CN101912609A - 防治绿脓杆菌感染的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及防治绿脓杆菌感染的组合物及其制备方法。本发明要解决的技术问题是安全、有效的预防和治疗绿脓杆菌感染。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种绿脓杆菌免疫原和(或)抗体组合物。该绿脓杆菌免疫原为绿脓杆菌O特异性多糖与载体蛋白共价结合形成的多糖蛋白结合免疫原。本发明将绿脓杆菌O-SP(O特异性多糖)与合适蛋白质结合，提高了免疫原性和保护性，又使T细胞非依赖型多糖抗原转化为T细胞依赖型结合抗原，从而产生持久免疫力以及IgG为主的抗体，具有好的前景。

Description

防治绿脓杆菌感染的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及防治绿脓杆菌感染的组合物及其制备方法。

背景技术

绿脓杆菌对营养和环境条件要求不高，在自然界广泛存在，能从水、土壤、动植物及人体中分离出绿脓杆菌【A.C.Gales，R.N.Jones，J.Turnidge，et al.Characterization of Pseudomonas aeruginosa Isolates.Clin Infect Dis 2001，32(S2)：146-155】。在医院中，洗涤盆(池)、呼吸治疗仪、防腐剂或去污剂等都可成为绿脓杆菌储存场所，交叉传染可发生在病人、卫生工作人员、受污染的材料和试剂之间。

当宿主正常防御机制改变或损伤，如皮肤粘膜破损、留置导尿管、气管切开插管，或免疫机制缺损如粒细胞缺乏、低蛋白血症、各种肿瘤患者、长期应用激素或抗生素的患者，在医院环境中常可从带菌发展为感染。烧伤焦痂下，婴儿和儿童的皮肤、脐带和肠道，老年人的泌尿道，常常易罹患绿脓杆菌感染，故绿脓杆菌成为医院内获得性感染最常见的条件致病菌之一，国家细菌耐药性监测网【马越，李景云，张新妹等.2002年临床常见细菌耐药性监测.中华检验医学杂志，2004，27(1)：38-45】2002年和中国医院内病原菌耐药监测网【陈民钧，王辉.中国重症监护病房革兰阴性菌耐药性连续7年监测研究.中华医学杂志，2003，83(5)：375-381】1994～2001年监测表明，绿脓假单胞菌在临床致病菌分离率中占据前两位。

2002年1月1日～12月31日，国家细菌耐药性监测网包括北京、天津、广东、广西、辽宁、四川、湖北和浙江，计8个省、市、自治区的57家三级甲等医院，共收集临床分离菌48 081株，从每一患者的首次分离株为40 379株。分离菌株数列前20位的菌种见下表。

绿脓杆菌感染常常表现出多种临床症状，例如：

1.绿脓杆菌引起的败血症；大面积烧伤、白血病、淋巴瘤、恶性肿瘤、气管切开、静脉导管、心瓣膜置换术及各种严重慢性疾病等易继发绿脓杆菌败血症。绿脓杆菌引起的败血症病死率则居革兰阴性杆菌首位。

2.呼吸道绿脓杆菌感染；呼吸道绿脓杆菌感染常继发于宿主免疫功能受损后，尤其易发于原有肺部慢性病变基础上，如慢性支气管炎、支气管扩张、气管切开、应用人工呼吸机后。

3.绿脓杆菌引起的心内膜炎；常发生于原有心脏病基础上，心脏手术、瓣膜置换术后，细菌常接种于伤口缝线上或补缀物上，也可发生在烧伤或有药瘾病人的正常心脏瓣膜上。

4.尿路感染；绿脓杆菌是医院内泌尿道交叉感染的常见菌，占院内感染尿路分离菌的第二位，留置导尿管是截瘫患者获得感染的诱因。其他如神经原膀胱、尿路梗阻，慢性尿路感染长期应用抗菌治疗亦易罹患绿脓杆菌感染。40％的绿脓杆菌败血症的原发病为尿路感染。

5.中枢神经系统感染；绿脓杆菌脑膜炎或脑脓肿常继发于颅脑外伤、头和颈部肿瘤手术后，或耳、乳突、鼻窦感染扩散蔓延，腰穿术或脑室引流后。粒细胞缺乏、严重烧伤则为绿脓杆菌败血症过程中迁徙至脑部的危险因子。临床表现与其他细菌性中枢感染相同，但预后较差，病死率在60％以上。

6.绿脓杆菌骨关节感染；主要由于败血症的血行迁徙或来源于邻近组织感染病灶，老年人复杂性尿路感染及泌尿生殖系手术或器械操作，可致多发性椎体骨髓炎。近年来报道，有海洛因注射者常致颈椎骨髓炎。临床预后不良。

7.消化道感染；绿脓杆菌可在消化道任何部位产生病变，常见于婴幼儿以及肿瘤化疗致粒细胞低下的免疫缺损者，可引起婴幼儿腹泻及成人盲肠炎或直肠脓肿。消化道绿脓杆菌感染亦是败血症的重要入侵门户之一。

8.耳、乳突及鼻窦感染；游泳后外耳道的pH因水进入而偏碱性，有利于绿脓杆菌生长，造成外耳道炎。糖尿病伴血管病变者，可发生绿脓杆菌所致慢性无痛恶性外耳道炎。本菌所致的中耳炎及乳突炎常继发于恶性外耳道炎或急性中耳炎，有糖尿病或其他疾病时，绿脓杆菌可通过血管鞘而引起颅内感染。

9.皮肤软组织感染；败血症患者可继发红斑坏疽性皮疹、皮下结节、深部脓肿、蜂窝织炎等皮损。烧伤创面、褥疮、外伤创口及静脉曲张溃疡面上，经常可培养出绿脓杆菌。

10.眼科感染；绿脓杆菌是角膜溃疡或角膜炎的常见病原菌之一，在各种细菌引起的角膜溃疡中，绿脓杆菌所致的角膜溃疡占第一位。北京市眼科研究所眼微生物室统计的490株致病菌中，绿脓杆菌的比例为32.2％。日本横滨市立大学眼科统计的120株致病菌中，绿脓杆菌为35.8％。在美国，戴隐性眼镜引起的角膜炎中绿脓杆菌占59.2％。感染发展迅速，48小时内可波及全眼并造成失明。

绿脓杆菌在感染过程中能产生多种毒素和酶，如内毒素、外毒素、致死性毒素、肠毒素、溶血素和胞外酶，对肌体造成伤害，尽管新的抗菌药物不断推出，但该菌的广谱耐药并有增加的趋势，多少年来其感染致死率一直居高不下，据美国国家院内感染监测的数据显示，铜绿假单胞菌是院内获得性，特别是呼吸相关性肺炎的首位病因，而铜绿假单胞菌肺炎引起的菌血症死亡率为70.0％。中国医院内病原菌耐药监测网研究表明，铜绿假单胞菌对所有广谱抗菌素的耐药率已升高至20.0％～37.0％。11种抗生素的敏感性都在下降。亚胺培南、头孢他啶的敏感性从1994年的96.0％和92.0％分别降至2001年的75.0％和79.0％，两药的MIC90分别升高16倍和8倍；敏感性降低较明显的是替卡西林/克拉维酸，敏感率从1994年83.0％降至58.0％，MIC50升高4倍；其他抗生素的敏感性降低2～10个百分点。因此，非常有必要对绿脓杆菌进行免疫治疗与预防。

绿脓杆菌LPS是重要的保护性抗原，在各种动物模型中，LPS抗体表现出良好的保护作用，如Cryz S.J.Jr，Furer E.，Germanier R.所述，″Protection against Pseudomonas aeruginosa infection in a murine burn wound sepsis model by passive transfer of antitoxin A，antilastase，and antilipopolysaccharide，″Infect.Immun.1983；39：1072-1079；Kazmierowski J.A.，Reynolds H.Y.，Kauffmann J.C.，Durbin W.A.，Graw R.G.Jr.，Devlin H.B.所述″Experimental pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa in leukopenic dogs：prolongation of survival by combined treatment with passive antibody to Pseudomonas and granulocyte transfusions，″J.Infect.Dis.1977；135：438-446；以及Pier G.B.，Sidberry H.F.，Sadoff J.C.所述″Protective immunity induced in mice by immunization with high-molecular-weight polysaccharide from Pseudomonas aeruginosa，″Infect.Immun.1978；22：919-925。

LPS分子一般都是由三部分(区段)组成：脂质A：为一种糖磷脂，由N-乙酰葡糖胺双糖、磷酸与多种长链脂肪酸组成，它是细菌内毒素的主要成分。核心多糖：由2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)、L-甘油-D-甘露庚糖、半乳糖及匍糖胺这样一组糖类组成。它一边通过KDO残基连接在脂类A上，另一边通过葡萄糖残基与O-侧链相连。O-侧链：是由多糖组成的重复单位，结构复杂，位于菌体的外表面，又称菌体抗原。由于各种革兰氏阴性菌多糖链的种类、排列顺序和空间构型都不同，造成革兰氏阴性菌的O-抗原有不同的特异性。

依据LPS O-特异性多糖化学成分和结构的差异，可将绿脓杆菌菌株分成不同的血清型别。不同国家采用不同的血清分型系统，其中绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)有在全球统一的趋势，最新的绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)有20个单价血清。就中国的临床分离菌株而言，采用IATS 20型分型系统分型血清，可对95％以上的菌株可定出型别，主要的流行菌型为6型、11型、3型、5型、4型、1型及其他菌型菌株。【王世鹏，彭如惠，谢茂超，陈廷祚.绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)分型血清的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1988，8(4)：228-233.王世鹏，谢茂超，彭如惠.绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)_20型血清的试制及应用.中国生物制品学杂志，1991，4(1)：13-16】。

绿脓杆菌国际抗原分型系统(IATS)的6型、11型、3型、5型、4型、1型菌株的O特异性多糖化学成分和结构见【Yu.A.Knirel，E.V.Vinogradov，Nina A.Kocharova，et al.The structure of O-specific polysaccharides and serological classification of Pseudomonas aeruginosa.Acta Microbiologica Hungarica，1988，35(1)：3-24】。

但LPS作为免疫原有两大缺陷，一为LPS本身是内毒素，对人体具有严重的毒负作用，二是LPS为非T细胞依赖抗原，产生以IgM为主的抗体，没有免疫记忆形成，需要多次重复接种疫苗。如Alexander T.W.，Fisher M.，所述″Immunization against Pseudomonas infection after thermal injury，″J.Infect.Dis.1974，130(Suppl.)：152-158.Haghbin M.，Armstrong D.，Murphy M.L.，所述″Controlled prospective trial of Pseudomonas aeruginosa vaccine in children with acute leukemia，″Cancer 1973，32：761-766.以及Young L.S.，Meyer R.D.，Armstrong D.，″Pseudomonas aeruginosa vaccine in cancer patients，″Annals Int.Med.1973，79：518-527.因此LPS在人体上的使用受到了限制。

将LPS中的类脂A除去，得到的O特异性多糖(本申请中所指的O特异性多糖为这种处理后得到的多糖)的毒负作用基本消失，但其免疫原性和动物保护性也大大降低。难以投入实际使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是安全、有效的预防和治疗绿脓杆菌感染。

本发明解决技术问题的技术方案是提供一种绿脓杆菌免疫原。该绿脓杆菌免疫原为绿脓杆菌O特异性多糖与载体蛋白共价结合形成的多糖-蛋白结合免疫原。

其中，上述绿脓杆菌免疫原中的O特异性多糖为绿脓杆菌IATS分型系统1型抗原、3型抗原、4型抗原、5型抗原、6型抗原、11型抗原或16型抗原中的至少一种绿脓杆菌的O特异性多糖。

其中，上述绿脓杆菌免疫原中的载体蛋白是流感嗜血杆菌蛋白D、脑膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌溶血素、白喉类毒素蛋白、破伤风类毒素蛋白或其重组遗传解毒变体、重组铜绿假单胞菌外毒素A、葡萄球菌外毒素h或上述蛋白的无毒突变体。

其中，上述绿脓杆菌免疫原中的绿脓杆菌O特异性多糖与载体蛋白共价结合的方式为1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐活化O特异性多糖上的羟基，然后用己二酰二肼对活化的O特异性多糖进行衍生，然后通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺将该物质连接至白喉类毒素或破伤风类毒素。

其中，上述绿脓杆菌免疫原中的绿脓杆菌O特异性多糖与载体蛋白共价结合的方式为还原胺化法，具体为用高碘酸钠氧化O特异性多糖上的羟基形成醛基，醛基与载体蛋白上的氨基形成亚胺，再在还原剂的作用下形成胺完成结合。所述的还原剂有多种选择，优选为NaCNBH₃。

本发明还提供了一种治疗或预防绿脓杆菌感染的抗体组合物，其特征在于包含：有效剂量的对至少一种绿脓杆菌抗原具有特异性的抗体形成的组合物；或含有该抗体的人血浆；或者向绿脓杆菌易感者投与有效剂量的单价或多价上述的绿脓杆菌免疫原后获得的抗体。

其中，上述抗体组合物为IVIG组合物。

其中，上述IVIG组合物为超免疫特异性IVIG组合物。

其中，上述抗体组合物中所述绿脓杆菌O特异性多糖抗原为绿脓杆菌IATS分型系统1型抗原、3型抗原、4型抗原、5型抗原、6型抗原、11型抗原、16型抗原中的至少一种。

其中，上述抗体组合物中所述抗体为对一种或多种绿脓杆菌IATS分型系统抗原的经修饰的形式具有特异性的抗体。

其中，上述抗体组合物为含有抗一种或多种绿脓杆菌免疫原(抗原)的抗体的人血浆。

其中，上述抗体组合物中所述蛋白免疫原的O特异性多糖经部分修饰。

本发明还提供了抗上述的绿脓杆菌免疫原的抗体。其中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。其中，所述抗体是投与有效剂量的上述的绿脓杆菌免疫原后的绿脓杆菌易感者的血浆中获得的抗体。

本发明还提供了上述的绿脓杆菌免疫原和上述的抗所述绿脓杆菌免疫原的抗体在制备治疗或预防绿脓杆菌感染的药物中的用途。

本发明提供治疗或预防绿脓杆菌感染的抗体组合物是以上述的绿脓杆菌免疫原或上述抗体为主要活性成份，添加药学上可接受的辅助性成分而制备得到的。

其中，上述绿脓杆菌O特异性多糖为绿脓杆菌LPS除去脂质A后的多糖成分。

本发明还提供一种治疗或预防绿脓杆菌感染的药物，所述方法包括对一种或多种绿脓杆菌抗原具有特异性的抗体组合物。其抗体来源于用单价或多价免疫原超免疫献浆员获得特异性免疫血浆，经各种分离技术和加工工艺制备的IVIG以及获得的特异性免疫血浆经各种加工工艺制备的含有特异性免疫抗体的保证临床安全的特异性免疫血浆。为临床患者绿脓杆菌感染的治疗或预防提供一种有效的手段。且其可以单独使用或与其它治疗法组合使用。同时，也可用单价或多价免疫原对绿脓杆菌易感者作主动免疫用。

本发明为了提高消除毒性的O特异性多糖的免疫原性，并使O特异性多糖的T细胞非依赖性转变成T细胞依赖性抗原，特将O特异性多糖与免疫载体结合，这里的免疫载体是一种蛋白质，它可以提高T细胞和B细胞之间的相互作用，用于诱导针对抗原免疫反应，并因此能够提高主动免疫和献血浆者中制备用于随后被动免疫的高滴度抗体血浆的免疫原性。根据本发明，合适的免疫载体包括但不限于白喉类毒素和破伤风类毒素，以及重组技术生产的上述类毒素的遗传去毒变体，葡萄球菌外毒素或类毒素，绿脓杆菌外毒素A或其衍生物和重组技术生产的无毒变异绿脓杆菌外毒素A，以及常用作免疫载体的其他蛋白质。

有多种方法可制备多糖蛋白结合免疫原，依据化学机理，可分为3类。其一是还原胺化法：该偶联方法利用多糖上的醛基和蛋白质上的氨基反应形成亚胺，还原后形成胺；其二是酰胺缩合：利用氨基和羧基反应脱去一分子水将多糖与蛋白质进行偶联；其三是硫醚缩合：由于巯基有很好的亲和性，也可用作偶联功能团。不过，无论是多糖还是蛋白质带有的巯基数量有限，因此常常需要引如更多的巯基。

为了将O特异性多糖结合至载体蛋白，首先将O特异性多糖进行衍生。有多种方法可以用于衍生O特异性多糖并将其共价连接至免疫载体蛋白。活化的O特异性多糖可以用己二酰二肼ADH、胱胺或吡啶二硫代丙酰肼(PDPH)进行衍生，然后可以通过碳二亚胺介导的反应将部分酰胺化的O特异性多糖连接至载体蛋白的羧基，或通过硫醇化O特异性多糖与吡啶二巯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)衍生的载体蛋白之间的二硫化物互换将特异性多糖连接至载体蛋白。

本发明优选1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化O特异性多糖上的羟基，原因在于CDAP毒性较之溴化氰低得多且反应要求的条件温和得多。用己二酰二肼(ADH)对活化的O特异性多糖进行衍生。然后通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)将该物质连接至白喉类毒素或破伤风类毒素。通过层析色谱将产生的结合免疫原与未结合的O特异性多糖和载体蛋白及其他的物质分离开。

本发明也采用还原胺化法制备O特异性多糖蛋白结合免疫原，用高碘酸钠氧化O特异性多糖上的羟基形成醛基，醛基与载体蛋白上的氨基形成亚胺，再在还原剂如NaCNBH₃的作用下形成胺。

无论用何种方法将O特异性多糖结合至载体蛋白，O特异性多糖与载体蛋白的共价连接都能显著提高O特异性多糖的免疫原性，并导致在小鼠体内进行首次和二次激发后抗体相对于O特异性多糖的水平增加。

本发明的O特异性多糖蛋白结合免疫原，可以制备成液体剂型或冻干剂型，除O特异性多糖蛋白结合免疫原成分外，可以添加包括但不限于赋形剂、稀释剂、辅剂和其他免疫刺激剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂。

本发明的O特异性多糖蛋白结合免疫原可以与或不与辅剂一起使用。如果使用了辅剂，则对辅剂进行选择以避免辅剂诱导的毒性。

本发明的O特异性多糖蛋白结合免疫原给献血浆者作首次免疫后，在7～28天后进行第二次免疫，还可在以后的7～28天后进行再次免疫，以使产生高滴度绿脓杆菌抗体血浆。并且，当血浆中绿脓杆菌抗体滴度下降以后，为了恢复血浆中绿脓杆菌抗体滴度，还可进行加强免疫。

本发明用O特异性多糖和载体蛋白经化学方法结合后转变为O特异性多糖蛋白结合免疫原，用该多糖蛋白结合免疫原给献血员免疫，抽取献血员的特异性免疫血浆，经各种分离技术后制得IVIG静脉注射免疫球蛋白供临床应用。

本发明的高滴度绿脓杆菌抗体血浆经各种血浆蛋白分离技术和加工工艺后，制备成特异性绿脓杆菌免疫球蛋白，供临床治疗和预防绿脓杆菌感染用，该制剂可进行静脉输注，也可进行肌肉注射或以其他方式应用。剂量和次数取决于大量因素，诸如感染的严重性和患者免疫状态。举例来说，可能需要投与约一次、两次、三次、四次或四次以上绿脓杆菌超免疫特异性免疫球蛋白以有效治疗感染。具有弱免疫系统或尤其严重感染的患者可能需要更多剂量和/或更频繁的注射输入。含高滴度绿脓杆菌抗体的血浆经各种加工工艺后保证临床安全的特异性免疫血浆也可供临床治疗和预防绿脓杆菌感染。

本发明将绿脓杆菌O-SP(O特异性多糖)与合适蛋白质结合，提高了免疫原性和保护性，又使T细胞非依赖型多糖抗原转化为T细胞依赖型结合抗原，从而产生持久免疫力以及IgG为主的抗体。本发明的特异性绿脓杆菌免疫球蛋白或特异性免疫血浆制剂可与或不与诸如抗生素、免疫调节剂和其他的特异性免疫制剂联合使用，治疗和预防绿脓杆菌感染和其他感染。具有好的营养前景。

附图说明

图1、IATS 1型绿脓杆菌的LPS消化1h后CL-4B层析图。1：LPS；2：O-SP；3：核酸。

图2、IATS 1型绿脓杆菌LPS消化2h后CL-4B层析图。1：LPS；2：O-SP；3：核酸。

图3、IATS 1型绿脓杆菌的O特异性多糖S 300凝胶层析图谱。1：LPS；2、3：O-SP；4、5：核酸。

图4、IATS 6型菌株O特异性多糖衍生后G₅₀柱层析图。1：多糖；2：ADH等小分子。

图5、IATS 1型菌株O特异性多糖-TT结合物4FF柱层析图。1：结合物；2：游离多糖/蛋白；3：EDAC等小分子。

具体实施方式

本发明通过借助下列具体实施方式将更详细说明本发明。下述实例使用的绿脓杆菌均购自ATCC(美国模式菌种保藏中心，American Type Culture Collection)，其保藏号为绿脓杆菌IATS 1型ATCC33348，绿脓杆菌IATS 3型ATCC33350，绿脓杆菌IATS 6型ATCC33354。分别培养各血清型绿脓杆菌，然后取其LPS纯化备用。其他试剂、材料均为普通市售。

绿脓杆菌培养菌体制备可采用液体发酵或固体克氏瓶培养收集，在菌种启封、菌种检定后，进行菌种扩增、大量栽种、杀菌脱毒，最后离心收集菌体。培养方法常规，不详述。

LPS的提取采用热酚水法提取，首先用注射用水将菌体配制成20％的菌液，再加入等体积的事先配制好的90％苯酚液，置65～68℃水浴振荡提取60min，冷却后4000～8000rmp离心50min，抽取水相层LPS提取液，用预热至68℃注射用水补充提取液到原体积，重复提取3次。汇总水相层LPS提取液，再次离心后用进行透析。

LPS提取液用级别为纯化水以上的水液透析，每天换水2～3次，至少透析3天，然后进行纯化。其纯化可用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶消化分解脱氧核糖核酸和核糖核酸，用蛋白酶消化分解蛋白质；也可用不同浓度的乙醇分级沉淀核酸和蛋白；还可用各种层析技术分离纯化LPS。本发明优选用终浓度为20％～50％的乙醇进行LPS分级纯化，用终浓度为75％～80％的乙醇沉淀纯化的LPS。纯化的LPS用注射用水溶解，用级别为纯化水以上的水液透析，每天换水2～3次，至少透析3天，之后进行冻干。

LPS类脂A的去除可以采用弱酸处理法或碱液处理法，优选弱酸处理法，切断寡糖上的2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)与类脂A上的葡糖胺的连接，将LPS溶于1％的乙酸溶液，LPS的浓度控制在5～50mg/ml，放入沸水浴中消化1～5小时；也可降低消化时的温度，例如60℃，延长消化时间，例如消化30小时。消化后冷却过夜后，离心除去类脂A，上清用级别为纯化水以上的水液透析，每天换水2～3次，至少透析3天，之后用无水乙醇沉淀O-SP，离心弃去上清，干燥沉淀，再用注射用水溶解沉淀，用通用电气公司sephacryl s-300凝胶层析柱进一步纯化。之后进行冻干。冻干后的O特异性多糖进行多糖、核酸和蛋白检测，要求核酸含量低于1％，蛋白含量低于2％。

以下用实例进一步详述本发明。

实施例1：绿脓杆菌O特异性多糖的制备

采用弱酸处理法将类脂A与O特异性多糖分离。

先将小量纯化后的绿脓杆菌IATS 1型的LPS溶于1％的乙酸溶液后放入沸水浴中消化，消化完成后，冷却至室温后放入2～8℃冰箱过夜，之后加入CaCl₂溶液至终浓度0.01M，转移至离心筒中，放入高速冷冻离心机中，6℃下15000rpm离心2.5h。将离心筒取出，取上清液上通用电气公司Sepharose CL-4B凝胶16/100柱进行层析并分析(参见图1，图2)。

在此基础上，同前方法将大量的纯化后的LPS除去类脂A，在离心后上清透析玻璃纸包袋，用超纯水透析，每天换水2～3次，透析3天，之后加入无水乙醇至终浓度80％，加入4MNaCl至终浓度0.1M，摇匀后溶液放置于-15～-18℃冰柜过夜，转移至离心筒中，放入高速冷冻离心机中，8℃下，6500rpm离心30min。干燥沉淀，再用注射用水溶解沉淀，用通用电气公司sephacryl s-300凝胶26/100层析柱进一步纯化O特异性多糖，并将收集的O特异性多糖溶液进行冷冻干燥(凝胶层析图谱见图3)。另参照上述方法制备得到绿脓杆菌IATS6型O特异性多糖和绿脓杆菌IATS 3型O特异性多糖。

实施例2：绿脓杆菌O特异性多糖的活化衍生

将绿脓杆菌IATS 6型菌株O特异性多糖溶于氯化钠生理盐水中，浓度控制在10～20mg/ml，用三乙胺(TEA)调节pH至5.8。加入量为特异性多糖量1/2的、已溶于乙睛的CDAP至多糖溶液中。30s后，调节pH至8.1。加入已溶于0.1M NaHCO₃溶液ADH溶液至终浓度0.4M。用0.1M HCl溶液维持pH在8.05～8.15之间2h。反应结束后，将溶液装入透析玻璃纸中，7℃下用级别为纯化水以上的水液透析过夜，中间换水1次。第二天上通用电气公司SephadexG50凝胶26/100层析柱进一步脱盐，用注射用水作流动相，收集第一峰，并进行冻干(衍生后G₅₀柱层析图见图4)，得到绿脓杆菌IATS 6型O特异性多糖。用上述方法将绿脓杆菌IATS1型菌株O特异性多糖和绿脓杆菌IATS 3型O特异性多糖也分别进行了活化衍生。

实施例3：绿脓杆菌O特异性多糖与TT载体蛋白结合免疫原的制备

将绿脓杆菌IATS 1型菌株衍生的O特异性多糖溶于氯化钠生理盐水中，浓度控制在6～30mg/ml，加入等量TT(破伤风类毒素蛋白，购自成都生物制品研究所)，再加入溶于生理盐水的EDAC至终浓度0.1M。用0.1M HCl溶液调节pH，使其维持在5.20±0.1。4小时后停止反应。将溶液装入透析玻璃纸中，7℃下用级别为纯化水以上的水液透析过夜，中间换水1次。第二天上通用电气公司Sepharose 4FF凝胶26/100层析柱进行分离纯化，用0.1M氯化钠溶液作流动相，收集第一峰即为蛋白结合免疫原溶液(4FF柱层析图见图5)。

同用上述方法将活化衍生后的绿脓杆菌IATS 6型菌株O特异性多糖和与TT载体蛋白结合制得结合免疫原；将活化衍生后的绿脓杆菌IATS 3型菌株O特异性多糖和与TT载体蛋白结合制得结合免疫原。

实施例4绿脓杆菌O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原的免疫原性试验

选用体重14～16g的NIH小鼠进行皮下免疫，设置结合IATS 6型菌株O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原组、O特异性多糖对照组和生理盐水对照组。各组小鼠20只，免疫剂量为每次每只注射0.5ml，结合免疫原组每0.5ml含2.5ug或5.0ug结合免疫原，O特异性多糖对照组每0.5ml含2.5ug或5ug O特异性多糖(O-SP)。首次免疫14天后，各组一半的小鼠进行眼球采血并分离血清，剩余小鼠重复首次免疫，再隔14天后进行眼球采血并分离血清。

所有小鼠血清分离后，用ELISA法检测血清中IgG抗体滴度，用阴性对照OD值X2.1作为阈值(Cut off)，计算各血清的抗体滴度，结果见表1。

表1ELISA法检测免疫小鼠血清IgG抗体滴度试验结果

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											板1	＜100	＜100	＜100	＜100	100	100	100	100	200	100
板2	＜100	400	＜100	＜100	200	100	100	200	100	100
											板3	＜100	＜100	＜100	＜100	＜100	100	＜100	＜100	＜100	＜100
板4	800	3200	3200	6400	3200	800	1600	1600	6400	1600

注：板1：O-SP初免小鼠血清：1～5：2.5μg 6～10：5μg

    板2：O-SP-TT初免小鼠血清：1～5：2.5μg 6～10：5μg

    板3：O-SP二免小鼠血清：1～5：2.5μg 6～10：5μg

    板4：O-SP-TT二免小鼠血清：1～5：2.5μg 6～10：5μg

表2ELISA法检测免疫鼠血清IgG抗体几何平均滴度

由数据可看出，初免疫的小鼠血清效价很低，O-SP的二次免疫小鼠血清的效价也很低，但O-SP-TT的二次免疫小鼠血清的效价有显著升高，均在800以上。由此可见，IATS 6型菌株O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原免疫原性与O特异性多糖多糖免疫原相比，在二次免疫后能显著提高小鼠血清的IgG水平。

实施例5：绿脓杆菌O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原小鼠主动免疫保护试验

选用体重14～16g的NIH小鼠进行皮下免疫，设置IATS 6型菌株O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原结合免疫原组、O特异性多糖对照组和生理盐水对照组。各组小鼠10只，每只小鼠免疫两次，间隔两周，免疫剂量为每次每只注射0.5ml，结合免疫原组每0.5ml含2.5ug或5ug结合免疫原，O特异性多糖对照组每0.5ml含2.5ug或5.0ug O特异性多糖。末次免疫2周后用菌液腹腔攻击免疫小鼠和对照小鼠。连续观察7天，记录各组的小鼠存活数(见表3)。

表3主动保护试验小鼠存活情况(存活数/试验数)

试验结果表明结合免疫原具有良好的小鼠免疫保护性，而O特异性多糖免疫原和生理盐水不具小鼠免疫保护性。

实施例6：绿脓杆菌O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原免疫兔后获得的血清对小鼠的被动免疫保护试验

用绿脓杆菌IATS 3型菌株O特异性多糖与TT蛋白结合免疫原结合免疫原免疫体重为2.0kg～2.5kg的家兔，免疫家兔2只，每只免疫3次，每次间隔两周，每次的免疫剂量以多糖含量计分别为50ug、100ug和200ug，末次免疫2周后家兔颈动脉采血，分离免疫血清。用生理盐水对兔免疫血清2倍稀释后，腹腔免疫小鼠，免疫剂量0.5ml，2小时后，用本菌株3LD50或5LD50活菌进行腹腔攻击。连续观察7天，记录各组小鼠的存活数。并用生理盐水作对照。

表4小鼠被动保护试验(存活数/试验数)

攻击菌剂量	3LD50	5LD50
			1号兔免疫血清(	10/10	9/10
2号兔免疫血清	10/10	9/10
			盐水对照	1/10	0/10

从试验结果(见表4)看：结合疫苗制备的抗体兔血清对本菌有显著的小鼠被动保护作用。

Claims (14)

1.绿脓杆菌免疫原，其特征在于为绿脓杆菌O特异性多糖与载体蛋白共价结合形成的多糖-蛋白结合免疫原。

2.根据权利要求1所述的绿脓杆菌免疫原，其特征在于：所述O特异性多糖为绿脓杆菌IATS分型系统1型抗原、3型抗原、4型抗原、5型抗原、6型抗原、11型抗原或16型抗原中的至少一种的O特异性多糖。

3.根据权利要求1所述的绿脓杆菌免疫原，其特征在于：所述的载体蛋白是流感嗜血杆菌蛋白D、脑膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌溶血素、白喉类毒素蛋白、破伤风类毒素蛋白或其重组遗传解毒变体、重组铜绿假单胞菌外毒素A、葡萄球菌外毒素或上述蛋白的无毒突变体。

4.根据权利要求1所述的绿脓杆菌免疫原，其特征在于：所述的共价结合的方式为1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐活化O特异性多糖上的羟基，然后用己二酰二肼对活化的O特异性多糖进行衍生，然后通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺将该物质连接至白喉类毒素或破伤风类毒素。

5.根据权利要求1所述的绿脓杆菌免疫原，其特征在于：所述的共价结合的方式为还原胺化法结合，具体为用高碘酸钠氧化O特异性多糖上的羟基形成醛基，醛基与载体蛋白上的氨基形成亚胺，再在还原剂的作用下形成胺完成结合。

6.一种治疗或预防绿脓杆菌感染的抗体组合物，其特征在于包含：有效剂量的对至少一种绿脓杆菌抗原具有特异性的抗体形成的组合物；或含有该抗体的人血浆；或者向绿脓杆菌易感者投与有效剂量的单价或多价权利要求1～6任一项所述的绿脓杆菌免疫原后获得的抗体。

7.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于：所述抗体组合物为静脉注射丙种球蛋白(IVIG)组合物。

8.根据权利要求7所述的抗体组合物，其特征在于：所述IVIG组合物为超免疫特异性IVIG组合物。

9.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于：所述绿脓杆菌O特异性多糖抗原为绿脓杆菌IATS分型系统1型抗原、3型抗原、4型抗原、5型抗原、6型抗原、11型抗原、或16型抗原中的至少一种。

10.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于：所述抗体为对一种或多种绿脓杆菌绿脓杆菌IATS分型系统抗原的经修饰形式具有特异性的抗体。

11.根据权利要求6所述的抗体组合物，其特征在于：为含有抗一种或多种绿脓杆菌抗原的抗体的人血浆。

12.根据权利要求10所述的抗体组合物，其特征在于：所述多糖蛋白免疫原的O特异性多糖保持为部分修饰。

13.抗权利要求1～6任一项所述的绿脓杆菌免疫原的抗体。

14.权利要求1～6任一项所述的绿脓杆菌免疫原或权利要求13所述的抗体在制备治疗或预防绿脓杆菌感染的药物中的用途。

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