CN111150839A - 一种用于免疫接种的组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于免疫接种的组合物及其制备方法,所述组合物包括至少两种多肽,每种多肽均不相同,且均为用于免疫接种各种肺炎克雷伯菌的外膜多肽;其中,所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽以及第六多肽。本发明通过将不同的多肽进行组合,可形成跨不同血清、广谱保护性的肺炎克雷伯菌疫苗组合物,能够有效抵御肺炎克雷伯菌感染。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫领域,特别是涉及一种用于免疫接种的组合物及其制备方法。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为革兰氏染色阴性的粗短杆菌,有较厚的荚膜,常见端对端成对排列,是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。克雷伯菌存在于人的上呼吸道和肠道,为人体本身存在菌属,当机体免疫力降低时,便经呼吸道进入肺内引起感染。肺炎克雷伯菌可引起肺炎、支气管炎、泌尿道和创伤感染,有时会导致严重的败血症、脑膜炎以及腹膜炎等疾病。
近年来产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌及多重耐药肺炎克雷伯菌等不同耐药表型的克雷伯肺炎菌在世界范围内发生流行性传播,引起的医院感染率逐年增高,且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延,目前临床可供选择的抗菌药物极为有限。根据2017年中国细菌耐药监测网中国细菌耐药性检测报告显示,肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率从2005年的3.0%上升至20.9%,而且临床分离率亦呈上升趋势。除了耐药性强的特点外,其高毒力也引起临床的极大关注。高毒力肺炎克雷伯菌主要感染健康人群,具有高黏液性、高侵袭性、高致死性等特点,给公共卫生防控和临床患者抗感染治疗带来极大挑战。抗菌药物的滥用导致耐药菌尤其是多重耐药菌迅速增加,使其引起的感染不能被有效控制,成为临床上的难题。
随着免疫学、分子生物学、纳米科学等学科的不断发展,针对肺炎克雷伯菌感染途径以及其毒理因子鉴定方面的研究已有显著的进展。肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因A(MrkA),有8个B细胞优势抗原表位区域可用来制备单克隆抗体和设计表位疫苗。针对肺炎克雷伯菌引起的感染,近年来研制出了多种不同类型组成的新型细菌疫苗,包括多糖疫苗、多糖结合疫苗、蛋白疫苗以及微胶囊疫苗。针对肺炎克雷伯菌导致的菌血症,使用肺炎克雷伯菌的24价多糖疫苗是最有前景的方法,而且已经通过了Ⅰ期临床试验。遗憾的是,24价疫苗能提供的保护作用只能覆盖不超过70%的菌株,且由于生产过程比较复杂,研究人员在Ⅰ期临床试验后,没有继续这项研究。
传统的细菌疫苗的作用机理主要在于利用抗原刺激机体产生相应的抗体,增强免疫细胞杀伤病原菌的能力,但由于肺炎克雷伯菌有不同类型的毒理因子用以逃逸宿主的免疫杀伤作用,且感染途径多样化,所以传统单一的靶向疫苗可能并不是最行之有效的预防肺炎克雷伯菌感染的最佳途径。
目前市面上以及研究较多的肺炎克雷伯菌的疫苗主要类型有多糖、脂多糖、以及蛋白。这些疫苗都具有良好的免疫原性和抗原性,但各有其缺点。例如,肺炎克雷伯菌中的荚膜多糖位于细胞最外层,是重要毒力因子,然而,由于荚膜多糖血清型的多样性,单价荚膜多糖疫苗不能提供对肺炎克雷伯菌的广泛保护效应,因而在很大程度上限制了荚膜多糖疫苗的开发应用;有研究证实纯化的脂多糖LPS可以诱导小鼠产生抗肺炎克雷伯菌感染的免疫保护作用,但由于其存在不良内毒素反应,使得该种疫苗的应用也受到限制。
结合疫苗是运用化学方法将多糖抗原共价结合到载体蛋白上形成糖蛋白,从而达到持久的免疫保护效应。有学者构建了O-抗原与外膜蛋白结合的结合疫苗,通过一系列的实验证明这种结合疫苗具有持久的免疫原性。由于目前载体蛋白种类单一且生产成本较高,在一定程度上限制了结合疫苗的发展。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种用于免疫接种的组合物及其制备方法,能够抵御肺炎克雷伯菌感染。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是提供一种用于免疫接种的组合物,包括:
组合物包括至少两种多肽,每种多肽均不相同,且均为用于免疫接种各种肺炎克雷伯菌的外膜多肽;其中,多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽以及第六多肽。
其中,第一多肽包括SEQ ID1中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID1中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID1中抗原表位的氨基酸序列;
其中,第二多肽包括SEQ ID2中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID2中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID2中抗原表位的氨基酸序列;
其中,第三多肽包括SEQ ID3中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID3中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID3中抗原表位的氨基酸序列;
其中,第四多肽包括SEQ ID4中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID4中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID4中抗原表位的氨基酸序列;
其中,第五多肽包括SEQ ID5中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID5中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID5中抗原表位的氨基酸序列;
其中,第六多肽包括SEQ ID6中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID6中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID6中抗原表位的氨基酸序列。
其中,组合物包括第一多肽、第二多肽以及第五多肽中的至少两种。
其中,多肽吸附于氢氧化铝佐剂上。
其中,组合物包括组氨酸缓冲液。
其中,组合物还包括肺炎克雷伯菌荚膜多糖、脂多糖以及载体蛋白中的至少一种。
其中,组合物的偶联结构为NH2-A-{-X-L-}N-B-COOH;其中,A表示任选的N-末端的氨基酸序列;B表示任选的C-末端氨基酸序列;L表示任选至少一种多肽。
其中,组合物进一步包括非肺炎克雷伯菌抗原。
其中,多肽通过异源宿主重组表达来进行制备;其中,异源宿主为原核或真核生物。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是提供一种制备用于免疫接种的组合物的方法,包括:
获取至少两种不同的多肽,多肽为用于免疫接种各种肺炎克雷伯菌的外膜多肽;将获取到的多肽进行混合,并制备成抗原。
本发明的有益效果是:本发明鉴定了六种可单独或组合用于免疫接种的各种肺炎克雷伯菌外膜多肽,通过将不同的多肽进行组合,形成跨不同血清、广谱保护性的肺炎克雷伯菌疫苗组合物,从而有效抵御肺炎克雷伯菌感染。
附图说明
图1是本发明实施例中制备六种多肽的流程示意图;
图2是本发明实施例一中六种多肽引起的小鼠血清中Egg/IgG1/IgG2a抗体效价水平的示意图;
图3是本发明实施例二中经过抗原免疫的小鼠感染致死剂量的菌血症模型后的存活率的示意图;
图4是本发明实施例三中经过抗原免疫的小鼠感染致死剂量的肺炎模型后的存活率的示意图;
图5是本发明实施例四中经过抗原免疫的小鼠感染非致死剂量的肺炎模型后不同组织中的细菌负荷的示意图;
图6是本发明实施例五中经过抗原免疫的小鼠的脾脏组织在抗原同步刺激下诱导T细胞分泌的细胞因子的统计示意图;
图7是本发明实施例六中经过抗原免疫的小鼠的血清调理HL60细胞促进其对肺炎克雷伯菌的吞噬作用的效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,均属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式,除非上文清楚地表示其他含义,“多种”一般包含至少两种,但是不排除包含至少一种的情况。
应当理解,本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。另外,本文中字符“/”,一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
应当理解,尽管在本发明实施例中可能采用术语第一、第二、第三等来描述XXX,但这些XXX不应限于这些术语。这些术语仅用来将XXX彼此区分开。例如,在不脱离本发明实施例范围的情况下,第一XXX也可以被称为第二XXX,类似地,第二XXX也可以被称为第一XXX。
在本发明实施例中使用的术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合体。该聚合物可以是线性或支化聚合物,可包含修饰的氨基酸,而且可以被非氨基酸中断。多肽也包括经天然或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物。
本发明鉴定了六种可单独或组合用于免疫接种的各种肺炎克雷伯菌外膜多肽,分别为:第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽以及第六多肽。其中,第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽以及第六多肽分别对应Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽以及Kpn_Omp006多肽。
以下用的术语“Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原、Kpn_Omp003抗原、Kpn_Omp004抗原、Kpn_Omp005抗原以及Kpn_Omp006抗原”等同于术语“Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽以及Kpn_Omp006多肽”。
以下用的术语“Kpn_Omp001、Kpn_Omp002、Kpn_Omp003、Kpn_Omp004、Kpn_Omp005以及Kpn_Omp006”等同于术语“Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽以及Kpn_Omp006多肽”。
本发明所鉴定出的多肽包括某些氨基酸序列,该序列与序列列表公开的某一多肽序列100%相同或大于等于70%。
优选地,鉴定出的多肽与参考的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性,最典型地,当此类多肽仅为对应氨基酸序列中毗邻的数个氨基酸片段时,该多肽与参考的氨基酸序列公开的某一多肽序列具有100%的序列同一性。
具体地,请参阅序列表,序列表中是本发明鉴定出的六种多肽分别对应的氨基酸序列表。
其中,第一多肽包括SEQ ID1中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID1中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID1中抗原表位的氨基酸序列;
第二多肽包括SEQ ID2中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID2中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID2中抗原表位的氨基酸序列;
第三多肽包括SEQ ID3中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID3中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID3中抗原表位的氨基酸序列;
第四多肽包括SEQ ID4中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID4中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID4中抗原表位的氨基酸序列;
第五多肽包括SEQ ID5中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID5中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID5中抗原表位的氨基酸序列;
第六多肽包括SEQ ID6中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID6中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,氨基酸片段包括SEQ ID6中抗原表位的氨基酸序列。
在一个具体的实施例中,组合物包括Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽以及Kpn_Omp006多肽中的至少一种,本发明所鉴定出的六种多肽可单独作为靶向疫苗用于免疫接种相应的肺炎克雷伯菌。
在另一个具体的实施例中,组合物包括Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽以及Kpn_Omp006多肽中的至少两种,能够引发免疫应答并提供针对不同类型的肺炎克雷伯菌的保护性免疫。
在又一个具体的实施例中,优选六种多肽中的Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽以及Kpn_Omp005多肽组成多肽亚组,组合物包括选自该多肽亚组中的至少两种多肽。
优选地,本发明所提供的组合物包括多肽亚组中的至少两种多肽。
上述任一组合物中多肽均吸附于佐剂。
其中,本发明使用氢氧化铝佐剂吸附组合物中的多肽。
可选地,使用激活Th1和/或Th2细胞免疫的佐剂组合,例如CPG和明矾等。
上述任一组合物中均包括组氨酸缓冲液。
本发明所鉴定的多肽既可作为分离的各多肽组分存在于组合物中,也可融合成更长的肽链。如果组合物包括至少两种多肽,多肽组合可能是以融合多肽的形式存在于组合物中。
具体地,融合多肽可包括Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽和Kpn_Omp006多肽中的至少一种多肽序列。此外,融合多肽在菌株间有部分变化的情况下,可包含相同多肽的两种或更多种变体。不同融合多肽可以混合在一种制剂中。
在某些具体的实施例中,还可以使本发明的组合物与另外的蛋白融合。例如,组合物还包括肺炎克雷伯菌荚膜多糖(K抗原)、脂多糖(O抗原)和载体蛋白的至少一种。通过与这些蛋白融合联用,本发明所提供的组合物还可针对特殊血清型和特殊菌株提供保护性免疫。
其中,组合物的偶联结构为:NH2-A-{-X-L-}N-B-COOH;其中,A表示任选的N-末端的氨基酸序列,B表示任选的C-末端氨基酸序列;L表示任选Kpn_Omp001多肽、Kpn_Omp002多肽、Kpn_Omp003多肽、Kpn_Omp004多肽、Kpn_Omp005多肽以及Kpn_Omp006多肽中的至少一种。
进一步地,本发明的组合物还包括非肺炎克雷伯菌抗原。
具体地,本发明所鉴定出的多肽可与医院内感染相关细菌的抗原联用,形成的组合物可提供广谱性的保护性免疫。
具体地,本发明所提供的具有免疫原性的多肽可从天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体、多聚体、颗粒、变性多肽的至少一种中进行制备。
具体地,本发明所提供的具有免疫原性的多肽通过异源宿主重组表达来进行制备。其中,异源宿主可以是原核或真核生物。例如:大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌、分支杆菌、酵母等。
优选地,编码多肽的序列可操作地连接至载体中的启动子。术语“可操作地连接”指核苷酸序列以一种方式连接至启动子,该方式允许该核苷酸序列表达。在某些实施例中,可以存在常规使用的载体pET28a,载体可用于在异源宿主中复制以繁殖并扩增。
本发明所鉴定出的六种多肽均可通过本领域已知的常规方法获得。
具体地,请参阅图1,图1是本发明实施例中制备六种多肽的流程示意图,该方法包括以下步骤:
S11:鉴定与筛选多肽。
在本步骤中,先探索酶处理肺炎克雷伯菌过程中的各个条件,完成对其活菌的“剃削”。细菌的生长阶段、酶与反应体系的选择、不同酶的组合方式、反应温度、反应时间都会影响到酶切效果。本发明测试胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶,并根据酶切的效果来选取最优的酶组合。
具体地,设立假阳性对照组排除自发裂解产生的污染,再通过多轮酶切富集细菌表面蛋白,对富集细菌表面蛋白进行液相二级质谱(LC-MS/MS)获得较为完整的表面蛋白质组,接下来在肺炎克雷伯菌蛋白数据库中搜索鉴定结果并分析进行交叉比对互证,完成潜在靶标的进一步分类,进而以蛋白的丰度和保守性为标准筛选潜在的抗原靶标。
S12:制备多肽。
在本步骤中,将聚合酶链式反应扩增到抗原基因片段(含NcoI和XhoI位点)和商业化的载体pET28a中。通过NcoI和XhoI双酶切,以及通过T4 DNA连接酶连接得到重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21菌株中,将菌株涂至卡那霉素抗性的平板表面,放置在37℃培养箱中生长过夜。分别挑单克隆至卡那霉素抗性的LB(肉汤培养基)培养基,放置在37℃,200rpm的摇床中培养过夜。第二天分别将菌液1:100接种至1L卡那霉素抗性的LB培养基,放置在37℃,200rpm的摇床中培养3小时至OD值上升至0.5-0.8,分别在菌液中加入0.5mM/L的IPTG,放回相同条件的摇床内培养4小时,诱导相应包涵体表达。之后将菌液放置在7000rpm,4℃的高速离心机中离心5min回收菌体,每种回收之后的菌体(1L菌液)平均分成两份,每份加30ml裂解缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaOH,PH8.0)以25%的功率超声破碎30min(每9秒破碎一次,每次破碎9秒),将破碎的菌液放置在8000rpm,4℃的高速离心机中离心30min,收集上清液。进一步地,通过离子交换法和亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的蛋白放置在透析袋中,并将透析袋放置在5L PBS(137mMNaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,PH7.4)中,透析48小时,期间换液一次。透析后将液体放置在13000rpm,4℃的高速离心机中离心15分钟,取上清浓缩即为目的蛋白质溶液,使用BCA试剂盒检测目的蛋白浓度。
基于上述情况,本发明实施例提供了一种用于免疫接种的组合物,该组合物能够引起细胞介导免疫应答及体液免疫应答,诱导细胞介导的免疫以及长效的抗体,以便在接触肺炎克雷伯菌时迅速做出反应。两类T细胞,CD4和CD8细胞是启动和/或增强细胞介导免疫和体液免疫所必须的。CD8T细胞可表达CD8共同受体,被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能识别MHC I型分子上抗原肽。CD4T细胞可表达CD4共受体,称之为T细胞辅助细胞。CD4T细胞能识别MHC II型分子上抗原肽。抗原肽与MHC II型分子相互作用后,CD4细胞可分泌细胞因子,这些分泌的细胞因子可激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞等参与免疫应答的其他细胞。
基于上述情况,本发明实施例提供了一种制备用于免疫接种的组合物的方法,通过获取至少两种不同的用于免疫接种各种肺炎克雷伯菌的外膜多肽,并将获取到的不同多肽进行混合,制备成疫苗。
当描述本发明的一些实施例时,所有可能实施例的组合和排列还没有明确地描述。然而,在互不相同的实施例中描述的某些事实并不表示这些实施例的组合不可被有效地使用。本发明考虑所述实施例中所有可能的组合和排列。
为便于对本发明实施例进行理解,本发明提供了以下非限制性实施例。
实施例一
本实施例的目标是探究小鼠模型中颈部皮下注射的六种重组外膜多肽的免疫原性和保护效力。
分别用25ug Kpn_Omp001、25ug Kpn_Omp002、25ugKpn_Omp003、25ug Kpn_Omp004、25ug Kpn_Omp005以及25ugKpn_Omp的抗原剂量研究基于肺炎克雷伯菌的疫苗。
疫苗1:25ug Kpn_Omp001抗原,氢氧化铝佐剂,其包含组氨酸缓冲液;其中,氢氧化铝佐剂在疫苗组合物中的最终浓度为1mg/ml(10%)。
疫苗2:25ug Kpn_Omp002抗原,氢氧化铝佐剂,其包含组氨酸缓冲液;其中,氢氧化铝佐剂在疫苗组合物中的最终浓度为1mg/ml(10%)。
疫苗3:25ug Kpn_Omp003抗原,氢氧化铝佐剂,其包含组氨酸缓冲液;其中,氢氧化铝佐剂在疫苗组合物中的最终浓度为1mg/ml(10%)。
疫苗4:25ug Kpn_Omp004抗原,氢氧化铝佐剂,其包含组氨酸缓冲液;其中,氢氧化铝佐剂在疫苗组合物中的最终浓度为1mg/ml(10%)。
疫苗5:25ug Kpn_Omp005抗原,氢氧化铝佐剂,其包含组氨酸缓冲液;其中,氢氧化铝佐剂在疫苗组合物中的最终浓度为1mg/ml(10%)。
疫苗6:25ug Kpn_Omp006抗原,氢氧化铝佐剂,其包含组氨酸缓冲液;其中,氢氧化铝佐剂在疫苗组合物中的最终浓度为1mg/ml(10%)。
使用健康Balb/c小鼠,约6周龄,并且通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定免疫动物的血清中的抗体水平。动物饲养在标准笼子中,在整个研究期间,为动物提供商业化颗粒饲料和水。
每组10只的6组小鼠分别在第0、14、28天共接受三次颈部皮下注射25ug抗原蛋白,每只动物注射的总体积为100ul,氢氧化铝佐剂占10%。
对照组的10只小鼠分别在第0、14、28天共接受三次颈部皮下注射90%PBS缓冲液,每只动物注射的总体积为100ul,氢氧化铝佐剂占10%。
在第0、7、21、35天取血并分离血清制备样品,用酶联免疫吸附试验(ELISA),分别判断Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原、Kpn_Omp003抗原、Kpn_Omp004抗原、Kpn_Omp005抗原以及Kpn_Omp006抗原是否可以诱导B细胞的反应,以及检测检测血清中IgG/IgG1/IgG2a抗体效价水平。
具体地,请参阅图2,图2是本发明实施例一中六种多肽引起的小鼠血清中IgG/IgG1/IgG2a抗体效价水平的示意图。
小鼠血清中IgG/IgG1/IgG2a抗体效价水平如下:
第1组(注射Kpn_Omp001抗原)
在第0、14和28天注射Kpn_Omp001抗原后,可以有效的激起小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体水平,随着加强免疫次数而增强。
第2组(注射Kpn_Omp002抗原)
在第0、14和28天注射Kpn_Omp002抗原后,可以有效的激起小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体水平,随着加强免疫次数而增强。
第3组(注射Kpn_Omp003抗原)
在第0、14和28天注射Kpn_Omp003抗原后,可以有效的激起小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体水平,随着加强免疫次数而增强。
第4组(注射Kpn_Omp004抗原)
在第0、14和28天注射Kpn_Omp004抗原后,可以有效的激起小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体水平,随着加强免疫次数而增强。
第5组(注射Kpn_Omp005抗原)
在第0、14和28天注射Kpn_Omp005抗原后,可以有效的激起小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体水平,随着加强免疫次数而增强。
第6组(注射Kpn_Omp006抗原)
在第0、14和28天注射Kpn_Omp006抗原后,可以有效的激起小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体水平,随着加强免疫次数而增强。
对照组(注射PBS缓冲液)(图未示)
经过三次注射后,小鼠体内IgG/IgG1/IgG2a抗体效价水平无明显变化。
动物试验结果表明,分别接种6种外膜抗原的小鼠在经过三次免疫蛋白注射后,均可激活体液免疫应答水平。
实施例二
本实施例的目标是探究肺炎克雷伯菌抗原对经尾静脉注射感染菌血症模型的小鼠模型的保护效力。
对上述实施例一中经过三次蛋白免疫的小鼠经尾静脉注射剂量为1×109CFU的K.pneumoniae 260(菌血症模型),每天监测感染小鼠的健康状况,持续两周。
具体地,请参阅图3,图3是本发明实施例二中经过抗原免疫的小鼠感染致死剂量的菌血症模型后的存活率的示意图。
存活情况如下:
第1组(注射Kpn_Omp001抗原)
小鼠在感染菌血症模型后三天内死亡率为20%,此后十多天内死亡率不变,免疫Kpn_Omp001抗原的小鼠在两周后的存活率为80%。
第2组(注射Kpn_Omp002抗原)
小鼠在感染菌血症模型后三天内死亡率为30%,小鼠在两周内的死亡率为50%,免疫Kpn_Omp002抗原的小鼠在两周后的存活率为50%。
第3组(注射Kpn_Omp003抗原)
小鼠在感染菌血症模型后三天内死亡率为70%,此后十多天内死亡率不变,免疫Kpn_Omp002抗原的小鼠在两周后的存活率为30%。
第4组(注射Kpn_Omp004抗原)
小鼠在感染菌血症模型后三天内死亡率为80%,此后十多天内死亡率不变,免疫Kpn_Omp002抗原的小鼠在两周后的存活率为20%。
第5组(注射Kpn_Omp005抗原)
小鼠在感染菌血症模型后三天内死亡率为50%,此后十多天内死亡率不变,免疫Kpn_Omp002抗原的小鼠在两周后的存活率为50%。
对照组(注射PBS缓冲液)(图未示)
小鼠在感染菌血症模型后三天内死亡率为80%,在两周内的死亡率为100%。
存活结果表明,免疫Kpn_Omp003抗原、Kpn_Omp004抗原后,小鼠体内的抗体水平不足以对小鼠进行保护,在感染致死剂量的菌血症模型后,小鼠在两周内的存活率较低;免疫Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原后,小鼠体内的抗体水平对小鼠的保护较高,在感染致死剂量的菌血症模型后,小鼠的存活率分别为80%、50%和50%。
实施例三
本实施例的目标是探究肺炎克雷伯菌抗原对经滴鼻注射感染肺炎模型的小鼠模型的保护效力。
由于上述实施例二中已表明免疫Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原并在感染致死剂量的菌血症模型后,小鼠的存活率显著提高,因此接下来的试验中只感染免疫了Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原的小鼠以及对照组小鼠。
将经过三次蛋白免疫的小鼠在用戊巴比妥钠麻醉后,经滴鼻注射剂量为1×109CFU的K.pneumonia 260(肺炎模型)(每个鼻孔中25μL),监测感染小鼠的健康状况,持续200个小时。
具体地,请参阅图4,图4是本发明实施例三中经过抗原免疫的小鼠感染致死剂量的肺炎模型后的存活率。
存活情况如下:
第1组(注射Kpn_Omp001抗原)
小鼠在感染肺炎模型后96个小时内死亡率为50%,此后100多个小时内死亡率不变,免疫Kpn_Omp001抗原的小鼠在200小时后的存活率为50%。
第2组(注射Kpn_Omp002抗原)
小鼠在感染肺炎模型后96个小时内死亡率为60%,此后100多个小时内死亡率为80%,免疫Kpn_Omp002抗原的小鼠在200小时后的存活率为20%。
第3组(注射Kpn_Omp005抗原)
小鼠在感染肺炎模型后96个小时内死亡率为70%,此后100多个小时内死亡率不变,免疫Kpn_Omp005抗原的小鼠在200小时后的存活率为30%。
对照组(注射PBS缓冲液)(图未示)
小鼠在感染肺炎模型后96个小时内死亡率为100%。
存活结果表明,免疫Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原后,小鼠体内的抗体水平对小鼠的保护较高,在感染致死剂量的肺炎模型后,小鼠的存活率分别为80%、50%和50%。
实施例四
本实施例的目标是探究经过抗原免疫的小鼠模型经静脉注射非致死剂量的肺炎模型后,小鼠不同组织中细菌负荷量的变化。
由于上述实施例二中已表明免疫Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原并在感染致死剂量的菌血症模型后,小鼠的存活率显著提高,因此接下来的试验中只感染免疫了Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原的小鼠。
对经过三次蛋白免疫的小鼠经静脉注射剂量为5×108CFU的K.pneumonia 260(肺炎模型),监测感染小鼠的健康状况,攻毒四天后,用戊巴比妥钠麻醉小鼠,通过放血进行安乐死。在无菌条件下采集小鼠的脾脏、肾脏和肺组织,在BHI平板上,梯度稀释不同组织样品并计数K.pneumonia 260的CFU数量。
具体地,请参阅图5,图5是本发明实施例四中经过抗原免疫的小鼠感染非致死剂量的肺炎模型后不同组织中的细菌负荷的示意图。
结果显示,免疫Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005免疫的小鼠,在感染非致死剂量的肺炎克雷伯菌后,其肺脏、肾脏及脾脏组织中的细菌负荷显著性降低。
实施例五
本实施例的目标是探究经过抗原免疫的小鼠的组织中诱导T细胞分泌细胞因子的具体情况。
在小鼠进行第三次加强免疫的72个小时后,用戊巴比妥钠麻醉小鼠,通过放血进行安乐死。在无菌条件下采集小鼠脾脏组织,充分研磨后使用淋巴细胞分离液分离脾单核细胞。将脾单核细胞孵育到ELISPOT板孔中,分别用相应的Kpn_Omp001、Kpn_Omp002和Kpn_Omp005蛋白同步刺激,在37℃培养箱中培养和捕获细胞因子,24小时后检测是否有斑点形成。
具体地,请参阅图6,图6是本发明实施例五中经过抗原免疫的小鼠的脾脏组织在抗原同步刺激下诱导T细胞分泌的细胞因子的统计示意图。
结果显示,经过Kpn_Omp001抗原、Kpn_Omp002抗原和Kpn_Omp005抗原免疫的小鼠的脾脏组织可以诱导产生与之IFN-γ、IL-4和IL17a相关的Th1、Th2和Th17的细胞免疫反应。
实施例六
本实施例的目标是探究经过抗原免疫的小鼠的血清是否可以调理细胞促进细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬作用。
在小鼠进行第三次加强免疫的72个小时后,取血并分离血清制备样品,所得血清样品即为抗血清。在兔补体存在的条件下,将抗血清样品与K.pneumonia 260以及分化的HL60细胞一起温育,检测分析HL60细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬作用。
对照组中提取未经免疫的小鼠的血清与K.pneumonia 260以及分化的HL60细胞一起温育,检测分析HL60细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬作用。
具体地,请参阅图7,图7是本发明实施例六中经过抗原免疫的小鼠的血清调理HL60细胞促进其对肺炎克雷伯菌的吞噬作用的效果图。
结果显示,对照组中的HL60细胞不介导细菌杀灭,而提取经过Kpn_Omp001、Kpn_Omp002、Kpn_Omp005以及Kpn_Omp006抗原免疫的小鼠的血清制成抗血清样品,在与K.pneumonia 260以及分化的HL60细胞一起温育后,HL-60细胞均可以杀死了25%以上的肺炎克雷伯菌。
序列表
SEQ ID1 (GB: QDX70306.1): Kpn_Omp001
MAHTIKALAISIGAALALTSLPSHAEITLLKQDPQAGDPLSRLNFTVGGSIRPQFNMMTGDGDKGSYKRNGFDGGTRFRFAADYYLFDDISWISYYELGVNIPALFDWDNHYAEGANNTTRRMLYTGLKSDTWGTLTYGQQNSIYYDVVGVKTDIWDYDMIGQAPGNGINGDYDGSYRSRNMLKYKKTVGDVDLYGSYLFEDSEYLPGNGLRYKRKGGGSVGADYHIMKDLTWGTAWNYTRAEMRDPSSADSKTYDQNIVGTALSWTPDNWTFSFGGGWYQNFLTTKKTDVHNYFAGDAWGIEYFAGYKFPINQYAVKSIQPYFMGDRLEYVNGRNYQRIDNGLGISFQLDYGFRVDYEHVFTSSTDNLGDMNLVRLRYDF
SEQ ID2(GB:QDX64613.1): Kpn_Omp002
MRKLNILILAALTAVSGSAMAVGFTVEQGKNFTNLNMEMGKSSSGLYAESHWLKNTDDGSQTGGVGAGYNLEVGPVMLNAGAKAIYLGPKKGDNGVAFPVGGGVNVALTDSIHVFGEGYVAPDGLNNSVKNYVEANGGVSWSPIGPVTLKVGYRHVSVDGKEGRPNHTLIDGAYVGGGVTF
SEQ ID3 (GB: QER79328.1): Kpn_Omp003
MKLLKTVPAAVMLAGGLFASVGAMADDSVFTVMDDPSAAKKPFEGVVNAGYLAQSGNTKSSSMTADSTLTWYGNTTAWSLWGNASNTSSNDERSSEKYAVGGRSRYNLTDMNYVFGQGSWLTDRYNGYQQRDVVTAGYGRQILNGPVHSLRFEFGPGVRYDEYTDGDTDTQPLGYASGTWAWQMTDNAKFSQGVSVFGAEDTTVNSESALNVAINAHFALKVAYNVTWNSEPPASAPEHTDRRTSLSLGYKM
SEQ ID4(GB: QEX41443.1): Kpn_Omp004
MKLILNKSVLAALPLAIALAGCAPSHEVANPPQQQIPASHVSMDLPAAVKNGWPQTDWWKDYHDPQLNNLIQRALANAPDMQIAEQRIRLAEAQARMSQANLGPEMDFSADIERQRMSAEGLMGPFATDTDGNTGPWYTNGTFGLTAGWDLDLWGKNRALVKARIGELKAQVAEQAQTRELLSGSVARLYWQWQTEAAIKAVLQQVKNEQNNIVTVDKALYQRGITNSAEGAENDINVSKTDQQLADVTGTMKEIEARLMALTNSQSQSLNLKPASLPTVSAQLPDTLGYELLARRPDLQVAHWYIEASLSEVDAAKAAFYPDINLMAFLQQDALHLSDLFRHSAQQMGVTAGLTLPIFDSGRLNANLDIASAQNSLSIAQYNKAVVDAVNQVAKTASQVETLMAKSQQQQQVEKDAQRVVDLAQARMAAGILPGSRVSMAKLPALQERITALRLHGQWIDASIQLTSALGGGYHQTVK
SEQ ID5(GB: QEX42815.1): Kpn_Omp005
MKKLAAAALILGTLSTGSVWAHEAGEFFIRAGTATVRPTEGSDNVLGSLGSFNVSNNTQLGLTFTYMATDNIGVELLAATPFRHKVGTGPTGTIATVHQLPPTLMAQWYFGDAQSKVRPYVGAGINYTTFFNEDFNDTGKAAGLSDLSLKDSWGAAGQVGLDYLINRDWLLNMSVWYMDIDTDVKFKAGGVDQKVSTRLDPWVFMFSAGYRF
SEQ ID6: Kpn_Omp006
MMKRNILAVVIPALLVAGAANAAEIYNKNGNKLDFYGKMVGEHVWTTNGDTSSDDTTYARIGLKGETQINDQLIGYGQWEYNMDASNVEGSQTTKTRLAFAGLKAGEYGSFDYGRNYGAIYDVEAATDMLVEWGGDGWNYTDNYMTGRTNGVATYRNSDFFGLVDGLSFALQYQGKNDHDRAIRKQNGDGFSTAATYAFDNGIALSAGYSSSNRSVDQKADGNGDKAEAWATSAKYDANNIYAAVMYSQTYNMTPEEDNHFAGKTQNFEAVVQYQFDFGLRPSIGYVQTKGKDLQSRAGFSGGDADLVKYIEVGTWYYFNKNMNVYAAYKFNQLDDNDYTKAAGVATDDQAAVGIVYQF
Claims (10)
1.一种用于免疫接种的组合物,其特征在于,所述组合物包括至少两种多肽,每种所述多肽均不相同,且均为用于免疫接种各种肺炎克雷伯菌的外膜多肽;
其中,所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽以及第六多肽。
2.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述第一多肽包括SEQ ID1中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID1中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,所述氨基酸片段包括SEQ ID1中抗原表位的氨基酸序列;
所述第二多肽包括SEQ ID2中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID2中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,所述氨基酸片段包括SEQ ID2中抗原表位的氨基酸序列;
所述第三多肽包括SEQ ID3中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID3中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,所述氨基酸片段包括SEQ ID3中抗原表位的氨基酸序列;
所述第四多肽包括SEQ ID4中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID4中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,所述氨基酸片段包括SEQ ID4中抗原表位的氨基酸序列;
所述第五多肽包括SEQ ID5中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID5中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,所述氨基酸片段包括SEQ ID5中抗原表位的氨基酸序列;
所述第六多肽包括SEQ ID6中至少70%的氨基酸序列和/或包括SEQ ID6中的至少7个毗连氨基酸片段;其中,所述氨基酸片段包括SEQ ID6中抗原表位的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述组合物包括所述第一多肽、所述第二多肽以及所述第五多肽中的至少两种。
4.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述多肽吸附于氢氧化铝佐剂上。
5.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述组合物包括组氨酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述组合物还包括肺炎克雷伯菌荚膜多糖、脂多糖以及载体蛋白中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,所述组合物的偶联结构为NH2-A-{-X-L-}N-B-COOH;
其中,A表示任选的N-末端的氨基酸序列;B表示任选的C-末端氨基酸序列;L表示任选至少一种所述多肽。
8.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述组合物进一步包括非肺炎克雷伯菌抗原。
9.根据权利要求1所述的用于免疫接种的组合物,其特征在于,
所述多肽通过异源宿主重组表达来进行制备;其中,所述异源宿主为原核或真核生物。
10.一种制备用于免疫接种的组合物的方法,其特征在于,所述方法包括:
获取至少两种不同的多肽,所述多肽为用于免疫接种各种肺炎克雷伯菌的外膜多肽;
将获取到的所述多肽进行混合,并制备成疫苗。
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