CN1876832A - 以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，以及利用所述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法。本发明还涉及一种用于上述筛选模型和筛选方法的过量表达MexAB－OprM蛋白之重组绿脓杆菌。本发明还涉及利用上述筛选模型和方法获得的抗绿脓杆菌药物。

Description

以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型

发明领域

本发明涉及一种以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，以及利用所述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法。本发明还涉及一种用于上述筛选模型和筛选方法的过量表达MexAB-OprM蛋白之重组绿脓杆菌。本发明还涉及利用上述筛选模型和方法获得的抗绿脓杆菌药物。

发明背景

绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)，又名铜绿假单胞茵，是一种重要的院内感染条件致病菌，在机会性感染的病源菌中位于前三甲之列，经常感染癌症病人、烧伤患者等免疫力低下的病人，引起茵血症，肺炎，泌尿系统感染和囊性纤维化等疾病。

由于绿脓杆菌具有先天的和后天获得的耐药性，对多种在结构和作用机制上都大相径庭的抗生素产生多重高度耐药，使临床治疗十分困难，一旦感染，死亡率很高，为临床医生面临的治疗难题之一。

绿脓杆菌的耐药机理十分复杂，但其对多种抗茵药物产生多重高度耐药主要得益于如下两种机制：一种是绿脓杆菌外膜通透性很低，其非特异性通透性仅为大肠杆菌的0.2％-1％；另一种是绿脓杆菌中存在着可以外排多种药物的主动外排系统。有关绿脓杆菌外排泵的作用机制、耐药机制、毒性机理的基础研究已成为全球的研究热点。目前在绿脓杆菌中已经发现了7种跨膜质子梯度能驱动(Transmembrane protongradient energy driven)的外排泵，分别命名为MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和最近发现的MexVW-OprM。对绿脓杆菌基因组数据的分析表明，可能还存在着8种潜在的外排系统。

随着对外排泵研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的外排作用不仅可以直接降低细胞内的药物浓度，提高菌体对药物的MIC值，还可以间接地通过在细胞内较低药物浓度下，对抗性突变体进行快速选择，从而进一步提高细菌的耐药水平；筛选外排泵抑制剂(efflux pumpinhibitor，EPI)，不仅可以抑制绿脓杆菌的外排作用，大大降低绿脓杆菌对药物的先天抗性，而且还可以逆转后天获得的抗性，降低临床治疗中高水平耐药菌株出现的频率，克服耐药绿脓杆菌带来的威胁。

在已经发现的外排系统中，MexAB-OprM是绿脓杆菌中底物谱最广，外排作用最强的外排泵，可以外排四环素、氯霉素、喹诺酮类抗生素、新生霉素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂等多种广泛使用的抗生素，在绿脓杆菌的多重耐药性中起着极其重要的作用。其他几种外排泵，如MexCD-OprJ，MexEF-OprN和MexXY-OprM只在一些突变体中或是经过特殊诱导才会表达，在通常的实验室条件中，并不表达或表达量很低。

对临床分离的高度耐药绿脓杆菌进行分析的结果表明：绝大多数的耐药绿脓杆菌都有MexAB-OprM高表达，进一步证明了MexAB-0prM外排系统，是绿脓杆菌产生多重高度耐药性的主要原因。因此，有效抑制高度耐药的绿脓杆菌之MexAB-OprM外排系统，将有助于改善绿脓杆菌的耐药现状。

国外一些著名的药物研发机构对于外排泵抑制剂的研究正如火如荼地进行。1999年的ICAAC(The Interscience Conference onAntimicrobial Agents and Chemotherapy)会议上MicrocidePharmaceutical Co.和日本第一制药株式会社共同报道了三种抗外排泵药物的成功化学合成；2001年，日本的研究人员报道了在其化合物库中筛选得到了一种外排抑制剂MC-207，110，可以使绿脓杆菌对左旋氧氟沙星的MIC值降低32到64倍，其结构也被认为是一种很有前景的先导化合物。对先导化合物MC-207110的最优化处理得到的一些广谱外排泵抑制剂，对绿脓杆菌体内有效；2002年，发现的新的外排抑制剂(MC-02,595)，可以将左旋氧氟沙星的MI C值降低8倍，一系列以此化合物为基础的研究正在展开；2003年，筛选得到了作用于MexAB-OprM外排泵的抑制剂MC-510,050，正在对该化合物的结构优化，以期获得活性更强的外排抑制剂。但是，到目前为止，还没有专门作用于外排系统的抗绿脓杆菌药物应用于临床。因此，始终需要不断筛选以早日获得能够真正用于临床的抗绿脓杆菌药物或前体化合物。

本发明人首次提出建立以绿脓杆菌外排泵为靶点的高通量药物筛选模型，旨在从微生物的代谢产物中优选的以外排泵MexAB-OprM为靶点筛选抗耐药绿脓杆菌药物。所述筛选模型在国内、外的文献中均未见到相关的报道。

具体的，在缺失外排系统的绿脓杆菌中克隆表达外排蛋白mexAB-oprM基因，构建过量表达MexAB-OprM蛋白的绿脓杆菌，以此作为检定菌建立高通量的药物筛选模型，筛选作用于MexAB-OprM的抗耐药绿脓药物。本发明的筛选模型克服了现有技术中通过大肠杆菌作为宿主表达外排蛋白所导致的外排底物谱发生改变，以及由于外膜通透性不同所带来的假阳性，具有极高的特异性。

采用本发明所述筛选模型获得的抗耐药绿脓杆菌药物与目前临床上广泛应用的抗细菌药物具有完全不同的作用机制，可以大大降低绿脓杆菌对药物的先天抗性，克服由于外排作用导致的高度耐药绿脓杆菌，逆转其后天获得的抗性，使一大批因为绿脓杆菌的外排作用失去对相关感染的治疗功能的抗生素在临床应用中恢复应有的活性。

发明内容

本发明人针对绿脓杆菌的耐药机制，通过分子生物学方法，构建高效表达外排泵，特别是过量表达外膜蛋白MexAB-OprM的重组绿脓杆菌作为检定菌，成功建立了作用于绿脓杆菌外排系统之药物的高通量药物筛选模型。该模型能够用于从微生物代谢产物中筛选例如以外排泵MexAB-OprM为靶点的新型抗耐药绿脓杆菌药物。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种以绿脓杆菌外排泵例如外膜蛋白Mex AB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种以外膜蛋白Mex AB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，其是通过以重组绿脓杆菌XY229(含有质粒pAK1900-mexAB-oprM)为检定茵，以刚好低于所述检定菌MIC值浓度的抗生素(MexAB-OprM的底物)为辅助抗生素，通过比较加入或不加入待测化合物后不同时间点于540nm测定的光吸收值，从待测样品中获得以外膜蛋白Mex AB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物。

在本发明中，所述待测样品，包括但不限于，天然来源的样品和微生物发酵产物，和人工合成的化合物。

本发明还涉及一种利用本发明上述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法，所述方法包括如下步骤：

1)在加入终浓度为100μg/ml的链霉素和100μg/ml的氨苄青霉素的MH培养基中，37℃，200rpm过夜培养接种含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌作为检定茵；

2)在96孔板中分别加入生长对照组(C)和样品筛选组(S)的样品，样品对照组(S’)，在540nm波长下分别检测生长对照组、样品对照组和样品筛选组样品的光吸收值，

其中生长对照组的组成为：MH液体培养基，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素以及1％的步骤1)中制备的检定菌过夜培养物；

样品对照组的组成为：MH液体培养基，刚好低于所述检定茵MIC值的辅助抗生素以及待测发酵液样品；

样品筛选组的组成为：MH液体培养基，刚好低于所述检定茵MIC值的辅助抗生素，1％的步骤1)中制备的检定茵过夜培养物以及待测发酵液样品；

3)将生长对照组、样品对照组和样品筛选组的样品于37℃培养24小时后，再次分别测定540nm处的光吸收。

4)依据步骤2)和3)中两次测定的光吸收值，判定所述待测样品是否具有抗耐药绿脓杆菌活性。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明涉及一种以外排蛋白MexAB-OprM为靶点筛选抗耐药绿脓杆菌的药物的方法，包括：

1)在3ml MH培养基中，加入终浓度为100μg/ml的链霉素和100μg/ml的氨苄青霉素，接种含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌XY229(CGMCC1375)作为检定菌，37℃，200rpm过夜培养；

2)在96孔板中分别加入生长对照组(C)，样品对照组(S’)和样品筛选组(S)的样品，在540nm波长下分别检测生长对照组、样品对照组和样品筛选组样品的光吸收值，

其中生长对照组的组成为：MH液体培养基180μl，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素以及1％的步骤1)中制备的检定茵过夜培养物；

样品对照组的组成为：MH液体培养基180μl，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素以及待测发酵液样品20μl；

样品筛选组的组成为：MH液体培养基180μl，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素，1％的步骤1)中制备的检定菌过夜培养物以及待测发酵液样品20μl；

3)将生长对照组、样品对照组和样品筛选组的样品于37℃培养24小时后，再次分别测定540nm处的光吸收。

4)依据步骤2)和3)中两次测定的光吸收值，判定所述待测样品是否具有抗耐药绿脓杆菌活性。

在本发明中，通过如下方程计算各浓度的辅助抗生素对绿脓杆菌的生长抑制作用：

$R=\{1-\frac{(S_{24}-S_0)-({S^{\′}}_{24}-{S^{\′}}_0)}{C_{24}-C_0}\}\×100$

其中：R为细菌生长抑制率(100％)，C₂₄-C₀为37℃培养24小时后生长对照组中的样品之光吸收OD₅₄₀值的增加量，S₂₄-S₀为37℃培养24小时后样品筛选组中的样品之光吸收OD₅₄₀值的增加量，S’₂₄-S’₀为37℃培养24小时后样品对照组中的样品之光吸收OD₅₄₀值的增加量。

R值越大，表明绿脓杆菌被抑制的程度越高。换言之，如果待测样品例如微生物发酵液中含具有外排泵抑制剂作用的活性成分，则将显著性降低辅助抗生素抑菌浓度，故而可将R值显著性升高改变作为初筛依据。

在本发明中，将R值大于50％的样品确定为初筛阳性样品。

本发明所述筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法还可以包括复筛的步骤。

在本发明的具体实施方案中，针对初筛阳性样品进行复筛的方法，包括分别以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+辅助抗生素为鉴定组，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一种MexAB-OprM的底物)为对照组，对于初筛所得的阳性样品进行复筛。

本发明还涉及一种用于上述筛选模型和筛选方法的过量表达MexAB-OprM蛋白之重组绿脓杆菌。在本发明的一个实施方案中，作为检定菌用于本发明筛选模型的重组绿脓杆菌是含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌XY229，其已于2005年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京，中关村北一条13号，100080)，保藏号CGMCC 1375。

本发明通过成功建立作用于绿脓杆菌外排泵的药物筛选模型，能够高通量地从微生物代谢产物中和其他来源的化合物中，筛选作用于外排泵的抗耐药绿脓杆菌新型药物及先导化合物，以克服目前临床上绿脓杆菌高度耐药问题，为解决临床上所面临的治疗难题做出贡献。

实施例1外膜蛋白mexAB-oprM操纵子基因的克隆

1)用CTAB法从野生绿脓杆茵PAO1中提取总DNA：

按照常规方法过夜培养5ml的PAO1悬液，离心2分钟。沉淀加入567μl的pH8.0的TE缓冲液，重悬，加入30μl的10％的SDS溶液和6μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，37℃水浴1小时。混合物加入100μl的5mol/l的NaCl溶液，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，65℃温浴10分钟。酚/氯仿/异戊醇抽提两次。用异丙醇常温下沉淀基因组DNA。

2)PCR扩增目的基因：

将如步骤1)所述获得的绿脓杆菌PAO1的基因组DNA，用限制性内切酶HindIII处理，作为PCR的模版。根据绿脓杆菌基因组数据库中的序列数据，设计引物：引物1：5’-AGC GAGCTCAGCAGGCGTCCGTCGAAAAGG-3’；引物2：5’-CAG AAGCTTGCTGACCCGCAACCGCTAAG-3’，扩增得到mexAB-oprM操纵子基因。

实施例2过量表达MexAB-OprM蛋白的重组绿脓杆菌的构建

1)将实施例1所得操纵子基因mexAB-oprM连接到表达载体pAK1900：

用限制性内切酶HindIII将如实施例1所述获得的存在于克隆载体pUC 18中的目的基因切下后，进行去磷酸化处理，连接到同样由HindIII处理并去磷酸化的表达载体pAK1900中，得到重组质粒pAK1900-mexAB-oprM。

2)常规方法电击转化宿主茵XY229(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM四种外排泵缺失，由Komori.Y博士惠赠)。

3)制备感受态细胞：

挑单茵落接种到25ml LB液体培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜；将1ml过夜培养物接种到50ml LB液体培养基中，37℃剧烈震荡培养至OD600＝0.5；把培养物冰浴10分钟后，用冰预冷的SMEB缓冲液洗两遍。然后用200μl SMEB缓冲液重悬，置于冰上待用。

4)电击转化：把1μl pAK 1900、pAK1900-mexAB-oprM分别与40μl依上述步骤3)制备好的感受态细胞XY229混匀，转移到0.2cm电击转化杯中，电击(C＝25μF；PC＝200ohm；V＝2.5kV)。电击完成后，迅速把质粒/细胞混合物转移到1ml SOC培养基中，37℃剧烈震荡培养，然后涂布氨苄平板，37℃过夜孵化。挑选阳性克隆，并提取质粒并进行酶切鉴定。

实施例3以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选之初筛模型

本发明所述初筛模型采用浊度法高通量筛选具有抑制外排泵活性的物质。以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)为检定菌，以刚好低于其MIC值浓度的抗生素(MexAB-OprM的底物)为辅助抗生素，初筛天然样品及人工合成的化合物。如下表所示在96孔板中分别加入相应组分，于540nm测定光吸收。37℃培养24小时后，再次测定540nm处的光吸收。

组分	生长对照组(C)	样品对照组(S’)	样品筛选组(S)
				MH液体培养基	+	+	+
1mM的IPTG	+	+	+
				刚好低于其MIC值的辅助抗生素	+	+	+
1％检定茵的过夜培养物	+	-	+
				待测发酵液	-	+	+

用如下方程计算各浓度辅助抗生素对绿脓杆菌的生长抑制作用：

$R=\{1-\frac{(S_{24}-S_0)-({S^{\′}}_{24}-{S^{\′}}_0)}{C_{24}-C_0}\}\×100$

其中R值大于50％的确定为初筛阳性样品

根据光吸收度所反映出的绿脓杆菌生长情况，筛选有外排泵抑制活性的阳性发酵液。

实施例4以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM为靶点的抗绿脓杆茵药物筛选之复筛模型

以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+辅助抗生素为鉴定组，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一种MexAB-OprM的底物)为对照组，对于初筛所得的阳性样品进行复筛。复筛模型的实验步骤参照初筛模型。其中鉴定组XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+辅助抗生素复筛的实验方案，就是初筛的那个方案。各个对照组只需把鉴定菌和辅助抗生素调整成相应的成分既可。

Claims (8)

1.一种以绿脓杆菌外排泵为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选模型，其特征在于使用过量表达所述绿脓杆菌外排泵的重组绿脓杆菌为检定菌，以刚好低于所述检定菌MIC值浓度的外排泵之底物抗生素为辅助抗生素，通过比较加入或不加入待测化合物后不同时间点于540nm测定的光吸收值，用于以绿脓杆菌外排泵为靶点的抗绿脓杆菌药物筛选。

2.权利要求1所述的筛选模型，其中所述绿脓杆菌外排泵选自MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM，优选的为外膜蛋白MexAB-OprM。

3.权利要求1所述的筛选模型，其中所述检定菌为含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌XY229(CGMCC1375)。

4.一种利用权利要求1所述筛选模型筛选抗耐药绿脓杆菌的药物之方法，包括如下步骤：

1)在加入终浓度为100μg/ml的链霉素和100μg/ml的氨苄青霉素的MH培养基中，37℃，200rpm过夜培养含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌作为检定菌；

2)在96孔板中分别加入生长对照组(C)和样品筛选组(S)的样品，样品对照组(S’)，在540nm波长下分别检测生长对照组、样品对照组和样品筛选组样品的光吸收值，

其中生长对照组的组成为：MH液体培养基，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素以及1％的步骤1)中制备的检定菌过夜培养物；

样品对照组的组成为：MH液体培养基，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素以及待测发酵液样品；

样品筛选组的组成为：MH液体培养基，刚好低于所述检定菌MIC值的辅助抗生素，1％的步骤1)中制备的检定菌过夜培养物以及待测发酵液样品；

3)将生长对照组、样品对照组和样品筛选组的样品于37℃培养24小时后，再次分别测定540nm处的光吸收；

4)依据步骤2)和3)中两次测定的光吸收值，判定所述待测样品是否具有抗耐药绿脓杆菌活性。

5.权利要求4的方法，其中还包括如下的复筛步骤：分别以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+辅助抗生素为鉴定组，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一种MexAB-OprM的底物)为对照组，对于初筛所得的阳性样品进行复筛。

6.一种用于权利要求1的筛选模型和/或权利要求4的筛选方法的过量表达MexAB-OprM蛋白之重组绿脓杆菌。

7.权利要求6所述重组绿脓杆菌，其为含有重组质粒pAK1900-mexAB-oprM的重组绿脓杆菌CGMCC1375。

8.利用权利要求1的筛选模型和/或权利要求2的方法获得的抗绿脓杆菌药物。