JP2015525771A - 緑膿菌ワクチンのための合成オリゴ糖 - Google Patents

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Abstract

本発明は、種々の緑膿菌血清型特異的なオリゴ糖抗原又は種々のコア緑膿菌オリゴ糖構造若しくはモチーフを含有する、合成緑膿菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）ベースのオリゴ糖及びコンジュゲートを提供する。本発明は、緑膿菌に起因する感染症を、診断し、治療し、予防するための、緑膿菌ＬＯＳベースの免疫原性及び免疫防御組成物並びにそれから得られた抗体をさらに提供する。

Description

本願は、２０１２年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／６７１，８９８号の優先権を主張するものであり、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、均一な合成緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）リポオリゴ糖（ＬＯＳ；ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）ベースのオリゴ糖、それから得られたコンジュゲート、及び抗体の免疫原性及び免疫防御組成物、並びにそれを作製し使用するための方法に関する。
本発明は、合成オリゴ糖１ａ又は１ｂ：
Figure 2015525771
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に、Ｈ、単糖又はオリゴ糖であり、Ｘは、Ｈ、リンカー基又は保護基であり；Ｌはリンカーであり、Ｙは担体である］を提供する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、α−Ｒｈａ−、α−Ｇｌｃ（１−２）−α−Ｒｈａ−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、β−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、α−Ｒｈａ［２，３，４−ＯＡｃ］−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４−ＯＡｃ］−又はβ−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４，−ＯＡｃ］−である。いくつかの実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔｓ）において、Ｒ１及びＲ２は、下記の表：
Figure 2015525771
における組合せから選択される。
本発明は、抗原１ａ及び／又は１ｂと、薬学的に許容されるビヒクルとを含む組成物も包含する。好ましくは、組成物は、単抗原、又は抗原の公知の定義された混合物を含有する。
本発明は、抗原１ａ及び／又は１ｂと、薬学的に許容されるビヒクルとを含む免疫原性及び免疫防御組成物を包含する、ワクチン組成物をさらに提供する。これらのワクチン組成物は、場合により、薬学的に許容されるアジュバントを包含し得る。好ましくは、ワクチン組成物はエンドトキシンフリーである。ワクチン組成物は、一、二、三又は四価であってよい。
本発明は、オリゴ糖１ａ及び抗原１ｂを合成的に形成するための方法をさらに提供する。
本発明は、緑膿菌に起因する感染症を、診断し、治療し、予防するための方法をさらに提供する。
定義
本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、下記の定義が提供される。
単位、接頭辞及び符号は、それらのＳＩ許容形態で表され得る。本明細書において列挙されている数値範囲は、範囲を定義する数字を包含し、さらに定義された範囲内の各整数も包含し補完するものである。別段の注記がない限り、用語「ａ」又は「ａｎ」は「少なくとも１つの」を意味するものとして解釈されるべきである。本明細書において使用される節見出しは、組織化のみを目的としており、記述されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。これらに限定されないが特許、特許出願、論文、書籍及び専門書などの本願において引用されているすべての文書、又は文書の一部は、参照によりその全体が目的に応じて明示的に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「オリゴ糖」は、２つ以上の単糖単位を含有する化合物を指す。オリゴ糖は、還元末端の単糖単位が実際に還元糖であるか否かにかかわらず、還元末端及び非還元末端を有するとみなされている。認められている命名法に従って、オリゴ糖は、左側に非還元末端を、右側に還元末端を伴って本明細書において描写されている。本明細書において記述されているすべてのオリゴ糖は、グリコシド結合の立体配置（α又はβ）、環結合、結合に関与する還元単糖の環位置、次いで還元単糖の名称又は略称（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）が前に付く、非還元単糖を表す名称又は略称（例えば、Ｇａｌ）を伴って描写されている。２つの糖間の連結は、例えば、２，３、２→３、又は２−３と表現され得る。各単糖は、ピラノース又はフラノースである。
本明細書において使用される場合、「単糖」又は「単糖単位」は、その誘導体を包含する、オリゴ糖中の単糖残基を指す。オリゴ糖の文脈の中で、個々のモノマー単位は、ヒドロキシル基を介して別の単糖と結合している（又は結合する可能性がある）単糖である。
本明細書において使用される場合、「エンドトキシンフリー」は、単離された細菌性炭水化物及び多糖中に通例なら存在するエンドトキシンもエンドトキシン成分も含有しないオリゴ糖を指す。
本明細書において使用される場合、「合成」は、通例、化合物が単離される際にそれに付随して存在するエンドトキシン、糖脂質、関係のないオリゴ糖等の成分が実質的に又は本質的にない材料を指す。典型的には、合成化合物は、少なくとも約９０％純粋、通常は少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９９％純粋である。純度は、当技術分野において周知である多数の手段によって示すことができる。好ましくは、純度はＨＰＬＣによって測定される。合成材料の同定は、質量分析及び／又はＮＭＲ分光法によって決定され得る。
本明細書において使用される場合、用語「リンカー」は、一方の端では、担体の反応性官能基、例えばアミノ、チオール又はカルボキシル基との共有結合に入ることができる基を提示し、他方の端では、本発明によるオリゴ糖のヒドロキシル基又はアミノ基との共有結合に入ることができる基を提示する、結合又は部分のいずれかを指す。リンカー分子の２つの官能基の間には、好適な長さの生体適合性架橋分子、例えば、置換又は非置換のヘテロアルキレン、アリールアルキレン、アルキレン、アルケニレン又は（オリゴ）アルキレングリコール基がある。リンカーは、好ましくは、置換若しくは非置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン基又は置換若しくは非置換（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン基を包含する。
本明細書において使用される場合、用語「担体」は、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリマー、デンドリマー、ビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はそれらの組合せを指し、これは、得られるオリゴ糖−担体コンジュゲートの免疫原性をオリゴ糖単独よりもさらに高い程度に高めるために、オリゴ糖とカップリングされている。
本明細書において使用される場合、「タンパク質担体」は、タンパク質、ペプチド又はそのフラグメントを指し、これは、得られるオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲートの免疫原性をオリゴ糖単独よりもさらに高い程度に高めるために、オリゴ糖とカップリング又はコンジュゲートされている。例えば、担体として使用される場合、タンパク質担体は、Ｔ細胞を活性化且つ動員し、それにより、Ｔ細胞依存性抗体産生を増進することができるＴ依存性抗原として役立ち得る。
本明細書において使用される場合、「コンジュゲートされている」は、コンジュゲートされていないオリゴ糖と比べて増大した免疫原性をオリゴ糖コンジュゲートが有するように、オリゴ糖を担体と近位で会合させる、共有又は非共有いずれかの化学的結合を指す。
本明細書において使用される場合、「コンジュゲート」は、リンカー及び／又は架橋剤を介して担体と化学的にカップリングされているオリゴ糖を指す。
本明細書において使用される場合、「受動免疫」は、対象に抗体が投与されることにより、抗体が細菌の表面に付着して細菌を貪食させる又は死滅させるように、異なる対象（同じ及び異なる種の対象を包含する）で抗体が産生されることを指す。
本明細書において使用される場合、「防御免疫」は、動物に投与されるワクチン又は免疫化スケジュールが、病原体に起因する疾患の重症度を、予防し、その発症を遅滞させ、若しくは低減し、又は疾患の症状を軽減する若しくは完全に解消する、免疫応答を誘導することを意味する。防御免疫は、好適な動物刺激モデルにおいて、補体媒介性殺菌活性を活性化する、又は細菌感染症に対する受動防御を与える血清抗体の能力に基づいて、予測が可能である。
本明細書において使用される場合、「免疫防御組成物」は、宿主において防御免疫を提供するように製剤化された組成物を指す。
本明細書において使用される場合、（例えば、調製物中に存在するエピトープに対する）「免疫応答を引き出すのに十分な量で」又は「免疫応答を刺激するための有効量で」は、特定の抗原調製物の投与の前後に測定した免疫応答インジケーターの間に検出可能な差異があることを意味する。免疫応答インジケーターは、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、殺菌アッセイ（例えば、血清殺菌抗体を検出するため）、フローサイトメトリー、免疫沈降、Ｏｕｃｈｔｅｒ−Ｌｏｗｒｙ免疫拡散法；例えば、スポット、ウエスタンブロット又は抗原アレイの結合検出アッセイ；細胞毒性アッセイ等のアッセイによって検出されるような、抗体力価又は特異性を包含するがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製物、並びに、ハイブリッド抗体、改変抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上に可変表示される一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び親抗体分子の免疫学的結合特性を提示するそれらの官能性フラグメントを包含する調製物を包括する。
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」は、均一の抗体集団を有する抗体組成物を指す。該用語は、それが作製される様式によって限定されない。該用語は、全免疫グロブリン分子、並びに、Ｆａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示される一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、及び親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を提示する他の分子を包括する。
本明細書において使用される場合、「抗体と特異的に結合する」又は「と特異的に免疫反応性である」は、オリゴ糖、タンパク質又はペプチドに関して言及される際、他の分子の不均一集団も包含し得る試料中における、抗原の存在に基づく且つ／又はその証拠となる結合反応を指す。故に、定められたイムノアッセイ条件下で、指定の抗体（単数又は複数）は試料中の特定の抗原（単数又は複数）と結合し、試料中に存在する他の分子と有意な量で結合することはない。そのような条件下での抗体との特異的結合は、特定の抗原（単数又は複数）に対するその特異性で選択される抗体又は抗血清を必要とする場合がある。
本明細書において使用される場合、「抗原」は、抗体分子と特異的に結合できる任意の物質を指す。
本明細書において使用される場合、「免疫原」及び「免疫原性組成物」は、リンパ球活性化を開始させて抗原特異的免疫応答をもたらすことができる抗原組成物を指す。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」は、特異的なＢ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。該用語は、「抗原決定基」又は「抗原決定基部位」とも交換可能に使用される。タンパク質、オリゴ糖又は他のバイオポリマー上のＢ細胞エピトープ部位は、フォールディングによって一緒になった巨大分子の異なる場所由来の部分から構成されていてよい。この種のエピトープは、該部位が、直鎖的配列では不連続であるがフォールディングされたコンフォメーション（単数又は複数）では連続的であるポリマーのセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）から構成されることから、コンフォメーションエピトープ又は不連続エピトープと称される。バイオポリマー又は他の分子の単一のセグメントから構成されるエピトープは、連続又は線状エピトープと称される。Ｔ細胞エピトープは概して線状ペプチドに制限される。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原との別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示す単純なイムノアッセイにおいて同定され得る。
用語Ａｃは、アセチル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）を意味する。
用語ＴＢＳは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルを意味する。
用語Ｔｒｏｃは、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルを意味する。
用語ＴＣＩは、トリクロロアセトイミダートを意味する。
用語Ｐｈｔｈは、フタロイルを意味する。
用語ＴＦＡは、トリフルオロアセタートを意味する。
用語ＴＣＡは、トリクロロアセタートを意味する。
用語Ｃｂｚは、ベンジルオキシカルボニルを意味する。
用語Ｂｚは、ベンゾイルを意味する。
用語Ｂｎは、ベンジルを意味する。
用語ＴＥＳは、トリエチルシリルを意味する。
用語ＴＢＤＰＳは、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルを意味する。
用語ＭＣＡは、モノクロロアセタートを意味する。
用語Ｌｅｖは、レブリノイルを意味する。
用語ＡＤＭＢは、４−Ｏ−アセチル１２，２ジメチルブタノアートを意味する。
用語Ｔｒは、トリフェニルメチルを意味する。
用語ＤＭＴは、ジメトキシトリチルを意味する。
用語ＦＭＯＣは、９−フルオレニルメチルカーボナートを意味する。
用語Ａｌｌｏｃは、アリルオキシカルボニルを意味する。
用語Ｎａｐは、ナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）を意味する。
用語ＳＥｔは、チオエチルを意味する。
用語ＳＰｈは、チオフェニルを意味する。
用語ＳＴｏｌは、チオトリルを意味する。
用語ＳＡｄｍは、チオアダマンチルを意味する。
合成オリゴ糖
本発明は、外膜の主要な表面成分である緑膿菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の一部に対応する抗原構造を化学的に合成するための、組成物及び方法を提供する。
オリゴ糖（１ａ及び１ｂ）において、オリゴ糖は、１つ又は複数のα−及び／又はβ−グリコシド結合を介して互いに連結している１つ又は複数の単糖単位を包含し得る。好ましくは、オリゴ糖は、緑膿菌ＬＯＳ構造において、概して１−２又は１−４の結合で自然に見られる単糖及びグリコシド結合を包含すると予想される。本発明は、とりわけオリゴ糖の設計が自然の緑膿菌ＬＯＳ構造を越えて拡張される場合、１−３及び１−６等の他の結合をさらに意図している。
Ｒ１又はＲ２のいずれかがオリゴ糖である場合、これは、１から約６つの間、好ましくは最大約４つの単糖単位を含有し得る。本発明は、とりわけオリゴ糖の設計が自然の緑膿菌ＬＯＳ構造を越えて拡張される場合、グルコース、フコサミン及びラムノース等の天然及び修飾単糖単位の包含を意図している。
化合物（１ａ及び１ｂ）において、好ましいサッカリド置換基は、α−Ｒｈａ−（ラムノシル）、α−Ｇｌｃ（１−２）−α−Ｒｈａ−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、β−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、α−Ｒｈａ［２，３，４−ＯＡｃ］−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４−ＯＡｃ］−及びβ−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４，−ＯＡｃ］−を包含する。
一態様において、本発明は、オリゴ糖１ａ：
Figure 2015525771
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に、Ｈ、単糖又はオリゴ糖であり、Ｘは、Ｈ、リンカー基又は保護基である］を提供する。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、α−Ｒｈａ−（ラムノシル）、α−Ｇｌｃ（１−２）−α−Ｒｈａ−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、β−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、α−Ｒｈａ［２，３，４−ＯＡｃ］−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４−ＯＡｃ］−及びβ−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４，−ＯＡｃ］−から選択される。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、以下の表：
Figure 2015525771
における組合せから選択される。
別の態様において、本発明は、オリゴ糖１ｂ：
Figure 2015525771
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に、Ｈ、単糖又はオリゴ糖であり、Ｌはリンカー基であり、Ｙは担体である］を提供する。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、α−Ｒｈａ−（ラムノシル）、α−Ｇｌｃ（１−２）−α−Ｒｈａ−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、β−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、α−Ｒｈａ［２，３，４−ＯＡｃ］−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４−ＯＡｃ］−及びβ−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４，−ＯＡｃ］−から選択される。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、以下の表：
Figure 2015525771
における組合せから選択される。
一実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（２ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
別の実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（２ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（３ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（３ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（４ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（４ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（５ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（５ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（６ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（６ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（７ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（７ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（８ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（８ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ａ）は、式（９ａ）：
Figure 2015525771
を有する。
さらなる実施形態において、オリゴ糖（１ｂ）は、式（９ｂ）：
Figure 2015525771
を有する。
表１は、置換によって被覆されることが提案されている好ましいＲ１及びＲ２組合せ並びにシュードモナス菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）血清型を収載している。
Figure 2015525771
別の態様において、本発明は、２０の主要な血清型、所与の血清型内のメンバー、及び表１において描写されている通りの個々の血清型亜型の１つ又は複数に対応するコアオリゴ糖構造又はモチーフを含むＬＯＳ抗原を提供する。下記の実施形態において、リンカーは、１から２０個の間、好ましくは１から８個の間の炭素原子を有するアルキレンチオール基として例示されている。これらの実施形態のいずれかにおいて、示されているリンカー（すなわち、アルキレンチオール基）は、本明細書において記述されている通りの任意の他の好適なリンカーで置きかえることができる。
本発明は、上述のチオール生成物を異なるリンカー及び／又はスペーサーで修飾し、上述したオリゴ糖のいずれか、加えてそれから得られたあらゆる部分配列の組合せに向けられたＬＯＳ抗原構造、又は実際にはそれに関連するあらゆる緑膿菌ＬＯＳ構造を作製するために、以下の十分なガイダンスを意図し提供するものであることを認識すべきである。
さらなる態様において、本発明は、例えば表１において記述されている複数の異なるオリゴ糖のいずれかを表す多価ＬＯＳ抗原組合せ（及びそのコンジュゲート）を提供する。
好適なリンカーは、一方の端では、担体の反応性官能基、例えばアミノ、チオール又はカルボキシル基との共有結合に入ることができる基を、他方の端では、同様に、本発明によるオリゴ糖のヒドロキシル基との共有結合に入ることができる基を含む。リンカー分子の２つの官能基の間には、好適な長さの生体適合性架橋分子、例えば、置換又は非置換のヘテロアルキレン、アリールアルキレン、アルキレン、アルケニレン又は（オリゴ）アルキレングリコール基がある。リンカーは、好ましくは、１〜１０個の炭素原子を含有する置換又は非置換のアルキレン又はアルケニレン基を包含する。
担体上のチオール基と反応することができるリンカーは、例えば、マレイミド及びカルボキシル基であり；アルデヒド又はカルボキシル基と反応することができる好ましい基は、例えば、アミノ又はチオール基である。リンカーと担体との間の好ましい共有結合は、チオールとマレイミドとの反応を包含する、チオールとα−ハロカルボニル又はα−ハロニトリルとの反応からのチオエーテル；ヒドラジド又はヒドラジンと活性化カルボニル基（例えば、活性化ＮＨＳ−エステル又は酸ハロゲン化物）との反応からのヒドラジド；アジドとアルキンとの（例えば、「クリック化学」を介する）反応からのトリアゾール；並びに、例えばＬｅｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４：７１６、２００６において開示されている通りの、ヒドロキシルアミンとアルデヒド又はケトンとの反応からのオキシムを包含する。アミンベースのコンジュゲーション化学は、リンカー及び／又はスペーサーを本明細書において記述されているオリゴ糖とカップリングするための原理において使用され得るが、本発明のオリゴ糖が典型的にそれぞれの単糖単位の第２の炭素と結合した複数のアミンを含有することから、これらのアプローチは典型的に均一性を犠牲にするであろう。
さらなる好適なリンカー分子は、当業者に公知であり、市販されているか、又は必要に応じ、存在する官能基に応じて設計することができ、公知の方法によって調製され得る。
好適な担体は当技術分野において公知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０）を参照）、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリマー、デンドリマー、ビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はそれらの組合せを包含し得、それら自体は特定の抗原特性を提示しない可能性があるが、担体（単数又は複数）の表面に提示された本発明のオリゴ糖（抗原）に対する宿主の免疫原性反応を支持することができる。
好ましくは、担体は、細菌トキソイド、毒素、エキソトキシン、及び破傷風トキソイド等のその非毒性誘導体、破傷風毒素フラグメントＣ、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７等のＣＲＭ（非毒性ジフテリア毒素変異体）、コレラトキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）エキソトキシン又はトキソイド、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン、組換え技術によって生成された、遺伝子的に解毒されたその変異体を包含する緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ；ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）、外膜クラス３ポーリン（ｒＰｏｒＢ）及び他のポーリン等の細菌外膜タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＫＬＨ）、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びオボアルブミン等のアルブミン；肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）；ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）；トランスフェリン結合タンパク質、ポリ（リシン：グルタミン酸）等のポリアミノ酸；ＴＬＲ−５のペプチジルアゴニスト（例えば、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のような運動性細菌のフラジェリン）；並びに上記担体の誘導体及び／又は組合せを包含するがこれらに限定されない、タンパク質担体である。ヒトにおいて使用するための好ましい担体は、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７及びＯＭＰＣを包含する。
リンカーと担体との間の結合の種類、並びに担体及びオリゴ糖の構造的性質に応じて、担体は、平均して、例えば、１から５００、１から１００、１から２０、又は３から９つのオリゴ糖単位をその表面上に表示し得る。
オリゴ糖を担体タンパク質等の担体に付着させるための方法は慣例的であり、当業者ならば、本発明に従い、慣例的な方法を使用してコンジュゲートを作成することができる。ガイダンスは、例えば、米国特許第４，３５６，１７０号；同第４，６１９，８２８号；同第５，１５３，３１２号；同第５，４２２，４２７号；及び同第５，４４５，８１７号を包含する種々の開示において；並びに種々の印刷物及びオンラインのＰｉｅｒｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｕｉｄｅｓ ａｎｄ ｃａｔａｌｏｇｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）においても利用可能である。
一実施形態において、本発明の糖鎖抗原は、多数のＦＤＡ承認ワクチンにおいて使用される市販のタンパク質担体であるＣＲＭ１９７とコンジュゲートされる。ＣＲＭ−コンジュゲートは、ＯＭＰＣ等の他のＦＤＡ承認担体よりも、合成、精製及び特徴付けするのが容易という利点を有する。糖鎖抗原は、チオール−ブロモアセチルコンジュゲーション化学を介してＣＲＭとコンジュゲートされ得る。ＣＲＭ活性化は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７−０１３４７６２号において以前に記述されている通りの標準的な条件を使用して、リシン側鎖をブロモ酢酸のＮＨＳエステルと反応させることによって達成され得る。ＣＲＭは、コンジュゲーションの前にタンパク質１個当たり１０〜２０のブロモアセチル基（ｎ＝１０〜２０）で官能基化されてよい。コンジュゲーションは、ＣＲＭの凝集を回避するためにｐＨ＝９で行ってもよい。ｐＨの慎重なモニタリングを用いて、ＣＲＭのバックグラウンド加水分解を最小化しながらＮＨＳ−ブロモ酢酸との完全なＣＲＭ反応を確実にしなくてはならない。活性化ＣＲＭを、コンジュゲーション前にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製してよい。抗原−ＣＲＭコンジュゲートは、チオール終端糖鎖抗原をブロモアセトアミド−活性化ＣＲＭと反応させることによって合成できる。
サイズ排除クロマトグラフィーを介しＣＲＭコンジュゲートを精製して、あらゆる未反応炭水化物を除去及び回収してよい。ＭＢＴＨ（ＧｌｃＮＡｃ残基に特異的）及びブラッドフォードアッセイを使用して、炭水化物：タンパク質比及びタンパク質含有量をそれぞれ先述の通りに決定することができる（Ｍａｎｚｉら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１７．９．１節（付録３２）、１９９５。好ましい実施形態において、各コンジュゲートにつき約１０重量％の最小炭水化物含有量が生じ得る。典型的には、コンジュゲートは、タンパク質担体１個当たり約３〜２０個の抗原を包含し得る。
別の実施形態において、糖鎖抗原は、ＥＬＩＳＡ及びマイクロアレイを包含する診断アッセイの開発に好適な１つ又は複数の担体にコンジュゲートされ得る。そのようなアッセイにおいて使用するための例示的な担体は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ビオチン、標識、スライドガラス又は金表面を包含する。例として、合成糖鎖抗原は、チオール−マレイミドカップリング手順によってＢＳＡとコンジュゲートされてよい（図５Ｂ）。マレイミド−ＢＳＡは、タンパク質１個当たり１５〜２０のマレイミド基（ｎ＝１５〜２０）を含有する。したがって、オリゴ糖抗原は、マレイミド官能基化ＢＳＡとコンジュゲートされてよく、それによって２０倍モル過剰の抗原がマレイミドコンジュゲーション緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中の市販のイムジェクトマレイミドＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応する。コンジュゲーションは、コンジュゲーション中におけるマレイミド基の加水分解を回避するために、ｐＨ＝７．２で行ってもよい。
サイズ排除クロマトグラフィーを介してＢＳＡコンジュゲートを精製して、あらゆる未反応炭水化物を除去及び回収してよい。炭水化物含有量及びコンジュゲートの価数についての情報を提供するために、フェノール−硫酸及びブラッドフォードアッセイを介する特徴付けをＭＡＬＤＩ−ＭＳとともに行ってもよい。好ましい実施形態において、コンジュゲートは、ＢＳＡコンジュゲート１つ当たり約１０重量％の最小炭水化物含有量及びコンジュゲート１つ当たり８より多くの抗原複製を含有すると予想される。
ＬＯＳ−オリゴ糖構造を合成するための方法
さらなる態様において、本発明は、単糖及び二糖ビルディングブロックから上述したものを包含する緑膿菌から合成均一ＬＯＳ−オリゴ糖構造を構築するための方法を提供する。
スキームＩは、緑膿菌ワクチン外核逆合成を示す。
スキームＩ：
Figure 2015525771
外核は、スキーム１における逆合成の後、ＷＯ２０１２／０８２６３５において記述されている手順に従って調製され得る。
α−グルコシル供与体は、下記のスキーム：
Figure 2015525771
を使用して調製され得る。
緑膿菌ワクチン外核合成を調製するために好適なガラクトサミンリンカー単位は、下記の通りに調製され得る：
Figure 2015525771
カルバミン酸ヘキシル（ベンジル）化合物は、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ Ｄ．Ｍ．ら（Ｃｏｌｌｅｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５８：１５９〜１７２９１９９３））によって記述されている手順を使用して調製され得る。６−Ｏ及び４−Ｏを、Ｂｅｄｉｎｉ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．３４９：２４〜３２（２０１２）に準じてベンジリジンで保護してよい。
緑膿菌ワクチン外核を調製するために好適な分枝状グルコース二糖単位は、下記の通りに調製され得る：
Figure 2015525771
緑膿菌ワクチン外核を調製するために好適なコア四糖（ｔｅｔｒａｃａｃｃｈａｒｉｄｅ）構築物（ａｓｓｅｍｐｌｉｅｓ）は、下記の通りに調製され得る：
Figure 2015525771
ＧａＩＮ３−３，４−ジオールと二糖との選択的カップリングは、Ｏｓｓｗａｌｄら（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５８ｂ：７６４〜７７４（２００３））及びＫｏｍａｒｏｖａ Ｂ．Ｓ．ら（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．４７：３５８３〜７８（２００６））によって開示されている下記の手順によって達成され得る。いずれの参考文献も、４位よりも３位を選んで反応の選択性を示している。Ｋｏｍａｒｏｖａは、得られた三量体の４位をＯＴＦＩ−活性化単糖とカップリングして、四量体を提供するためのプロセスについても記述している。
表１において記述されている他のものを包含する、上述したＬＯＳ−オリゴ糖及びそのコンジュゲートの合成のための組成物及び方法を、以下の例１から９において記述する。ＬＯＳ−オリゴ糖の合成において用いられる保護基は、糖化学において習慣的に考慮されるもの、例えば、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９において言及されているものを包含し得る。
免疫原性及び免疫防御組成物並びにそれらの使用方法
別の態様において、本発明は、ＬＯＳ抗原に対する免疫応答を誘導するための、ＬＯＳオリゴ糖又はＬＯＳオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲートを含有する免疫原性及び免疫防御組成物を提供する。免疫原性組成物は、動物又は個体への投与に好適な、１つ又は複数のアジュバント、及び薬学的に許容されるビヒクルを包含し得る。免疫原性又は免疫防御組成物は、本明細書においてさらに定義されている通り、免疫応答を生じさせること又は防御免疫を提供することを目的として、「十分な量」若しくは「免疫学的有効量」の本発明によるオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート、及び上記で言及した成分のいずれかを包含することになる。
一実施形態において、本発明は、緑膿菌に対する免疫応答を誘導するために好適な、ＬＯＳオリゴ糖（単数又は複数）１ａ又はＬＯＳオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート（単数又は複数）１ｂを含む免疫原性組成物を提供する。
別の実施形態において、本発明は、緑膿菌感染症に対する防御のためのワクチンとして製剤化された、ＬＯＳオリゴ糖（単数又は複数）１ａ又はＬＯＳオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート１ｂを含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの１つ又は複数の緑膿菌血清型から防御するためのワクチンとして製剤化された、オリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート１ｂを含む医薬組成物を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、１つ又は複数の緑膿菌血清型に対する受動免疫又は治療を提供するための方法において使用するための、抗体と生理学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物を提供する。より詳細には、本発明は、本発明に係る１つ又は複数のＬＯＳ−オリゴ糖コンジュゲート１ｂ組成物に対する抗体調製物を提供する。抗体調製物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マウスモノクローナルＩｇＧ抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、それらのフラグメント、又はそれらの組合せからなる群からの任意のメンバーを包含し得る。本発明は、本明細書において記述されているＬＯＳ−オリゴ糖のいずれかに対して向けられているモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をさらに意図している。
オリゴ糖若しくはオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート又はそれに対する抗体の投与は、非経口投与によって（例えば、静脈内に、皮下に、皮内に又は筋肉内に）；例えば気道表面への抗体の局所投与によって；経口投与によって；例えば鳥類における卵内注射によって等を包含する任意の好適な手段によって行われ得る。
具体的な態様において、各免疫原性又は免疫防御組成物は、実質的に水性の混合物を形成する薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤中に、式１ａ若しくは１ｂによる１つ又は複数のオリゴ糖又はそのコンジュゲートを包含する。好ましい実施形態において、免疫原性又は免疫防御組成物は、１つ又は複数のオリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲートを、動物又は個体への投与に好適な１つ又は複数の薬学的に許容されるアジュバント、ビヒクル及び／又はタンパク質担体と併せて包含する。
アジュバント
オリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート組成物は、１つ又は複数の免疫学的アジュバントをさらに包含し得る。免疫学的アジュバントは、抗原と組み合わせた場合に、抗原単独によって誘導される応答と比較して、抗原に対する免疫応答を増大させるため、より少ない抗原で同様の応答を達成することができる化合物である。例えば、アジュバントは、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、又は両方を増進し得る。
当業者であれば、用語「アジュバント」及び「担体」は、かなりの程度重複する場合があることが分かるであろう。例えば、「アジュバント」として作用する物質は「担体」であってもよく、「担体」であると通例考えられるある特定の他の物質は、例えば、「アジュバント」としても機能し得る。したがって、合成オリゴ糖の免疫原性を増大させ得る物質又はそれに関連する担体は、潜在的なアジュバントである。本明細書において使用される場合、担体は、概して本発明のオリゴ糖とのより方向付けられた部位特異的コンジュゲーションに関して使用され、一方アジュバントは、概して本発明のオリゴ糖との特異性が低い又はより一般化された構造的結合において使用される。
例示的なアジュバント及び／又はアジュバント組合せは、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム（ミョウバン）（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）等のアルミニウム塩並びにリン酸カルシウムを包含する鉱物塩；２％スクアレン／ツイン８０エマルション中に、細菌、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出された３つの成分を含有し、ここで、ＭＰＬ、ＴＤＭ又はＣＷＳの３つの成分のいずれかを、単独で又は２つずつ組み合わせて使用してもよい、ＲＩＢＩ；例えば、ＴＬＲ−１のアゴニスト（例えば、トリ−アシルリポペプチド）；ＴＬＲ−２のアゴニスト［例えば、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）及びブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）のようなグラム陽性細菌のペプチドグリカン；リポタイコ酸］；ＴＬＲ−３のアゴニスト（例えば、二本鎖ＲＮＡ及びポリ１：Ｃ等のそれらの類似体）；ＴＬＲ−４のアゴニスト（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及び大腸菌のようなグラム陰性細菌のリポ多糖（エンドトキシン））；ＴＬＲ−５のアゴニスト（例えば、リステリア菌のような運動性細菌のフラジェリン）；ＴＬＲ−６のアゴニスト（例えば、ＴＬＲ−２ペプチドグリカン及びある特定の脂質（ジアシルリポペプチド）を持つ）；ＴＬＲ−７のアゴニスト（例えば、インフルエンザ、はしか及びおたふく風邪等のウイルスの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノム；並びにロキソリビン及びｓｓＲＮＡのようなグアノシンベースの抗ウイルス低合成分子並びにそれらの類似体）；ＴＬＲ−８のアゴニスト（例えば、ｓｓＲＮＡと結合する）；ＴＬＲ−９のアゴニスト（例えば、病原体のＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ及びそれらの類似体；ＴＬＲ−１０のアゴニスト（機能は定義されていない）及びＴＬＲ−１１−（例えば、数種の感染性原生動物によって発現されるタンパク質と結合する（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）を含む、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、特異的なｔｏｌｌ様受容体アゴニストは、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）、ＯＭ−１７４（大腸菌脂質Ａ誘導体）を包含する；ＯＭトリアシル脂質Ａ誘導体、並びに、ＭＰＬ（登録商標）−ＳＥ、ＲＣ−５２９（Ｄｙｎａｖａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＳ０１（リポソーム＋ＭＰＬ＋ＱＳ２１）、ＡＳ０２（水中油型ＰＬ＋ＱＳ−２１）及びＡＳ０４（ミョウバン＋ＭＰＬ）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ、Ｐａ．）を包含する他のＭＰＬ又は脂質Ａベースの製剤及びそれらの組合せ、免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有するＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、二本鎖ＲＮＡ、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、並びにリポソーム中に場合により封入されている他のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド；ＡＳ０３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ、Ｐａ．）、ＭＦ−５９（微小流体化された洗浄剤安定化スクアレン水中油型エマルション；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、並びにモンタナイドＩＳＡ−５１ＶＧ（安定化油中水型エマルション）及びモンタナイドＩＳＡ−７２０（安定化水／スクアレン；Ｓｅｐｐｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ）を包含する水中油型エマルション；コレラ毒素Ｂサブユニット；Ｑｕｉｌ Ａ又はＱＳ２１等のサポニン、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から得られたＨＰＬＣ精製非毒性画分（ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ；サポニン及び脂質の構造化複合体）を包含するサポニンベースのアジュバント、並びにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）及びＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００及び−３００シリーズアジュバント（Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）等の他のＩＳＣＯＭベースのアジュバント；米国特許出願第２００６／００７３１７１号において開示されている通りの水中油型エマルションと一緒になったＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬ；ステアリルチロシン（ＳＴ）及びそのアミド類似体；ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）；完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）；ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３等のサイトカイン、Ｂ７．１等のアクセサリー分子、及び肥満細胞アクチベーター化合物４８／８０（Ｃ４８／８０）等の肥満細胞（ＭＣ）アクチベーターを包含する、免疫アジュバント；不水溶性無機塩；ＤＮＰＣ／Ｃｈｏｌ及びＤＣ Ｃｈｏｌから作製されたものを包含するリポソーム；ミセル；スクアレン；スクアラン；米国特許第４，６０６，９１８号において見られる通りのＮ−アセチル−ムラミール−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、及びＮ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリル等のムラミールジペプチド；ＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅｘ）；ＡＳ０５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ、Ｐａ．）；並びにそれらの組合せからなる群から選択され得る。
好ましい実施形態において、アジュバント効力は、種々の送達系を包含する上述した通りの複数のアジュバントを、免疫増強物質と組み合わせて、抗原特異的免疫応答をインビボで強化するように相乗的に作用する可能性を持つ多成分アジュバントを形成することによって強化され得る。例示的な免疫増強物質は、例えば、ＭＰＬ及び合成誘導体、ＭＤＰ及び誘導体、オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ等）、ｄｓ ＲＮＡ、代替的な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）（大腸菌易熱性エンテロトキシン；フラジェリン、サポニン（ＱＳ−２１等）、低分子免疫増強剤（ＳＭＩＰ、例えば、レシキモド［Ｒ８４８］）、サイトカイン、並びにケモカインを包含する、上述のアジュバントを包含する。
薬学的に許容される送達ビヒクル
上述したものを包含する薬学的に許容される送達ビヒクルを用いて、送達を強化し、且つ／又は作用持続時間を制御することができる。制御放出調製物は、オリゴ糖、オリゴ糖コンジュゲート及び／又はアジュバントを複合する又は吸収するためのポリマーの使用を介して達成することができる。制御送達は、適切な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセタート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミン）及び巨大分子の濃度、並びに放出を制御するための取り込みの方法を選択することによって実現され得る。制御放出調製物によって作用持続時間を制御するための別の考えられる方法は、本発明の化合物を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレン酢酸ビニルコポリマー等のポリマー材料の粒子に取り込むことである。代替として、これらの作用物質をポリマー粒子に取り込む代わりに、これらの材料を、例えば界面重合で調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリラート）−マイクロカプセル中にそれぞれ、又はコロイド状薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル中に、又はマクロエマルション中に閉じ込めることが可能である。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記において開示されている。
オリゴ糖−タンパク質担体コンジュゲート組成物を包含する本発明のオリゴ糖組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化され得、それによって、これらの材料又はそれらの官能性誘導体は、薬学的に許容されるビヒクル（又は賦形剤）との混合物に合わせられる。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを包含するそれらの製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記において記述されている。有効な投与に好適な薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は、有効量の上述の化合物を、好適な量のタンパク質担体及び／又はビヒクルと一緒に含有することになる。
典型的には、免疫原性又は免疫防御組成物は、液体溶液又は懸濁液；注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態としてのいずれかで、注射用物質として調製され得る。非経口投与用の水性組成物は、例えば、薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤、好ましくは主として水性ビヒクルに溶解又は懸濁された免疫原性成分（単数又は複数）の溶液を包含し得る。薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤は、水、リン酸で緩衝された中性生理食塩溶液を包含する生理食塩水、トリス、グリセロール、エタノール等を包含し得る。水性組成物は、無菌、パイロジェンフリー緩衝生理食塩水又はリン酸含有溶液として製剤化され得、これは、保存剤を包含してもよいし、又は保存剤非含有であってもよい。好適な保存剤は、例えば、ベンジルアルコール、パラベン、チメロサール、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムを包含する。水溶液は、好ましくはほぼ等張であり、その張性は、酒石酸ナトリウム、塩化ナトリウム、プロピレングリコール及びリン酸ナトリウム等の作用物質で調整され得る。加えて、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張性調整剤、湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等（酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、オレイン酸トリエタノールアミン等を包含する）を包含する、生理学的条件に近づけるために必要とされる補助物質が、本明細書において記述されているビヒクルとともに包含されていてよい。
これらの組成物は、慣例的な滅菌技術によって滅菌されてもよいし、又は滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージするか、又は凍結乾燥してよく、凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わせる。そのような医薬組成物の調製は、当業者の技量内であり、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、上記等の標準的な参考図書によって指導され得る。
組成物は、経口送達用の固体又は液体形態で製剤化されてよい。固体組成物では、非毒性且つ／又は薬学的に許容される固体タンパク質担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を包含し得る。経口投与では、薬学的に許容される非毒性組成物は、先に収載したタンパク質担体を包含する通例用いられる添加剤のいずれかと、タンパク質担体にコンジュゲートされるか否かにかかわらず、１つ又は複数の本発明の化合物である活性原料の単位投薬量とを取り込むことによって形成され得る。
気道表面への抗体の局所適用は、例えば、鼻腔内投与によって（例えば、医薬製剤を鼻腔内に堆積させる、点滴器、綿棒又は吸入器の使用によって）行われ得る。気道表面への抗体の局所適用は、エアロゾル懸濁液として抗体を含有する医薬製剤（固体粒子及び液体粒子の両方を包含する）の呼吸域粒子を作成し、次いで対象に呼吸域粒子を吸入させることによって等、吸入投与によっても行われ得る。医薬製剤の呼吸域粒子を投与するための方法及び装置は周知であり、任意の慣例的な技術を用いてよい。経口投与は、摂取可能な（ｉｎｇｅｓｔａｂｌｅ）液体又は固体製剤の形態であってよい。
さらに、組成物は、経鼻投与用のエアロゾルに製剤化されてよい。エアロゾル投与では、免疫原性化合物は、好ましくは、界面活性剤（単数又は複数）及び／又は噴射剤（単数又は複数）とともに微粉化した形態で供給される。界面活性剤は非毒性となり、好ましくは噴射剤に可溶性である。そのような作用物質の代表は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸及びオレイン酸等の６から２２個までの炭素原子を含有する脂肪酸のエステル又は部分エステルに、脂肪族多価アルコール又はその環状無水物を加えたものである。混合又は天然グリセリド等の混合エステルを用いてよい。界面活性剤は、組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を構成し得る。組成物の平衡は通常は噴射剤である。タンパク質担体は、所望の通り、例えば鼻腔内送達用のレシチンと同様に包含されていてもよい。
医薬製剤中における本発明の免疫原性オリゴ糖の濃度は、広く、すなわち、重量で、約０．１％未満、通常は約０．１％又は少なくとも約０．１％から、最大２０から５０％以上まで変動し得、主として流体体積、粘度等により、選択された特定の投与様式に従って選択されることになる。化合物及び組成物のヒト単位用量形態は、典型的には、ヒト単位用量の許容されるタンパク質担体、好ましくは水性タンパク質担体を含む医薬組成物に包含され、そのような組成物のヒトへの投与に使用されることが当業者に公知である流体の体積で投与され、治療される特定の対象のための一般に理解されている原理に従って調整される。故に、一実施形態において、本発明は、０．１〜３ｍｌ、好ましくは０．２〜２ｍＬ等の好適な量の水溶液中の、単位投薬量の本発明のワクチン成分を提供する。
治療の方法
本発明の免疫原性及び免疫防御組成物は、緑膿菌による感染症を発症するリスクがある任意の動物種に投与され得る。
治療は、単回用量スケジュール、又は好ましくは複数回用量スケジュールで与えられてよく、複数回用量スケジュールにおいて、初期の治療経過は１〜１０回の別個の用量によるものであってよく、続いて、応答を維持及び又は増強するために必要とされるその次の時間間隔で、例えば２回目の用量の場合には１〜４か月間で別の用量を与えてもよく、さらに必要ならば数か月後にその次の用量（単数又は複数）を与えてもよい。好適な治療スケジュールの例は、（ｉ）０、１か月及び６か月、（ｉｉ）０、７日及び１か月、（ｉｉｉ）０及び１か月、（ｉｖ）０及び６か月、又は病状を低減させることが期待される所望の応答を引き出す、若しくは疾患の重症度を低減させるために十分な他のスケジュールを包含する。
免疫応答を誘導する又は防御免疫を提供するために有効な量は、オリゴ糖組成物、タンパク質担体とのコンジュゲーション、アジュバント（単数又は複数）の包含及び性質、投与の様式、患者の体重及び全般的な健康状態、並びに処方医師の判断を包含する様々な要因によって決まることになる。例として、量は、概して、初期免疫化では（すなわち予防的投与では）、７０ｋｇの患者には約１．０μｇから約５，０００μｇまでの糖鎖抗原（例えば、１．０μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、３．５μｇ、４．０μｇ、４．５μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、１７．５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、７５０μｇ、１，０００μｇ、１，５００μｇ、２，０００μｇ、２，５００μｇ、３，０００μｇ、３，５００μｇ、４，０００μｇ、４，５００μｇ又は５，０００μｇ）の範囲であってよい。対象に投与される実際の用量は、多くの場合、対象の体重１ｋｇ当たりの適切な量に従って決定される。例えば、有効量は、体重１ｋｇにつき約０．１μｇから５μｇであってよい。
一次用量に続いて、場合により、約１．０から約１，０００までの糖鎖抗原の追加免疫投与（例えば、１．０μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、３．５μｇ、４．０μｇ、４．５μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、１７．５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、７５０μｇ、１，０００μｇ、１，５００μｇ、２，０００μｇ、２，５００μｇ、３，０００μｇ、３，５００μｇ、４，０００μｇ、４，５００μｇ又は５，０００μｇ）を、追加免疫レジメンに準拠し、患者の血液中における特異的Ｔ細胞活性を測定することにより、患者の応答及び状態に応じて、数週間から数か月間にわたって行ってもよい。
本発明は、本明細書において記述されている合成オリゴ糖のいずれかを含む一価及び多価のグリココンジュゲートワクチンの使用を意図している。交差反応性免疫応答を引き出す単一のオリゴ糖抗原の同定は、すべての一般的な緑膿菌細菌血清型及び／又は株に対して活性な単抗原ワクチン候補の開発を容易にすることができる。
本発明は、緑膿菌の単一の血清型若しくは血清型亜型に対する、又は緑膿菌の複数の血清型若しくは血清型亜型に対する防御を提供するように、本明細書において記述されている合成オリゴ糖のいずれかを複数含む多抗原グリココンジュゲートワクチンをさらに意図している。故に、一実施形態において、例えば、本発明は、式１ｂによる、２、３、４つ又はそれ以上の異なるオリゴ糖抗原を含有する組成物を提供する。
本発明の化合物を含む免疫原性組成物は、ＬＯＳ発現細菌種に起因する感染症に罹患するリスクのある幼児他を包含する、成人又は小児において使用するのに好適となり得る。場合により、そのような組成物は、他の薬学的に活性な物質と組み合わせて投与されてよく、高頻度で、小児期予防接種プログラムの一部として、他のワクチンと組み合わせて投与されるであろう。
投与用の組成物は、有益に、緑膿菌の単一の株若しくは血清型に対する、又は緑膿菌の複数の株若しくは血清型に対する防御の増大を提供するように、複数の異なるエピトープに対して免疫応答を引き出す複数のオリゴ糖又はオリゴ糖コンジュゲートを包含し得る。その上、組成物を投与することにより、１つ又は複数の抗原コンジュゲートによる初回免疫化に続いて、本発明による１つ又は複数の交差反応性コアコンジュゲートを用いる追加免疫イベントを起こしてもよい。
抗体組成物
別の実施形態において、本発明は、診断用抗体、及び、抗ＬＯＳ抗体（単数又は複数）又はその官能性フラグメント（単数又は複数）と、生理学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物を提供する。これらの抗体を生じさせるための方法について以下でさらに記述する。
医薬抗体組成物は、緑膿菌感染症に対する受動免疫を提供するための方法において使用され得る。医薬抗体組成物は、動物対象、好ましくはヒトに、緑膿菌の１つ又は複数の株又は血清型による感染症を予防する又はその重症度、持続時間の程度を軽減するために十分な量で投与され得る。
１つ又は複数の抗体の投与は、予防的（細菌感染症への予測される暴露前）又は治療的（感染症の開始後、又は症状の発生時若しくはその直後）のいずれかであってよい。１つ又は複数の抗体の投薬量は、対象の年齢、体重及び種のような要因に応じて変動することになる。概して、抗体の投薬量は、体重１ｋｇにつき約１〜１０ｍｇの範囲内であってよい。好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＡクラスのヒト化抗体である。１つ又は複数の抗体の投与経路は、経口又は全身、例えば、皮下、筋肉内若しくは静脈内であってよい。
診断剤としての抗体の使用について、以下並びに米国特許第７，５９５，３０７号及び米国特許出願公開第２００９／０１５５２９９号においてさらに記述されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、緑膿菌感染症を診断し、治療し、且つ／又は予防するために有用な１つ又は複数のキットも提供する。例えば、キットは、本発明の診断又は医薬組成物を保持する１つ又は複数の容器を包含し得る。キットは、例えば、特定の診断又は薬学的使用に必要又は好都合な１つ又は複数の溶液を含有する、他の容器（単数又は複数）も包含し得る。容器手段は、ガラス、プラスチック又はホイルでできていてよく、バイアル、ボトル、パウチ、チューブ、バッグ等であってよい。キットは、本発明を行うための手順等の書面情報、又は容器（単数又は複数）中に含有される試薬の量等の分析情報を含有していてもよい。
抗体の生成及びアッセイ開発におけるその使用
さらなる態様において、本発明は、検出剤及び血清スクリーニングツールとしてのそれらの使用を包含する、アッセイ開発において使用するための抗体の産生を誘導するための組成物及び方法を提供する。
ＬＯＳ−コンジュゲートに対する抗血清は、ニュージーランド白ウサギにおいて、１３週にわたる３〜４回の皮下注射によって生じ得る。免疫前出血により、各ウサギから約５ｍＬのベースライン血清を生じさせることができる。初回注射（１０μｇの抗原等価物）は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のエマルションとして投与され得る。その後の注射（５μｇの抗原等価物）は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中、３週間間隔で与えられてよい。ウサギは、第３回免疫化の１週間後から開始して２週間ごとに出血させてよい。ウサギ１匹当たりおよそ２５〜３０ｍＬの血清を各出血イベントにより生じさせ、−８０℃で凍結させてよい。血清を、後述する通り、対応するＬＯＳ−コンジュゲートに対してＥＬＩＳＡによって分析してよい。加えて、後者の出血からの抗血清を、さらに後述する通りに親和性精製してよい。
本発明のオリゴ糖及び抗体は、生物試料中に存在する緑膿菌ＬＯＳ抗原又はそれに対する抗体を検出するための診断試薬として使用され得る。検出試薬は、ＥＬＩＳＡ及びマイクロアレイに関係するテクノロジーを包含する、当業者に公知である様々な免疫診断技術において使用され得る。加えて、これらの試薬を使用して、免疫原性オリゴ糖コンジュゲートに対する、血清抗体レベルを包含する抗体応答を評価することができる。本発明のアッセイ方法論は、典型的には、蛍光、化学発光、放射性、酵素的標識又は色素分子等の標識、並びに／或いは、生物試料中の抗原又は抗体と固体支持体に結合している対応する抗体又は抗原との間の複合体の直接的又は間接的検出のための二次的免疫学的試薬の使用を伴う。
そのようなアッセイは、典型的には、抗体−抗原複合体が結合している固相支持体からの液相中における非結合抗体の分離を伴う。本発明の実践において使用され得る固体支持体は、ニトロセルロース等の基質（例えば、膜又はマイクロタイターウェルの形態で）；ポリビニルクロリド（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ等を包含する。
典型的には、固体支持体を、第１の結合成分が支持体に十分固定化されるような好適な結合条件下で、第１の結合成分（例えば、本発明に係る抗原又は抗体）と最初に反応させる。いくつかの事例において、支持体への可動化は、抗体又はオリゴ糖を、より良好な結合特性を持つ、又は抗体結合活性も特異性も有意な喪失なしに支持体上に抗体又は抗原の固定化を提供するタンパク質と最初にカップリングすることによって、強化することができる。好適なカップリングタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を包含する血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、及び当業者に周知である他のタンパク質等の巨大分子を包含するがこれらに限定されない。抗体を支持体と結合するために使用され得る他の分子は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー等を包含する。そのような分子及びこれらの分子をカップリングする方法は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第７，５９５，３０７号及び米国特許出願公開第２００９／０１５５２９９号において記述されている。
本発明のシュードモナス菌ワクチン及びオリゴ糖に関するさらなる情報は、付録Ａにおいて添付する。
上記の詳細な説明は限定ではなく例証と考えられること、並びに本発明の趣旨及び範囲を定義するように意図されているのは、すべての等価物を包含する下記の特許請求の範囲であると理解されるものとする。

Claims (31)

  1. 合成オリゴ糖１ａ又は１ｂ
    Figure 2015525771
    ［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立に、Ｈ、単糖又はオリゴ糖であり、Ｘは、Ｈ、リンカー基又は保護基であり；Ｌはリンカーであり、Ｙは担体である］。
  2. Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｈ、α−Ｒｈａ−、α−Ｇｌｃ（１−２）−α−Ｒｈａ−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、β−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ−、α−Ｒｈａ［２，３，４−ＯＡｃ］−、β−ＱｕｉＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４−ＯＡｃ］−及びβ−ＦｕｃＮＡｃ（１−３）−α−Ｒｈａ［２，４，−ＯＡｃ］からなる群から独立に選択される、請求項１に記載のオリゴ糖。
  3. Ｒ１及びＲ２が、下記の表：
    Figure 2015525771
    において収載されている組合せの１つから選択される、請求項１に記載のオリゴ糖。
  4. Ｌがアルキレンチオールリンカーである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のオリゴ糖。
  5. Ｙが、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリマー、デンドリマー、ビロソーム及びウイルス様粒子又はそれらの組合せからなる群から選択される担体である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の合成オリゴ糖。
  6. 担体が担体タンパク質である、請求項５に記載の合成オリゴ糖。
  7. 担体タンパク質が、細菌トキソイド、毒素、エキソトキシン、及びそれらの非毒性誘導体からなる群から選択される、請求項６に記載の合成オリゴ糖。
  8. 担体タンパク質が、破傷風トキソイド、破傷風毒素フラグメントＣ、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ、コレラトキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）エキソトキシン又はトキソイド、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ、遺伝子的に解毒されたその変異体；細菌外膜タンパク質、血清型Ｂ外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、外膜クラス３ポーリン（ｒＰｏｒＢ）、ポーリン；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、チログロブリン、アルブミン及びオボアルブミン；肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）；ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）；トランスフェリン結合タンパク質、ＴＬＲ−５のペプチジルアゴニスト；並びに上記担体の誘導体及び／又は組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の合成オリゴ糖。
  9. 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリ（リシン：グルタミン酸）、運動性細菌のフラジェリン、並びにそれらの誘導体及び／又は組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の合成オリゴ糖。
  10. 担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７及びＯＭＰＣからなる群から選択される、請求項８に記載の合成オリゴ糖。
  11. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴ糖を、免疫応答を刺激するための有効量で含み、場合により薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
  12. アジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 免疫応答が抗原特異的免疫応答である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
  14. 請求項１から３までのいずれか一項に記載の合成オリゴ糖と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、組成物。
  15. 複数の異なるオリゴ糖を含み、ここで、各オリゴ糖は式１ａ又は１ｂのオリゴ糖である、請求項１４に記載の組成物。
  16. アジュバントをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  17. アジュバントが、アルミニウム塩、ＲＩＢＩ、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＡＳ０５、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、ＭＦ−５９、モンタナイドＩＳＡ−５１ＶＧ、モンタナイドＩＳＡ−７２０、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ２１、合成サポニン、免疫刺激複合体、ステアリルチロシン、ウイルス様粒子、再構成インフルエンザビロソーム、サイトカイン、肥満細胞アクチベーター化合物４８／８０、リポソーム、ムラミールジペプチド、ＳＡＦ−１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
  18. シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に対する免疫を与えるのに十分な量の、少なくとも１種のオリゴ糖を含む、請求項１６に記載の組成物。
  19. ワクチンとしての、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のオリゴ糖を含む組成物。
  20. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載のオリゴ糖に対する抗体調製物。
  21. ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マウスモノクローナルＩｇＧ抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、それらのフラグメント、又はそれらの混合物からなる群からの少なくとも１つのメンバーを含む、請求項４６に記載の抗体調製物。
  22. 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症に関連する疾患を治療する方法であって、シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に対する免疫応答を誘導するための有効量の、請求項１から１０までのいずれかに記載のオリゴ糖又はそれに対する抗体を投与するステップを含む上記方法。
  23. 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症に関連する疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１から１９までのいずれかに記載のオリゴ糖又は組成物を投与するステップを含む、上記方法。
  24. 患者がヒトである、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 抗体を産生するための方法であって、
    （ａ）場合によりアジュバントをさらに含む、シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に特異的な抗体を産生するための有効量の、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴ糖を対象に投与するステップと、
    （ｂ）抗体を対象から単離するステップと
    を含む、上記方法。
  26. モノクローナル抗体を産生するための方法であって、
    （ａ）モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）に特異的な抗体を産生するための有効量の、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴ糖を対象に投与するステップと、
    （ｂ）対象から抗体を単離するステップと、
    （ｃ）対象からの抗体産生細胞を、骨髄腫細胞と融合させるステップと、
    （ｄ）融合サブクローンから産生された抗体を収集するステップと
    を含む、上記方法。
  27. 対象がウサギである、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 対象がヒトである、請求項２５又は２６に記載の方法。
  29. 請求項２６のステップ（ａ）から（ｃ）を実施することによって得ることができる抗体産生細胞。
  30. 請求項２６のステップ（ａ）から（ｄ）を実施することによって得ることができる抗体。
  31. 試料を、請求項２０、２１、２９又は３０に記載の抗体と接触させるステップを含む、試料中におけるシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の存在を診断する方法。
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