuje chemické reakce při kondenzaci jodistanu a EDC.

Obr. 19 ukazuje mono-hapten 8-oligosacharidový konjugát toxoidu tetanu, inhibovaný.anti-8 sérem, vázaným na 8 polysacharidem pokrytou ELISA desku.

Obr. 20 zobrazuje isotopy protilátek IgG, vyvolané polysacharidem S. pneumoniae sérotypu 8 po imunizaci 8:14 dihapten-oligosacharid-TT-konjugátem.

Obr. 21 ukazuje zvýšenou hladinu isotopu protilátky IgG-p vyvolanou polysacharidem po imunizaci 8:14 dihapten-oligosacharidovým konjugátem, typickou pro thymus dependentní odpověď.

Obr. 22A a 22B ukazují vyvolané IgG isotopy ze skupiny myši imunizovaných 14-polysacharidovými a oligosacharidovými konjugáty s adjuvans a bez adjuvans.

Nyní bude uveden krátký souhrn vynálezu.

Jeden aspekt vynálezu je, že vynález skýtá kompozice, které obsahují

a) karbohydrátový hapten, obsahující alespoň jeden imunogenní epitop a separovaný podle velikosti, a

Λ ·

b) nosič, ve kterém výše zmíněný hapten je kovalentně kondenzován k výše zmíněnému nosiči a kde konjugát haptenu s nosičem je protektivně imunogenní.

Jiný aspekt vynálezu poskytuje způsoby přípravy -4vong-ugovaji-ých—sloučenin,_které spočívají v tom, že se ___________

a) štěpí bakteriální polysacharid na oligosacharidy, aby byly chráněny imunogenní epitopy na výsledných oligosacharidech, b) separují výsledné oligosacharidy na základě velikosti,

c) provede selekce těch oligosacharidů, které obsahují imunogenní epitopy, založená na inhibici ELISA, d) aktivují oligosacharidy selektované v bodě c), a e) kondenzují aktivované oligosacharidy k purifikovanému nosiči, kde výsledná sloučenina obsahuje imunogenní epitopy a je protektivně imunogenní.

Další aspekt vynálezu spočívá v tom, že vynález poskytuje způsoby zajištující ochrannou imunizaci proti bakteriálnímu patogenu tím, že se podává savci, potřebujícímu takové ošetřeni, účinné množství vakcinové kompozice popsané výše.

Ještě dalším aspektem vynálezu je, že vynález skýtá kompozice vhodné pro stimulování imunitní odpovědi na antigen, přičemž výše zmíněné imunostimulační kompozice zahrnují oligosacharid S. pneumoniae sérotypu 8, který obsahuje imunogenní epitop, jak byl stanoven inhibici ELISA, a vhodné farmaceutické vehiculum, kde výše zmíněný oligosacharid poskytuje imunostimulační efekt.

4« ····

- 18 Ještě dalším znakem vynálezu je, že vynález poskytuje způsoby zajišťování protektivní imunizace proti bakteriálnímu patogenu. Tyto způsoby zahrnují podávání savci, v případě potřeby takového léčení, účinného množství kompozice sérotypu 8, popsané výše.

Ještě dalším znakem vynálezu je, že vynález poskytuje způsoby zvýšení imunogenní odpovědi na antigen, které zahrnují podávání oligosacharidu S. pneumoniae sérotypu 8, který obsahuje imunogenní epitop, jak byl stanoven inhibicí ELISA, společně s výše zmíněným antigenem.

Jiný dalším aspektem vynálezu je, že vynález poskytuje způsoby přípravy imunostimulačních kompozic popsaných výše, které zahrnují

a) štěpení polysacharidu S. pneumoniae sérotypu 8 na oligosacharidy, aby byly chráněny imunogenní epitopy na výsledných oligosacharidech,

b) separování výsledných oligosacharidů podle velikosti,

c) selekci těch oligosacharidů, které obsahuji imunogenní epitopy, která je založená na inhibici ELISA, a

d) smísení selektovaných oligosacharidů s vhodným farmaceutickým nosičem.

Nyní se uvádí podrobný popis vynálezu.

Tento vynález se vztahuje ke zlepšeným způsobům přípravy konjugátů oligosacharido-proteinových nosičů.

• ····

- 19 Konjugovaný produkt může být složen z různých haptenů nebo nosičů. Mohou být připraveny mono-, di- a multihaptenové konjugáty. Jsou popsány způsoby určení přítomnosti imunogenních epitopů na haptenu nebo nosiči výsledného konjugátu. Takové konjugáty mají využití jako vakcíny, terapeutické a profylaktické prostředky, imunomodulační 'diagnostické prostředky a prostředky pro vývoj a výzkum!

Tento vynález je obzvláště vhodný pro vyvíjení konjugátů jako vakcín proti takovým bakteriálním patogenům, které zahrnují Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis-,—Haemoph-i-lus—intkuenzae^.,—Streptococcus--------------skupiny B/ Streptococcus skupiny A, Bordetellapeřťusíš, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Cryptococcus neoformans, Pseudomonas aeruginosa a Klebsiella pneumoniae, na které však výčet není omezen. Konjugáty podle tohoto vynálezu přeměňují slabě imunogenní nebo neimunogenní molekuly na molekuly, které vyvolávají specifické imunoprotektivní protilátkové nebo buněčné odpovědi.

U vysoce rizikových skupin, jako například starších osob a dětí do 2 let, byly pozorovány slabé imunitní odpovědi na polysacharidové vakcíny (thymus independentní antigeny, TI). Několik výzkumníků se pokusilo vyvolat thymus dependentní odpovědi (TD) na velký počet bakteriálních polysacharidů, když použili proteinové nosiče. Integrita kritických imunogenních epitopů a nepevná kovalentní vazba mezi karbohydrátem a proteinem jsou velká omezení u těchto konjugovaných vakcín. Tento vynález směřuje k objevení kondenzační technologie, která poskytuje dobrou reprodukovatelnost s ohledem na poměr uhlohydrátu a nosiče v konjugátu. Tento vynález také poskytuje způsoby ověřování přítomnosti > o ·> o > 3 ů *>»’

0 3 9 53

373 a 7

-} 3 ~3 3 O O 3 o □ d>3

O O M) '> ·>

- 20 imunogenních epitopů na origosacharidových haptenech. aína konjugátech hapten - nosič. ’' ' ^: <*'·-' ·<* ··’«· ’ > ,·· 'rtui’ η·.'·.* 3-:t.

Polysacharidové konjugáty vyvolávají- nezvyšovatelné odpovědi protilátek IgM, obvyklé pro-TI antigeny. Antisérum, vytvořené jako odpověď na tyto polysacharidové konjugáty, nemá opsoninovou aktivitu. V^tomťovvynáTezu“oTigosacharldy^ připravené štěpením polysacharidů z různých bakteriálních kmenů jsou separovány podle velikosti a použity k produkci mono-haptenových konjugátů. Tyto konjugáty vyvolají isotypy IgG protilátek s imunoprotektivní opsonizační schopností. IT-a-to—prot-i-l-á-tková—odpověď—j e—vy-vo lána—bez—použití_______________________ jakéhokoliv adjuvans. Á tak způsoby podle tohoto vynálezu jsou ideálně vhodné pro vytváření imunogenních konjugátů oligosacharidový hapten - nosič, které využijí slabě imunogenni nebo neimunogenní polysacharidy různých kmenů.

Zjistilo se, že kritickou pro vyvolání imunoprotektivní odpovědi je přítomnost imunogenních epitopů na těchto oligosacharidech.

Počet bakteriálních antigenů potřebných k vývoji účinných antipatogenních vakcín vzrůstá. Avšak opakované podávání toxoidů tetanu nebo záškrtu (které jsou často užívány jako proteinové nosiče ve vakcínových kompozicích a?jako profytaktická míra následujícího traumatu) může způsobit fenomén, který se»nazývánosičem indukovaná epltopová suprese. Epitopová‘suprese byla popsána v literatuře u konjugátů isyntetického·· peptidu? a sacharidového toxoidu (Gaur.. a< kol. , 1990, Peeters á kol·., 1991).

Imunologické odpovědi·' na hapten kondenzovaný s proteinovým nosičem mohou'být’ redukovány, nebo mohou.chybět, když příjemce byl předtím imunizován nosičem.

« 99··

- 21 Cílem mnoha výzkumníků je vyvinout vakciny, které vyvolají ochranu k hlavním bakteriálním sérotypům, které způsobují akutní respirační infekční onemocnění, zánět středního ucha, bakteriemii u dětí, bez vyvolání suprese nosičem. Způsoby podle tohoto vynálezu mohou být využity k vytváření multi-haptenových konjugátů s optimálními -i-munogenními~~epitopy^lce^kazďémír^-bakteriálnímu sérotypu. Tyto konjugáty, které obsahují nižší množství proteinového nosiče než tradiční konjugáty, snižují výskyt fenoménu (jevu) suprese nosičem. Snížená dávka antigenu při možném použití těchto konjugátů minimalizuje antigenní kompetici, pozorovanou u tradičních konjugátů.

Již dříve původci tohoto vynálezu uvedli, že povrchové vrstvy (S-vrstvy) krystalické bakteriální buňky jsou vhodné jako nosiče pro vývoj prototypových konjugovaných vakcín (Malcolm a kol., 1993a) a jako prostředek při vyhnutí se jevu suprese nosičem (Malcolm a kol., 1993b). V laboratoři majitele patentu se rozpoznalo několik glykoproteinů S-vrstvy, které vyvolávají nezkříženě reagující protilátkové a buněčné odpovědi. Při použití S-vrstev, izolovaných z různých bakteriálních kmenů, mohou být vyvinuty vakciny proti mnoha chorobám, a tím se vyhne supresi laosičem, pozorované u toxoidů tetanu a záškrtu. Avšak S-vrstvy je obtížné izolovat a purifikovat, dále je drahé je vyrobit, takže nelze dosáhnout jejich širokého využití jako nosiče vakcín. Tento vynález popisuje způsoby pro přípravu mono-, do a multi-haptenových oligosacharidových konjugátů, které snižují množství nosiče nezbytného k vyvolání zvláštní odpovědi, a tím klesá riziko nosičem indukované epitopové suprese dokonce i tehdy, když je jako nosič použit toxoid tetanu nebo záškrtu.

Využitelnost

Jedno zvláštní použití technologie podle tohoto vynálezu spočívá ve vývoji účinných vakcin pro prevenci infekcí zápalu plic u dětí. Jinou aplikací vynálezu je vyvinout vakcínu pro ochranu proti kmenům Streptococcus skupiny B, Streptococcus skupiny A, Haemophilus influenzaě B, Streptococcus pneumoniae a N. meningitidis, které převládají u dětí a u osob starších a imunosupresovaných. Další použití zahrnují vývoj konjugátu pro vyvolání ochrany proti různým bakteriálním nebo virový patogenům.

Původci tohoto vynálezu zjistili, že použití podmínek, které štěpí specifické vazby (například 1 až 4 vazby), ale nechají monosacharidy a další imunologicky důležité sloučeniny jako například fosfáty neporušené, má za následek zlepšenou imunogennost výsledných konjugátů.

Původci tohoto vynálezu zjistili, že velikost a struktura oligosacharidů jsou důležité pro maximalizování imunogennosti konjugovaného preparátu. Různé velikosti oligosacharidů jsou separovány z hydrolyzovaných směsí polysacharidů a izolovány podle velikosti frakce. Obsah monosacharidů a relativní velikost separovaných oligosacharidů se měří například HPLC. analýzou. Opakující se jednotky různé velikosti jsou testovány za použití inhibice ELISA. Původci vynálezu zjistili, že inhibice ELISA je přímo úměrná imunogennosti oligosacharidového preparátu a výsledného konjugátu.

V laboratoři původců byly používány zejména oligosacharidy, připravené ze štěpení polysacharidů druhů Ξ.

pneumococcus, kmenů 3, 6B, 8, 14, 19F a 23, pneumokokové

999· 9 99 999999 »·> · · · · · · « • · a · · · · · · -t • 9 9 99 9 9 999 9 • 9 9 9 9♦ ·

999999 999 ·♦ 9· *

- 23 C-substance, a C-polysacharidy N. meningitidis. Pro některé sérotypy S. pneumococcus a pneumokokovou C-substanci jsou preferovány následující opakující se jednotky (R.U.):

Sérotyp 3: 4-8 R.U.

6B: 4-10 R.U.

----------------------8:-2-8--R.U.-----------------------------------------:---14: 4-6 R.U.

19F: 4-10 R.U.

C-substance: 6-10 R.U.

Preferované opakující se jednotky pro C-polysacharid N. meníIRjTfídY sF~jls ou “ 6 -TO RTU1

Bylo nalezeno, že vytvářející se nabité skupiny na sacharidových haptenech usnadňují vazby haptenů k nosiči. K umožnění vazby oligosacharidu k nosiči při vyšším poměru cukru k nosiči je účinné použití kationových nebo anionových výměnných kolon. Toto zajišťuje více haptenů na nosič a snižuje jev (fenomén) suprese nosičem. Redukované frakce . karbohydrátu jsou použity pro vazbu k nosiči.

Jiný důležitý aspekt při přípravě účinných konjugova. ných vakcín je použití purifikovaného nosiče. Nečistoty v preparátu nosiče mohou vadit v procesu kondenzace. Shluky ·, nosičových proteinů, nalezených v preparátu nosiče, mohou mít nepříznivý vliv na optimální poměr haptenů a nosiče, nezbytný k vyvolání požadované odpovědi. Nosiče jsou zpravidla purifikovány na velikosti vylučující kolonové chromatografii, ačkoliv může být použita jakákoliv standardní metoda, která odstraňuje nečistoty a shluky.

Pro získání ideálního poměru uhlohydrátu a konjugované- 24 ho nosiče jsou kritické doba kďďenzační (reakce,, množství oligosacharidu, kondenzačníhoKČinidla. a,·nosiče. Původci tohoto vynálezu vyvinuli, způsoby,, které měří' poměry,.uhlohydrátu k nosiči pomocí opakovatelných.itestů. K přípravě účinného konjugátu je také důležité během kondenzační reakce udržovat optimální hodnotu. pH a teplotní,, podmínky..3 tK, vytvořenl-účŤnných^konjugdvanyqiriKoi^ozicčj^ěrfžňpbdobhělIpJiřileďíska důležité užití účinných blokovacích činidel, . která, zastaví kondenzační reakci, ale nezakrývájípimunogenní.skupiny...

» y 1 x 1 ·. : j. Je_nezbytnéBvy

vlastností·, ,které,.udržuji imunogenní epitopy na oligosacharidech/polysacharidech. Původci tohoto vynálezu zjistili, že kondenzace EDC s jodistanem, jak je popsána níže, může být použita pro kondenzaci oligosacharidů a nosičů. Kromě přímé kondenzace cukru k nosiči; se· mohou použít různé spojovníky (linkery).,' které oddělí/sacharid· od povrchu proteinu. Příslušné linkery mohou také zajistit nabité nebo nenabité části , jak je-;požadováno. .Impnogennost;fkQndenzQyané,;kompozice cukr - nosič se určí•vinhibicí^cELISAovv-ch .

' --5· .· - »,· :,Ví>ut Má v. .· )<:.·>

Při používání způsobu podle vynálezu původci objevili možnosti produkovat di-haptenové a multi-haptenové konjugáty, které sj > ještě zachovávájíxsyéqimunogenní-..epitopy,. Mohou být vyráběny konjugáty íSřcrůznými/ýfglig.osacharidqyými·,. sekvencemi a/nebo ^velikostmi-. íPodobně..mohou._:být ssyntetizovány konjugáty, obsahujícíxoligqsachařidové a polysacharidové kompozice. Takové konjugáty jsou schopny snižovat nebo eliminovat antigenní .kompetici ý vwo ·\ ?uj· < · ,·· . f-> Ί.1 , e _f · ·; á a t

A tak vhodná forma. konjugátu; .zaj išťuje schopnost redukovat supresi; ^epitopu indukovanou nosičem. 'Klíčem v₎₍ tomto ohledu . jsou identitikace a> použití l.munogenních

^s <

(	oligosacharidových epitopů a účinnější kondenzace cukru k proteinu. Vázání většího počtu imunogenních epitopů na molekulu proteinu znamená, že je k zajištění ochranné imunizace potřeba menší množství nosiče.
-Ir ,í f	Původci tohoto vynálezu vyvinuli způsoby, které měří rozsah imunoprotektivní protilátkové odpovědi na kongngované kompozice pomocí isotopování ELISA, baktericidních a opsonizačních testů. Toto dovoluje určit, které konjugáty budou vyvolávat odpověď vhodného imunoglobulinového isotypu, například IgG isotypů, pokud se použijí u protektivně
1	imunizovaných savců. Definice
í 4 ♦	Dále vysvětlené termíny mají následující významy, pokud jsou zmiňovány,v tomto dokumentu: Oligosacharid znamená karbohydrátovou sloučeninu, sestavenou z malého počtu monosacharidových jednotek. Oligosacharidy mohou vzniknout zejména štěpením polysacharidů.
	Polysacharid znamená karbohydrátovou sloučeninu, obsahující velký počet sacharidových skupin. Polysacharidy,
< -	nalézající se na vnějším povrchu bakterií nebo virů, jsou obzvláště výhodné při tomto vynálezu.
	Nosič znamená látku, která vyvolává thymus dependentní imunologickou odpověď, a která může být vázána k haptenu
*	nebo antigenu za vzniku konjugátu. Zejména může být použito různých proteinových, glykoproteinových, karbohydrátových nebo podjednotkových nosičů včetně toxoidu/toxinu tetanu,

r · · · · · · • · · ·

- 26 |ř

	toxóidu/toxinu záškrtu, proteinů vnější membrány bakterie,
	povrchových vrstev krystalické bakteriální buňky, sérového albuminu, τ-globulinu nebo hemocyaninové přílepky.
	Imunogenní znamená být příčinou imunitní odpovědi. Imunogenní epitop znamená, že část molekuly, která je
-Λ	rozpoznána imunitním systémem, zapříčiňuje řmunogenní odpověď. Hapten znamená antigen, obsahující nekompletní nebo
* í	částečný antigen, který nemusí být sám schopný způsobit ...... produkci protilátek. Di - a multi-hapten, pro účely tohoto ........patentu, “še* uvádí ve vztahu ke kompozicím, obsahujícím dva - - (di) nebo více (multi) oligosacharidové hapteny, konjugované k nosiči. Protektivně imunogenní neboli imunoprotektivní znamená stimulující imunitní odpověď, která zabraňuje infekci
i i	patogenem.
t t	Imunostimulační znamená stimulující nebo zvyšující imunitní odpověď k slabším imunogenním haptenům nebo antigenům. Novorozeně znamená nově narozený živočich, včetně dětí. Metodologie
t-	Příprava a separace štěpených polysacharidů Polysacharidy, které jsou dostupné ze sbírky Američan
i	Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, nebo se mohou dostat postupy izolace, známými v tomto oboru, se

- 27 štěpí na oligosacharidové jednotky za použití vhodných _f koncentrací chemikálií. Mezi tyto chemikálie se zahrnuje kyselina trifluoroctová, kyselina octová, kyselina fluorovodíková, kyselina cholorovodíková, hydroxid sodný a octan sodný, třebaže na ně výčet není omezen. V závislosti na jednotlivých chemických vlastnostech a koncentracích a na požadOvaných^—výsT^3ných-^_oTigosacharřd“ech~se“mohOU'^_pOUž'ít různě dlouhá časová období a teploty. Dále se mohou k přípravě oligosacharidů z polysacharidů použít komerčně dostupné enzymy (napříkhd celuláza a β-galaktosidáza) nebo izolované endoglykany související s bakteriofágem, známé v oboru nebo připravené podle dosavadního stavu techniky.

__................................- ........................._: , ....___________ „ „ - .............-·_Τ-__Γ·.... ...

Obr. 1 ukazuje opakující se jednotkové struktury polysacharidů, použité v příkladech podle tohoto vynálezu. Odborníkovi v tomto oboru jsou známy další bakteriální • a virové polysacharidy, které mohou být použity při způsobech a v kompozicích podle tohoto vynálezu. Mohou se štěpit různé polysacharidy, mezi které se zahrnuje pneumokokový skupinový antigen (C-substance) a kapsulárni polysacharidy sérotypů Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus skupiny A a Streptococcus skupiny B, na které však výčet není omezen.

Po rozštěpení se výsledné oligosacharidové směsi separují podle velikosti za použití P-10 (frakcionační rozsah molekulové hmotnosti 1500 až 20 000), P-30 (frakcionační rozsah molekulové hmotnosti 2500 až 40 000) t· a P60 (frakcionační rozsah molekulové hmotnosti 3000 až

000) BioGel kolony. Přítomnost karbohydrátů v různých frakcích kolony se určuje rozbory za pomocí kyseliny fenolsírové nebo kyseliny sialové a chromatografie na tenké *···

- 28 vrstvě (TLC). Frakce kolony, které obsahují karbohydráty, se . potom analyzují pomocí HPLC.

Přítomnost imunogenních epitopů ve frakcích štěpených polysacharidů separovaných podle velikosti je určována inhibicí ELISA, jak je popsáno dále. Jestliže příprava nemá —--------—za—násiedek—oi-igosa^ha-ridové—f-rakce.,—které inhibujX—při_____ testu ELISA, postupy štěpení mohou být modifikovány změnou enzymů nebo chemikálií, molarity, doby reakce nebo teploty, aby se vytvořily imunogenní epitopy.

Stanovení imunogenních epitopů v oligosacharidavých “ ‘ přípravcích --------------------------------------------------------Přítomnost imunogenních epitopů ve frakcích kolony se potvrzuje inhibicí ELISA a testováním fosforu, jak je . uvedeno dále v experimentální části. Oligosacharidové frakce, které obsahují imunogenní epitopy [definovány jako ,4 ty, které způsobují alespoň přibližně 25% redukci a spíše přibližně 50% redukci v O.D.₄₀₅ (optická hustota) při koncentraci 12,5 μg], jsou selektovány pro kondenzaci s nosičem.

Kondenzace k nosiči

t.,. Oligosacharid nebo polysacharid, který má být použit pro kondenzaci s nosičem, je okyselen nebo redukován v preparátu pro EDT nebo jodistanovou oxidační kondenzaci. Například oligosacharidový preparát může být redukován pomocí Rexyn™ 101 (H) kationoméničové kolony na bázi organické kyseliny, k okyselení cukru pro EDC kondenzaci. Podobně mohou být redukovány cukry při použití normalizovaných způsobů pro jodistanovou oxidační kondenzaci. Když se *·

- 29 připravují di-haptenové nebo multi-haptenové konjugáty, každý oligosacharid je aktivován jednotlivě pro EDC nebo jodistanovou konjugaci.

Mezi výhodné dihaptenové oligosacharidové konjugáty se zahrnuje 3:8-TT, 6:8-TT, 6:14-TT, 8:14-TT, 8:19-TT, 8:23-TT ---al-4:19-TT,---------------------------------Nosič

Může se použít různých proteinových, glykoproteinových karbohydrátových nebo podjednotkových nosičů včetně ~toxo rdu/toxinu-^tetanu, toxoidu/toxinu záškrtu, proteinů______ vnější membrány bakterie, povrchové vrstvy krystalické bakteriální buňky, sérového albuminu, τ-globulinu nebo hemocyaminové přílepky. Ve zvláštních případech tohoto vynálezu se jako nosič používá toxoid tetanu. Preparáty na bázi toxoidu tetanu běžně obsahují shluky a nízkomolekulární nečistoty. Čistota nosiče je nezbytná pro získání pevnosti v kondenzačních reakcích. K získání purifikovaného preparátu nosiče se používá vylučovací chromatografie podle velikosti.

Oligosacharidy obsahující imunogenní epitop, separované podle velikosti, se kondenzují k purifikovaným nosičům karbodiimidovou (EDC) nebo jodistanovou aktivací, při použití způsobů popsaných v experimentální části. Libovolné oligosacharidy zbavené heptenu se separují od konjugátů hapten - nosič pomocí kolonové chromatografie. Poměr uhlohydrátu k proteinu v konjugátech se stanoví Lowryho proteinovými testy a testy na bázi kyseliny fenolsírové nebo kyseliny sialovou. Obvykle mají konjugáty připravované EDC kondenzací poměr uhlohydrátu a nosiče 1:2, zatímco konjugáty připravené použitím jodistanové oxidační kondenzace mají

- 30 poměry uhlohydrátu k nosiči v rozsahu od 1:5 do 1:10.

Určování imunogenních epitopů na konjugátech

Jak již bylo dříve uvedeno, integrita kritických imunogenních epitopů je problémem dříve známých konjugačních -technologií____V tomto vynálezu ~je používán test inhibice_________

ELISA k určení potenciální imunogennosti různých konjugátů, produkovaných konjugačními postupy podle tohoto vynálezu. Původci tohoto vynálezu zjistili, že konjugáty, které prokazují inhibici při tomto testu (alespoň asi 25% redukci a výhodněji asi 50% redukci v O.D.₄₀₅ při koncentraci 6,25 ug)-^—při-použit i—způsobů—uvedených„dál^V—příkladech,___________ zajištují ochrannou imunogennost, když se používají jako vakcíny u savců. A tak tento test je používán k vyšetřeni vhodných konjugovaných kompozic.

Imunizace k vyvolání imunoprotektivních odpovědí protilátky

Obvykle se myši imunizují ve dni 0 (první neboli primární imunizace), ve dni 7 (druhá neboli sekundární imunizace) a ve dni 28 (třetí neboli terciární imunizace) podkožní injekcí (100 μΐ do 2 bočních stran) s antigeny (polysacharidové konjugáty, oligosacharidové konjugáty, nekondenzovaný polysacharid nebo oligosacharid nebo nekondenzovaný toxoid tetanu) v dávkách 0,1, 0,5, 1, 2,5 a 5 μg, vztaženo na obsahu uhlohydrátu pro EDC konjugáty a obsahu proteinu pro jodistanové konjugáty.

Antigeny se zředí na různé dávky v 0,9% roztoku chloridu sodného. Jako negativní kontrolní vzorky se použijí myši, kterým se aplikuje 0,9% roztok chloridu sodného. Myším se odebere krev 7 až 10 dní po 2. a 3. imunizaci, aby bylo

3	9 0 O »9	9	•>4)	9 0	9 0 0 0
	0	•3 O	9	9	7 3	•9
3	9O0	O	9	3	3 9	9
a	9 9	9	0	9 9	9 0 0	1
3	3	9	9	9	3
90 0 9OO	90 0		9 0	9 0	i

- 31 získáno sérum ke zkoumání imunoprotektivních odpovědí protilátky. V tabulce 1 je běžné imunizační schéma pro S. pneumoniae sérotypu 3. Jde o konjugáty polysacharidu a oligosacharidu s toxoidem tetanu, připravené za použití EDC kondenzace.

-----Úč-iriná—j-sou i různá jiná schémata včetně: den)O (1.____ imunizace), den 14 (2. imunizace) a den 44 (3. imunizace), a den.,0,.(1. imunizace), den 30 (2. imunizace) a den- 60 (3. imunizace).

< · ς-.·⁴ £ - · *' *'

Konjugáty podle tohoto vynálezu mohou být použity jako klasické vakciny, jako imunogeny, které vyvolávají____________ specifickou produkci protilátek nebo stimulují specifické buňkou zprostředkované imunitní odpovědi. Mohou být také využity pro terapeutické metody, například ke stimulaci imunního systému, aby rozpoznal tumor - doprovodné antigeny, jako imunomodulátory, například ke stimulaci produkce lymfokinů/cytokinů aktivováním specifických buněčných receptorů, jako profylaktická agens, například k blokováni na buněčné membráně a prevenci buněčné adheze, jako diagnostická agens, například k identifikování určitých buněk, jako nástroje vývoje a/nebo výzkumu, například ke stimulaci buněk pro produkci monoklonální protilátky.

Určování odpovědi

Jak již bylo dříve diskutováno, protilátkové odpovědi ma TI a,TD antigeny se liší. U myši je odpověď·na polysacharidový. (TI) antigen obvykle složena'*zi TgM a IgG v poměru 1-: 1 .. Všeobecně, jsou IgG isotopy omezeny, s IgG₃ , který .je! příliš {vytlačen do anti-polysacharidóvého séra. Isotypy IgA- mohou být také přítomny. TI antigeny vyvolávají

- 32 protilátky s nízkou afinitou a imunologická pamět není vytvářena.

U TD antigenů jsou zjištěny zvýšené sekundární odpovědi . IgG protilátek (anamnestická odpověď) s vyšším poměrem IgG ku IgM. Zřetelné hladiny“TgA~obvýkTe~nejsou^přítomné.—TD--------—— _íS, árTtfgeň^-vyvoTává—heterogenní— odpověď- IgG—isotypů.. Predomi-__________ nantni isotyp, kterým jsou isotypy IgG-^, IgG_2a a IgG_2b, může způsobit expresi, zatímco hladina IgG₃ isotypu je obvykle relativně nízká. TD antigeny vyvolávají imunologickou paměť —----aprot i látková afinita se zvyšuje s imunizací. A tak analýza imunoglobulinových isotypů, produkovaných jako odpověď na podávání‘konjugátů; umožní určit, zda konjugát bude .....

protektivně imunogenní nebo takový nebude.

Původci tohoto vynálezu zjistili, že konjugáty podle vynálezu indukují odpověď typickou pro TD, spíše než TI antigeny, jak bylo stanoveno přímým a isotypovým ELISA baktericidním a opsonizačním testem.

Konjugáty připravované pomocí způsobů EDC kondenzace ____________________podle tohoto vynálezu vyvolávaly lepší protilátkové odpovědi, než konjugáty připravované joďisťanovou áktíváciT Dávky 1 pg byly nejvíce imunogenní. Oligosacharidové konjugáty, připravené z nosičů toxoidu záškrtu, vyvolávaly podobné protilátkové odpovědi jako oligosacharidové konjugáty, připravované z nosičů toxoidu tetanu.

Jak bylo zmíněno výše, několik výzkumníků se pokusilo zvýšit imunogenitu a vyvolat thymus dependentm protilatkovou ochranu pomocí kondenzace polysacharidové látky fc..| k toxoidům tetanu a záškrtu. Výsledky ukazují, že tyto konjugáty jsou jen o málo více imunogenní, než nekondenzova·· • ··· · · · .· ·· • ·· ·· · '· · · ·· • · · · · ·· ··· ··· ··· ·· ·* ·

- 33 né kapsulární polysacharidy (CPS). Jedno možné vysvětlení pro tento úkaz může být ve skutečnosti, že toxoidy černého kašle, záškrtu a tetanu (v hlinité soli jako adjuvans) jsou často profylakticky podávány dětem v imunizačním režimu ve čtyřech dávkách. Tento režim mohou děti tolerovat, avšak u dětí způsobuje neschopnost vyvolat protektivní odpověď -pro^-l-átk-y--k--haptenu7'ant:ú“geriUG kondenžóvaňým k^tTěmťo toxoidovým nosičům (suprese nosičem). Jiný možný důvod pro selhání indukce ochrany může být strukturální. Proteinové nosiče vyvolávají a zvyšují imunitní odpověď na haptený, ale v případě konjugátů CPS-protein, je podíl CPS relativně velký k TI antigenu. Imunitní systém nemusí rozpoznat CPS-proteihT2j^Ko”Konj‘úgá“ťý “ale jednoduše jako dva odlišné subjekty, což má za následek thymus independentní odpověď na CPS a thymus dependentní odpověď na nosič.

Zdá se, že tomu tak je případě zde popisované studie, jak je ukázáno v tabulce 2. Imunitní systém rozpoznává polysacharid z konjugátu polysacharid - toxitoid tetanu (TT) podle tohoto vynálezu jako TI antigen. Možná TD indukující schopnost nosiče s ohledem na protilátky k polysacharidů není pozorována. Nutně se předpokládá, že imunogenní epitopy karbohydrátových haptenů (oligosacharidů) musí být v těsné blízkosti u TD indukujících epitopů nosiče, aby konvertovaly odpověď TI na odpověď TD.

K přípravě konjugátů je zde použita také technologie linker arm. Jako linker se podle tohoto vynálezu použila například kyselina 6-amino-n-hexanová. Bylo shledáno, že výsledné konjugáty jsou méně účinné ve vyvolávání protilátkových odpovědí, než konjugáty připravené přímo kondenzací EDC aktivovaných oligosacharidových haptenů k nosičům. Toto zjištění podporuje hypotézu původců tohoto

- 34 vynálezu, že k vyvolání TD odpovědí je třeba, aby hapten a nosič byly v těsné blízkosti.

Původci tohoto vynálezu také vyvinuli způsoby stanovení hladiny imunoprotektivní protilátky vyvolané konjugáty podle

T-t· tohoto vynálezu, při použití baktericidních nebo opsonizačj nich^-ťě“stů; Tyto^-“testy^-ukázaly“; že konjugátypodle—tohoto--vynálezu jsou účinné ve vyvolávání protektivních protilátek, Z jak bylo změřeno pomocí těchto testů.

r · i' Jak bylo uvedeno dříve, u studií s nosičem S-vrstva, provedených v laboratoři majitele tohoto vynálezu i u jiných {řý^kumňiků/^byP póT^ořOváirifěhóměh ěpiťóp nosič suprese“ (Malcolm a kol., 1993b). Multi-haptenové konjugáty podle tohoto vynálezu snižují nebo zmaří tuto supresi, protože tyto konjugáty budou obsahovat větší množství imunogenního epitopu na molekulu nosiče, než obvyklé konjugované vakcíny. S konjugáty podle tohoto vynálezu nebude imunní systém ,· přestimulován nosičem. Například tri-haptenový konjugát, připravovaný způsoby podle tohoto vynálezu, bude vyžadovat _t jen tři injekce k vyvolání specifických imunitních odpovědí

V*· na tři různé cílové patogeny. Na rozdíl od něj, při použití běžných monohaptenových konjugátů, je třeba aplikovat devět injekcí k vyvolání podobných odpovědí. To znamená, že by se požadovalo trojnásobné množství proteinu.

Dále, využitím konjugátů podle tohoto vynálezu mohou být navrženy imunizační režimy, které konvertují anti-polysacharidovou TI odpovéd’ na TD odpověď. Ekonomická počáteční expozice na polysacharid (například použitím látky Pneumovax^R 23), následovaná jednou aplikací konjugátu podle tohoto vynálezu, by indukovala hladiny IgG protilátek (anamnestická odpověď). Takový imunizační režim by

neindukoval supresi nosiče. V takových případech, imunitní systém zpočátku vyškolený na různé karbohydrátové epitopy a antigeny (TI odpověď), by byl indukován multihaptenovými konjugáty k vyvolání silnějších imunogenních odpovědí na patogeny často způsobující nemoci u zvláštních populačních skupin (například sérotypy 1, 3, 4, 6, 9, 14, 18, 19 a 23 u—dětí);------------------------------------------------------Farmaceutické kompozice

K vyvolání^- protilátek na specifické patogeny a/nebo na různé podíly uhlohydrátů se konjugáty podle tohoto vynálezu mohóu podávat různýmí způsoby k doručění na místo určen17 ‘“ tedy intraperitoneálně, intramuskulárně, intradermálně, subkutánně, orálně nebo nasálné.

Složení kompozic podle tohoto vynálezu může zahrnovat vhodné farmaceutické nosiče. Konjugáty podle tohoto vynálezu jsou imunogenní bez adjuvans, ačkoliv adjuvans mohou zvýšit titry imunoprotektivních protilátek nebo buňkou zprostředkovanou imunitní odpověď. Taková adjuvans mohou zahrnovat dále uvedené přípravky, na které však nejsou omezeny: Freundovo kompletní adjuvans, Freundovo nekompletní adjuvans, hydroxid hlinitý, dimethyldioktadecylamoniumbromid, Adjuvax (Alpha-Beta Technology), Inject Alum (Pierce), Monophosphoryl Lipid A (Ribi Immůnochem Research), MPL + TDM (Ribi Immůnochem Research), Titermax (CytRx), toxiny, toxoidy, glykoproteiny, lipidy, glykolipidy, stěny bakteriální buňky, podjednotky (bakteriální nebo virové), karbohydrátové podíly (mono-, di-, tri-, tetra-, oligoa polysacharidy), různá složení liposomů nebo saponiny. K přípravě imunogenní látky mohou být s konjugátem použity kombinace různých adjuvans.

• ·

Přesná složení kompozice budou záviset na jednotlivém konjugátu, na druhu, který má být imunizován a na cestě podání.

Takové kompozice jsou vhodné pro imunizování kteréhoIcolŤv—žú^očŤcha^T^náchytnélro^k^akteriá^n^n^b^^vTřove infekci, jako jsou například hovězí, ovčí, kozí, koňské, zaječí, prasečí, psí, kočičí a ptačí druhy. Mohou být imunizována domácí i divoká zvířata. Lidé mohou být těmito konjugovanými kompozicemi také imunizováni.

Způsobem^óďáváňinmuže^být kterýkoli-v vhodný způsob a může se měnit v závislosti na bakterii nebo viru, na živočichu, který má být imunizován a na jiných okolnostech. Přednost se dává parenterálnímu podání, jako například subkutánnímu, intramuskulárnímu nebo intravenóznímu podání. Nejvíce se preferuje subkutánní podání. Může být použito také orální podávání, mezi které se zahrnují orální dávkové formy, které jsou enterálně povlečené.

Rozvrh podávání se může měnit v závislosti na bakteriálním nebo virovém patogenu a na živočichu, který má být imunizován. Živočichové mohou dostat jednu dávku nebo mohou dostat další booster dávku nebo dávky. Pro trvalou ochranu mohou být použity každoroční boostery. K počátečnímu vyvolání protilátkové odpovědi jsou zejména preferovány tři dávky ve dnech 0, 7 a 28.

Příklady provedení vynálezu

Dále zařazené příklady nemají v úmyslu jakýmkoli způsobem omezit rozsah vynálezu.

se βe e e

•· •· •· · •v • ·· • · • · • · · · • ·

Příklady

Příklad 1

Způsob přípravy a separace polysacharidových hydrolyzátů

Obr. 2 ukazuje separační profil kapsulárních polysacharidů sérotypu 8 druhu Streptococcus pneumóniae na koloně BioGel P-10 po kyselé hydrolýze (O,5-M kyselina trifluoroctová, teplota 100 °C, doba- 20 minut). Výsledkem jsou rozeznatelné oligosacharidy opakujících se jednotek od jedné ďo~osmi— čřsla—od“j edné—do ~osmi— se -shoduj-í— s—čírsTy------—— opakujících se jednotek, nalezených v každém píku, přičemž pík devět obsahuje oligosacharidy větší než osm opakujících se jednotek. Oligosacharidy odvozené od hyaluronové kyseliny byly použity k normalizaci chromatografického systému.

Relativní velikost opakujících se jednotek u píků 1, 2, 3 a 4 byla stanovena pomocí analýzy HPLC (obr. 3). Obr. 4 ukazuje HPLC retenční doby glukózy,-M-3 maltotriózý, M-7 maltokeptózy a M-10 maltooligosacharidu (Sigma Chemical Co.), používané jako standardy k určení relativní velikosti různých oligosacharidových opakujících se jednotek. Obsah monosacharidu opakující se struktury se stanoví další hyďrolýzou oligosacharidových opakujících se jednotek s 2,0-M kyselinou trifluoroctovou (TFA) při teplotě 100 °C po dobu 2 hodin. Příklad retenčních doby ribitolu, rhamnózy, galaktózy, fukózy a mannózy jako monosacharidových standardů, použitých k určování obsahu karbohydrátu hydrolyzovaných opakujících se jednotek je znázorněn ná obr.

5. Chemická struktura jednoho sérotypu 8 opakující se jednotky byla určena jako β-glukóza (1 ---> 4) β-glukóza (1 ·· ··*·

- 38 ---> 4) α-galaktóza (1 ---> 4) α-glukuronová kyselina (1 «· ---> 4) pomocí analýzy GC-MS a NMR. Toto souhlasí s opakující se jednotkou struktury citované v literatuře (Jones a Perry, 1957).

« é

Obr. 6 až 10 jsou příklady separačnich profilů ·* polysacharfdovycřr~hýďro±yzátů—(-ky-seXina-Jtnifloroctová,______ kyselina octová nebo kyselina fluorovodíková) S. pneumoniae, sérotypů 6B, 14, 19F a 23F na kolonách P-10, P-30 nebo P-60 BioGel.

''íObr. 11 ukazuje separaci enzymem štěpeného polysachari—Ir— —.___________ _____ du (sérotyp 8 štěpený’‘cěTůTá^ZOU^-)^-.·· Separace oligosacharidů__________

C-substance je ukázána na obr. 12.

Příklad 2

fy

Způsob inhibice ELISA k určení imunogenních epitopů oligo sacharidových preparátů

Základní postup využitý pro iliibici ELISA k testováni na přítomnost imunogenních epitopů na oligosacharidových -preparátech a oligosacharidových nebo polysacharidových konjůgátech s.e uvádí dále,. . ..

Pokryje se 96 jamek EIA plotny (NUNC) s 1 gg

Ag) na jamku-za použití 0,05τ:.Μ NA2CO3 pokryvaciho pufru (100 _a i_nk_Ub_Uje při teplotě 4 °C přes noc.

2. 'Ten samý děn Jée přip^y^i^ (například s různými oligosaČfť&iidovými hydrolyzáty) při použití 1 x PBS - 0,01 % Twéen 20 jako ředidla.

v o o «

- Provede se sedminásobné sériové ředění ve zkumavkách (počínaje 25 ug na jamku, až do 0,391 jxgZjamku ve trojím provedení), celkový objem v každé zkumavce·by měl být 175 μΐ po sériovém ředění.

- Připraví se ředění antiséra specifického typu- í-napří-kl-ad—Diagnostic—anti-serum 14, které bylo získáno_____ u králíků, Státům Seruminstitut) v poměru 1 : 1000, v 1 x PBS + Tween. ‘ jí SČr.i, L.r .

-Přidá se 175 μΐ tohoto roztoku dogkaždé zkumavky. Celkový objem*.v každé zkumavce je nyní í 3 50 ·,μ1·.'/Zkumavky se udržují při konstantní teplotě 4 °C přes noc-----------------

3. Dalšího den se blokují EIA plotny, pomocí blokovací- ho pufru (100 μΐ/jamku, 1 x PBS + 1 % BSA) a udržují při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. x; η» >

- ... 1 .»dnntk is

4. Odeberou se plotny, obsah každé, zkumavky.rse tpřenese do jamek (100 ·μ1/jamku) a inkubuje za· teploty ;místnosti-.po dobu 2 hodin, h r · . AÍřři , /¼. <

.··.·.. ·. . . ‘ly . ncc-. t ·< '·. 1 *

5. Třikrát se promyjí plotny promývacím.roztokem (0,01 % Tween + 1 x PBS). ·..· - · pr© U ϊ á .1/ ťízti·· , . _ř, ... · ... .Lz.uhogc· ’.n i ‘ícicop.

6. Připraví se ředění konjugá;tu>kOZ.í? ant.ikráličíjrCnebo antj.-druhových sérotypů specifického; .séraxpoužitého, ,γ bodě ) ;IgG alkal-ijcKé }fosfatázy ..(TAGO) ‘V lj x yPBS, + < 1 %íTween pufru (100 μΐ/jamku), v>ypoměru <1 p:.· ,150.0' a'.yinkubuje .pří ,...., teplotě místnosti po dobu.·⁵² rhodín·.„ cpát uč ival*'. · túci j. *;.?)bylv oi t-n ·*

Ol'·. ⁷· Čtyřikrát se promyjí plotny promývacím roztokem a oklepe se přebytečná kapalina.

• ··

8. Rozpustí se substrátové tablety alkalické fosfatázy (#104 - Sigma) v diethylenaminovém (DEA) pufru, hodnota pH =9,98, 5 ml/tabletu, 100 μΐ/jamku.

___________________________ ________________________________________________.__________,______________________________;________ ______________________

9. Inkubují se plotny v temnu a odečte se absorbance při vlnové délce 405 mm každých 15 minut.

V tomto testu mohou být použita různá komerčně a laboratorně připravená antiséra, zahrnující séra, která

- -----------vytvářejí—myši-_r krysy, králíci, kozy, prasata, opise----— paviáni a lidé, na které však výčet není omezen.

Obr. 13 ukazuje výsledky inhibice ELISA při použití myšího antiséra ke konjugátu proteionový nosič - oligosacharidy sérotypu 8, Streptococcus pneumoniae (2 až 4 opakované jednotky kondenzované při použití EDC k toxoidu tetanu). Inhibice byla testována s opakujícími se jednotkami 1, 2, 3, 4, 6 a 8+ oligosacharidů typu 8 (0,5 M kyseliny trifluoroctové, teplota 100 °C, 20 minut příprava) a polysacharidy typu 8. Z těchto výsledků může být vidět, že opakující se ______________________jednotka 1 (řetězec se 4 monosacharidy) neobsahuje________________ imunogenní epitop. Opakující se jednotka 2 (řetězec s 8 monosacharidy) byla schopna inhibovat protilátky, vázané na ELISA plotnu, co udává, že obsahuje imunogenní epitop. Molekulová hmotnost opakující se jednotky 2 byla určena pomocí FAB-MS analýzy v hodnotě 1365. Toto dobře koreluje s teoretickou molekulární hmotností 8 sacharidů. Opakující se jednotky 3, 4, 6, 8+ a celý polysacharid také inhibovaly protilátky vázané na ELISA plotnu. Opět tak udávaly, že na těchto oligo/polysacharidech byly přítomny imunogenní epitopy.

- 41 Tabulka 3 ukazuje podobné výsledky, zjištěné za použití králičího anti-S. pneumoniae sérotypu 8 specifického séra (Statems Seruminstitut). Opakující se jednotka 1 neinhibuje zřetelně vazbu, opakující se jednotky 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8+ a celý polysacharid inhibují vazbu.

Inhibice ELISA byla také používána k určení přítomnosti imunogenních epitopů na oligosacharidech, připravených při použití různých postupů hydrolýzy na různých polysacharidech. Tabulka 4 ukazuje výsledky s metodami používanými

----------podle dosavadního stavu techniky, například kanadský patent---------č. 2 052 323, původce Porro, k hydrolyzování polysacharidu

S. pneumoniae sérotypu 6 (0,01 M kyseliny octové, teplota

100 °C, doba 30 hodin). Celý polysacharid blokoval vazbu při nízké koncentraci antigenu (účinný při koncentraci 0,39 μg), zatímco hydrolyzát kyseliny octové neblokoval. Je třeba povšimnout si, že původci tohoto vynálezu nemohli separovat hydrolyzovaný preparát podle velikosti, protože byl karamelizován.

Původci tohoto vynálezu zjistili, že různá hydrolyzační č: inid1a (například kyselina trif1uoroctová), doba redukce________________________ a teplota vytvářejí oligosacharidy s imunogennějšími epitopy, jak je ukázáno v tabulce 5. 0,5 M kyseliny trifluoroctové, teplota 70 °C a doba 1 nebo 2 hodin hydrolyzování účinně inhibují vázání protilátky při 3,13 μg koncentraci, avšak při čtyřhodinové přípravě tomu tak není. Také tabulky 6 a 7 ilustrují vliv doby přípravy 6B oligosacharidů s imunogenními epitopy nebo bez imunogenních epitopů.

Dvouhodinová příprava s kyselinou octovou blokuje vázání protilátek (při koncentraci 3,13 μg), přípravy po dobu 24 a 48 hodin toto neblokují. Podobně příprava s kyselinou trifluoroctovou po dobu 1,5 hodiny účinněji blokuje vázání » fll než příprava po dobu 3 :hodin.

Jak je ukázáno v·tabulce 8, /hydrolýza sérotypu 14 S. pneumoniae v 0,5 M kyselině trifluoroctové při .teplotě·70 °C po dobu 7 hodin, jak bylo zjištěno při. dosavadním.;stavu techniky (Porro, kanadský,patent č 2 052 323), není výhodná. Lepší-pro—př-íprav_u_imunogennich 14 oligosacharidů je snížená molární koncentrace kyseliny trifluoroptoyé (například 0,1 M). - i - . >·.·,. _; . Tabulka! 9. ilustruje důležitost výběru oligosacharidů, které obsahují imunogenní epitopy, pro kondenzaci k nosiči. Struktura opakující se jednotky 3 oligosacharidů·sérotypu 14 nemůže inhibovat vázání protilátky. Avšak opakující se jednotky 4 a 8 obsahují imunogenní epitopy a účinněiblokuji vázání protilátky.

Tabulka 10 ukazuje vliv koncentrace hydrolyzátu a’reakčního doby na přípravu 14 oligosacharidů, obsahujících imunogenní epitopy. Imunogenní epitopy se při sedmihodinové hydrolýze pomocím kysel iny / tr if luproctoyéi zachova j í-,r< ale při hydrolýze po dobu 24 hodin jsou zničeny.

Tabulka. 1·1·λilustu^je důležitost'použití^optimálních tepelných podmínek pro vytváření ol-igosacharidů’. 19F., obsahujících imunogenní epitopy.- -Imunogenníaepitopy se_t zničí hydrolýzou prováděnou kyselinou chlorovodíkovou při teplotě místnosti , ale^j^spu zachovány;,-když? hydrpJýza_j- se· provádí při teplotě 70 .3>C; ,; ť* , , '<.>' .-.íiC'^-. se potzrčU pocc ·-’ i. ..x . V pH váže n~í Iwrvu .

Jak jei ukázánox ví tabulce 1'2*, ·.· slabá-inhibice vázání protilátky se pozoruje- u hydrolyzátů 23.F. polysacharidů s 0,25-M kyselinou f-luoroctovou při teplotě 70 °C po dobu

J J

- 43 3' í 3 hodin (Porro, kanadský patent č 2 052 323). Tabulka 13

- ukazuje vliv času na vytváření /imunogenních-23-oligosacharidů. Oligosacharidy, vytvářené (hydrolýzou(pomocí 0,1 M kyseliny trif luoroctové , _přijteploté 7.0 °C po.idobu. 3 thodin, ' inhibuji vázání protilátky.,* avšak oligosacharidy.’připravené

Γ” hydrolýzou po dobu 5 hodin nepůsobí inhibičně.'Tabulka 14 — _p ukazuge-přítomnost—imunogenních o 1 igo~sachar i”dů po hydrolyže g 0,5 M kyselinou trifluoroctovou při teplotě 70 °C po dobu minut nebo při hydrolýze 5 molární kyselinou octovou při teplotě 70 °C po dobu 5 hodin. Tyto hydrolyzáty účinně ______inhibuji do koncentrace 0,78 ^g. . cty__________ r—-- Tabulka 15 ukazuje užitečnost inhibice ELISA k rozpoznání imunogenních oligosacharidů Neisseria meningitidis sérotypu C. Hydrolyzáty připravené pomocí octanu sodného blokuji vázání protilátky stejně účinně, .jako celý polysacharid. n,) . ‘ ·. » ^!' z ceku hy*ta:a.Uu j, . -¹ z «ξ Příklad 3 hxůtnta pH *',ů.

i ' . . < .. «.c díů.u 1 n:?d*.ný, ?

Způsob acidifikace karbohydrátových . častí pro >karbodi’imidovou kondenzaci „ 6 r* i? t__ · ►cr.jcmth’ ř itinu ί·~Η>.·χ’»·· Připraví se . kationměničová .kolona» (-FishernScientif ic) s náplní Rexyn 101 (H, organická kyselina) a promyje —it. deuterovanou vodou (dH₂O) . Polysachařidové a oligosacharidové vzorky,, rozpuštěné v deuterované <.vgděit(hodnota/pH.né voce neutrální) cseKvedou tuto kolonou raťtzachycujíi· rychlostí i jedné kapky .za 6 ,'sekund. Acidifikace se potvrdí pomocí indikátoro*” vých tyčinek, u kterých se hodnota pH váže na barvu.

Přebytečná deuterovaná .voda se použije <k· promytí -kolony.

ΐ»

Acidif ikované f rakce se. .spo j í a lyof il-izuj í- <<pro^f použití při kondenzačních reakcích. / e

- 44 Obr. 14 popisuje štěpení prováděné pomocí kyseliny trifluoroctové mezi β-D-Glcp (1 ---> 4) β-D-Gal oligosacharidové struktury. Jako výsledek vznikne aldehyd a hydroxylová skupina. Další oxidací aldehydu vzniká karboxylová skupina. Když tato látka projde kationoměničovou— _________kolonou, vytvoří se skupina C00~. ___________ _ ________

Příklad 4

Způsoby kondenzace a kvantitativní testy

Způsob kondenzace karbodiímidu . (EDC)

Ve 2 ml 0,1-molárního dihydrogenfosforečnanu draselného se rozpustí vzorek ionem nabitého karbohydrátu (polysacharidu nebo oligosacharidů) (například 3 mg) a EDC (3 mg) v poměru 1:1. Pomocí 1-normálního roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové se udržuje hodnota pH 4,5. Tato směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Potom se přidá nosič (3 mg) k EDC aktivovaným karbohydrátům a dále míchá při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Tato reakce se zastaví přidáním 200 μ1 10 % hydrogenuhličitanuamonného. Vzniklá směs se dále míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny.

Výsledný konjugát se dialyzuje proti deuterované vodě přes noc za použití dialyzační trubice s hranou molekulární hmotnosti (MWCO) 50 000.

Konjugáty se lyofilizují a potom testují pomocí Lowryho proteinu, kyseliny fenolsírové, kyseliny sialové a testují na fosfor, aby se stanovilo složení (způsoby jsou popsané _

• ♦·

- 45 níže). Konjugáty připravené těmito kondenzačními metodami mají obvykle poměr karbohydrátu a nosiče 1:2.

Testování pomocí kyseliny fenolsírové pro kvantitativní stanovení karbohydrátů

Rěakční“'cTniÚTo'^-: 5%'roztOk-feno-l-u---[-5 7-5—m-l--kapa-l-ného--------------fenolu (90%) přidaného do 94,5 ml destilované vody].

Standard : Zásobní roztok glukózy, 1 mg/ml. Pro standardní křivku se připraví 2 až 60 pg/200 μΐ vzorku pufru.

Postup: Převzato z publikace Handbook of Micromethods for the Biological Sciences, G. Keleti a W. H. Lederer (vyd.), 1974, Van Nostrand Reinbold Co., New York.

1. Umístí se 200 μΐ vzorků do velmi čistých zkumavek.

2. Přidá se 200 μΐ fenolového činidla.

___ 3. Rychle se přidá 1 ml koncentrované kyseliny sírové.

4. Reakční směs se nechá dobře vířit.

5. Reakční směs se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

6. Při teplotě místnosti je barva stabilní 2 až 30 hodin.

7. Odečte se absorbance při vlnové délce 490 mm. Slepý vzorek se zkumavkou obsahující pouze vodu se označí jako • 9

- 46 vzorek # 1.

Kvantitativní stanovení pomocí kyseliny sialové

Reakční činidla :

a“) 6” g “oktahydrátu—sí-ranu -hl-i-n-i-tého- [-A-l-₂ (-SO-₄-) 3-.18H₂0 ]—. se rozpustí a doplní destilovanou vodou na objem 20 ml.

b) 1 g p-dimethylaminobenzaldehydu se rozpustí a doplní 6-normální kyselinou chlorovodíkovou na objem 20 ml. (Uloží se ve tmavé lahvičce v chladničce)·

Standard : N-acetylneuraminová kyselina v koncentraci

0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 a 50 gg/μΐ, celkový objem je 350 μΐ. Použije se destilovaná voda k doplnění na 350 μΐ.

Postup: 1

1. Použije se 200 μΐ vzorku duplicitně. Doplní se destilovanou vodou na objem 350 μΐ.

2. Přidá se 700 μΐ reakčniho činidla A do každé zkumavky a vše se protřepe.

3. Přidá se 350 μΐ Ehrlichova reakčniho činidla B.

4. Zakryjí se všechny zkumavky mramorovou destičkou.

5. Zkumavky se zahřívají po dobu 30 minut na teplotu 100 °C při použití modulu Pierce Heatings.

• · ·· · • ·

6. Zkumavky se rychle ochladí na teplotu místnosti na ledové lázni.

7. Odečte se optická hustota při vlnové délce 530 nm.

Testy na fosfor- .

Reakční činidla:

a) 2,5% molybdenan amonný

b) 10% kyselina askorbová

c) kyselina chloristá a

d) 1-mmolární fosforečnan sodný jako standard.

Postup: Převzato z G. Rouser, A. N. Siakotos a S. Fleischer, Lipids 1, 85-86 (1996).

1. Vzorky a standardy (0, 25, 50, 100 a 200 μΐ, 25 až 200 nmol) se umístí do čistých zkumavek.

2. Vzorky se suší v ohřívacím bloku v digestoři po dobu 5 minut při teplotě 180 °C.

3. Do každé zkumavky se přidá 450 μΐ kyseliny chloristé, každá zkumavka se zakryje mramorovou destičkou a zahřívá po dobu 30 až 60 minut na teplotu 180 °C.

4. Po ochlazení zkumavek se přidá 2,5 ml deuterizované vody.

·· ···· • ·

5. K reakční směsi se přidá 0,5 ml molybdenanu amonného a ihned míchá vytvářením víru.

6. K reakční směsi se přidá 0,5 ml kyseliny askorbové a ihned míchá vytvářením víru.

_________________7___Zkumavky—se—umíst-í-po-dobu- -l-S-m-i-nut-na—vodnou—lázeň o teplotě 95 °C.

8. Po ochlazení zkumavek se odečtěte absorbace při vlnové délce 820 nm.

—.9. Před odečtením-mohou být vzorky nechány několik hodin.

Testování Lowryho proteinu

Reakční činidla:

a) 2 % (hmotnost/objem) uhličitanu sodného v 0,1-molárním roztoku hydroxidu sodného (1 litr)

b) 0,5% síran měďnatý v 1% roztoku citrátu sodného (100 ml)

c) Folin-Ciocalteuovo fenolové činidlo (2 x)

d) hovězí sérový albumin (BSA) (1 mg/ml)

Postup:

1. Připraví se standardní křivka, která sestává z 0,

12,5, 25, 50, 100 a 200 μg BSA v konečném objemu 200 μΐ.

• «·

2. Vnese se vzorek neznámého proteinu do 200 μΐ deuterované vody.

3. Smíchají se reakčni činidla A a B v objemovém poměru 50:1 a přidají se 2 ml do každého vzorku.

4. Míchá se vířením a vše nechá stát při teplotě místnosti po dobu 10 minut.

5. Folin-Ciocalteuovo fenolové činidlo se zředí v poměru 1:1 deuterovanou vodou a přidá v objemu 200 μΐ do každého “vzorku.

6. Vše se míchá vířením a ponechá stát při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

7. Odečte se absorbace při vlnové délce 660 nm.

Kondenzační způsob jodistanové oxidace

Vzorky polysacharidu nebo oligosacharidu (například 3 mg) se rozpustí ve 3 ml čerstvě připraveného 60-milimolárního jodistanu sodného v 50-milimolárním octanu sodném. Tento přípravek se potom míchá přes noc při teplotě 4 °C.

K zastavení reakce se přidá ethylenglykol (300 μΐ). Tato směs se potom míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a poté lyofilizuje. Vzorky rozpuštěné v 1,5 ml 0,03-molárního hydrogenuhličitanu amonného (hodnota pH = 8,0) se vedou přes kolonu s náplní P-2 Bio-Gel. Testy kyselinou fenolsírovou nebo kyselinou sialovou se použijí k určení frakcí, obsahujících jodistanem redukovanou formu vzorků, a tyto vzorky se potom lyofilizují.

* · · ··

- 50 Obr. 15 ukazuje separaci redukované polysacharidové frakce (23-valentní polysacharidová vakcína - Pneumovax^R 23, Měrek Sharp & Dohme) frakce. Obr. 16 a 17 ukazují separaci redukovaných oligosacharidů sérotypů 6B a 19F druhu Streptococcus pneumoniae.

mg redukovaného sacharidu a 3 mg nosiče se rozpustí ve 3 ml 0,1-molárního dekahydrátu tetraboritanu sodném, hodnota pH = 8,9. Do této směsi se potom přidá natriumkyanborhydrid (H + zdroj) a vše se míchá po dobu 48 hodin při teplotě 50 °C. Tato reakce se zastaví úpravou hodnoty pH na 3 až 4 pomocí 80% kyseliny octové. Vzniklý konjugátse potom dialyzuje po dobu 48 hodin proti deuterované vodě (2 až 3 výměny deuterované vody) při použití dialyzačni trubice s 50 000 MWCO.

Konjugát se lyofilizuje a složení konjugátu se určí testováním Lowryho proteinu a testy pomocí kyseliny fenolsírové, kyseliny sialové a testem na fosfor. Konjugáty připravené použitím těchto kondenzačních způsobů mají poměr karbohydrátu a nosiče od 1:5 do 1:10.

Obr. 18 popisuje jodistanovou a EDC kondenzační chemickou reakci.

Příklad 5

Konjugované nosiče

Příklad 4 popisuje způsoby používané k přípravě imunogenních oligosacharidových/polysacharidových konjugátů ze slabé imunogenních nebo neimunogenních polysacharidů.

• ·· · • · · ·· ····

Toxoid tetanu se čistí pro použití jako nosič sloupcovou chromatografií. Tento purifikovaný toxoid vyvolává vysoké hladiny isotopů IgM (například 50 μg/ml myšího séra) a IgG (například IgG, 100 μg/ml séra, IgG_2a, μg/ml séra, IgG^, 68 μg/ml séra, a IgG₃, 105 μg/ml séra ) .______...____________

Příklad 6

Způsob stanovení imunogenních epitopů na oligosacharidovém/ polysacharidovém konjugátu

Použije se inhibice ELISA, jak je popsána v příkladu

2. Pomocí inhibice ELISA se potvrzuje přítomnost imunogenních epitopů na mono-hapten 8-oligosacharidovém konjugátu toxoidu tetanu. Tento konjugát inhibuje anti-8 sérum, které se váže k 8 polysacharidu, pokrývajícímu ELISA plotnu (obr. 19). Volný toxoid tetanu vázání neinhibuje. Je také prokázána přítomnost imunogenního 8 oligosacharidů na di-haptenových konjugátech 6:8, 14:8 a 19:8. Tento obrázek ilustruje reprodukovatelnost kondenzačních postupů podle tohoto vynálezu, protože konjugáty 8=mono-haptenové a di-haptenové blokovaly vázání protilátek stejně, což vyjadřuje, že každý konjugát obsahuje ekvivalentní množství 8 oligosacharidů.

Tabulka 16 ukazuje výsledky inhibice ELISA, když se jako inhibující antigeny použijí 6B polysacharid, 6B oligosacharidy, konjugát 6B:8-di-hapten-oligosacharidu a toxoidu tetanu a samotný toxoid tetanu. Toxoid tetanu neinhibuje vázání anti-6B-séra k 6B-polysacharidu, pokrývajícímu ELISA plotnu. Volný 6B-oligosacharid nebo polysacharid inhibuje vázání. Konjugát 6B:8-di-hapten-oligosacharid-TT také inhibuje vázání. To potvrzuje přítomnost imunogenních 6B epitopů na kogugátu 6B:8-di-hapten-TT.

Podobně konjugát 14:8-di-hapten-TT inhibuje anti-14 sérové vázáni-,_co_dokazuje přítomnost imunogenních epitopů sérotypu 14 (tabulka 17). Za povšimnutí stojí, že při vysokých koncentracích existuje nespecifická inhibice samotným tetanovým toxoidem. Původci tohoto vynálezu zjistili, že toto je artefakt anti-14 v tomto testu.

K toxoidu tetanu byly kondenzovány různé oligosacharidové frakce 23F hydrolyzátu. Všechny imunogenní epitopy, které obsahoval sérotyp 23F, jsou uvedeny v tabulce 18.

Imunogenní epitopy oligosacharidů N. meningitidis (příprava s NaOAc) byly zachovávány podobné, když kondenzovaly k toxoidu tetanu (viz tabulka 19).

Příklad 7

Způsob stanovení hladin isotopů protilátek, vyvolaných thymus independentními (TI) a thymus dependentními (TD) antigeny

Základní postup k měření hladin protilátkových isotopů je založen na kvantitativním stanovení isotopů IgM, IgG a IgA, vyvolaných různými konjugáty.

1. Pokryji se EIA plotny (NUNC, IMMUNOSORB) 1 Rg/jamku Ag v 0,05-molárním pufru uhličitanu sodného a hydrogenuhličitanu sodného, hodnota pH = 9,5, v objemu 100 μΐ/jamku.

·♦ ····

2. Inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C.

3. Další den se blokují plotny se 100 μΐ/jamku blokovacího pufru (1 x PBS + 1 % BSA) a inkubuje se za teploty místnosti přibližně během 1 hodiny.

4. Rozředí se myší sérum v pracovním pufru (1 x PBS + 0,1 % Tween) v poměru 1:25, přidá se 100 μΐ/jamku do příslušné jamky a udržuje po dobu 2 hodin při teplotě místnosti.

5. Plotny se třikrát promyjí promývacím pufrem (1 x PBS + 0,05 % Tween) a přebytečná kapalina se odklepe poklepem ploten o pracovní desku stolu.

6. Rozředí se EIA Grade Mouše Type (králičí anti-myší IgM, IgG-^ IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ a IgA, Bio-Rad) v pracovním pufru v poměru 1:2 při 100 μΐ/jamku a inkubuje 2 hodiny při teplotě místnosti.

7. Plotny se třikrát promyjí promývacím pufrem.

8. Rozředí se konjugát kozí anti-králiči IgA alkalické fosfatázy (TÁGO) v pracovním pufru v poměru 1:1500 při 100 μΐ/jamku a inkubuje během 2 hodin při teplotě místnosti.

9. Plotny se čtyřikrát promyjí promývacím pufrem.

10. Připraví se enzymový substrát za použití tablet Sigma # 104 Alkaline Phosphatase Substráte (jedna tableta/5 ml 10% dietanolaminového substrátového pufru) při 100 μΐ/jamku a inkubuje v temnu při teplotě místnosti a odečet se provádí každých 30 minut při vlnové délce 405 nm.

11. Přepočítá se odečtená absorbance na μ9 protilátek/ml séra za použití křivek dávka-odpovéď, vytvořených z ELISA odpovědí, králičích anti-myších isotopů protilátek na různé koncentrace imunoglobulinů zvláštních myších—t-říd—a—podtříd.LZymed Labs . Inc. ). _______________

Tabulka 2 ukazuje protilátky vyvolané u myší po imunizaci oligosacharidovými a polysacharidovými konjugáty S. pneumoniae sérotypu 8. Pouze 8 oligosacharidový konjugát vyvolává IgG protilátky všech isotopů, nekonjugovaný oligosacharid není imunogenní, polysacharid a polysacharidový konjugát vyvolává protilátky isotopů typické pro TI odpovědi (převážně isotopy IgM, IgA a IgG₃). Adjuvans není nezbytné k vyvoláni IgG isotopů s konjugátem oligosacharid-toxoid tetanu podle tohoto vynálezu. Konjugáty obsahující relativně malé oligosacharidy, hapteny o 2 až 4 opakujících se jednotkách (8 až 16 sacharidů), vyvolávají nejlepší protilátkové odpovědi, jak je změřeno přímou metodou ELISA.

Pracovní postup přímé ELISA

1. Použije se NUNC Maxisorp Immunoplate.

2. Rozředí se pokrývači antigen v uhličitan-hydrogenuhličitanovém pufru na 1,0 μg/100 μΐ. Použijí se skleněné zkumavky, protože antigen by se k plastické hmotě přilepil.

3. Přidá se 100 μΐ do každé jamky plotny a uloží přes noc při teplotě 4 °C.

4. Promyje se třikrát v PBS s 0,05 % Tween a přebytečné

PBS se odklepe poklepem ‘na Kimwipes papírové ručníky ,

5. Přidá se 100 μΐ/jamku blokovacího.činidla (1 x PBS

- 1 % BSA) a inkubuje při teplotě místnosti po dobu 60 minut.

----,—6-.—P3zov-ede_se_tr_o_jnásobné promytí jako v bodě 4. _______ . \ f - ^f

7. Přidá se testovaná protilátka příslušně zředěná PBS

- 0,01 % Tween v množství 100 μΐ/jamku a inkubuje při teplotě místnosti .po dobu ,90 minut. < ' > ·

·.· ' · < r jí ii .i ' ' 1 . - ^A .

8. Provede se trojnásobné promytí jako v bodě 4.

9. Rozředí se alkalickou fosfatázou konjugovaný anti-myší Ig (TÁGO Cat # 4653) PBS Tween v poměru 1:1500, přidá se 100 μ1/jamku a inkubuje v temnu.po dobu 90 minut.

r

10. Provede s.e trojnásobné promytí jako v bodě 4.

11. - Přidá , se .Sigma, 10,4 fosf atázový rsubstrát ( tablety s obsahem dinatrium-:p-nitrofenylfosfátu) v množství 100 μΙ/jamku. Přidají- se 2 tablety (5 mg/tabletu) substrátu do 10 ml dietanolaminového pufru. Vše se udržuje v temnu, protože substrát je světlem inaktivován.Inkubace se provádí za teploty místnosti v temnu. Vývoj: reakce-je různý v závislosti,na_nprotilátce. Absorbance „může: být odečítána přístrojem Microelia Auto Reader< (405 nm) iy „přibližně 30 minutových intervalech. ··.·' c · , iaría-i.'· -<:

, · - - rh f rakcí '· - '

Výsledky v tabulce 20 ukazují srovnání- hladin IgGj^ a IgG₃ u myší imunizovaných-8-konjugátem ve věku 3 týdnů a ve věku 8 týdnů., Signifikantní hladiny IgG^ byly vyvolány

- 56 8-oligosacharid-TT-konjugátem u myší imunizovaných ve stáří týdnů (0,273 μg/ml) a ve stáří 8 týdnů (0,700 μg/ml). Příznačné pro TD odpověď je, že ajduvans (například FCA), zvyšuje specificky hladinu IgG^ (1,22 μg/ml). 8-Polysacharid indukuje nadměrnou expresi IgG₃ a nízkou hladinu IgG_lz typickou pro polysacharidovou TI odpověď. 8-Polysacharíd-TT _wř konjugátT,” ’pokTádáný“ ž^á' TD“antTgen·“indukuje -pouze- ní-z-ké-----hladiny IgG_T s nadměrnou expresí IgG₃, charakteristické pro TI polysacharidové antigeny. Tedy adjuvans v kombinaci s 8-polysacharid-TT-konjugátem nezvyšuje hladiny IgG_lz ale zvyšuje protilátky IgG₃ (jako TI odpověď), O některých polysacharidových konjugátech je známo, že vyvolávají kombinace diagramů ŤI a TD protilátkových odpovědí (Stein, — 1992, Stein, 1994).

Obr. 20 zobrazuje IgG protilátkové isotopy vyvolané * 8:14 di-hapten-oligosacharid-TT-konjugátem na 8 polysacharid. Podobně jako 8-mono-hapten konjugát, tento di-hapten konjugát může indukovat mnohem vyšší hladiny specifických IgG₃ protilátek (TD odpověď), než 8-polysacharidový konjugát nebo 8-polysacharid samotný. Je prokázána nadměrná exprese --------------------- IgG₃ isotopu na polysacharidový imunogen. Kontrolním myším se injektuje samotný toxoid tetanu.

Výsledky, získané s oligosacharidovými konjugáty sérotypu 14, jsou ukázány v tabulce 21. 14-01igosacharid-TT-konjugát, připravený hydrolýzou 0,1-molární kyselinou trifluoroctovou, vyvolává IgG^, G_2a, G_2b a G₃ isotopy. Dávka 1 μg je nejvíce imunogenní. Oligosacharid-TT-konjugáty, připravené za použití karbohydratovych frakci separovaných píků 7 a 8 z hydrolyzátu s 0,5-molární kyselinou trifluor€ octovou, vyvolávají nižší hladiny IgG isotopů. Menší oligosacharidy (píky 4 a 5 preparátu získaného s 0,5-molární

- 57 kyselinou trifluoroctovou) v konjugované formě vyvolávají nízké hladiny IgG isotopů. 14-Polysacharid-TT-konjugát vyvolává relativně vysoké hladiny IgG·^ isotopů. Nicméně sérum z myší, očkovaných tímto polysacharidovým konjugátem, nebylo imunoprotektivní (jak bude ukázáno v příkladu 8, tabulka 24). Zde se objevuje požadovaná prahová hladina IgG přOtiráťkdvých“^_řsotopů- která“zajišťuje—i-munoproteke-i---------k patogenu sérotypu 14. Nekondenzovaný 14-polysacharid, samotný toxoid tetanu nebo 0,9% roztok chloridu sodného jako negativní kontrolní sérum, všechny vykazují nízké hladiny všech isotopů, ekvivalentní k hladinám normálního myšího séra (NMS).

Obr. 21 ukazuje zvýšenou hladinu protilátky IgG^ isotopu na 14-polysacharid, vyvolanou 8:14 di-hapten-oligosacharidovým konjugátem, typickou pro TD odpověď. 14-Polysacharid indukuje nadměrnou expresi IgG₃ (TI odpověď), samotný 14-oligosacharid není imunogenní. Nekondenzovaný toxoid tetanu slouží jako negativní kontrolní stanovení.

Jako u jednotlivých lidí, různé skupiny myší prokázaly variabilní vnímavost na oligosacharidové a polysacharidové konjugáty. U určitých skupin myší byly pozorovány změny hladin u různých IgG protilátkových isotopů. Obr. 22A ukazuje výsledky ze skupiny dobrých respondentů myší, které vytvářejí IgG-^ na 14-polysacharidový konjugát (jako TD odpověď). Přesto však 14-oligosacharidový konjugát vyvolává vyšší hladiny IgG-^. Tento konjugát také vyvolává výrazné hladiny IgG_2b (0,955 μg/ml = oligosacharidový konjugát, 0,139 μg/ml = polysacharidový konjugát). Tato odpověď je řízena TD, protože FCA zvyšuje tyto IgG_2b protilátky, viz obr. 22B (1,509 μg/ml = oligosacharidový konjugát, 0,474 μg/ml = polysacharidový konjugát).

•	····	•	··	·· ····
• ·	•	• ·	• ·	• · ·
•	···	•	* ·	• · ·
•	• ·	•	•	• ·	··· ♦
•	•	•	•	•	• ·
		• Φ 9!	··	·· ·

- 58 Schopnost oligosacharidových konjugátů podle tohoto vynálezu vyvolat větší TD protilátkové odpovědi než polysacharidové konjugáty není omezena na imunogeny S. pneumoniae. Oligosacharidové konjugáty druhu Neisseria meningitidis skupiny C vyvolávají větší hladiny protilátek IgGj^ isotopu (“7 70*l^—jxg/ml )~než“polysachar-iďový konjugát-----(3,60 μg/ml) nebo polysacharid samotný (0,162 μg/ml), Zajímavé je, že množství isotopu IgG₃, indukovaného oligosacharidovými konjugáty, je také větší (13,11 μg/ml = oligosacharidový konjugát, 9,84 pg/ml = polysacharidový konjugát, 3,81 μg/ml = polysacharid samotný).

Příklad 8

Baktericidní a opsonizačni testy k měření imunoprotektivních protilátek vyvolaných konjugáty

Základní použité baktericidní a opsonizační testy jsou takové, jak je uvedeno dále.

----------------------Baktericidní test ... ................

1. Naočkuje se plotna krevního agaru požadovanými gramnegativními bakteriemi, opatřenými z Američan Type Cultur Collection a inkubuje přes noc při teplotě 37 °C.

2. Příští den se vezme izolovaná kolonie a naočkuje se v 1,0 ml prostředí Todd-Hewitt Broth (THB) kvasinkovým extraktem (YE) do sterilní testovací zkumavky. Vše se udržuje přes noc při teplotě 37 °C.

3. Další den se změří optická hustota naočkovaných

- 59 bakterií při vlnové délce 420 nm. Jako slepý vzorek se použije prostředí s THB + YE.

4. Na sterilní 96-jamkové plotně s plochým dnem se přidá do každé jamky sterilní 2,5mm skleněná kulička.

5“ Do~kazlié^-j'amky^—se—přidá--------------------

a) 5 μΐ bakterií,

b) 10 μΐ myšího séra, které má být testováno.

Vše se inkubujě během 1 hodinypři teploté37°C—

Poznámka : Body 5 a 6 se provádějí trojnásobně.

6. Po 1 hodině inkubace se provede ředění exogenního komplementu (například Low Tox Rabbit Complement, Cedarlane) sterilně v THB + YE v poměru 1 : 20 a přidá se 50 μΐ/jamku. Poté se inkubujě během 1 hodiny při teplotě 37 °C.

________7. Po úplné inkubaci se 50μ1 alikvot rozprostře na plotny krevního agaru pomocí skleněného nanášedla.

8. Zabalí se všechny plotny krevního agaru do plastikových sáčků a inkubují po dobu 12 hodin při teplotě 3 7 °C.

9. Další den se spočítají kolonie tvořící plaky.

Opsonizační test

1. Naočkuje se plotna krevního agaru požadovanými

- 60 gramnegativními nebo grampozitivními bakteriemi (opatřenými z Američan Type Culture Collection) a inkubuje se přes noc při teplotě 37 ^QC.

2. Příští den se vezme izolovaná kolonie, smíchá se s 1,0 ml prostředí THB + YE ve sterilní testovací zkumavce a^-inkubuje^-přes— noc—při—teplotě—3 7-—C------

3. Další den se připraví 100 jedn./ml sterilního heparinu.

4. Aplikuje se intravenózní injekcí 100 μΐ sterilního hěparinudo ocasu každé myši ( 5 až“10- myší-)-. Po 10 -minutách se retroorbitálně odebere myším krev do sterilní zkumavky.

5. Změří se optická hustota bakterií při vlnové délce 420 nm, přičemž se použije prostředí THB + YE jako slepý vzorek. (Ke změření optické hustoty se použije spektrofotometru 4040).

6. Na sterilní 96-jamkovou plotnu s plochým dnem se sterilní skleněnou 2,5-mm kuličkou v každé jamce se přidá:

a) 50 μΐ heparinizované krve

b) 10 μΐ séra

c) 5 μΐ bakterií.

Tento stupeň se provádí triplicitně.

7. Plotna se zabalí do tenké folie a inkubuje při teplotě 37 °C v inkubátoru po dobu 1 hodiny na třepačce ·· ····

- 61 (s pomalým pohybem).

8. Po jedné hodině se 50μ1 alikvot rozprostře na krevní agarové plotny pomocí skleněného nanášedla.

9. Zabalí se všechny plotny do plastikového obalu a^—“íhkubuj“í^—^r’i“tepTOtě“37^_oC^_po—dobu—1~2—hodin-;---

10. Další den se spočítají kolonie tvořící plaky.

Jak bylo změřeno opsonizačním testem, o séru z myší, imunizovaných oligosacharidovým konjugátem S. pneumoniae typu 8 , bylo zjištěno,“ že’je imunoprotektivní.'Opsonizace bakterie S. pneumoniae, zprostředkovaná specifickými anti-kapsulárními protilátkami, je nezbytná pro hostitelovu obranu (Saunders a kol., 1993). Tento test je všeobecně považován za spolehlivou indikaci imunoprotektivní schopnosti in vivo. Výsledky testů prokazují, že protilátky na 8-oligo-konjugát velmi redukují růst kolonie tvořící jednotky S. pneumoniae sérotypu 8 na plotnách krevního agaru (tabulka 22). Tato redukce je specifická, protože růst kolonií sérotypu 3 a 6B (použity jako kontroly specifity) nebyl inhibován. Imunizace s nekonjugovanými oligosacharidy nebo polysacharidy (které jsou používány v komerčně dostupných vakcínách proti zápalu plic) nevyvolává žádnou ochranu. Ochrana vyvolaná polysácharidovým konjugátem je mnohem menší (39 % redukce), než ochrana vyvolaná oligosacharidovým konjugátem (98 % redukce). Tyto výsledky prokazují, že 8-oligo-tetanus toxoidový konjugát vyvolává vysoké hladiny imunoprotektivních protilátek proti patogenu

S. pneumoniae, sérotypu 8. Hladina imunoprotektivních protilátek vyvolaná polykonjugáty je nízká.

- 62 8-01igo-konjugát může také vyvolat imunoprotektivní odpověď protilátky u myší, kterým byl předtím podán úplné samotný polysacharid. Myši, očkované 2 dávkami 8-polysacharidu a potom třetí oligo-konjugovanou injekcí, mají ve svém séru imunoprotektivní protilátky (70% redukce kolonii při opsonizačním testu). Jako v předchozích experimentech, —myš-i—dostávag-ící—3_injekce polysacharidů nevyvoláváj í žádné signifikantní množství protektivních protilátek. Oligosacharid specifických sérotypů, kondenzovaný k nosiči proteinu, může být prospěšný jako booster ke zvýšení imunoprotekce vysoce rizikových skupin, skupin bez odpovědi nebo jen s malou odpovědí na 23-valentní polysacharidovou vakcínu.

Původci tohoto vynálezu provedli studii imunogennosti s di-hapten 3 oligo/8-oligo-tetanus toxoidovými konjugáty. Oligosacharidy obou sérotypů se připravují hydrolýzou prováděnou kyselinou trifluoroctovou. Myši, jimž byl aplikován tento multi-haptenový konjugát, vyvolávají imunoprotektivní protilátky na sérotypy 3 a 8 (96 až 99 % redukce kolonií - tabulka 23). 3/8-Polysacharidový konjugát vyvolává malé množstvím imunoprotektivní protilátky (10 až 12 %). Mono-hapten 3-oligo-tetanus toxoidový konjugát, použitý v této studii, se připravuje s oligosacharidy, u kterých bylo určeno inhibicí ELISA, že mají imunogenní epitopy a nejsou schopny vyvolat imunoprotektivní odpověď. Mechanismus, který dovoluje imunitnímu systému odpovědět na epitopy na 3-oligosacharidu v di-haptenové formě je ovšem spekulativní. Nicméně původci tohoto vynálezu předpokládají, že 8-oligosacharidy stimulují klony buněk (například přídatných nebo pomocných buněk), které mohou zvýšit odpověď na epitopy oligosacharidu sérotypu 3.

Původci tohoto vynálezu objevili, že struktura 8-oligosacharidu má aktivitu jako adjuvans nebo aktivitu podobnou jako adjuvans. Relativně jednoduchá struktura opakujících se jednotek 8-oligosacharidu [β-glukóza (1 --->

4) β-glukóza (1 ---> 4) a-galaktóza (1 ---> 4) a-glukonová kyselina] může specificky nebo nespecificky stimulovat/ ak-tl-vovat^—imunf-tní—buňky nebo indukovat receptory nebo faktory ke zvýšení humorálni/buněčné odpovědi na neimunogenní nebo slabě imunogenní polysacharidy/oligosacharidy. Oligosacharidy sérotypu 8 mají adjuvansovou aktivitu v konjugované formě nebo jako přísada do prostředku ve formě vakcíny.

Výsledky opsonizace 14-oligosacharid-TT-konjugátu (0,1-molární TFA preparát - tabulka 24) ukazují dobrou redukci bakteriální kolonie sérotypu 14 (76 %). 14-Oligo-TT 0,5-M TFA preparát vyvolává méně imunoprotektivní protilátky (54 % redukce). Séra z polysacharid-TT-konjugátu, polysacharidů samotného a z toxoidu tetanu injektovaná myším, prokazuji velmi sníženou inhibiční schopnost (18, 2 a 15 %). Sérum z kontrolních myší (0,9 % roztok chloridu sodného a NMS) neprokazují žádnou redukující schopnost.

Di-hapten-oligosacharidové konjugáty také vyvolávají protilátky s opsoninovou aktivitou. Sérum k 8:14-oligo-TTkónjugátu redukuje kolonie tvořící jednotky sérotypu 14 o 65 % (tabulka 25). Tento di-haptenový konjugát je stejně imunogenní jako mono-haptenový 14-konjugát (redukce CFU = 68 %). Sérum z myší, imunizovaných polysacharidovým konjugátem, redukuje CFU málo, o 37 %.

Příklad 9

- 64 tZmaření nosičové suprese a redukce antigenní kompetice

V literatuře byly publikovány redukované odpovědi, za určitých podmínek, způsobené antigenní kompeticí, když byly injektovány mnohočetné antigeny. Výsledky, získané z imunizačních schémat A a D (tabulka 26), se použijí ~k—urěen-í-7—zda—odpověď—na. každou konjugátu podle tohoto vynálezu složku multi-haptenového je stejná jako odpověď vyvolaná jednotlivými mono-haptenovými konjugáty.

Jednotková hmotnost karbohydrátového antigenu monoa multi-haptenových konjugátu podle tohoto vynálezu je ekvivalentní (například poměr CHO k proteinu je roven 1:2 u konjugátů EDC). Forma multi-haptenových konjugátů podle tohoto vynálezu, používající redukovanou celkovou zátěž antigenu, minimalizuje potenciál pro vývoj antigenní kompetice.

Schémata B a E určí, zda první injekce s konjugátem je dostatečná k vyškolení imunitního systému a k vyvolání T dependentní odpovědi, když je posílena nekondenzovaným polysacharidem nebo polysacharidy.

Schémata C a F stanoví schopnost konjugátů podle tohoto vynálezu ke zvýšení imunoprotektivních odpovědí protilátky u myší, které byly předtím senzibilizovány samotným polysacharidem nebo polysacharidy. Jestliže tomu tak je, multi-haptenová vakcina proti zápalu plic, obsahující oligosacharidy sérotypů 3 a 4 může být velmi vhodná ke zvýšeni odpovědi na Pneumovax^R 23 u vysoce rizikových pacientů.

Skupina myší bude očkována 3 dávkami (1., 2., 3.)

- 65 toxoidu tetanu (titry k toxoidu tetanu mají být potvrzeny metodou ELISA) a dále 3 injekcemi různých oligo nebo poly-TT-konjugátů S. pneumoniae jako v bodě G (tabulka 26).

Ve všech studiích budou konjugáty podávány perorálně a subkutánní injekcí.

Konjugáty podle tohoto vynálezu budou stimulovat imunitní odpovědi u malých dětí, u dětí s nezralým imunitním systémem a u imunosupresovaných osob. Jako modely pro tyto situace, původci tohoto vynálezu určují imunopotenciační účinnost konjugátů zde popsaných u mladých myší, u SCID a u holých myší. Jak bylo popsáno výše, tyto myši budou také pre-senzibilizovány toxoidem tetanu před multikonjugovaným očkováním, aby bylo možné studovat jev (fenomen) suprese nosičem.

Modifikace výše popsaných způsobů provedení různých ztělesnění tohoto vynálezu budou zřejmé odborníkovi v oboru, sledujícímu údaje z tohoto vynálezu, jak jsou zde uvedeny. Příklady, popsané výše nejsou omezením, a představují pouze příklady vynálezu, jehož rozsah je definován dále zařazenými patentovými nároky.

L·..

* ·

Tabulka 1

Běžné imunizační schéma pro konjugované vakcíny

Den aplikace Den odebrání krve Konjugát ______________PSC-TT (A-123)

7 28	38
0	17	PSC (A-123)
7	38
28
0	17	OSC-TT (A-124)
7	38
28
0	17	OSC (A-124)
7	38
28
0	17	TT
7	38
28
0	17	0,9 % NaCl
7	38
28

N/A

Normální myš

Žádná injekce ·£·

- 67 Skupina pěti myší dostala subkutánní injekce 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, nebo 5,0 konjugátu v 200 μΐ 0,9% roztoku NaCl (100 μΐ injekce do každého boku). PSC-TT (A-123) je konjugát polysacharid-toxoid tetanu (šarže # A-123). OSC-TT (A-124) je konjugát oligosacharidů (4 až 8 opakujících se jednotek) s toxoidem tetanu (šarže # A-124). PSC (A-123) je -po-l-vsachar-id—(-šar,že # A-123). OSC (A-124) je oligosacharid (4 až 8 opakujících se jednotek) (šarže # A-124). TT je toxoid tetanu.

Tabulka 2

Průměrné hladiny protilátek myšího séra na jednotlivé konjugáty sérotypu 8 S.pneumóniae (postterciární imunizace)

Třída imunoglobulinu isotopu ^g/ml)

	Antisérum proti:	IgA	IgGi	^G2a	igc2b	IgG 3	IgM
	konjugáty 8-oligo- sacharid- -toxoidu tetanu	3,3	2,7	0,08	0,07	1,7	8,4
	nekonj ugovaný 8-oligosacharid	0,3	0,05	0,02	0,02	0,8	0,8
l·	konjugáty 8-poly- sacharid- -toxoidu tetanu	10,8	0,13	0,07	0,07	1,75	14,6
4.	nekonj ugovaný 8-polysacharid	5,75	0,08	0,05	0,06	2,75	10,4

····

- 68 Tabulka 3 - první část

Inhibice ELISA při použití oligosacharidů typu 8

Inhibující O.D. 405 nm koncentrace—Opakuíící-se^iednotky, připravené pomocí O, 5-M

antigenu	TFA, 100	°C, 20	min
(R9)	8-PS	1R.U.	2R.U.	3R.U.	4R.U.
25,0	0,013	2,575	1,015	0,680	0,733
12,5	0,011	2,583	1,610	1,109	1,190
6,25	0,031	2,542	2,042	1,751	1,878
3,13	0,105	2,591	2,359	2,127	2,456
1,57	0,228	2,585	2,566	2,264	2,748
0,781	0,468	2,602	2,643	2,313	2,761
0,391	0,821	2,919	2,829	2,549	3,000

- 69 Tabulka 3 - druhá část

Inhibíce ELISA při použiti oligosacharidů typu 8

Inhibující O.D. 405 nm koncentrace Opakující se jednotky, připravené pomoci 0,5-M antigenu-----TFA->—l-GO^G-j—20—min— ---------—__________

	(úg)	5R.U.	6R.U.	7R.U.	.8+R.U.
	25,0	0,698	0,564	0,489	0,177
	12,5	0,974	1,008	0,827	0,427
	6,25	1,395	1,303	1,243	0,783
Γ	3,13	1,845	1,827	1,628	1,204
	1,57	2,282	2,234	1,944	1,744
	0,781	2,597	2,531	2,219	2,014
	0,391	2,814	2,837	2,318	2,865

·· 9···

- 70 Tabulka 4

Inhibice ELISA, při použití oligosacharidů typu 6B

O.D. 405 nm ______________6B (0,01-M kyselina

6B-PS octová, 100°C, 30 h)

Inhibuj ící koncentrace— antigenu (úg)

E-	25,0	0,018	0,300
	12,5	0,023	0,502
	6,25	0,025	0,776
	3,13	0,054	0,952
	1,57	0,109	1,090
	0,781	0,207	1,192
	0,391	0,331	1,266

- 71 Tabulka 5

Inhibice ELISA, oligosacharidy typu 6B, užity různé přípravy pomocí TFA

O.D. 405 nm

Inhibuj ící toncentraee---------6B—LO_,j0 5M TFA, 6B (O,1M TFA, 6B ( 0,1M TFA, antigenů 6B-PS 70°C, lh) 70°C, 2h) 70°C, 4h) (μυ)

25,0	0,016	0,223	0,211	1,897
12,5	0,017	0,281	0,372	2,417
6,25	0,069	0,717	0,702	2,276
3,13	0,370	1,096	1,216	2,674
1,57	0,958	2,411	1,793	2,673
0,781	0,959	2,595	2,243	2,817
0,391	1,216	2,540	2,502	2,563

9999

- 72 Tabulka 6

Inhibice ELISA, oligosacharidy typu 6B, užity různé přípravy pomocí kyseliny octové O.D. 405 nm Inhibující koncentrace 6B (2-M kys. 6B (2-M kys. 6B (2-M kys.

antigenu octová, octová, octová, ~(-|igj---------6B—PS 70°C-,—2h_)________70°C, 24h) 70°C, 48h)

25,0	0,016	0,341	1,530	2,452
12,5	0,017	0,631	1,849	2,534
6,25	0,069	0,982	2,319	2,613
3,13	0,370	1,504	2,579	2,716
1,57	0,958	2,034	2,748	2,807
0,781	0,959	2,473	2,751	2,732
0,391	1,216	2,533	2,597	2,626

t·

Tabulka 7

Inhibice ELISA při použití oligosacharidů typu 6B

O.D. 405 nm

Inhibuj ící koncentrace antigenu (ůg)

6B-PS

6R (0,05—M TFA, 6B (0,05-M TFA,___________

70°C, l,5h) 70°C, 3h)

25,0

12,5

6,25

3,13

1,57

0,781

0,391

0,100

0,140

0,215

0,396

0,563

1,060

1,616

0,297	0,594
0,485	0,916
0,816	1,371
1,180	1,852
1,702	2,195
2,286	2,644
2,515	2,551

- 74 Tabulka 8

Inhibice ELISA při použití oligosacharidů typu 14

O.D. 405 nm

Inhibující koncentrace------------14_(0,1—M TFA,____14 (0,5-M TFA, antigenu 14-PS 70°C, 3h) 70°C, 7h) (μ?)

25,0	0,020	0,072	0,201
12,5	0,022	0,229	0,339
6,25	0,022	0,362	0,745
3,13	0,065	0,631	1,032
1,57	0,161	1,028	1,341
0,781	0,299	1,277	1,614
0,391	0,644	1,691	1,714

- 75 r

Tabulka 9

Inhibice ELISA při použití oligosacharidů typu 14

O.D. 405 nm

Inhibuj ící koncentrace--—Opal^uýdÍcř—se—jjednotky, připravené pomoci antigenu 0,5-M TFA, 100°C, 15 min ^g) 3 R.U. 4 R.U. 8 R.U.

	25,0	2,011	0,596	0,337
	12,5	1,966	1,078	0,517
	6,25	1,936	1,425	0,712
	3,13	1,891	1,620	0,924
	1,57	2,021	1,889	1,242
	0,781	2,055	1,923	1,595
	0,391	2,089	1,877	1,727

• 4444 4 ·· 44 *44«

4 44 4 * 4 4· • ··· · 4 4 4 44 • · * · · · 4 ·44« • 4 4 4 4 44

444 ·«· >·· *4 444

- 76 Tabulka 10

Inhibice ELISA při po^užití oligosacharidů typu 14

.*	Inhibuj ící	O.D. 405 nm	14 (0,05-M
14-(0,01=M TFA, 70°C, 7h)	14 (0,05-M
• f	koncentrace antigenu (gg)	14-PS
TFA, 70°C, 7h)	TFA, 70°C, 24h)
	25,0	0,038	0,075	0,163	0,610
	12,5	0,055	0,110	0,283	0,986
	6,25	0,093	0,191	0,503	1,406
	3,13	0,197	0,318	0,857	2,225
	1,57	0,330	0,528	1,367	2,562
	0,781	0,623	0,945	2,095	2,622
R	0,391	1,053	1,462	2,429	2,569

• ·

Tabulka 11

Inhibice ELISA za použití oligosacharidů typu 19F

O.D. 405 nm «*

Inhibující

-koncentrace----—_________19F(0,2—M HC1,____19F(0,2-M HC1 antigenu 19F-PS nezahříváno, 3h) 70°C, 3h) (pg)

25,0	0,347	2,335	0,253
12,5	0,380	2,926	0,328
6,25	0,460	3,286	0,495
3,13	0,669	3,415	0,691
1,57	0,805	3,405	1,064
0,781	1,000	3,491	1,414
0,391	1,508	3,549	1,827

- 78 Tabulka 12

Inhibice ELISA za použití oligosacharidů typu 23F

O.D. 405 nm

Inhibuj ící koncentrace--------antigenu 23F-PS (μυ) nF.(0_r5rM.TfA, 23F(0,25-M TFA,____________

70°C, lh) 70°C, 3h)

25,0	0,033	0,385	0,435
12,5	0,033	0,586	0,592
6,25	0,027	0,686	0,743
3,13	0,037	0,832	0,870
1,57	0,062	0,952	0,933
0,781	0,128	1,085	1,029
0,391	0,240	1,155	1,099

····

Tabulka 13

Inhibíce ELISA za použití oligosacharidů typu 23F

O.D. 405 nm

Inhibuj ící koncentrace----------------2 3F(O,-1-M T-FA-,-----2 3 F(-0,l-MTFA,— antigenu 23F-PS 70°C, 3h) 70°C, 5h) (úg)

25,0	0,487	0,187	2	,107
12,5	0,364	0,261	2	,517
6,25	0,355	0,339	2	,623
3,13	0,341	0,545	3	,009
1,57	0,358	0,770	2	,689
0,781	0,401	0,998	2	,624
0,391	0,432	1,366	2	,887

φ φ φ φ φ

i>

Tabulka 14 - první část lInhibice ELISA za použití oligosacharidů typu 23F

O.D. 405 nm

Inhibující ]<_onceTjt_race antigenu 23F(0,5-M TFA, 23F (0,5-M TFA, (ug) 23F-PS 70 °C, lh) 70 °C, 15 min)

25,0	0,127	0,309	0,159
12,5	0,111		0,529		0,149
6,25 “ ”	0,118	** -	0,923 '		0,179
3,13	0,148		1,480		0,242
1,57	0,288		2,118		0,430
0,781	0,480		2,534		0,712
0,391	0,940		2,557		1,218

&

J.Tabulka 14 - druhá část &

Inhibice ELISA za použití oligosacharidů typu 23F

0.D. 405 nm

23E—( 5-M_kys_._______23F ( 2-M kys .

octová, octová, °C, 5h) 70 °C, 24h)

Inhibuj ící

-koneenta?ace--------antigenu (ug)

ř	25,0	0,160	0,241
	12,5	0,144	0,405
	6,25	0,243	0,750
	'3,13	0,410	1,172
	1,57	0,852	1,662
	0,781	1,345	2,361
	0,391	1,909	2,430

'»->

Tabulka 15

Inhibice ELISA za použití N-.Hineningitidis-G polysacharidu

O.D

405 nm

Inhibující

Γ

. *»	antigenů (úg)	N.meng-CPS	N.meng-C(0 NaOAc,50 ? )	, lMo* ? > °C,. 6 h) '0 , ·.» 3 >	N.meng-C(: NaOAc,. 50 2 , . 1 <1
i-	25,0	0,304	!.0 » 269	0,04 6	0/269 J
	12,5	0,240 .	9,0/245	¢,011 '	0/2589
	6,25	0,369	0,406	•. .; >	0/412 1
	3,13	0,836	1,088		1,151
	1,57	2,402	2,593	•	2,512
	0,781	2,679	2,839		2,749
	0,391	2,434	2/448		2,504

1M

6h) l

Tabulka 16

Inhibice ELISA za použiti konjugátů typu 6B

	Inhibuj ící koncentrace	O.D. 405	nm
	antigenu
	(ng)	6B-PS	6B:8-TT	6B-OS	TT
	25,0	0,019	0,070	0,037	2,314
iř	12,5	0,022	0,117	0,046	2,289
	6,25	0,033	0,205	0,081	2,209
	' *3,13----- --------	O*, 0 58---------	0,339 ’	0,14 5	' 2,173
	1,57	0,127	0,533	0,287	2,208
	0,781	0,248	0,816	0,534	2,237
	0,391	0,435	1,234	0,856	2,249

·· ····

···«

Tabulka 17

Inhibice ELISA za použití konjugátů typu 14

	Inhibuj ící koncentrace	O.D. 405 nm
	antigenu (ng)	14-PS	14:8-TT 14-OS	TT

25,0	0,004	0,029	0,026	0,216
<- 12,5	0,006	0,04 3	0,037	0,510
6,25	0,017	0,075	0,068	0,769
------ -----‘3,13--------	0-043- -	0,141	0,131'	1,018
1,57	0,078	0,258	.0,247	1,242
0,781	0,160	0,447	0,400	1,362
0,391	0,299	0,669	0,655	1,475

• ·

Tabulka 18 - první část

Inhibice ELISA za použití konjugátů typu 23F

Inhibující O.D. 405 nm koncentrace antřgenu-------------------------23-E-TT---------23_F-_TT_________________________ ^g) 23F-PS-TT (F:27-47) (F:32-51)

	25,0	0,027	0,348	0,235
Ir	12,5	0,038	0,433	0,390
	6,25	0,055	0,556	0,547
t·	3,13	0,104	0,659	0,665
	1,57	0,189	0,806	0,823
	0,781	0,215	0,944	0,861
	0,391	0,412	1,029	1,017

·· ····

Tabulka 18 - druhá část

Inhibice ELISA za použití konjugátů typu 23F

Inhibuj ící	O.D. 405 nm
koncentrace flirt igenvi------	--2 3F-T-T	23F--TT	TT
(ůg)	(F:32-65)	(F:31-51)

	25,0	0,397	0,053	1,073
	12,5	0,463	0,093	1,017
	6,25	0,604	0,161	1,094
	3,13	0,698	0,255	1,097
	1,57	0,769	0,371	1,098
	0,781	0,954	0,548	1,085
	0,391	0,978	0,696	1,089

Tabulka 19

Inhibice ELISA za použití N. meningitidis-C polysacharidu

O.D. 405 nm

Inhibuj ící koncentrace------------------------antigenu

(Rg)	N.meng- CPS	N.meng- CPS-TT	N.mengC-TT (F:37-49)	TT
25,0	0,038	0,068	0,250	2,222
12,5	0,025	0,042	0,221	1,880
6,25	0,028	0,120	0,297	1,917
3,13	0,058	0,209	0,529	1,894
1,57	0,108	0,212	0,610	1,807
0,781	0,371	0,511	0,762	1,813
0,391	0,393	0,623	1,101	1,849

e·.· · 9 ·

- 88 Tabulka 20

Průměrné hladiny protilátek IgG-^ a IgG₃ na konjugáty S. pneumoniae sérotypu 8 (postterciární imunizace)

Imunoglobulin isotopu ^g/ml)

IgG^ igc₃

1. Imunizace ve:

3 týdnech věku
8-O-TT	0,273	0,468
8-P-TT	0,036	0,213
8-P	0,052	3,18
TT	0,034	-

*	8 týdnech věku
8-O-TT	0,700	1,96
(Z	8-P-TT	0,159	2,89
	8-P	0,007	2,17
	TT	0,003	0,74
	8 týdnech věku + FCA
r-,;	8-O-TT	1,273	1,74
	8-P-TT	-	3,73
ΐχ	8-P	0,055	5,06
	TT	-	0,295

Ir

Tabulka 21

Průměrné hladiny protilátek myšího séra na různé konjugáty

S.pneumoniae sérotypu 14 (postterciární imunizace)

Imunoglobulin isotopu ^g/ml)

Antisérum na :	IgM	IgGx	I9G2a	I9G2b	jgC3	IgA
14-oligo-TT (0,1M TFA)	6,50	50,99	0,178	0,158	37,65	0,078
1 ug 14-oligo-TT (0,5M TFA pík 4 a 5)	2,8	-	0,009	0,018	1,51	-
1 ug 14-oligo-TT (0,5M TFA pík 7 a 8)	3,39	12,35	0,155	0,143	9,32	0,020
1 ug 14-poly-TT	5,11	15,25	0,038	0,053	8,95	0,001
1 ug 14-poly	4,70	-	0,008	0,031	9,20	0,077
1 μ TT	3,37	—	0,024	0,060	8,36	0,031

·· ····

Tabulka 22

Opsonizační výsledky testující antisérum na konjugát

S. pneumoniae sérotypu 8 % redukce jednotek tvořících

------------------------------------------kolonie—(-CFU)---------

Antisérum na :	Typ 8
konjugát 8-oligosacharid -toxoidu tetanu	98
nekonj ugovaný 8-oligosacharid	10
konjugát 8-polysacharid toxoidu tetanu	39
nekonjugovaný 8-polysacharid	11

- 91 Tabulka 23

Opsonizační výsledky testující antisérum na konjugáty

S. pneumoniae sérotypů 3 a 8 % redukce CFÚ

Antisérum na :	Typ 3	Typ 6B	Typ 8
konjugát. 3/8-oligosacharid -toxoidu tetanu	96	0	99
	... — _ . — „	~ ‘ -
konjugát 3/8- polysacharid -toxoidu tetanu	10	0	12
PBS kontrola	0	0	0

-3 o e *>

- 92 Tabulka 24

Opsonizační výsledky testující antisérum na konjugáty

S. pneumoniae sérotypů 14 i- Φ % redukce CFU

Antisérum na :

14-0-TT (0,1-M TFA)

'.T44Q-TT-í;('.0,5-M TFA, píky 7 a 8)

14-poly-TT

14-polysacharid toxoid tetanu 0,9% NaCl

NMS

Typ 14 *>3

- 93 Tabulka 25

Opsonizační výsledky testující antisérum na konjugát di-hapten S. pneumoniae % redukce CFU

Antisérum na : Typ 14

14-O-TT68

8:14-O-TT65

14-P-TT37 toxoid tetanu0

0,9% NaCl0

NMS0

Tabulka 26

Imunizační režimy

A: 1. Mono-hapten-oligosacharidový konjugát

2. Mono-hapten-oligosacharidový konjugát

3. Mono-hapten-oligosacharidový konjugát

B: 1. Mono-hapten-oligosacharidový konjugát

2. Nekondenzovaný polysacharid

3. Nekondenzovaný polysacharid

C: 1. Nekondenzované polysacharidy — - „ -2..Mono-hapten-oligosacharidový-konjugát

3. Mono-hapten-oligosacharidový konjugát

D:

1. Multi-hapten-oligosacharidový konjugát

2. Multi-hapten-oligosacharidový konjugát

3. Multi-hapten-oligosacharidový konjugát

E: 1. Multi-hapten-oligosacharidový konjugát

2. Nekondenzované polysacharidy

3. Nekondenzované polysacharidy

F: 1. Nekondenzované polysacharidy

2. Multi-hapten-oligosacharidový konjugát

3. Multi-hapten-oligosacharidový konjugát

G:

1. Toxoid tetanu

2. Toxoid tetanu

3. Toxoid tetanu

4. Mono- nebo multi-hapten-oligosacharidové konjugáty

5. Mono- nebo multi-hapten-oligosacharidové konjugáty

6. Mono- nebo multi-hapten-oligosacharidové konjugáty (náhradní strana)

Claims (47)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozice, vyznačující se tím, ž e obsahuje :

   _____a)_alespoň—jeden—podle^veTiÁOStNseparovány karbo^ hydrátový oligosacharidový hapten, obsahující alespoň jeden imunogenní epitop, kde oligosacharidový hapten je separován podle velikosti na zvláštní opakující se jednotky,

   b) nosič, který vyvolává thymus dependentní imunitní odpověď v subjektu, přičemž hapten je kovalentně kondenzován přímo k nosiči a kde konjugát hapten - nosič je protektivně imunogenní.
2. 2. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že haptenem je oligosacharid bakteriálního nebo virového polysacharidu.
3. 3. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že přítomnost výše zmíněného imunogenního epitopu je stanovena použitím inhibíce ELISA.
4. 4. Kompozice podle nároku 2,vyznačující setím, že výše uvedený oligosacharid je produkován kyselou hydrolýzou zmíněného polysacharidu.
5. 5. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že protektivní imunogennost je stanovena isotopovou ELISA.
6. 6. Kompozice podle nároku 1, vyznačující (náhradní strana)

   - 96 se tím, že protektivní imunogennost je stanovena baktericidním nebo opsonizačním testem.
7. 7. Kompozice podle nároku 2, vyznačuj ící se tím, že polysacharid je vybrán ze skupiny, sestávající z kapsulárních polysacharidů S. pneumococcus sérotypů 1, 2,3,4,5, 6B, 7, 7F, 8“9N7-9V7^OA7“11'ATTL27

   12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22, 23F a 33F.
8. 8. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že obsahuje alespoň dva hapteny.
9. 9. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že neindukuje nosičovou supresi.
10. 10. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že neindukuje antigenní kompetici.
11. 11. Kompozice podle nároku 1,vyznačuj icí se tím, že dále obsahuje adjuvans.
12. 12. Způsob přípravy kompozice podle nároku 1, v y značující se tím, že se

    a) štěpí bakteriální nebo virový polysacharid na oligosacharidy při zachováni imunogenních epitopů na výsledných oligosacharidech,

    b) separují se výsledné oligosacharidy na zvláštní opakující se jednotky na základě velikosti,

    c) provede se selektování oligosacharidů separovaných podle velikosti, které obsahují imunogenní epitopy, ·· ·*·· (náhradní strana)

    d) aktivuje se alespoň jeden oligosacharid, selektovaný ve stupni c), a

    e) přímo se kondenzují aktivované oligosacharidy k nosiči, který který vyvolává thymus dependentní imunitní odpověď v subjektu-,----------- --------- ’ přičemž výsledná kompozice je protektivné imunogenní.

    <.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že’ štěpení se provádí použitím kyselé < hydrolýzy.
14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že jako aktivace se použije acidifikace na kationové koloně.

    i
15. 15. Způsob podle nároku 12, vyznačující í i se tím, že kondenzace se provádí použitím l-ethyl-3,3'-dimethyl(aminopropyl)karbodiimidu nebo jodistanu.
16. 16. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se t i m, že kondenzace poskytuje předem stanovený poměr haptenu k nosiči.
17. 17. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že stupně a) až d) se opakují za použití * alespoň jednoho dalšího bakteriálního nebo virového polysacharidu, k dosaženi di- nebo multivalentniho konjugátu.
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačuj ící • · • · · · · ♦ « · • · · · · • · · · · ♦ · · • · · · · *·· · · *· · (náhradní strana)

    - 98 se tím, že bakteriální polysacharidy se vyberou ze souboru sestávajícího z kapsulárních polysacharidů S. pneumococcus sérotypů 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12, 12F, 14, 15B, 17F, 18C,
19. 19F, 19A, 20, 22, 23F a 33F.

    ______19. Z půso±>__z a ji š-t ěn í^aro tekt-ivn-í-—i-mu niž a ee—pr otH-bakteriálnímu patogenu, vyznačující se tím, ž e zahrnuje podání účinného množství kompozice podle nároku 1 savci, který potřebuje takového ošetřování.
20. 20. Způsob podle nároku 19,vyznačuj ící se tím, že podávání se volí ze skupiny sestávající z perorálního a parenterálního podání.
21. 21. Způsob podle nároku 19,vyznačuj ící se tím, že výše zmíněným savecem je novorozenec.
22. 22. Způsob podle nároku 19, vyznačuj íc í se tím, že savec je vybrán ze skupiny, sestávající z imunosupresovaných savců a savců pokročilejšího věku.
23. 23. Kompozice vhodná pro stimulování imunitní odpovědi na antigen, vyznačující se tím, že imunostimulační kompozice obsahuje oligosacharid S. pneumoniae sérotypu 8, který obsahuje imunogenní epitop a vhodné farmaceutické vehikulum, přičemž oligosacharid zajišťuje imunostimulativní účinek.
24. 24. Kompozice podle nároku 23, vyznačuj ící se tím, že oligosacharid je konjugován k proteinovému nosiči.

    (náhradní strana) •· •· •· •· • · • · • · ·· •· ··»
25. 25. Kompozice podle nároku 23, se t i m, ž e neindukuje supresi v y z n a č u nosiče.
26. 26. Kompozice podle nároku 23, se t i m, ž e neindukuje antigenní kompetici.

    ______
27. 27. Způsob—zag ištění—protekti-vná—imunizace—pro tú--bakteriálnímu patogenu, vyznačující se tím, ž e zahrnuje podání účinného množství kompozice podle nároku 23 savci, který potřebuje takového ošetřování.
28. 28. Způsob vyznačuj oligosacharidů S. pneumoniae sérotypu 8, který obsahuje určený imunogenní epitop, společně s tímto antigenem.

    zvýšení imunogenní odpovědi na antigen, ící se tím, že zahrnuje podání
29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačuj ici se tím, že podávání se vybere ze skupiny, sestávající z perorálního a parenterálního podání.
30. 30. Způsob přípravy prostředku podle nároku 23, vyznačující se tím, že se

    a) štěpí S. pneumoniae sérotypu 8 polysacharidu na oligosacharidech k zachování imunogenních epitopů na výsledných oligosacharidech,

    b) separuji výsledné oligosacharidy, založené na velikosti,

    c) vyberou takových oligosacharidy, které obsahují imunogenní epitopy, a i• · · · (náhradní strana) í

    - 100 -

    d) smísí selektované oligosacharidy s vhodným farmaceutickým nosičem.
31. 31. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se tím, že štěpení se provádí za použití kyselé hydrolýzy.
32. 32. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupně, zařazené před stupněm d), spočívající v | 1) aktivování oligosacharidů, selektovaných ve stupni ' ^L c), a ; 2) kondenzování aktivovaných oligosacharidů k purifiko| vánému nosiči.
33. 33. Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící se tím, že aktivace se provádí acidifikací na kationové koloně.
34. 34. Způsob podle nároku 32, vyznačuj ic í se tím, že kondenzace se provádí za použití l-ethyl-3,3'-dimethyl(aminopropyl)karbodiimidu nebo jodistanu.
35. 35. Způsob podle nároku 32, vyznačuj íc í se tím, že kondenzace zajištuje předem stanovený poměr haptenu k nosiči.
36. 36. Způsob zvýšení imunogennosti antigenu u savce, vyznačující se tím, že se podává oligosacharid S. pneumoniae sérotypu 8, který obsahuje (náhradní strana)

    - 101 stanovený imunogenní epitop, společně se zmíněným antigenem, přičemž oligosacharid zvyšuje imunogenní účinek.
37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že oligosacharidem je S. pneumoniae sérotypu 8, který je konjugován k nosiči.
38. 38. Způsob podle nároku 36,vyznačující se tím, že oligosacharidem je S. pneumoniae sérotypu 8, podávaný jako příměs do farmaceutické nebo vakcínové kompozice.
39. 39. Způsob podle nároků 36, 37 a 38, vyznačující se tím, že podávání se vybere ze skupiny, sestávající z perorálního a parenterálního podání.
40. 40. Způsob specifické nebo nespecifické stimulace sav- čích buněk, vyznačující se tím,že se těmto buňkám podává oligosacharid S. pneumoniae sérotypu 8, který obsahuje strukturu β-glukóza (1 ---> 4) β-glukóza (1

    ---> 4) α-galaktóza (1 ---> 4) α-glukonová kyselina.
41. 41. Způsob podle nároku 40·, vyznačující se tím, že oligosacharid se konjuguje k nosiči.
42. 42. Způsob podle nároku 41, vyznačuj ící se ti m, ž e oligosacharid se podává jako příměs do farmaceutické nebo vakcínové kompozice.
43. 43. Způsob podle nároků 40, 41 nebo 42, vyznačujícíse tím, že podávání se vybere ze skupiny, sestávající z perorálního a parenterálního podání.

    (náhradní strana)

    - 102 • · ·
44. 44. Způsob podání adjuvans savci, vyznačuj ící se t í m, ž e se podává savci oligosacharid S. pneumoniae I sérotypu 8, který obsahuje strukturu β-glukóza (1 ---> 4) β-glukóza (1 ---> 4) α-galaktóza (1 ---> 4) a-glukonová kyselina.

    ___
45. 45._Způsob—podle -nároku 44,—v~yz—n~a—č~u j—í~c~~í

    I setím, ž e se oligosacharid konjuguje k nosiči.
46. 46. Způsob podle nároku 44, vyznačující

    I - setím, že se oligosacharid podává jako příměs do farmaceutické nebo vakcínové kompozice.
47. 47. Způsob podle nároků 44, 45 nebo 46, vyznačující setím, že podání se vybere ze skupiny, sestávající z perorálního a parenterálního podání.