CN111088269B - OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途 - Google Patents

OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，本申请提供一种OprJ‑N‑M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途，该OprJ‑N‑M融合基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。通过动物实验验证，由该OprJ‑N‑M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。

Description

OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及 用途
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途。
背景技术
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),又称铜绿假单胞菌，是一种普遍存在于环境中的革兰氏阴性菌。该菌为条件致病菌，是导致医院内复杂及持续感染的三大病原体之一。在正常人体内，绿脓杆菌可以与宿主维持共生关系互不侵扰，当宿主免疫力低下时，这种共生状态发生倾斜，绿脓杆菌大规模增殖，引发一系列的感染。比如，代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或烧烫的病人易感染本菌。绿脓杆菌感染的病灶可以导致血液散播，严重者可引起全身性败血症、脑膜炎或多器官衰竭，一旦发生败血症，其死亡率44％-81％，多器官衰竭达70％，整体死亡率高达50％。
由于绿脓杆菌天然耐药性及广谱抗生素的滥用，多重耐药绿脓杆菌感染频繁发生，尤其耐碳青霉烯类绿脓杆菌(CRPsA)在全球的快速播散及感染情况日益严重，已严重危害公共健康。
发明内容
本申请提供一种OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白的制备方法和用途。通过动物实验验证，由该OprJ-N-M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种OprJ-N-M融合基因，所述OprJ-N-M融合基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
为解决上述技术问题，本申请采用的另一个技术方案是：提供一种OprJNM融合蛋白，所述OprJNM融合蛋白是通过如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因表达而获得的，所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
其中，所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次包括：绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的结构域a、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的结构域b、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的结构域c；
其中，柔性连接体的氨基酸序列为AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。
其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ是通过OprJ基因表达而获得的，所述OprJ基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN是通过OprN基因表达而获得的，所述OprN基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM是通过OprM基因表达而获得的，所述OprM基因的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
为解决上述技术问题，本申请采用的又一个技术方案是：提供一种OprJNM融合蛋白的制备方法，包括：提供一OprJ-N-M融合基因，所述OprJ-N-M融合基因为如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因；将所述OprJ-N-M融合基因与载体pET28a通过NcoI和XhoI双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-OprJ-N-M；在预设培养条件下，培养所述重组质粒pET28a-OprJ-N-M转化至大肠杆菌BL-21菌株中，进行培养；分离纯化，得到所述OprJ-N-M融合基因所表达的所述OprJNM融合蛋白。
为解决上述技术问题，本申请采用的再一个技术方案是：提供一种根据前述的OprJNM融合蛋白在制备治疗或预防绿脓杆菌感染的药物中的用途。
为解决上述技术问题，本申请采用的再一个技术方案是：提供一种免疫原性组合物，包括：绿脓杆菌抗原组合和/或绿脓杆菌结合抗原；以及医药上可接受的载剂。
其中，所述绿脓杆菌抗原组合包括：OprJ抗原、OprN抗原、OprM抗原中的至少两种；所述OprJ抗原含有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述OprN抗原含有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述OprM抗原含有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
其中，所述绿脓杆菌结合抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的杂合多肽；其中，所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少50％同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少50％同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少50％同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少50％同一性。
其中，所述载剂选自：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸盐处理的氢氧化铝中的至少一种。
本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请提出一种OprJ-N-M融合基因，通过动物实验验证，由该OprJ-N-M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中：
图1是本申请OprJNM融合蛋白设计示意图；
图2是本申请三种绿脓杆菌外排泵蛋白OprJ、OprN和OprM的结构示意图；
图3是SDS-PAGE分析纯化后的OprJNM融合蛋白的实验结果；
图4是OprJNM融合蛋白在小鼠体内诱导强烈的体液免疫的实验结果；
图5是OprJNM融合蛋白在小鼠体内诱导强烈IFN-γ，IL-4和IL-17A反应的实验结果；
图6a和图6b是OprJNM融合蛋白在血液感染模型中诱导针对绿脓杆菌的保护作用的实验结果；
图7是血清移植保护作用的实验结果。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在详细说明本申请之前，先介绍一下与本申请相关的基本概念。
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，简称P.aeruginosa),又称铜绿假单胞菌，是一种普遍存在于环境中的革兰氏阴性菌。该菌为条件致病菌，是导致医院内复杂及持续感染的三大病原体之一。在正常人体内，
绿脓杆菌可以与宿主维持共生关系互不侵扰，当宿主免疫力低下时，这种共生状态发生倾斜，绿脓杆菌大规模增殖，引发一系列的感染。比如，代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或烧烫的病人易感染本菌。绿脓杆菌感染的病灶可以导致血液散播，严重者可引起全身性败血症、脑膜炎或多器官衰竭，一旦发生败血症，其死亡率44％-81％，多器官衰竭达70％，整体死亡率高达50％。
由于绿脓杆菌天然耐药性及广谱抗生素的滥用，多重耐药绿脓杆菌感染频繁发生，尤其耐碳青霉烯类绿脓杆菌(CRPsA)在全球的快速播散及感染情况日益严重，已严重危害公共健康。在我国，因感染控制不利而导致该类耐药细菌在院内爆发流行的案例时有报道。根据《中国抗菌药物管理和细菌耐药现状报告(2018)》，2017年全国细菌耐药监测网(CARSS)的数据显示，中国碳青霉烯类耐药绿脓杆菌全国平均分离率为20.7％，其中ICU病房分离率高达35.8％。
造成绿脓杆菌耐药的机制非常复杂，包括其本身能够合成抗生素灭活酶或者修饰酶，降低了外膜的渗透性及膜孔丢失，及主动外排等。有研究表明，在细菌外膜及内膜广泛分布的特异性的多药物主动外排系统(multidrug efflux systems，外排泵)是造成绿脓杆菌耐药的重要因素。这些外排泵的功能不仅仅是引起细菌的多重耐药，还能够调节细菌的应激反应，代谢物的排出功能。
多数的外排泵是三聚复合物，其结构包含三类蛋白：第一类是外膜通道蛋白，比如OprM、OprJ、OprN，能够形成门通道，使药物排出到菌体外；第二类是膜融合蛋白或连接蛋白，如MexA、MexC、MexE、MexX等(Mex，membrane efflux，膜外排)，用于连接内蛋白；第三类是内膜蛋白，具有识别药物的作用，但不具有特异性，比如MexB、MexD、MexF、MexY、MexK等主动外排蛋白。这些三聚复合外排泵大多属于耐药结节分化(resistance nodulationdivision，RND)家族成员。对绿脓杆菌全基因组分析结果显示，绿脓杆菌可能至少有12种主动外排泵，到目前为止，已经报道过的主动外排泵包括：MexAB-OprM、MexEF-OprN、MexCD-OprJ、MexJK-OprM、MexXY-OprM、MexVW-OprM以及MuxBC-OpmB。以上所述的外排泵的存在有助于细菌克隆的形成，生物膜的形成，细菌向宿主细胞的浸润，群体感应，保护细菌不受氧化和氮化损伤以及细菌的蹭行运动。但当这些外排泵过度表达，则会引起细菌的多重耐药。
OprM是在绿脓杆菌中发现的第一个RND家族外排系统。能够帮助细菌对多种抗生素实现耐受，包括氟喹诺酮类，青霉素类，四环素类，大环内酯类，氯霉素类，新生霉素类，甲氧苄胺嘧啶类以及磺胺类药物等等。在绿脓杆菌所有的血清型分类中都具有OprM基因的存在提示，该基因或许对绿脓杆菌耐药具有非常重要的作用。研究证明，OprM的同系物ToIC能够通过RND结构域直接与其结合，并且这种结合可以促进药物的外排。其下游证明可能是由TonB介导，TonB能够促进OprM构象的变化，从而引起整个通道的开启，促使药物通过外膜排出。OprJ外排系统的发现并不是在野生型菌株中，而是在nfxB基因突变的突变菌株中发现的。nfxB编码MexCD-OprJ的受体。所以有研究人员认为这两者的出现存在一定的因果关系。起初，人们发现，MexCD-OprJ能够使得绿脓杆菌耐受氟喹诺酮类药物。随后又发现，事实上MexCD-OprJ能够帮助绿脓杆菌耐受大环内酯类，氯霉素，新生霉素，四环素，甲氧苄啶类，以及部分β-内酰胺类药物。
OprN系统同样在野生型菌株中维持静默状态nfxC基因突变导致该系统的过表达，从而引起对多种抗生素的耐药，比如氟喹诺酮类，四环素，氯霉素等等。其突变也可以导致OprD的减少(OprD是一种外膜表达的亚胺培南通道，是抗生素进入菌体的常规通道)。重要的是，经研究发现基因突变导致的某种外排系统表达量上升对引起对应的另外一种外排系统表达量的降低，在绿脓杆菌菌体中，维持着外排系统数量的平衡。这反应了一个可能，那就是外排系统的表达量可以根据生存需求产生一定的波动，以帮助细菌存活，其内在机制还有待探索。近年来，在绿脓杆菌毒力因子的鉴定及其在不同感染过程中的研究取得了显着进展。现在基本认识到绿脓杆菌是一种抗原性可变的致病菌，易于适应不同的生长条件和逃避宿主免疫的识别。
绿脓杆菌株相关蛋白具有高度变异性，可以在复杂多样的环境条件下生长，这导致针对绿脓杆菌开发广泛有效的疫苗非常困难。到目前为止，使用经典方法鉴定出许多表面蛋白、低聚糖或一些特定的毒力因子来作为疫苗潜在的抗原。最近，已经有通过结合基因组学和蛋白质学方法，来预测针对绿脓杆菌的潜在的保护性抗原，且有几种候选疫苗进入临床试验，如：OprF-OprI融合蛋白，鞭毛蛋白，O抗原偶联疫苗及高分子量的藻酸盐。但是不幸的是，到目前为止，还没有一种有效的疫苗进入市场。
下面结合附图和实施方式对本申请进行详细说明。
本申请的发明人在长期研发过程中，发现传统的细菌疫苗多注重在刺激宿主产生抗体，以对抗病原菌或加强巨噬细胞的噬菌能力，进而阻止细菌在患者体内繁衍。由于绿脓杆菌可以通过突变部署多种通道蛋白来逃避抗生素的杀伤，阻止一类致病因子，其他的因子可能会替代发挥作用。在加上绿脓杆菌感染可以通过不同途径感染宿主，在不同的感染性疾病中，发挥作用的毒力因子可能又不同。此外，在感染过程中，会产生不同的有毒代谢产物，进而加剧临床症状的复杂性。因此，靶向单一致病机制的疫苗预防绿脓杆菌效力有限。因此，本申请提出一种OprJ-N-M融合基因及其表达的OprJNM融合蛋白，并评估该OprJNM融合蛋白在动物体内预防绿脓感染性疾病的潜力。
采用基因工程手段将主动外排泵系统的OprJ基因、OprN基因、OprM基因融合一个新的OprJ-N-M融合基因，该OprJ-N-M融合基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
本申请实施方式中，SEQ ID NO:1序列如下：
ATGATCCAGCGCGCCGACCGCGTGCCGGGCCTGAACGCCGCCGCCATCCTGGCCGCCGAGCACCGCCTGCGCGCCCGCAACGCCGACATCGGCGCCGCCCGCGCCGCCTTCTTCCCGCGCATCAGCCTGACCGGCAGCTTCGGCACCAGCAGCGCCGAGATGAGCGGCGCCGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGCCCTGGAGGCCGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGCCGCCCTGCGCGACGACGTGGCCCGCCCGGACATCCGCGCCGCCGAGCGCCGCCTGGCCGCCAGCACCGCCGACGTGGGCGTGGCCACCGCCGACCTGTTCCCGCGCGTGAGCCTGAGCGGCTTCCTGGGCTTCACCGCCGGCCGCGCCGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGCCCTGGAGGCCGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGCCCGCGCCGACCTGTTCCCGCGCATCGGCGTGGACGGCAGCGGCGCCGAGCACCAGCTGATGGCCGCCAACGCCAGCATCGGCGCCGCCCGCGCCGCCTTCTTCCCGAGCATCAGCCTGACCGCCAACGCCGGCACCATGAGCCGCCAGCTGAGCGGCCTGTTCGACTAA
OprJ基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，本申请实施方式中，SEQ ID NO:2序列如下：
ATGCGCAAACCTGCTTTCGGCGTATCGGCGCTGCTGATCGCCCTGACCCTCGGCGCCTGCTCCATGGCGCCGACCTACGAACGTCCCGCCGCGCCGGTGGCCGACAGCTGGAGCGGCGCCGCCGCCCAGCGCCAGGGCGCGGCGATCGACACGCTGGATTGGAAGAGTTTCATCGTCGATGCCGAACTACGCCGCCTGGTGGACATGGCCCTGGATAACAACCGCTCGCTGCGCCAGACCCTCCTGGATATCGAGGCGGCCCGCGCGCAGTACCGAATCCAGCGCGCCGACCGGGTTCCGGGCCTGAATGCCGCTGCCACCGGCAACCGCCAGCGGCAGCCGGCCGACCTGTCCGCCGGCAATCGCTCGGAAGTGGCCAGCAGCTACCAGGTCGGGCTGGCCCTGCCGGAGTACGAACTGGACCTCTTCGGTCGGGTCAAGAGCCTGACCGACGCAGCCCTGCAACAGTACCTGGCCAGCGAGGAGGCAGCGCGCGCGGCACGGATCGCCCTGGTCGCCGAGGTCAGCCAGGCCTACCTGAGCTACGACGGCGCCCTGCGGCGCCTGGCGCTGACCCGTCAGACCCTGGTCAGCCGCGAGTATTCCTTCGCCCTGATCGACCAGCGCCGCGCGGCCGGCGCCGCCACCGCGCTGGACTACCAGGAAGCCCTTGGCCTGGTGGAGCAGGCGCGCGCCGAGCAGGAGCGCAACCTGCGGCAGAAACAGCAGGCATTCAACGCGCTGGTGTTGCTGCTGGGTAGCGACGATGCCGCGCAGGCGATTCCGCGGAGTCCGGGGCAGCGGCCGAAGCTGCTGCAGGACATCGCTCCCGGCACGCCGTCCGAGCTGATCGAGCGACGTCCGGACATCCTTGCCGCCGAACATCGTTTGCGGGCGCGCAACGCGGATATCGGCGCGGCGCGCGCGGCGTTCTTCCCGCGCATCAGCCTGACCGGCAGCTTCGGCACCTCCAGCGCGGAAATGTCCGGCCTGTTCGATGGCGGCTCGCGCTCCTGGAGCTTCCTGCCGACGTTGACGCTGCCGATCTTCGATGGCGGGCGCAACCGTGCCAACCTGAGCCTGGCCGAGGCGCGCAAGGATTCGGCGGTGGCCGCCTACGAGGGGACCATCCAGACCGCTTTCCGCGAGGTCGCCGACGCCCTGGCGGCCAGCGATACCCTGCGTCGCGAAGAGAAGGCCCTGCGCGCCCTGGCGAACAGCAGCAACGAAGCCCTGAAGCTGGCCAAGGCACGCTACGAGAGTGGCGTCGACAACCACCTGCGCTACCTCGATGCGCAGCGCAGCAGCTTCCTCAACGAGATCGCCTTCATCGACGGCAGCACCCAGCGGCAGATCGCCCTGGTCGACCTGTTCCGCGCGCTCGGCGGAGGCTGGGACGAGGGACGGAGCCTGGTGGTACATCGAGGCGGCAGGAGTTGA
OprN基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，本申请实施方式中，SEQ ID NO:3序列如下：
ATGATTCACGCGCAGTCGATCCGGAGCGGGCTCGCGTCCGCCCTGGGTCTGTTCAGTCTGCTGGCGCTCAGCGCCTGCACGGTGGGTCCGGACTACCGGACCCCCGACACCGCGGCGGCGAAGATCGACGCCACGGCGAGCAAGCCCTACGACCGCAGCCGCTTCGAAAGCCTGTGGTGGAAACAGTTCGACGATCCGACCCTGAACCAGTTGGTCGAACAGTCGCTGAGCGGCAACCGCGACCTGCGCGTGGCCTTCGCCCGCCTGCGCGCCGCCCGCGCCCTGCGCGACGACGTGGCCAACGATCGCTTCCCGGTGGTCACCAGCCGCGCCAGCGCCGACATCGGCAAGGGCCAGCAACCGGGAGTGACCGAGGACCGGGTCAACAGCGAGCGCTACGACCTTGGCCTGGATAGCGCCTGGGAGCTTGACCTGTTCGGGCGCATCCGCCGTCAGCTGGAGTCCAGCGACGCCCTCAGCGAAGCGGCCGAGGCCGACCTGCAGCAACTGCAGGTCAGCCTGATCGCCGAGCTGGTGGACGCCTACGGCCAACTGCGCGGCGCGCAACTGCGCGAGAAGATTGCCCTGAGCAACCTGGAGAACCAGAAGGAGTCGCGCCAGCTCACCGAGCAACTGCGCGACGCCGGGGTCGGTGCCGAACTCGACGTACTGCGCGCCGATGCGCGCCTGGCGGCCACCGCCGCCAGCGTGCCGCAACTGCAGGCGGAAGCCGAGCGCGCCAGGCACCGTATCGCCACCCTCCTCGGCCAACGGCCGGAAGAGTTGACAGTGGACCTTTCGCCGCGCGACCTGCCGGCGATCACCAAGGCCCTGCCGATCGGCGATCCCGGCGAACTGCTGCGCCGCCGGCCGGACATCCGCGCCGCCGAACGGCGCCTGGCCGCCAGCACCGCCGACGTCGGCGTGGCCACCGCCGACCTGTTCCCGCGGGTCAGCCTCAGCGGCTTCCTCGGCTTCACCGCCGGGCGGGGCTCGCAGATCGGCTCAAGCGCCGCCCGCGCCTGGAGCGTCGGCCCGAGCATCAGTTGGGCCGCCTTCGACCTCGGCAGCGTGCGTGCCCGCCTGCGCGGCGCCAAGGCCGACGCCGACGCCGCGCTGGCCAGCTACGAACAGCAGGTGCTGCTGGCCCTGGAAGAATCGGCGAATGCCTTCAGCGACTATGGCAAGCGCCAGGAGCGCCTGGTCTCGCTGGTCCGCCAGTCGGAAGCCAGCCGCGCCGCCGCGCAACAGGCGGCGATCCGCTACCGCGAAGGCACCACCGATTTCCTGGTGCTGCTGGACGCCGAACGCGAGCAACTCTCCGCCGAAGATGCCCAGGCCCAGGCCGAGGTCGAGCTGTACCGCGGCATCGTGGCGATCTACCGCTCCCTCGGCGGTGGCTGGCAACCCAGCGCCTGA
本申请提供一种OprJNM融合蛋白，该OprJNM融合蛋白是上述实施例中的OprJ-N-M融合基因表达而获得的。
其中，OprJNM融合蛋白的制备和纯化过程如下：将OprJ-N-M融合基因和载体pET28a通过NcoI和XhoI双酶切，T4DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-OprJ-N-M。将重组质粒pET28a-OprJ-N-M转化至大肠杆菌BL-21菌株中，将菌株涂至卡那霉素抗性的平板表面，放置在37℃培养箱中生长过夜。分别挑单克隆至卡那霉素抗性的LB(肉汤培养基)培养基，放置在37℃，200rpm的摇床中培养过夜。第二天分别将菌液1：100接种至1L卡那霉素抗性的LB培养基，放置在37℃，200rpm的摇床中培养3小时至OD值上升至0.5-0.8，分别在菌液中加入0.5mM/L的IPTG，放回相同条件的摇床内培养4小时，诱导OprJ-N-M的包涵体表达。之后7000rpm，4℃，5min离心菌液回收菌体，每种回收之后的菌体(1L菌液)平均分成两份，每份加30ml裂解缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaOH,pH8.0)以25％的功率超声破碎30min(每9秒破碎一次，每次破碎9秒)，破碎的菌液8000rpm，4℃，30min离心，收集上清。使用离子交换和亲和层析纯化，进而将纯化后的OprJNM融合蛋白，放置在透析袋中，透析袋放置在5LPBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)中，透析48小时，期间换液一次。透析后液体13000rpm，4℃，15分钟离心，取上清浓缩即为OprJNM融合蛋白溶液。
OprJNM融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，本申请实施方式中，SEQ IDNO:8序列如下：
MIQRADRVPGLNAAAILAAEHRLRARNADIGAARAAFFPRISLTGSFGTSSAEMSGAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAALRDDVARPDIRAAERRLAASTADVGVATADLFPRVSLSGFLGFTAGRAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKARADLFPRIGVDGSGAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFD
请参阅图1，图1为OprJNM融合蛋白的设计示意图。上述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次包括：绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的结构域a(OprJ Loops)、柔性连接体(linker)、绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的结构域b(OprN Loops)、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的结构域c(OprM Loops)。柔性连接体的氨基酸序列为
AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。
上述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ、MexEF-OprN以及MexAB-OprM的结构示意图如图2所示。绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ、MexEF-OprN以及MexAB-OprM均包括细胞外环状结构域(Extracellular Loops)、细胞外膜部分(Outer Membrane)和周质空间部分(Periplasm)。
其中，绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的结构域a指绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的细胞外环状结构域(L1:74I-87A和L2:271I-311G)；绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的结构域b指绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的细胞外环状结构域(L1:69A-75A和L2:265R-305R)；绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的结构域c指绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的细胞外环状结构域(L1:81R-94G和L2:278A-318D)。
其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，本申请实施方式中，SEQ ID NO:5序列如下：
MRKPAFGVSALLIALTLGACSMAPTYERPAAPVADSWSGAAAQRQGAAIDTLDWKSFIVDAELRRLVDMALDNNRSLRQTLLDIEAARAQYRIQRADRVPGLNAAATGNRQRQPADLSAGNRSEVASSYQVGLALPEYELDLFGRVKSLTDAALQQYLASEEAARAARIALVAEVSQAYLSYDGALRRLALTRQTLVSREYSFALIDQRRAAGAATALDYQEALGLVEQARAEQERNLRQKQQAFNALVLLLGSDDAAQAIPRSPGQRPKLLQDIAPGTPSELIERRPDILAAEHRLRARNADIGAARAAFFPRISLTGSFGTSSAEMSGLFDGGSRSWSFLPTLTLPIFDGGRNRANLSLAEARKDSAVAAYEGTIQTAFREVADALAASDTLRREEKALRALANSSNEALKLAKARYESGVDNHLRYLDAQRSSFLNEIAFIDGSTQRQIALVDLFRALGGGWDEGRSLVVHRGGRS
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，本申请实施方式中，SEQ ID NO:6序列如下：
MIHAQSIRSGLASALGLFSLLALSACTVGPDYRTPDTAAAKIDATASKPYDRSRFESLWWKQFDDPTLNQLVEQSLSGNRDLRVAFARLRAARALRDDVANDRFPVVTSRASADIGKGQQPGVTEDRVNSERYDLGLDSAWELDLFGRIRRQLESSDALSEAAEADLQQLQVSLIAELVDAYGQLRGAQLREKIALSNLENQKESRQLTEQLRDAGVGAELDVLRADARLAATAASVPQLQAEAERARHRIATLLGQRPEELTVDLSPRDLPAITKALPIGDPGELLRRRPDIRAAERRLAASTADVGVATADLFPRVSLSGFLGFTAGRGSQIGSSAARAWSVGPSISWAAFDLGSVRARLRGAKADADAALASYEQQVLLALEESANAFSDYGKRQERLVSLVRQSEASRAAAQQAAIRYREGTTDFLVLLDAEREQLSAEDAQAQAEVELYRGIVAIYRSLGGGWQPSA
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，本申请实施方式中，SEQ ID NO:7序列如下：
MKRSFLSLAVAAVVLSGCSLIPDYQRPEAPVAAAYPQGQAYGQNTGAAAVPAADIGWREFFRDPQLQQLIGVALENNRDLRVAALNVEAFRAQYRIQRADLFPRIGVDGSGTRQRLPGDLSTTGSPAISSQYGVTLGTTAWELDLFGRLRSLRDQALEQYLATEQAQRSAQTTLVASVATAYLTLKADQAQLQLTKDTLGTYQKSFDLTQRSYDVGVASALDLRQAQTAVEGARATLAQYTRLVAQDQNALVLLLGSGIPANLPQGLGLDQTLLTEVPAGLPSDLLQRRPDILEAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFDAGSGSWLFQPSINLPIFTAGSLRASLDYAKIQKDINVAQYEKAIQTAFQEVADGLAARGTFTEQLQAQRDLVKASDEYYQLADKRYRTGVDNYLTLLDAQRSLFTAQQQLITDRLNQLTSEVNLYKALGGGWNQQTVTQQQTAKKEDPQA
其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ是通过OprJ基因表达而获得的，所述OprJ基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN是通过OprN基因表达而获得的，所述OprN基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM是通过OprM基因表达而获得的，所述OprM基因的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
其中，前述的OprJNM融合蛋白可用于在制备治疗或预防绿脓杆菌感染的药物。
本申请还提供一种免疫原性组合物，包括：绿脓杆菌抗原组合和/或绿脓杆菌结合抗原；以及医药上可接受的载剂。
术语“免疫原性组合物”系指包含至少一种抗原之组合物，其引发被施用该免疫原性组合物之宿主之免疫反应。该免疫反应可为细胞和/或抗体介导之针对本申请免疫原性组合物之免疫反应。该宿主亦被称为“对象”。较佳地，本文所阐述或提及之任一宿主或对象系动物。
通常，“免疫反应”包括(但不限于)以下效应中之一或多者：特异性指向本申请免疫原性组合物中所包括抗原之抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞之产生或活化。较佳地，宿主将展示保护性免疫反应或治疗反应。
“保护性免疫反应”将显示为受感染宿主通常展示之临床病征之减少或缺少、较短恢复时间和/或缩短之感染性持续时间或组织或体液中降低之病原体效价或受感染宿主之排泄。
若宿主展示保护性免疫反应而使得对新感染之抗性将增强和/或疾病之临床严重度降低，则将免疫原性组合物称为“疫苗”。
如本文所用“抗原”系指(但不限于)引发宿主对包含该抗原或其免疫活性组份之所关注免疫原性组合物或疫苗之免疫反应之组份。抗原或免疫活性组份可为完整微生物(呈灭活或改良活形式)或其任何碎片或部分，若将其施用宿主可引发宿主之免疫反应。抗原可为或可包含呈其原始形式或作为所谓改良活疫苗(MLV)中之减毒生物体之完整的活生物体。抗原可进一步包含该等生物体之适当组件(亚单位疫苗)，其中该等组件系藉由以下方式来生成：破坏完整生物体或该等生物体之生长培养物且实施后续纯化步骤以产生期望结构；或藉由对适宜系统(如但不限于细菌、昆虫、哺乳动物或其它物种)进行适当操作来诱导合成过程，且随后视情况实施分离及纯化程序；或藉由使用适宜医药组合物直接加入遗传物质在需要疫苗之动物中诱导该等合成过程(多核苷酸疫苗接种)。抗原可包含所谓的死菌疫苗(KV)中之藉由适当方法灭活之完整生物体。若生物体系细菌，则死菌疫苗称为死菌苗(bacterin)。
术语“医药上可接受之载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。
其中，所述绿脓杆菌抗原组合包括：OprJ抗原、OprN抗原、OprM抗原中的至少两种；所述OprJ抗原含有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述OprN抗原含有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述OprM抗原含有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
其中，所述绿脓杆菌结合抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的杂合多肽。其中，所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少50％(例如：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少50％(例如：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少50％(例如：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列具有至少50％(例如：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)同一性。
其中，所述载剂选自：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸盐处理的氢氧化铝中的至少一种。
为了更好的解释本申请，以下结合具体的实施例进一步阐明本申请的主要内容，但本申请的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：OprJNM融合蛋白的表达、纯化及蛋白性质的研究
将重组质粒pET28a-OprJ-N-M转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达后，请参阅图3，SDS-PAGE结果显示：OprJNM融合蛋白在35KDa左右有一明显的表达带，大小与理论值相符。将重组蛋白表达菌裂解上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，目的蛋白大多数以可溶性的形式表达。数据表明，通过不同诱导条件的优化，可以使本申请公开的OprJNM融合蛋白以可溶性的形式表达。OprJNM融合蛋白表达菌体经超声裂解，离心收集上清，通过离心交换和亲和层析纯化技术制备疫苗抗原，蛋白纯度达到98％以上，内毒素含量小于10EU/mg。该纯化后的融合蛋白达到动物体内试验研究的条件。
实施例2：OprJNM融合蛋白免疫原性的鉴定
每只小鼠通过颈部皮下注射免疫25ug OprJNM融合蛋白，每只注射总量100ul，佐剂为铝佐剂占10％，每隔14天免疫一次，一共免疫三次。阴性对照为90％PBS加10％佐剂，每只注射总量100ul。并在第7天、21天和35天取血并分离血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测血清中的IgG、IgG1和IgG2a的水平，以评估OprJNM融合蛋白是否可以诱导B细胞的反应。
请参阅图4，试验结果显示：免疫组的小鼠均可显著性激活IgG/IgG1/IgG2a抗体水平
此外，第三次加强免疫72个小时后，安乐死试验动物，无菌取出脾脏组织，研磨后，使用淋巴细胞分离液分离单核细胞。将单核细胞孵育到ELISPOT板孔中，并同步进行刺激。37℃培养箱培养和细胞因子捕获。24小时后检测斑点的形成，可检测免疫小鼠的脾脏细胞中特异性分泌IFN-γ、IL-4和IL-17A的细胞数目。
请参阅图5，数据显示：OprJNM融合蛋白免疫的小鼠可以诱导产生与之IFN-γ、IL-4和IL17a相关的Th1、Th2和Th17的细胞免疫反应。
图5中，数据表示为平均值±SD；SFU表示点形成单元；SI表示OprJNM融合蛋白刺激的免疫小鼠的脾细胞；SM表示OprJNM融合蛋白刺激的模拟免疫小鼠的脾细胞；UI表示未有OprJNM融合蛋白刺激的免疫小鼠的脾细胞。
实施例3：攻毒保护性试验
如图6a所示，对照组(mock)小鼠在注射后一周内全部死亡；而OprJNM+AHG组中，免疫过后的小鼠通过尾静脉注射致死剂量的绿脓杆菌(菌血症模型)免疫的小鼠的保护率(survival)达到100％。
如图6b所示，用非致死剂量的绿脓杆菌感染免疫后的小鼠，四天后，取不同的组织检测细菌负荷，结果发现，免疫组的小鼠在肺脏(lung)、肾脏(kidney)及脾脏(spleen)中的细菌负荷(log10 CFU g-1)显著性降低。此外，在烫伤模型中发现，免疫OprJNM融合蛋白可以显著性清除皮肤感染绿脓杆菌的细菌负荷。其中，统计分析通过对数秩(Mantel-Cox)检验。
实施例4：保护机制的探究
为了进一步探究本申请的融合蛋白的保护机制，将免疫后的小鼠血清或正常小鼠的血清通过静脉回输(intravenous Injection of Mouse serum)到免疫缺陷的NCG小鼠体内。如图7所示，2个小时后，静脉注射致死剂量的绿脓杆菌。结果显示，在40天内的观察周期内，注射正常小鼠血清的对照组(即
Figure GDA0002718467710000161
Mouse Serum组)，100％死亡；而回输免疫小鼠血清的试验组(即Anti-OprJ-N-M Mouse Serum组)存活率(survival)为100％，得到100％的保护。说明在血液感染模型中，接受OprJNM抗血清的免疫缺陷小鼠可以更有效地抵抗绿脓杆菌PA01的攻击。其中，统计分析通过对数秩(Mantel-Cox)检验。
本申请中以OprJNM融合蛋白作为主动免疫制剂，可以显著性减少或杜绝绿脓杆菌感染及其导致多器官综合症的发生。采用基因工程手段将绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexAB-OprM的膜外环状结构域融合一个OprJNM融合蛋白，构建、表达及纯化免疫原。利用基因工程表达融合蛋白免疫原辅以氢氧化铝佐剂免疫实验动物，该OprJNM融合蛋白不仅诱导机体产生保护性的抗体，同时激活强烈的T细胞相关的免疫反应。通过动物攻毒保护实验，在菌血症和烫伤感染模型结果显示，动物生存保护率达到100％。
通过动物实验验证，由该OprJ-N-M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。
以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途
<160> 8
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)…(479)
<400> 5
MRKPAFGVSALLIALTLGACSMAPTYERPAAPVADSWSGAAAQRQGAAIDTLDWKSFIVDAELRRLVDMALDNNRSLRQTLLDIEAARAQYRIQRADRVPGLNAAATGNRQRQPADLSAGNRSEVASSYQVGLALPEYELDLFGRVKSLTDAALQQYLASEEAARAARIALVAEVSQAYLSYDGALRRLALTRQTLVSREYSFALIDQRRAAGAATALDYQEALGLVEQARAEQERNLRQKQQAFNALVLLLGSDDAAQAIPRSPGQRPKLLQDIAPGTPSELIERRPDILAAEHRLRARNADIGAARAAFFPRISLTGSFGTSSAEMSGLFDGGSRSWSFLPTLTLPIFDGGRNRANLSLAEARKDSAVAAYEGTIQTAFREVADALAASDTLRREEKALRALANSSNEALKLAKARYESGVDNHLRYLDAQRSSFLNEIAFIDGSTQRQIALVDLFRALGGGWDEGRSLVVHRGGRS
<210> 6
<211> 472
<212> PRT
<213> C_region
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)…(472)
<400> 6
MIHAQSIRSGLASALGLFSLLALSACTVGPDYRTPDTAAAKIDATASKPYDRSRFESLWWKQFDDPTLNQLVEQSLSGNRDLRVAFARLRAARALRDDVANDRFPVVTSRASADIGKGQQPGVTEDRVNSERYDLGLDSAWELDLFGRIRRQLESSDALSEAAEADLQQLQVSLIAELVDAYGQLRGAQLREKIALSNLENQKESRQLTEQLRDAGVGAELDVLRADARLAATAASVPQLQAEAERARHRIATLLGQRPEELTVDLSPRDLPAITKALPIGDPGELLRRRPDIRAAERRLAASTADVGVATADLFPRVSLSGFLGFTAGRGSQIGSSAARAWSVGPSISWAAFDLGSVRARLRGAKADADAALASYEQQVLLALEESANAFSDYGKRQERLVSLVRQSEASRAAAQQAAIRYREGTTDFLVLLDAEREQLSAEDAQAQAEVELYRGIVAIYRSLGGGWQPSA
<210> 7
<211> 485
<212> PRT
<213> C_region
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)…(485)
<400> 7
MKRSFLSLAVAAVVLSGCSLIPDYQRPEAPVAAAYPQGQAYGQNTGAAAVPAADIGWREFFRDPQLQQLIGVALENNRDLRVAALNVEAFRAQYRIQRADLFPRIGVDGSGTRQRLPGDLSTTGSPAISSQYGVTLGTTAWELDLFGRLRSLRDQALEQYLATEQAQRSAQTTLVASVATAYLTLKADQAQLQLTKDTLGTYQKSFDLTQRSYDVGVASALDLRQAQTAVEGARATLAQYTRLVAQDQNALVLLLGSGIPANLPQGLGLDQTLLTEVPAGLPSDLLQRRPDILEAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFDAGSGSWLFQPSINLPIFTAGSLRASLDYAKIQKDINVAQYEKAIQTAFQEVADGLAARGTFTEQLQAQRDLVKASDEYYQLADKRYRTGVDNYLTLLDAQRSLFTAQQQLITDRLNQLTSEVNLYKALGGGWNQQTVTQQQTAKKEDPQA
<210> 8
<211> 251
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)…(251)
<400> 8
MIQRADRVPGLNAAAILAAEHRLRARNADIGAARAAFFPRISLTGSFGTSSAEMSGAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAALRDDVARPDIRAAERRLAASTADVGVATADLFPRVSLSGFLGFTAGRAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKARADLFPRIGVDGSGAEHQLMAANASIGAARAAFFPSISLTANAGTMSRQLSGLFD

Claims (6)

1.一种OprJ-N-M融合基因，其特征在于，所述OprJ-N-M融合基因的碱基序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种OprJNM融合蛋白，其特征在于，所述OprJNM融合蛋白是通过如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因表达而获得的，所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次包括：绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的结构域a、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的结构域b、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的结构域c；
其中，柔性连接体的氨基酸序列为AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK；
其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ是通过OprJ基因表达而获得的，所述OprJ基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN是通过OprN基因表达而获得的，所述OprN基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种OprJNM融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
提供一种OprJ-N-M融合基因，所述OprJ-N-M融合基因为如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因；
将所述OprJ-N-M融合基因与载体pET28a通过NcoI和XhoI双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-OprJ-N-M；
在预设培养条件下，培养所述重组质粒pET28a-OprJ-N-M转化至大肠杆菌BL-21菌株中，进行培养；
分离纯化，得到所述OprJ-N-M融合基因所表达的所述OprJNM融合蛋白。
4.根据权利要求2所述的OprJNM融合蛋白在制备预防绿脓杆菌感染的药物中的用途。
5.一种免疫原性组合物，其特征在于，包括：
如权利要求2所述的OprJNM融合蛋白；以及
医药上可接受的载剂。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其特征在于，
所述载剂选自：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸盐处理的氢氧化铝中的至少一种。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006129092A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 The University Of Birmingham Use of bacteriophage in medicaments
CN1876832A (zh) * 2005-06-09 2006-12-13 中国医学科学院医药生物技术研究所 以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型
CN101878302A (zh) * 2007-06-29 2010-11-03 明治制果株式会社 绿脓杆菌的外膜蛋白质pa4710
CN101912609A (zh) * 2009-08-20 2010-12-15 成都蓉生药业有限责任公司 防治绿脓杆菌感染的组合物及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006129092A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 The University Of Birmingham Use of bacteriophage in medicaments
CN1876832A (zh) * 2005-06-09 2006-12-13 中国医学科学院医药生物技术研究所 以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型
CN101878302A (zh) * 2007-06-29 2010-11-03 明治制果株式会社 绿脓杆菌的外膜蛋白质pa4710
CN101912609A (zh) * 2009-08-20 2010-12-15 成都蓉生药业有限责任公司 防治绿脓杆菌感染的组合物及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Overexpression of the multidrug efflux pumps MexCD-OprJ and MexEF-OprN is associated with a reduction of type III secretion in Pseudomonas aeruginosa;Juan F Linares等;《J Bacteriol》;20080228;第187卷(第4期);全文 *
铜绿假单胞菌主动外排系统研究进展;魏光等;《中国抗生素杂志》;20131231;第38卷(第12期);全文 *
铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研究;章喻军;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20080731(第07期);全文 *

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